JPH01500900A - ヘモグロビン高分子複合体、その調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫学的去勢および卵巣　除去に用いる組成物および方法 この発明は、雄の家畜の社会的および性的行動の抑制並びに雌の家畜の排卵およ び発情周期性の抑制、さらに詳しくは免疫学的去勢および卵巣　除去に用いる組 成物および方法に関する。

雌動物の正常な性的行動はアンドロゲンまたは雄性ホルモンにより維持され、こ れらは主に精巣で産生される。主なアンドロゲンの１つはテストステロンである 。農家の場合、外科的去勢により家畜の性的行動を排除し、それらの攻撃的習性 を弱める方法を採ることが一般的である。しかしながら、外科的去勢には幾つか の不都合な問題が伴う。これらには出血、感染およびストレス関連性体重減少が 含まれる（シャンバッヘル、１９８４年）。さらに、去勢により、成長速度およ び非脂肪組織沈着速度の両方が低下する（ロパートラン等、１９７０年）。

外科的去勢に代わる方法は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以後、ＬＨＲＨと して示す）またはその類似体に対する能動免疫処置である。ＬＨＲＨは視床下部 から下垂体門脈中に放出される。ＬＨＲＨは下垂体前葉のゴナドトロピンに結合 して黄体形成ホルモン（ＬＨ）の分泌および放出を刺激すると考えられている。

ＬＨは精巣のライジヒ細胞に作用してテストステロンの産生を増加させる。ＬＩ （ＲＨに対する能動免疫処置により視床下部および下垂体間の連絡は断たれる。

ＬＨＲＨに対する抗体が生殖機能を阻害し得る部位は下垂体の門脈血管に存する と考えられる（シャンパッヘル、１９８４年）。

ＬＨＲＨに対して能動免疫処置を行うと、下垂体前葉の機能および形態に著しい 変化が生じる。この結果、ラット（コック、１９７７年、フレーザー等、１９８ ２年）、うさぎ（アリムラ等、１９７４年）およびさる（チャッペル等、１９８ ０年）を含む幾つかの動物種では下垂体の重量、ゴナドトロピン含有量およびＬ ＨＲＨ結合が低下する。さらに、テストステロンの分泌が減少し、精巣が退縮す る（ラット、フレーザー等、１９８２年、マーモセットモンキー、ホラジスおよ びバーン、１９７７年、雌羊、シャンバッヘル等、１９８２年、シェフコート等 、１９８２年、雄牛、ロバートランおよびその他、１９７９年、１９８１年、１ ９８２年、１９８４年）。

ＬＨＲＨに対して能動免疫化された雄牛における生体重増加速度は早期去勢牛よ りも著しく速い（ロパートラン等、１９８２年）。また免疫去勢牛は、早期去勢 牛よりも有効に食物を変換し、ドレッシング・アウトのパーセンテージが高く、 屠体の脂肪が少なく、き甲（ｗｉｔｈｅｒｓ）の高さが短く、胴まわりが細い（ ロバートラン等、１９８２年）。

ＬＨＲＨに対する能動免疫化に充分応答する雄の子牛は、ゴナドトロピン（シェ フコート等、１９８２年）およびテストステロンの分泌低下を示し、また精巣サ イズの縮小を呈する（ロノ（−トランおよびその他、１９７９年、１９８１年、 １９８２年、１９８４年）。行動の主観的評価から、免疫去勢牛は（非去勢）雄 牛よりも従順で扱い易い早期去勢牛の方に似ていると思われる（ロバートランお よびその他、１９７９年、１９８１年、１９８２年、１９８４年）。免疫化され た雄牛を発情期の雌牛または人工のちっと接触させると、高い抗体力価を有する ５頭の動物中３頭は乗駕を試みなかったが、他の２頭は乗駕を試み、これらのう ち１頭は射精に至った（ロバートラン等、１９８２年）。進行中の研究において 、ロバートラン等（１９８４年）はＬＨＲＨに対する免疫化に充分応答した動物 を非免疫中と比較し、乗駕、ヘッディングおよびリッキング（なめること）およ び動きに関して免疫去勢動物は（非去勢）雄牛よりも活動性に劣ることを発見し た。

ＬＨＲＨに対する能動免疫処置は、維手における排卵および発情を抑制しくクラ ーク、フレーザーおよびマクネイジー、１９７９年）、兎（アリムラ等、１９７ ３年）、ハムスター（デ・う・クルス等、１９７６年）およびラット（フレーザ ーおよびベーカー、１９７８年）において生殖腺萎縮を起こすことが報告された 。

羊におけるクラーク等（１９７８年）、ラットにおけるフレーザー等（１９７４ 年）およびアカゲザルにおけるマコーマック等（１９７７年）の試験では、抗Ｌ ＨＲＨ処置の結果、血しょうＬＨ濃度の著しい低下が起こった。すなわ課抗ＬＨ Ｒ）（処置は血しょうＬＨ濃度および生殖腺機能に対して雌にも雄の場合と同様 の効果を及ぼすと思われる。高いＬＩ（ＲＨ抗体の証拠を示す維手は無排卵であ り、連続２季節において発情周期性を示さなかったので、クラーク等の試験（１ ９７８年）は特に関連性を示している。

ＬＨＲＨに対する能動免疫処置は雄の子牛および他の動物に成果をもたらしたが 、それらの免疫応答において個々の動物の間にかなりの変動があった。殆どの試 験では、Ｌ）（ＲＨに対して免疫された雄の子牛のうち、高い抗体力価を有する 処置に充分応答したのは約半分に過ぎなかった。これは１２週令（ロバートラン およびその他、１９７９年、１９８１年）、２０週令（ロバートラン等、１９８ ４年）および２８週令（ロバートラン等、１９８２年）の時点で免疫化された雄 の子牛について報告されたものである。シェフコート等（１９８２年）は１か刃 金の雄の子牛にＬＨＲＨに対する能動免疫処置を行い、抗体力価は動物に２回の 免疫原注射を行った後上昇したが３度目の注射後には下降し始めたことを報告し た。この結果抗体力価の回復に４度目の注射を必要とした。

抗原刺激に対する免疫応答の欠乏現象は文献に詳述されている。例えば、バーバ ートによる（１９７６年）「ベテリナジー・イミュノロジー」に関する教科書で は、「一般に、ワクチン接種集団の構成員に見出される抗体力価は、統計的正常 曲線、高い力価を有する少数の動物および一切応答しない別の小群に分配される 」と１９９−２００頁に述べている。別の節では、「かなり多数について（抗原 により）試験した場合、ワクチン接種された動物の中には非保護状態であるもの もあった。技術の誤りはこれらの幾つかの説明となり得るが、その他については 、何度抗原を投与しようと、またそれらにおいて免疫を刺激するために他のいか なる手段（すなわちアジュバントの使用）を採ろうと、免疫保護状態を全（達成 し得ない」と述べている。

ＬＨＲＨは９個のアミノ酸から成る小ペプチドである。免疫学分野では、小免疫 原では宿主に注射された場合不充分な免疫応答しか引き出せないことが充分確立 されている。従って、上記の各試験では、Ｌ）（ＲＨを一特定担体蛋白質、例え ばひと血清アルブミンに化学的にコンジュゲートした。

驚くべきことに本発明の出願人らは、ＬＨＲＨまたはＬＨＲＨの類似体に２種ま たはそれ以上の異なる担体を結合させた組み合わせにより動物を免疫化すると、 相乗的相互作用が起こることを発見した。（複数の）担体とコンジュゲートした ＬＨＲＨまたはＬＨＲ）（の類似体の組み合わせは、単一担体にコンジュゲート したＬＨＲＨまたはＬＨＲＨの類似体を投与した場合よりも高比率の動物におい て有効な免疫応答（抗体力価に関して測定）を引き出す。

この発明の一態様によると、ＬＨＲＨまたはその類似体に特異的な抗体の動物に おける産生を目的とする組成物であって、２種またはそれ以上の異なる担体をＬ ＨＲＨまたはＬＨＲＨの類似体に個々に結合させて成る組成物が提供される。

ＬＨＲ）（の類似体は、ＬＨＲＨの天然配列に付加、削除、修飾または変形が為 されたペプチドである。天然配列に対する変形には、ＬＨＲＨのアミノまたはカ ルボキシ末端への１個またはそれ以上のアミノ酸の付加がある。

この発明の範囲内に含まれる家畜の種類には、畜生、羊、やぎ、猫、モルモット 、豚、犬、トナカイ、馬および女性を含む霊長類がある。

有用な免疫原であるタイプの担体であればすべて使用され得る。好ましくは担体 情蛋白質であり、さらに好ましくは蛋白質は水溶液に可溶性であるが、沈澱蛋白 質も使用され得る。

好ましい蛋白質の例には、ジフテリア・トキソイド（ＤＴ）、ひと血清アルブミ ン（ＨＳ　Ａ）、スタフィロコツカス・プロテインＡ（Ｐ、Ａ、、）、キーホー ル・リンベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびテタヌス・トキソイド（ＴＴ） がある。

一般的に、２種またはそれ以上の異なる担体の組み合わせが使用され得る。好ま しくは担体はＨＳＡおよびＰ、Ａ、またはＫＬＨおよびＴＴのような蛋白質であ り、これらの蛋白質の各々はＬＨＲＨにコンジュゲートされる。しかしながら、 特に好ましいのは、ＬＨＲＨに結合され、別々に動物に投与された各担体が総じ て良好な力価応答を引き出す２種またはそれ以上の担体である。特に好ましいの は、担体の一つがジフテリア・トキソイド（ＤＴ）である組成物である。

この発明で使用され得る他の担体には、リボ多糖類、多糖類、グリコペプチド類 、ムラミルペプチド類似体、ペプチドグリカン［細菌細胞壁からコ、リポソーム 、レシチン様物質、および細菌蛋白質、例えばツベルクリンからの精製蛋白質誘 導体がある。

ＬＨＲＨおよびＬＨＲＨの類似体と様々な担体とのコンジュゲートには常用の技 術が使用され得る。例えば、ヘテロ２機能剤、例えば５ＰＤＰ（ファルマシア、 ビスキャタウェイ、ニューシャーシー）、カルボジイミド・、グルタルアルデヒ ドまたはビオチン／アビジン系が有用である。担体との結合時にＬＨＲＨまたは ＬＨＲＨの類似体をその生物活性立体配座に維持するような条件が一般的に選択 される。

好ましくは組成物はアジュバントを含む。使用され得るアジュバントの例には、 水酸化アルミニウム、フロインド不完全アジュバント、フロイント完全アジュバ ント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびポリＡ１ポリＣまた はポリＵがある。アジュバントとして特に好ましいのは局所炎症を起こさない物 質である。かかる物質の一例は、細菌細胞壁物質例えばペプチドグリカン、また は前記細胞壁物質の合成誘導体を含む鉱油組成物である。かかる合成物質はムラ ミルジペプチドとして知られている。

組成物は、所望により緩衝剤例えばトリス−ＭＣＩ２．ヘペス、ピペスまたは他 の適当な緩衝剤を用いて生理学的ＰＨに緩衝化され得る。

この発明の別の態様によると、°家畜の雄の社会的および性的行動の抑制方法で あって、家畜への組成物の投与を含み、前記組成物がＬＨＲＨまたはＬＨＲＨの 類似体に個々にコンジュゲートされた２種またはそれ以上の異なる担体を含むも のである方法が提供される。

別の態様は、前記組成物を投与することによる雌の家畜の排卵および発情周期性 の抑制方法に関する。

投与は非経口、例えば皮下および／または筋肉内もしくは静脈内注射、経口また は皮膚を通しての吸収または動物内に内植もしくは動物の外側に付着させたミニ ポンプによる吸収であり得る。

牛馬の場合、雄の子牛を好ましくは８〜４０週令の間に組成物により免疫化する 。早馬の場合、雄の子羊を好ましくは８〜２４週令で免疫化する。ブースター注 射を好ましくは８適間隔てて行い、好ましくは１〜３回のブースター注射を施す 。

この発明の前記方法において、この方法の範囲内には、個々の担体に結合させた 物質（例、Ｉ、’ＨＲＨ）の投与は個別であるが、投与は比較的短い間隔の時間 に亙って行われる処置が含まれる。

少なくとも２種の担体に結合した物質の単一投与と比べて明らかに不都合ではあ るが、通常数分または数時間の期間をおいて行うと満足すべき結果をもたらす。

この発明は、愛玩動物または家畜、特に猫および犬の免疫去勢および卵巣除去に おいて特別の用途を有する。獣医により行なわれる常用の外科的処置は費用が高 くつき、しばしば対象となる動物およびその所有者に外傷をもたらし得る・また 、ＬＨＲＨまたはＬＨＲＨ類似体以外の免疫応答を引き出す他の物質を少なくと も２種の異なる担体にコンジュゲートし、続いてこれらのコンジュゲートの組み 合わせを動物に投与する場合に応答する動物の比率の増加が起こり得る。免疫応 答を引き出す前記物質の例には、ペプチドおよび蛋白質、例えば副腎皮質刺激ホ ルモン、物質Ｐ１ヒトじゅう毛膜生殖腺刺激ホルモン、ソマトスタチン、表皮お よびインシュリン様成長因子、ステロイド類、例えばアンドロステンジオン（フ ェクンジン）、テストステロンおよび他の物質例えばメラトニンおよびプロスタ グランジンがある。

この明細書の記載において、次の語は下記の意味を有する。

ＬＨＲＨ・・・黄体形成ホルモン放出ホルモンは、脳下垂体線部から分泌される 黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンを刺激するのに必要な特定物質である 。

担体・・・小物質に結合したとき動物に対して免疫応答を引き出し得る物質であ ればよく、特に蛋白質である。

抗体力価・・・４℃で１６時間０．１５ｎＣｉ”Ｉ−標識ＬＨＲＨの５０％を結 合する抗血清の希釈度。最終濃度１４．５％のポリエチレングリコールを用いて ガンマグロブリンの沈澱を達成した。

ＤＴ・・・ジフテリア・トキソイド。

ＨＳＡ・・・ひと血清アルブミン。

ＫＬＨ・・・キーホール・リンベット・ヘモシアニン。

ＴＴ・・・テタヌス・トキソイド。

ＣＰ・・・コリネバクテリウム・パルブム。

Ｐ、Ａ、・・・スタフィロコッカス・アウレウスからのプロティンＣａｒｂ・・ ・ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド。

Ｇｌｕｔ・・・グルタルアルデヒド。

以下、実験手順、実施例および表を示しながら単なる例によりこの発明に関する 記載を行う。

第１図および第２図は、雄の子羊および雄の子牛のそれぞれの様々な処置群に対 してグラフ化した抗体力価（対数目盛り）を示す。第３図および第４図は、コリ ネバクテリウム・パルブム（ＣＰ）、キーホール・リンベット・ヘモシアニン（ Ｋ　Ｌ　Ｈ）、ジフテリア・トキソイド（ＤＴ）、テタヌス・トキソイド（ＴＴ ）およびＬＨＲＨに結合したこれらの担体（第４図ではＣＰ、ＫＬＨ，ＤＴおよ び第３図ではＫ　Ｌ　ＨｌＴＴおよびＤＴ）の組み合わせを用いた場合における 雄の子羊の平均精巣体積を示す。

（Ａ）実験手順 １、ＬＨＲＨコンジュゲートの製造。

（ａ）テタヌス・トキソイド−ＬＨＲＨＬＨＲＨ（２４０ｇｇ）おヨヒテタヌス ・トキソイド（３５，５ｄ、２４８ｍ９）を２０ｘＱの蒸留水に溶かし、混合物 のｐ）（を０．ｌＮ−ＮａＯＨにより６，０に調節した。２１１２の蒸留水に９ 　、４　ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ド塩酸塩（ＥＣＤＩ）を含む新たに調製した溶液を滴下し、反応を一夜室温（２ ２℃）で続行させた。溶液を３交換の食塩水（５リツトル）に対して透析した。

テタヌス・トキソイドに結合したＬＨＲＨのモル数を評価するために、３ｎＣｉ の１３１■標識ＬＨＲＨを反応混合物中に加えた。この手順を用いると、広範な 透析前後において溶液中の”’Ｉ　−ＬＨＲＨの量を数えることにより担体蛋白 質との標識ＬＨＲＨの明白な結合の測定が可能である。この実施例では３９モル のＬＨＲＨが各モルのテタヌス・トキソイドに結合していた。

（ｂ）グルタルアルデヒド結合方法を用いるＬＨＲＨ−テタヌス・トキソイド免 疫原の製造。

１０ｊ！９量のＬＨＲＨおよび１２００μＱ（１３，６ｍ９）のテタヌス・トキ ソイドを３４ｘＱの水に溶かし、０．１モルのＮａＯＨを加えて最終ｐ）（を８ ．０とした。次いで、グルタルアルデヒド（４ｚＱの２５％ｖ／ｖ）を滴下し、 反応を２５℃で１８時間続行させた。溶液を（ａ）の記載と同様に透析した。

透析前後の”’Ｉ−ＬＨＲＨ活性を算出すると、テタヌス・トキソイド１モル当 たり３８モルのＬＨＲＨの値が得られた。

（ｃ）カルボジイミド結合方法を用いるＬ）ＩＲＨ−プロティンＡ免疫原の製造 。

ＬＨＲＨ（１０ｘ（１（１）水中１０ｍｇノｆｆ１）を５ｏｏμｃのプロティン Ａ（５０ｘｙ）および１０πＱの蒸留水に加えた。０．０１モルのＮａＯＨまた はＨＣｌ２によりｐ）１を６．５に調節し、１０ｚｉ２の蒸留水中２００ｚ９の ＥＣＤ　Ｉを加えた。（ａ）項と同様に反応を２５℃で１８時間インキュベーシ ョンした。

プロティンＡへの１″’Ｉ−ＬＨＲＨを取り込みを評価すると、３交換の生理食 塩水に対する透析後ｌ：３６のＬＨＲＨ／プロティンＡ比が得られた。

（ｄ）グルタルアルデヒド結合方法を用いるＬＨＲＨ−プロティンＡ免疫原の製 造。

１０ｕ量のＬＨＲＨおよび５００μｍ２（５０１９）のプロティンＡを３４ｚＱ の蒸留水に溶かし、０．０１モルのＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節した。混合 物に４ｘＱの２５％グルタルアルデヒド溶液を滴下し、溶液を１８時間２５℃で インキュベーションした。３交換の食塩水に対する透析後、（Ａ）項で前述した ヨウ素処理ＬＨＲＨ方法を用いてプロティンＡとＬＨＲＨの結合量を算出した。

結果は明白なＬＨＲＨ／プロティンＡ比が１＝３４であることを示した。

（ｅ）結合試薬としてカルボシイ・ミドを用いるＬＨＲＨ−キーホール・リンベ ット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の製造。

２４ｍ（ｌの蒸留水中１０ｉ９のＬＨＲＨおよび２０ｘｙのＫＬＨに０．０１モ ルのＨＣｌ２を加えて最終ｐ）ｌを６．５とした。次いでＥＣＤ　Ｉ　（２０ｚ ９／ｘＱ溶液１０ｓ＋Ｑ）を混合物に加え、２５℃で１８時間インキュベーショ ンした。（ａ）項と同横に、溶液を３交換の食塩水に対して透析した。上記溶液 に１！’Ｉ−ＬＨＲＨを加えると透析後に１　ニア　５０のＬＨＲＨ／ＫＬＨモ ル比を示した。

（ｆ）結合剤としてグルタルアルデヒドを用いるＬＨＲＨ−ＫＬＨの製造。

５η量のＬＨＲＨおよびｌＯＯ２０ＫＬＨを１２ｘＱの蒸留水に溶かし、０．０ １モルＮａＯＨによりｐＨを８．０に調節した。この混合物に２村のグルタルア ヒド（２５％ｗ／ｖ）を滴下し、溶液を１８時間２５℃でインキュベーションし た。次いで混合物（ａ）項の記載と同様に３交換の生理食塩水に対して透析した 。

溶液に”’Ｉ−ＬＨＲＨを加えると、Ｌ　Ｉ　ＲＨ／Ｋ　Ｌ　Ｈの明白なモル比 は８４９であることを示した。

（ｇ）ジフテリア・トキソイド−ＬＨＲＨｃＬＨＲＨ（２００ｒ９）およびジフ テリア・トキソイド（１３７＋１、２１９ｘｙ’）を１０！Ｑの蒸留水に溶かし 、０．ｌＮ−ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調節した。

２ｚＱの蒸留水に０．６９のＥＣＤＩを含む新たに調製した溶液を滴下し、反応 を室温（２２℃）で−夜続行させた。溶液を３交換の食塩水（５リツトル）に対 して透析した。

（ｈ）コリネバクテリウム・パルブムーＬ）ＩＲＨ。

ＬＨＲＨ（１００ｍ９）およびコリネバクテリウム・パルブム（６０Ｒ９）を５ ｚＱの蒸留水に溶かし、”０．ｌＮ−ＮａＯＨを用いてｐ）（を６．０に調節し た。２Ｊ１１２の蒸留水に０．２９のＥＣＤＩを含む新たに調製した溶液を滴下 し、混合物を室温で一夜インキュベ（ｉ）キーホール・リンベット・ヘモシアニ ン−ＬＨＲＨ。

ＬＨＲＨ（１２０ｇ）およびキーホール・リンベット・ヘモシアニン（８０ｍ９ ）を１０ｘＱの蒸留水に溶かし、０　、　Ｉ　Ｎ−Ｎａ０　Ｈを用いてｐ）（を ６．０に調節した。４Ｈの蒸留水に０．４９のＥＣＤＴを含む新たに調製した溶 液を滴下し、混合物を室温で一夜インキユベーションした。溶液を３交換の食塩 水（５リツトル）に対して透析した。

結合の有効性、すなわち担体蛋白質に結合したＬＨＲＨのモルを評価するため、 ０．１５ｎＣｉ”Ｊ　−ＬＨＲＨを上記混合物に加えた。各反応後、透析の前後 に得られた数値に基づいてパーセント結合”Ｊ−Ｌ）（ＲＨを算出した。一般的 に、結合の有効性は良好であっに０ （Ｂ）結果 実験１ ４２頭のメリノ種の雄の子羊から成る群を試験に使用した。

維手を生体重により選択して６頭の維手から成る７群に分けた。

（しかしながら実験期間に数頭の維手を失った。死因は肺炎であった。）処置を 下記に示す。

［群］ １、去勢されていない維手に担体蛋白質ＫＬＨ，プロティンＡおよびテタヌス・ トキソイドを用いて注射した。

２６　ｌＯ週令の維手に外科的去勢を施した。

３、維手をＬＨＲＨ−テタヌス・トキソイドコンジュゲートに対して免疫化した 。

４、維手をＬＨＲＨ−プロティンＡコンジュゲートに対して免疫化した。

５、維手をＬＨＲＨ−ＫＬＨコンジュゲートに対して免疫化した。

６、維手をＬＨＲＨ−ＨＳＡコンジュゲートに対して免疫化した。

７、維手をＬＨＲＨ−ＴＴ、ＬＨＲＨ−プロティンＡおよびＬＨＲＨ−ＫＬＨコ ンジュゲートに対して免疫化した。

コンジュゲートの注射の用量、組成物および時間を第１表に示す。

各免疫原溶液を等量のフロイント完全アジュバントにより乳化した。次いで雄の 子羊における股間に隣接した後足の４箇所の離れた皮下部位に２ｘ（ｌの混合物 を投与した。合わせた免疫原を８ｊ１１！のエマルジョンを用いて注射した。等 量のフロインド不完全アジュバントを用いてブースター注射を行った。

２回目のブースター注射の２週間後に静脈穿刺により血液試料を採取した。この 実験における抗体力価を第３表に示す。

実験２ 主としてフリーシアン種の３５頭の雄の子牛から成る群を実験に使用した。子牛 に脱脂乳を与え、１０週令目に離乳させて牧草を与えた。選択の基礎として生体 重を用いて雄牛を７動物から成る５群に分けた（実験期間中３頭の雄牛を肺炎に より失った）。処置を下記に示す。

［群］　［処置］ １、去勢していない雄の子牛を担体蛋白質、テタヌス・トキソイド、キーホール ・リンベット・ヘモシアニンおよびプロティンＡに対して免疫化した（ｎ＝６） 。

第１表 免疫原用量およびブースタースケジュール−ＬＥＲＲ（Ｃａｒｂ”）　４００ｐ ｇ　４００ｕｇ　４００ｕｇ　４００ｕ９プロティンＡ− −ＸＪｍｌ　（Ｃａｒｂ）　９００ｕｇ　９００ｕｇ　９００ｓ＋ｇ　９００ｕ ｇ刈」−υ■頃 （Ｃａｒｂ）　９００ｕｇ　９００１Ｊ（Ｊ　９００Ｌ＋９　９００１Ｊ９Ｈ５ 入−ＬＥＲＲ （Ｃａｒｂ）　５００１ｇ　５００ｕｇ　５００ｕｇ　５００ＳＪ９テクヌス・ トキソイド−ｕＵ頃今プロティン入−ＩａＥＩ　＋　ＫＬＥＩ−ＩＪＲ１！＝テ タヌス・トキソイド −Ｉ−ＲＲＨ（Ｃａｒｂ）−４００ｐｇ　４００ｕｇ　４００ｕｇ　４００ｕｇ プロティン　入 −ＬＩＩＲＨ（＋ｊｏｂ）　９００ＩＪｇ　９００ｕｇ　９００ｐｇ　５ｏｏｕ ｉＫＬＥ−誌朋 （Ｃａｒｂ）　９００１ｇ　９００ｕｇ　９００ｕｇ　９００ＩＪ９第１表（つ づき） ｔ！ｉの少年におけるＬ）ＩＲＨ免疫化に関する組成物、免疫原用ｍおよびブー スタースケジュールｌＯ週間　１８週間　２６　週間　３４　週間テタヌス・ト キソイド÷ＫＬＩ！＋プロティン入；テタヌス・トキソイド ４００１ｇ　４００ＳＪ９　＜ＯＯｙｇ　４００ＬＩ９ＫＬＩＩ　４００Ｌ＋９ 　＜ＯＯｕｇ　４００ｕ９　＜００ｐｇ７’ロティ７Ａ　９００Ｌ＋９　９００ Ｍｇ　９００Ｍｇ　９００Ｍｇ２．１４週令の雄の子牛に外科的去勢を施した（ ｎ＝６）。

３、雄の子牛をＬＨＲＨ−ＩＳＡコンジュゲートに対して免疫化した（ｎ＝６） 。

４、−雄の子牛をＬＨＲＨ−テタヌス・トキソイドコンジュゲートに対して免疫 化した（ｎ＝６）。

５、雄の子牛をテタヌス・トキソイド、キーホール・リンペット・ヘモシアニン およびプロティンＡに結合したＬＨＲＨに対して免疫化した（ｎ＝６）。

実験に関する組成物、用量および免疫化スケジュールの概略を第２表に示す。

免疫化手順として、等量のフロイント完全アジュノ（ントを用いて免疫原溶液を 乳化した。個々の処置群全部において合計２ｍＱのエマルジョン溶液を４−５部 位に注射した。組み合わせた免疫原群については、雄の子牛において４−５部位 に８１Ｑのエマルジョン溶液を注射した。子牛の前肩および胸部付近に皮下注射 を行った。ブースター注射の場合フロインド不完全アジュバントを用いて免疫原 を乳化した。２回目のブースター注射の２週間後に血液試料をヘパリン凝血防止 容器中に集めた。この実験における抗体力価を第４表に示す。

試験を発展させて雄牛の社会的および性的行動の研究を行った。この試験では、 各々の雄の子牛を個々に非発情期の雌に１５分間曝し、動物の社会的および性的 行動を観察し、記録した。

この試験の結果を第５表に示す。

第２表 生後 （１４３１１間　）（２２ａ間）（３ｏ週間　）（３８週間　）−ＩＪｒＲＥ　 （Ｃａｒｂ）会　３６０Ｍｇ　２ｏｏｕｑ　２ｏｏｕ９　ｓｏｏｕｇ−ＬＥＲｌ ｌ　（Ｇｌｕｔ）会費　３６０Ｍｇ　２００Ｍｇ　２００Ｍｇ　５ｏｏｕｖＫｒ Ｊ　−Ｗ −（Ｃａｒｂ）　３６０Ｍｇ　２００Ｍｇ　２００１Ｊｇ　ｓｏｏｗ−（Ｇｌｕ ｔ）　３６０ｓ＋ｇ　２００ｓ＋９　２００１ｇ　５００１Ｊ９プロテインλ −ｒＪ１’ｌ！Ｉ（Ｃａｒｂ）　９００Ｍｇ　６５０ｕｑ、　６５０＄１９　１ ｓｏｏｕ９−ＬＩＩＩＲＩ！（Ｇｌｕｔ）　９００Ｍｇ　６ＳＯｕｇ　６５０Ｍ ｇ　１５００ｐｇＴ１Ｓ入−ＩＪＲ１！ −（Ｃａｒｂ）　３ｓｏｕ９　２００Ｍｇ　２ｏｏｕｇ　５ｏａｐｙ−（Ｇｌｕ ｔ）　３５０Ｓ１９　２００ＳＩ９　２００Ｍｇ　５００ｕ９テタヌス・トキソ イＦ　、＃！Ｊ期＋ＫＬＨ−ｗｙ　＋　フロティンＡ−ＩＪＩＭ　：テタヌス・ トキソイド 一′ｒｘＲＢ（Ｃａｒｂ）　３６０Ｍ　２００Ｍｇ　ｚｏｏｕ９　５００１１９ イロ頃（Ｇｌｕｔ）　３６０＄＋９　２００Ｍｇ　２００Ｍｇ　５００ｐｇＫＬ ＥＩ　−ｕＲｌＥ −（Ｃａｒｂ）　３６０ｕｇ　２００ｕｇ　２００ｕｇ　５００ｕ９−（Ｇｌｕ ｔ）　３６０ｐｇ　２００ｕｇ　２００ｕｇ　５００ｕｇプロティン入 −ＴＸＭ（Ｃａｒｂ）　９００９９　６５０ｕｇ　６５０ｕｇ　１５００ｐｇ− ！ＪＲＨ（Ｇｌｕｔ）　９００ｕｇ　６５０ｕｇ　６５０ｐｇ　１５００ｐｇテ クヌス・トキソイド十訂１＋ブ。ティン・入：テタ５７．−トキソイド３６０ｕ ｑ　ｚｏｏｕｇ　ｚｏｏｕ９　５ｏｏｕｑ−ＫＩＪＩ　３６０１１９　２００ｕ ｇ　２００ＳＪ９　５００１４９−７ｏｆ＜：ｚＡ　３６０ＳＩｇ　２００ｐｇ 　２００１ｇ００ＩＪｇ ”　カルボジイミドをＬＨＲＨと担体蛋白質の結合Ｉこ使用。

會會　グルタルアルデヒドをＬＨＲＨと担体蛋白質の結合に使用。

う 第５表 ２回目のブースター注射後の雄牛の社会的および性的行動におけるＬＨＲＨに対 する免疫化の効果処置 試験の所要時間の パーセンテージ　未去勢　去勢　組み合わせ　ＴＴ　ＨＳＡ非攻撃性の社会的 一性的相互作用　１．０１　０．３１　０．６１　０．６８　１．４１性的相互 作用　０．６１　０．０９　０．３９　０．４８　０．９０社会的および性 的調査　０．７２　０．３１　０．３５　０．４６　０．７０攻撃的相互作用　 １．４３　３．８３　３．３３　２．８０　３．５０様々なＬＨＲＨ−コンジュ ゲートおよびそれらの組み合わせによりそれぞれ免疫化した雄の子羊および雄の 子牛に関して第３表および第４表に示した抗体力価を第１図および第２図にグラ フ化する。

第１図では、予想通り、担体蛋白質のみで免疫化した雄の子羊の中で測定系にお いて免疫応答を示した子羊は無かった。単−ＬＨＲＨコンジュゲートにより免疫 化した子羊の場合、抗体力価および応答した動物数の両方に変化のある結果が得 られた。

ＫＬＨの場合、４０％の動物しか応答しなかった。この応答の平均力価は１：１ ３０である。プロティンＡの場合も同様の結果が得られたが、６６％の試験動物 が免疫応答を示しく実験中２頭の動物が肺炎により死亡した。）、この応答の平 均力価は１：１３０であった。テタヌス・トキソイド（ＴＴ）の場合に単一コン ジュゲートによる最善の結果が得られ、６０％の動物が免疫応答を示し、平均力 価は１　：２２００であった。

ＬＨＲＨ−ＴＴＳＬＨＲＨ−プロティンＡおよびＬＨＲＨ−ＫＬＨコンジュゲー トの混合物による免疫化に関して得られた結果はこの発明の有効性を示している う試験された子羊の全部は１：５１４６の平均力価を有する実質的免疫応答を示 し、個々の抗体力価は１　：６００〜１：２００００の範囲で変動していた。こ れらの結果は、単−ＬＨＲＨ−コンジュゲートを用いて得られた結果よりも明ら かに好ましく、統計的に有意に優れている（応答動物の比率のＸ″試験おいてｐ ＜０．０５）。

上記と同じ統計的有意性を含む同様の結果を第２図に示す。

第２図において、テタヌス・トキソイド、キーホール・リンベット・ヘモシアニ ンおよびプロティンＡと結合したＬＨＲＨの混合物により免疫化した雄の子牛は １：Ｉ７０の平均力価を有する良好な免疫応答を示し、これは単一担体蛋白質と 結合したＬＨＲＨにより得られた結果と対照的であった。

第５表に示された行動データは、対照動物が、去勢、組み合わせ（ＬＨＲＨをＫ ＬＨ，ＴＴおよびＦＡに個々に結合）およびテタヌス・トキソイド（ＴＴをＬＨ ＲＨに結合）による処置を受けた動物よりも社会的および性的行動並びに社会的 および性的調査において多くの時間を要することを示す。予想通り、去勢された 雄は社会的および性的行動に要する時間が最も短かった。

組み合わせ処置を受けた雄牛が社会的および性的行動に必要とする時間は去勢動 物の場合よりも多かったが、対照動物の場合よりは少なかった。これは、ＬＨＲ Ｈに対する能動免疫処置が雄牛の社会的および性的行動に影響を与え得ることを 示す。対照動物の場合去勢動物または組み合わせ処置動物よりも攻撃的相互作用 に要する時間は少なかったが、敢えて記すれば、この特性は去勢動物および組み 合わせ群の動物の場合と類似していた（従順な試験動物が攻撃的相互作用を伴い 得ることは可能である）。また、このことは、免疫化が攻撃性に影響を与え得る ことを示す。テタヌス・トキソイド−・Ｌ、ＨＲＨおよびＨＳＡ−ＬＨＲＨコン ジ二ゲートの注射を受けた動物の場合よりも組み合わせ処置を受けた動物の行動 に対して大きな影響があったことは明らかである。

実験３ ５箇月令のメリノＸコリゾール種の子羊８０頭から成る群をこの実験で使用した 。子羊（１６週令）を各々１０頭の子羊から成る８群に分けた。１群には１６週 令で外科的去勢を施し、別の１群については未去勢動物として残した。残りの６ ０頭の子羊に幾つかのＬＨＲＨ抗原処置を行った。

様々なＬＨＲＨ−担体蛋白質コンジュゲートを前記と同様に製造した。使用した 抗原は、それぞれジフテリア・トキソイド、テタヌス・トキソイド、キーホニル ・リンペット・ヘモシアニンおよびコリネバクテリウム・パルブムと別々に結合 したＬＨＲＨであった。他の２群には各ＬＨＲＨ複合体の２種の相異なる組み合 わせを注射した。使用したコンジュゲートの合計量と共に、処置を第６表に示す 。子羊の首にフロイント完全アジュバントを用いた前記単−ＬＨＲＨ担体蛋白質 の皮下注射を行った。

ブースター注射の８週間後金動物にペン試験を実施してそれらが性的に活性であ るか否かを測定した。この試験では、アレーナ（５１Ｘ５１）中で各雄を４頭の 発情期の雌と１５分間合わせ、雄により示された上部生殖器（ａｎｏｇｅｎｉｔ ａｌ）ＦＪ査の反応、求愛行動ノ発生、乗駕の数および射精の数を記録した。６ 頭の雄を同時に観察し、全動物を同じ日に観察した。ペン試験前の１２時間動物 を試験アレーナに閉じ込めて試験状況に馴染ませた。試狭巾に乗駕および／また は射精した動物を性的に活動性であるとみなした。

第６表 Ｌ’＝意および用量割合 １　１０　対照 ２　１０　去勢 ３　１０　ゴミ−（耐　１円 ４　１０　圧四−【Ｎ］　１■ Ｓ１０　ゴミ−【０１　１■ ７　１０　圧器−π◆誌四−１十庄囲−口　３■８　１０　部器−扉◆鮒：Ｈフ ＋＝−口　３３第Ｙ表 対照、去勢動物および処置された少年における生体重の変化対照　４０．７　５ ４．２　４８．４　５１．０　２１０．０去勢　４０．６　４９．６　４３．１ 　４６．４　−Ｌ）ＩＩＲＨ−Ｔｒ　３９．２　５４．２　４５．４　４７．５ 　？４６ｊＬＦＥ！ＩＨ−ＤＴ　３９．３　５３．９　４５．６　４８．７　Ｂ ３．３ｍ−（？　３９，３　５５．８　４６，８　４９．３　Ｉ７１．０Ｌｈｉ ２）１−ＫＬ）Ｉ　３１！、フ　５５．３　４６．３　４Ｌフ　１５３．３Ｌ） ｉｄ−Ｔ丁＋ＤＴ＋ＫＬＨ３Ｂ、°３　５４，７　４６．５　４ｇ、６　フ１． ０ＬＦＲＨ−ＤＴ＋Ｇ’＋ＫＬＨ３Ｂ、７　５５．５　４４．９　４Ｌ６　５５ ．０生体重および精巣サイズを（一連の測定用ビーズを用いて測定）４週間毎に 測定した。

放射線免疫検定法（ＲＩ　Ａ）およびＥＬＩＳＡ技術の両方によりＬＨＲＨに対 する抗体力価を測定した。血しょう試料をりん酸緩衝液（０，０５モル、ｐＨ７ ，６）により系列希釈した。希釈試料（１００μＱ）を１００μＱのうしガンマ グロブリン（３％９ｖ／ｖ）および１００μ５の２ｎＣｉ”Ｊ−！、ＨＲＨ含有 緩衝液に加えた。管を４℃で一夜インキュベーションした。１１１Ｑの２１％ポ リエチレングリコール４０００を加え、遠心分離後上清を吸引することにより、 遊離および結合Ｌ）（ＲＨを分離した。

１分間クリ二ガンマカウンターで管の計数を行った。

全子羊の生体重を第７表に示す。群の間に著しい差異は無かったが、免疫化され た子羊の平均生体重値は去勢された雄よりも高く、対照子羊よりも低かった。各 処置における平均精巣体積を第８表並びに第３図および第４図に示す。

各抗原処置に関してかなりの変動があった。個々の担体における最大の減少がジ フテリア・トキソイドと結合したＬＨＲＨに対し免疫化された子羊において観察 された。次に優れた担体はテタヌス・トキソイドであり、°次いでキーホール・ リンペット・ヘモシアニンおよびコリネバクテリウム・パルブムであった。３種 の別々の抗原の２種の相異なる組み合わせは個々の抗原の各々よりも低い試験値 をもたらした。

結果的に同様の傾向がＲＩＡ結果においても観察された。力価の中央値は組み合 わせ抗原を用いた２群において最高であり、ホール・リンペット・ヘモシアニン 、コリネバクテリウム・パルブムであった。ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ　ＩｇＧ結 果をそれぞれ第９表に示す。

第３表 対照　１６０．０　１６ｇ、０　１１１３．５　１８７．０　２１０−０去勢　 −−一一− ＬＫ’ＪＩ−Ｔｒ　１５５．０　１３５．６　１０＋１．３　１１１．１　１４ ＆、ｔＬＨＲＨ−１１ｙｒ　１５０．０　１０１．フ　？３．３　５９．１　Ｂ ３．３Ｌ）ＩＰＪ（−Ｇ’　−１４４，０１４９，５１６２Ｊ　１７０．５　１ ７１．０比四−ＫＩＪｉ　１５３．３　１３３．５　１３６．１　１２７．２　 １５１．３ＬＨ只）！−ＴＴ＋ＤＴ＋ＫＬＨ１３Ｂ、９−　！１１．１　６２． ２　５６．０　？１．０ＬＨ２Ｈ−ＤＴ＋Ｇ’＋ＫＬＨ１４１，１７７，５６７ ，１４１１，３５５，０ヘヘｆＮＮＩＮＮＮ（ＮＭ　ＭＰＩｆ’ＩＭＦ’１ＭＭ Ｐ’ｌｆＱ　＃！啼？七つ 網 法 第１０表 は射もフした動物の比率に対する効呆 処置群　乗駕および／すたは射精した動物の比率ゴミ−ＴＴ　２７ｇ ゴ四圧四７　１１ｇ Ｌ」仁ジ４−Ｑ’５７タ 圧四−口　３／１゜ ＬＦａ）ｆ　−Ｔフ゛＋　ＤＴ　＋　ＫＬＨＯ／１０庄四−ば十Ｇ＋瑯　０／１ 一般に、高いＲＩＡ力価を有するそれらの子羊はＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定による測定 と同様に高い力価を有していた。しかしながら、個々の子羊では矛盾がみられ、 場合により低いＩｇＧ力価を有する試料において高いＲＩＡ力価が認められるこ ともあった。

これらの結果は、ＲＩＡ測定の方がさらに特異的なＩｇＧ　ＥＬＩＳＡ検定より も多数の抗体サブクラスをモニターしていることを示す。

ブースター注射の２箇月後に性的活動性であった各群における子羊の比率を第１ ０表に示す。対照群における合計１０頭の子羊のうち１０頭が性的活動性を示し た。性的活動性を示す９頭の子羊のうち１頭について最善の単一抗原はジフテリ ア・トキソイドであった。有効性の序列は、ジフテリア・トキソイド、ンおよび コリネバクテリウム・パルブムであった。組み合わせ抗原を用いた２群は性的活 動性を示さなかった。Ｌ）ＩＲＨとＴＴ、ＤＴおよびＫＬＨを結合した組み合わ せを与えた前記千羊の場合、合計１０頭の子羊のうち活性を示した子羊は無かっ た。

担体、ＤＴ、ＣＰおよびＫＬＨの相異なる組み合わせを用いると同様の結果が得 られ、やはり合計８頭（２頭の子羊は試験中に死亡した）の子羊のうち活性を示 した子羊は無かった。去勢された子羊のうち性的活動性を示した子羊は無かった 。

これらの結果は、様々な担体蛋白質の組み合わせが個々の抗原を別々に与えた場 合よりも優れた生理学的応答をもたらすことを示している。この効果は精巣サイ ズ、ＲＩＡ力価および性的活動性を示した動物の比率において観察された。これ らの結果全体は、ＬＨＲＨ抗原の組み合わせが個々の抗原の場合と比べて良好な 免疫応答をもたらすことを示している。

この発明の他の態様並びにその修正および変形は、当業界の熟練者がこの明細書 を読めば明らかなものであり、かかる他の態様並びにその修正および変形はすべ てこの発明の範囲内に含まれるものと考えられる。

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処置鮮 第１図 雄の小中における抗体力価 処２２ｎ 第２図 最初の注射後からの時間（月） 最初の注射後からの時間（月） 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＬＨＲＨに対して特異的な抗体の動物における産生を目的とする組成物で あって、ＬＨＲＨに対する免疫応答を引き出すのに充分な量で、ＬＨＲＨまたは ＬＨＲＨの類似体に個々に結合した２種またはそれ以上の異なる担体を含んで成 る組成物。
2. （２）少なくとも２種の担体が担体蛋白質である、請求の範囲第１項記載の組成 物。
3. （３）担体蛋白質の少なくとも１種がジフテリア・トキソイドである、請求の範 囲第２項記載の組成物。
4. （４）組成物がさらにアジュバントを含む、請求の範囲第１−３項のいずれか１ 項記載の組成物。
5. （５）組成物が炎症の原因とならないように選択されたアジュバントを含む、請 求の範囲第４項記載の組成物。
6. （６）請求の範囲第１−５項のいずれか１項記載の組成物の投与を含む、雄の家 畜の社会的および性的行動の抑制方法。
7. （７）請求の範囲第１−５項のいずれか１項記載の組成物の投与を含む、雌の家 畜の排卵および発情周期性の抑制方法。
8. （８）前記組成物を２回またはそれ以上投与する、請求の範囲第６項記載の方法 。
9. （９）動物がイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ロバ、ウサギおよびシカから選択され る、請求の範囲第６−８項のいずれか１項記載の方法。
10. （１０）担体とコンジュゲートした場合に動物における免疫応答を引き出し得る 物質に特異的な抗体の動物における産生を目的とする組成物であって、少なくと も２種の相異なる担体にコンジュゲートした物質から成る混合物を含む組成物。