CN86103459A - 利用dna重组技术产生抑制素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括以编码抑制素为特征的DNA方法、和用于鉴别此DNA的探针。要求保护的还有重组DNA，包括：克隆载体及编码抑制素的完整或部分序列、抑制素的结构类似物、同源物或前体的DNA、或编码一种具有相似免疫学或生物学活性的蛋白的DNA，用这种重组DNA转化并能够表达这种多肽的细胞及其方法。要求保护的还有含这些肽的药物组合物。脊椎动物中的性腺功能和抗这些多肽的抗体也用于相似目的。

Description

本发明特别涉及到克隆载体的建立，这些载体中含有编码完整或部分称为抑制素的激素的脱氧核糖核酸（DNA）序列，特别涉及到含有这些载体的宿主细胞如菌株的建立，还特别涉及到能产生完整、部分抑制素或其前体的宿主细胞如菌株的建立。此外，本发明涉及到所述载体和菌株的表达产物的产生和利用，还涉及到表达产物和载体的片段的产生和利用，不管它们在本质上是天然的还是合成的。

1932年有人提出，性腺产生一种称为抑制素的非类固醇因子，它与垂体功能的反馈调节有关（McCullagh，D.R.（1932）Science（科学）76卷19～20页）。自此以来，已经证实前垂体至少产生两种促性腺激素，促卵泡素（FSH）或叫follitropin及促黄体生成素（LH）或叫Lutropin，它们共同调节性腺的发育及功能。利用灵敏度很高的放射免疫检测技术，人们能对每种激素进行独立的精确监测，并已证实了这些性腺激素的反馈调节作用。LH的反馈调节似乎主要是通过类固醇物质进行的，而FSH的反馈调节除了类固醇以外，还通过称为抑制素的蛋白质或糖蛋白因子进行。

现在，我们可以将抑制素定义为蛋白或糖蛋白激素，它由卵巢的粒膜细胞或睾丸的谢尔托立氏细胞分泌。它是作为对于FSH的反应而分泌的，它以FSH的合成及分泌的反馈抑制剂作用于垂体，但基本上不影响LH的基础合成及分泌。抑制素的mRNA或前体是否在其它细胞和组织中形成，人们目前还不了解。

七十年代初期以来，人们已作出了一些努力，希望从多种动物的性腺中纯化抑制素，包括睾丸和卵巢，但所获结果并不一致（de    Jong.F.H.（1979）Mol.Cell.Endocrinol.13卷1～10页），这部分是由于他们所用的生物测试系统不同，在这些系统中，对于离体或活体垂体细胞中FSH的任何抑制，可能是由于在测试所测物质的非专一毒性效应时，没有保证同时做抑制素和对照的试验（Baker，H.W.G.等人（1981），见于Franchimont，p.和Channing，C.P.编辑的《生殖的内性腺调节》第193～228页，伦敦科学出版社出版;Baker，H.W.G.等（1982）Ann.New    York    Acad.Sci.383卷329～342页）。

最近，已经从牛卵泡液（bFF）中纯化得到了均质的抑制素（国际专利申请PCT/AU85/00119;Robertson，D.M.等（1985），Biochem.Biophys.Res.Commun.（生物化学及生物物理研究通讯）126卷220～226页）。这是借助于利用严格培养的鼠垂体细胞测试法（Scott，R.S.等（1980），Endocrinol.（内分泌学）107卷1536～1542页）而完成的，此法包括一种测试所测物质的细胞毒性效应的手段（Robertson，D.M.等（1982），Mol.Cell.Endocrinol.26卷119～127页），因此，减少所测细胞FSH含量的非专一毒性效应则能从抑制素效应中单独辨别出来。所用的标准是牛卵泡液制备物，它具有20单位/毫升的抑制素活性，此单位基于前人所述的绵羊睾丸淋巴标准，即主观定义活性标准为1单位/毫克（Scott，R.S.等（1980），Endocrinol.107卷1536～1542页）。

来自bFF的抑制素被纯化大约3，500倍，直至比活达到200，000单位/毫克蛋白，它是一个58KD的蛋白，由两个具有链间双硫键的亚基组成，即亚基A和亚基B，通过有十二烷基磺酸钠存在的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证明，它们分别为大约43KD和15KD。每个亚基NH₂-端的氨基酸序列已经测定。此纯化物质在体外具有原来为抑制素定义的那些生理性质，即抑制鼠垂体细胞内源FSH的合成及释放，而不影响LH如催乳激素和甲状腺激素的合成及释放。

在决定雌性的排卵方式及速率和雄性的精子生成中，FSH起着重要的作用，因此，抑制素、其结构类似物或同源物或抗抑制素抗体的有开发潜力的重要应用，将是抑制或促进人类或家养动物的性腺功能，并作为性腺功能分析的诊断工具使用。利用粗提物或初步分离的性腺提取物或分泌物已经完成了许多活体实验，以期分析抑制素的生理效应。在这些实验中，产生于抑制素或抗抑制素抗体的效应包括如下-

1.抑制性腺功能（Moudgal，N.R.等（1985），见于Sairam，M.R.及Atkinson，L.E.所编《性腺蛋白和多肽及其生物学意义》第21～37页，新加坡，世界科学出版公司出版）。

2.提高排卵速率（O′Shea，T等（1982），Proc.Aust.Soc.Rep.Biol.14卷85页;O′Shea，T.等（1983），Proc.Aust.Rep.Biol.15卷22页;Henderson，K.M.等（1984），J.Endocrinol.102卷305～309页）。

3.提前青春期的开始（Al-Obaidi，F.A.R.等（1983），Proc.Aust.Soc.Rep.Biol.15卷80页）。

这些性质的商业应用的开发和在活体动物生理中的进一步研究，都需要有大量纯化的抑制素或其片段或抑制素兴奋剂及拮抗剂，天然的或合成的都可以。由于原材料可能有限（如人卵泡液），因此，仅仅依赖目前的纯化方法不可能满足此需求量，而且，一个典型的提取过程如果从50毫升bFF开始，只能产生5～10微克纯化物质。

本发明特别探索了克服这些限制的方法，本发明对编码抑制素的基因加以鉴别并找出其特征，从而将编码抑制素的完整或部分基因克隆到一种宿主如大肠杆菌中，并且，通过操作这些完整或部分的基因克隆以产生宿主，如菌株，此宿主能合成包括亚基在内的完整或部分抑制素分子或其前体。

本发明的第一步实施方案提供了一种第一DNA序列，它编码完整或部分抑制素或其前体的氨基酸序列，或一种与所述第一DNA序列杂交的DNA序列，所述序列不论从何种来源都可获得，包括天然的、合成的或半合成的，所述序列包括由于突变、单个或多个碱基置换、缺失、插入、倒位等而相关的序列，还包括编码一种多肽的完整或部分序列或其前体、同源物及结构类似物的DNA序列，所述多肽即抑制素或表现出类似抑制素的免疫学或生物学活性。

本发明中较好的序列是编码相应于牛和人抑制素43KD和15KD（A和B）亚基多肽的序列，这些亚基在本文后面部分有更为详细的描述，在附于本文的图5、6、7和8中也对它们作了描绘。

在另一个较好的实施方案中，DNA编码在后面将要说明的抑制素20KD（Ac）亚基。

本发明包括的DNA序列可从例如脊椎动物细胞中制备，先从中提取所有的DNA，再通过常规技术分离所需序列。此DNA也可以通过合成法或生物合成法离体制备，例如用mRNA作为模板。

而且，本发明的范围内还包括选择DNA或RNA序列的方法，所述DNA或RNA序列编码一种多肽的完整、部分序列或其前体，该多肽即抑制素或具有类似抑制素免疫学或生物学活性。该方法包括提供一种或多种DNA或RNA序列，并且确定所述序列中的哪一个能与编码部分的或完整的具有这种活性的多肽或其前体的DNA或RNA杂交，或者提供一种抑制素的抗血清，或者是部分抑制素的抗血清，并鉴别能部分或完整地表达抑制素的宿主-载体的结合体。

上述序列可以是天然来源的、可以是RNA序列、合成序列、来自DNA重组分子的DNA序列及这种序列的结合体。

在本发明一个较好的方案中，用于分辨和鉴定至少编码一部分抑制素蛋白的DNA的方法，包括从生成抑制素的细胞中提取mRNA分子，将它们转化成双链DNA（互补DNA或cDNA），并将它们插入一种能自动复制的因子中，如质粒。然后用该因子转化一种宿主细胞如菌株，及用合成的DNA探针筛选所产生的文库，这些探针互补于类似抑制素的mRNA或DNA序列，因此，它们能够检测那些含有编码抑制素的DNA的克隆，而排斥编码任何其它细胞蛋白的DNA。

因此，本发明的另一种方案提供了合成的多核苷酸探针，以鉴别类似抑制素的mRNA或DNA，这些探针包括一种多核苷酸和一种标记，所述多核苷酸具有从下列中选择出来的一种序列：

T    G

探针1    5′    C    CAT    AANCCNCC    3′

G    A

A    A    T    A

探针2    5′    CCGAT    TC    TT    AA    3′

T    G    C    G

探针3    5′    ACGCCTGACTCCAGGA    3′

探针4    5′    CCTCCCAGTTTCATCT    3′

C    C

探针5    5′    ATGTT    ACCTT    CCGTC    3′

G    G

探针6    5′    CTTTGAGATTTCCAAAGAAGGC    3′

标记最好是结合于5′一端的³²PO₄基团，或者是其它的标记。

本发明的一个进一步的实施方案中，提供了以具有DNA插段为特征的DNA重组分子，它们包括一种编码完整或部分抑制素、或其前体的氨基酸序列的第一DNA序列，或与所述第一序列杂交的DNA序列，所述序列可产生于任何来源，包括天然的、合成的、生物合成的或半合成的来源，这些序列包括那些由于突变、单个或多个碱基置换、缺失、插入、倒位等而相关的序列，还包括编码一种多肽的完整或部分序列、或该多肽的前体、结构类似物或同源物的序列，该多肽即抑制素或表现出类似抑制素的免疫学或生物学活性。

本发明中较好的DNA重组分子包括一个控制表达的序列，它与所述DNA插段有效地连在一起。在本发明一个较好的方案中，所述DNA插段有效地连接于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因。其它较好的控制系统包括色氨酸（Trp）操纵子系统、λ噬菌体的左向启动子（P_L）和杂交启动子如tac或病毒启动子如Moloney血癌病毒的末端长段重复的启动子。

本发明中一个较好的DNA重组分子是一种含有上述DNA插段的质粒。本发明中较好的质粒将在后面详细描述，它们包括pBTA22、pBTA23、pBTA28、pBTA29、pBTA30、pBTA290和pBTA292-pBTA305。

而且，所述DNA重组分子可能包括连接于合适的噬菌体DNA的所述DNA插段，如λ噬菌体，或连接于能够在离体真核细胞或整个生物体中复制的病毒DNA。

本发明还提供一种融合基因，它包括一个启动子、一个启动转译的信号和一个第一DNA序列，此DNA序列对应于、或者说此DNA为之编码的是一种多肽的完整或部分氨基酸序列、或此多肽前体的氨基酸序列，该多肽即抑制素或具有类似抑制素的免疫学或生物学活性，或还包括一种与所述第一序列杂交的DNA序列，或一种由于突变、单个或多个碱基置换、缺失、插入及倒位等而与所述第一DNA序列相关的DNA序列。

本发明中较好的DNA重组分子包括一种质粒，其中插入有包含本发明之DNA的DNA序列。合适的质粒包括pBR322、pUR290、pUR291或pUR292或pBTA286、pUC7、pUC8或pUC9或pUC13或ptrpL1或pWT111、pWT121或pWT131及它们的衍生物。还包括病毒载体如pZIP    NeoSV（X）1、牛痘病毒、基粒棒病毒（baculoviruses）及它们的衍生物。

本发明还包括一种生产DNA重组分子的方法，该方法包括提供一种包含第一DNA序列的DNA插段，此第一DNA序列对应于、或者说它为之编码的是一种多肽的完整或部分氨基酸序列、或此多肽的结构类似物、同源物或前体的氨基酸序列，该多肽即抑制素或具有类似抑制素的免疫学或生物学活性，或包含一种与所述第一序列杂交的DNA序列或由于突变、单个或多个碱基置换、缺失、插入及倒位等而与所述第一DNA序列或杂交序列相关的序列，该方法还包括将所述DNA插段导入一种克隆载体中。

最好是将所述DNA序列导入克隆载体序列的正确位置中，完整的读码系统（reading    frame）是具有表达控制序列的基本读码系统。

在本发明一个进一步的实施方案中，提供了一种至少用一种本发明之DNA重组分子转化的宿主，它能够表达抑制素多肽或具有类似抑制素的免疫学或生物学活性的完整、部分或多部分的多肽、或它们的前体。

合适的宿主包括细菌细胞、噬菌体、酵母菌、其它真菌、脊椎动物细胞或昆虫细胞、植物细胞、包括人细胞、人组织细胞在内的移植细胞或整个真核生物体。

合适的细菌宿主包括大肠杆菌和其它的肠道生物、假单胞菌（pesudomonas）和杆菌（Bacillus）。鉴别出的较好的宿主培养物如下：大肠杆菌BTA545、BTA634、BTA637、BTA647和BTA652，而较好的宿主-载体结合体为ATCC67054-ATCC67059及BTA1361。

本发明范围中还包括一种转化宿主的方法，该方法包括：提供一种合适的宿主，将本发明之DNA重组分子导入所述宿主的正确的读码位置中。

本发明进一步提供本发明之转化宿主的表达产物，该产物包括一种多肽的完整或部分序列或该多肽的前体，此多肽即抑制素或一种具有类似抑制素免疫学或生物学性质的多肽。这些表达产物最好是以基本纯化的形式提供。

在本发明一个较好的实施方案中，这些表达产物包括与宿主同源的第一多肽序列和其氨基酸序列是一种多肽的完整或部分序列、或该多肽的前体、结构类似物或同源物序列的第二多肽序列，所述多肽即抑制素或具有类似抑制素的免疫学或生物学性质。

在本发明一个较好的实施方案中，第一氨基酸序列是部分或完整的β-半乳糖苷酶，而且宿主细胞是大肠杆菌。在本发明一个进一步的较好的实施方案中，该第一序列是表达产物的NH₂-末端序列。

在本发明一个进一步的实施方案中，提供了利用生物法合成一种多肽的方法，该多肽包括完整或部分的抑制素或抑制素前体、或一种具有类似抑制素免疫学或生物学活性的多肽，该方法包括：用本发明之DNA重组分子转化一种合适的宿主，使它能够表达一种蛋白产物，该产物包括完整或部分的抑制素多肽、或抑制素前体的多肽、或一种具有类似生物学或免疫学活性的多肽;培养所述宿主并得到所述表达产物;收集所述多肽。

在一个较好的方案中，形成的表达产物为不溶性的内含体，通过离心使它与细胞中可溶蛋白分开，从而将它从细胞提取物中纯化出来。较好的纯化方法包括加入蛋白分解抑制剂和生物膜破碎剂及进行密度梯度离心。如果需要，可以使纯化的内含体溶解，通过例如选择性酶切和/或通过进一步纯化使释放蛋白得到进一步处理，以便除去不需要的蛋白物质。

进一步，本发明将产生一种类似抑制素的蛋白，它由用质粒pBTA28、pBTA29、pBTA292和pBTA296-pBTA305等转化的细菌表达。

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，作为药物上可接受的形式，它包括本发明中的一种或多种表达产物或合成的等同物。

在一个进一步的方案中，本发明包括一些合成的多肽，它们是部分抑制素，也可以是抑制素的兴奋剂、拮抗剂或者能引起抗原反应并能用于影响FSH水平或生殖生理。

组合物包括适于口服或注射形式的组合物，最好是包括一种药物上可接受的辅助剂。本发明的药物组合物中还包括那些药效持久的、尤其是适于植入脊椎动物中并长期维持药效的组合物形式。这种形式的组合物可植入脊椎动物中以影响其性腺功能，并在达到所需效果后将其取走。

在一个进一步的方案中，本发明提供了一种疫苗，它包括一种或多种作为药物上可接受的表达蛋白。

本发明还包括一种影响脊椎动物性腺功能的方法，该方法包括对所述脊椎动物施用有效量的本发明药物组合物的方法。

在一个进一步的方案中，本发明包括抗体制备物，这些抗体是通过对一种脊椎动物施用本发明一种或多种表达产物或本发明药物组合物、在其体内引起免疫反应后而制备的。这种抗体制备物包括多克隆或单克隆抗体制备物。

本说明书和权利要求书中通篇使用的名词“抑制素”是非种特异性的，因此它包括相关种的抑制素如牛、人、绵羊、猪、鸡和鱼，尤其是人和牛的抑制素。此名词还包括非糖基化的及糖基化的抑制素。

名词“脊椎动物”包括的种类有鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及包括人类在内的哺乳类。

正如本说明书通篇指明的那样，分泌到卵泡液中的抑制素是一个58KD的蛋白，它包括两个亚基，43KD和15KD的亚基-分别称为A和B。A或43KD的亚基是一种具有一定的时间差别的同源蛋白，因此当一个种的抑制素施用给另一个种时，它可能在该种中起抗原的作用。我们据此认为，不同种的抑制素可以用于产生抗抑制素的抗体，这一点在后面将要讨论。

比较而言，亚基B或15KD亚基的氨基酸序列在不少种间都是基本一致的，如在人和牛之间。

在某些情况下，整个蛋白被切成31KD的形式，它包括分子量为20KD和15KD的两个亚基-分别称为Ac和B。31KD的形式表现出抑制素活性并组成本发明的一部分。58KD的形式切成31KD的形式时，释放出一个称为A_N片段的多肽片段，它本身在性腺功能的调节中具有重要的作用，并因此也是本发明的一部分。

尽管上述方案落入本发明的主要方案范围之内，我们仍将进一步描述本发明的较好的方案，并参照下列系统实验方法和附图：

图1描绘了合成含有牛粒膜细胞cDNA的重组质粒的战略。

图2是从牛粒膜细胞信使RNA合成的cDNA产品的聚乙烯亚胺纤维素薄层层析。

图3描绘了43KD（A）亚基和15KD（B）亚基探针的序列。

图4描绘了一种限制性酶（PstI）的图谱和七种抑制素cDNA序列分析的战略。

图5描绘了牛抑制素亚基A    cDNA的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列。选择的限制性酶切位点示于DNA序列之上。

图6描绘了牛抑制素亚基B    cDNA的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列。选择的限制性酶切位点示于DNA序列之上。

图7描绘了人抑制素亚基A    DNA的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列。

图8描绘了人抑制素亚基B    DNA的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列。

图9示出了在SDS-PAGE凝胶上58KD抑制素（Ⅰ）和31KD抑制素（Ⅱ）与分子量标准（S;以KD表示的大小）相比的结构（A）及牛的58KD天然抑制素在小牛血清（SS）和人类绝经后的血清（PMS）中保温过夜后转化成31KD形式的抑制素，通过测定未稀释的SDS-PAGE凝胶片的放射活性而确定（B）。

图10描绘了获得亚基A的完整cDNA的战略。

图11描绘了用于使亚基A和B的cDNA表达的连接物。

图12示出了质粒pBTA302、pBTA303和pBTA304的图谱。

图13示出了大肠杆菌菌株中抑制素亚基融合蛋白和β-半乳糖苷酶的表达。

图14示出了建成原前亚基A的完整cDNA的战略。

图15示出了用合成肽免疫的兔的血清中的FSH水平。箭头标明接种时间。

本文中使用下列缩写。

ATP    腺苷三磷酸

bFF    牛卵泡液

bp    碱基对

cDNA    互补DNA

CG    绒毛膜促性腺激素

Ci    居里

D    道尔顿

dATP    2′-脱氧腺苷三磷酸

dCTP    2′-脱氧胞苷三磷酸

dGTP    2′-脱氧鸟苷三磷酸

DNA    脱氧核糖核酸

DTT    二硫苏糖醇

dTTP    2′-脱氧胸苷三磷酸

EDTA    乙二胺四乙酸

ELISA    酶连接的免疫吸附测定

FSH    促卵泡素

Xg    重力倍数

g    克

HPLC    高压液相层析

K    （前缀）千

L    （前缀）升

M    摩尔浓度

m    （前缀）毫

mol    摩尔

mRNA    信使RNA

P    （前缀）微微

n    （前缀）毫微

PAGE    聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCMB    对氯汞苯甲酸

PMS    人类绝经后的血清

PMSF    苯基甲基磺酰氟

PMSG    孕期母马的血清促性腺激素

RIA    放射免疫检测

RNA    核糖核酸

RP-HPLC    反相HPLC

SDS    十二烷基磺酸钠

SS    小牛血清

Tris    三羟甲基氨基甲烷

μ    （前缀）微

此外，本文中定义和使用的下列名词是可以互换的，不管其起源或糖基化状况如何：

亚基A＝43KD亚基＝58KD抑制素的大亚基＝氨基酸His1至Ile300（图5）＝氨基酸His1至Ile306（图7）。

亚基Ac＝20KD亚基＝31KD抑制素的大亚基＝氨基酸Ser167至Ile300（图5）＝氨基酸Ser172至Ile306（图7）。

A_N片段＝亚基A的NH₂-末端部分＝氨基酸His1至Arg166（图5）＝氨基酸His1至Arg171（图7）。

亚基B＝15KD亚基＝58KD和31KD抑制素的小亚基＝氨基酸Gly1至Ser116（图6和图8）。

短语“具有相似的免疫活性”的应用是指包括一种蛋白，它与抑制素或部分抑制素有足够的同源性，以至于（1）受体的免疫系统对它的反应与对天然蛋白的一样或（2）施用此蛋白所产生的抗体将能够识别内源抑制素。

还应当认为，名词“部分抑制素”包括抑制素的亚基。

下面详述了本项工作的方法和产物，应当认为，对于本领域的专业人员来说，还存在着可付诸使用的不同方法，但这些方法都落入本发明的主要方案中。

实例1

从牛粒膜细胞中分离信使RNA（mRNA）

整个的睾丸和卵巢或分离的谢尔托立氏细胞和粒膜细胞都可作为抑制素mRNA来源。本实例中使用分离的粒膜细胞。

1.粒膜细胞的收集    在就近的屠宰场，利用针和注射器，从新鲜牛卵巢表面的大卵泡中收集含有粒膜细胞的牛卵泡液（bFF）。回到实验室后，立即将刚刚收集的卵泡液冰冻保存。70～100毫升bFF中的细胞以500xg离心5分钟，取出上清液用作纯化天然抑制素。细胞中的RNA如下述方法提取。

2.RNA的提取和纯化    将粒膜细胞收集后，立即加入24毫升的4.2M异硫氰、120mM巯基乙醇、5%（体积/体积）sacrosyl、10mM    Tris-Hcl    pH7.4使其溶解（Chirgwin，J.M.等（1979），Biochemistry    18卷5294～5299页）。将溶解物在Sorvall    Omnimix型匀浆机中以第4档速度匀浆30秒钟，然后以20，000xg离心15分钟以除去细胞碎片。在每2.5毫升上清液中加入1克CsCl。将此混合物置于9毫升的5.7M    CsCl、10mM    EDTA、50mM    Tris-HCl    pH7.8的衬垫上在15℃以122，000xg离心65小时。

RNA沉淀在5毫升的70%乙醇、30%TE（1mMEDTA、10mM    Tris-HCl    pH7.5）中洗涤几次以除去CsCl。最后，在3毫升TE中加入0.3毫升pH7.5的3M醋酸钠和6毫升乙醇使其沉淀，然后冰冻至-70℃并以20，000xg离心10分钟。在取用之前，将RNA沉淀溶于1毫升TE中并保存在-70℃。

3.mRNA的分离    通过在寡聚dT纤维素上的层析，将mRNA从总RNA中提取出来（Aviv.H.和Leder，P.（1972），Proc.Natl.Acad.Sci.USA    69卷1408～1412页）。将RNA配制成1M    NaCl、1mM    EDTA、20mM    Tris-HCl    pH7.5的溶液，加热至70℃保持2分钟，在冰水中迅速冷冻后上寡聚dT纤维素的柱（床干重为0.5克）（BRL公司产品）。将上柱时的过柱溶液加热、冷冻后再上柱，重复两次。用5毫升上柱缓冲液洗柱，然后用5毫升含有0.5MNaCl的同一缓冲液洗脱。将mRNA在60℃洗脱入TE中。分部收集（0.25毫升）洗脱液，用醋酸钠和乙醇（参见上面）使洗脱液中含的mRNA沉淀，然后使沉淀真空干燥。将mRNA再溶于0.1毫升TE中，等分成25微升在-70℃下冰冻保存。

从通过这些提取和纯化步骤得到的RNA洗脱液的总集份中取出1～2微克样品，在琼脂糖-尿素凝胶上电泳进行检测（Locker，J.（1979），Anal.Biochem.98卷353～367页）。尤其是，将10微升TE中的RNA样品加热至70℃两分钟，此TE中还含有5M尿素和0.01%（重量/体积）的溴酚蓝和二甲苯苯胺FF之一的泳道染料，然后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，此凝胶中含有5.6M尿素、14mM醋酸碘、1mM EDTA、36mM NaH₂PO₄、40mM Tris-HCl pH7.4。当溴酚蓝染料到达凝胶底部时停止电泳，用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后在紫外光下观察RNA。

由RNA在260毫微米处的光吸收测定它的浓度，使用1厘米的光路时，每毫升40微克RNA的A₂₆₀读数为1.0。对于典型的操作来说，60～100毫升bFF将产生1～3克湿重的粒膜细胞沉淀，从中可提取600～900微克总RNA和20～60微克mRNA。

这一部分mRNA中含有专一于抑制素、抑制素亚基或类似抑制素多肽的mRNA，但应当认识到，这部分mRNA是大量含量不一的不同mRNA的混合体，此混合体中的大部分都是不需要的。

在下面的cDNA合成和接尾的步骤中，每一种cDNA经历的过程都与专一于抑制素、抑制素亚基或类似抑制素多肽的mRNA相似，它们的存在最终将导致大量不需要的克隆的产生，因此必需有一个筛选过程以鉴别所需克隆，即那些含有编码部分抑制素、抑制素亚基或完整抑制素的cDNA序列的克隆。

从mRNA制备cDNA和将此cDNA并入载体pBR322的战略示于图1中，并实例2和3中有更为详尽的描述，但仅限于举例说明而已。

实例2

从mRNA合成DNA的拷贝（cDNA）

1.第一cDNA链的合成 建立一种dATP含量有限的反应混合物，从中取出一小部分以监测通过α-³²PdATP的结合而合成cDNA的程度。然后向主体反应混合物中补加过量的dATP，使第一链得以全部合成。尤其是，将一份mRNA制备物的样品（2微克）配成27微升的水溶液，在70℃加热两分钟，然后迅速在冰水中冷冻。反应是通过加入23.5微升混合物而启动的，此混合物中含有500毫微克寡聚dT_10-17引物（Boeh-ringer公司产品）、dCTP、dTTP和dGTP各为50毫微摩尔、5毫微摩尔dATP、100毫微摩尔的DTT、20单位的AMV反转录酶（Life Sciences产品）、2微摩尔KCl、400毫微摩尔MgCl₂和25微摩尔的Tris-HCl pH8.5。

搅拌后立即建立分析反应液，取2微升样品放入另一支试管中，其中含有0.5微升α-³²P dATP（1800居/毫微摩尔;5微居/微升），然后向反应主体中补加0.5微升60mM的dATP，将其置于42℃保持60分钟。从分析反应液中取出0.5微升，在乙醇-干冰浴中迅速冷冻以作为零时对照。剩余反应液置于42℃保持60分钟，然后再取出0.5微升用于分析。

将每一份具放射活性的样品在pH3.5的0.75M KH₂PO₄缓冲液中进行聚乙烯亚胺（PEI）纤维素（Merck公司产品）薄层层析。放射自显影的结果示于图2中。通过这种方式，未结合的核苷酸从新合成的第一链（DNA-RNA杂交体）中去除，第一链停留在层析原点。放射自显影后切下独立的斑点，测定结合进的放射活性，以给出结合效率的估计值。我们认为，总计数的10%的结合（结合的最高估计值为33%）或更大的比例，将有利于进行cDNA第二链的合成。剩余的放射活性物质用2M醋酸铵、67%的乙醇沉淀两次，并在上柱缓冲液（见上述）中沸腾两分钟后进行琼脂糖-尿素凝胶电泳，以分离RNA和DNA链。然后使凝胶在富士RX型X-光胶片上放射自显影。此程序给出cDNA产物大小的估计值，典型的操作所产生的cDNA范围从多于1000碱基到少于200碱基。

通过本领域专业人员熟知的其它程序，也能够进行第一链的合成。在本实例中，用寡聚dT作为引物从所有具有多腺苷区域的mRNA合成第一cDNA链。也可随意使用其它引物从mRNA合成cDNA。另外，具有与抑制素mRNA某些部分互补的序列的引物也可用于合成专一于抑制素的cDNA。具有与抑制素mRNA某些部分互补的序列的寡聚dT或其它引物可用作合成第一链的引物。

2.第二链的合成    利用类似合成第一cDNA链的战略，从最初缺乏dATP的反应混合液中得到主体和分析反应液。

特别是，在第一链主体反应液的cDNA-RNA杂交分子中加入50微升pH7.5的3M醋酸铵和200微升乙醇使之沉淀，然后冷冻至-70℃，以15，000xg离心5分钟。沉淀悬浮于50微升TE中，并再次沉淀，然后进行干燥，最后溶于50微升TE中。

在其中加入350微升溶液，该溶液含有dCTP、dTTP和dGTP各16毫微摩尔、1毫微摩尔dATP、3.5单位RNA酶H（BRL公司产品）、92单位DNA聚合酶I（Boehringer公司产品）、40微克BSA、6毫微摩尔β-NAD、400毫微摩尔（NH₄）₂SO₄、4微摩尔KCl、200毫微摩尔MgCl₂和800毫微摩尔Tris-HCl pH7.5（Gubler，U.和Hoffman，B.J.（1983），Gene 25卷263～269页）。

搅拌后立即建立了分析反应液，取2微升样品放入另一支试管中，其中含有0.5微升α-³²P dATP（1800居里/毫微摩尔;5微居里/微升），然后向主体反应液中补加2微升10mMdATP，将其置于15℃保持60分钟，然后在22℃保持60分钟。在零时、1小时和2小时时，从分析反应液中取出0.5微升样品，在乙醇-干冰浴中迅速冷冻，如第一链合成中所述方法进行薄层层析分析（图2）。总计数中至少5%的结合（估计最大值为8%）被认为是第二链合成效果良好的标志。

通过本领域专业人员熟知的其它程序，也可能进行第二链的合成。下面略举几例说明。

在本实例中，与DNA聚合酶一道，利用专一于DNA/RNA杂交体中RNA的RNA酶（即RNA酶H）。可使用的不同方法有，从合成第一链所得DNA/RNA杂交体中的RNA可能遭到化学的或酶学的破坏，或与DNA分离开来，从而使DNA能自己成为引物。然后，第二链的合成利用DNA聚合酶或反转录酶进行，留下的发夹环通过专一于单链的释放因子降解，如Sl核酸酶。

第三种方法包括去除或降解mRNA，然后在第一DNA链产物的3′-端加上寡聚核苷酸（如寡聚dC）的尾巴。使一个与之互补的寡聚核苷酸（如寡聚dG）与该尾巴退火，并作为通过DNA聚合酶或反转录酶进行第二链反应的引物。具有与抑制素cDNA互补或一致或相似的序列的单链或双链DNA，也可能通过化学合成得到后用于克隆。

实例3

大肠杆菌中牛粒膜细胞cDNA文库的建立

1.cDNA的接尾与退火    来自第二合成链的双链cDNA中加入40微升pH7.5、3M的醋酸钠和800微升乙醇使其沉淀，然后冷冻至-70℃并以20，000xg离心5分钟。沉淀颗粒再溶解于50微升TE中，用等体积的苯酚（先与TE预平衡）萃取两次，再用100微升的二乙基醚（先与TE预平衡）萃取三次，然后加入50微升4M的醋酸铵和200微升乙醇使其沉淀，继之冷冻至-70℃。与前面的沉淀过程不同，先让冷冻混合物回至室温，然后以15，000xg离心5分钟。此过程有助于去除未结合的核苷酸。沉淀颗粒溶于50微升TE中，再用醋酸铵和乙醇进行沉淀。沉淀颗粒经过真空干燥后再悬浮于30微升的TE中。

在15微升cDNA中加入同样体积的缓冲液，该缓冲液中含有30毫微摩尔CoCl₂、3毫微摩尔DTT、PH7.2的1.5微摩尔卡可酸钾、5微克牛血清清蛋白、30毫微摩尔dCTP和17单位的末端转移酶（BRL产品）混合物在37℃保温3～5分钟后在乙醇-干冰浴中冷冻，然后加热至65℃保持5分钟。在取用之前，将接过尾的DNA保存在-20℃下。通过称为退火的方法，将此cDNA结合到市售得到的pBR322质粒分子中去（见图1和表2），该质粒在限制性核酸内切酶PstI（BRL产品目录中5355号）作用位点的突出的3′-端含有大约24个dG残基。在此退火过程中，cDNA的dC单尾与质粒的dG单尾形成稳定的杂交体。由于PstI位点位于pBR322的B-内酰胺酶基因中，因此所得到的质粒对氨必西林敏感，但对四环素具有抗性。

退火的方法是，将2.5微升具有dC接尾的cDNA和大约0.5微克具有dG接尾的pBR322在含有0.1MNaCl的50微升TE中加热至65℃保持5分钟，然后在57℃保温2小时。然后将该溶液在1个小时内缓慢冷却至室温，在进一步使用之前，将其保存在冰中或在-20℃下冷冻。

对于本领域的专业人员来说，还可能有其它的方法将此cDNA插入载体分子中去。例如，利用称为接尾作用的末端转移酶的反应，可将任何核苷酸加到DNA分子的3′-末端。然后，可将这些分子与具有互补序列接尾的DNA载体分子退火。还可通过DNA连接酶的作用，在cDNA分子上加上合成的连接物，这种连接物通过限制性酶作用后，可为克隆提供合适的DNA序列。也可用限制性酶或DNA酶直接切开cDNA，将其直接用于克隆。还可以将平头末端的DNA分子直接克隆到载体中去，这样的载体包括质粒、柯氏质粒（Cosmids）、噬菌体和其它病毒。

2.用重组质粒转化大肠杆菌ED8654利用D.Hanahan（1983;J.Mol.Biol.（分子生物学杂志），160卷557～580页）的方法使大肠杆菌ED8654处于感受态，取0.2毫升的感受态细胞用10微升退过火的cDNA-pBR322杂交体进行转化。转化以后，将细胞在2毫升SOC培养液中培养2小时（SOC培养液组成：5克/升酵母提取物、20克/升胰蛋白胨、10mM NaCl、2.5mM KCl、20mM MgCl₂、20mM MgSO₄、20mM葡萄糖），然后以2，000Xg离心5分钟，再将细胞悬浮在0.5毫升0.85%的Nacl溶液中，为了从中选择出被pBR322或重组质粒转化过的细胞，将全部悬浮液分布于含有10微克/毫升四环素-盐酸的280毫米LB（每升5克酵母提取物、10克胰蛋白胨、5克NaCl）琼脂（每升15克琼脂）平板上。在37℃下保温48小时。通过这种方法，一个典型的转化过程可从每微克pBR322重组体中产生大约5×10³至5×10⁴个克隆，或从每微克cDNA产生大约10⁴至10⁵个克隆。对于来自14个抗四环素的克隆所作的随机筛选表明，含有重组质粒的转化细胞一般在78%以上。

3.转化细胞的保存    将每个平板上的克隆括入10毫升的LB中。将由大约2，000个独立转化得到的细胞集于一处，以1，500Xg离心5分钟，再悬浮在5毫升LB中（体积/体积），其中加入0.5毫升的二甲亚砜。在使用之前，分成每份0.4毫升冰冻在液氮中并保存在-70℃。上述方法能够建成5个这样的集份。

由于每个初始转化细胞含有一个重组的DNA分子，而这些重组的DNA分子产生于对mRNA集份中存在的某一个mRNA分子的完全或不完全的拷贝，则这样的转化细胞的收集体或集份被称为文库。在这儿的例子中，牛粒膜细胞cDNA的文库是在大肠杆菌中建立的。一个真核细胞大约可合成1×10⁴至2×10⁴种不同的蛋白，所以，10⁴个独立的转化细胞的收集体应当含有产生于更为繁多的mRNA分子的成分。显然，这些文库中绝大部分细胞含有的cDNA都没有直接用处，只有少数几个细胞含有抑制素mRNA分子的完全或不完全的拷贝，下述方法的设计，就是为了对这些克隆进行鉴别和分离。

实例4

从文库中筛选抑制素克隆

1.制备用于筛选的文库 将一个试管中的冰冻细胞熔化，稀释5×10⁵倍，然后取0.5毫升分布在含有10微克/毫升四环素-盐酸的280毫米LB琼脂平板表面，在37℃下保温过夜。每个平板大约可产生10⁴个克隆，因此初始文库中的每个转化细胞扩增了1～5倍。将重复复制物转移至硝化纤维素（Schleider and Schuell公司产品）滤器上，用蘸有墨汁的针刺穿滤器的琼脂以作为定位标记。原平板在使用之前保存在4℃下，复制物滤器则对面合上含有10微克/毫升四环素-盐酸的新鲜LB琼脂平板并保温8小时。然后将它们转移至含有50微克/毫升氯霉素的LB琼脂平板上，保温过夜，以提高每个细胞中重组质粒的拷贝数目（Clewell，D.B.（1972）J.Bacteriol.（细菌学杂志），110卷667～676页;Hanahan，D.和Meselson，M.（1980），Gene（基因），10卷63～67页）。根据修改过的Grunstein，M.和Hogness，D.S.的方法（1975;Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院学报），72卷3961～3965页）对滤器进行处理。将滤器对面铺在用0.5MNaoH及1.5MNaCl饱和的华特曼3MM型滤纸（Whatman 3MMPaper）片上15分钟，以促进细胞的溶解和单链DNA的形式，然后在15分钟内换两次用1.5MNacl和0.5MpH7.5的Tris-HCl饱和的滤纸，使其回至中性。经过空气干燥后，将它们铺在布氏漏斗上并用20毫升CHCl₃饱和，再进行抽气过滤。然后将滤器置于真空炉中在80℃下烘烤2小时。

2.战略 为了鉴别那些含有整个或一部分抑制素的cDNA基因的克隆，运用了放射活性标记的寡聚脱氧核糖核苷（寡聚核苷酸）探针。设计这些探针时，使它们与部分mRNA序列互补，即那些编码43KD和15KD亚基的NH₂-端氨基酸序列的mRNA（探针1和5，图3）。43KD和15KD亚基的NH₂-端序列产生于58KD的完整抑制素及其分离亚基的氨基酸序列测定，每个亚基前面的16个氨基酸序列可见于国际专利申请PCT/AU85/00119。然后，通过从58KD的完整抑制素序列中去除43KD亚基（由pBTA22和pBTA23中的cDNA序列分析确定，参见实施例6第1节）的氨基酸序列，有可能使15KD亚基的初步分析得以扩展和精确化，如表1中所示。此精确分析指出了可用于制备寡聚核苷酸探针的另一个区段，即从20至24的氨基酸区段。图3表明了所制备的寡聚核苷酸探针（探针2）。它是一个24折的简并的14聚合体，并被用于分离pBTA293和pBTA294。由于每个氨基酸（除蛋氨酸和色氨酸以外）都具有不止一个为其编码的DNA密码，因此有必要在探针中包括进所有可能的密码子结合方式。这样，为抑制素大亚基选择出来的大部分氨基酸序列，有64种可能的为其编码的DNA序列（探针1，图3），编码为抑制素小亚基选择的大部分氨基酸序列的DNA序列有24种可能（探针2，图3）。为了最大可能地得到这些序列中的代表性分子，探针1是将四个独立的合成物合并得到，它们在从5′-端数起的2和6位分别具有dG和dA、或dT和dA、或dG和dG、或dT和dG。探针2则是通过一次性合成得到。

3.寡聚核苷酸的合成及纯化    寡聚核苷酸探针是借助于DNA自动合成仪（Applied    Biosystems    Inc.（应用生物系统公司），380A型）合成的。根据最初由Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.研究出来的方法（1981，J.Amer.Chem.Soc.（美国化学学会杂志），103卷3185～3191页），该机器能够程序化地将N，N′-二异丙基亚氨基磷酸酯脱氧核糖核苷衍生物连续偶联到控制下的微孔玻璃支持物的衍生臂上。

我们运用了应用生物系统公司推荐的操作程序。通过替换亚氨基磷酸酯脱氧核糖核苷混合物，在单一的衍生基质上产生了简并的寡聚核苷酸。通过含有20%（重量/体积）丙烯酰胺、1.0%（重量/体积）N，N′-二丙烯酰胺、1mM EDTA和50mM用固体硼酸将pH调至8.3的Tris的制备凝胶电泳（20厘米×20厘米×1.5厘米），将寡聚核苷酸从过早终止的寡聚核苷酸中纯化出来。电泳在500伏电压下进行1.5小时，然后将凝胶置于Kieselgel F254（Merck产品）的薄层色谱板上，在紫外光下观察寡聚核苷酸。寡聚核苷酸呈现出黑色带状。将它们分离下来后置于0.8毫升无菌水中过夜，将寡聚核苷酸从凝胶上洗脱下来。在260毫微米波长测定寡聚核苷酸的光吸收以估计其洗脱浓度，利用1厘米的光路时，每毫升35微克单链DNA的A₂₆₀读数为1.0

4.5′一端标记反应    在纯化的寡聚核苷酸中向其5′-端加入³²P-标记的磷酸酯基团，可使它们具有放射活性。

尤其是，使40微微摩尔的寡聚核苷酸和40微微摩尔的γ-³²PATP（2000居里/毫摩;5微居里/微升）在低压下冻干，然后溶解于20微升含有4单位T₄多核苷酸激酶、10mMMgCl₂、10mM DTT、1mM亚精胺和pH7.5的50mMTris-HCl的缓冲液中，并在37℃下保温90分钟。

用上述方法将具放射活性的寡聚核苷酸纯化，使其在富士公司的RX型X-光胶片上放射自显影5分钟后观察。在0.8毫升无菌水中过夜进行洗脱。共同组成探针1（参见实例1第2节）的寡聚核苷酸的4个集份，每一份都分别处理到这一步后将其合并。

58KD的抑制素被切断并烷基化，切断的亚基从SDS-PAGE凝胶中通过电洗脱分离。将58KD的抑制素（80微微摩尔）、亚基A（17微微摩尔）和亚基B（6微微摩尔）在气相序列分析仪中进行Edman降解。

（Xaa）＝从cDNA序列确定的氨基酸。

Xaa^＊＝从58KD抑制素的双链序列中去除亚基A序列后鉴别的氨基酸。用作设计寡聚核苷酸探针的区域下面加线表明。

5.利用探针筛选文库    将每一套具放射活性的探针置入40毫升5×SSC、10×Denhardt的溶液中（20×SSC即3M    Nacl、0.3M    pH7.0的柠檬酸三钠;50×Denhardt的溶液即1%（重量/体积）Ficoll、1%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮、1%（重量/体积）牛血清清蛋白），将代表各文库的每个滤器浸入溶液中，在轻度搅拌下过夜。

用1×SSC、0.1%SDS（十二烷基磺酸钠）溶液在室温下多次洗涤滤器，然后用富士公司的RX型X-光胶片和Dupont    Cronex    Hi    Plus增感屏在-70℃下放射自显影3～5小时。将胶片显影，滤器再在37℃下、在1×SSC、0.1%SDS中洗涤，然后过夜进行放射自显影。

在室温下洗涤后，任何比背景更厚密的区域，或者在37℃下洗涤后仍然可见的区域，及相应于原来平板上菌落位置的区域，都被认为是潜在的抑制素克隆。

前述实例描述了一些方法和一个战略计划，根据此战略计划，可以获得含有抑制素或类似抑制素的DNA序列的细胞，但这并不意味着排除其它的方法或战略计划。例如，有可能利用基团组DNA作为起始DNA，因此可以不需要cDNA的合成（参见实例8）。而且，克隆载体可以是其中被克隆的DNA片段得到表达的载体，而筛选程序以利用抗抑制素的抗血清（见实例10）、或者直接检测抑制素或类似抑制素的生物活性为基础。这些方法对本领域的技术人员来说是众所周知的。

实例5

假定克隆的特征

1.潜在的抑制素克隆的纯化    将对应于自显影照片上黑色斑点的区域取下，在含有10微克/毫升四环素-盐酸的LB平板上进行单菌落划线培养，在37℃下保温16小时。在使用之前，将这些平板重复保存在4℃。将滤器置于带有四环素-盐酸的LB琼脂上3～6小时，然后转移至含有50微克/毫升氯霉素的LB琼脂上16小时，然后如前述将菌落溶解，再次用具放射活性的寡聚核苷酸探针筛选。将对应于自显影照片上最深斑点的单菌落从这些滤器上取下，再次进行划线培养并加以分析。

2.质粒DNA的限制性图谱    利用限制性核酸内切酶PstI的切除和降解作用，分析了至少一个假定的抑制素克隆分离物中的质粒DNA含量。该酶从质粒中释放出cDNA插段，还能在cDNA上的任一PstI作用位点将其切断。质粒DNA的提取是基于Birnboim和Doly的方法（1979;Nucl.Acids    Res.（核酸研究），7卷1513～1523页）。将培养在3毫升LB中过夜的培养细胞离心，再悬浮在0.2毫升溶解缓冲液中（50mM葡萄糖、10mM    EDTA、0.2%溶菌酶、25mMTris-HclpH8.0），在0℃下保温10分钟。在其中加入0.4毫升碱性SDS（0.2MNaoH1%（重量/体积）SDS），在0℃保温10分钟后，再加入0.3毫升pH4.8的3M醋酸钠。在0℃下15～30分钟后，将产生的白色沉淀离心去掉。在0.8毫升上清液中加入0.7毫升异丙醇，使其中的质粒沉淀，冷冻至-70℃后以15，000×g离心5分钟。离心所得沉淀溶于0.4毫升TE中，加入40微升pH7.5的3M的醋酸钠和0.8毫升乙醇使之沉淀，并如上述冷冻和离心。使最终沉淀物真空干燥后溶于0.2毫升TE中。取出20微升的样品，用20单位的PstI（Boehringer公司产品）在最终体积为40微升的TA缓冲液（66mM醋酸钾、10mM醋酸镁、0.5mMDTT、0.1毫克/毫升BSA、33mM    Tris-乙酸pH7.9）中在37℃下降解60分钟，其中还含有10微克/毫升RNA酶A，然后在TBE缓冲液（2.5mMEDTA、133mM    Tris、89mM硼酸）中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（高至10%的丙烯酰胺、0.27%二丙烯酰胺）。用AluI（Boehringer公司产品）降解的pBR322的样品作为分子大小的标准。最初鉴别的克隆列于表2。

3.序列测定战略    用聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化合适的限制性酶解片段（用PstⅠ、PvuⅡ、Sau3AⅠ或SmaⅠ中的一个或多个酶产生），在0.5M醋酸铵、10mM醋酸镁、0.1M    EDTA、0.1%SDS中在37℃下过夜将其从凝胶中洗脱，然后用乙醇沉淀并溶于TE中，根据Sanger    F.等人的双脱氧链终止法（1977;Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74卷5463～5467页），利用通用引物（17聚合体，1211或1212号，NewEngland    Biolabs产品）或与cDNA本身互补的寡聚核苷酸引物，将其亚克隆到细菌噬菌体M13mp8和M13mp9的复制形式中以待序列测定。对于分离重迭的cDNA、从重迭的cDNA扩展已知序列或从dG/dC尾端向cDNA中心部位的序列测定来说，与cDNA本身互补的寡聚核苷酸引物非常有用。

在所有的序列测定、亚克隆和表达工作中（见实例10），限制性酶都是在TA缓冲液（实例5第2节）中使用，T₄连接酶（Boehringer公司产品）根据生产者的说明使用。

（1）.Biotechnology    Australia    Pty.Ltd.培养物收集中心的号码。

（2）.大小（如果给出）是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳大致测定的碱基对，以AluI降解的pBR322作为标准。这些数值与DNA序列测定所得实际大小略有差异。

（3）.Murray，N.K.等（1977）.Mol.Gen.Genet.（基因分子遗传学），150卷53～61页。

（4）.Bolivar，F.等（1977），Gene，2卷95～113页。

（5）.BTA647＝大肠杆菌K12、hsdR_K、supE44、supF58、lac Y1、galT22、galK2、trpR55/FlacI^q、△（LacZ）M15、LacY⁺A⁺、ProA⁺B⁺、tra⁺。

（6）.Ruther，U.和Muller-Hill，B.（1983）EMBOJ.（欧洲分子生物学组织杂志），2卷1791～1794页。

（7）.BTA634＝大肠杆菌K12△（lac、pro）、supE（glnV）、thi、lon-1、Zaj：：Tn5/F′proA⁺B⁺、lacI^q、△（lacZ）M15、lacY⁺A⁺、traD36。

（8）.pBTA286是pUR291的衍生物，其中，2355个碱基对的HpaI-AvaIDNA片段从lacZ基因的编码序列中切除，而编码序列仍留在密码中。

（9）.BTA652＝大肠杆菌K12△（lac、pro）、thi^-、supE（glnV）44、hsdR_K17endA1、gyrA96、relAl/F′proA⁺B⁺、lacI^q、△（lacZ）M15、lacY⁺A⁺traD36。

（10）.Viera，J.和Messing，J.（1982）Gene19卷259～268页。

（11）.BTA545＝大肠杆菌K12 thi^-、△（lac、argF）、U169△（lon）100、hf1150、Zjelzjf：：Tn10、rpsL、hsdR_k/F′lacI^q、△（lacZ）M15、lacY⁺A⁺、proA⁺B⁺、tra⁺。

（12）.BTA637＝BTA652、Lon^-1、zaj：：Tn5。

实例6

抑制素的克隆

1.亚基A（43KD）的克隆    首先用探针1（图3）得到为部分43KD亚基编码的两个质粒，即pBTA22和pBTA23。它们的序列分析表明，其cDNA长度不完全，所以，制备了特异的寡聚核苷酸探针，以分离从pBTA22（探针3）的5′-端和从pBTA23（探针4）的3′一端扩展的cDNA。pBTA290用探针3分离得到，而pBTA30和pBTA295用探针4分离得到。

图4给出了PstI的图谱和测定质粒cDNA插段序列的战略，图5表明了为亚基A编码的复合核苷酸序列。此序列完全包含在质粒pBTA290和pBTA295的cDNA中。pBTA30的410碱基对的片段含有终止密码子，紧靠着它的3′一端，在dG/dC的尾端之前有6个碱基的非转译区域。编码亚基A的His1的CAG位于pBTA22、pBTA23和pBTA290的PstI酶切cDNA片段的5′一端，但是并不存在于pBTA30的PstI酶切cDNA片段的240或300碱基对处。这两个片段都没有开放读码系统或与其它克隆一致的序列，因此，它们可能代表一个非重迭内含子的一部分。

在cDNA序列中，从碱基1至1140含有一个开放读码系统。在此读码系统中，第一个ATG位于碱基61（Met-60），紧跟着Met-60的氨基酸序列是一个信号肽，但与大多数信号肽不同，在疏水的亮氨酸串之前没有精氨酸或赖氨酸（Watson，M.E.E.（1984）Nucl.Ac.Res.12卷5145～5164页）。预期此信号肽终止于Gly-44和Gly-41之间，在His-1之前留下一个大约40个氨基酸的前肽。因此，最初合成的抑制素的亚基A是一个38，810道尔顿、从Met-60至Ile300的原前蛋白。

亚基A是通过切开前体中的双精氨酸残基（-2，-1）产生的，那是蛋白前体的蛋白分解加工过程中的一个普遍信号（Steiner，D.F.等（1980），Ann.N.Y.Acad.Sci（纽约科学院年刊），343卷1～16页）。亚基A的前蛋白在-6、-5;8、9和165、166位置还包含有三对精氨酸残基。将亚基A在残基165、166处切开，将产生两个我们称为AN和Ac的两个大小相似的片段。片段Ac构成了31KD牛抑制素的20KD亚基（见实例9）。预测亚基A含有11个半胱氨酸残基，其中有4个在从His1至Arg166的AN片段中。这4个残基可能形成链内键，使A_N片段从Ac亚基中分离开来。Ac亚基含有7个半胱氨酸，其中至少有一个可能与亚基B形成双硫键。以识别序列Asn-X-Ser/Thr为基础，亚基A在Asn80和Asn202处有两个潜在的N-糖基化位点（Wagh，P.V.和Bahl，O.P.（1981），CRC Crit.Rev.Biochem.10卷307～377页），并且，Asn202被包含在Ac亚基中。亚基A和Ac蛋白链的预测分子量为32，298和14，624，这比SDS-PAGE测定的天然抑制素的数值大约低25%（分别为43KD和20KD）。这一部分可能是由于天然分子中含有碳水化合物，它们可能改变其分子量及摩尔体积。从这些差别看来，A_N和A_C两部分都可能被糖基化，也许就在Asn80和Asn202位点，但糖基化中究竟是与丝氨酸还是与苏氨酸形成氧桥还不得而知。糖蛋白激素如牛LH、人CG和PMSG中含有的碳水化合物分别估计为占重量的16%、29～31%和45%（Pierce，J.G.和Parsons，T.F.（1981），Ann.Rev.Biochem.（生物化学年评），50卷465～495页），因此，我们测得的占表观分子量大约25%的数值也许代表了此范围的下限。

cDNA的序列指出在42碱基的mRNA的3′-端有一个非转译区域。它在多腺苷尾端前16碱基处包括一个典型的多腺苷信号（AATAAA）（Nevins，J.R.（1983）Ann.Rev.Biochem.52卷441～466页）。与编码序列（66.3%G+C）和5′-端非转译区域（71.6%G+C）不同，3′-端非转译区域富含A+T（40.4%G+C）。

2.亚基B（15KD）的克隆    用探针2检出了五个独立的克隆，图4表明了其中两个编码成熟的亚基B的cDNA。另外三个含有与pBTA293相似的限制性序列的cDNA，但5′-端的PstI片段较短。

亚基BcDNA的核苷酸序列得自于pBTA293和pBTA294的序列测定（图6）。亚基B至少是以前蛋白的形式合成的，并与Ac亚基相似，前蛋白特征位于C端。它由5个连续的精氨酸残基与前蛋白部分分开。它在13、14和102、103位置含有两对精氨酸残基，但它们似乎不是加工位点（Steiner，D.F.等（1980），参见上面）。它还有九个胱氨酸残基，此奇数揭示我们，其中至少有一个可以与Ac亚基形成链间桥键。从cDNA序列可以预测，亚基B蛋白链的分子量为12，977道尔顿，这与用SDS-PAGE法测定的天然亚基B的14，900的表观分子量近似。在成熟的亚基B中没有明显的N-糖基化序列，但原前蛋白中的Asn-145可能被糖基化。

亚基B的3′一端非转译区域长达94个核苷酸，而且与编码亚基A的cDNA不同，没有AATAAA的多腺苷信号。3′一端非转译区域中在多腺苷之前的最后12个碱基，与也没有AATAAA序列的促红细胞生成素cDNA的3′一端非转译的最后12个碱基密切相配（Jacobs，K等（1985）Nature（自然）313卷806～810页）。与亚基A编码区和3′-端非转译区之间的差别不同，亚基B编码区（碱基157至504）的G+C含量为54.2%，3′-端非转译区域的G+C含量也与此相似（55.3%）。

实例7

基因组DNA中类似牛抑制素的DNA序列的鉴别

与编码牛抑制素大（43KD）和小（15KD）亚基基因相似或同源的序列，在人、绵羊、猪、鱼和鸡基因组DNA中得到了鉴别。

这基本上是通过常规的南方印迹法（Southern    Blot）杂交技术完成的（Maniatis    T.等（1982）。《分子克隆》，Cdd Spring Harbour出版）。基因组DNA基本上是用限制性酶降解的，用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的片段。将DNA转移至硝化纤维素（或其它的）膜上，然后用编码牛抑制素43KD或15KD亚基中大部分蛋白链的³²P-标记的cDNA作为探针与之杂交。这样可检测出核苷酸序列相似甚或一致的基因组DNA片段。

基因组DNA是分别从人巨噬细胞系U937（ATCC CRL1539）或人血、猪血和鸡血或从牛和绵羊的软组织中制备的。从软组织和人细胞系制备的方法基本上与前面Maniatis T.等人的文章所述一致。从血液中制备DNA的方法如下述：10～15毫升血液（+0.625%柠檬酸盐）用10mM EDTA、10mM Tris-Hcl pH7.5（TE10-10）的冷溶液稀释至40毫升，在冰上放置5分钟使红血球溶解。以4000Xg离心5分钟后将沉淀悬浮于10毫升TE10-10的冷溶液中，用TE10-10稀释至40毫升，以3000Xg离心5分钟。沉淀在10mM Tris pH7.5、5mM EDTA（与初始血液等体积的）溶液中分散。加入10%的SDS至0.5%的浓度，加入蛋白酶K至50微克/毫升，混合物在37℃下保温过夜并加以轻缓摇动。加入10毫升用0.1mM Tris-Hcl pH8.0饱和并含有0.1%的8-羟基喹啉的苯酚，在室温下轻轻搅拌5～10分钟。加入10毫升CHCl₃∶异戊醇（24∶1）并搅拌5～10分钟，然后以8000Xg在室温下离心10分钟。水相用15毫升CHCl₃∶异戊醇萃取两次以上。在室温下加入1/20体积的5MNaCl和2倍体积的乙醇并搅拌。DNA用巴氏吸液管取出，空气干燥30～60秒后溶于4毫升TE中，在37℃下轻度搅动3小时。DNA如上述再次沉淀并再溶于3毫升TE中。

根据生产者的说明，在40～50微克/毫升浓度下用最高达500单位/毫升酶浓度及16小时的保温时间，用各种限制性核酸内切酶降解此DNA样品（一般取10微克）。所得产品用等体积苯酚萃取去除蛋白，跟着用氯仿萃取三次，然后用2.5倍体积的乙醇沉淀于0.2MNaCl中。将沉淀的DNA溶于水中，在TAE缓冲液中在1.1×1.4厘米的琼脂糖凝胶上电泳（75伏、4小时），以分离不同大小的DNA。将凝胶浸于1.5MNaCl、0.5MNaoH溶液中45分钟使DNA变性，然后两次浸于3.0MNaCl、0.5MTris-Hcl    pH7中45分钟使之回到中性。利用毛细作用将DNA转移至硝化纤维素膜上（Schleicher及Schuell公司产品），在80℃下真空烘烤2小时使之固定。这些滤器与含有50%的甲酰胺、5×SSPE（Maniatis等，参见前面）、5×Denhardts和25微克/毫升超声波处理过的鲱鱼精子DNA预先杂交过2～4小时。

杂交探针如下：

1）、来自pBTA23中亚基A的cDNA基因的790碱基对的SphI-SmaI片段（图5）。

2）、得自pBTA293之牛亚基B克隆的1109碱基对的SphI-EcoRI片段（图4）。它在361至718碱基处含有亚基B的cDNA（图6），还含有pBR322中pstI至EcoRI切点的751碱基对片段。

这些片段是在电泳后从低温胶粘的琼脂糖凝胶上分离到的，并根据Feinberg，A.P.及Vogel-stein，B.（1984）在Anal.Biochem.137卷266-267页中所述方法用α-³²PdATP进行标记。

大约有30毫微克DNA的标记比强达到2×10⁸至2×10⁹每分钟计数（CPM）/微克DNA，将3×10⁶至4×10⁶CPM之间的探针加热至100℃后，在含有1×Denhardts、50%甲酰胺、5×SSPE、1×Den-hardts、10%葡聚糖硫酸酯、25微克/毫升超声波处理过的鲱鱼精子DNA的溶液混合。滤器在42℃下杂交20小时。用2×SSC、0.1%SDS在室温下浸洗滤器，然后分别在2×SSC、0.1%SDS中，1×SSC、0.1%SDS中，0.2×SSC、0.1%SDS中在50℃下浸洗30分钟。杂交条件必须使至少70～75%的与牛cDNA同源的序列达到杂交。曝光于富士RX型X-光胶片至少24小时后，可以用已知大小的DNA片段为标准来确定杂交片段的大小。

下面给出了与牛亚基A或B基因探针高度杂交的人、牛、绵羊、猪和鸡基因组DNA片段的大致大小（碱基对）。

每一种测试的DNA都具有一定数目（一般为一个，少数用PstI降解的可达到三个）与大或小的牛抑制素亚基cDNA的探针杂交的片段。但它们有一个共同的特点，即所有与大亚基cDNA杂交的DNA都是具有一个大约为480碱基对的PstI片段。这些杂交片段表明，在牛以外的生物种中，也存在着与牛抑制素基因相似或同源的基因。并不排除这样的可能，即没有被选择进来的抑制素cDNA序列的探针可能与表3中没有的基因组DNA杂交。

在另一系列实验中，用牛亚基的cDNA作为探针检测了鼠卵巢RNA中的亚基A和B的mRNA前体。在用PMSG处理过的鼠卵巢中，发现这些mRNA更为丰富，表明抑制素DNA能够用作诊断探针。

因此，编码牛抑制素亚基A和B的cDNA基因，能够用于鉴别其它生物基因组和器官中的编码抑制素分子的DNA和RNA。由于这一点，它们编码的抑制素分子与牛抑制素是同源的，并可以相似的方式加以应用。

实例8

从基因组DNA中分离类似人抑制素的序列

已经分离得到了与编码牛抑制素亚基A和B的cDNA相似并同源的人DNA序列。这是通过将人基因组的DNA文库克隆到λ噬菌体中、用从编码牛抑制素亚基A或B的cDNA制备的³²P-标记的DNA片段作探针与噬菌斑杂交而完成的。分离阳性噬菌斑的噬菌体DNA，用限制性核酸内切酶降解，为测定其核苷酸序列，将含有类似抑制素的DNA片段（利用实例7中的探针和技术通过南方印迹杂交法确定）亚克隆到M13中。

以上面Maniatis等所述方法为基础，我们还在入噬菌体EMBL3中建立了人基因组文库，或在入L47中建立了类似的人基因组文库（Loenen，W.A.M.和Brammar，W.J.1980Gere 20卷249～259页）。人基因组DNA（如实例7所述制备）用Sau3AI进行部分降解，产生长度大约为5～30千碱基对的DNA。取12.5微克DNA在TE及1M NaCl中进行蔗糖梯度离心以分离不同大小的DNA（McCarty，K.S.等（1974），Anal.Bioehem.61卷165～183页），所用梯度中C_mix＝15%、Cr＝31.5、Vm＝34.45、aK＝2.174，离心时间为2小时，转速为50，000RPM，使用贝克曼SW50.1型转子。

从此梯度中收集约为15～25千碱基对的DNA，用5微克tRNA作载体进行乙醇沉淀并连接到入EMBL3的臂上。用核酸内切酶BamHI及EcoRI降解EMBL3的DNA（美国Promega Biotec.Madison WI公司产品），用苯酚和氯仿萃取除去蛋白，在0.3M醋酸钠的存在和0～4℃的温度下，用0.6倍体积的异丙醇进行沉淀。取2.4微克与大约1微克15～25千碱基对的人DN在体积为40微升的10mMTris-Hcl pH7.5、10mM Mgcl₂、1mM ATP、20mM二硫苏糖醇、2单位T₄DNA连接酶（Boehringer Mannheim公司产品）中混合，在15℃下保温20小时。加入95微升的Packagene（Promega Biotec公司产品）在22℃下保温2小时。用限制性宿主NM539涂布混合物（参见Promega Biotec公司的说明书），使其密度大约为直径14厘米的每块平板上有50，000个噬菌斑。上述反应的混合物可产生8个这样的平板。

噬菌体L47中的人基因组文库也用NM539涂布成类似的噬菌斑密度。

为了便于用抑制素cDNA的探针杂交，根据Maniatis等人所述方法（1982，参见上面）将噬菌斑转移到硝化纤维素滤器上，每个平板做两个重复。标记的探针如下：对于相应于牛抑制素亚基A的序列，使用pBTA297中790碱基对的SphI-SmaI片段与λL47文库杂交，使用pBTA297中含有亚基AcDNA的BamHⅠ-HindⅢ片段（见表2）与EMBL3文库杂交。小亚基的探针是实例7中所述的SphI-EcoRI片段。制备、标记及杂交条件与实例7中所述南方印迹杂交法相同。对于噬菌斑的第一次筛选来说，杂交溶液中包括有两种探针。

将潜在的阳性噬菌斑洗脱、再涂布于平板上用探针杂交直至获得纯克隆。有两个克隆非常有用，即从L47文库获得的与大（A）亚基杂交的λA2和从EMBL3文库获得的与小（B）亚基杂交的B1。A2携带有一个大约11～12千碱基对的人DNA插段。将其用PstI降解可产生若干片段，其中有三个片段值得注意，它们与牛的A基因的用³²P-标记的SphI-SmaI片段杂交（如上述）。用PvuⅡ降解则产生与相同探针杂交的两个片段（表4）。

1160和480碱基对片段（由PstⅠ降解）及800碱基对片段（由PvuⅡ降解）的大小与杂交于相同探针的PstⅠ和PvuⅡ片段相似，此相同探针即实例7中所示的人类基因组DNA的南方印迹法分析中的探针。

相同的λA2与pBTA295中³²P-标记的500碱基对的

表4

酶    DNA大小（碱基对）    杂交程度

PstⅠ    2500    +

〃    1160    ++

〃    480    ++++

PvuⅡ    800    +++

〃    420    ++

PstⅠ片段进行南方印迹法杂交，仅只鉴别出λA2中1160碱基对的PstⅠ降解片段。这种方式的杂交与以下假设是一致的，即克隆的人DNA片段携带着与牛抑制素DNA相似或同源的序列。用PstⅠ降解λA2，然后从低温胶粘的琼脂糖凝胶中切除480、1160和2500碱基对的片段，将其亚克隆到M13中，核苷酸序列测定（参见实例5第3节）所得结果示于图7中。在碱基275和276之间，略去了一个1.4～1.5千碱基对内含子的DNA序列。它代表的氨基酸序列和牛抑制素原前亚基A的氨基酸序列很相似，这表明它是一个同源蛋白，并代表人类抑制素亚基A和Ac的前体。人类抑制素的A_N片段被定义为氨基酸His 1至Arg 171，氨基酸Ser172至Ile306则为Ac亚基。

λB1的克隆携有大约21～26千碱基对的DNA插段。此DNA也用限制性核酸内切酶PstⅠ降解，在1%的琼脂糖凝胶上电泳以分离不同大小的片段，并转移至硝化纤维素滤器上。与从pBTA293中纯化得到的136碱基对或510碱基对的抑制素PstⅠ片段（³²P-标记）（图4）杂交时，较小的探针结合于长约1300碱基对（1100～1350碱基对之间）DNA片段上，而较大的探针结合于长约800碱基对（740～840碱基对之间）的片段上。800碱基对片段的部分核苷酸序列通过下列步骤测定：用PstⅠ降解λB1，在低温胶粘的琼脂糖凝胶上纯化约800碱基对的PstⅠ片段，将其克隆到M13mp9的PstⅠ位点中，然后测定核苷酸序列。图8所示的核苷酸序列，是将800碱基对片段中的较小片段（PstⅠ-Sau3AⅠ;Sau3AⅠ-Sau3AⅠ）亚克隆到M13中后的序列测定结果。由DNA序列转译确定的氨基酸序列表明，此DNA编码抑制素的整个B链，并表明人类B链中Gly1至Ser116与牛的B链是一致的。

可以认为，这些λ克隆的片段携有人类抑制素的DNA序列及相似的合成片段，它们可以插入原核生物或真核生物的表达系统中，以产生人类抑制素或与抑制素有相关结构的多肽（见实例10）。而且，λ克隆本身也可以转导合适的真核细胞系以得到表达。

利用牛cDNA作为探针，检测各种脊椎动物中的抑制素亚基基因（实例7），然后通过人类抑制素亚基基因的克隆技术和序列测定，表明了氨基酸序列的广泛相似性，这一切揭示了其它脊椎动物的抑制素与牛抑制素蛋白即使不是一致也是同源的，此牛抑制素蛋白在国际专利申请PCT/AU85/00119和图5、图6中都有定义。

我们检测了抑制素在多种脊椎动物的卵泡液或卵巢提取物中的活性（例如见表5），我们还根据国际专利申请PCT/AU85/00119和实例9的方法，从人FF和绵羊FF中纯化得到了天然抑制素，发现这两种抑制素都与牛抑制素的功能相似，并具有与牛的亚基结构相似的58KD和31KD的亚基结构形式。

而且，通过国际专利申请PCT/AU85/00119中所述的兔抗血清的作用，可使兔、牛和人类的抑制素发生免疫中和，该抗血清是由于抗纯化的58KD的牛抑制素而产生的，它们还能在RIA中发生交叉反应，这再次表明了它们之间有密切的结构同源性（表5）。

然而，天然的牛抑制素能在兔子体内引起免疫反应的事实，表明兔和牛抑制素之间存在区别，这种区别被兔免疫系统作为异体蛋白识别，因此，一个种的抑制素可在另一种中作为抗原使用，以产生能识别内源抑制素的抗体。

即使表5中所有的种都在鼠垂体细胞培养物中具有活性（这些细胞表现出与其感受体相互作用时所要求的构象一致性），兔产生的抗体与绵羊或鼠的抑制素仍没有显著的交叉反应，这表明该抗血清对于特异抗原决定基有专一性。

从前面的讨论中可以明显看出，由于亚基B具有高度的保守性，并可能在大多数种中具有一致性，因此，利用突变的亚基B蛋白作为抗原，以产生能与内源抑制素的亚基B发生交叉反应的抗体，将对于许多种有广泛的实用性，并将在许多种中产生良好的效果。通过下列技术可产生这样的抗原，如DNA的体外诱变，然后使新基因如实例10所述方法进行表达，或对亚基B蛋白进行化学修饰，或从具有与图6和图8中亚基B相似而不一致的亚基B的种中分离出亚基B的基因，然后使该基因如实例10所述方法进行表达等。

表5.卵泡液抑制素与兔474抗牛58KD抑制素

抗血清的相互作用

种 免疫中和反应 在RIA^＊中的交叉反应% 31KD示踪物

58KD示踪物

牛    +    100    100

人    +    27    28

绵羊    -    8.0    0.3

鼠    -    6.0    未测

兔    +    未测    未测

^＊参见实例16第1节。

实例9

58KD和31KD两种形式抑制素之间的关系

卵泡内粒细胞制造抑制素，並将其分泌至卵泡液中，如前所述（国际专利申请PCT/Au/85/00119）抑制素最初是以58KD形式存在。

旨在改进从牛卵泡液中提纯抑制素效果的研究为较小形式的抑制素提供了证据，使用Roberson.D.M.等人的纯化方法（1985;生化生物物理研究通讯126，220～226，国际专利申请号PCT/Au85/00119），在最初中性和酸性缓冲凝胶过滤色层分离步骤中间加进了在PH4.75的沉淀操作。从而获得了第二种生物活性物，利用酸性凝胶过滤可将这种活性物与第一种生物活性物分开，将第二种活性物进行逆相高压液相色谱和用于制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现这种物质是一种蛋白质其分子量约为31，000，并由两个分子量分别为20，000和15，000的亚基组成，这两个亚基的生物学活性与原来的58KD物相似。两种抑制素的小亚基的分子量非常接近（约15KD），这说明两种抑制素分子量所表现出的差异主要是因为43KD亚基部分的改变，它缩短了大约20KD。

此外，纯净的58抑制素在与小公牛血清（SS）或人绝经期血清（PMS）一起培养可转变为31KD形式的抑制素。这种裂解现象在与bFF（图9）一起培养时不会发生。所以，较小（31KD）形式抑制素和其更大（20KD）的亚基可以认为直接来自58KD形式的抑制素。后者在国际专利申请PCT/Au85/00119）和Roberson.D.M.等（1985）的文章（生化和生物物理研究通讯126，220-226）中已有介绍。同时也可以直接从所描述的亚基基因衍生而得。

另一方面，同样明显的是，不含天然抑制素（SS和PMS）的血清可以用来在体外进行抑制素或其亚基的重组，有关的酶可以从血清或进行这种反应的细胞中提纯並用于有相同终点的反应。这种酶具有对蛋白酶抑制物的活性特征。将碘化58KD抑制素与血清一起在有SS或PMS存在情况下，30℃培养17小时，58KD形式抑制素转化为31KD形式抑制素的百分比可因包函 1/3 mM对氯汞苯甲酸或10mMEDTA而从24%减小至4.5%。而杆菌素和胃蛋白酶抑制素（各为0.3mM）却无此效力。这种蛋白酶的抑制作用是酶过程所独具的特征（Lazure.C等（1983），加拿大生化杂志，细胞生物学，61，501-515）。此种发现亦有证明，即有一个典型作用位点（精氨酸-精氨酸）与用于该反应的A亚基（图5）丝氨酸167有关。

抑制素在释放到血清中时发生裂解，生成2个分子，即31KD形式抑制素和A_N片段（较大亚基的1-166氨基酸）。虽然已知31KD形式可以抑制垂体细胞对FSH的合成与释放，但它有可能一或两个分子回到性腺並直接调节性功能。此外，除了垂体的FSH调节机能外，抑制素本身，抑制素片段或其前体分子如A_N有生物功能。经肽1兔699的免疫，其FSH滴度急剧下降到零（例15）这一事实为我们提供了某种启示。

形成的两种抑制素亚基可视为前原分子。每个亚基的前肽可能已具有它们本身的生物活性，以及细胞生长和调节作用。31KD形式的抑制素本身与生长转化因子-β，非常相似（Derynck）.R.等（1985）自然316，701-705），也可以认为，这种天然分子除了已知的对垂体细胞合成FSH有影响外，尚在细胞调节过程中起一些作用。

实例10

抑制素CDNA的表达

a、43KD和20KD亚基：虽然克隆BTA405（表2）含有编码抑制素的部分大亚基的CDNA，但是不能期望生成那怕一部分抑制素，因为这种CDNA是以dC结尾（见例3a），而且没有核糖核蛋白体的结合点，或者起动序列中没有ATG（f-甲硫氨酸）密码子。为了获得抑制素部分基因得以表达，pBTA23，cDNA最大的（约480bp）PstⅠ片段克隆到PUR292的pstⅠ位置，以制造出一个融合肽。在正确的定向中，这样操作可产生由大部分大肠杆菌β-半乳糖苷蛋白酶组成的蛋白质，也能够产生抑制素43KD亚基的氨基酸27-183。质粒结构转入大肠杆菌BTA647（表2）。

为鉴定这种克隆，使用了免疫筛选法，将转化的细胞接种在含有50μg/ml氨比西林钠盐的LB琼脂上，37℃培养16小时，以选取转化株，在硝酸纤维素膜（Schleicher和Schuell）上复制菌落，使用浸有印度墨水的细针穿过纤维膜刺入琼脂以标出生长方向。主平板可贮藏在4℃备用。培养的复制品在滤膜面朝上置于含有50μg/ml氨苄青霉素钠的新鲜LB琼脂上3个小时。在含有0.5mM异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的LB琼脂中，37℃培养2小时以诱导融合蛋白质。将滤膜放在一张用0.2MNaOH/1%（重量/体积）SDS饱和的Whatman3MM滤纸上，经5分钟后，在用0.5MpH7.5Tris-Hcl缓冲液饱和的滤纸上进行中和。菌落释放出的蛋白质就地与硝基纤维素结合。将滤膜浸入含有附加的Tween20（0.5%（体积/体积）的TST中（150mMNacl和0.05%（体积/体积）Tween    20（Sigma）和10mMTris-Hcl（PH8.0），轻轻搅动1小时，以封闭硝化纤维素上残留的所有蛋白结合点。滤膜先用含经TST以1∶50稀释的兔抗-牛58KD抑制素抗血清溶液（国际专利申请PCT/Au85/00119），在室温下处理过夜，再在TST中清洗若干次以除去残余抗体。用在TST中以1∶200稀释的猪抗-兔免疫球蛋白-马萝卜（horseradish）过氧化物酶结合物（Dakopatts），在室温下处理滤膜1小时，然后在TST中清洗，最后，在20mMpH7.5Tris-Hcl洗涤，並用含有0.5mM/ml氯萘酚和0.03%（体积/体积）H₂O₂/20mM Tris-Hcl，pH为7.5的溶液染色。

含有融合肽的菌落可以从滤膜上着色深的部分鉴定出来，其余部分分系生长着对照菌株：BTA647（PUR292）。将稀释的抗血清与长有诱导的和自溶的大肠杆菌BTA647（PUR292）的滤膜进行予培养，以期减低兔抗-抑制素抗血清的抗-大肠菌抗体滴度，尽管做了如此努力，其它菌落的背景染色仍然可见。

将三个这样的菌落进行纯化，並对它们的质粒成分进行分析，所有菌落都包含pUR292並具有正确定向培养中所期望获得的cDNA片段。其中一个菌株称之为BTA410，其质粒为pBTA28（表2）。使用了Western印迹分析法（Towbin，H;等（1979），美国科学院报76    4350-4354）对融合肽的鉴定进行检测，这种方法包括用十二烷基磺酸钠使蛋白质变性，用聚丙烯酰胺凝胶电泳使之按大小顺序分离，然后再转移到一片硝化纤维素上。为确定哪种蛋白质含有抑制素抗原必要成分，将硝化纤维素按上述方法处理。按下述方法制备蛋白质样品。

在37℃生长在LB上的BTA647（pUR292）和BTA410的过夜培养物以1∶100稀释到新鲜培养基中进行培养，直到浓度为A6000.4，然后制成0.5mM    IPTG溶液，继续培养两小时后收获，细胞颗粒物直接悬浮在0.1体积的负载缓冲液（含有30%（重量/体积）蔗糖/1%（重量/体积）SDS/0.1Mβ-巯基乙醇/0.01溴酚兰的电泳缓冲液），在沸水浴中加热5分钟。样品（10-30μl）用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（Laemmli.U.K.（1970）自然。227，680-685;mattick.J.S.等（1980）Eur.J.生化114，643-651）直至溴酚兰达到凝胶底部为止。横向转移使用的Hoeffer移点装置，在15.6mM    Tris碱/120mM甘氨酸中进行，电流为1amp，持继1小时，如上所述，用抗血清对滤膜进行处理和中断，为了在聚丙烯酰胺凝胶中直接看到蛋白质，将凝胶浸入脱色溶液（10%（体积/体积）甲醇/5%（体积/体积）冰醋酸），30分钟，再用0.5%（重量/体积）溶于同样溶液的考马斯亮兰（Coomassie    Brilliant    Blue）R250染色1小时，轻轻搅动凝胶，更换几次脱色溶液以使凝胶脱色。显出的蛋白质带链可与Western法和免疫检测法的蛋白质进行比较。BTA410菌株至少含有两种蛋白;两者合在一起占细胞被IPIG诱导出的总细胞蛋白的5-10%，並可用抗-抑制素抗血清（图13，规迹10）检测。菌株BTA647（pUR292）（图13，规迹11）中不存在两种蛋白质。与天然β-半乳糖苷酶相比，它们分子量更大（约130和117KD），所以代表了β-半乳糖苷酶抑制素融合蛋白质。最大的融合蛋白质与DNA分析中估计的蛋白质相一致（约132KD）。

用相似的方法，可使pBTA30的410^bpPstⅠ片段在pUR291中得到表达。得到的质粒称之为pBTA292（表2），用抗-抑制素抗血清（图13，规迹9）法可以检测这种融合蛋白质。

为了获得表达完全的亚基，将pBTA290和pBTA30中的cDNA进行连接，所以采用的战略步骤如图10所示。简言之，它包括了每个克隆中Sau3AⅠ片段的提纯，在唯一的RsaⅠ处切断，並且再行结合。混合的结合产物再经Sau3AⅠ切割，然后将其接入pUR290。用探针3和4筛选克隆（图3），以便鉴定同时含有pBTA290的5′-Sau3AⅠ-RsaⅠ片段和pBTA30的3′-RsaⅠ-Sau3AⅠ片段的克隆，在正确定向培养中进行这种插入可以保证生产出β-半乳糖苷酶-抑制素融合蛋白，因为pUR290能够给出从天门冬氨酸-10至异亮氨酸300之间的正确读码、使用从含有pBTA28和pBTA292（见例9）的融合产物的柱中分离出的特异性抗体，可以独立检测出480和410bp    PstⅠ部分片段的正确表达。所得质粒称之为pBTA296（表2）。这种完全的A亚基基因也曾作为一个Sau3AⅠ-Sau3AⅠ片段被克隆到pUC7的BamHⅠ点，所得到的质粒（pBTA302，图12），又被转移到BTA652使之产生BTA426（ATCC67057），在Sau3AⅠ位置上天门冬氨酸-脯氨酸序列可以用来从蛋白质链的上部（upstream）切下融合蛋白质的抑制素部分，因这个序列在甲酸中是很不稳定的（nilsson.B.等（1985）Nucl.AC.Res.13.1151-1162）。

被融合到BTA419菌株的β-半乳糖苷酶（天门冬氨酸-10至异亮氨酸300）中的43KD亚基的完全表达已如图13规迹8所示。除了完整长度的β-半乳糖苷酶-抑制素蛋白质之外，至少还有3个较小长度的蛋白质带链，其分子量小至与天然的β-半乳糖苷酶相近，这或许代表了完整产物蛋白质水解降解现象，或过早终止转录和翻译。绝大部分融合蛋白质是可溶的。从pBTA296中切下抑制素DNA和与之相伴的β-半乳糖苷酶DNA，作为一个EcoRⅠ限制片段将其插入pBTA286（表2、图13，规迹4）以产生pBTA297（表2），使之上述菌落免疫杂化方法可以选出一些克隆，它们能在缩短了的pBTA286β-半乳糖苷酶蛋白的C末端表达抑制素DNA，使用相差显微镜检测这些克隆（即BTA    420;表2），可以看到，它们产生一种不溶性的融合蛋白质产物，称之为包涵体，这种包涵体具防止细胞蛋白质水解降解的保护作用，並能大大简化抗原制备中的纯化过程（例12和13）。菌株BTA420定名为ATCC67054，其它BTA420的纯化后的包涵体蛋白质见图13，规迹3。BTA426A亚基的表达见图13，规迹14，此种蛋白质主要是以包涵体形式生成。BTA426的最长的融合蛋白质与BTA420融合蛋白质不同，不仅数量最多，而且在Western印迹分析中反应最明显。这说明在类似抑制素蛋白质生产中它是最主要的宿主-载体接合体。

从以上所述，可明显地看出其它起限制作用的酶部位在A亚基的表达中也可能有一定的用途，其中最主要的点是仅有的跨越组氨酸1编码的SP^hI点，可以设计寡聚核苷酸联结子使之在各种宿主和载体中表达A亚基或A_N片段，表达形式可以是融合产物，也可以是非融合的，单独的蛋白质，此时，在CAG组氨酸编码前面引入了一个新的f-蛋氨酸密码;或在组氨酸1之前加入一个肽。凡从事这一工作的人都清楚地知道这种结构，具体实例见图11。

设计这种表达联结子可以使之表达43KD蛋白质，其方法是在插入到trp起动子质粒如：perpL1（Edman.g.C.等（1981）自然291.503-506）之后，借用一个新的N末端的蛋氨酸。这种设计对于pUC7，pUC13或pUR290是利用了ClaⅠ部位，在插进后表达形式为β-半乳糖苷酶-抑制素融合蛋白质。对于pWT121，则利用BamHⅠ部位，在插入后表达形式为一种trpE-抑制素融合蛋白质（Tacon，W.等（1980）Molec，Gen，Genet，177.427-438）。

全长前原A亚基的前体的再重建的方法如图12所述。一般说来，包括从pBTA295分离PvuⅡ-PvuⅡ片段，加入图11Aii所示的联结子（未经砱酸化作用），以使信号肽5′的前4个氨基酸（蛋氨酸-60至谷氨酰胺-57）再重建到第一个PvuⅡ部位，並在5′末端提供出BamHⅠ部位。用SphⅠ切割联结子的分子，接到用BamHⅠ和SphⅠ切割过的pBTA297中以产生pBTA305。

这种中间体所表达的前原A亚基系一种融合蛋白质抑制素DNA序列也可以切成HindⅢ-HindⅢ片段或ECoRⅠ-EcoRⅠ片段，备以后使用。特别是EcoRⅠ-EcoRⅠ片段可以继续被亚克隆到pUC8或pUC9中，抑制素cDNA序列经切割可以得到BamHⅠ-BamHⅠ片段，在使用pZIP    NeoSV（X）1载体时，可在真核细胞中得到表达（Cepko.C.L.等（1984）细胞37，1053-1062）。这种表达系统予期得到的产物是分泌出的43KD蛋白质的糖基化形式，与以前描述的原核系统不同。

因此，5′PvuⅡ，Sau3AⅠ和SphⅠ部位都能提供方便的表达43KD蛋白质的联结子部位。在碱基734起动子的HaeⅡ结构为表达起始于精氨酸165的A亚基的Ac部分提供了方便。

利用图11Aiii描述的HaeⅡ部位联结子在pUR290、pBTA286和pUC13中以得到β-半乳糖苷酶融合产物的表达形式。为实现此种表达，所用的pBTA30HaeⅡ-Sau3AⅠ片段应予纯化，並需加入联结子，生产出的结构经Sau3AⅠ切割，然后用异丙醇沉淀DNA，异丙醇只能有效地沉淀DNA大片段，对像联结子这样的小DNA片段却缺乏效力。沉淀的DNA又溶于TE，並接入pUR290，将质粒转化到BTA634，所得克隆复制在两个滤片上，其中一个滤片被筛选，如例4所述，该试验使用〔³²P〕-标记的HaeⅡ联结子（上部DNA链如图11Aiii所示）。另-滤片用探针4处理（如图3）。选出用两个探针检测过的克隆，用Western印迹分析检测其表达作用。其中一个这样的克隆画于图13，规迹7，並命名为BTA421（表2）。编码抑制素Ac亚基及其相关的β-半乳糖苷酶DNA序列的DNA片段也已经作为EcoRⅠ片段被切下，並将其插入pBTA286用于表达出同样不易溶解的融合蛋白质，所以在提纯和防止降解方面，具有优点，该菌株已定名为BTA422（ATCC67059;表2，图13，规迹2）。

编码Ac亚基的新的BamHⅠ-Sau3AⅠ片段也已从pBTA298中切出，并被亚克隆到PUC13以产生出一个短的融合蛋白质。BTA427菌株（ATCC67056，表2）产生以包涵体形式出现的这样的蛋白质，经凝胶分析表明（如图13，规迹15）和BTA426情况一样，最长的融合蛋白质数量最多，並且在Western印迹分析中最容易看到，可以说BTA427对于生产类似抑制素蛋白质是很有用的宿主-载体结合体。

图11中每个联结子具有最突出的特点是，当从BamHⅠ部位起始的DNA得到正确的表达氨基酸序列（天门冬氨酸-脯氨酸）可能连接到融合蛋白质。如上所述，该序列在甲酸中不稳定，可以用来从蛋白质上部切下抑制素蛋白质（Nilsson.B.等（1985）Nucl.Ac.Res.13    1151-1162），其中的A亚基蛋白质中没有天门冬氨酸-脯氨酸序列。当然其它分离方法从融合蛋白质分离出某个序列也是可能的。这方面的例子包括进入蛋白酶辨认序列，例如Xa因子辨认序列（Nagai.K.and    Thoger    Son.H.C.（1984）自然309，810-812）或胶原酶辨认序列（Serminu    J.and    Bastia.D.（1984）proc、Natl    acad    Sci.UsA81，4692-4696）有关用以辨认配对精氨酸残基的酶的可能性，以前已有讨论（见例9）。在上述的抑制素序列之前连接蛋氨酸可以用溴化氰切割融合产物，以获得不含β-半乳糖苷酶的抑制素片段。抑制素序列中蛋氨酸残基可以用体外DNA诱变，而转变为相应其它氨基酸，而且因为全长类抑制素蛋白质与融合蛋白质前体分开，故可以更广泛地使用溴化氰切割技术。蛋氨酸残基本身转变也可以产生出具有一些更佳抗原性质，或类抑制素起动剂或拮抗剂性质的分子。

b.15KD亚基的表达，pBTA293的510bp    PstⅠcDNA片段（图4）被接到pUR291PstⅠ部位，然后将该质粒转化到大肠杆菌BTA634，使用24-倍降解14寡核苷酸从所得克隆中筛选产生的重组质粒，这种核苷酸起初是曾用来分离pBTA293和pBTA294（探针2，图3）。使用限制性酶HindⅡ将若干重组质粒变换（mapped），为了在聚丙烯酰胺凝胶上表达，则分析那些在正确定向培养中含有插入成分的两个质粒，这类菌株称之为BTA423（表2）。

pBTA293的510^bp pstⅠcDNA片段直接克隆到pBTA286的PstⅠ部位，並转化到BTA634，用以表达一种融合蛋白质。pBTA286是从pUR291中衍生的，以使横过PstⅠ部位的读码能允许这种直接的克隆，这种产生的菌株是BTA424（ATCC67058，表2），而且产生作为包涵体的融合产物。

pBTA293的510bp pstⅠ_cDNA片段也克隆到puc8的pstⅠ部位，而且转化到BTA637用以表达一种不溶性的短链融合蛋白质，后者並产生菌株BTA1360（ATCC 67055;表2）

BTA423，BTA424和BTA1360的融合蛋白质粒都不能用兔抗抑制素抗血清检测（图13，规迹1，6，和16），虽然它可以检测A和Ac亚基融合蛋白质，这表明对15KD蛋白质来说，其抗体水平很低，甚至等于零。所以单独使用A或Ac亚基可以获得与抗抑制素免疫作用相关的生物效应（见例17-20）。

通过分离HaeⅡ片段，並加入图11Aiii描述的HaeⅡ部位联结子可以实现对15KD序列的表达，这种片段跨越整个15KD序列和精氨酸-5至-1。所以得到的融合密码如图11Bi和上文所述，对于_pUR290/puc7/puc13中表达β-半乳糖苷酶融合蛋白质是很有用的，在实现这种表达时要利用BamHⅠ部位和甲酸在Asp（天门冬氨酸）-pro（脯氨酸）序列处分离融合蛋白质的能力。此外，ClaⅠ部位对在ptrp＜1中的表达是有用的（Edman.J.C.等（1981）前述），在ptrp＜1中ATG起着新的翻译起动点的作用。

表达的第三种可能性是使用唯一的HindⅡ部位，或利用要求的联结子和蛋氨酸-1序列（图11Bii）合成编码氨基酸1至8的DNA序列。

因此，pstⅠ、H_aeⅡ和HindⅡ部位都是加入表达联结子的方便部位。在510bpⅠ片段的H_aeⅢ部分水解后使用跨越氨基酸1和2的该片段的H_aeⅢ部位（GGCC），也是可能的。此外，对这一领域工作经验丰富的人来说，都清楚地知道有多种的表达系统。上述有关A和Ac亚基的各种可能性对B亚基也是适用的。

很明显，为了研究其功能，可能只表达部分亚基的前体，不表达抑制素A_c和B亚基序列。例如，A_N片段DNA可以分离出来，作为一个SphⅠ-H_aeⅡ（部分）片段，在用图11Ai和11Aiii所示联结子的情况下，使之在puc7或puc13中得以表达，以便两个末端转变成BamHⅠ部位。

同时，已知抑制素蛋白质或类抑制素蛋白质或肽的表达不能只局限于上述实例。尚有很多的可用于原核或真核细胞不同的表达系统，它们是为从事这方面工作的人所熟悉的，当然它们也适用于表达这里所给出的某些序列。

因为牛的和人的B亚基氨基酸序列是一样的，所以，不难明了，编码牛B亚基的_cDNA得以表达时的产物，与相似的人DNA序列的表达所获得的产物是一致的。因此，应该认为菌株BTA423、BTA424和BTA1360也能产生人抑制素的B亚基。

实例11

分离抗抑制素抗体

从BTA410和BTA415得到的含有β-半乳糖苷酶-抑制素融合蛋白质的蛋白质组分，借助碳酰二咪唑方法与Sepharose    CL-6B结合（BetheⅡ.G.S.等（1979）J.Biol.Chem.254，2572-2574），用亲合纯化方法从1ml兔抗抑制素抗血清中分离对各融合蛋白质的抗体，这些吸附的抗体是用3MMgCl₂从柱上洗脱，並在PH7.5，10mMTris-Hcl/150mMNacl溶液中透析。

洗脱出的抗体用以进行Western印迹分析，以检测各种融合蛋白质，结果表明，它们只与和它们分离的融合蛋白质结合，即无交叉反应，β-半乳糖苷酶抗体与抗抑制素抗体相比其数量可以忽略不计。用来自BTA425、420、422和424菌株的融合蛋白质进行了相似的实验。

这些实验表明，重组抑制素或类抑制素蛋白质可以用来提纯抗抑制素抗体和筛选单克隆或多克隆抗体制备物。以便获得抗抑制素抗体或作为抑制素试验系统，（如ELISA′S和RIA′S试验）的标准物。

实例12

合成肽的合成

另一个在原核和真核细胞中产生类抑制素蛋白质的途径是化学合成部分或全部抑制素。这样合成的肽可以作为抑制素的类似物，强化剂和拮抗剂，其用途如例10和11所述。

所采用的合成、提纯、鉴定合成肽程序如下。使用430A型肽合成器（应用生物系统Inc公司产品）和未经过改造的市售Version    1.00软件。全部试剂皆由应用生物系统公司供应。反应器充入C末端氨基酸（0.5mmol），这些氨基酸能以其共价键方式与PAM树脂结合。每个残基偶联后，便以茚三酮反应鉴测合成效果。连结在树脂上的肽的产率一般情况可达75%。

要使肽与树脂分离或去保护（deprotection），可在清除剂苯甲酚（0.5ml）和甲苯硫酚（0.5ml）存在下，在0℃用氢氟酸（10ml）处理与肽结合的树脂1小时。这种分离和去保护是在聚四氟乙烯HF-反应装管中进行的（Protein    Research    Foundation，Osaka，Japan），将反应产物在乙醚（3×50ml）中捣碎，过滤，然后将得到的肽溶于乙酸（10%），过滤，所得滤液进行冰冻干燥。

残留物溶于含乙腈（10%）的三氟乙酸（0.1%）用逆相高压液相色色谱提纯肽使之达到均一性。用含有10%至80%线性递增乙腈的三氟乙酸（0.1%）进行梯度洗脱。

使用Altex    C8柱进行色谱分析。在220nm连续监视洗脱过程，使之每分钟流速为1ml。用Vydac蛋白和肽C18柱（Cat、No218TP1010）进行制备RP-HPLC（逆相高压液相色谱）分析，流速为2-4ml/分，要使用梯度调整到能够提纯各种肽。通过蒸发乙腈並冰冻干燥水相的方法回收纯化的蛋白质。

使用Waters    Pico-Tag系统对合成的肽进行氨基酸分析。采用制造商所提供的方案，並用PCT氨基酸校准。每个肽的氨基酸组成与期望的每种氨基酸比率相符。

从cDNA序列产生的A亚基氨基酸序列片段的两个区域起初用于产生合成肽。第一段是从组氨酸1至丙氨酸26，第二段从丝氨酸167至天门冬氨酸195，因此包括了抑制素43KD（A）和20KD（Ac）亚基的N-末端。肽1的序列全长如下，其中数字用的是图5氨基酸序列所用的数字：

肽1

His-Ala-Val-Gly-Gly-Phe-met-

1    2    3    4    5    6    7

Arg-Arg-Gly-Ser-Glu-Pro-Glu-

8    9    10    11    12    13    14

Asp-Gln-Asp-Val-Ser-Gln-Ala-

15    16    17    18    19    20    21

Ile-Leu-Phe-Pro-Ala-Lys

22    23    24    25    26

（注：His：组氨酸;Ala丙氨酸;Val：缬氨酸;Gly：甘氨酸;Phe：苯丙氨酸;met：蛋氨酸;Arg：精氨酸;Ser：丝氨酸;Pro：脯氨酸;Glu：谷氨酸;Gln：谷氨酰胺;Asp：天门冬氨酸;Ile：异亮氨酸;Leu：亮氨酸;Lys：赖氨酸）

如果使用一个字母表示氨基酸密码，则上述序列又可缩写为（H₁-A₂₆）K，括号内的氨基酸代表抑制素序列，与图5标号相同。

肽2是Y（H1-A₂₆）K，它是由肽1加合一个NH₂-末端酪氨酸。单一合成是以赖氨酸为开端进行的。为了产生肽2，除去75%的树脂，並向余留的25%肽加入酪氨酸残留物，赖氨酸残留物的加入能促进半抗原的制备，加入酪氨酸以提供放射碘化作用点。

实例13

包涵体的产生和提纯

菌株BTA420，BTA422和BTA424产生作为融合产物的类似抑制素蛋白质。该三种菌株产生的这些蛋白质在体内以不溶解的、称之为包涵体的附聚物形式存在，按下述方法可以制备和提纯。用2升挡板式烧瓶，将过夜培养物以1∶50稀释成2×1升的新鲜的LB培养液（每升含10g胰化胨/5g醇母提取液/5g    Nacl）经37℃振荡培养至培养液光密度为OD0.3-0.4。加入异丙基-B-D硫代半乳糖苷酶（IPTG最终浓度为0.1mM），继续培养2-7小时，两小时后可见包涵体呈明亮颗粒状。通常七小时后包涵体颗粒最大，数目最多。

收获细胞，方便的做法是将收获物在-80℃冰冻过夜。所获细胞按每升原培养物悬浮于20ml水中，並用法式挤压器破裂细胞。在苯甲基磺酰氟化物（PMSF）和5%三硝基甲苯X-100制备0.1mM的悬浮液，然后在1，200xg下离心10分钟。

弃去上清液，借超声波作用将沉淀颗粒物再悬浮于50ml1MNacl/5%三硝基甲苯X-100溶液中，再次离心。重复上述清洗操作。所得沉淀颗粒物再用超声波以每升原培养液悬浮于2.5ml1MNacl/5%三硝基甲苯X-100中。

将所得悬浮液在60%（重量/体积）蔗糖密度梯度上铺层，使用Beckman    SW28转头在32，000Xg下离心60分钟。包涵体穿过蔗糖缓冲区沉出与细胞碎片分离。包涵体可用水清洗，並在-80℃冰冻状态下保存，至少在三个月内蛋白质结构无变化，和聚丙烯酰胺凝胶中所见无异。

实例14

抗原的制备

提纯过的包涵体以2mg/ml溶于8M尿素/0.1MDTT/0.1MPH为8.0的Tris Hcl缓冲液中，在氮气中37℃保温两小时，使用12，000rpm离心溶液15分钟。用5升PH7.5的50mMNaH₂po₄/150mMNacl缓冲液（PBS）4℃透析上清液过夜，至少更换两次。透析袋内的蛋白质成分形成白色絮凝物，即可使用，不必进一步纯化。取制备物1mg腹腔注射小鼠内表明该材料不含焦精和脂多糖。

絮凝物悬浮液用等体积油基辅助剂即Marcol52：Montanide    888（9∶1）乳化，使最终浓度为每ml含100-250μg抗原。对于有两个以上来源的抗原，每个浓度也为100-250μg/ml。

用戊二醛方法可将合成肽与多孔且易亲合的血兰蛋白偶联（Briand.J.P.等（1985）免疫方法杂志78，56-69），偶联物可用上述方法乳化。

可以说，还有多种其他方法制备抗原，也有许多其他途径和方法实行免疫。制备抗原的方法包括Freund氏完全或不完全辅助剂的乳化法，在水凝胶或皂角等中的乳化法，以及从含有抗原的聚丙烯酰胺凝胶部分将其浸出的方法。此外，抗原的导入亦可不掺入辅助剂。给药途径有口服、上皮膜渗透和肌肉、腹腔、皮下注射等，当然，亦有多种方法增加肽和蛋白质的抗原性，包括自身交联，与其它蛋白的交联，改变残基、改变序列。

实例15

兔疫法实施

从零周时第一次注射动物，四周后给以辅药，计算各种絮凝物抗原给于剂量的方法如下：

兔    100    ug/剂量

羊    250    〃

猪    200-250    〃

大鼠    100    〃

此外，人工合成肽（肽1，例10），与多孔亲合性血兰蛋白（KLH），同时用于兔的免疫，每次剂量为100g。

实例16

抗血清的分析

定时取血，标准取血方法为首次注射前取血一次，给以辅药之前取血一次或多次，给辅药时和以后每周取血一次。血样在4℃絮凝过夜，经离心取得血清，将其分为若干等份，整个分析抗体和测定FSH滴定度期间皆在-20℃下冰冻保存。

用三种不同的试验操作检验血清;a）结合示踪物-测定抗体与碘化58KD和31KD抑制素结合能力，用以指明该抗体能否辨认小牛天然抑制素。示踪抗体复合物可借助第二种抗体使其沉淀，颗粒物的放射活性可以用全部参加反应数量的百分比表示。

碘化程序如下：将纯化的58KD和31KD抑制素（25μl电泳洗脱缓冲液（国际专利申请号pCT/AU85/00119）含1-2μg）加入25μl0.5MPH7.2砱酸盐缓冲液，加入Na125I（0.5mci;5μl，Amersham，Bucks，uk），再加入40μl氯胺T，它和激素比例为8∶1。在室温下搅拌反应60秒，並加入20μl偏二亚硫酸钠（3mg/ml）终止。在20mM砱酸盐缓冲液/0.1%BSA或PH6.0的0.5%的Polypep，使反应混合物至500ul。经Sephadex G25凝胶柱，（PD10Pharmacia，Uppsala，Sweden），过滤以除去游离¹²⁵I。各部分空白液收集在一起，至体积20ml，加至200μlMatrex Red A（Amicon，Danvers，Mass;USA）柱上，经含400mMKcl的砱酸缓冲液洗脱，弃掉洗脱液。用1MKCl/4M尿素砱酸缓冲液洗脱¹²⁵I-抑制素。碘化抑制素再进一步在Sephadex G25柱（PD10）凝胶过滤，用适宜RIA缓冲液（见下文）除去Kcl/尿素。

58KD和31KD抑制素经碘化反应和Sephadex G25凝胶层析后，可在大量空白液中分别回收60uci和25uci。用1MKCl/4M尿素缓冲液可洗脱出30%左右。从SDS-PAGE所列分子量估计，¹²⁵I-抑制素应存在于该部分中。

碘化制备的特异活性可用放射免疫实验评定，该实验使用的是自身取代法（Marana等（1979）Acta Endocrinol（Kbh）92，585-598），並用激素作为碘化标准。分别测得¹²⁵I-58KD抑制素和¹²⁵I-31KD抑制素的特异性活性为50-60μci/ug和24μci/μg，其回收率为5-25%。

从天然58KD抑制素免疫过的实验兔474制得的抗抑制素抗血清能中和天然抑制素的生物活性，与碘化58和31KD抑制素有较强的结合能力，但是却难于和两种抑制素离解的亚基结合，这表明碘化作用不会引起分子结构的改变。所以试验抗血清与碘化抑制素的结合能力可以视为抗血清辨认天然抑制素的能力。

b、体外生物试验-在以前描述过的生物试验（国际专利申请PCT/Au85/00119）中，抗体血清抑制天然抑制素生物活性的能力表明存在抗体被中和作用。

c、FSH-羊的FSH血清水平可用放射免疫实验法测定，此法使用了兔抗-羊FSH血清以及作为示踪物的碘化羊FSH。兔FSH血清水平也可用放射免疫实验法测定，其中利用豚鼠抗-兔FSH血清，並以碘化兔FSH作为示踪物。用对重组材料作用产生的抗体可以除去血液循环中的内源性抑制素，从而有希望增加FSH滴度。

实例17

羊类实验

每组9只动物（Corriedales;试验期间动物处于非发情期），用单一品种或匹配后的絮状抗原免疫，如表4所示。按例16所述进行血清分析。

a）示踪法研究：19只动物（在给辅药两周）产生具有明显的与示踪物结合的能力的血清（表6）。除了无药对照组（A组）和经pBAT301，15KD亚基融合蛋白质免疫组（C组）除外。这些动物来自各个试验组。最好的反应发生在动物673（D组）。在稀释1000倍情况下，与31KD示踪物和58KD示踪物的结合分别为10%和3.1%。

结合率小于1%的所有动物未列出。

因此，重组抑制素亚基，当作用抗原时，具有提高羊抗血清辨认天然抑制素能力的作用。这将指出ⅰ）这些试验能够检验血清中的游离抗体，此外，也有这样的可能性，对羊抑制素具有最大亲合性的抗体实际上是与羊的抑制素结合在一起的，所以在此实验中无法检测。ⅱ）筛选试验使用的稀释度为1000倍，该浓度很可能超出了微弱阳性血清的稀释滴度。

b）体外生物试验资料。在体外的垂体细胞内培养生物实验中，在给出的试验条件下（每2单位抑制素1μl抗血清），没有一种血清显出中和抑制素活性的作用。

c）FSH滴度。各动物组血清FSH水平列于表7。在对照喂养组（A）中间没有显著性差异，但是所有实验组，除去一个例外，都观察到显著的增加，尽管这种增加是瞬时的。

所以，重组物抑制素可以用作增加家养动物FSH滴度的抗原，正如已知的FSH能增加排卵率一样，我们可以期望对重组物抑制素的免疫作用也能增加排卵率，並被用作增加剂改进再生产效率。也可以得出这样的结论，导入具生物活性的重组物抑制素会抑制FSH水平，故可作避孕药使用于雌性或雄性动物，因为FSH与控制雄性精子产生率和雌性卵泡生成的机制有关。

实例18

兔子实验

用示踪物结合系统，分析取自未阉割雄性兔的抗血清，这些兔已用天然的58KD或31KD抑制素，或用来源於携带质粒pBTA297，299或301细胞的融合蛋白，或用含有合成肽1的结合蛋白（实例10）进行了免疫。其测定结果见表8。

表8    兔抗血清的示踪物结合实验

兔号    抗原来源    示踪物结合百分数

58KD    31KD

474    58KD    天然的    25.2    28.5

461    31KD    天然的    4.0    5.8

692    BTA420    3.2    0

693    〃    23.2    0

694    〃    7.2    0

464    BTA422    0    0

465    〃    0    0

466    〃    0    0

695    BTA424    0    0

696    〃    0    0

697    〃    0    0

698

肽1 3.8 0

699    〃    13.9    0

动物474的血清以1∶2000进行稀释，其他所有的都按1∶1000进行稀释。

这些数据再次说明重组体抑制素亚基和合成肽是有能力产生抗体反应的，其中也包括能辨认並能与天然抑制素结合的抗体。各种动物的反应不一，但是在缺乏，於所有的试验兔子中都能产生有意义反应的重组体15KD抗原（来自BTA424）的情况下，出现了这样一种事实，即在至今为止进行的试验中，好像取自474号兔（是增加了对天然58KD抑制素抵抗力的兔）的所有的抗体会直接抵抗43KD亚基，这就意味着15KD亚基也只是兔子的弱的抗原。但这並不意味着这个亚基不能用於其他的品种。通过这些结果得到启示，就是，为了产生对15KD亚基的显著抗原反应，必须对它的结构，序列或形式进行一些修饰。同样，20KD亚基也是兔子的一种弱的抗原。

用肽1-KLH结合抗原（图15）进行促升兔疫后，699号兔子血清的促卵泡激素含量出现了引人注目的降低，降到0，698号兔也显示出逐渐衰退。每个动物的反应都与它的抵抗58KD示踪物抗血清的滴定度相对应。而且，合成肽本身或直接抵抗它的抗血清在体外鼠垂体细胞生物鉴定中是不起作用的，它们对抑制素接受体没有直接的作用。所以，这种肽以及它们的衍生物可用作雄性和雌性的避孕药，因为促卵泡激素与精子的生成，卵泡的生成有关（见实例19）。此外，因为这是A_N片段的NH₂-末端，所以假定所知的反应是抗体作为媒介引起的，则可以推论A_N片段本身或其他的来源于牛、人或其他脊椎动物品种的A_N片段的合成肽也可以发现有同样的用途。还可以推论以与抗原不同的方式施用具有生物活性的A_N片段或其构成部分可以增加促卵泡激素的含量，因此它们可用作增殖剂以提高繁殖效率（也见实例19）。

实例19

猪的实验

这个实验的草案与前面所述不同。

选择未成年的猪（22-23周），用750ug来源於BTA425的β-半乳糖苷酶絮凝抗原（16个动物，对照组）或用一个含有来源於BTA422，BTA424和BTA426亚基絮凝抗原各250ug的混合物（16个动物，试验组）进行免疫。在首次注射后的第25天及第47天两次作同样的促升免疫。在首次注射后的第60天，取血清，采用示踪物结合方法，分析抗抑制素的抗体。在60天后尽早观察未成熟猪动情和交配的形迹。

对15个试验组动物的血清进行示踪物结合能力的测定，其稀释比例为1∶100，其中有10个显示出与125_I-58KD抑制素结合，其结合范围为1.7-9.0%（ X＝4.9±2.5）。有一个以2.0%与125_I-58KD抑制素结合的血清还显示出以6.4%与125_I-31KD抑制素结合。而6个试验的对照血清中没有一个与任何一个示踪物进行有效结合的，这些示踪物是用来证明重组体抑制素亚基有能力使猪产生一种由於能辨认自然抑制素抗体的存在而引起的抗原反应。

猪动情的周期是21天到27天，於60天放血后，试验中的所有动物都会显示出动情的样子於是再进行交配这是视为当然的。表9列示了对照和试验组交配的数据。AX₂分析说明了处理有重要的作用，该作用是很多试验组动物没有进行交配的结果。

表9 交配数据的X²分析

组    交配    未交配    总数

对照    14    2    16

试验    6    10    16

总数    20    12    32

X²＝6.5 P＜0.02应用yates修正值

以上数据所反映出抗体对58KD抑制素的A_N片段所起的作用是可能的，因为携带抗58KD抑制素抗体的10个血清中，有9个在1∶100的稀释比例下，未能检测出31KD抑制素，表明大部分的抗体是A_N特效药。在兔子试验中所观察到的施用肽1作抗原会引起促卵泡激素含量降低的结果（实例18）支持了上述的假定，其结果之一使在雌性脊椎动物内停止循环及生成卵泡。通常，在此期间，将一个能产生对31KD抑制素比对58KD抑制素有较高抗体滴定度的血清之动物进行交配。其他的解释也是可能的，例如：43KD抑制素含有前、原A亚基的-10到-1的氨基酸，这样的序列对效果起到作用这是可能的。然而，无论根据哪个机理，在体内得到的仍是似是而非的结果，数据强调了抑制素作为促卵激素的调节剂，进而强调了对繁殖生理学及方法的调节剂。它还证实了重组体抑制素可作为雄性和雌性的避孕药以及可作为阻止雌性动物循环的微粒。

实例20

老鼠试验

采用用於羊的相同方法对鼠组进行免疫。血清以1∶500稀释后，用碘化示踪物结合检定法进行分析，每个组的结合百分数的数据以平均数±标准误差的方式列示在表10中。用於A-F组的抗原见表6。

表10.    鼠抗血清的示踪物结合实验

组    性别    数量    示踪物

58KD    31KD

A    雄性    9    1.06±0.26    0.38±0.58

雌性    10    0.55±0.45    0.82±0.62

B    雄性    9    7.00±3.50    0.52±0.50

雌性    9    4.17±4.84    0.82±0.49

C    雄性    9    0.54±0.53    0.67±0.51

雌性    10    0.66±0.72    0.79±0.70

D    雄性    9    1.10±0.74    1.46±0.96

雌性    10    0.89±0.83    1.55±0.37

E    雄性    10    8.30±5.00    0.79±0.58

雌性    10    4.50±2.65    0.98±0.69

F    雄性    9    0.51±0.61    0.85±0.59

雌性    10    0.66±0.72    0.79±0.70

这些数据，通过A组示踪物结合能力与B组和E组或D组的比较，再次说明A（43KD）亚基是比A_c（20KD）亚基更好的抗原。根据示踪物结合研究的评价，B亚基用作抗原是无效的，这些结果补充了这样一种看法，即58KD天然抑制素在474号兔内，产生了一种强的抗体反应以及中和抗体，而461号兔及其他两个用31KD天然抑制素免疫的兔内，不产生中和抗体，产生的是弱的抗原反应。

正如其他动物品种（羊，兔，猪）的情况一样，在用重组体抑制素亚基免疫的动物中，没有一个被检测出有中性抗体的存在，而且，还可以观察到，所有的品种，都有广泛的抵抗抗原的β一半乳糖苷酶部分的免疫反应。由这些观察结果想到构象抗原决定基可能是重要的，鉴于融合物的β-半乳糖苷酶部分显著地减少（图12）或不存在，那些抗原，例如来源於BTA426，BTA427和BTA1360或来源於色氨酸载体的抗原（实例10）将是有价值的。为了产生构象抗原决定基和改进抗原的形式，可以着手做些试验。

尽管如此，这里提供的动物实验还是肯定了重组体抑制素，亚基，片段和合成的同类物或其同系物可应用於

a）产生能辨认天然抑制素的抗体

b）改变促卵泡激素的含量

c）用作增殖剂或避孕药

实例21

抑制素的生产方法

把含有携带抑制素生产基因信息的重组体质粒的宿主细胞，放在冷冻干燥小并内，保存在生产培养收集液中。由贮存小并取出的细胞经重新形成后，平板培养在选择培养基中，取自这种培养基的细胞可用来制备发酵罐的接种物。接种物可用於含有适宜生长培养基的种子培养罐中，发酵在适宜于抑制素蛋白质生产的条件下进行。发酵完成后，收集细胞，产品就从细胞中被释放出来，然后进行纯化。产品经过分析和质量检验后，贮存在能保持良好稳定性的条件下。在严格的卫生条件下，经过与其他组份的结合制成可用的产品。

工业上的应用

抑制素的用途

通过本发明生产的抑制素或其构成部分可以用作抗原或生物活性化合物;某一个使用方法的效用对立於其他使用方法产生的效用，这一点是可以预见的。

通过本发明和/或其后的改进产生的某种形式的抑制素或其构成部分可用作抗原，也可用於改变生育力。包括人在内的脊椎动物的排卵速度的提高将会改进生育力，於是就增加了多产力或改进了再生产的效率。本发明的产品可用来增加排卵速度，於是就发现了可用於体外的增殖程序，例如：用於家畜或人，它们也可用於非家畜中，例如：在动物园中推进繁殖程序。而且，本发明的产品也可用於促进性的成熟或发情，以延长生殖寿命和/或促进生产动物的动情以缩短产仔和交配间的时间和/或用於减少季节性或后动情。在交配中，发明的产品可用於刺激精子的生成。

於是，农业品种，例如：牛，羊，猪，山羊，鹿，马，鱼和鸡的生产也可从抑制素的这些应用中获益。

用作活化剂的抑制素可用作控制雌性动物排卵的工具或抑制精子的生成，所以它可用作避孕药或协调排卵剂。

抑制素的构成部分，例如：合成肽或A_N片段可用作抑制促卵泡激素含量的抗原，因此可用作避孕药或抑制动情的微粒。

本发明的产品可用於产生抗体，抗抑制素的抗体可用作诊断剂，这也是发明的一部分。例如：那些监控包括人在内的脊椎动物的再生产循环状况的用途。用这种方式可以预料排卵的时间以及卵子排出的数量，那么就可以承认用于改变再生产循环治疗方法的确定。

抗体可用来评价粒膜细胞在雌性动物中的作用，给雄性动物的Sertoli细胞的作用作记号，还可以给优良饲育物的基因选择作记号。

总之，前述的重组体蛋白质和其衍生物或同系物和同类物有很多方面的用途，其包括：

a）用作抗原和抑制素的拮抗物以减弱调节或取消一些或全部的生理作用，这些生理作用是天然抑制素或其前体在体内产生的。

b）用作抗原以生产单克隆或多克隆抗体。

c）用作生产体内或体外的有生物活性的重组体抑制素的前体。

d）用作抑制素放射免疫试验（RIA）和酶连接免疫吸收剂试验（ELISA）或其他检测系统如：化学发光或萤光试验的标准。

e）用於筛选单克隆和多克隆抗体制备物

f）用於辨认抑制素或类似抑制素氨基酸序列抗体的纯化（见实例9）

g）用作抑制素的激动剂，以加强天然抑制素或它的前体在体内的一些或全部的生理作用。生物活性重组体抑制素可以在体外，通过在同一细胞内，两个亚基或其两个前体的复合表达，或通过个别亚基或它们的前体物，同类物，同系物或衍生物的正确叠影来生产。

作为举例抑制素C^DNA序列有以下几个用途：

1）用作在原核生物或真核生物细胞内蛋白质合成的C^DNA模板（见实例8）。

2）用作制造放射性标记抑制素C^DNA探查物的DNA模板。这些探查物可用来探测和分离抑制素或类似抑制素的序列，这些序列在不同品种的基因组DNA或制造抑制素或抑制素类似物肽的细胞的mRNA内（见实例7和8）。因此，它们有可能诊断人与家畜在抑制素合成和调节方面的缺陷，並用以克隆和控制抑制素基因。

3）用作制造与上述（2）有同样用途的放射性标记RNA探查物的DNA模板。

4）用作制造放射性标记抑制素的DNA模板。

附件

①

图16表示表达牛An片段的载体之结构。

图17表示早期前亚基B基因的结构。

图18表示在pBTA418中，早期前亚基B基因的结构。

图19表示pBTA306和pBTA307的限制酶（Pst+I）的图谱和顺序战略。

图20表示完整的牛抑制素cDNA早期前亚基B的核苷酸序列，及其预测的氨基酸序列。

图21表示完整的人抑制素编码DNA早期前亚基B的核苷酸序列，及其预测的氨基酸序列。

图22表示通过质粒pBTA303，pBTA308，pBTA309和pBTA472编码的抑制素融合蛋白的序列。

②

BTA1362    ED8654    pBTA306    pBR322    B;    675/320

BTA1363    ED8654    pBTA307    pBR322    B;    550/330/550

BTA1364    BTA652    pBTA308    pBTA416/B;    HaeⅡ-HaeⅡ加接合物

pUC13

BTA1365 BTA652 pBTA309 pUC13 A_N;SphⅠ-HaeⅡ加接合物

BTA1366 BTA634 pBTA310 pBTA286 A_N;SphⅠ-SmaⅠ加接合物

BTA1367    BTA652    pBTA472    pUC13    hAc;HgaⅠ-BamHⅠ加接合物

BTA1418 ED8654 pBTA415 pZipNeo^mAc;

BTA1419    ED8654    pBTA416    pZipNeo    B

BTA1420    ED8654    pBTA417    pZipNeo    早期前A

BTA1421    ED8654    pBTA418    pZipNeo    早期前B

BTA1422    ED8654    pBTA419    pZipNeo    -

③

信号肽的长度肯定不为公众所知，但Gly-282是一种可能的选择物，将成为信号肽的最终氨基酸。在前蛋白内有若干潜在的蛋白水解的切割位点，表明这些肽的生理活性的潜在性。亚基B的3′-

④

由这些λ克隆测定的人体原前亚基B的整个编码序列，列于图21。在碱基388与389之间的内含子间断了该编码序列。

⑤

用于表达An片段的克隆增殖的方法见图17所示。主要是用Bam    HI和Sph    Ⅰ来消化pBTA297，再插入图11ai中所描述的联结子。将整个亚基A基因分离为Sam    3AⅠ片段，再经部分Hae    Ⅱ消化，见图16所示。将含有衔接无义密码子的终止联结子加到HaeⅡ位点上，用BamHI切割反应产物，再将该片段插入pUC13中。

用低聚核苷酸探针TCCTGGCGCTCCTGC筛选重组体质粒，该探针跨越按氨基酸128-130编码的Hae    Ⅱ位点，于是保证了小的Hae    Ⅱ片段以正确定向存在。收集和提能阳性克隆，将它们插段按顺序排列以确保它们的同一性。从两种这样的克隆来看，各含有一种正确的插段和另一种未鉴别源。将正确的插段提纯，再重新克隆到pUC13上，然后将之转移到大肠杆菌上，得到为最初表达的BTA1365（＝BTA652    pBTA309）。（图22）根据在分子各端位上的三种限制性位点，能将之亚克隆到正如上文所述的其他载体上。

生成由BTA1365产生的重组体蛋白作为包涵体，其表观分子量为23.5KD并类似BTA426和BTA427（图13所示）的融合蛋白，最大的谱带表明数量最多和在使用血清474的Western印迹分析中最容易看到。

⑥

通过分离人体基因组DNA的436对PvuⅡ-BamHI片段，来完成在pUC13中的人体亚基Ac基因的表达，并由克隆λA2（第8段）得到，含有亚基λAc的编码区。在用HgaI消化后，将联结子

5′GAT    CCG    GCA    TCG    ATC    ATG    TCT    A    3′

GC    CGT    AGC    TAG    TAC    AGT    TGA    GGG    G    5′（联结子1）

加入，在该联结子接入pUC13的BamHI位点之前，用BamHI将生成产物切开。再将该质粒产物转移到大肠杆菌BTA652上，然后分离用亚基hAc作为融合产物表达的克隆。该克隆是BTA1367（＝BTA653（pBTA472）〕，载体融合的序列见图22所示。在Western印迹上用抗血清474检测这种融合蛋白，它类似于BTA427的牛等价物，最大的谱带是质数量最多的。

⑦

在图17中表示以原前亚基A和原亚基BcDNA的用途为基础的原前亚基B的建立。从pBTA293分离抑制素的亚基B，作为510碱基对PstI片段（见图4）。在用HaeⅡ消化PstⅠ片段看，在HaeⅡ位点联结子（图ⅡBi）的存在下，通过连接方法将释放的365碱基对HaeⅡ片段转化成BamHI片段。将生成的Bam    HI片段连接到pZipZeo    SV（X）1的BamⅡ位点上，再转移到大肠杆菌上以得到BTA1419（＝ED8654    pBTA416）。为了在pZipNeo中建立合成的原前B基因，从pBTA305中分离亚基A的部分信号序列，作为160碱基对Bam    HI-San    3AI片段，将之连接到pBTA416衍生物的Bam    HI位点，而pBTA416已删去了下游的Bam    HI位点，得到一种指定pBTA418合成的原前B载体。这种建立的性质见图18所示。从氨基酸-61到-1的序列在信号肽中只含有一种半胱氨酸残基。于是在表达真核细胞的过程中，用正确的二硫化物形成，期望亚基B发生折叠，以及Gly1前的五个精氨酸残基处，仍期望从亚基B的合成前体中处理亚基B。

很明显，为了真核表达工作，通过接合pBTA306与pBTA294或pBTA306与pBTA308的片段，能重新建立完整的真实原前亚基B基团，以及为了研究亚基前体的有关作用，能以抑制素Ac和亚基B序列各自独立的原核体或真核体来表达部分亚基前体。

由于牛和人类亚基B的氨基酸序列是相同的，所以很明显地，用已按牛亚基B编码表示的cDNA的方法，该产物则与通过类似方法表达人类DNA序列得到的产物是相同的。于是也应认为菌株BTA423，BTA424和BTA1360能产生人类抑制素的亚基B。

通过在单SacI位点上（碱基767-770，图20）用质粒pBTA294和pBTA306接合cDNA，制得按整个原前亚基Bm    RNA编码的cDNA。

C.用真核细胞表达    在真核细胞中通过将载体pBTA417和pBTA418转化成NIH3T3细胞，来研究抑制素亚基的表达，既可以独立地又可以同时地采用下列程序。在转染前一天，在5毫升培养基中将大约2×10⁵个NIH3T3细胞种入T25的长颈瓶中。通过用Graham，F.L.和Van der Eb，A.J.（病毒学杂志，1973年第52卷，第456-467页）及由Parker，B.A.和Stark，G.R.（病毒学杂志，1979年第31卷第360-369页）改进的磷酸钙方法，大约100毫微克-1微克的DNA（或是还原病毒或是噬菌插入DNA）用来转染。四小时后，用甘油将它们休克。在甘油休克后72小时，将1/3的细胞放入含有每毫升200μg G418的完全培养基的T75的长颈瓶中。每隔3-4天就用含有培养基的G418洗涤细胞，在14-21天发生分裂得到会合生长。

用10%（体积/体积）小牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素（完全培养基）补合由Dulbecco改进的Eagle培养基，以维持NIH3T3细胞。

当被转染的细胞和上清液达到会合生长时，在分裂后大约三天里，将它们进行抑制素表达测定，用大约2×10⁷的已胰酶消化过的细胞来制备细胞溶解产物，用10毫升PBS来洗涤，将该产物重悬浮，pH为7.0的1毫升5mM磷酸钠缓冲液在-20℃下冷冻保藏。

离心收获RNA细胞（2×10⁷）制备物后，立即悬浮在95℃下的2毫升2×NETS/苯酚（2×NETS＝200mM NaCl，2mM EDTA，pH7.5的20mM Tris-HCl，1.0%SDS）中。在强力涡动后，并在离心分离各相之前，让该混合物冷却至室温。用苯酚重新萃取水相，在最终水相中加入1/10份体积的3M乙酸钠和2份体积的乙醇，使RNA从该最终水相中沉淀。在干冰上10分钟后，在4℃时以11，000g速度，将该RNA离心10分钟后得到片状沉淀物。将该RNA溶于水中，通过将LiCl加至2.5M，从总核酸中分离DNA和tRNA。让该溶液在4℃静置过夜，通过等体积的3M LiCl垫层在4℃以及11，000g的速度离心10分钟分离沉淀LiCl RNA。将最终的RNA片状沉淀物用水重新沉淀处理，然后用70%的乙醇洗涤，干燥，再用无菌蒸馏水溶解。吸光率在260nm时测定其浓度后，将该RNA在-80℃下保藏直到使用。

用Northern印迹分析和Dot印迹分析，来估计由于载体产生的mRNA转录本的数量和大小。正如Thomas，P.S.，在Proc.Natl.Acad.Sic.USA，第77卷，第5201～5205页，1980年版上所描述的那样，经乙醛酸作用后，在1%的琼脂糖凝胶上分离（5μg）RNA。该RNA在室温下过夜，将直接转化到20×SSC的硝化纤维素上，并在80℃真空条件下，烘烤两小时。在42℃下，用50%甲酰胺、5×SSC、10mM磷酸钠pH为6.5、250μg/ml的DNA、0.02%PVP25、0.02%Ficoll    400，将过滤物预杂交4小时，然后在42℃用含有达到10%的右旋糖酐硫酸酯和含有10-10cpm的每μg2×10cpm    DNA探针的预杂交缓冲液中，进行杂交过夜。用于亚基Ac的探针是362碱基对cDNA片段，它包括碱基788-1149（图5），以及用于亚基B的探针是369碱基对cDNA片段，它包括碱基504-872（图6）。在65℃下用0.1×SSC，0.1%SDS洗涤该过滤物，然后在-80℃下进行放射自显影。

为了制备基因组DNA，将收获的细胞（2×10⁷）重新悬浮在TNE缓冲液（10mM Tris-HCl，400mM NaCl，2mM EDTA，pH8.2）中，再添加SDS到最终浓度为0.5%。在混合后，添加蛋白酶K到20μg/ml，然后在37℃下保温过夜。用等体积的苯酚萃取DNA两次，每次15分钟，然后用氯仿∶异戊醇（24∶1）萃取一次。

通过乙醇沉淀从最终水相中回收DNA，再转绕形成DNA，并重新溶入TE（10mM    Tris-HCl，1mM    EDTA，pH7.5）中。添加热处理的核糖核酸酶到40μg/ml;并在37℃保温30分钟后，再加SDS到0.5%。添加蛋白酶K到20μg/ml，再继续保温两小时。在两次用苯酚和一次用氯仿∶异戊醇处理后，用乙醇沉淀分离DNA。将转绕的DNA溶于TE中，并在4℃下保藏至使用。

用Southern印迹分析测验载体整合到基因组，还有潜力来估计如此整合拷贝数。在生产商建议的条件下，DNA（10μg）在37℃用每μgDNA8～10单位的酶消化过夜。在含有40mM Tris-乙酸酯、1mM EDTA、pH8.2的0.7琼脂糖凝胶电泳前，该样品用苯酚萃取乙醇和沉淀。在紫外线下显色、变性和中和后，该DNA从凝胶转移到20×SSC硝化纤维素上，正如Southern（1975年）所描述的。在过夜转移后，主要用5×SSC洗涤过滤物，再在80℃真空烘烤两小时。在42℃下，在50%甲酰胺，1×Denhardts，25μg/ml DNA，5×SSPE（SSPE∶180mM NaCl，10mM NaH₂PO₄，1mM EDTA）中，进行预杂交最少四小时，然后在42℃下，在含有10%的右旋糖酐硫酸酯和10⁶～10⁷cpm的探针（比活性为每μgDNA 2×10cpm）的预杂交缓冲液中杂交过夜。该探针如上文所述。用0.1×SSC，0.1%SDS在65℃下洗涤过滤物，然后在-80℃下进行放射自显影。

RIA基本上是按McLachlan，R.I.等人（1986年，Mol.Cell，Endocr-inol，第46卷，第175-185页）所描述的那样，用I¹²⁵标记的31KD牛抑制素作为示踪物。该实验测定了肯定正确的抑制素或亚基比变性亚基好得多。所用的标准是用高压液体色谱法纯化的31KD抑制素，其B/I比为0.4，与BFF不同，其B/I比为1.0。

在国际专利申请公开物WO86/00078中描述的分散性鼠垂体细胞培养物，被用作羊睾丸网液体的标准。

在各种情况下，在基因组中观察正确的DNA，指明转化载体的整合，并且通过这些细胞生产mRNA。然而在整合拷贝数，mRNA水平和表达的蛋白之间没有相关作用出现。

当用生物检定和放射免疫测定法检测新生细胞培养基时，没有测定出抑制素，从用载体pBTA419转化的细胞来看已用过的培养基，在生物检定中只有低水平的FSH抑制，但在放射免疫测定法中就没有测定出类似抑制素的物质，因此可能是非特异性抑制效果（见表6）。

相反，将pBTA417中的亚基A基团表达，并且该蛋白分泌得到在生物检定和放射免疫测定法中可检定的物质。这表明来自原前亚基A基团的蛋白单独可以有类似生物活性的抑制性，而以前只是将亚基AB或亚基AcB的组合体分类作为抑制素。产生的免疫反应物质的数量与生长培养基细胞数目成正比〔亚基B印迹〕。转染3，各样品的B/I比与天然抑制素接近，而无论何处只要要求生物活性例如开发避孕药，该B/I比表明这种重组物质对于天然抑制素有在潜在的代替物。还在用pBTA417和418共转染的细胞的上清液中，或在用每个载体转染后从混合的种群的上清液中，发现生物活性物，而该载体可以表示抑制素的重组。

表6    表达真核细胞的概说

实验

载体    1    2    3

转染    B    I    B    I    B    I

pBTA417    2.04    31.2

pBTA417＊    1.3    65.3    2.7    40.7

2.6    102.5    14.3    34.3

15.4    31.2

17.5    34.2

pBTA417    2.8    43.9

3.0    41.4

pBTA418

pBTA417/    2.3    12.2    2.6    46.1    2.9    9.1

pBTA418    2.4    13.6

pBTA419    1.3    ND    1.2    ND

MEDIUM    ND    ND    ND    ND    ND    ND

用生物检定（B）或放射免疫测定法（I）测定，并用单位/毫升表示培养物上清液得到以上数据。

ND    表明在检测之下的水平

＊    表明从提纯细胞菌落得到的数据，而从含有混合的细胞种群的转染上清液得到余数。

+    表明在转染后独立地和混合地用各载体转染的细胞培养物。

/    表明同时用各载体共转染的细胞。

通过观察人体、牛和其他动物（实例7）的抑制素基因之间的相似点，则可以发现类似于上面所述的建立，能用以表达来自包括人体的任何物种选择的生物活性分子。但是，应理解抑制素蛋白或类似抑制素蛋白或肽的表达并不限制于以上所指的实例。对那些本技术领域里有经验的人来说熟知的，可以有多种不同的表达系统，用于原核和真核细胞，这些都适合于本文给出的序列表达。

⑧

pUC-碱融合蛋白作为免疫原的制造和应用

通过用羊生产中和抗体以举例说明由pBTA303，pBTA308，pBTA309和pBTA472制得短pUC-碱基融合产物的优良免疫原性质，而其中用到的羊被由菌株BTA427生产包涵体的牛Ac产品接种。

在N₂和37℃下，将包涵体溶于含有8M脲和0.1M（DTT的0.1M Tris-HCl pH8.0中两个小时，以制备该蛋白。又通过加冰醋酸使溶液达到pH3，然后通过离心作用将溶液澄清，接着进行浓缩并在Sephadex G50或G75的柱上用0.1M乙酸进行色谱分析。用SDS-PAGE识别含有重组蛋白的馏份，再在Vydac C4或Dynamax Macro C18反相色谱柱上进行汇集和色谱分析。在所有情况下，在0.1% TFA中用乙腈浓度梯度的柱子洗脱蛋白。再用SDS-PAGE识别洗脱的蛋白，并汇集所要的馏份，浓缩到1至10mg/ml，并将之透析入PBS，通过NH₂一末端序列肯定了蛋白的同一性。

通过戊二醛法（Briand等人，1985年，书的出处同上），用300μgKLH免疫四只羊，用300μg牛Ac融合产物，同样免疫四只羊，以及用300μg含Ac联结KLN（107∶1摩尔比）的Ac接合物的Ac等同物。初级免疫在零天同Freund式的完整辅药，在21天到50天时，激发剂量用Marcol52∶Moutanide    888（9∶1）。测试第56天的血清，在放射免疫测定法上识别31KD天然牛示踪物的能力，其结果以%计并列于表12。

表12    血清与31KD示踪物结合抗体稀释的测定

羊    免疫原    1∶400    1∶2000    1∶10，000

1    KLH    0    0.4    0.5

2    KLH    0.2    0.5    0.7

3    KLH    0.3    0.4    0.6

4    KLH    0.2    0.6    0.6

5    bAc    15.4    9.1    2.8

6    bAc    36.8    46.8    23.4

7    bAc    28.8    19.1    5.9

8    bAc    39.5    23.2    6.5

9    bAC-KLH    10.5    5.2    1.8

10    bAC-KLH    36.1    44.8    21.0

11    bAC-KLH    7.4    6.1    1.7

12    bAC-KLH    11.5    4.8    1.7

现已完成了与天然31KD抑制素的明显结合，即表明了抗体在构象上识别正确的抑制素业已完成。另外，当用离体生物检定测定动物6，7，8和10的抗体时，它们中和了抑制素的生物活性。在第93天，用非接合的免疫原（100μg，Montanide    888∶Marcol    52）再激发动物5～12，按照孕激素动情同期同步治疗法，检查它们的排卵率的反应。接受重组体抑制素的那些组比KLH-免疫的对照或一组未经处理过的对照的排卵率明显地高，肯定了当单独用或共同用载体分子时，短融合蛋白作为免疫原的优良性质，并表明了抗体与抑制素的单一亚基在体外或体内能中和抑制素的生物活性。发现一种动物（第9号）用腹腔镜检查时已被切除了卵巢。

表13    用重组抑制素亚基接种，观察排卵率的反率。

对照    排卵率    试验    排卵率

羊    羊

C1    1    5    1

C2    2    6    3

C3    1    7    4

C4    1    8    4

C5    1    9    OVX

1    1    10    4

2    0    11    3

3    1    12    5

4    1

当分别使用或一起使用pBTA303，pBTA308，pBTA309和pBTA472的融合蛋白的产物时，这些方法显然是能用于人类和家畜，例如猪，狗，马，牛，羊和山羊。

实施例22

Claims (73)

1、一个多核苷酸序列，包括一个对抑制素的整个部分，构成部分，同类物或前体的氨基酸序列起编码序列作用的第一多核苷酸序列，一个杂化上述第一序列的多核苷酸序列，一个通过突变，包括单个或多个碱基取代，缺失，插入和逆位，与上述第一序列或杂化序列有关的多核苷酸序列或一个为多肽的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体表达密码的多核苷酸序列，此多肽是抑制素或是与此抑制素显示出类似免疫学或生物学活性的多肽。

2、权利要求1中的多核苷酸序列，以真正纯的形式存在。

3、权利要求1或2中的多核苷酸序列，它为抑制素的43KD亚基表达密码。

4、权利要求1或2中的多核苷酸序列，它为抑制素的20KD亚基编码。

5、权利要求1或2中的多核苷酸序列，它为抑制素的15KD亚基编码。

6、权利要求1到4中的任意一个多核苷酸序列，其中所说的抑制素选自於人或牛的抑制素。

7、权利要求1或2中的多核苷酸序列，它为图5中的-60到166氨基酸序列，图5中的-10到166氨基酸序列，图7中的1到166氨基酸序列，图7中的-61到171氨基酸序列，图7中的-10到171氨基酸序列，图7中的1到171氨基酸序列或其他的生物等同物编码。

8、一个DNA序列，实际如同前面有关图5，6，7和8中任意一个附图所述。

9、一个选择为蛋白质的整个部分，构成部分或前体编码的RNA或DNA序列的方法，所说的蛋白质是抑制素或是与抑制素显示出类似免疫或生物活性的蛋白质，该方法包括提供一个或多个序列，和决定上述序列中哪一个与一个已知的、为有这样一种活力的蛋白质的整个部分，构成部分或前体编码的DNA或RNA序列杂化;或提供一个抗血清给抑制素或其构成部分並鉴定表达抑制素的构成部分或整个部分的宿主-载体组合物。

10、权利要求9的方法，其中所说的大多数序列是牛或人的基因组DNA。

11、权利要求9或权利要求10的方法，包括下列步骤：

（a）提供许多RNA序列，其中的一个或多个为一个含有抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的氨基酸序列，或为一个显示出与上述抑制素类似免疫或生物活性的多肽编码。

（b）合成与上述RNA序列相对应的DNA序列以形成DNA序列文库。

（c）将上述的DNA序列插入到自主复制的克隆载体中以形成重组体克隆载体。

（d）用步骤（c）中的重组体克隆载体转化宿主细胞。

（e）选择转化宿主细胞，为抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体或类似的多肽已经插入的DNA序列编码。

（f）鉴定包含在步骤（e）所说的转化宿主的克隆载体中的，已插入的DNA序列。

12、权利要求11的方法，其中上述的许多RNA序列包括人或牛的RNA序列。

13、选择一个为蛋白质的整个部分，构成部分或前体编码的RNA或DNA序列的方法，所说的蛋白质是抑制素或是显示出与抑制素有类似免疫或生物活性的蛋白质，实际上如同前述的实例。

14、一个用于鉴定抑制素RNA或DNA的探查物，它含有一个多核苷酸序列和一个标记，这个序列对至少有一部分蛋白质抑制素或有其亚基的氨基酸序列，或一种显示出类似免疫或生物活性的蛋白质，或一个与上述序列杂化的序列起编码序列的作用。

15、权利要求14的探查物，其中上述的标记是一个放射性辐射标记。

16、权利要求14或15的探查物，其中上述的多核苷酸序列选自於下列的序列：

探查物1

T  G

5′  C  CAT  AANCCNCC  3′

G  A

探查物2

A  A  TA

5′  CCGAT  AC  TT  AA  3′

T  G  C  G

探查物3

5′  ACGCCTGACTCCAGGA  3′

探查物4

5′  CCTCCCAGTTTCATCT  3′

探查物5

C  C

5′  ATGTT  ACCTT  CCGTC  3′

G  G

探查物6

5′  CTTTGAGATTTCCAAAGAAGGC  3′

17、权利要求11的方法，其中权利要求16中至少有一个探查物被用在步骤（e）中。

18、一个重组体DNA分子，其特征在於DNA插入物和载体DNA，这个DNA插入物包括一个为抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的氨基酸序列编码的第一DNA序列，一个与上述的第一序列杂化的DNA序列，一个通过突变，包括单个或多个碱基取代，缺失，添加或逆位，与上述的DNA序列或杂化序列有关的DNA序列，或一个为多肽的整个部分，构成部分，前体或同类物，同系物表达编码的DNA序列，此多肽是抑制素或是显示出与此抑制素类似免疫或生物活性的多肽。

19、权利要求18的重组体DNA分子，其中上述的载体DNA包括质粒，病毒或细菌噬菌体DNA。

20、权利要求18的重组体DNA分子，含有一个选自：

pBR322，pUR290，pUR291，pUR292，

pBTA286，pUC7，pUC8，pUC9，pUC13，

ptrpL1，pWT111，pWT121或pWT131的质粒，上述的DNA插入物已插入其中。

21、权利要求18，19或20的重组体DNA分子，其中一个表达控制序列有效地与上述的DNA插入物相连。

22、权利要求21的重组体DNA分子，其中上述的表达控制序列选自於：大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，色氨酸操纵子，细菌噬菌体λ的Leftward启动子或Moloney  Leukaemia病毒的长末端复制。

23、权利要求21或22的重组体DNA分子，其中上述的表达控制序列含有一个启动子和一个翻译开始信号。

24、重组体DNA分子选自於前面所述和命名的质粒：

pBTA22，pBTA23，pBTA28，pBTA29，pBTA30，pBTA290，pBTA292-pBTA305。

25、重组体DNA分子，实际上如同前面有关的实例和/或附图所述。

26、一个制造重组体DNA分子的方法，其方法包括：提供一个DNA插入物，此插入物包括一个为多肽的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的氨基酸序列表达密码或对应於此密码的第一DNA序列，所说的多肽是抑制素或与抑制素有类似免疫或生物活性的多肽，一个杂化上述第一序列的DNA序列或一个通过突变，包括单个或多个碱基取代，缺失，逆位和插入，与上述第一DNA序列或杂交序列有关的序列，及把上述的DNA插入物引入到克隆运载工具中。

27、权利要求26的方法，其中上述的克隆运载工具选自於细菌质粒，细菌噬菌体或质粒或病毒，它能在体外的真核细胞内或在整个生物体内进行复制。

28、权利要求26或27的方法，其中上述的DNA插入物以带有表达控制序列的正确译读结构被引入到克隆运载工具中。

29、权利要求28的方法，其中上述的DNA插入物被引入到大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因中。

30、一个转化宿主，其中宿主用权利要求18到50中任意一个的重组体DNA分子进行转化。

31、附加了权利要求17到20中任意一个后的权利要求29的转化宿主，其中上述的宿主选自於细菌细胞，细菌噬菌体，酵母，真菌和包括脊椎动物和植物细胞的真核生物细胞。

32、权利要求30或31的转化宿主，它有能力表达多肽抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体，或一个与抑制素有类似免疫或生物活性的多肽。

33、权利要求32的宿主，它有能力表达非糖基化结构的抑制素的43KD，20KD或15KD亚基。

34、权利要求33的转化宿主，其中上述抑制素的43KD，20KD和15KD亚基，在序列上与人或牛的抑制素结构相当。

35、权利要求30或31f的转化宿主，它有能力表达图5中的-60到166氨基酸序列，图5中的-10到166氨基酸序列，图7中的1到166氨基酸序列，图7中的-61到171氨基酸序列，图7中的-10到171氨基酸序列，图7的1到171氨基酸序列或其他的生物等同物。

36、给於保藏号的转化株微生物的培养物：大肠杆菌，ATCC67054，ATCC67055，ATCC67056，ATCC67057，ATCC67058或ATCC67059。

37、转化宿主使其能产生抑制素的整个部分，构成部分，前体，同类物或同系物或显示出生物或免疫活性的多肽的方法，其方法包括提供一个适用的宿主並将权利要求18到25中任意一个重组体DNA分子，以正确译读结构，引入到上述的宿主中。

38、权利要求37的方法，其中上述的宿主选自於细菌细胞，酵母，细菌噬菌体和包括脊椎动物和植物细胞的真核生物细胞。

39、权利要求30到36中任意一个转化宿主的表达产物，其包括抑制素的整个部分，构成部分或同类物，同系物或前体或一个有类似免疫或生物活性的多肽。

40、权利要求39的表达产品，实际上是以纯的形式存在。

41、权利要求39或40的表达产品，其含有一个与宿主同系的第一多肽序列和是抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的氨基酸序列或是有类似免疫或生物活性的多肽的第二多肽序列。

42、权利要求41的表达产品，其中上述的第一氨基酸序列是β-半乳糖苷酶的构成部分或整个部分，宿主细胞是大肠杆菌。

43、权利要求40，41或42的表达产品，其包括抑制素的43KD，20KD或15KD亚基，抑制素43KD和15KD亚基的复合物，抑制素20KD和15KD亚基的复合物或其他的生物等同物。

44、权利要求43的表达产物，其中上述的43KD，20KD或15KD亚基有与人或牛的抑制素相当的序列。

45、权利要求38，39或40的表达产品，其包括图5的-60到166氨基酸序列，图5的-10到166氨基酸序列，图5的1到166氨基酸序列，图7的-61到171氨基酸序列，图7的-10到177氨基酸序列或图7的1到171氨基酸序列或其他的生物等同物。

46、生物合成多肽的方法，所说的多肽包括抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体或一个有类似免疫或生物活性的多肽，其方法包括：提供一个以DNA插入物为特征的重组DNA分子，包括一个为抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的氨基酸序列表达密码或与此密码相当的第一DNA序列，一个与上述的第一序列杂化的DNA序列，一个通过突变，包括单个或多个碱基取代，逆位，缺失和插入，与上述的第一DNA序列或杂化序列有关的DNA序列或一个为抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体或显示出类似免疫或生物活性的多肽表达密码的DNA序列;

用上述重组DNA分子转化宿主，以使上述的宿主能表达蛋白

产品，所说的产品包括抑制素的整个部分，构成部分或前体的多肽或是与抑制素有类似生物或免疫活性的多肽;

培养上述的宿主以获得上述的表达;和收集上述的蛋白质产品。

47、权利要求46的方法，其中上述的蛋白质产品以包涵体形式产生。

48、权利要求46或47的方法，其中上述的蛋白质产品为牛或人抑制素的43KD，20KD或15KD亚基或是它们的一个具体部分。

49、权利要求46或47的方法，其中上述的蛋白质产品为图5中的-60到166氨基酸序列，图5中的-10到166氨基酸序列，图7中的1到166氨基酸序列，图7中的-61到171氨基酸序列，图7中的-10到171氨基酸序列，图7中的1到171氨基酸序列或其他的生物等同物。

50、权利要求46到49中任意一个方法的产品为包括抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体的多肽或是有类似免疫或生物活性的多肽。

51、一种通过重组DNA技术产生的多肽，它包括抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体或一个有类似生物或免疫活性的多肽。

52、权利要求51的多肽，其包括牛或人抑制素的43KD，20KD或15KD亚基或它们的主体部分。

53、一种药学组合物，其含有权利要求39到45中任意一个的表达产品，或权利要求51到53中任意一个的多肽，用制药学上容许的稀释剂或载体进行组合。

54、权利要求54的药学组合物，有口服形式，注射剂形式或持续释放的组合物形式。

55、一个合成的肽，其含有一种至少有部分抑制素的氨基酸序列並有由此抑制素微粒或该微粒的一部分而产生免疫或生物活性的多肽。

56、权利要求56的合成肽，实际上以纯的形式存在。

57、权利要求56或57的合成肽，有下列的序列

组氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-

1  2  3  4  5  6

蛋氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-谷氨酸-

7  8  9  10  11  12

脯氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸-谷氨酰胺-天门冬氨酸-

13  14  15  16  17

缬氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-

18  19  20  21  22  23

苯丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸

24  25  26  27

可任意选择地添加一个羧基-或氨基-末端酪氨酸残基。

58、权利要求56或57的合成肽，有一个与图5，6，7或8附图所示序列的整个部分或构成部分相符的氨基酸序列。

59、权利要求56到59中任一个合成肽，用作抑制素激动剂，拮抗物或用於产生一种影响性腺功能或繁殖生理学的抗原反应。

60、影响性腺功能或繁殖生理学的方法，其方法为施药给脊椎动物一种权利要求39到45中任意一个权利要求所明确说明的表达产品，或一个在权利要求51到53中任一个明确的多肽，或在权利要求56到59中任一个明确的合成肽。

61、权利要求39到45中任意一个表达产品，或权利要求51到53中任意一个多肽，或权利要求56-59中任意一个合成肽的用途，用於免疫攻击脊椎动物，使其产生对产品，多肽或合成肽的抗体。

62、一种根据权利要求62对脊椎动物进行免疫攻击后产生的抗体制剂。

63、一种表达产品，包括抑制素的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体，或一种有类似免疫或生物活物的多肽，具体的如同前面有关实例和/或附图所述。

64、一种能对抑制素或是与抑制素有类似免疫或生物活性的多肽的整个部分，构成部分，同类物，同系物或前体相当的多肽进行表达的转化宿主，具体的如同前面有关实例和/或附图所述。

65、权利要求39到45或51到53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求56到59中任意一个权利要求的合成肽，用作诊断剂或药剂。

66、权利要求39到45或51到53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求56到59中任意一个权利要求的合成肽，用作脊椎动物的避孕药。

67、权利要求63的抗体制剂，用於增加脊椎动物的多产能力，其方法为把上述的抗体制剂施药给脊椎动物。

68、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用作脊椎动作的免疫，抵抗它们内生的抑制素，以增加增殖能力。

69、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用於脊椎动物，可减少性成熟时间，或缩短或除去季节性的动情时间。

70、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用於在所要求生育控制方式的情况下，以促使脊椎动物动情期的固定。

71、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用於脊椎动物后能减少或使促卵泡激素完全不存在，从而使避孕药有效地提供了生育控制的方式，人体的避孕或害虫消灭的方式。

72、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用作人的避孕剂，特别适合男性。

73、权利要求39到45或51和53中任意一个权利要求的重组体抑制素，它的构成部分，同类物，同系物或前体，或权利要求51和59中任意一个权利要求的合成肽，用作产生单克隆或多克隆抗体的药剂，这些药剂可用於脊椎动物抑制素或其衍生物含量的诊断测定和作为该诊断测量系统的标准。

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