CN86103836A - 自身抗原疫苗的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

自身抗原疫苗是通过形成多体、形成非细菌顺序上的并合蛋白或形成两者来提供抗原性获得的。这种疫苗可以用通常肽疫苗的剂量来接种或者以重组体牛痘和原位合成的肽来供应。特别有用的自身抗原是从控制生殖的激素中得到的。

本发明揭示了易接种、可逆阻止人受孕的疫苗。该疫苗包括牛痘病毒载体或多体。在最佳实施例中，流感血细胞凝集素蛋白或其部分用作嵌合体的组分。对自身抗原获得的抗体和对这些自身抗原具有特异性的抗体是有用的。

Description

本发明涉及起中和固有蛋白质作用的疫苗的结构和设计。这样的疫苗可被制成种特异性的疫苗或者可具有交叉物种效果。具体地说，它们用于控制人和动物的生育能力。这样疫苗的一个重要的实施例利用出自牛痘的抗原。

控制人口是人类的一个长久性的问题。甚至有人建议特洛伊战争（Trojan    War）是降低东地中海区域的人口密度的一种佐斯（Zeus）手段[图希曼，B.，蠢事进行曲（1984），第47页;引证塞浦路斯和欧里庇得斯][Tuchman，B.，The    March    of    Folly（1984），p47.citing    Cypria    and    Euripides]。近来，人们的一些努力均依赖于比较复杂一些的技术。虽然需要反复自我施用的方法在某些情况下尚是成功的，但是许多个人以及有些作为政策性的国家已感到必须依赖于长期性的手段，例如绝育或者事后治疗，比如流产。然而，这些手段似乎并不最适宜。

动物群体中生育能力的控制，尤其是那些供玩尝的动物也是一个严重的问题，至少在美国是这样。由于动物的主人不能适当地防止其玩尝动物的繁殖，所以每年消灭了无数的小狗和小猫。防止玩尝动物繁殖的失败，原因是由于目前所采用的绝育方法很麻烦和费用昂贵，包括外科手术。另外，可以认为部分玩尝动物主人在心理上是不愿让其动物遭受到一个剧烈的过程。然而，农场动物的主人比较起来不易受惊，但是他们要求提供一个控制动物数量和行为的代替方法以取代阉割法。例如，众所周知，公牛在年青时阉割会导致肉的数量减少而脂肪量增加。可是，迄今在玩尝动物或者训养的农场动物中，控制数量和行为的代替方法是行不通的。

采用疫苗来控制人和动物的生育能力的一般理论已是一些重大研究的课题。例如，对人来说，有人建议使女性免疫使其可以对抗精子[Li.T.S.，Obstet    Gynec（1974）44：607-623]并且还可以对抗胎盘的和滋养层的抗原，在早期的研究中，采用粗制的提取物[Koren.Z.，et    al，M    J    Obstet    Gynec（1968）102：340-346;Beck，J.S.，et    al，J    Path（1970）125-129]，而近来采用较纯抗原，例如人的胎盘的催乳物和人的绒毛膜促性腺激素进行免疫[Stevens，V.C.，et    al    Am    JRepro    Immunol（1981）1：307-314]。也可参见美国专利第4384995、第4526716号、第4302386号以及第4201770号，这些专利都为史蒂文斯（Stevns）所发明的。还有人建议把人的绒毛膜促性腺激素（h    CG）的合成类似物作为抗原[Matsuura，s.，et    al，Endocrinol（1979）101：396-401]。

史蒂文斯.V.C在其所采用的文献“生育力调节的内分泌机制”中（Endocrlne    Mechanisms    in    Fertility    Regulation，Benagiano，G.，and    Diczfalusy，E.，eds.，New    York：Raven    Press，1983，pp.141-162）也对免疫方法作了最新评述。该评述文中建议，如果结构合适，具有绒毛膜促性腺激素的羧基未端肽的疫苗作为抗原组份可以用于人体。此外，在以下引用的几篇文章中，Tha，U.R.B.等建议可把绵羊的黄体化激素（OLH）用于使妇女免疫而不受孕。

服用抗怀孕抗原的难处之一是在于寻找一种合适的可注入人体可接受的载体。

原有的辅助剂，例如弗朗得在完全辅助剂或者弗朗得非完全辅助剂对人体来说是不能接受的[Stevens，V.C.，Serono    Symposium    No.45.Academic    Press，London    &    New    York，（1982）pp131-143]。在制备一种合适的亚单位疫苗中的成本因素已被看作是用于不发达国家的制备抗生育能力疫苗的一个问题。这是特别尖锐的问题，因为在那些区域人口过剩的威胁已成为进一步发展的主要障碍。

对于动物来说，也已进行了一些研究而且生产出可以阻止动情期或者破坏动物的雄性性功能的肽基疫苗或蛋白质基疫苗。塔尔瓦等人[Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1985）82：1228-1231]制备出抗激素促性腺激素释放（Gn    RH）的单克隆抗体，当把它注入雌狗体内时，这种抗体能够立即抑制动情期的发展。十年前，弗雷泽等人（J    Endocn（1974）63：399-406）证明了通过用与牛血清蛋白结合的Gn    RH（后称LHRH）免疫可诱发雄大鼠的第一性征和第二性征的萎缩。据推测，这种结合可提高Gn    RH的抗体，这就是通过中和这种激素而中止了正常持有的性机能。斯因巴切[JAndrol（1983）4：233-239]最近完成了一项用雄狗作试验对象并得出类似结果的类似的研究。在美国专利第4556555号中，埃伯夏德揭示了一种动物在青春期前注射抗Gn    RH抗血清来使动物被被动中和的方法。

然而，很显然，控制家畜和农场动物的数量和行为的疫苗的研制尚未认真地进行。因此，从蛋白质或者肽结合体制备的疫苗具有某些固有的缺点。肽的制备和疫苗的配制是昂贵的，而且接种必须在控制的条件下由经培训的人员进行。同时，因为这些疫苗是通过由自身抗原在蛋白质上与载体结合而不是在遗传水平上来制备必然会出现变性作用。因此，难以要使每批均达到均匀的组成，并且一些组成具有低的抗原性，从而导致免疫反应反复不定。

多年来，已经知道另一种蛋白质基疫苗，通过采用由牛痘病毒构成疫苗业已成功地消灭了无花。由牛痘病毒的菌苗在价格方面（每次剂量大约两美分）以及在处理方面均具有极大的优点，因为它可以在非无菌区的条件下划痕接种和可在预先干冻时可在室温下保持其稳定性。近年来牛痘的这些特性已被用于通过把为对付乙型肝炎、疮疹、流感以及狂犬病的所需要的免疫原编码的基因重新结合到牛疫苗基因组中来制备对付其他传染物的疫苗。然后，这样经重组的牛痘可以以与原有天花疫苗相类似的方式来应用，并具有所有的保管上的优点。实例请参见Smith，G.L，和Moss，B，Biotechnigues（1984）306-312;Smith，G.L，Nature（1983）302：490-495;Panicali，D等人，Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1983）80：5364-5368;Paoletti，E，等人，Proc    Natl    Acad    Sci（1984），81：193-197;Wiktor，T.J，Proe    Natl    Acad    Sci（1984）81：7194-7198;以及Panicali，D，等人，Proc    Natl    Acad    Sci（1982）79：4927-4931。

但是，为了管理对付自身抗原的有效疫苗需要了解牛痘疫苗载体特性尚未加以整理。控制生育能力的合适自身抗原取决于试验者的物种，但是，一般来说它是与调节生殖系统的激素相关的。人体的绒毛膜促性腺激素是一种特别抗原，如果它被中和，就不能在维持人体受孕中起其必要的作用。因此，提高抗对付这一因素的中和抗体，例如通过服用牛痘疫苗载体就能有效的控制人的怀孕。然而，一般来说，利用绒毛膜促性腺激素羧基未端肽并不对动物起作用，因为除了马之外，大多数物种胎盘不产生绒毛膜促性腺激素。所以，为了使疫苗对非人物种有效的达到绝育或者暂时无生育能力，那么就必须使用另一种自身抗原。已经知道，为许多激素编码的DNA顺序在控制动情期周期是重要的，例如黄体化激素（LH）和促卵泡成熟激素（FSH）是可采用的。但是，在具体的最佳实施例中，为（Gn    RH）编码的DNA在产生制止动物生育能力的抗体是有效的。由于雌的和雄的农场动物和狗猫的性功能主要是由Gn    RH控制的，因此每一物种性别的动物可以用这种疫苗使其不生育或者绝育。

本发明提供了成本低廉的有效制剂，适用于发展中国家和工业化国家用于控制生育，对人和动物都适用。一般来说，这些疫苗还可用于控制由固有蛋白质或自身抗原所调节的任何代谢功能。

这些疫苗包含在限定的时间内防止人怀孕，并且是可逆的疫苗，为的是在使用时没有不利的作用和不会产生永久的绝育。这样疫苗是人体绒毛膜促性腺激素（h    CG）的免疫原的形式，这是一种维持受孕所必需的胎盘的产物。另外一些与生殖功能相连系的激素，如（Gn    RH）和（LH）的某些形式也可用作提供人体疫苗中的抗原决定簇的基础。利用自身抗原形式的Gn    RH、FSH或LH的类似的疫苗对控制动物的生育能力是有用的。免疫原是以DNA与牛痘病毒一起构成的形式被施用，这是一种使配制成本低廉以及可以在一定范围条件下施用的载体。此外，它们还可以以较普通的方法施用，例如，把一种合适的激素的合适区的自身抗原结构用作一种抗原决定簇。

然而，本发明具有广阔的应用。一般来说，通过使它们的“表位”多体化或者通过以并合的蛋白质的形式结合到非细菌氨基酸顺序，固有的蛋白质可有效地作为自身抗原，还可以以一般或者牛痘产生的形式被使用。故而，由肽所调节的任何代谢功能易于用合适的疫苗来控制。这种疫苗的种特异性可以加以控制，因为这种特异性取决于“表位”的选择。所以，这些疫苗可以构成为可广泛地用于交叉物种品系，或者它们可以只限于对选择的单一物种有效。

在最宽广的方面，本发明涉及到用自身抗原作疫苗控制代谢功能，其中对一种合适的固有蛋白质的抗体随着对重组所建立的“自身抗原的”形式作出反应而增加，例如，一种含有与固有蛋白质相关的至少一个“表位”的至少两个重复单位的多体，或者作为一种重组所产生的带有一个合适表位的并合蛋白质。自身抗原的形式是采用重组技术在DNA水平上被构成的，并且自身抗原蛋白质既可以在试验对象中原来位置被产生，如果为自身抗体编码的DNA在牛痘载体之中适当的配置，也可以用重组技术来产生和以肽或蛋白质形式被提供应用。

在一种方法中，自身抗原是一种多体，为固有肽（例如一种激素）编码的DNA，或者它的含表位的部分在玻璃试管内处理以获得这个顺序的多体的重复密码顺序。构成疫苗基础的蛋白质相对对自身抗原表位而言可以是单体，如果它们配置在适当的载体蛋白质之中提供足够的免疫原性，它们在这种情况下，这种为表位编码的DNA附在为载体编码的DNA上。最后，含表位的部分可以连接在载体上，在蛋白质水平上建立起免疫原性。

在一个特别方面，本发明涉及用于的防止人受孕的疫苗，该疫苗是以HCG蛋白质的一个特定区的表位-代表“β-HCG”链未端的羧基未端肽（CTP）。（如下所述，HCG含有两个非共价结合的亚单位，以α和β表示）。这些单体和多体包括通过在110位置上无半胱氨酸或者在110位置上用丝氨酸或其他相当的氨基酸残基取代半胱氨酸而加以改良的CTPs。在另一个实施例中防止农场动物和玩尝动物以及服用适应的防止人受孕的疫苗是建立在免疫原即，控制生育能力的自身抗原是促性腺激素释放因子（Gn    RH）产生的基础上，这是一种控制从垂体释放的某些激素的下丘脑的产物。最佳的Gn    RH形式是人的（Gn    RH）顺序的改正，其中N-未端焦谷氨酸（据推测是通过在血清中环化构成的）是由谷氨酰胺取代，而C-未端酰胺化了的甘氨酸是由谷氨酰胺取代。其他实施例在动物和人体中仍使用其他控制生育能力的自身抗原的免疫原形式，特别是LH和FSH。

同时，本发明的一个方面是一些通过在把人体、牛及狗LHβ链的部分转换成自身抗原的表位来调节种特异性的疫苗。根据被选的肽的部分，这些疫苗在其应中是种特异性的或者种通用的。

在所有的情况下，如有需要的话，所需要的自身抗原可以以含有表示自身抗原的单体和多体的重组的牛痘的形式被施用。对于其DNA顺序仅为自身抗原（例如CTP或Gn    RH的多体）编码的载体来说，可以预料，细胞内的表达是可行的。当这些抗原所存在的受感染细胞被对付牛痘的对细胞毒性的免疫反应所破坏时，这些抗原将显示剂免疫系统。对于其中牛痘基因组与所需要的自身抗原编码的DNA顺序所阻断的载体蛋白质编码顺序（例如流感血细胞凝集素编码DNA）重组的那些实施例来说，第二种载体起着把自身抗原的单体或多体输送到被感染细胞的表面的作用。就使自身抗原更有效地暴露到试验对象，从而提高免疫反应。在一个实施例中使用HA，例如把需要的自身抗原基因克隆到流感HA的A或B抗原区;在第二个实施例中，它们是在HA信号顺序或膜固着部分之间被克隆。这两种方法使抗原呈现在细胞的表面。其它结构导致了表达的蛋白质的分泌作用。例如，所需要的自身抗原Dn    AS可以被克隆入HA编码DNA，以致所得到蛋白质与信号顺序相连接，但是HA的膜固着部分却消除掉。另外，例如与细菌性碱性磷酸酶（BAP）或血管紧张肽原酶相关联的其他信号顺序可以被用于实现所需要的自身抗原免疫原的分泌作用，或者可以使用与天然抗原蛋白质相关联的信号顺序。

在另一方面，本发明涉及通过施用前述的疫苗制止受孕或者控制其它代谢机能的方法以及涉及制备这类疫苗的方法，还涉及在其制备中所用的中间载体和DNA顺序。

再另一个方面本发明涉及对这些疫苗起反应所产生的抗体。这些抗体对于通过免疫测定法确定激素本身的水平是特别有用的。因此，本发明中还包括这些抗体的标记形式和未标记形式以及以可溶性形式和束缚在固体载体上的这些抗体。从用本发明疫苗免疫了的动物所得到的脾还可用作胚质不灭的细胞源，以获得相应单克隆制剂。

附图说明：

图1所示在制备为改良的和未改良的β-HCGCTP单体和代表β-HCG109-145氨基酸的多体编码的基因是有用的DNA顺序;

图2所示为几种物种的Gn    RH氨基酸顺序和在制备为改良的人体和小鸡ⅡGn    RH单体和多体编码的基因是有用的DNA顺序;

图3a所示为构成牛LH的β肽的一部分的合适的多体的CDNA顺序和方法;

图3b所示为构成狗LH的β肽的一部分合适的多体CDNA顺序和方法;

图4所示为构成人体LH的β肽的一部分的合适的多体的CDNA顺序和方法;

图5所示为得到宿主载体PVA1的PKK223-3和为得到宿主载体PVA2的PKT19及PKT41的改变过程;

图6所示为含有HA编码DNA的PHA1和PHA2衍生载体的结构;

图7所示为具有有用的限制部位的典型的血细胞凝集素编码基因图它的用途是作载体。

图8所示为把自身抗原多体插在HA抗原区的HA基因的改变过程;

图9所示为携带着通过把自身抗原插在它的信号顺序和膜固着部分之间而改变了的HA基因的中间载体的结构;

图10a、10b及10c所示为含有插入进缺少膜固着部分密码子的HA第二载体中的自身抗原的中间体载体的结构;

图11和图12所示为分别采用BAP和血管紧张肽原酶信号顺序实现自身抗原分泌作用所设计的载体的结构;

图13所示为PGS20的结构和它用于有效把所需的顺序整合进牛痘病毒TK基因的图;

图14所示为用本发明的自身抗原CTPS的表达载体转移感染的细胞所产生的蛋白质的凝胶分析的结果;

图15a为人体、大鼠、牛以及狗的βLH氨基酸顺序的比较;图15b所示为用于种特异性的疫苗的肽的位置以及为它们编码的低聚核苷酸的顺序。

实施本发明的方法

在一个方面，本发明涉及利用牛痘系统引入和表达脊椎动物宿体中自身抗原的基因的方法和结构。因此，牛痘被用作表达在靶宿主中已是免疫原的蛋白质的DNA顺序的载体，而且不被用来获得自身抗原的表达，自身抗原被改变为使它们具有免疫原性。一种特别合适的“改变”包括用多体基因产生多体抗体，以便所结合的区形成外来的表位。当单体基因以及多体基因被插入到为已知的抗原部位编码的DNA区时，例如在流感血细胞凝集素内，也可以提供免疫原性。然后，自身抗原将成为已知易受抗体影响的蛋白质的一部分，而其它的血细胞凝集素抗原部位以及与抗原区顺序的结合区表示外来的表位。在外来蛋白质中利用单体和多体基因的这些和其它结构是应用这些外来蛋白质把所得的嵌合体方法带到和配置在被感染的细胞表面或者从感染的细胞把它们分泌出来。这种输送使得带有自身抗原的嵌合体易达到免疫系统。

由于从这些重组体结构的在原来位置表达所产的蛋白质是免疫源，所以免疫源也可采用重组技术在试验对象外来产生和以通常的蛋白质疫苗被施用。这种重组体表达包括应用通常的原核的和真核的表达系统和宿主以及采用标准转移法把重组体中间往这载体插入易受牛痘感染的细胞和用牛痘病毒感染作用的瞬时表达。对生殖作用所涉及的激素和其它因有蛋白质具有免疫特异性的抗体是有效的，所以这些抗体当然可被提纯和在免疫测定法用于测定抗原。

A.赋于固有蛋白质免疫原性

本发明的核心在于应用重组技术建立各种形式具有免疫原性的并且表现为自身抗原作用的固有蛋白质。

这些“自身抗原”通常是在宿主中制成蛋白质的部分顺序或者全部顺序，因此，除非它们被做成免疫原的，这些蛋白质在免疫学上是授予优惠。这种免疫原性可以通过下述获得，即使把表示免疫学上优惠全部或者部分蛋白质的主自身抗原的基因与一个附加顺序的基因相连接，自身抗原或第二个载体蛋白质或两者被复制，以致使得自身抗原和其邻近氨基酸之间的连接区对宿主有机体是明显的外来的，并且能够赋予整个蛋白质以免疫原性。通过插入牛痘病毒所产生的嵌合体的蛋白质当在原来位置被产生时就呈现出弱的特性，或者同样的编码顺序可以采用重组技术在玻璃试管中产生，然后用作通常疫苗。在有些情况下，其中自身抗原仅仅是免疫学上赋予优惠的蛋白质的一部分，自身抗原单独可能是免疫原性。

总之，本发明涉及到用重组技术生产各种免疫原形式的固有的蛋白质。免疫原形式的蛋白质是通过构成为下列多体编码和生产的基因来获得的，一个多体基本上是由与固有蛋白质的至少一个表位的或者与在非细菌多肽结合的固有蛋白质的至少一个表位的至少两个重复单位组成的，或者多体基本上是由与一个附加多肽顺序结合的固有蛋白质的至少一表位的至少两个重复单位组成的。

按照本发明的一个实施例，所需要的自身抗原的多体是在DNA水平上建立的。多体蛋白质的的连接区构成了贼予所得到的聚合的蛋白质以免疫原性的外来顺序。与更加传统的把所需要的半抗原与载体蛋白质相结合进行比较，这种方法的优点是用几个不相干的表位和用高浓度的所需要的决定簇生产较大的免疫源，采用直接对肽起作用的聚合剂如戊二醛创造表位的另一种方法结果得到的是变性形式的表位，因此在生产所需要的构成物的效率有时是介于中间的。采用本发明的技术，蛋白质是在Dn    A水平上被“聚合”，从而得到一种较象与天然肽形式极其类似的重组聚合物。重组体多体已从胰岛素源构成[Shen，S.，Pooc    Natl    Aead    Sei（USA）（1984）81：4627-4631]，这些多体在大肠杆菌中表达。这些多体被用于稳定在组体蛋白质，随后被解聚合作用重新形成单体形式，这就是所需要的产物。人体疟原虫的“CS”蛋白质的重组多体也已被构成[Young，J，Fy    etal，Science（1985）228：958-962]。这些是通过Xho    Ⅰ片断单体、二聚物、三聚物编码四肽，因此，它们含有重复四肽顺序的16、32或48衔接拷贝。天然蛋白质含有点缀着4个相同（相互）的四肽的这种四肽的37重复。已发现这些肽在小鼠中是免疫原的。

这种蛋白质的免疫原性还可以通过将其插入到从诸如病毒表面蛋白质的感染物中得到蛋白质的抗原区内，或者插到简单起着增大肽的尺寸作用的载体得以增强。

“载体”是一种导致产生融溶蛋白质的肽顺序，这种融溶蛋白质处在能够赋予要为免疫原的自身抗原的至少一个表位和提供半抗原的表位免疫原性的非细菌来源的顺序之间。再次，结合区表示受体的不常见的顺序，如果需要，附加肽中具有足够的尺寸，以增加抗付这种决定簇的抗体。流感血细胞凝集素蛋白质的肽顺序对提供所需的附加氨基酸顺序是特别有用的。

图7所示为典型的血细胞凝集素（HA）基因图。所示的具体的图是抗原变异体A/Japan/305/57[H2]图。它是Gething，M.T等在《Mature》（1980）287：301中所揭示的。如图中所指示的那样，该基因为信号顺序编码，这是一个含有大约550氨基酸随着是膜固着部分顺序的肽。该基因是由Bal    Ⅰ、Nde    Ⅰ及Pst    Ⅰ限制部位构成，并在氨基酸顺序体中含有几个便利的限制部位。通过采用部位特异的突变形成在这些区的密码子之间提供纯的末端限制部位，表位或者单体或者多位可以被结合到如A和B所示的抗原区的。此外，天然存在的限制部位可以用于得到被HA载体的剩下的部分所扩展的蛋白质。

如果提供并合蛋白质的如果并合基因（bused    gene）在宿主外培养物中被表达的话，那么HA顺序仅仅起着向结构成物提供并合基因所需免疫原性的作用。当然，在经培养的细胞中保有信号顺序和消去膜底固着部位就能够从培养基中收回所需要的蛋白质。如果在经接种疫苗的宿主原来部位表达，那么HA顺序起到与把抗原决定簇引入宿主直接相关的功能的作用。

当然，以前述的九种方法结合起来多体编码顺序可以结合到为载体编码的DNA上。

用牛痘作为如上述构成的任何自身抗原基因的载体可以获得附加的优点，因为免疫原性的水平可以通过编码蛋白质的特性来进行调整。如上所指出的那样，如果自身抗原直接插入到牛痘中，则经编码的自身抗原蛋白质将以有限地暴露在免疫系统中的胞内蛋白质形式被生产。插入到病毒蛋白质的抗原区内将导致在细胞表面上抗原的显示;通过采用可导致受感染细胞的分泌作用或者细胞表面上配置的附加第二载体顺序可获得类似的增强。

自身抗原是在宿主的代谢控制（尤其是激素控制，特别是生育率控制）中所涉及的肽的构成物。

以下为说明本发明的特殊应用的实施例。在其中一个实施例中，从β-h    CG得到的编码顺序是被制成免疫原的，因此，它可用于建立防止人受孕的疫苗。在两个另外的特别说明中，已知的Gn    RH和LH顺序可制成一种使各种动物无生育能力的形式。人体Gn    RH一般是用于以在动物，包括狗和猫中的应用来说明。然而，最好的是另外的已知顺序的Gn    RH肽，例如图2中在蛙和小鸡已证明的Gn    RH肽。应当指出，猪和牛的顺序彼此是相同，与人的顺序也相同。据推测，鉴于与蛙亲缘很远的物种的高度顺序同源性，狗或猫或者其它的农场动物天然有的Gn    RH至少与人和（或）鸡的形式具有免疫学上的交叉反应性。

对牛、狗以及人的LHβ肽还要加以说明。这些肽可能有很大的交叉物种反应性，特别是包括了同种的区。然而，如下所说明，种特异性疫苗也可以通过重组技术产生代表非同源区的肽或肽的多体来构成。

此外，另外的控制生育能力的自身抗原也可以应用，它们包括从卵细胞蛋白质得到的自身抗原如透明带肽;精子抗原如透明质酸酶和精虫头粒蛋白;精子特异的乳糖脱氧酶的同工酶，以及附加的垂体激素促卵泡激素（FSH）。

具体地说，控制生育能力的某些方法是考虑具体的要求。对于人来说，以βHEG的CTP部分为基础使受试对象成功免疫的疫苗特别优先考虑，但利用卵的βLH亚单位或者其中部分也可有效防止人受孕。Thau，R.B等人[Fertil    Steril（1979）31：200-204;ibid（1980）33：317-320;ibid，Endocrinol（1983）112：277-283];以及Yamamoto，Y等人[J    Repod    Fertil（1982）4：295-311;J    Reprod    Immunol（1983）5：195-202]说明了卵的βLH对防止猴子受孕是有效的。此外，服用提供抗FSH免疫性的疫苗[Mougdal，N，R.，Arch    Androl（1981）7：117-125;Mougdal，N.R等人，Am    JReprod    Immunol（1985）8：120-124]和Gn    RH可降低男人的生育能力，虽然提高抗GNRH抗体的疫苗的接种必须通过服用防止性欲丧失的睾酮或其他类固醇来实现。

对动物来说，优先采用在提高抗Gn    RH的抗体特异的疫苗。具体所用的是种特异性的疫苗，亦即仅在接种的物种中能够制止受孕或者诱发不育性的疫苗。这些疫苗是利用残留在控制物种间非同种的生殖的激素的各区内的表位，特别是在人与必须接种疫苗的物种之间。这就可能特别要求构成用于动物的疫苗，而在人接种它时几乎没有危险性。下面叙述一种典型的工艺，选择低同源区作为疫苗的抗原决定簇。

在逆向应用中，可以应用为抑制素编码的基因，抑制素是一种通过降低垂体分泌FSH的能力来影响生育能力的激素;这里抗体会增强宿主的生育能力。参见Olson，P.W.，等人，Symposium    on    Endocrindogy，Vet    Clin    NA：Small    Animal    Practiec（1984）14：927-926。此外还有可能需要使宿主免疫以对抗这些和另一些激素免疫，以便调节这些激素产生过多和结果产生代谢异常。一般来说，与本发明最密切的自身抗原是“控制生育能力”，亦就是涉及到包括行为和生殖力的性特性的生理控制的激素。

在另一方面，Reddy，V.B等人[Proc    Natl    Acad    Sci    USA（1985）82：3644-3648]、PCT申请公告第WO85/01958号和第WO85/01959号揭示了采用猴子细胞中自发地复制的载体可以达到同时增强为生育激素的α和β亚单位编码的基因的表达。如果从载体中去掉为α链编码的顺序，则那么就不生产h    CD的β链。

由于有大量附加自身抗原存在因此需要产生中和抗体。这种自身抗原的一部分名单包括与对宿主自已组织是特异的自身免疫疾病的病人所产生的免疫球蛋白相对应的抗原（其中中和抗体会抑制自身免疫性）和与T24膀胱癌生长因子相对应的抗原[Taparowsky，E等人，Nature（1982）300：762]、一种由引起膀胱细胞转移的人体致癌基因所产生的蛋白质（其中抗体会延迟恶性肿瘤的发展）。

B.CTPn免疫原

在防止人受孕的疫苗的最佳的实施例中，其中自身抗原肽是从人体绒毛膜促性腺激素（β-h    CG）的β链的羧基末端肽（CTP）得到的。采用CTP相关肽有以下几个优点：

第一，虽然CTP是从与类似于某些以下所规定的人体激素相关的人体蛋白质得到的，但是CTP区对h    CG是独特的，因此，藉助于提高抗CTP的抗体可以把对其他必需的激素的不必要的干扰的可能性降低到最小。h    CG本身是一种30%为糖分子量为38kd的糖蛋白。这种蛋白质具有两个不同的亚单位，即通过非共价链偶合的α和β-h    CG。h    CG的α亚单位和三个其他激素（促黄体激素（LH）、促滤泡激素（FSH）以及促甲状腺激素（TSH）的α亚单位在人体中都是相同的h    CG是由胎盘分泌;LH、FSH以及TSH是由垂体分泌。这些激素的所有四个β亚单位在它们之间呈现出差异，但却保留一些氨基酸顺序同源性。同源性在h    CG和h    LHβ亚单位之间是最大;然而，h    CG却含有一个附加的三十氨基酸，它延伸到超出h    LH的β亚单位中115氨基酸残基后面。一般来说，β-h    CG的111-145位置在h    LH中并没有相似物。诚然，以h    CG的109-145位置代表的肽（如牛γ球蛋白或白喉类毒素）相结合与载体蛋白质相已作抗生育剂对狒狒[Stevens，Serono    Symposrum（supar）]进行试验。

利用β-h    CG的CTP区的第二个优点是从胎盘得到的激素不是直接由宿主产生的。因此，提高抗h    CG（与FSH、LH或TSH不产生交叉反应）的抗体不会干扰可调节被免疫的试验对象的代谢作用的激素。可以假定h    CG的作用是通过怀孕后黄体刺激类固醇（黄体酮）产生，直到胎盘自身可以产生类固醇为止。胎盘产生h    CG显然是在怀孕6天内开始的，并对维持受孕是必需的。如果到7天不合成出足够数量的h    CG的话，则黄体就退化，正常的行经开始;这种缺乏的影响可以用中和抗体来模拟。因此，抗h    CG的免疫作用代表了抗非母体激素的免疫作用（显然免疫学上为优先的话），显然，非母体激素是专为维持受孕而设计的，据推测，不会分泌该激素用于任何其它附加目的。

采用h    CG的部分顺序的第三个优点是用CTP作免疫原的疫苗很显然可作为可逆转的不育剂，正如对狒狒的初步试验（Stevens，supra）所判断那样。可以认为，这种可逆转性是由于T-细胞记忆的方向不对准本身的h    CG，而是向着准h    CG/载体蛋白质结合区。所以，间歇性受孕中本身激素的生产（假定它可被抗体终止）似乎并不能增强抗h    CG反应，在狒狒（Stevens，supra）试验中已说明这点。在上面透露的结构中，把CTP部分构成为不同蛋白质的能力的确成为被认为是一种固有蛋白质的免疫原性的原因。

（确实，该特征并不限于CTP，但是一般来说是对自身抗原来说确是如此。试验对象的这特征不会因它们自已激素或内成的肽产生而增高）。

虽然史蒂文森已进行的对狒狒（Stevens，supra）的初步试验表明，CTP区很可能作为抗生育能力疫苗很显然，尚未发现可以接种的免疫顺序的满意的配方。牛痘可提供这样的可能性，如上所述，而牛痘有可能为在原来位置大量生产免疫原提供一种手段以及通过天花接种和通过对其他疾病的实验性免疫接种所收集的经验来构成一种载体。

这样并不是排除了另外的结构物。采用一般的重组技术可以制备含有CTP单体或多体的并合蛋白质，并且以与通常的传统亚单位疫苗所共用的方法来使用。

C.Cn    RHn免疫原

促性腺激素释放激素的（Cn    RH）是一种由下丘脑分泌的十肽，控制着脊椎动物促黄体激素（LH）和促滤泡激素（FSH）的释放（FinK，G，British    Medieal    Bulletin（1979）35：155-160）。这些激素反过来又控制类固醇（例如雌二醇和黄体酮的水平。如图2所示，对于几个物种已确定十肽Gn    RH的氨基酸顺序，并已克隆人Gn    RH的c    DNA，以致它的顺序毫无疑问地被确定（Seeburg.P.H等人，Nature（1984）311：666-668）。Gn    RH以前曾被称为成LHRH，在Seeburg文章中如此命名）。由于已知Gn    RH的肽顺序是来自蛙的，两种这样的因子来自小鸡，因此，为它们编码的DNA构成物很容易制备。

LH和FSH在调整狗和猫的动情周期都是重要的，虽然所得的动情模式周期不同。狗的促黄体激素在动情期开始时急到地达到最高峰，随着动情期继续进行而下降并消失。FSH在此时也达到峰值，虽然该峰值略延迟于LH的峰值，动情周期模式也并非精确地相同。雌二醇（受FSH控制）和黄体酮（受LH控制）的水平也是周期性的。所以，通过防止垂体分泌LH和FSH可破坏动情周期。这可通过免疫反应来抑制Gn    RH的活性来实现。

猫的动情协调性（orchestratvrc）不同，但试验者是相同的。除了靠性刺激外，对排卵必不可少的波动的LH却不释放。然而，控制性行为和感受性的LH和FSH水平是周期变化的，并且受Gn    RH的控制，正如其他脊椎动物那样[Johnson，L.M.等人Endoerinol（1981）190：240-246]。因此，通过抑制Gn    RH的活性，以阻止LH和FSH分泌将导致暂时性不育。

此外，较早的研究也说明Gn    RH的抗体抑制雄性的性功能（Fraser，等人和Sehanbacher等人，Supra）。因此，依靠产生Gn    RH作为抗原的疫苗对于使雄性试验对象也是有效的。

采用Gn    RH的一个优点是单一疫苗的交叉物种效果。在物种之中对Gn    RH的氨基酸顺序可高度有效地得到保存。如图2所示，人、绵羊、大鼠、猪及牛的Gn    RH是完全同源的;最大差别的肽是从小鸡中得到的两个中的一个，它仅显示三个氨基酸残基的不同。所有这些肽对大鼠均具有生物活性。

本发明中所用的构成物是从人的顺序中所得到的，但是要通过用在N-末端位置上谷氨酰胺残基代替焦谷氨酸来加以改良。这种取代作用具有保留谷氨酸结构的作用，但保持焦谷氨酸的不带电的结构。因此，所得到的肽不需对谷氨酸残基进行环化作用，它可以很方便地在被感染细胞的细胞质中产生，而不必担心影响这一过程的条件，例如原来在血清中所发现。作为从这些构成物所得到的多体将具有C-末端的谷氨酰胺，它模拟了天然存在的十肽的酰胺化作用，还排除对以后过程的需要。

就采用Gn    RH作基础以获得适合的疫苗而论，以上讨论的问题是关于CTP应用。接种可以是牛痘病毒构成物形式或者以通常的亚单位疫苗的形式。

D.促黄体激素及其物种特异性

下面也阐明了从人、牛和狗LHβ链顺序得到的疫苗。正如以上所描述的，LH是被包含在黄体的保养区中，虽然其含量调节在物种与物种之间是不同的，但对它们的生殖力来说都是必不可少的。所以，能够中和LH的抗体就是有效的抗生殖力剂。

图15a显示了人、老鼠、牛和狗LH的氨基酸顺序。许多区域是高度同源的，但是这些盒子指明了出现与人顺序有差别的区域。基于提高对LH的抗体疫苗，可以通过选择这些低同源现象的区以获得自身抗原而被制成为具有种特异性（或至少在人体中是不起作用的）。一般来说，种特异性是通过选择非同区来获得的，或者是通过使用同源区而有效地把疫苗制成跨超物种品系。图15b指出了有用于牛和狗的疫苗的肽。

所指出的非同源肽已足够的短以便把它们编码的基因能通过使用现行的化学合成方法容易地被制取。于是，类似于以上述的CTP和Gn    RH的单体的和多体的单元就能按照类似的途径被合成和处理，或者是个别地，或者是含有两至三种所需的肽，这象混合鸡尾酒。然而，能对牛或人顺序的主要部分进行编码的DNA，最适宜于用回收通过从使用牛或人脑下垂体m    RNA构成的储存所中c    DNA克隆的方法来取得用于牛LH[弗吉（virgin）J.B等，《生物化学杂志》（J    Bid    Chem）（1985）260：7072-7077]和人LH[泰马吉（Talmadg）K等，《自然》（Nature）（1984）307：37-40]的完整地基因编码程序为已知的，并由于高的顺序同源现象，作为Hind    Ⅲ片段从弗得（Fiddes）J.C.等在《自然》（Nature）（1980）286：684-677中所描述的p    BR322克隆载体中的所释放的-HCG    c    DNA可被用来作探测。编码有鼠LH的β链的核甘酸顺序也已经被公开了[秦（Chin）W.W等，国家科学院学报（Proc    Natl    Acad    Sci）（USA）（1983）80：4649-4653]。为猫和狗βLH编码的cDNA顺序可以从由相应物种属脑下垂体m    RNA制备的λgt10储存所取回。

牛、狗和人LH顺序的重要部分可被切割去，以便形成如下述更详细地描写的自身抗原形式。对牛c    DNA来讲，在自然出现的HaeⅢ第22位和第85位氨基酸上可提供一种合适的片段;对人c    DNA来讲，在密码子111-112位上的MaeⅢ部分能随人工引入的在密码子1～2位上的MaeⅢ部分同时使用。在所有的情况下，这些结构仅仅是为了举列，而这些结构能通过使用肽的任何主要部分而构成。影响DNA自身抗原性-多聚体作用的处理、连成一种载体蛋白质、融合蛋白质的生产等等;以及处理的方法作为产生菌苗的表达系统或作为用再组合方法生产出的一种蛋白质或蛋白质混合物，则类同于与Gn    RH和CTP有关的描述。

本发明中所培取的抗免疫蛋白质抗体，无论生产这些蛋白质是为了构成菌苗或是为了它本身，它们在诊断方面很有用，而且如果制备正确，还在被动治疗方面很有用。该技术领域中已知的传统方法被用于制备这些抗体。抗体本身和它们的特殊免疫片段，例如Fab片段因此都很有用。

E.定义

正如这里所使用的“羧基终端肽”（“carboxy    terminal    peptide”）或“CTP”系指与三种类似的激素FSH、TSH、和LH很少有相同之处的β-HCG区域。β-HCG是由145氨基酸肽组成的已知链[弗得（Fiddes）J.C等《自然》（Nature）（1980）286：684-687]。代表109～145号位置的大约30种氨基酸表示了这一组中的独特的决定因素。正如这里所使用的，CTP系指具有基本上类同于由源β-HCG的氨基酸109～145所代表的氨基酸顺序的肽。然而可认为：对氨基酸顺序可进行少许的改变而不致影响所形成的肽的免疫特性。氨基酸的加入、消除以及改变均可进行，只要它们不消极地影响产生-引致中和抗h    CG本身的抗体的肽的能力即可。这些改变，包括了（但不限于）在110位置上除去半胱氨酸残留体，或者用丝氨酸或其它氨基酸取代半胱氨酸残留体，这些氨基酸不妨碍所形成的修改形式的免疫性能，例如丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸。这种半胱氨酸残留体的消除，提供了一种蛋白质的改进形式，即防止了不需要的二硫化合物的偶然形成。

包括使用特殊CTP肽的重复顺序的CTP的“多体”（multimers）也被应用在本发明的疫苗中。这些多体可以由2～10个CTP肽构成，并且是以单体首尾连接形式构成。于是，CTPn其中n个为2～10表明了就是含有2～10个相应于CTP的大约30-链节的具体例子。

正如这里所使用的，“促性腺激素的释放因子”或“激素”或“Gn    RH”系指一般被认为是能影响来自垂体的FSH和LH的释放以及作其他有关性活动调节机能的下丘脑产物，并且那些以氨基酸顺序确定各种脊椎动物类的特征的下丘脑产物如图2所示。在上下文显然如此需要的地方，Gn    RH也是指编有有关肽编码的相应的DNA顺序。也正如这里所使用的，Gn    RH系指具有基本上相同于图2中所代表的氨基酸顺序的肽;然而，我们认识到可以对氨基酸顺序作微小的变化而不至于影响所生存肽的免疫特性，并且该定义包括了这些所生成肽。在本发明的上下文中，可以进行氨基酸的加入、消除以及改变，只要它们不消极地影响导致抗Gn    RH本身的中和抗体的肽的生成能力。这种改进包括（但不限于）在人顺序的位置1用谷氨酰胺取代焦谷氨酸，并且在单体或多体的C-末端加入谷氨酰胺残留体。这些改变并不减弱经改进后形式的生成物的免疫性，并且是特别地被包括在这一定义中的。事实上，他们代表了理想的具体体现。从图2也可清楚地看出，在7和8的位置上氨基酸残留体是最不稳定的。因此，在这些位置上带有取代基的Gn    RH的改变形式是很有效的。

被应用在本发明疫苗中的还有含有所使用的特殊Gn    RH肽的重复顺序的Gn    RH的“多体”（multimers）。这些多体可以由2～10个Gn    RH肽构成，并且是单体形式的首尾连接。于是，其中N为2～10的Gn    RHn表明了含有2～10个相应于Gn    RH的十链节的具体体现。多体可含有另外的C-末端的氨基酸，如以下说明中所涉及的情况。

正如这里所使用的，“人LH”或HLH、“牛LH”或b    LH和“狗LH”或d    LH系分别指人或牛的激素，这些是维持黄体的主要原因。一般说来，本发明中所使用的b    LG、d    LH和h    LH抗原具有图3a、3b和4中所示的氨基酸顺序，或者是它们的重要部分。在上下文显然如此需要的地方，b-、d-或h    LH也是指编有有关肽编码的合适的DNA顺序。正如这里所使用的，b    LH系指具有基本上类同于图3a的氨基酸顺序或部分的肽（dLH类同图3b的;h    LH类同于图4的）;然而，我们认识到，可以对氨基酸顺序作微小的修改而不影响所生存的肽的免疫特性，并且，该定义包括了这些生成的肽。在本发明的上下文中，可以进行氨基酸的加入、消除和更改，只要不消极地影响导致抗相应的LH本身的中和抗体的肽的生成能力。

被应用于本发明菌苗的还有包括所使用的特殊LH肽的重复顺序的牛、狗和人LH的“多体”。这些“多体”可以由相应的LH顺序的重要部分的多个重复所组成，例如，由牛LH的22～85、狗LH的43～115和人LH的2～111所代表的氨基酸，并且是单体首尾连接的形式。使用了2～10个单体的多个重复体。于是，b    LHn，表明了包括2～10个由b    LH顺序的残留物22～85代表的肽、或它的功能上等同物的具体体现;d    LHn和h    LHn分别表明了狗LH的氨基酸43～115和h    LH是2～111的顺序的相应的多体。

一般来说，“激素n”系指任何特殊激素的相应部分的单体（假如n为1）或多体。

“自身抗原”系指通常至少是间断性地存在于靶宿主的蛋白质或它的部分，以及通常不招致宿主免疫反应的部分。这些抗原通常只有作为半抗原与合适的载体结合后才能成为有免疫原性。该载体可简单为氨基酸链的延长部分;诚然，这种延长部分可简单地是自身抗原的多个单元形式的增殖。在这种情况下，免疫原性被假设是来自不寻常561接点的区域。同样地，当自身抗原连到的链上是作为次要作用（例如提供自身为抗原性表位）的时候，或作为载体作用的时候，那么接点区就可产生免疫原性。有时，免疫学上特定的蛋白质的一部分其本身可以为免疫原性的。“自身抗原”这一术语被用来系指要想把末改性的蛋白质制成具有免疫原性，和对免疫结构有关的抗原。

“非细菌载体”系指把免疫原性赋予固有的蛋白质表位的载体蛋白质，所说的赋予是依靠如下途径来实现的，即：扩大肽的粒度和/或提供含有与宿主相异的氨基酸顺序的接点区域。加入的顺序可以是任何非来源于细菌的蛋白质，也可包括病毒外壳层或核心的蛋白质，酵母分泌出的蛋白质、例如在哺乳动物中没有同源化对应物的转化晦、来自原生动物的膜上和分泌的蛋白质，例如疟疾原虫。特别有用的载体蛋白质是那些从流行性感冒的血细胞凝集素衍生出来的载体蛋白质。这里所使用的，“从……衍生”一词意思是指氨基酸顺序相当于含有至少10种源蛋白质顺序的部分，当然并不是指从那蛋白质自身获得的物理的平均值。从血细胞凝集素蛋白质衍生的有用顺序包括抗原区域的部分和该蛋白质的膜固位凹区域的部分。

“第二载体”系指能把自身抗原例如CTP或LH或它的多体运输到感染了牛痘病毒细胞表面的蛋白质，这种牛痘病毒含有的DNA编码是第二载体和CTP或LH或它的多体，或者是指能影响感染细胞分泌CTP或LH或它的多体的蛋白质。在这点上，牛痘病毒自身通常在这里被称为该基因组中所包括的异体顺序的“载体”。于是外加到自身抗原的DNA的异体DNA，例如CTP或LH或它的多体，可对作为免疫原第二载体的蛋白质进行编码。正如以下所描述的，流行性感冒的血细胞凝集素蛋白质是在这一方面上有用的第二载体的代表。然而，也可使用已知的能传递至传染细胞表面的其它蛋白质。这些蛋白质包括流行性感冒的神经氨（糖）酸苷酶肽、狂犬病糖蛋白和单纯性疱疹病毒（herpes    simplex    virus）糖蛋白D.在传染的细胞中可行的信号顺序可以是从各种来源衍生出来的，这些来源包括前血管紧张肽原酶原，前胰岛素酶原，前凝乳酶原（pieprorenin    preproinsulin    preprorennin）和细菌的碱性磷酸酶。另一种分泌抗原的方法利用了肝炎的pre-s基因。编码了所需抗原的基因被克隆到pre-s基因上，因而导致了嵌合性蛋白质的分泌，它自然的聚集而形成空的肝炎外壳（Valenzuela等，Vaccines    85：Molecular    and    Chemical    Basis    of    Resistance    to    Parasific    Bacterial，and    Viral    Diseasses，New    York，Cold    Spring    Harbor    Press1985.pp.285-290）

“可行地连接”系指并列，应可保持要素的作用。于是，例如，可行地连结到编码顺序的启动区就能在合适的宿主体中有它们的表达。可行地连接至其它肽（或者，在DNA水平上，信号顺序编码可行地连接到编码了DNAs的肽）允许从宿主细胞中分泌出主要的肽。

应该认识到，“从……衍生”这一术语是指DNA顺序或氨基酸顺序时，它表明的是在组成中与有关物质的相应之处，并不一定是来自那里的实际的物理衍生。例如，编码有从流行性感冒血细胞凝集素衍生出来的信号顺序的DNA是指编码有基本上类同于流行性感冒HA中所发现的肽顺序的DNA结构，该顺序也可以是这样构成的，例如，通过使用自动的寡核苷酸合成的方法，或者按照任何其它的设计来为所需的肽再造一编码顺序的方法，从HA蛋白质中取得c    DNA。

F.重组牛痘的制备

能影响把异体DNA聚合进牛痘的参数在该领域中是已知的技术，并且目前是处于可实际应用的状态。简单地讲，所需的免疫原是通过与天然牛痘和载体质粒同时感染宿主细胞而被转化成牛痘基因组的非实质部分，所说的载体质粒含有夹在带有牛痘基因组的选择性的非实质部分之间的异体基因。此外，该异体基因其有牛痘启动区，该启动区将在牛痘的转录和转译系统的影响下允许它的表达。能容纳异体基因的通用载体已经被MOSS，B等人发现。[Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1983）80：7155-7159]。该载体，pGS20的图，和它的为获得含有所需异体基因的重组牛痘病毒而使用的方法显示在图13。

p    GS20具有从p    BR328衍生的载体片段，是一种与E.coli相容的载体，该E.coli含有E.coli起源的复制物，和抗氨苄丰霉素的基因。该载体含有来自7.5K牛痘基因的启动区，它是作为275bp    HincⅡ/RsaⅠ片段（Venkatsen等cell（1981）25：805-813）而被消除的，它被移位到牛痘胸（腺嘧啶脱氧核）苷激酶（TK）基因的EcoRⅠ位置。TK基因是作为Hind    Ⅲ/Bg    Ⅲ片段从牛痘的Hind    Ⅲ    J片段中得到的。为了方便起见也作了其它限制部位的变化，如图13所示，并且有启动区的BanHⅠ和SmaⅠ限制部位的立刻向下流动以允许异体基因克隆化。

因此，PGS20是如下构成的，pBR328用EcoRⅠ来消化、钝化和再连接。所生存载体然后就用HindⅢ来消化并被连接到牛痘的HindⅢJ的片段上。所生成的质粒用BanHⅠ和BgⅢ来消化并连接于是就消除了非-TK顺序和来自插入物的一些不需要的载体顺序，并且也消除了BanHⅠ和BgⅢ部位，该载体是通过如下途径来完成的，即：把HincⅡ/RsaⅠ7.5KD基因的启动区片段插入到pUCB的Smal部位、除去作为EcoRⅠ/RamH    Ⅰ片段的启动区和使它与分离的EcoRⅠ/Smal/BamH1连接体片段连接，从PUCB络合成EcoRⅠ-消化的牛痘载体。图13也显示了为进行CTP多体具体体现而在启区/限制位置片断接点的区域中的核苷酸顺序。

在制备本发明的载体时，正如所显示的，编码有所需免疫原的DNA被插入到使用启动区限制位置顺流的PGS20。重组载体在使用至AmpR的转变中被放大，然后与到达CU-1细胞的野生型牛痘进行相互感染。不象其它大的DNA动物病毒，牛痘会在传染细胞的细胞质中转录、复制它的基因组。在其核酸代谢作用中所包含的许多酶，例如DNA和RNA聚合酶，覆盖甲基化产物和聚腺苷RNA的酶类以及胸（腺嘧啶脱氧核）苷激被编码在它自己的基因组中。确实，脱离蛋白质的牛痘是非感染性的-由于它编码有它自己的转录酶，以及显然不能使用被它的真核宿主所使用的转录酶，故它不能合成在与宿主细胞机构的结合中单独使用其DNA的蛋白质。

影响重组的TK-编码的顺序的使用是特别所希望的，因为这不但是牛痘基因组的非本质部分，而且也为含有重组的牛痘的细胞提供了一可选择的标记，也就是当外延DNA被插入时，该TK基因就被钝化，而TK重组病毒就能在5-溴脱氧尿苷的存在下，通过TK-细胞上的噬菌斑化验（BUd R）而被选择出来。正如图13上所显示的，tk-重组病毒噬菌斑能被选择从而产生所需的重组牛痘。另外，tk-牛痘已被显示为，与野生形牛痘相比，其在动物中的毒性要小10⁵～10⁶倍，这表明其在人体中具有增加安全因素的潜力。

虽然p    GS20是一种传统直观的载体，但必须认识到，包括基因的其它非实质性区域中的其他牛痘启动子的另一类结构也可以被使用（Moss等人著Geue    Amplification    Analysis，第Ⅲ卷，Pappas，TK等人编（1982）New    York，Elsever，PP.201-213;Mackett，M等人著，Jvirol，（1984）586-864）。

G.疫苗结构的其他类型及其施用

该重组的牛痘也可以作为灭活的疫苗被施用。组织培养中的主题细胞被体外牛痘感染，然后被加热致死。减毒的灭活的牛痘就跟传统的疫苗一样通过一种佐药被施用。

本发明的自身抗原结构不必作为编码有该抗原的牛痘基体的DNA来施用。也可使用重组蛋白质生产的标准方法把它作为蛋白质并作为传统的疫苗来施用。途径的选择当然是取决于课题种类和抗原的本质。

为DNA顺序的重组表示标准方法已在以下给出。此外，含有所需自身抗原顺序的PGS20载体可通过使用当该载体横切断的敏感细胞受牛痘病毒感染时出现的瞬时表示，在玻璃试管内被用作表示载体。所产生的蛋白质可从细胞溶胞产物或从上层液中获得，这取决于载体结构在分泌中是否生成。

如果自身抗原是作为蛋白质被施用的，它们就被配成可注射的传统剂量形式，或者用作溶液、悬液、乳剂，或者用作再组成的固体。适合的赋形剂包括水、盐水、右旋糖溶液、甘油溶液、，Hauk溶液、Ringer溶液等等。含有疫苗的蛋白质的配制技术是在标准参考著作中发现的，例如Remington′s    Pharmaceutrical    scieuce    Mack出版公司Easton，PA.最新版。佐药也可被使用，例如氢氧化铝，胞壁酰基二肽酶、干扰素和免疫刺激肽区域。赋形剂能够包括鱼鲨烯：天南星科混合物，巴豆或其他合适的组成物。

在那些小肽被用作自身抗原的情况下，例如代表LH的非-同系化区域的肽被典型地接到载体蛋白质去，或者是在蛋白质或DNA水平。在DNA水平上混合的技术是标准的：使用一合适连接的反应的停调被应用了，正如以下所述的。在蛋白质含量上，可使用各种化学过程，包括使用商业上可得到的联结子，例如SPDP和SMCC。这一场合中的载体蛋白质是一种合适于例如用于牲口的BSA或用于人的HSA或破伤风类霉素，这些种类的抗原是中性的肽。

Ⅱ    抗体的生产

由于本发明的疫苗其成功性在于提高具结有与代谢作用的重要调节剂相关的抗原决定部位，所以它们提供了一条有效途径来为这种抗原种类获得免疫测定的组份。于是本发明中还包括作为带有所提供疫苗的免疫作用的结果而获得的抗体制备。该抗体的制备可以从血清中以多克隆直接得到，或者来自免疫哺乳动物的中心偶体，并可获得单克隆的产生杂种瘤的免疫球蛋白。为了在免疫测定中使用，只有与特异性有关的免疫球蛋白部分和本发明于是才包括所生成抗体的Fab区域。

抗体或Fab部分能被作上标记或被移至固体支柱，或者象用于测定的制备技术中已理解的那样进行变化。

标准方法

1.载体构成

含有所需编码和控制顺序的合适载体的构成使用了该技术中已熟知的标准络合和阻止技术。分离的质粒、DNA顺序或合成的寡核苷酸按所需的形式被分解、减弱和络合。

位置特定的DNA卵裂在本技术所一般知道的条件下通过用合适限制酶（或酶）进行处理来施行，该条件的特殊之处是通过制造这些商业上可获得的阻止酶来限定的。见，例如New    England    Biolabs，Product    Catelog。一般说来大约1ug的质粒或DNA顺序被一单位的酶在大约20ul的缓冲溶液中分解;在这里的例子中，典形的是过量的限制性内切酶被用来确保DNA底物的完全消化。在37℃的温度下大约一至二小时的培育时间是可行的，虽然也允许有变化。每次培育后，蛋白质通过用酚/氯仿进行萃取来除去，接着可用醚来萃取，再通过用乙醇沉积从含水馏份中回收核酸，假如需要，可采用标准技术通过聚质粒凝胶或琼脂凝胶来对分解的碎片实行大小分离。大小分离的一般描述可参见Methocls    in    Enzymdogy（1980）65：499-560。

分解的碎片的限止可被钝化，结果是在四脱氧核苷三磷酸（dNTPS）的存在下，培育的时间为15～25分钟、温度为20～25℃，在50mM的Tris（PH为7.6）、50mM的NaCl、6mM的MgCl₂、6mM的DTT和1mM的dNTP中用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（Klerow）的大碎片进行处理。该Klenou碎片充填在5′粘性末端，但又把伸出的3′单股拉回来，即使四d NTP是存在的也是如此。如果需要，可通过提供的粘性尾部的性质所表明的限制的仅一种或选择的d NTP来进行选择性修复。用Klenow处理之后就用酚/氯仿对该混合物进行萃取，而乙醇就沉淀了。在适当条件下用SI核酸酶或mung豆核酸酶进行处理会导致任何单股部分的脱水。

合成的寡核苷酸通过Efimou，V.A（Nucleic Acids Res（1982）6875-6894）的方法来制取，并可通过使用商业上可得到的自动寡核苷酸合成器进行制备。退火前的或为作标记的单股的激酶是这样实现的，即：使用过量的、例如约10单位的聚核苷激酶至1nmole的底物（在50mM Tris的存在下），PH值为7.6，10mM的Mgcl₂，5mM的二硫苏糖醇，1～2mM的ATP，1.7pmole的r32 P-ATP（2.9mCi/mmole）、0.1mM的亚精胺、0.1mM的EDTA。

络合物形成作用是在下列标准条件和温度下于15～20Ml的体积中进行的：20mM的Tris-Hcl，PH值为7.5，10mM的MgCl₂，10mM的DTT，33ug/ml的BSA，10mM～50mM的Na Cl，并或者是在0℃（为“粘性尾部”的络合物形成）下用40um的ATP、0.01～0.02（welss）单位的T4 DNA连接酶或者是在14℃（为“纯化尾部”的络合物形成）使用1mm的ATP，0.3～0.6（weiss）单位的T4 DNA连接酶。分子间“粘性尾部”络合物形成作用通常是在33～100g/ml的总DNA浓度（5～100nM总尾部浓度）下进行。分子间钝化尾部络合物形成作用（通常使用10～30倍摩尔的过量联结子）在1M总尾部浓度下进行。

在使用“载体碎片”的载体构成中，通常是用细菌碱磷酸酯酶（BAP）或小牛肠的碱磷酸酯酶来处理载体碎片，目的在于除去5′磷酸盐和防止载体的络合。消化是在PH为8大约150mM的TriS中进行的，并且是在Na⁺和Mg⁺的存在下使用大约每μg载体1单位的BAP或CTP，温度为60℃，时间为1小时。为了回收核酸碎片，用酚/氯仿来对该制备过程进行萃取，于是乙醇就得到沉淀。另一方面，被不需的碎片的附加限制性内切消化作用所双倍消化的载体中可防止再络合作用。

2.部位-特定的突变形成

为了衍生自c    DNA或需要顺序变化的染色体组DNA的载体部分，使用了部位特定的指向突变形成的引物。这是通过如下途径进行的：使用引物合成寡核苷酸，该种寡核苷酸适用来补充有待突变的单股噬菌体DNA，但有限的缺对是例外，这表示所希望的突变。简单地说，合成的寡核苷酸被用作引物以便调整一串补足噬菌体的合成，所生成的双股的DNA被转化成噬菌体-支持的宿主细菌。已转化细菌的培养物被包在顶部琼脂中，因而就允许从保护噬菌体的单细胞中生成噬菌斑。

从理论上讲，50%的新噬菌斑将含有具有作为单股的突变形式的噬菌体;50%将含有原顺序。生成的噬菌斑被激酶的合成引物杂化，然后再在允许恰好匹配物的杂种仍然保留的温度下接受洗涤，但在该温度下，原股的失配物被洗掉。于是就可得到并培养在严格的洗涤温度下保持杂化至探查物的噬菌斑并回收DNA。部位特定的突变形成程序之细节将在以下的特定例了中得到阐述。

为了探测，通过把噬菌斑复制到复制的硝酸纤维素滤纸（S&    S型BA-85）而对噬菌斑进行筛滤，而感染的细胞就被允许在37℃下在含有15ug/ml四环素的L琼脂上生长14～16小时。菌落用10%的SDS来溶解，而DNA则通过用500mm    Na    OH/1.5M    Na    Cl，然后用0.5M的Tris    H    Cl（PH8.0）/1.5M    NaCl，再用2×标准盐水柠檬酸（SSC）顺序处理5分钟后被固定到过滤体中。过滤体是在80℃下干燥和烘烤了2小时的空气。

对于合成的（15-链节）寡核苷酸探查物来说，复制过滤体在42℃温度下用每个一寡-杂化缓冲剂（6×SSC，0.1%    SDS，1mM的EDTA15×Denhardt′s，0.05%的焦磷酸盐和50ug/ml的变性的和剪切的青蛙精子DNA）的过滤体10ml接受预杂化达2～8小时。

在取决于寡核苷酸组成的条件下用15～30核苷酸的激酶了的寡核苷酸探查物使样品杂化。典型的条件其温度为30～42℃，时间为24～36小时，5ml的这同样的含有探查物的寡-杂化缓冲剂。过滤体在23℃下被洗涤两次达15分钟，每次用6×SSC.0.1%的SDS和50mM的PH值为7的磷酸钠溶液，然后再在严格的洗涤稳定下用6×SSC和0.1%的SDS洗涤一次达2分钟。典型地，用于有1～3失配的16～24基体的寡核苷酸的严格的洗涤温度将是40～70℃，并能最容易地通过对杂化滤体的成功洗涤而得到确定。例如，杂化滤体能首先在40℃下接受洗涤，然后是50℃，再是60℃，接着是70℃，用空气干燥滤体，并在-70℃下于每次洗涤的一夜之间施行放射自显影术。

3.构成的检验

在以下给出的构成中，用于质粒构成的正确的络合作用已由用络合混合物对大肠杆菌菌株MC1061（casadaban.M等人J    Mol    Biol（1980）138：179-207）或其他合适的宿主进行的首次转变而得到了证实。成功的转化株是由氨苄青霉素、四环素或其他的抗菌阻止体来选择的，或通过使用其他取决于质粒结构模型的标记物来选择，正如该领域中所已知的。根据ClewellD·B等人的方法（Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1969）62∶1159），并接着选择性地进行氯霉素放大作用，于是制备来自转化株的质粒（Clewell，D.B，J    Bacteriol（1972）110：667）通过限制作用对分离的DNA进行分析，和/或通过Sanger    F等人的双脱氧方法对上述DNA编顺序（Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1977）74：5463），如Messing等人所进一步描述的（Nucleic    Acids    Res（1981）9：309），或者通过Maxam等人的方法（Methodsin    Enzymc    logy（1980）65：499）。

4.例证的宿主

在这里的克隆和表达中所使用的宿主菌株如下：

为克隆和编顺序，并为在大多数细菌启动子控制下的结构的表达，而使用了大肠杆菌菌株MC1060。

为MB噬菌体重组，对噬菌体感染敏感的大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株JM101被使用。

为真核生物的表达，使用了猴细胞品系CV-1。

5.重组体表达系统

原核生物和真核生物系统可用来表达编码有顺序的自身抗原，原核生物宿主用于克隆程序当然是最方便的。原核生物最经常地是用各种大肠杆菌菌株来代表的，然而，也可使用其他的微生物菌株。并且使用了含有复制部位的质粒载体、选择性标记物和从与宿主相容的种类衍生的控制顺序;例如大肠杆菌是典型地通过使用pBR322的衍生物而受到转化的，这是由Bolivar等人从大肠杆菌种类衍生出来的质粒（Gene（1977））2：95.pBR322含有氨苄青霉素和四环素阻止体的基因，于是就提供了在构成所需载体时被保留或破坏的多选择性标记物。通常使用的原核生物的控制顺序这里被定义为包括为转录起始作用的启动子，选择性地带有一操纵基因，同时还有束缚位置顺序的核糖体，它们包括了作为B-lactamese（青霉素酶）和乳糖（lac）起动系统（chang等人Nature（1977）198：1056）和色氨酸（trp）起动系统（cooddol等人Nuclcic Acids Res（1980）8：4057）和衍生物的P₂启动子和束缚位置的N-gene核糖体（Shimatake等人Nature（1981）292：128）的这种通常使用的启动子。

除细菌外，真核生物的微生物例如酵母也可被用作宿主。虽然一些其他的菌株或种类一般是可获得的，但Saccharomyces    cerevisiae的实验室菌株，Baker酵母是最常使用的。也可使用利用下列物质的载体，它们是例如Broach    J.R.复制品的原质（Meth.Enz（1983）101：307）、或复制品的其他酵母的可相容原质（见，例如Stinchcomb等人Nature（1979）282：39、Ts-chumper    G.等人Geue（1980）10：157和Clarke    L等人Meth    Enz（1983）101：300）。用于酵母载体的控制顺序包括为糖酵解酶合成的启动子（Hess等人J    adv    Enzyme    Reg（1968）7：149;Holland等人Biochemistry（1978）17：4900）技术中已知的其他启动子包括为了-磷酸甘油酸激酶的启动子（Hitzeman等人J·Biol    Chem（1980）255：2073）。其他的启动子，它们具有由生长条件和/或基因环境控制的转录作用的额外优点，是下列物质的起动区域，这些物质是乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢作用有关的降解酶、α因子系统和起着麦芽糖酶及半乳糖利用作用的酶，也必须确信终止顺序在编码了顺序3′-末端是所需要的。在跟有酵母-衍生物基因中的编码顺序的3′-末端未翻译区域中发现了终止区。

在从多细胞有机物衍生物来的真核生物的宿主细胞中表示编码有聚肽的基因也当然是可能的。见，例如，Axel等人4，399，216。这些系统具有连接外内含子的另外的能力之优点，因此就可被直接用来表示基因组片段。有用的宿主细胞品系包括VERO和He    La细胞以及中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。为这种细胞的表达载体通常包括启动子和与哺乳动物细胞相容的控制顺序，例如通常使用的来自Simicm病毒40（SU40）的早和迟的启动子（Fier.等人Nature（1978）273：113），或其他病毒启动子，例如从多瘤衍生的那些启动子、腺病毒2、牛的乳头状瘤或鸟类肉瘤病毒。可控制的启动子hMTⅡ（Karin    M等人Nature（1982）299：797-802）也可能使用。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已经由Axel（见上）作了描述。现在已出现这一情况，即“促动区”域在最优表达中是重要的;这些通常是在非编码DNA区域中的起动区域的上游或下游所见到的顺序。如果需要，复制品的原质可以从病毒原中获得。然而，进入染色体的聚集是真核生物中DNA复制品的通常机理。

根据所使用的宿主细胞，通过使用适合于这种细胞的标准技术来进行转化。为原核生物细胞或其他含有实质细胞壁载体的细胞，可以使用利用氯化钙的钙处理方法，如Cohen S·N所描述的（Proc Natl Acad Sci（USA）（1972）69：2110），或Mamiatis等人所描述的RbCl₂方法（Molecular cloning：A Laboratory Manual（1982）Cold Spring Harbor Press，P·254和Hanahan，D，J Mol Biol（1983）166：557-580）。对于没有这种细胞壁的哺乳动物细胞来说，可以使用Graham和Van    der    Eb的磷酸钙沉淀方法（Virobgy（1978）52：546），由Wigler    M等人作了选择性的修改（cell（1979）16：777～785）。根据B    eggs.    J·D的方法可以转化成酵母（Nature（1978）275：104～109）或根据Hinnen    A等人的方法（proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1978）75：1929）。

6.附加的c    DNAs

通过利用这里所公开的DNA顺序和其他种类的相应的激素之间的同系化可制成附加的结构。于是，RNA就可以从相应腺中制备，例如LH的脑下垂体，在以前所未调查的种类中，例如兔子和制备及探测的c    DNA贮存机构。提取m    RNA的有效技术在本技术中是已知的，并且一般是使用带有寡d    T的亲和色谱法从而获得多腺甘酸脂的信息RNA。该RNA然后就用来获得c    DNA贮存机构，例如，通过克隆到噬菌体载体λgt10（Hunyh.T·V·等人DNA    Cloning    Techniques.a    Practical    Approach（1984）D.Glouer）或通过使λgt11克隆到能在细菌中表达的噬菌体载体贮存机构中，如Young.R·A等人描述的（Proc    Natl    Acad    Sci    USA（1983）80：1194）。生成的cDNA然后就能用从这里所公开的激素顺序衍生的变性的DNA顺序进行探测，例如牛LHβ链或狗LH顺序。

实施例

以下实施例打算用来说明本发明，但不是限制其范围。

实施例1

自身抗原编码顺序的构成

A.CTD多体

所需基因的构成被显示在图1。该基因的主要部分作为编码有氨基酸117～141的BstNI/Sau3A的片段被分离出来（Fiddes，J·C等人Nature（1980）286：684～687）。基因的5′-末端和3′-末端是化学合成的，目的在于为合成过程提供所需的悬突，如果需要，还有密码子变种。对所有已说明的CTP片段来说，中间部分和C-末端部分是相同的;然后，不同之处是出现在上游的片断中，这取决于原顺序是否被使用或是否在110位置上被改变。

对这三种结构的每一种来说，三种有关的片段被络合从而获得β-h    CG    CTP单体，通过使用聚丙烯酰胺凝胶而把所需的产物分离出来。通过在凝胶上进行各种多体的自我聚合和分离作用得多体，例如3-链节（MW＝12KD）;4-链节（MW＝16FD）;6-链节（MW＝24KD）或较大的多体。

通过使用klenow和合适的d    NTPs而使所需的CTPn结构末端钝化，或者是在直接重组到牛痘之前通过使用中间载体（实施例3）在大肠杆菌中放大，或者是在大肠杆菌中放大和后来重组入牛痘之前而被克隆到第二载体的蛋白质编码顺序中。

B.Gn    RH多体

所需基因的DNA顺序显示在图2。通过对两个互补的股进行退火获而得编码有单体的双股部分，该股通过使用标准的自动技术来合成。单体在凝胶上被分离，并被证实为正确的尺寸。通过在凝胶上进行各种多体的自我聚合作用和分离而获得多体，例如8-链节（243碱基对）;10-链节（303碱基对）;15-链节（453碱基对）或较大的多体。

通过使用Klenow和适当的d    NTP而获得所需的Gn    RHn，或者是在直接重组进牛痘之前通过使用中间载体实施（例3）在大肠杆菌中放大，或者是在大肠杆菌放大和后来重组进入牛痘之前而被克隆到第二载体的蛋白质编码顺序中。

C.LH多体

编码有人促黄体激素（hLH）和牛痘对应物（bLH）的β链的完整的c    DNA顺序是已知的（见图3和图4），于是就能使用化学合成来构成所需的寡核苷酸。然而，以下描述的构成使用了这种长度的部分，以致虽然直接化学合成是可能的，则也更方便地从制取自人和牛垂体m    RNA的λgt10中的标准贮存机构中获得编码有它们的c    DNA。采用标准方法通过使用EcoRT联结子来制备贮存机构，并使用β-h    CG    cDNA插入物而进行探测，而随着Hind    Ⅲ自克隆有载体的p    BR332移动，如Fiddes，J·等人所公开的，Nature（参见上述）。（LH和hcGβ肽是高度同系化的）。c    DNA插入物于是就从噬菌体载体被传递到p    BR322的EcoRT部位，从而分别获得蛋白质的人和牛形式的克隆载体的phLH和pbLH。

同样地，编码有狗LH的β肽的c    DNA是从通过使用狗重体mRNA作为模板制备的λgt10c    DNA贮存机狗中获得的。用上述相同的Hind    ⅢHCGβ肽探测了贮存机构，从而收回了含有编码顺序可从氨基酸18起编码到氨机酸121之后的终止密码子为止的单克隆。该单克隆与用同样方法从贮存机构收回的另一个单克隆结合，就允许引伸出为狗βLH的完整的氨基酸顺序、以及在成熟蛋白质的N-末端的氨酸残基之前的18残基信号顺序。编码有成熟蛋白质及其信号肽的完整的c    DNA顺序和引出的氨基酸顺序显示在图3b。

在包括30%甲酰胺（42＊）的杂化条件下，在2×SSC中，且在50℃下洗涤2次而回收了含有编码有氨基酸18～121顺序的单克隆。在λgt10克隆中的EcoRⅠ插入物于是就被移到p    BR322的EcoRⅠ部位，从而获得为狗蛋白质的克隆载体pdLH。

根据相同于以上的为回收狗LH的方法，编码有猫蛋白质的c    DNA就从猫垂体m    RNA制备并被克隆到p    BR322中，以获得pcLH。

在载体中直接制取多体。对狗LH来说，编码有氨基酸22-85的重复顺序被插入到pbLH中的全长度顺序中，具体是把由pbLH的HaeⅢ消化作用得到的192bp片段重复地插入到与氨基酸22的密码上的HaeⅢ部位相一致的Stu    Ⅰ部位中去（参见图3）。当钝化末端的HaeⅢ片段能被插入两个可能方位时，正确的结构通过限制性分析就可区别的，因为它产生了短于不正确构成的EcoR    Ⅰ/Stu    Ⅰ消化片段192bp。HaeⅢ片段的插入重复进行达所希望的次数（n-1），结果生成了重复了n次的22～85区域肽（该Stu    Ⅰc消化载体提供了额外的重复）。n次的理想值为3～10。

对人多体来说，ph    LH的EcoR    Ⅰ插入体首先传递到部位特定的致突变，从而提供一氨基酸1～2上的MaeⅢ部位已存在于桥接有氨基酸111～112的密码子的cDNA的外体（通过Schmid    K等人的净化程序来获得MaeⅢ，Nucleic    Acids    Res（1985））。该引子为CCGTAGGCACTGGGCGAAGCC，如图4所示。单股致突变的噬菌体于是就被杂化成全能引子，并用Klenow和四d    NTPs（延伸）（室温下进行30分钟），还用MaeⅢ分解，从而获得在成熟顺序的密码子1～2上的新MaeⅢ部位和在111～112上的自然出现的MaeⅢ部位之间延伸的所需片段。通过自我聚合作用，按照类同于以上为CTP或GURH所描述的方法，对该片段进行络合，而框架和方位仍然维持在聚合作用中。为了相容性，我们认为这些聚合产物含有n-1次重复。多体于是就被插入到MaeⅢ的分解的phLH中，从而获得具有n次重复的克隆载体（多余的重复由宿主载体供给），n的理想值为3～10。

通过使用密码子43（Rsa    Ⅰ部位）和密码子115（Sma    Ⅰ部位）之间c    DNA区域来构成狗多体。再通过把钝化的RsaⅠ/SmaⅠ片段反复地插入到SmaⅠ分解的pdLH及其生成物而制备多体。当处在正确方位时，把RsaⅠ/SmaⅠ片段插入到pd    LH的Sma    Ⅰ部位会破坏插入体的RsaⅠ部位，并再产生3′-末端的SmaⅠ部位，因而就允许重复的插入。由于唯一的SmaⅠ部位是留在多体化区域的3′-末端，该多体化区域于是就能通过用Rsa    Ⅰ/Sma    Ⅰ来消化而被释放出来。连接区域的有关部分被显示在图3b。如以上一样，n的理想值为3～10。

实施例2

克隆载体的准备

图5显示了衍生物p    KK223-3的克隆载体p    VAL的构成（Brosius    J等人Proc    Natl    Acad    Sci（USA）（1984）81：6929～6933）。衍生自p    KT19和p    KT41的p    VA2构成（Tal-madge.K等人，Gene（1980）12：235-241）也被显示在图5。

两种构成导致了含有作为插入物的如下所示的合成核苷酸的载体：

NcoI

BamHI BalI NdeI SmaI

          TGGATCCATGGCCAGGCATATGATTGATTGACCCGGG

ACGTACCTAGGTACCGGTCCGTAT ACTA ACTA ACTGGGCC CTTAA

No  PstI                                      ter  ter  ter          EcoRI

该顺序，这里是指NoPst/R低聚物，在所有三种可能的解读框架中含有终止密码子，还有为插入编码顺序的方便的限制性Ncol、Ndel和Ball部位的适合于插入到用于牛痘重组的p    GS20中间载体的BamH    Ⅰ和Sma    Ⅰ部位。

在所述的构成中，NoPst/R1低聚物被插入到合适的宿主载体中。所生成的克隆载体理想地应缺乏Ndel和Bal Ⅰ部位，从而允许NoPst/R低聚物中所含的那些被唯一地用于所需编码顺序的后来的插入：由于Bal Ⅰ是麻烦的酶，因而NoPst/R插入物中的相间的上游部位、Ncol和BamHL部位就能在它的位置上被使用。克隆载体也必须携有标记物，例如那些给予抗体阻力的标记物，以及，最好是复制品的高复制数起源。两种载体被构成，一种是pVAL，它符合上述标准，但含有Amp基因中Hinc Ⅱ阻制部位，另一种是pVA2，它含有完整的Tet^R基因但不具有HincⅡ或PvuⅡ部位，对某些插入的HA操作法来说，这些部位是不需要存在的，正如以下会详细看到的。于是，起始克隆可以在pVAL中进行，但是对需要使用Hinc Ⅱ和PvuⅡ部位的构成来说，HA基因必须被移入pVA2。

pVA1的构成

参照图5，先对PKKK223-3加以处理，去除不需要的DNA顺序以及一个多余的PvuⅡ部位。PKK223-3用EcoRⅠ和PvuⅡ消化，并用Klenow切成钝头，A然后再重新连接，以产生PALⅠ，PAL10为一种带有复制起始点和Amp基因的2.6千碱基对的质粒。PAL1然后用EcoRⅠ和PsTR消化，连接至NoPst/R寡聚体以形成PVA1。

pVA2的构成

参照图5，制备p    VA2，选用EcoRⅠ和SphⅠ消化p    KT19和p    KT41，将从聚丙烯酰胺凝胶中分离出来的小p    KT19片段同从1%琼脂糖凝胶中分离出来的大p    KT41片段连接起来，以形成p    KT1941。p    KT1941用PvuⅡ消化，再同一个Kpn    Ⅰ连接子连接，用分解后，再重新连接以去除PvuⅡ部位，产生pKT1941.1。p    KT1941.1中的BalⅠ和NdeⅠ部位在一个两步骤程序中被去除，第一步用NdeⅠ消化，pKT1941.1，用Klenow将之切成钝头，与Kpn    Ⅰ连接子连接后，重新连接该质粒;第二步相似地包括用BalⅠ消化，与KpnⅠ连接子连接，以及重新连接以形成p    KT1941.3。该质粒用EcoRⅠ和Pst1消化并与摩尔过量干倍的上述合成片段连接以形成p    VA2。

实施例3

用于多体的细胞内表达的中间载体的制备

当重组到牛痘中时，用于细胞内表达的携带如上制备的多体基因的载体通过将所需多体基因插入到例2的p    VA1或p    VA2载体中来制备。p    VA1或p    VA2用NcoⅠ和Ndel分解，且用Klenow和四种d    NTPs切成钝头;该多体编码顺序相应地被切成钝头并被连接至经消化的载体上。

要获得CTP的多体，将例1A中所描述的经合成多聚化的多体切成钝头连接至经消化的载体NcoⅠ（修复）/NdeⅠ（修复）中，这样产生的媒介载体p    VA1/CTPn和p    VA2/CTPn（其中n为单体基因数）作为CTRn顺序的一个物源可用于重组牛痘的制备，如后所述。

要获取Gn    GH的多体，可将例1B中的经自聚并被切成钝头的Gn    RH    DNA顺序相似地插入，以形成p    VA1/Gn    RHn和p    VA2/Gn    RHn。

要获取LH基因部分的多体，可将合适形式的多连可被插入到Ncol（纯头）/Ndel（纯头）载体中以产生诸如p    VA1/h    LHn和p    VA21    b    LHn。然而，在这两种情况下，均需一个经合适地放置的Nco    Ⅰ部位，以便将上游部分放置在带有由从载体中修复的Ncol提供的起始密码子的阅续框码中，如图3和图4中所示。因此，通过EcoRⅠ的的消化，将此多体插入物从含有pbLH和phLH多体的载体中去除，以部位专一的诱变放置至ML3mp的EcoRⅠ部位中，这样产生的复制型多体，插入p    VA1或p    VA2已以去除NcoⅠ（去除单链）/EcoRⅠ（钝头）片段。

上述载体一般可称为p    VA/激素。由因NcoⅠ部位的修复而产生的ATG起始密码子先导并由No    Pst/R片段所提供的终止密码子所终止的该激素的单体或多体，作为一个BamH    Ⅰ/Sma    Ⅰ片段被转化至p    GS20。瞬时的重组表达可通过p    GS20衍生物转染的和用牛痘感染的细胞获得，也可将这些细胞中的牛痘重组体直接作疫苗。另外，此单体的或多体的激素片段还可被连接至带有其他蛋白质编码顺序的载体中，如下所描述。

实施例4

包含HA的衍生载体的制备

已经制备了三种包含HA的载体。pHA1用于多体顺序至该HA基因的经诱变的抗原部位的插入。如下所述，通过定位诱变在抗原区域提供了钝头所致的分解部位，在已经详细描述的Gn    RH和CTP的质粒构成中，这些部位被置于密码子之间，这样可得到用于这些多体的阅读框码，该阅读框码亦终止于密码子边界。pHA2允许插入自然的限制部位，将这些多体连接至膜上定位顺序和信号顺序，限制部位在密码子边界也作钝头终止。pHA3允许在HA基因中使用ECo    RⅠ，以连接LH顺序，LH顺序在密码子边界的每一端有一个多余的碱基对。

p    HA1和p    HA2的构成如图6所示。用HindⅢ/BamHⅠ消化切下p    SVL-HA8或p    SVE-HA3（盖辛（Gething），MT.，《自然》（1981）293：620-625）中的HA基因。所得的片段包括完整的基因。HA基因的基因图如图7所示。

如图6所示，该HA基因片段被连接至HindⅢ/BglⅡ经消化的pW6中，后者为经过饰变的p    BR322保留的一个Amp，但包含有在缺失的Tet抗性基因区域提供所需限制性部位连接子（为制备pW6，p    RR322用EcoRⅠ和NruⅠ消化并和deeignote    EcoRⅠ/钝头合成寡聚核苷酸连接，此地称为R/No    Nru，如图所示，它包括BamHⅠ，HindⅢ，BglⅡ和SmaⅠ部位）。因此，该p    HA1载体包括由BamHⅠ和SmaⅠ部位所框定的完整的HA基因。

由于剩下来的包含来自p    BR322的Amp基因的骨架片段包括不需要的限制性部1位，它可由3    BamHⅠ/NdeⅠ经消化的p    VA2取代。来自pHA1的HA基因作为一个BamHⅠ/NdeⅠ片段被切出，它包括除了第611位密码子和终止密码子之外的全部基因;pHA2中的终止密码子由p    VA2的No    Pst/R寡聚体的下游部分提供。

pHA3载体从pHA2制备，其方法为在插入如上所述的HA基因之前用EcoRⅠ消化，切钝头，并重新连接以去除连接子的EcoR1部位。

包含该HA基因的p    HA1克隆的载体，通过在A和B的抗原区形成下列所示的限制性部位，（HpaⅠ部位除外）可很方便地饰变，接受框架内多体片段。pHA2可经饰变形成HpaⅠ部位。这通过用部位专一的引物通过部位专一诱变剂来实现：

5′-GTGTCTGGTAGGCCTTCATTTTTC-3′，它提供了位于A抗原区域的139和140位密码子之间的Stul部位，（如图所示）（HA/Stu）;

5′-GCGCGGTGTCGCGAAATCCATCAT-3′，它提供了位于A抗原区域的137和138位密码子之间的NruⅠ部位，（如图所示）（HA/Nru）;

5′-TCTGGCTGGTTAACGAAGGATC-3′，它提供了位于B抗原区域的150和151位密码子之间的HpaⅠ部位;以及

5′-TCCCATTGATATCACAGAACAAA-3′，它形成了位于B抗原区域的182和183位密码子之间的EcoRV部位，（HA/RV）。

进行诱变时，从pHA1或pHA2切下BmaHⅠ/SmaⅠ插片，将插片连接至BamHⅠ/SamⅠ-经消化的M    Bmp8中以产生诱变，然后将经改变的噬菌体插入片重新连接至原始载体中。上述例举的限制性部位专用于提供以本文所述的方法制备的CTP和Gn    RH多体的框架内插入。另外，插入所述被切成各种阅读框架的片段的LH顺序需要类似的部位。

实施例5

HA/多体重组子的制备pHA/Nru，pHA/Hpa和pHA/RV分别用NruⅠ，

StuⅠ，HpaⅠ和EcoRⅤ消化（均提供钝头分解片段），并和在实施例1中制备的CTP或Gn    RH的单体和多体纯头基因片段连接。如图8所示，由于酶在密码子之间消化，这些插片位于带有HA编码顺序的正确的阅读框码中。这样，载体含有能够把所需的源自激素的表位编码到HA的嵌合基因。这些载体被称为诸如p    CTPn/HA/Stu，pGn    RHn/HA/Nru，或pHCTpn/HA/Hpa或统称为p激素质粒/HA/部位。（我们所记得这些特定的限制性部位对图示的LH多体不适合。）当HA蛋白质被运送至受到感染的细胞的表面时，与牛痘重新连接的嵌合体的表达导致这些表位暴露于细胞表面。

实施例6

带有HA信号顺序和膜上定位顺序之间的嵌合体的中间载体的制备

为细胞表面蛋白质提供嵌合体的另一种方法使用HA信号和膜上定信顺序。所产生的经表达的蛋白质如实施例5中的蛋白质那样被运送至受到感染的细胞的表面，用于免疫反应。参照图7和图9，HA基因插片具有一个在密码子16和17位之间有一产生钝头的HincⅡ（SalⅠ）限制部位在密码子450和451位之间有一产生钝头的pvuⅡ限制性部位。分解带有HincⅡ（SalⅠ）和PvuⅡ的HA基因切出HA蛋白质的主要区段并将源自激素的单体和多体插入信号顺序和膜上定位顺序之间。因为该载体不含有干扰性的限制性部位，采用插入pHA2或pHA3的HA基因。

含有LH顺序的类似载体的制备如下。对牛的LH，pHA3用EcoRⅠ消化，EcoRⅠ在该HA基因的密码子226-227位，切开切口处留下了一二碱基对越过密码子边界的两端的延伸段。如果需要的话，牛的LH顺序含有多体形态，用DdeⅠ消化，如图3所示DdeⅠ在密码子18和19位以及86和87位之间切开，它在密码子边界的两端又留下碱基对延伸段。这样，把b    LH顺序连接以上述方法制备的载体，从而把LH编码顺序放置到HA基因多体的阅读框码。

用类似的方法，PHA2用HincⅡ（参见图7）消化，HincⅡ在密码子边界处密码子16和17位之间以及密码子208中分解，以留下一个越过密码子209位的碱基对延伸段。这样，可以连接用NcoⅠ和StuⅠ消化法从克隆宁载体切下的人的单体或多体LH    DNA，得到自密码子1至除最后一对碱基对密码子115之外的所有密码子的区域，把人的LH    cDNA放置到带有HA顺序的阅读框码中去。

对狗的βLH，将实施例Ⅰ中以p    R322为基底的多体化的片段作为一个RsaⅠ/SmaⅠ经钝头的片段去除并连接至pHA2，该片段曾用SalⅠ消化，切成钝头，然后用Hinc    Ⅱ消化。与此相关的连接区域为：

通过限制性分析可确定准确的连接。所需的免疫原被插入一系列称为p    CT    Pn/HAMB，phLHn/HAMB或统称为p激素HAMB的载体的信号顺序和膜上定位顺序之间的正确的阅读框码中。

实施例7

提供使用带有HA信号顺序的激素免疫原分泌的嵌合体的中间载体的制备

导致分泌的载体可以三种途径构成。第一种，如实施例5中构成的载体含有在HA运载体（Stu，Nru，Hpa，RV）抗原区的激素抗原，该载体通过用部位专一诱变剂去除密码子下游的密码子514位的去除，可进一步饰变去除HA蛋白质的膜上定位顺序。第二种，通过限制性分解和重新连接那些源自p    HA2的载体可去除位于密码子451和510位之间的NdeⅠ/PvuⅡ片段。第三种，可使用缺少膜上定位顺序的HA区段。

在第一种途径中，如图10a所示，p激素/HA/Stu或类似的Nru，Hpa或RV载体上的整个编码顺序作为一个BamHⅠ/SmaⅠ片段被切下而接至SmaⅠ/BamHL-经消化的MB上，使用诱变剂5′-GGGGTAAAATTGAGCTGATTGATTGACCCG-3′致变。如上图所示它去除了膜上定位顺序区段下游的密码子504位。经改变的片段然后被重新连接入由BamHⅠ/SmaⅠ，自例如未改变的载体PHA2上消化的较大片段，这样产生的载体泛称为p激素/HA504/部位。

在第二种途径中，如图10b所示，含有源自实施例5中的单体或多体，如p    CTP/HA/Stu或p    Gn    RH/HA/RV的载体可用PvuⅡ和PstⅠ消化以去除所需区域。有dCTP时由NdeⅠ消化产生的3′端突出部分用Klenow处理，而且载体被重新连接。1601-1729位的核苷酸顺序（盖辛等，《自然》（1980），前述）被去除，将密码子450位与密码子511位的最后一位核苷酸连接起来，然后以另外8位密码子的新的阅读框码继续翻译，并由克隆的载体中的第三个终止密码子所终止。这些载体泛称为p激素/HA450/部位。

另一无附着顺序的载体由来自作为运载蛋白质的p    SVEH20-A（盖辛，M.J.，等，《自然》（1982）300：598-603）的HA基因的一种无附着顺序形态物构成，如图10c所示。HA的无附着顺序的区段通过将该部分基因的下游BamHⅠ部转成NdeⅠ即作为插入p    VA2的一个BamHⅠ/NdeⅠ片段获得。这通过用BamHⅠ消化p    SVEHA20，用Klenow和四种d    NTVPs处理之并将之连接至一个NdeⅠ连接子完成。用BalⅠ和NdeⅠ后消化可提供用于插入p    VAⅠ的合适的BalⅠ/NdeⅠ片段，获得p    VA1/HA450-A然后用与实施例5中所描述的用于p    VAⅠ/HA的完全相同的方法使p    VA10/HA450-A-饰变，通过致变使所需激素，位于抗原部位。

实施例8

带有信号顺序的其它中间载体

来自其它蛋白质的信号顺序也可用于构成中间载体，从而使最终的重组牛痘运载体作为一种分泌蛋白质表示源自激素的抗原。

在一个这样的构成中，可使用编有码细菌碱性磷酸酯酶（BAP编码合成基因信号顺序。运载带有此种实际连接至多体的顺序的中间载体的构成如图Ⅱ所示。

采用一系列杂交以显示一致的限制性部位的互补的寡聚体（015-020）用传统技术合成基因，如图11所示。将具有部分Nco    Ⅰ5′端突出和Hind    Ⅲ3′端突出的合成基因连接至一个已用NcoⅠ和HindⅢ消化的宿主载体p    SS1，p    SS1为p    BR322的衍生物，其中如图11中所示的合成寡聚核苷酸013和014被连接至p    BR322的BamH    Ⅰ/EcoR    Ⅰ载体片段，形成一系列方便的限制性部位。所产生的载体p    SS2用Hind    Ⅲ消化并用Klenow使其末钝头化，然后用一个摩尔数过量十倍的插入顺序被连接至源自钝头化激素的片段，所产生的载体p激素BAP包含了带有BAP信号顺序的在阅读框架中的激素抗原，由阅读框架的框架内终止密码子终止，并由用已插入p    BR322中的寡聚体片段所提供的Sma    Ⅰ和BamH    Ⅰ位点框限。然后，把这些中间载体：p激素BAP用作转入牛痘的BamH    Ⅰ/Sma    Ⅰ插入顺序的来源。

也可用连接至激素抗原片段的前血管紧张肽原酶原信号顺序。该构成如图12所示。如图所示，p    SS1用Hind    Ⅲ消化，用Klenow钝头化，并用酚抽提，用NcoⅠ消化，并分离出载体片段。将经钝头化的激素抗原连接至载体片段以及血管紧张肽原酶的信号顺序。血管紧张肽原酶的信号顺序可作为从p    PP14切除的一个NcoⅠ/RsaⅠ信号顺序携载片段获取。（pPP14在1985年4月3日申请的第719414号美国专利中已有充分描述，该专利转让给了同一受让人，引用于此，以作参考;p    PP14载有前血管紧张肽原酶原c    DNA插入顺序）。此连接产物为p激素/血管紧张肽原酶系列，其中血管紧张肽原酶原信号顺序被置于紧靠激素原编码基因的上游，而且此载体带有一个紧靠激素基因下游一个框架内终止密码子（和二种不重要的多余的氨基酸）。

实施例9

牛痘重组子的制备

所有在实施例3、5-7和8中描述过的其制备方法可通过用BamH    Ⅰ和Sma    Ⅰ消化媒介载体的方式将包含有携带盒子（bearing    casettes）的激素抗原作为插入p    GS20的Bam    HⅠ/SmaⅠ片段切下的媒介载体，在凝胶上离析被切下的片段，用一种摩尔数过量十倍的经离析的片段处理BamH    Ⅰ/Sma    Ⅰ-经消化的p    GS20，所产生的p    GS20衍生物包括实际连接至牛痘启动子并以TK基因区段为边界的激素抗原盒，如图13所示。

这些重组载体被转染至受到野生型牛痘病毒感染的细胞内，这些细胞购自威斯（Wyeth）实验室有限公司[玛利塔（Marietta），PA]和在CV-1细胞中纯化过二次的噬菌斑。用一等容积的胰蛋白酶（0.25毫克/毫升）稀释病毒储液的一小等分（0.1毫升）并在搅拌下以37℃保温30分钟，然后通过超声处理使细胞聚集块分散。此病毒被稀释至浓度为每毫升5×10⁴噬菌斑形成单位，每毫升含0.2%牛血清白蛋白（BSA）和青霉素/链霉素的磷酸缓中液的盐溶液（PBS）中。CV-1细胞在带有1毫升牛痘病毒的60毫米培养皿上单层被感染产生0.05pfu/细胞的多重性的感染。病毒接种物在细胞上受到摇动的状况下以37℃保温2小时。

用于转化的DNA用格雷哈姆（Graham），等，在《病毒学》（1973）52：456中;斯托（Stow），等，在《J基因病毒学（J.Gen    Virol）》（1976）33：447中;以及福罗斯特（Frost），等，在《病毒学》（1981）91;39中所描述的方法制备。简单地说，将5-10微克质粒（p    GS20衍生物）DNA和1-2微克野生型牛痘病毒DNA加入1毫升Hepes缓冲液的盐溶液（0.14摩尔氯化钠，5毫摩尔/升氯化钾，1毫摩升/升磷酸钠，0.1%葡萄糖，20毫摩尔/升Hepes，PH7.05）中，并加入50微升2.5摩尔氯化钙。混合此溶液并在室温下放置30分钟，此时形成所需的DNA的沉淀。

将病毒接种物从CV-1细胞层吸出，16毫升DNA沉淀物被置换，将此细胞层在室温下留置30分钟，然后加入9毫克包含8%FBS的经预热的鹰的（Eagle′s）MEM。在吸掉介质并用10毫升含有8%FRS的人新鲜的鹰的MEM取代其之前，以37℃将此细胞层保温3.5小时。然后以37℃将此单层放置2天。导致牛痘致病作用的发展。收集此细胞和病毒时，将细胞和病毒刮出，从刮棒上拉下来，在0.5毫升鹰的MEM中再悬浮，并以-20℃冷冻，通过以-20℃冷冻细胞30分钟，冷冻-融解经悬浮的病毒/细胞小块，然后超声处理1分钟以分散病毒/细胞结块。再后所产生的粗制的病毒储液掺入一系列10倍稀释液中接种至143个细胞上（玛克特（Mackett），M.，等，《J病毒学（JVirol）》（1984）49：857-864），一个人体tk-细胞系。在37℃下2小时后，用包含1×经饰复的鹰的介质，5%胎牛的血清和25微克/毫升5-溴脱氧尿苷（BUd    R）的1%琼脂糖将此143个单层涂遍。在37℃下保温二天后，收聚BUd    R-抗噬菌斑，置入放置143个细胞单层的24个井含有25微克/毫升BUd    R的培养皿中，在37℃下生长48小时。

收集病毒并用DNA-DNA点杂交测定激素抗原基因的存在，步骤如下：将细胞从皿中刮出、放入埃派道夫（Eppendorf）离心管，离心分离1分钟，并将此细胞碎片重新悬浮于0.2毫升PBG中，在如上所述冷冻-融解3次和超声破碎后，将被超声物放至一种硝基纤维素膜上用空气干燥。一种野生型病毒控制也被点到同样的膜上，然后，将该膜在（1）0.5摩尔/升氢氧化钠，（2）1摩尔/升Tris-盐酸，ph7.5和（3）2×SSc中浸泡过的纸上各放置5分钟。再后，以80℃将此膜真空烘烤2小时。经烘烤的此膜在5毫升50%甲酰胺，4×SSc，5×旦哈德特的（Denhardt′s）溶液和0.1毫克/毫升经纯净和沸煮过的鲑鱼精DNA中以42℃预杂交1小时。然后此膜以42℃杂交过夜成包含所需激素的每分钟2×10⁷计数的³²P-标纪探针，例如，在加入10毫克/毫升合成血液酸盐缓冲液的5毫升预杂交液中h CGCTP基因探针通过从h CGCTP基因媒介载体之一分离5微克h CGCTP基因插入顺序来制备此探针，用一个商品化的缺口转译盒缺口转译DNA。然后在0.5×SSC，0.1%SDS中将该该膜洗涤30分钟二次，用空气干燥，并放在-70℃下放射自显影过夜。

将包含所需激素基因顺序的病毒留置143个细胞的单层上感染，直至发生汇合细胞致病作用。然后将培养介质吸掉，细胞被溶胞于1%SDS，0.1M-巯基乙醇，50mM    Tris-盐酸PH7.8中。此溶胞物在蛋白酶K中制备成以50毫克/毫升的浓度，以37℃保温4小时，用酚提抽，用乙醇沉淀，并用限制性酶介分析来分析，以表示牛痘基因组包含需的基因。

实施例10

生物检验评价

将兔用作为实验对象以评价牛痘提高血清中和化抗激素的抗体的效价的能力，下面描述用CTP编码疫苗的过程;用如Gn    RH、LH或FSH代替CTP也可分析其它激素。过程类似，但在每次分析中的抗原组分为相应地的激素。

成对的兔通过在皮内注射1-2×10⁸分布于背上2-3部位上的因噬菌斑形成单位用野生型或重组型的病毒接种。在0，14，28天时从兔耳中抽血，在如下致射性配基受体分析中测试血清中抗-hCG的中和化的抗体的存在。

通过在一个100微升的包含5微克h CG，1毫居里钠¹²⁵碘，0.1微克氯胺T和0.1摩尔/升磷酸钠，PH7.5的反应混合物中的格林伍德（Green wood），F.C.，等《J生物学（JBiochem）》（1963）89：114-123的氯胺T法，在100微升反应中使商用h CG碘化。将此混合物在室温下保温10分钟，并加入0.1微克偏亚硫酸氢钠使反应停止。通过在一个碳18柱上的反相高压液相色谱法纯化¹²⁵碘-hCG。

大鼠睾丸的间质细胞在磷酸盐缓冲液的盐溶液（PAS）被均浆，如凯特（Catt），K.J.，等在《（JClin Endocrinol Met ab）》（1974）34：123-127）中所描述。将1500克此均浆物离心分离50分钟，并将固体物在每睾丸10毫升PBS中重新悬浮。通过在PBS-牛的球蛋白（1毫克/毫升）和100微升在预免疫血清，包括一种无-h CG控制内的0.1～100纤克/毫升各浓度的h CG中培养100微升睾丸均浆物，50微生示踪碘¹²⁵-hCG（20，000cpm），作一条结合饱和典线。在24℃时保温18小时后，通过经白蛋白浸泡的0.45微纤维素膜过滤确定此受体结合的示踪物的数量，并在一个贝克曼盖玛（Beckman Gamma）5000射线计数器内计数。80%连接至此睾丸匀将液的浓缩h CG，然后与经标记的示踪物一起用于后续分析。通过用100微升睾丸匀浆液，50微升在PBS-牛的γ球蛋白（1毫克/毫升）中的示踪物碘-hCG（20，000cpm），50微升在上述饱和结合分析中决定的浓度的h CG，以及50微升从1∶10～1∶5000稀释的血清，包括一种无-血清控制的培养以测试血清的中和污性。然后培养此样本，并且用与上述描述的饱和结合分析完全相同的方法分离和计算结合的示踪物的数目。

中和活性的效价为血清的稀释，它在此分析中抑制50%结合。来自动物血清的答者的效价具有低水平免疫中和应，将为1∶5～1∶50，弱应答者为1∶50～1∶250效价的血清，强应者为大于1∶1000效价的血清。胞内h    CG抗原的直接表达，重组牛痘很容易产生低应答，且各种经分泌和膜结合的抗原易产生弱和强应答。也可用以大鼠子宫重量改变为基础的另一分析。

在兔中产生弱的至强的免疫中和应答或在大鼠子宫重量分析中显示阳性应答的重组牛痘将在狒狒或猕猴中作生育控制试验。总之，在兔中产生强应答的重组病毒将提供长期节育，对人类为至3～5年或更长，而在兔中产生弱应答的重组病毒将提供较短时期节育，对人类为6个月～3年。

实施例11

多肽疫苗的制备

上述描述的用于自身抗原的编码顺序也可用常规重组体技术表示，所产生的多肽用作为常规疫苗。其一种方法是，在已详细描述过的pGS20中的结构可用疫苗病毒共感染瞬间地表示在CV-1猴细胞中，该方法是由考切莱（Cochran）.M.A.，等人在1985年的《美国国家科学院会议录》第82卷、第19～23页（Proc    Natl    Sci    USA（1985）82：19-23）中发表。简单地说，CV-1细胞被在30moi时被疫苗感染，然后通过和有p    GS20的自身抗原一起的磷酸钙沉淀而感染。转染后12-48小时收集细胞，回收自身抗原。如果此自身抗原为膜结合，则这些细胞便溶液化，如果封闭的话，自身抗原则从介质中回收。

另一种方法是，对激素的顺序编码，或作为多体，带第二载体的融合蛋白，或作为它们的混合物，按常规的控制顺序的控制下被置于表达的载体中。对原核生物中的表达，一种特别有用的宿主载体为p    KT52。p    KT52包含其下跟有一个ATG的“trc”启动子，且其结构如下。“trc”启动子包含trp启动子的上游区和含有操纵子的lac启动子的下游区。

制备p    KT52，p    KT233-2（埃曼（Amann），E.，等，《基因》（1985）40：183-190）用EcoRⅠ和PvuⅡ消化，并用d    ATP和d    TTP填充，并重新连接以产生正确结构的p    KT52。

p    KT52包含所希望的trc启动子，一个下游ATG起始密码子和下游的NcoⅠ，PstⅠ和HindⅢ部位。包含盒子的自身抗原可以任何前述的载体中删除并插入经p    KT52消化的NcoⅠ/HindⅢ中。

对真核生物的表达，一种有用的宿主载体是pMT，它包括一个合适的EcoRⅠ部位，和其相关的载体p    MT-Apo。这些载体由下列结构组成。

宿主载体，pMT包括金属巯基组氨酸三甲内盐Ⅱ（hMTⅡ）控制顺序，如凯林（Karin），M.，等人在《自然》杂志（1982）第299卷第797-802页中所述。也可通过如下方法连接此启动子至p    UC8中而获得。

运载h    MTⅡ基因的质粒84H（凯林，M.，等（超（supra）））用BamHⅠ完全消化，用核酸外切酶Bal-31处理而去除末端核苷酸，然后用HindⅢ消化至释放掉一种包含-765至+70位的h    MTⅡ基因的核苷酸（+1位的核苷酸是被转录的第一个核苷酸）的840对碱基的片段。用Hind    Ⅲ/Hinc    Ⅱ离析和连接此840对碱基的片段，用p    UC8消化（维拉（Vieira），J.，等，《基因》（1982年）第19卷第259-268页），且转化连接混合物至E.coliMC1061。通过双脱氧核苷酸顺序分析法可确定pMT的正确的结构。

另外，也可制备pMT的一种衍生物，而包括C-端调控信号的pMT-Apo。pMT-Apo位于包括3′-端调控信号的人肝蛋白APo    A基因（休德斯（Shoulders），C.C.，等人在《核酸研究（Nucleic    Acids    Res）》（1983）第11卷第2827-2837页。一个ApoA基因（末端钝头的）的Pst    Ⅰ/Pst    Ⅰ2.2干碱基对（Kb）片段被繁殖至pMT多连接子区域的SmaⅠ部位，且通过用BamHⅠ消化去除大量的ApoA，基因，用Klenow末端钝头化，用StuⅠ消化，并重新连接。所产生的载体大致包括如双脱氧顺序分析确定的来自3′-末端的500碱基对ApoA基因。自身抗原作为一个NcoⅠ/EcoRⅠ片段插入。

实施例12

重组产生的多肽的抗原性

用如实施例6中所描述的，用适当的多体构成在pHA2的HA基因的HincⅡ和PvuⅡ部位之间包括多体2拷贝ser110    CTP，2拷贝des110CTP或3拷贝Gn    RH的媒介载体，从而分别给出p    CTP（ser110）/HAMB，p    CTP（no110）/HAMB和p    Gn    RH/HAMB。包括用于包含专一化的多体的HA基因的1-16位和451-551位氨基酸的编码顺序的BamH    Ⅰ/Sma    Ⅰ片段如上所述被转移至p    GS20，并且所产生的p    GS20/运载体/激素载体被转化至如实施例11中的受CV-1细胞感染的疫苗内。此蛋白质用硫蛋氨酸标记，从此细胞表面回收，一个区段的带有多克隆抗血清的免疫沉淀的蛋白质恰好起到对抗hCG或Gn    RH作用。在12.5%    Laemmli凝胶上分析经标记的蛋白质和其免疫沉淀，结果如图14所示。

图14的第一和14槽表示低和高分子量标准控制，第2至5槽为来自从图1所指示的载体转化而来的细胞的总蛋白质。高背景水平不允许通过插入单一地产生蛋白质而使其变得显而易见。然而，用适当的抗血清的免疫沉淀可以测定和确定这些蛋白质的分子量。

第6和7槽表示用抗-Gn    RH的CV-1细胞的膜结合蛋白质的免疫沉淀的结果;第6槽表示p    GS20/HA/Gn    RH转化子，第7槽为控制转化的p    GS20。抗-Gn    RH是专一对Gn    RH中间区域的，其如金（King），J.A.，等人在《内分泌学》（1980）106卷，第707-717页中所述。在约23千对碱基（Kd）上连成一片的带谱为大致上正确的分子量（由HA组成的17千对碱基，由多体组成的6千对碱基），它也可为一种糖基化蛋白质（在HA顺序中有两个糖基化部位）。

第8至13槽为带有Miles抗血清（第11至13槽）或Meloy抗血清（第8至10槽）的免疫沉淀，上述两种血清在兔中均起抗h    CG作用。第10和13槽表示p    GS20/HA/CTP（ser110）转化子并表示一种约正确分子量（来自HA的17千对碱基和来自多体的12千对碱基）的新的免疫沉淀的蛋白质的存在。控制槽8和11和带有no110多体的转化子，第9和12槽没在新的带谱中表示出。

同样分析产生于胞溶物上的被一种包含DNA编码CTP2-聚体的重组疫苗病毒所感染的CV-1细胞，其表明带有抗-h    CG抗体的特定免疫沉淀的正确分子重量的带。

实施例13

特定疫苗种的结构

如图15所示的LH顺序中的低物种同源性区域有利于在此基础上构成肽，它是一种特定的抗生疫苗。以牛的（蛋白）顺序的58～69位、104～118位氨基酸和狗的（蛋白）顺序的58～68位和104～107位氨基酸表示的合适的寡聚体编码肽，如图15所示表示带有人的LH的低同源性位置，因此，允许从它们制备疫苗而由人们完全地操作。

这些寡聚体可被多聚化和钝头化而获得经如上所述处理的多体，从而产生疫苗。当肽链较短时，同时使用它们会有利于得到一种最高效率的疫苗。

Claims (15)

1、一种可有效地提高对付靶固有蛋白质的抗体的疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括用重组技术生产所说的蛋白质的免疫形式，其中所说的免疫原形式是选自由以下组成的组：

a)基本上由所说的固有蛋白质的至少一个表位的至少两个重复单位组成的多体，

b)所说的固有蛋白质与至少有一个表位与非细菌多肽相结合，

c)基本上由与附加的多肽顺序相结合的所说的固有蛋白质的至少一个表位的至少两个重复单位组成的多体，

所说的方法包括培养能够产生所说的免疫原形式的重复体细胞，

回收免疫原形式

将免疫原形式配制成疫苗。

2、一种DNA顺序，其特征在于所说的顺序为权利要求1的免疫原形式的蛋白质编码。

3、一种重组体宿主细胞，其特征在于所说的细胞被权利要求2的DNA转化。

4、根据权利要求2所述的DNA顺序，其特征在于所说的顺序被配置在牛痘病毒的非本质区。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的免疫原形式包括一种基本上由所说的固有蛋白质的至少一个表位的至少两个重复单位组成的多体。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于非细菌多肽是一种流感血细胞凝集素。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于疫苗是一种对哺乳动物有效的抗生育能力的疫苗。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于固有蛋白质是选自由LH、Gn  RH、CG及FSH组成的组。

9、一种有效地抗哺乳动物生育能力的疫苗的制备方法，其特征在于所说的方法包括：

一种牛痘病毒染色体组，已配置在其非本质区内，DNA顺序具有化学式激素n，其中n为等于1～20的整数，激素表示从生殖激素编码的顺序中得到的一种DNA顺序，

所说的方法包括：

培养细胞用含有所说的DNA的一种载体转化和用牛痘病毒进行感染，

回收含有所说的DNA的重组牛痘病毒。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于从为生殖激素编码的顺序中得到的DNA顺序是选自由以下组成的组中得出的：

CTP，其中CTP表示为人的绒毛膜促性腺激素（β-h  CG）的β-肽的羧基末端部分（CTP）编码的一种DNA，

Gn  RH，其中Gn  RH表示从促性腺激素中得到的一种DNA编码的肽，

h  LH，其中h  LH表示从人的促黄体激素中得到的一种DNA编码的肽，

b  LH，其中b  LH表示从牛的促黄体激素中得到的一种DNA编码的肽，

d  LH，其中d  LH表示从狗的促黄体激素中得到的一种DNA编码的肽，

c  LH，其中c  LH表示从猫的促黄体激素中得到的一种DNA编码的肽，

o  LH，其中o  LH表示从绵羊的促黄体激素中得到的一种DNA编码的肽，

FLH，其中FLH表示从促滤泡激素中得出的一种DNA编码的肽。

11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于DNA选自由以下组成的组：

它为由β-h  CG的109-145氨基酸组成的肽编码的组，

为由β-h  CG的109-145氨基酸组成的肽des110形式编码的组，

为由β-h  CG的109-145氨基酸的肽的Ser110形式编码的组，

为具有小鸡Ⅱ或人的Gn  RH的（在N-末端带有谷氨酰胺残基）的氨基酸顺序的肽编码的组，

为具有人的LH的2-111氨基酸的氨基酸顺序的肽编码的组，

为具有牛的LH的22-85氨基酸的氨基酸顺序的肽编码的组，

为具有狗的LH的43-115氨基酸的氨基酸顺序的肽编码的组。

12、根据权利要求9所述的方法，其特征在于化学式激素n的DNA可以有效地连接到能够影响构成激素n的蛋白质分泌的信号顺序上。

13、根据权利要求9所述的方法，其特征在于化学式激素n的DNA配置在DNA编码的HA的抗原编码部分。

14、一种为可有效地控制哺乳动物生育能力的肽编码的DNA顺序，其特征在于所说的顺序包括为流感血细胞凝集素（HA）编码的一种DNA顺序配置在化学式激素n的DNA之中。

15、一些抗体或者Fab部分，其特征在于所说的提高抗体或者，其中Fab部分以对抗权利要求1的疫苗。

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