CN111134084A - 一种优化后备母猪定时输精效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种优化后备母猪定时输精效果的方法，将适龄后备母猪，连续饲喂剂量为20mg/头/天的烯丙孕素18d，并在停喂烯丙孕素42h后，向后备母猪肌肉注射10ml AIS/头，80h后肌肉注射200μg GnRH/头，并于24h后进行第一次人工输精，16h后再进行第二次人工输精。本发明AIS替代现有定时输精程序中的PMSG可显著增加后备母猪排卵数、降低卵巢囊肿率和改善后备母猪激素分泌情况，实现了对现有定时输精技术的优化，进而提高实施FTAI程序的后备母猪的繁殖性能。
Description
技术领域
本发明涉及家畜养殖技术领域，具体涉及一种优化后备母猪定时输精效果的方法。
背景技术
后备母猪作为一个猪场良性循环的储备资源，其质量和繁殖能力直接影响猪场的生产水平和经济效益。在规模化猪场中，每年补充的后备母猪是基础母猪的20％～30％。然而，后备母猪达到性成熟或体成熟后的不发情率达到了15％～20％。所以提高后备母猪的发情、排卵，使后备母猪成功进入生产母猪群体，最大限度地挖掘后备母猪的潜能，已成为一个急需解决的问题。
目前，利用激素制剂人为控制并调整母猪发情周期的进程，使之在预定的时间内集中发情、排卵和配种的一项技术为定时输精技术(Fixed Timed ArtificialInsemination,FTAI)，该技术能够有效解决后备母猪发情率低的问题。以定时输精技术为核心的母猪繁殖管理技术逐渐成为规模化猪场实现批次化生产管理的技术基础。但在现行技术模式下，定时输精程序对后备母猪受胎和产仔成绩等繁殖指标的优化存在一定的不确定性，仍需进一步研究外源激素处理对后备母猪发情、排卵、胚胎发育等的影响。
在现行的定时输精程序中，常采用孕马血清促性腺激素(Pregnant horse serumgonadotropin,PMSG)作为超数排卵的诱导剂，但因PMSG具有较长的半衰期会干扰排卵后的受精和胚胎发育，且PMSG的反复刺激有引发卵泡囊肿(或黄体化)和家畜耐药性的风险，对母猪的繁殖性能产生负面影响。同时，PMSG促进卵泡发育至其成熟排卵的持续时间及排卵效果具有较强的个体差异性，也是限制定时输精技术广泛运用的因素之一。因此，寻找一种减少或消除这些不良反应的PMSG替代物可能有助于实现对现有定时输精技术效果的优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种优化后备母猪定时输精效果的方法，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种优化后备母猪定时输精效果的方法，将适龄后备母猪，连续饲喂剂量为20mg/头/天的烯丙孕素18d，并在停喂烯丙孕素42h后，向后备母猪肌肉注射10ml AIS/头，80h后肌肉注射200μg GnRH/头，并于24h后进行第一次人工输精，16h后再进行第二次人工输精。
进一步地，所述适龄后备母猪为210±3日龄的后备母猪。
本发明的有益效果：
1.本发明通过AIS替代现有定时输精程序中的PMSG，更有效地诱导卵泡发育，提高后备母猪排卵率、胚胎发育潜能，实现对现有的定时输精技术的优化。本发明运用AIS代替现有定时输精程序中的PMSG，诱导卵泡发育，对比分析两者对后备母猪发情配种后的卵巢状态、排卵率、胚胎发育潜能以及生殖激素分泌情况，结果显示AIS替代现有定时输精程序中的PMSG可显著增加后备母猪排卵数、降低卵巢囊肿率和改善后备母猪激素分泌情况，实现了对现有定时输精技术的优化，进而提高实施FTAI程序的后备母猪的繁殖性能。
2.本发明AIS代替现有定时输精程序中的PMSG后，发生卵巢囊肿的后备母猪数减少、排卵数增多，其中后备母猪排卵数提高了58.8％，卵巢囊肿率降低了20.8％；且总回收胚胎数未见明显差异的条件下，6-8cell数明显增多，胚胎发育得到一定程度地促进。
3.E2水平可反映卵泡发育情况。本发明AIS代替现有定时输精程序中的PMSG后，后备母猪血清中E2水平明显升高，E2水平在诱导发情过程中提高了1.36倍，表明本发明对后备母猪卵泡发育具有更加有效的促进作用，这与改良组后备母猪红体数显著高于对照组后备母猪红体数的结果一致。
4.P4在建立和维持妊娠过程中起到重要作用。本发明AIS代替现有定时输精程序中的PMSG后，后备母猪血清中P4水平明显升高，P4含量在配种后48h提高了1.35倍，更有利于胚胎着床、发育和妊娠的维持。
附图说明
图1为激素处理流程图。
图2为各组卵巢状态对比。
图3为回收胚胎的发育状态。
图4为胚胎DAPI染色图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
1实验动物
随机选取17头210(±3)日龄，体重110kg左右的金华两头乌×杜洛克杂交后备母猪为实验用动物，并在试验实施前，用果汁诱导饲喂4～5d，以便试验动物适应药物投喂器。
2试验分组及流程
(1)分组：①对照组，采用现有FTAI程序；②改良组，将现有FTAI程序中的1000IUPMSG更换为10ml抗抑制素血清(Anti-inhibin serum,AIS)。
(2)流程：于每日下午3点饲喂烯丙孕素，并将饲喂烯丙孕素的第1天记为Day 1，然后连续饲喂烯丙孕素18天，20mg/头/天。根据停喂烯丙孕素42h后对后备母猪的注射药物的不同，将17头后备母猪随机分为：1)对照组(n＝9)，停喂烯丙孕素42h后肌肉注射1000IUPMSG(购自宁波市三生生物科技有限公司)；2)试验改良组(n＝8)，停喂烯丙孕素42h后肌肉注射10ml AIS/头(购自RIKEN)。80h后，对各试验用母猪肌肉注射200μg GnRH。24h后进行第一次人工输精，并于第一次人工输精后16h进行第二次人工输精。最后，在第二次人工输精后48h处死试验用母猪，收集静脉血用于检测血清中雌二醇和孕酮含量；采集卵巢、输卵管和子宫，对各母猪的红体数、卵巢囊肿数、卵巢直径、输卵管长度、子宫角长度、回收胚胎数和不同发育阶段胚胎数进行统计；并对采集的受精卵继续培养，观察各母猪发育到囊胚数和囊胚率。具体试验流程见图1。
3样品的采集及检测
(1)血清中雌二醇(E2)及孕酮(P4)含量检测：分别在饲喂烯丙孕素最终日(Day18)、肌肉注射PMSG/AIS当日(Day 20)、肌肉注射GnRH当日(Day23)以及屠宰当日等4个时间点，对各组后备母猪进行前腔静脉采血(5ml/头)；血液样本4℃静置过夜，以4000r/min，4℃离心15min，分离血清，并在-20℃条件下保存。血清样本(1ml/头)统一送往杭州金域医学检验所有限公司，检测分析各组生殖激素E2和P4的变化情况。
(2)卵巢状态分析：观察统计各组红体(排卵点数)，同时测量两侧卵巢的大小，以最大接触面的长×宽来计算。
(3)胚胎回收：用含有1％FBS的PBS，恒温37℃条件下，分别对各组后备母猪两侧的输卵管和子宫进行管内冲洗，回收早期胚胎，镜检观察胚胎发育状态(单细胞、二细胞、四细胞等)，并统计各个发育时期的胚胎数目；对回收胚胎后的输卵管以及子宫角长度进行长度测量。
(4)胚胎体外培养：用口吸管将各组同一个体的胚胎收集，并统一转移至胚胎保存微管内，恒温37℃条件下，从屠宰场带回实验室进行胚胎培养。
(5)胚胎计数：当体外培养3d时，随机挑选各组中早期发育囊胚进行胚胎计数，主要的操作步骤是：保证每组有效的囊胚计数在10个以上；剩余胚胎继续培养，观察各组囊胚发育状态，统计囊胚发育率。
4试验结果
(1)AIS处理后对后备母猪卵巢状态的影响情况见图2，改良组(图2A)卵巢上的红体数明显多于对照组(图2B)；改良组、对照组的卵巢上均存在直径大于6mm以上的大卵泡，但在同时含有大卵泡和红体的卵巢上，改良组的红体数多于对照组。对各组红体数、卵巢大小、输卵管长度、子宫角长度和卵巢囊肿数进行数量统计，结果如表1所示：改良组红体数是对照组红体数的1.59倍，显著高于对照组(p<0.05)。两组间卵巢大小和输卵管长度未见显著差异(p>0.05)；改良组子宫角长度显著低于对照组(p<0.05)；此外，改良组母猪中观测到1例卵巢囊肿，而对照组母猪中观测到3例卵巢囊肿。
表1红体数、卵巢大小、输卵管及子宫角长度的比较
(2)AIS处理对后备母猪排卵及受精的影响情况见表2和图3，结果显示，改良组母猪的平均回收胚胎数与对照组的平均回收胚胎数在统计学上无显著差异(p>0.05)，但改良组平均每头母猪的回收胚胎数比对照组多4～5个。同时，改良组和对照组均有1-cell状态的胚胎/卵母细胞，且经体外培养证实这些1-cell均为未受精的卵母细胞，其中对照组未受精卵子的比例为27.5％高于改良组未受精卵子的比例9.17％。此外，改良组发育至6-8cell期的胚胎数量也明显高于对照组(p<0.01)。
表2各组胚胎回收情况
(3)AIS处理后对后备母猪胚胎发育的影响情况见图4和表3，结果显示，对各组回收的胚胎进行体外培养至第3天时进行DAPI染色(图4)，然后对囊胚发育情况进行统计，发现改良组和对照组的受精胚胎的囊胚发育率无显著差异(p>0.05)，分别为78.04±4.24％和77.86±6.39％；早期囊胚的细胞数分别为45.0±2.80和43.25±1.55，也无显著差异(p>0.05)(表3)。
表3胚胎发育情况
(4)AIS处理后对后备母猪生殖激素水平的影响见表4和5，对各组四个时间点血液中的激素水平进行检测分析，结果显示，与对照组相比在诱导发情过程中改良组的雌激素水平极显著地提高了1.36倍(p<0.001)；配种后48h改良组后备母猪血清中的孕酮含量也极显著地提高了1.35倍(p<0.001)。
表4后备母猪血清中E2含量
表5后备母猪血清中P4含量
在现行的定时输精程序中，常采用PMSG作为超数排卵的诱导剂，但研究发现使用PMSG进行超数排卵刺激时可引发卵巢囊肿、干扰正常排卵时间、抑制胚胎发育和引起家畜产生耐药性等不良影响。本发明使用AIS代替现有定时输精程序中的PMSG，结果显示，改良组的平均红体数显著高于对照组，且具有平均高出10个的优势，这在实际养猪生产中具有明显优势，也反映了通过本发明能够显著提高后备母猪的排卵效果。同时，与对照组相比，改良组中6-8cell期的胚胎数显著增多，且改良组后备母猪发生卵巢囊肿的现象也得到了明显的改善，这也就表明本发明有效地促进了胚胎的发育和改善了现有定时输精程序中较高卵巢囊肿率的情况。此外，两组间卵巢直径和输卵管长度未见明显差异，表明AIS代替现有定时输精程序中的PMSG在一定程度上并未对卵巢和输卵管发育产生影响。与本发明相比，对照组后备母猪的子宫角长度相对较长；然而，虽然PMSG可增加子宫角长度，但是研究表明PMSG可延迟胚胎发育、着床，并导致妊娠时间延长。因此，本发明相较于现有定时输精程序具有明显的优势。
研究表明，卵泡发育过程中大部分卵泡最终发生闭锁，仅有部分优势卵泡可有效发生排卵；而在此过程中E2水平可反映卵泡发育情况。本发明显示，相较于现有定时输精程序，本发明使用过程中，后备母猪血液中的E2含量显著高于对照组，表明本发明对后备母猪卵泡发育具有更加有效的促进作用，这也与上文中描述的改良组红体数显著高于对照组红体数的结果相对应。同时，P4在建立和维持妊娠过程中起着重要作用，相对较高浓度的P4更有利于胚胎着床和胎儿发育等，本发明相对于现有输精程序，在一定程度上能够更加明显地提高后备母猪血液中的P4含量，这也就表明，使用本发明的后备母猪具有更有利的妊娠内环境。
综上所述，本发明相较于现有定时输精程序，能够更加有效地提高后备母猪的排卵数和降低卵巢囊肿发生概率，并为胚胎着床、发育和妊娠维持提供了更加优越的激素内环境。
Claims (2)
1.一种优化后备母猪定时输精效果的方法，其特征在于，将适龄后备母猪，连续饲喂剂量为20mg/头/天的烯丙孕素18d，并在停喂烯丙孕素42h后，向后备母猪肌肉注射10ml AIS/头，80h后肌肉注射200μg GnRH/头，并于24h后进行第一次人工输精，16h后再进行第二次人工输精。
2.根据权利要求1所述的优化后备母猪定时输精效果的方法，其特征在于，所述适龄后备母猪为210±3日龄的后备母猪。
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