CN1058291C - 低能离子束细胞修饰技术和装置 - Google Patents

Abstract

本发明是低能离子束细胞修饰技术和装置。

本发明技术是用低能离子束溅射刻蚀对放在微环境靶室内的并经过预冷的动、植物细胞进行溅射刻蚀，外源基因导入，细胞融合等。

本发明装置是由一个离子源，一个可使离子束通过的主真空室和一个微环境靶室组成。微环境靶室内装有样品架，配有预抽系统，装有高效过滤材料和气源接口的气流净化结构。主真空室与微环境靶室是由隔离阀连接的。

Description

低能离子束细胞修饰技术和装置

本发明涉及生物工程，国际分类号C12N 13/00；G01N1/00。

在植物细胞工程中，操作的受体为原生质体，但是由于纤维素酶，果胶酶等的酶解作用和较长时间的去壁操作，使细胞受到一定的损害。加之，不少植物，特别是禾谷类作物的原生质体再生植株相当困难，因此在一定程度上限制了这些技术的应用。曾经有不少人采用物理方法，但因各自都有不可避免的缺点，如：电击法、超声波法、γ射线等电离辐射方法，其主要受体仍为原生质体；基因枪法，则由于金属粉载体的毒害作用，效果也不很理想；激光法，属于热蒸发一类，虽可在细胞壁上打孔，但极易伤及临近的细胞器，加之是单个细胞操作，效率低。

本发明的第一个目的就是提供一种采用低能离子束对细胞进行修饰从而达到改良物种的方法；

本发明的另一个目的，就是提供一种实现低能离子束对细胞进行修饰的装置。

采用离子注入作物诱变育种技术，对于促进农作物改良起了重要作用。

离子注入作物诱变育种的原理是：将离子注入到生物体某一薄层内，通过注入离子与生物分子的能量交换和慢化离子的掺杂，引起这一薄层内的基因突变和重组，从而达到改良物种的目的。

由于离子的射程是可控的，因而对种子的损伤是局部的，而在局部区域的诱变作用又是双重的：即能量交换和质量沉积。因此，在物种成活率高的情况下可获得高的突变率和宽的突变谱

据联合国粮农组织统计，γ射线诱变在半致死剂量下，平均突变率为1％，有利突变率万分之三；而离子注入诱变在成活率90％的情况下，平均突变率8.4％，有利突变率1％。由此可见，离子注入诱变育种的效率比γ射线高几十倍甚至上百倍。更重要的是，由于离子束与生物体相互作用在入射方向上有高度的空间分辨率，如果离子束聚焦到微米束以下，就可以实现三维空间分辨。人们可以利用这一技术进行基因位点操作，从而解决诱变育种的方向性问题。

本发明是利用低能离子束溅射刻蚀细胞壁，使之在细胞壁上形成微孔，离子通过微孔作用在细胞膜上，形成生物大分子(如外源基因分子)进入细胞的通道。

本发明是借助低能离子与细胞表面动量交换原理，适应各种动、植物细胞诱变、去壁的细胞修饰技术。

本发明的方法，是在无菌条件下，将动植物细胞以0.5度/分的速度使之预冷到4-6度，通过无菌室，放入微环境靶室，靶室的真空度为2×10^-4～2×10^-6乇。

本发明还需根据不同的目的，选择不同的离子：

作细胞诱变时，注入N⁺，能量为30-50KeV，剂量在1×10¹⁵～1×10¹⁶之间；

作细胞壁刻蚀时，选择Ar⁺，能量为10～20KeV，剂量在1×10¹⁴～1×10¹⁵之间。

当两细胞靠得很近时，用Ar⁺离子束来扫过，进行细胞融合；当壁被离子束刻蚀后，进行外源基因导入。

根据热力学原理，汽液相面的平衡湿度与蒸汽压有关。当气压下降时，相面温度会随之而下降。假设一个细胞为一个半径为r的小水滴，当它瞬间暴露在10^-2乇以下的真空时，细胞表面一层将迅速结冰，形成厚度为dr的冰壳。随着时间的推移，冰壳向内部延伸。冰壳的存在防止内部水份的蒸发，并有足够的强度承受负压，使细胞不致破坏。但当细胞放置在真空室内的时间过长，细胞表层的冰壳将会因承受不住真空室里的负压而破裂。为此，本发明设计了低能离子束细胞修饰技术的装置。

本发明装置包括：

一个离子源，

一个主真空室，该真空室配有真空机组，留有一通道，可以让离子源引出的离子束通过，注入到放在样品架上的动植物细胞上。

一个小真空室，亦称微环境靶室，该靶室是通过隔离阀与大真空室相连，靶室内有用于放置动、植物细胞物种的样品架，靶室配一个预抽泵，还有一个装有高效过滤材料的气流净化结构和一个气源接口。

工作时，首先将大真空室抽至2×10^-6，将离子源调试正常，在无菌的环境下，把待处理的动植物细胞放在小真空靶室的样品架上，再把小真空室相连的预抽泵打开，抽真空1分钟，使小真空室的真空度达10^-2乇左右，打开隔离阀，小真空室内的真室度迅速达到2×10^-6乇，同时，离子源放电引出，荷能离子注入到样品架上，即对动、植物细胞进行刻蚀、打孔、去核，以及外源基因转移，细胞融合等。

本发明装置的特点在于，有一个小真空室，而大小真空室的体积比为1000∶2，小真空室的真空度只需预抽到10^-1～10^-2乇，打开阀，小真空室就可在极短的时间内真空度达到10^-8左右，这样，放在样品架上的细胞，只需在小真空室内放置10分钟以内，就可完成离子注入，从而保护了被处理的细胞。

试验表明：对棉花花粉母细胞，在小真空室放置4小时，成活率为20.1％，而放置25分钟，成活率为96.0％，这相当于20分钟内40℃大气条件下的存活率(94.7％)。

本发明装置使得离子刻蚀过程中(10分钟内)排除了真空对细胞成活率的影响。

本发明装置的效果是好的。

1.动植物细胞在靶室内滞留时间10分钟，承受5×10¹⁶个离子/平方厘米刻蚀后，存活率对各种单细胞生物可达30-70％。

2.GUS CAT和PBI ₂₂₂报导基因经离子束介导转入水稻完整细胞和成熟胚获高水平表达，并获大量的转基因植株。

3.棉花花粉细胞和酵母菌的离子束细胞融合。

4.洋葱培养细胞的去核。

5.带有标记基因2.7Kb的质粒导入大肠杆菌，离子注入体内质粒，突变率30％。

附图说明：

1       离子源          2       主真空室

3、9    样品架          4       隔离阀

5       汽流净化结构    6       过滤

7       气源接口        8       预抽接口

10      冷却            11      微环境靶室

12      真空机械泵      13、14  真空机组

Claims (5)

1.一种低能离子束细胞修饰技术，其特征是用低能离子束对放在微环境靶室内的，并经过预冷过的动、植物细胞进行注入、溅射和刻蚀，所述的离子束，在作细胞诱变时注入N⁺离子，能量为30～50KeV，剂量为1×10¹⁶～1×10¹⁶，在作细胞壁刻蚀时用Ar⁺离子，能量为10～20KeV，剂量为1×10¹⁴～1×10¹⁵，所述的微环境靶室内的真空度为2×10^-4～2×10^-6乇。

2.根据权利要求1所述的技术，其特征是动、植物细胞在离子注入、溅射和刻蚀前，是以0.5度/分的速度预冷到4-6度。

3.根据权利要求1所述的技术，其特征是当两细胞靠得很近时，用Ar⁺离子束来扫过，进行细胞融合；当细胞壁被离子刻蚀后，进行外源基因导入。

4.一种低能离子束细胞修饰装置，其特征是配接离子源(1)和真空机组(13，14)的主真空室(2)内置有样品架(3)，所述的主真空室(2)经隔离阀(4)与内设样品架(9)的微环境靶室(11)相连接，所述的微环境靶室(11)配接有气源接口(7)和预抽接口(8)。

5.根据权利要求4所述的装置，其特征是气源接口(7)与微环境靶室(11)间串接有气流净化结构(5)和过滤材料(6)。

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