CN103041381A - 一种重组抑制素疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组抑制素疫苗，其特征在于：它是由油相制剂和水相制剂按照2:1的体积比混合而成的油乳剂，油相制剂由司本80、司本85和10号矿物油组成，其中含4％的司本80、2％的司本85；水相制剂由灭菌吐温80和重组抑制素α亚基蛋白和无菌蒸馏水组成，所述的重组抑制素α亚基蛋白由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化后获得，水相制剂中重组抑制素α亚基蛋白的含量为0.5~10mg/mL，灭菌吐温80的含量为4％。制备时将油相制剂和备用的水相制剂按照2:1的体积比混合，获得重组抑制素疫苗。应用中对雌性家畜肌肉注射后，通过重组抑制素α亚基蛋白的免疫提高家畜繁殖力。

Description

一种重组抑制素疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抑制素疫苗及其制备方法和应用，涉及一种促进家畜发情及提高家畜繁殖力疫苗及其制备方法和应用，属于动物繁殖学领域。

背景技术

家畜繁殖力的高低直接影响到养殖和畜牧业的经济效益。部分家畜受到夏季高温应激、泌乳、舍饲环境、季节及管理等因素的影响，导致下丘脑-垂体-性腺调节轴的调节机能紊乱，使垂体不能分泌足够的促性腺激素以促进卵泡发育成熟并排卵，致使卵巢处于相对静止状态，而使得其表现为乏情而导致繁殖性能的下降。目前，在实际生产中，多采用外源激素（如促性腺激素、雌激素和前列腺素等）进行处理，以促进母畜卵泡发育并表现发情，然后进行配种使之完成繁殖活动。然而以上三种应用较广泛的激素，其作用机制较简单或作用环节较少，如促性腺类激素只能影响卵泡发育并且因为半衰期短而持续时间较短而对动物受胎率的提高或保持较少，雌激素和前列腺素类则几无促进繁殖活动的功能。因此，动物繁殖研究人员在不断进行研究以开发新颖生殖调控新技术和新产品，希望以较为简单的程序很好地促进性腺活动、发情、配种、胚胎发育、生殖道发育使胚胎着床受胎，从而提高动物的繁殖性能。

大量研究表明，母畜的卵泡发育是由促性腺激素促进的，同时也受到但一些局部调节因子的影响。例如，抑制素（INH）-活化素（ACT）-卵泡抑素（FS）系统是参与卵泡发育调节的重要的卵巢内局部调控因子。排卵前期优势卵泡分泌的大量抑制素（INH）通过负反馈机制抑制垂体FSH的分泌，抑制素和卵泡抑素同时也具有直接抑制小卵泡或后进卵泡的发育。通过主动或被动免疫抑制素中和内源性抑制素的生物活性，则可以一方面促进FSH的分泌，另一方面又去除抑制素对发育中卵泡的抑制或损害。

因此，之前人们的研究发现，主动免疫抑制素后，通过促进卵泡发育促进卵泡分泌更多雌二醇（E2），从而使母畜发情表现更为旺盛，发育良好的卵泡在排卵后转化为高质量的黄体并分泌高水平的孕酮(P4)。发情时主水平的E2影响雌性生殖道内环境，有助于精子的运行和精卵的结合。排卵后黄体发育分泌的孕酮，则进一步通过对子宫内分泌环境的影响，促进胚胎的发育。而且，我们的研究还发现，抗抑制素抗体能够促进体外成熟的卵子使之在受精之后发育为质量更高的胚胎。而以上各方面事件，都有助于提高动物配种的受胎率，也即提高动物的繁殖性能。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能够促进雌性家畜发情及提高家畜繁殖力的重组抑制素疫苗及其制备方法和应用。

本发明的目的是这样实现的：一种重组抑制素疫苗，其特征在于：它是由油相制剂和水相制剂按照2:1的体积比混合而成的油乳剂，油相制剂由司本80、司本85和10号矿物油组成，其中含4％的司本80、2％的司本85；水相制剂由灭菌吐温80、重组抑制素α亚基蛋白和灭菌水组成，所述的重组抑制素α亚基蛋白由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化后获得，水相制剂中含4％的灭菌吐温80。

在本发明中：疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL或1mg/mL或0.5mg/mL或0.25mg/mL。

一种上述重组抑制素疫苗的制备方法，其特征在于：

a) 4％的司本80、2％的司本85与10号矿物油匀浆机上3000rpm混合20分钟，121℃条件下高压灭菌，获得油相制剂，备用；

b)由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化获得重组抑制素α亚基蛋白，将吐温80在121℃条件下灭菌15分钟，取无菌蒸馏水、灭菌后的吐温80以及重组抑制素α亚基蛋白在匀浆机上3000rpm, 20分钟混匀后形成水相制剂，备用；水相制剂中重组抑制素α亚基蛋白的含量为0.5~10mg/mL ，灭菌吐温80的含量为4％；

c) 将备用的油相制剂和备用的水相制剂按照2:1的体积比混合，具体步骤是：先将油相制剂置于匀浆机3000rpm中混匀，混匀过程中逐步加入备用的水相制剂，待全部水相制剂加入后继续混匀20分钟；获得重组抑制素疫苗，该疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL或1mg/mL或0.5mg/mL或0.25mg/mL。

一种上述重组抑制素疫苗的应用，其特征在于：对雌性家畜肌肉注射后，通过重组抑制素α亚基蛋白的免疫提高家畜繁殖力。

在所述重组抑制素疫苗的应用中：所述的雌性家畜为母猪或母羊或母水牛。

本发明的优点在于：采用本发明所提供的方法，利用重组抑制素免疫后，能够有效地治疗顽固不发情的种母畜，可以促使母畜的发情，显著地提高母畜发情率及发情表现，用于解决母畜的发情推迟或者不发情的问题，利用本发明技术可以大幅降低人力物力的消耗，降低生产成本，并产生了极大的经济效益和社会效应。

附图说明

图1为重组抑制素疫苗诱导乏情母猪发情示意图。

图中，实线为免疫组，虚线为对照组；上方的箭头表示肌肉注射的时间，分别表示实验开始第1天、第21天和第42天。

具体实施方式

实施例1

重组抑制素疫苗的制备

材料：

司本80、司本85、10号矿物油、吐温80（以上材料均外购），无菌蒸馏水。

重组抑制素α亚基蛋白：由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化。

制备过程：

4％的司本80、2％的司本85与10号矿物油匀浆机上3000rpm混合20分钟，121℃条件下高压灭菌15分钟，获得油相制剂备用；由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化获得重组抑制素α亚基蛋白，将吐温80在121℃条件下灭菌15分钟，取无菌蒸馏水、灭菌后的吐温80和重组抑制素α亚基蛋白在匀浆机上3000rpm, 20分钟混匀形成水相制剂，水相制剂中的重组抑制素α亚基蛋白含量为0.5~10mg/mL ，灭菌吐温80的含量为4％，备用。

将备用的油相制剂和备用的水相制剂按照2:1的体积比混合，具体步骤是：先将油相制剂置于匀浆机3000rpm中混匀，混匀过程中逐步加入备用的水相制剂，待全部水相加入后继续混匀20分钟。获得重组抑制素疫苗。重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL或1mg/mL或0.5mg/mL或0.25mg/mL（通过改变水相制剂中的重组抑制素α亚基蛋白的含量来改变重组抑制素疫苗中的含量）。

实施例2

重组抑制素诱导乏情母猪发情

免疫组

试剂药品：重组抑制素疫苗（重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为0.5mg/mL和0.25mg/mL，由实施例1提供）

对照组

试剂药品：注射用生理盐水（外购）

实验过程

选择体况发育情况相似因夏季高温天气而导致长时间顽固不发情的成年乏情母猪18头，随机分为两组，每组9头。设计对免疫组的母猪每隔三周肌肉注射一次重组抑制素疫苗，第一次使用0.5mg/mL的疫苗1mL，第二次和第三次使用0.25mg/mL的疫苗1mL量相同。对照组每隔三周肌肉注射一次注射用生理盐水，每次1mL。注射后，免疫组和对照组出现发情个体，即进行配种，剩余不发情群体，继续进行疫苗注射。诱导乏情母猪发情过程见图1，图中上方的箭头表示肌肉注射的时间，分别为实验开始第1天、第21天和第42天。由图1可见，免疫组的9头母猪肌肉注射1~2次重组抑制素疫苗，发情率就达到100%。对照组9头猪中完成三次肌肉注射后，只有3头发情，发情率仅为33.3%。对发情的母猪产仔数进行追踪记录并统计，免疫组平均产仔数为12.25±1.03个，对照组平均产仔数为9.3±0.67，两者相比，差异显著(P<0.05）如表1。

表1：免疫IHN对乏情母猪发情和配种产仔数的影响

组别	数量 n	发情母猪数	发情率（%）	平均产子数
					免疫组	9	9	100	12.25±1.03a
对照组	9	3	33.3	9.30±0.67b

实施例3

重组抑制素诱导乏情母羊发情

免疫组

试剂药品：重组抑制素疫苗（重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为1mg/mL，由实施例1提供）；孕酮缓释阴道栓（外购）。

对照组

试剂药品：孕酮缓释阴道栓（外购）。

实验过程

选择相同条件的30头母羊随机平均分成两组，一组为免疫组，另一组为对照组。

免疫组在阴道埋植孕酮阴道栓的当天，肌肉注射重组抑制素疫苗1毫升，在埋植孕酮阴道栓的第12天时撤去阴道拴，然后观察母羊发情表现和配种受胎率。

对照组仅按照传统方式埋植孕酮阴道栓，在埋植孕酮阴道栓的第12天时撤去阴道拴，然后观察母羊发情表现和配种受胎率。

结果表明，免疫组的15头母羊中表现发情的为12头，同期发情率达80%；而对照组的15头母羊中表现发情的只有5头，同期发情率为33%。另外，免疫组母羊的发情表现都特别旺盛和明显，显著优于对照组发情母羊的表现。结果表明，免疫抑制素能够大幅提高母羊的同期发情率。

实施例4

重组抑制素诱导乏情母水牛发情

免疫组

试剂药品：重组抑制素疫苗（重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL，由实施例1提供）；氯前列烯醇PGF2α（外购）；促性腺激素释放激素GnRH（或促排卵素3号LRH-A3）（外购）。

对照组

试剂药品：氯前列烯醇PGF2α（外购）；促性腺激素释放激素GnRH（或促排卵素3号LRH-A3）（外购）。

实验过程  

选择相同条件的24头母水牛随机分成两组，其中免疫组11头，对照组13头。

免疫组在同期发情处理开始的当天，臀部肌肉注射含量为2mg/mL的重组抑制素疫苗，剂量为2mg/ml /头，同时肌肉注射促性腺激素释放激素GnRH，剂量为2ml/头（或促排卵素3号LRH-A3，剂量为100μg/头）；7天后注射氯前列烯醇PGF2α，剂量为2ml/头；2天后，再次肌肉注射促性腺激素释放激素GnRH，剂量为2ml/头（或促排卵素3号LRH-A3，剂量为100μg/头）；15-22小时后观察发情状况并进行人工受精。

对照组在同期发情处理开始的当天，臀部肌肉注射促性腺激素释放激素GnRH，剂量为2ml/头（或促排卵素3号LRH-A3，剂量为100μg /头）；7天后注射氯前列烯醇PGF2α，剂量为2ml/头；2天后，再次肌肉注射促性腺激素释放激素GnRH，剂量为2ml/头（或促排卵素3号LRH-A3，剂量为100μg /头）；15-22小时期间观察发情状况并进行人工受精。

    发情鉴定及人工受精时机是，发现母牛阴户充血肿胀、阴道黏膜潮红、有黏液流出并互相爬跨时，人工受精分别在72小时和96小时进行两次。所用冷冻精液解冻后活率为30%以上，一次输精量为1支（0.25ml）。输精方式为直肠把握法深部输精。7天后非手术法冲胚，记录排卵数。配种后90天用B超进行受胎率检测。实验结果记录在表2中，由表2可以明显看出，重组抑制素疫苗可以大幅提高母水牛同期发情后的排卵率和配种受胎率。

表2：免疫抑制素大幅提高母水牛同期发情后的排卵率和配种受胎率

组别	数量	排卵数（%）	配种后90天受胎数（%）
				对照组	13	7（53%）	2（15.4%）
免疫组	11	10（90.9%）	5(45.5%)

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据本发明说明书中公开的内容，结合本领域的基本常识或惯用手段，对本发明作出的非实质性的延伸，都没有超出本发明权利要求限定的范畴。

Claims (6)

1.一种重组抑制素疫苗，其特征在于：它是由油相制剂和水相制剂按照2:1的体积比混合而成的油乳剂，油相制剂由司本80、司本85和10号矿物油组成，其中含4％的司本80、2％的司本85；水相制剂由灭菌吐温80和重组抑制素α亚基蛋白和无菌蒸馏水组成，所述的重组抑制素α亚基蛋白由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化后获得，水相制剂中重组抑制素α亚基蛋白的含量为0.5~10mg/mL，灭菌吐温80的含量为4％。

2.根据权利要求1所述的重组抑制素疫苗，其特征在于：重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL或1mg/mL或0.5mg/mL或0.25mg/mL。

3.一种权利要求1所述重组抑制素疫苗的制备方法，其特征在于：

a) 4％的司本80、2％的司本85与10号矿物油匀浆机上3000rpm混合20分钟，121℃条件下高压灭菌15分钟，获得油相制剂，备用；

b)由表达载体pREST-INH，经大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)表达并纯化获得重组抑制素α亚基蛋白，将吐温80在121℃条件下灭菌15分钟，取无菌蒸馏水、灭菌后的吐温80以及重组抑制素α亚基蛋白在匀浆机上3000rpm, 20分钟混匀后形成水相制剂，备用；水相制剂中的重组抑制素α亚基蛋白含量为0.5~10mg/mL，灭菌吐温80的含量为4％；

c) 将备用的油相制剂和备用的水相制剂按照2:1的体积比混合，具体步骤是：先将油相制剂置于匀浆机3000rpm中混匀，混匀过程中逐步加入备用的水相制剂，待全部水相制剂加入后继续混匀20分钟；获得重组抑制素疫苗。

4.根据权利要求3所述重组抑制素疫苗的制备方法，其特征在于：获得重组抑制素疫苗中重组抑制素α亚基蛋白的含量为2mg/mL或1mg/mL或0.5mg/mL或0.25mg/mL。

5.一种权利要求1或2所述重组抑制素疫苗的应用，其特征在于：对雌性家畜肌肉注射后，通过重组抑制素α亚基蛋白的免疫提高家畜繁殖力。

6.根据权利要求5所述重组抑制素疫苗的应用，其特征在于：所述的雌性家畜为母猪或母羊或母水牛。

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