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ES2217911A1 - Una nueva composicion y procedimiento para aumentar la produccion de especies utiles desde el punto de vista agricola. - Google Patents

Una nueva composicion y procedimiento para aumentar la produccion de especies utiles desde el punto de vista agricola.

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ES2217911A1
ES2217911A1 ES200150032A ES200150032A ES2217911A1 ES 2217911 A1 ES2217911 A1 ES 2217911A1 ES 200150032 A ES200150032 A ES 200150032A ES 200150032 A ES200150032 A ES 200150032A ES 2217911 A1 ES2217911 A1 ES 2217911A1
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inhibin
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sheep
micrograms
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Boris Schwartzbord
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Federman & Sons (holdings) Ltd
Federman & Sons Holdings Ltd
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Abstract

Un procedimiento económicamente eficaz y una composición, para mejorar la producción de animales útiles desde el punto de vista agrícola, en particular mamíferos tales como ovejas y aves de corral tales como pollos, mediante la administración de una nueva composición para aumentar la fertilidad que contiene concentraciones sustancialmente bajas de un inmunógeno, que es una inhibina conjugada o un fragmento de la misma. Estas concentraciones preferiblemente están en el intervalo de aproximadamente 5 a 500 microgramos de inmunógeno por ml de composición y, más preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 microgramos de inmunógeno por mil de composición. El aumento de la fertilidad es útil para mamíferos, en particular ovejas, y para aves de corral, en particular pollos, y es eficaz en las condiciones de las granjas comerciales. La composición consta de inhibina o un fragmento de la misma, unida a una proteina de soporte y emulsionada con un adyuvante. Preferiblemente, el inmunógeno incluye la secuencia N-terminal (aminoacidos 1-29) de la subunidad de la inhibina bovina conjugada con la hemocianina de lapa de cerradura (KLH) en una relación de péptido (kLH) de 1:40.

Description

Una nueva composición y procedimiento para aumentar la producción de especies útiles desde el punto de vista agrícola.
Campo y Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para aumentar la producción de especies útiles desde el punto de vista agrícola, en particular especies de mamíferos tales como ovejas o especies aviares tales como pollos, después de la administración de una composición que comprende inhibina o un péptido derivado de la misma, conjugada con un soporte proteico y emulsionada con un adyuvante. La invención se refiere además a un aumento tanto de la fecundidad de los animales como del tamaño medio de las camadas como resultado del tratamiento con la composición.
Debido a las crecientes demandas por parte de los consumidores de productos de alta calidad y seguros para el medio ambiente, las ovejas están adquiriendo cada vez más importancia en el mercado. Las ovejas producen una leche de alta calidad; lana, una fibra con propiedades únicas; y carne de cordero, una carne de bajo contenido calórico, nutritiva y con un sabor exquisito. Las ovejas también ofrecen una multitud de subproductos usados en la fabricación de muchos productos comerciales que varían de tizas a champús. Por consiguiente, un procedimiento mejorado para aumentar la producción de ovejas es importante para la fabricación de productos derivados de estos animales.
Existe una necesidad general de un procedimiento para aumentar la ovulación y la fertilidad en especies animales útiles desde el punto de vista económico y agrícola, incluyendo mamíferos tales como ovejas y especies de aves de corral tales como pollos, por ejemplo, mediante la manipulación de factores hormonales en estos animales para aumentar la fertilidad. Al aumentar el nivel de ciertos de tales factores y/o reducir el nivel de otros factores, se puede aumentar la fertilidad global del animal.
En mamíferos y pájaros, la FSH (hormona estimulante del folículo) juega un papel importante en la potenciación del crecimiento folicular y del desarrollo. El aumento de la proporción de ovulación es una consecuencia de un nivel elevado de FSH en la sangre. Sin embargo, se sabe que la hormona inhibina actúa como un regulador de retroalimentación inhibidor de la hormona FSH (hormona estimulante del folículo). Por consiguiente, la fertilidad puede aumentarse induciendo una hiper-ovulación en especies de mamíferos y aviares por medio de la inmuno-neutralización de la inhibina endógena (o su subunidad biológicamente activa).
La inhibina se secreta por las células granulosas del ovario en las hembras y por las células de sertoli de los testículos en los machos. La inhibina consta de una subunidad \alpha (P_{m} = 18 kDa) unida a través de un enlace disulfuro a una de dos subunidades \beta muy homólogas (de aproximadamente 14 kDa) para formar inhibina A (\alpha-\betaA) o inhibina B (\alpha-\betaB). La forma completamente procesada de la molécula tiene un peso molecular de aproximadamente 32 kDa. La inhibina suprime selectivamente la secreción de la Hormona Estimulante del Folículo (FSH) de la pituitaria y también tiene acciones paracrinas locales en las gónadas. La inmuno-neutralización de la inhibina endógena por inmunización activa o pasiva produce un aumento de la FSH circulante y puede aumentar el desarrollo folicular del ovario y el número de oocitos.
Por lo tanto, existe la necesidad y sería útil disponer de un procedimiento para aumentar la fertilidad de animales útiles desde el punto de vista agrícola, incluyendo mamíferos tales como ovejas y especies de aves de corral tales como pollos, por medio de una inmunización contra la inhibina que no requiera grandes cantidades ni inyecciones múltiples del inmunógeno y que además promueva con alta eficacia la hiperovulación del animal y, por lo tanto, promueva el aumento de la fertilidad.
Resumen de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento económicamente eficaz para aumentar la producción de animales útiles desde el punto de vista agrícola, en particular mamíferos tales como ovejas y aves de corral tales como pollos, por medio de la administración de una nueva composición para aumentar la fertilidad.
Un alcance adicional de la presente invención se refiere al uso de concentraciones sustancialmente bajas del inmunógeno, que es una inhibina conjugada o un fragmento de la misma. Estas concentraciones preferiblemente están en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 microgramos de inmunógeno por ml de composición y, más preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 microgramos de inmunógeno por ml de composición.
Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un tratamiento para aumentar la fertilidad de los mamíferos, en particular de las ovejas, que sea eficaz en las condiciones de las granjas comerciales.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un tratamiento para aumentar la fertilidad de los animales de corral, en particular de los pollos, que sea eficaz en las condiciones de las granjas de aves de corral comerciales.
Es otro objeto de la invención proporcionar una composición que conste de inhibina o un fragmento de la misma, asociada con una proteína de soporte y emulsionada con un adyuvante. Preferiblemente, el inmunógeno incluye la secuencia N-terminal (aminoácidos 1-29) de la subunidad alfa de la inhibina bovina conjugada con la hemocianina de lapa de cerradura (KLH) en una relación de péptido/KLH de 1:40.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a la especie una composición que contiene una cantidad eficaz de inhibina o un fragmento de la misma.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una composición para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, que comprende: (a) inhibina o un fragmento de la misma; (b) una proteína de soporte para la conjugación con dicha inhibina; y (c) un adyuvante para la emulsión.
En lo sucesivo, el término "animal" hará referencia a cualquier especie útil desde el punto de vista agrícola, incluyendo, pero sin limitación, mamíferos inferiores tales como vacas, ovejas, cabras y cerdos; y aves de corral tales como pollos, patos, gansos y pavos.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención se refiere a un procedimiento económicamente eficaz y a una composición, para mejorar la producción de animales útiles desde el punto de vista agrícola, en particular mamíferos tales como ovejas y aves de corral tales como pollos, mediante la administración de una nueva composición para aumentar la fertilidad que contiene concentraciones sustancialmente bajas de un inmunógeno, que es una inhibina conjugada o un fragmento de la misma. Estas concentraciones preferiblemente están en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 microgramos de inmunógeno por ml de composición y, más preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 microgramos de inmunógeno por ml de composición.
El tratamiento para aumentar la fertilidad de la presente invención es útil para mamíferos, en particular ovejas, y para aves de corral, en particular pollos, y es eficaz en las condiciones de las granjas comerciales. La composición de la presente invención consta de inhibina o un fragmento de la misma, unida a una proteína de soporte y emulsionada con un adyuvante. Preferiblemente, el inmunógeno incluye la secuencia N-terminal (aminoácidos 1-29) de la subunidad alfa de la inhibina bovina conjugada con la hemocianina de lapa de cerradura (KLH) en una relación de péptido/KLH de 1:40.
La invención se ilustra por el siguiente ejemplo que describe una realización preferida de la invención sin imponer ninguna limitación sobre su alcance.
El procedimiento descrito más adelante incluye las siguientes etapas principales. En primer lugar, se preparó el inmunógeno. Posteriormente se inmunizó al animal, tal como, por ejemplo, una oveja, usando la composición de inmunógeno, que se ensayó para determinar las cantidades y los programas de dosificación óptimos para la administración. Después se analizaron los resultados obtenidos para determinar la especificidad de los anticuerpos activados contra el inmunógeno y la eficacia de la inmunización.
1. Preparación del inmunógeno (a) Preparación del inmunógeno para inyección
Se conjugó un péptido sintético correspondiente a la secuencia N-terminal 1-29 de la subunidad alfa de la inhibina bovina (sintetizada habitualmente por SYPEP Ltd. Dublin, CA, EE.UU) (denominado en lo sucesivo "el péptido inmunógeno") con la hemocianina de lapa de cerradura (KLH, Sigma H-2133) con glutaraldehído (Aldrich 34.085-5) a una relación de péptido/KLH de 1:40. El conjugado se dializó durante una noche frente a agua a 4°C. El agua de diálisis se reemplazó y el conjugado se dializó durante otras 4 horas a 4°C.
Para evitar la agregación del material que se produce con frecuencia durante la conjugación de péptido-KLH con glutaraldehído, el proceso de conjugación se realizó en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) a una concentración final del 0,1%. La presencia de SDS en el proceso de conjugación permitió usar concentraciones relativamente bajas de péptido inmunógeno en la composición. Sin pretender limitarse por una sola hipótesis, presumiblemente, al impedir la formación de agregados se consiguió que fueran accesibles más determinantes antigénicos peptídicos al sistema inmune de los animales objeto, que en los experimentos indicados a continuación eran ovejas. Por consiguiente, se requirió una dosis menor del péptido inmunógeno, con menos inyecciones de refuerzo, para inducir una respuesta inmune suficiente.
El conjugado de péptido inmunógeno/KLH se almacenó a -20°C hasta la emulsión con un adyuvante que comprendía un 85% (en volumen) de aceite mineral, un 14,8% de Span (emulsionante) y un 0,2% de Tween-80 a una concentración de 25 microgramos de péptido en 1 ml de adyuvante. La composición emulsionada se mantuvo a 4°C.
(b) Evaluación de diferentes concentraciones de péptido inmunógeno para inducir la inmunidad en ovejas
La titulación del anticuerpo contra la subunidad alfa de la inhibina bovina se cuantificó después de la administración de diferentes concentraciones de péptido inmunógeno por medio de inyecciones. Cinco grupos, conteniendo cada uno 5 ovejas lecheras Assaf, se inyectaron dos veces por vía intramuscular (i.m.) cada dos semanas. Las composiciones inyectadas contenían 25, 50, 100 y 300 microgramos de péptido inmunógeno. Un grupo de control recibió Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS). Diez días después de la segunda inyección, se extrajo sangre de todos los animales. Se separó el suero y se mantuvo a 20°C.
No pudieron observarse diferencias sustanciales entre las diversas dosis de péptido inmunógeno con el ensayo ELISA (descrito más adelante). Todos los animales, excepto los animales de control, desarrollaron una alta titulación anti-inhibina en comparación con el control positivo de suero hiper-inmune mostrado en la Figura 2.
(c) Cuantificación de anticuerpos anti-inhibina usando el ensayo ELISA
La titulación del anticuerpo anti-inhibina específico inducido contra las diversas concentraciones de péptido inmunógeno inyectado se determinó por un inmunoensayo enzimático (método ELISA) en el que los pocillos se recubrieron con el péptido inmunógeno y los anticuerpos de oveja se hicieron reaccionar con IgG de conejo anti-oveja marcada con peroxidasa. Los resultados se leyeron a 405 nm después de la adición del sustrato.
El control positivo era un suero de cabra "hiper-inmune" contra la subunidad alfa de la inhibina bovina (Biomakor Ltd, Israel), mientras que el control negativo era la reserva de suero pre-inmune procedente de las ovejas ensayadas.
La Figura 2 muestra los resultados del ensayo ELISA para diferentes concentraciones del péptido inmunógeno. Incluso la dosis relativamente baja de 25 microgramos del péptido fue capaz de inducir una buena respuesta inmune, como se refleja por la alta titulación de los anticuerpos. Todos los resultados se comparan con el control positivo del suero hiper-inmune contra la inhibina bovina y con el suero de control negativo obtenido a partir de las ovejas antes de la inmunización.
(d) Especificidad de los anticuerpos contra la aubunidad alfa de la inhibina procedente del fluido folicular bovino (BFF)
Se comparó la especificidad de anticuerpos inducidos por la inmunización de ovejas contra el fragmento sintético de la subunidad alfa (1-29) de la inhibina bovina con la especificidad obtenida con la inhibina natural procedente del Fluido Folicular Bovino (BFF). Como se muestra en la Figura 1, los resultados demuestran la unión específica de los anticuerpos inducidos por el inmunógeno en las ovejas con la inhibina nativa. El procedimiento experimental fue el siguiente.
Diez ovejas recibieron dos inyecciones i.m separadas por un periodo de dos semanas. Las inyecciones contenían subunidad alfa 1-29 sintética de inhibina bovina conjugada con KLH y emulsionada con un adyuvante. Diez días después de la segunda inyección, se extrajo sangre de las ovejas y el suero se separó y se mantuvo a -20°C.
(e) Transferencia de Western en BFF
El BFF se separó en gel de SDS poliacrilamida al 10% con un marcador de peso molecular y las fracciones se transfirieron a una lámina de nitrocelulosa por electrotransferencia. La nitrocelulosa se bloqueó con leche en polvo desnatada y deshidratada en tampón Tween.
La nitrocelulosa bloqueada se incubó con los anticuerpos anti-subunidad alfa de la inhibina diluidos con PBS. Después del lavado en tampón Tween, las manchas de transferencia se incubaron con IgG de conejo anti-oveja marcada con peroxidasa. Las manchas de transferencia se revelaron usando 4-cloro-1-naftol como sustrato.
Como se muestra en la mancha de transferencia de la Figura 1, las bandas 1 y 2 contienen BFF, mientras que la banda 3 contiene el marcador del peso molecular (en miles) y se indica como 3. Se muestran dos bandas de anticuerpos unidos específicamente, marcadas como "P" e "I". La banda "P" corresponde al precursor de la subunidad de la inhibina no procesada (P.M. 56-58 kDa), mientras que la banda "I" es la subunidad alfa de la inhibina neutra (P.M. 32 kDa).
Los resultados confirman que los anticuerpos obtenidos a partir de ovejas inmunizadas contra la subunidad alfa sintética de la inhibina bovina se unen específicamente a fragmentos de la inhibina bovina natural.
2. Inmunización de ovejas con composición de péptido inmunógeno
Las ovejas usadas en este estudio eran ovejas de una raza cruzada comercial (German Marino x Assaf local) de una granja moshav en el centro de Israel. Las ovejas se mantuvieron en la sombra a lo largo de todo el año, se alimentaron con una dieta comercialmente aceptable y tuvieron acceso libre al agua. Todas las ovejas del estudio se ensayaron al menos 45 días después del último parto.
Para el estudio experimental, se dividieron aleatoriamente 122 ovejas en dos grupos de 61 cada uno. El primer grupo (tratamiento) se inmunizó con 1 ml de la composición emulsionada de péptido inmunógeno/KLH (25 microgramos de péptido inmunógeno) por medio de una inyección intramuscular (i.m.) en la cadera. El segundo grupo (control) se inyectó i.m con 1 ml de adyuvante solo. Dos semanas después, se inyectó por vía i.m. 1 ml de la composición emulsionada de péptido inmunógeno/KLH, que también contenía 25 microgramos de péptido inmunógeno, al grupo de tratamiento. Al grupo de control se le administró una segunda inyección i.m. de 1 ml de adyuvante solo. En el mismo día, a todas las ovejas (de control y tratamiento) se les insertaron dispositivos intravaginales (EAZI BREED CIDR G™ que contiene 300 mg de progesterona, InterAg N.Z.) durante 12 días. Después de retirar estos dispositivos, cada oveja recibió 600 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) (Synchroject Vetimex, Holanda) por medio de inyección i.m.. Se tomaron muestras de sangre de 10 ovejas procedentes del grupo de tratamiento y de 3 ovejas del grupo de control. La sangre se coaguló y el suero se separó y se almacenó a -20°C.
Dos días después de la inyección de PMSG y 14 días después del refuerzo, se introdujeron carneros a una relación entre carneros y ovejas de 1:7. Los carneros se mantuvieron con las ovejas durante tres semanas. Después se determinó el número de embarazos. Las proporciones de embarazo se analizaron por un ensayo Chi Cuadrado. El tamaño medio de la camada se analizó por un ensayo t de Student.
3. Resultados obtenidos después de la inmunización de las ovejas con la composición que contiene péptido inmunógeno (a) Titulaciones de anti-inhibina en suero
Como se muestra en la Figura 3, todas las ovejas muestreadas del grupo de tratamiento que recibieron inyecciones del inmunógeno tenían una titulación de anti-inhibina significativa, mientras que las muestras procedentes del grupo de control no tenían tales anticuerpos. El valor medio de los resultados del ELISA para el grupo de tratamiento fue de 1,97 frente a 2,1 DO del control positivo, y para el grupo de control fue de 0,22 frente a 0,24 DO del control negativo.
(b) Proporciones de embarazo
Las proporciones de embarazo de los grupos se determinaron por los partos reales entre 140 y 175 días después de la inducción de los carneros. Los resultados fueron similares en los dos grupos. Se preñaron el 68% (40/59) de las ovejas del grupo de control y el 66% (40/61) de las ovejas del grupo de tratamiento, como se muestra en la Tabla 1 presentada más adelante. Al final del periodo experimental, se retiraron dos ovejas del grupo de control debido a una enfermedad. El cálculo de la proporción de embarazo se basó en los partos reales.
(c) Tamaño medio de la camada
El tamaño medio de la camada del grupo de tratamiento fue significativamente mayor que el del grupo de control, 2,1 corderos por oveja frente a 1,65, como se muestra en la Tabla 1. Esta diferencia se redujo cuando se contaron sólo los corderos nacidos vivos, aunque los resultados del grupo de tratamiento aún eran mayores que los del grupo de control: 1,9 frente a1,6 (Tabla 1).
Esas cifras reflejan el número de ovejas que concibieron en el primer ciclo o en el ciclo siguiente. El periodo de tres semanas durante el cual las ovejas estuvieron en contacto con los carneros cubrió dos ciclos de las ovejas, durando cada ciclo 17 días.
TABLA 1 Proporciones de embarazo y tamaño medio de la camada de los dos grupos
Grupo Proporción de Tamaño medio de la
embarazo (%) Camada
Control 68 (40/59) 1,65 a (66/40)
* 1,6 a (65/40)
Tratamiento 66 (40/61) 2,1 b (84/40)
* 1,9 b (75/40)
* Corderos nacidos vivos
a,b P < 0,05
Ocho de los nueve corderos nacidos muertos del grupo de tratamiento procedían de dos ovejas con un embarazo cuádruple y que abortaron 5 días antes del inicio del parto. Debe indicarse que la práctica común para el tratamiento de las ovejas es alimentar a las ovejas preñadas durante el último mes de embarazo con niveles nutricionales correspondientes a un embarazo doble (de acuerdo con el NRC). Los requisitos nutricionales para un embarazo triple superan en un 10% a los de un embarazo doble. Como los grupos de ovejas tratadas y de control se mantuvieron en las mismas condiciones nutricionales, los nueve corderos del grupo tratado que nacieron muertos probablemente murieron a causa de unas condiciones nutricionales insuficientes.
(d) Distribución del tamaño de la camada
La distribución del tamaño de la camada entre una, dos, tres o más crías muestra una clara tendencia a camadas de múltiples corderos en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control. Mientras que sólo un 5% de las ovejas de control tuvieron una camada de tres o más crías, el 27% de las ovejas del grupo de tratamiento tuvieron tres o más crías. Esta diferencia se reduce cuando se cuentan sólo los corderos nacidos vivos. La Tabla 2 y la Figura 4 muestran la distribución de los tamaños de las camadas entre grupos.
TABLA 2 Distribución de tamaños de las camadas entre grupos
Grupo Una cría Dos crías Tres crías > Tres crías
Control 47,5% 47,5% 2,5% 2,5%
47,5%* 50%* Ninguna* 2,5%
Tratamiento 32,5% 40,5% 15% 12%
35%* 47,5%* 12,5%* 5%*
* Corderos nacidos vivos.
(e) Fecundidad
La fecundidad global de cada grupo, considerada como los corderos nacidos de 100 ovejas tratadas y calculada a partir del tamaño de la camada, fue significativamente mayor en el grupo de tratamiento en comparación con el control. La Tabla 3 demuestra los resultados de fecundidad.
TABLA 3 Fecundidad de los grupos de control y de tratamiento
Grupo Fecundidad (Corderos nacidos/100 ovejas)
Control 112,2
108,8*
Tratamiento 138,6
125,4*
* Corderos nacidos vivos
El cálculo de la fecundidad se realizó con respecto al número total de ovejas tratadas. El cálculo del número de corderos nacidos de 100 ovejas se realizó como se indica a continuación:
100 x % Embarazos x Tamaño medio de las camadas = número de corderos nacidos/100 ovejas
(f) Resumen de los resultados
Los resultados demuestran que el procedimiento y la composición de inmunógeno descritos en este documento aumentaban el tamaño de la camada de las ovejas a las que se les había administrado el inmunógeno. El aumento total del tamaño de la camada se debía principalmente al aumento del número de trillizos y a la reducción del número de partos de una sola cría. En las condiciones normales de una granja, éste es un resultado deseado, ya que las ovejas pueden soportar fácilmente embarazos triples y los corderos nacen viables. La composición de la presente invención también puede inducir claramente una titulación de anticuerpos muy específicos con dosis muy bajas (tales como en el intervalo de 20-300 microgramos por inyección) del péptido inmunógeno. Los estudios de campo demuestran claramente que la inmunización activa de las ovejas con la composición de la presente invención condujo a un aumento del tamaño de las camadas al triple.
4. Evaluación de la composición de péptido inmunógeno de la presente invención para mejorar la fertilidad en carneros
Se cuantificó la titulación del anticuerpo contra la subunidad alfa de la inhibina bovina después de la administración de inyecciones de una composición de acuerdo con la presente invención que contenía péptido inmunógeno a carneros Assaf. Los carneros eran una mezcla de razas cruzadas locales Awassi x frezien. Al inicio del ensayo, se recogieron muestras activamente de los carneros, mediante la monta de una oveja artificial, de tal manera que se recogió el semen con una vagina artificial. Cada vez que se recogía semen de un grupo de carneros, todos los carneros del grupo habían montado igualmente a la oveja artificial. Al inicio del ensayo se examinaron las muestras para comprobar la calidad del semen. El semen recogido se diluyó inmediatamente con diluyente químico de carnero (RSD-1) y se comprobó en un analizador SQA II B. Los parámetros que se examinaron incluyeron volumen, concentración, motilidad, TFSC (Concentración de Semen Funcional Total) y SMI (Índice de Motilidad del Semen).
Se examinaron seis grupos, conteniendo cada uno 5 carneros Assaf. El carnero con la menor puntuación de cada grupo se trató mediante dos inyecciones intramusculares (i.m.) de 1 ml de la composición de acuerdo con la presente invención, separándose las inyecciones por un periodo de diez días. En total se trataron nueve carneros. La composición inyectada contenía 50 microgramos de péptido inmunógeno, mientras que los demás carneros recibieron Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS). Catorce días después de la segunda inyección, se recogió semen de todos los carneros y se volvió a comprobar la calidad con el mismo analizador. Además, en ese momento, se extrajo sangre de todos los animales tratados y de un carnero no tratado. Un carnero durante el periodo de ensayo. El suero se separó y se mantuvo a 20°C.
El tratamiento de los carneros con la composición de la presente invención aumentó claramente diversos factores relacionados con la fertilidad, como se muestra en las Tablas lA y 1B con una comparación de cada carnero antes del tratamiento (Tabla 1A) y después del tratamiento (Tabla 1B). Las puntuaciones iniciales para los carneros a tratar se proporcionan en letra itálica.
TABLA No. 1A Calidad del semen antes del tratamiento
Grupo Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
1 1458 1 151 70 372 774
1 1369 1 126 66 329 596
1 1396 0,6 140 68 351 684
1 121 1 137 68 346 664
Promedio 0,9 138,5 68 349,5 679,5
2 1929 1 104 61 288 448
2 1968 0,5 106 62 291 459
2 9934 0,6 125 66 327 588
2 Mines 0,6 138 68 348 672
2 1816 1,25 144 69 359 716
Promedio 0,79 123,4 65,2 322,6 576,6
3 HORNS 1 137 68 346 664
3 1163 1 154 71 378 801
3 212 1,1 110 63 300 490
3 OPEN 1,2 118 65 315 543
3 166 1,9 96 59 270 390
TABLA No. 1A (continuación)
Grupo Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
Promedio 1,24 123 65,2 321,8 577,6
4 2417M 1,1 146 69 361 725
4 9888 1,1 128 66 331 604
4 Ear 1,9 166 74 412 954
4 419M 1,1 153 71 376 792
4 421M 1 122 65 322 568
Promedio 1,24 143 69 360,4 728,6
5 7315 1,1 78 52 212 230
5 7279 1 132 67 339 636
5 Mines 1,9 121 65 320 560
5 123 0,7 137 68 346 664
5 6448 1 134 67 342 648
Promedio 1,14 120,4 63,8 311,8 547,6
6 5 0,7 96 59 270 390
6 FLUFF 1,1 100 60 279 417
6 1 1,2 128 66 331 608
6 108 0,8 123 5 324 576
6 24 2 125 66 327 588
Promedio 1,16 114,4 51,2 306,2 515,8
TABLA No. 1B Calidad del semen después del tratamiento
Grupo Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
1 1458 1 183 79 462 999
1 1396 0,7 171 75 428 999
1 121 1 133 67 340 640
1 1369 1,5 133 61 340 999
Promedio 1,05 155 70,5 392,5 909,25
4 421M 2,7 146 69 361 725
4 Ear 1,5 173 76 432 999
TABLA No. 1B (continuación)
Grupo Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
4 419M 1,5 168 74 418 981
4 9888 2 190 81 482 999
Promedio 1,925 169,25 75 423,25 926
6 Fluffi 0,8 152 70 374 783
6 5 2 167 74 416 972
6 24 2 156 71 383 824
6 1 1,5 164 73 407 932
6 108 1 181 78 455 999
Promedio 1,46 164 73,2 407 902
5 Mines 2 204 85 522 999
5 7279 1 169 75 420 990
5 123 1,5 154 71 378 801
2 9934 0,8 194 82 493 999
5 6448 1,2 200 84 511 999
Promedio 1,3 184,2 79,4 464,8 957,6
3 166 2 163 73 405 923
3 OPEN 2 142 69 355 700
3 1163 1 94 58 266 378
3 212 1,5 162 73 399 896
Promedio 1,625 140,25 68,25 356,25 724,25
2 1816 0,75 86 55 242 306
2 Mines 1,2 85 55 240 300
2 1968 0,5 143 69 357 708
5 7315 1 120 65 318 553
2 1929 1 111 63 302 497
Promedio 0,89 109 61,4 291,8 472,8
Las Tablas 2A y 2B demuestran la calidad relativa del semen de cada carnero tratado en el contexto del grupo antes del tratamiento (Tabla 2A) y después del tratamiento (Tabla 2B). La calidad relativa se averiguó como una relación del valor de cada parámetro para el carnero tratado, dividido por el promedio de estos valores para el grupo de carneros al que pertenece el carnero tratado.
TABLA No. 2A Índice de calidad del semen antes del tratamiento
Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
1369 1,111 0,91 0,97 0,94 0,87
1929 1,26 0,84 0,93 0,89 0,77
9934 0,75 1,01 1,01 1,01 1,02
166 1,5 0,78 0,9 0,84 0,67
9888 0,88 0,89 0,95 0,92 0,83
421M 0,8 0,85 0,94 0,89 0,78
7315 0,96 0,65 0,82 0,68 0,42
5 0,6 0,84 1,15 0,88 0,75
Fluffi 0,94 0,88 1,17 0,91 0,8
TABLA No. 2B Índice de calidad del semen después del tratamiento
Carnero Volumen Concent. Motilidad SMI TFSC
1369 1,43 0,86 0,87 0,87 1,10
1929 1,12 1,02 1,03 1,03 1,05
9934 0,62 1,05 1,03 1,06 1,04
166 1,23 1,16 1,07 1,14 1,27
9888 1,04 1,12 1,08 1,14 1,08
421M 1,40 0,86 0,92 0,85 0,78
7315 1,12 1,10 1,06 1,09 1,17
5 1,37 1,02 1,00 1,02 1,08
Fluffi 0,55 0,93 0,96 0,92 0,87
La Tabla 3 muestra el índice de calidad del semen para carneros tratadas como una relación de la calidad antes del tratamiento (Tabla 2A) y la calidad después del tratamiento (Tabla 2B). Claramente, la calidad del semen aumentó después del tratamiento para los parámetros de las Tablas 2A y 2B. Esta relación particular demuestra la mejora individual de cada carnero tratado.
TABLA 3 Relación entre la calidad antes del tratamiento y la calidad después del tratamiento para los carneros tratados
Carnero Volumen Conc. Motilidad MSI TFSC
1369 1,29 0,94 0,89 0,92 1,26
1929 0,89 1,21 1,10 1,16 1,37
9934 0,82 1,04 1,05 1,05 1,02
166 0,82 1,49 1,35 1,35 1,90
9888 1,18 1,26 1,24 1,24 1,30
421M 1,75 1,01 0,96 0,96 1,00
7315 1,17 1,69 1,60 1,60 2,78
5 2,28 1,21 1,16 1,16 1,44
Fluffi 0,58 1,05 1,01 1,01 1,09
La Tabla 4 compara el promedio de carneros tratados y no tratados antes y después del tratamiento. De esta forma se compara el valor medio del grupo antes y después del tratamiento. Los resultados se analizaron por un ensayo t para determinar el significado de las diferencias (a = P < 0,005, n = no significativo), demostrándose de esta manera que, antes del tratamiento, los carneros a tratar tenían una calidad del semen menor que los carneros de control, siendo la diferencia estadísticamente significativa. Después del tratamiento, se eliminó esta diferencia. En algunos casos, después del tratamiento, los carneros tratados tenían una calidad del semen ligeramente mayor que los carneros de control, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa.
Antes del tratamiento Después del tratamiento
Categoría Carneros Carneros valor Carneros Carneros de valor
de de p de tratamiento P
control tratamiento control
TFSC 660,9 470,1 0,0002 802,8 827,8 b 0,397
a
SMI 344,2 292 0,0002 389,7 387,9 b 0,477
a
Motilidad 64,5 61,5 0,2771 71,5 70,9 b 0,428
b
Concent. 135 108,3 0,0001 153,8 152,8 b 0,474
a
Volumen 1,09 1,06 0,3985 1,26 1,54 b 0,118
b
Las Tablas 1-4 demuestran claramente que el tratamiento con la vacuna anti-inhibina de la presente invención, como se ha descrito previamente, mejoraba la calidad del semen de carneros con una calidad del semen relativamente baja. Este resultado es particularmente significativo, ya que se demostró la mejoría para un gran número de carneros que demostraron tener una calidad del semen antes del tratamiento menor que los carneros de control, siendo la diferencia estadísticamente significativa, pero que tenían la misma calidad del semen después del tratamiento. De esta manera, la composición y el procedimiento de la presente invención tratan satisfactoriamente la baja calidad del semen en animales tales como carneros, que tienen una gran importancia agrícola y comercial.
La importancia de comparar cada carnero tratado con carneros de control del mismo grupo es que tal comparación soluciona cualquier desviación posible con respecto a factores externos, o a cualquier varianza interna dentro de cada grupo. La Tabla 3 muestra la mejora de carneros individuales después del tratamiento, mientras que la Tabla 4 muestra la mejora dentro de los grupos de carneros después del tratamiento.
Los parámetros sobre los que se influyó más en los carneros tratados fueron motilidad, SMI y TFSC. El volumen y la concentración se vieron menos afectados, posiblemente porque eran relativamente buenos antes del tratamiento.
5. Evaluación de la composición de péptido inmunógeno de la presente invención para inducir la inmunidad en gallinas ponedoras
Las composiciones anti-inhibina y el procedimiento de la presente invención han demostrado ser eficaces en especies de mamíferos, tales como ovejas, como se ha descrito anteriormente. Para examinar la eficacia de la presente invención en una especie que no es de mamífero, específicamente en aves de corral, se examinó el efecto de la composición en gallinas ponedoras. Un grupo de aproximadamente 800 gallinas ponedoras prematuras se encerró en un gallinero y se dividió en 3 grupos de aproximadamente 260-288 gallinas cada uno. A la edad de 18 semanas, antes del inicio de la puesta de huevos, los Grupos A y B se vacunaron con 0,1 ml (5 microgramos de péptido) de la composición de anti-inhibina por medio de inyecciones intramusculares; el Grupo B se vacunó de nuevo una segunda vez con esta composición a la edad de 20 semanas; y el Grupo C se dejó como control sin tratar.
A la edad de 20 semanas, algunas gallinas comenzaron a poner esporádicamente. Posteriormente, se recogieron los datos relacionados con el comportamiento de los 3 grupos. Los parámetros examinados incluían el aumento de la proporción de puesta; el aumento de la producción acumulativa de huevos; el aumento del peso y de la masa de los huevos por gallina; la reducción de la cantidad de alimento consumido por huevo producido; y la persistencia del pico de puesta. Con respecto al último punto, debe indicarse que la proporción de producción de huevos varía cíclicamente durante la vida de la gallina ponedora, de tal forma que el pico de puesta representa la proporción máxima de producción de huevos por día para esa gallina. Típicamente, tal pico se alcanza a una producción diaria de huevos del 90%, o casi un huevo al día.
Los resultados del estudio demostraron una clara mejora de la producción de huevos en comparación con el control, una reducción significativa de la masa de huevo por gallina encerrada en comparación con el control, y una reducción significativa de la cantidad de alimento consumido por huevo producido, de nuevo en comparación con el control. Así pues, el procedimiento y las composiciones de la presente invención resultaron ser útiles también para aumentar diversos parámetros de la producción de huevos de las gallinas ponedoras.
Se apreciará que las descripciones anteriores sólo pretenden servir como ejemplos, y que son posibles muchas otras realizaciones dentro del espíritu y del alcance de la presente invención.

Claims (24)

1. Un procedimiento para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a la especie una composición que contiene una cantidad eficaz de inhibina o un fragmento de la misma, estando dicha cantidad eficaz en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 microgramos por dosis.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha inhibina está presente a una concentración en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 microgramos por dosis.
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha inhibina en una inhibina bovina.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha inhibina es un péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 1-29 de la secuencia N-terminal de la subunidad alfa de inhibina.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha composición contiene un adyuvante para emulsión.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha inhibina se conjuga con una proteína de soporte.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha proteína de soporte es hemocianina de lapa de cerradura (KLH).
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha inhibina se conjuga con dicha proteína de soporte con glutaraldehído.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha conjugación se realiza a una relación de inhibina/KLH de 1:40.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la especie es una especie de mamífero.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la especie es la oveja.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la especie es una especie de ave de corral.
13. Una composición para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, que comprende:
(a)
inhibina o un fragmento de la misma, estando presente dicha inhibina en una cantidad del intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 microgramos por dosis;
(b)
una proteína de soporte para la conjugación con dicha inhibina; y
(c)
un adyuvante para emulsión.
14. La composición de la reivindicación 13, en la que dicha inhibina está presente a una concentración en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 microgramos por dosis.
15. La composición de las reivindicaciones 13 ó 14, en la que dicha inhibina es una inhibina bovina.
16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicha inhibina es un péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 1-29 de la secuencia N-terminal de una subunidad alfa de inhibina.
17. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en la que dicha inhibina se conjuga con una proteína de soporte.
18. La composición de la reivindicación 17, en la que dicha proteína de soporte es hemocianina de lapa de cerradura (KLH).
19. La composición de la reivindicación 18, en la que dicha inhibina se conjuga con dicha proteína de soporte con glutaraldehído.
20. La composición de la reivindicación 19, en la que dicha conjugación se realiza a una relación de inhibina/KLH de 1:40.
21. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en la que la especie es una especie de mamífero.
22. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 13-21, en la que la especie es una oveja.
23. Un procedimiento para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a la especie una composición que contiene una cantidad eficaz de inhibina o un fragmento de la misma, estando dicha cantidad eficaz en el intervalo de aproximadamente 0,31 microgramos a aproximadamente 4,6 microgramos por kilogramo de la especie por dosis.
24. Una composición para aumentar la producción de una especie útil desde el punto de vista agrícola, que comprende:
(a)
inhibina o un fragmento de la misma, estando presente dicha inhibina en una cantidad del intervalo de aproximadamente 0,31 microgramos a aproximadamente 4,6 microgramos por kilogramo de la especie por dosis;
(b)
una proteína de soporte para la conjugación con dicha inhibina; y
(c)
un adyuvante para emulsión.
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