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CN1126494A - 生产生物活性多肽重组体的方法 - Google Patents

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CN1126494A
CN1126494A CN94192673A CN94192673A CN1126494A CN 1126494 A CN1126494 A CN 1126494A CN 94192673 A CN94192673 A CN 94192673A CN 94192673 A CN94192673 A CN 94192673A CN 1126494 A CN1126494 A CN 1126494A
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gif
cell
antigen
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CN94192673A
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K·石坂
Y·-C·刘
T·三个山
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Kirin Brewery Co Ltd
La Jolla Institute for Allergy and Immunology
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
La Jolla Institute for Allergy and Immunology
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Abstract

多肽、多核苷酸、其片段、及其单克隆抗体被用于制备抗原特异性和抗原非特异性糖基化抑制因子，以及从编码多肽的结构基因产生生物活性多肽重组体的方法。

Description

生产生物活性多肽重组体的方法
本申请是1992年6月3日提交的PCT/US92/04614的后续申请，该PCT/US92/04614又是1991年6月3日提交的709375的后续申请，而该709375号申请则是1990年6月4日提交的流水号533889申请之后续申请。
                      本发明的领域
本发明涉及可抑制针对抗原的人类免疫反应的人的糖基化抑制因子(GIF)和编码GIF的多核苷酸序列。
                      背景技术描述
虽然常见到免疫反应是有益的，但在某些情况下，对抗原的免疫反应实际上对发生此免疫反应的动物来说是有害的。免疫反应的产生使宿主患有严重的病理后遗症症状的例子是引起自身免疫疾病：如红斑狼疮。在红斑狼疮中，常存在与宿主的甲状腺、红细胞、DNA和血小板中的决定簇反应的抗体。
另外述及的抑制免疫反应的例子是治疗过敏反应。已经确定的是，抗致敏原的IgE抗体引起枯草热，并与其它过敏性疾病，如外源性哮喘有关。在该过敏性疾病中IgE抗体起的决定性作用，提示了这样的可能性：即调整和抑制抗致敏原的IgE抗体的形成将成为对过敏性疾病的基本治疗手段之一。比如，在因豚草过敏原过敏的枯草热患者的血清中，总是检测到抗该致敏原的IgE抗体。花粉季节到后该IgE抗体值上升，然后在该年的其余时期中略有下降。由于IgE在血清中的半衰期仅为2或3天，所以IgE抗体滴度的这种持续，表明了即使并无过敏原影响，仍能由患者的淋巴细胞持续合成该抗体。
在过去的整个20年中，人们作了一些不同的尝试来控制实验动物的IgE抗体反应。这些方法之一是改进经典的免疫学治疗或脱敏治疗，按此法，过敏患者接受微剂量抗原的反复注射。业已表明，这种脱敏治疗可改善某些患者的临床症状。然而，在该治疗后，枯草热患者血清中的IgE抗体滴度并不下降。该治疗的主要免疫效应是IgG抗体形成增强和花粉季节过后抑制IgE抗体滴度增加。
脱敏或免疫抑制治疗中的限制在于，由于副作用，患者不能承受大剂量的抗原。为克服这种困难，尝试使用化学修饰的抗原，如，脲-变性抗原或该抗原的聚1，2-亚乙基二醇共轭物来进行治疗。由于该经修饰的抗原不与抗该天然抗原的抗体结合，所以注射剂是可相当大而不至引起过敏症状。然而，这种经修饰的抗原可刺激抗原特异性T细胞。得到的证据是，向小鼠静脉注射此种经修饰的抗原，导致了抗原特异性抑制T-细胞的产生，该细胞是抑制针对天然抗原反应的原发IgE抗体的。然而，如果在该抗体值达到最大值之后开始这种治疗，则该治疗对进行性IgE抗体形成的效果最小(Takatsu and Ishizaka，J.Immunol.，117：1211，1976)。与对小鼠的观察一致，在枯草热患者中的聚1，2-亚乙基二醇-共轭致敏原临床试验显示出该治疗对减少IgE抗体滴度无效。反复注射此经修饰的抗原来抑制进行性IgE抗体形成的失败可能是由于在该过敏患者中有相当大量的抗原特异性辅助T-细胞的缘故。由于此经修饰的抗原不仅诱发抗原特异性抑制T-细胞的产生，还增加协助T-细胞的数量，该治疗的后一效果可能抵消了抑制T-细胞的作用。这种解释为这样的事实所支持：将特异性抑制T细胞抗原移植于经免疫的小鼠体中，则可导致对进行性IgE抗体形成的抑制(Takatsu and Ishizaka，J.Immunol.，117：1211，1976)。该结果总的来说说明了：如果能产生抗原特异性抑制T-细胞而不增加协助T-细胞数量，则可抑制枯草热患者中的持续IgE抗体形成。
自1980年以来，本发明人一直研究各种方法，这些方法以免疫球蛋白同种特异性方式选择性地调节IgE的合成。作为这一研究的结果，已发现两类具有IgE亲和性及选择性调节IgE合成的T-细胞因子。IgE结合因子(IgE-BF)之一选择性地增强IgE反应，而其它类型的IgE-BF则选择性地抑制此反应。该IgE增强性因子和IgE抑制性因子间的主要区别看来在于该分子的碳水化合物部分。该IgE增强性因子与小扁豆植物凝血素和伴刀豆球蛋白A结合，而该IgE抑制性因子不与其结合(Yodoi，et al.，J.Immunol.，128：289，1982)。对IgE增强性因子或对IgE抑制性因子选择性形成，以及对该因子的基因克隆的细胞机制分析表明：IgE增强性因子和IgE抑制性因子共有一种共同的结构基因，而且这些因子的碳水化合物部分的性质和生物活性是在转译后糖基化过程中确立的(Martens，et al，Proc.Nat′l Acad，Sci.，U.S.A.，84：809，1987)。在生理学条件下，此糖基化过程受两种T-细胞因子的控制，它们或增强，或抑制此过程。这些因子被命名为糖基化抑制因子(GIF)和糖基化增强因子(GEF)。
GIF的独特性能是其生物化学活性。这种淋巴因子与抗脂调节素(lipomodulin)的单克隆抗体(一种磷脂酶抑制蛋白)结合，而且看来是一种磷脂酶抑制蛋白的磷酸化衍生物(Vede，et al.，J.Immunol.，130：878，1983)。在小鼠中也发现，GIF的主要来源是抗原特异性抑制T-细胞(Ts)(Jadieu，et al.，J.Immunol.，133：3266，1984)。随后的对卵清蛋白(OVA)特异性抑制T-细胞杂交瘤的实验表明：用抗原(OVA)激发的同源巨噬细胞对杂交瘤细胞的刺激导致了对OVA有亲和力的GIF(结合抗原的GIF)的形成。然而，同样的杂交瘤却基本上分泌对OVA没有亲和性的GIF(非特异性GIF)。对非特异性GIF和结合OVA的GIF间的关系的研究表明：该结合抗原的GIF是由一种与抗原结合的多肽链和一种非特异性GIF构成的(Jardieu，and Ishizaka，in Immune Regulation ByCharacterized Polypeptides，Goldstein，et al.，eds.，AlanR.Liss，Inc.，N.Y.，p595，1987)。还发现，该结合抗原的GIF和其它研究者所述的抗原特异性抑制T-细胞因子(TsF)共享共同的抗原决定簇，而且以抗原(载体)特异性方式抑制该抗体反应。此外，不仅结合抗原的GIF而且其它研究者所述的抗原特异性TsF都与和单克隆抗一脂调节素(lipomodulin)(141-139)结合的免疫吸附剂相结合，而且通过将该免疫吸附剂在酸性pH值下洗脱而回收。
尽管在治疗过敏时对脱敏有这种主要限制，但此技术仍将是继续选用的方法。因而对该技术提出非常重要的要求，即该技术应是抗原特异性的，但却无现存的脱敏治疗的副作用。
为防止宿主对移植物(HVG)的排斥和移植物对宿主(GVH)的排斥，抑制免疫反应是至关重要的。遗憾的是，在自身免疫病以及HVG和GVH的情况下，抑制免疫反应用的是一种高毒性的药剂，它们效果有限，而且是系统性地而不是特异性起作用。这类治疗的严重局限性，导致对毒性较小而特异性较大的免疫抑制剂的需求。
一种改进人体中抑制抗原免疫反应的方法是施用免疫抑制有效量的，可与该抗原特异性结合的GIF。这样处理时，可望T抑制因子浓度较高，结果对该抗原的免疫反应减小。本发明提供了达到这种结果的手段。
               本发明的概要
本发明提供了基本纯的人抗原特异性GIF和抗原非特异性GIE，以及编码GIF的核苷酸序列。还提供一种生物活性多肽的重组体生产的通用方法。
               附图的简要描述
图1所示是鼠GIF的cDNA克隆的核苷酸序列及推断出的氨基酸序列。
图2所示是人GIF的cDNA克隆的核苷酸序列及推断出的氨基酸序列。
图3所示是pST811载体图。
图4所示是pTMK-hGIF载体图。
图5所示是SRα-hGIF载体图。
图6所示为SRα-hcGIF载体图。
图7所示为融合表达载体，pMEproCT图。
                本发明的详细说明
本发明涉及基本纯的、对不希望的免疫反应相关联的抗原有特异性的人抗原特异性GIF。这种人的抗原特异性GIF，对以抗原特异性方式免疫抑制不希望的免疫反应是极为有用的。
本发明优选可特异性地与致敏原结合的人抗原特异性GIF。在本发明的一个特别优选实施方案中，公开了一种人抗原特异性GIF，它能与蜂毒磷脂酶A2(PLA2)上的抗原决定簇，即蜜蜂毒素中的主要致敏原结合。这种特异性能使此抗原特异性GIF和类似的，有同样特异性的抗原特异性GIF，被用于抑制对PLA2的人免疫反应。在本发明的另一特别优选实施方案中，公开了一种人抗原特异性GIF，它可与日本杉花粉上的抗原决定簇结合，能用于抑制对这种抗原的人的免疫反应。
这种有关生产对蜂毒PLA2有抗原特异性的GIF的论述很容易由本技术领域中的普通技术人员推广到其它的抗原，以便制备和提纯对那些其它的抗原有抗原特异性的其它的GIF分子而无需作过多的实验。因此，本发明的广泛的开创性特点能用来制备针对其它过敏原的人的抗原特异性GIF，用来抑制自身免疫病和过敏之类的免疫反应介导的疾患。在不希望的免疫反应的抗原已知的情况下，如大多数的过敏和各种自身免疫病等，生产各种人抗原特异性GIF是特别有利的。
本发明的人PLA2特异性GIF得自于从ACTT寄存号HB10473的细胞系AC5获取的抗原特异性GIF，或者说与该抗原特异性GIF有相同识别特征。本发明的人日本杉花粉特异性GIF得自于从细胞系31E9(ACTT HB11052)获取的抗原特异性GIF，或者说与该抗原特异性GIF有相同识别特征。
              产生杂交瘤及其特征描述的方法
用于产生杂交瘤的通用方法是公知的(Kohler，et al.，European J.Imm.，6：292，1976)。简言之，将得自对蜜蜂毒素过敏的人的外周血单核细胞(PBMC)，在有化学修饰的PLA2存在下加以培养，回收非附着的细胞，然后在与成淋巴细胞样细胞系BUC融合之前用IL-2和脂皮质素(lipocoptin)-1进行培养。将杂交瘤筛选出以便产生对PLA2特异性的人GIF。
更一般地说来，本发明针对生产产生人抗原特异性GIF的连续杂交瘤细胞系的方法，该方法包括：
(a)获得被抗原激活的人抗原引发T-细胞，而然后在IL-2和磷脂酶A2抑制因子存在下培养；和
(b)将该激活的T细胞与融合配偶体细胞系结合而产生能产生人抗原特异性GIF的杂交瘤。
该抗原引发T-细胞可从任何样品获得，包括外周血的单核细胞级分。然后该抗原引发T细胞可在有该抗原存在时加以培养而被激活(对抗该抗原而T细胞被引发)，接着在有白细胞介素-2(IL-2)和磷脂酶A2抑制因子存在下扩展此被激活的T-细胞。为此目的而特别有用的磷脂酶A2抑制因子是脂皮质素。换言之，有PLA2抑制活性的合成的化合物，如2-(p-戊基肉桂酰基)-氨基-4-氯苯甲酸(ONO-RS-082，ONO Pharmaceutical Co)可被使用。
在某些情况下，如原生的抗原对该T-细胞有毒性的场合下，可望以化学修饰此抗原。对这类修饰有用的试剂包括胍HCl化物，和氰的溴化物，但本技术领域中的普通技术人员无需作过多的实验就很容易地找出类似的试剂。总的来说，优选使用不破坏该抗原外部结构的试剂，因为认为这样的外部结构对抑制T-细胞表位识别该抗原是重要的。然而，该论点对大多数抗原，如很多非细胞毒性的致敏原来说，并不明显相符。因而，在典型的致敏原存在下，天然的分子可用于刺激T细胞。
本发明的目的在于产生抗原特异性人T-细胞和T-细胞杂交瘤，它们能产生抗原特异性GIF，它们与欲被免疫抑制的免疫反应相关抗原有特异反应活性。用为确定研究中的人抗原特异性GIF的基本反应模式的常规筛选技术，可完成能产生具有本发明人抗原特异性GIF抗原特异性的人抗原特异性GIF的T-细胞杂交瘤的分离。因此，比如对PLA2特异性的人GIF情况下，如果被测试的人抗原特异性GIF能抑制得自对PLA2过敏患者的细胞的免疫反应，那么，该被测试的人抗原特异性GIF和由本发明杂交瘤所产生的该对PLA2具特异性的人GIF是等同的。
还有另一种确定一种人抗原特异性GIF是否具有本发明人抗原特异性GIF的特异性的方法，是用抗原预培育本发明的人抗原特异性GIF，所述抗原与原有正常反应活性(比如蜂毒PLA2)并确定该被测试的人抗原特异性GIF是否在其结合该抗原的能力方面受到抑制。如果该被测试的人抗原特异性GIF被抑制，那么，十有八九，它具有与本发明的人抗原特异性GIF相同的抗原决定簇特异性。
本发明中所用的术语“抗原决定簇”(epitope)的意义是包括能与本发明的人抗原特异性GIF或单克隆抗体相互反应的任何决定簇。表位的决定簇由诸如氨基酸或糖侧链的化学活性分子基团构成，而且通常具有独特的三维结构特征和独特的电荷特征。
另一方面，本发明涉及生产基本纯的人抗原特异性GIF的方法，它包括：
(a)培养能产生人抗原特异性GIF的连续杂交瘤细胞系，从而该细胞系产生人抗原特异性GIF；以及
(b)将基本纯的人抗原特异性GIF从培养物中分离出来。
所用连续杂交瘤细胞系本身可如上所述制得。此外，在培育该杂交瘤细胞系过程中，最好通过将该杂交瘤细胞暴露于同源巨噬细胞中而刺激产生人抗原特异性GIF，该同源巨噬细胞已被用与抗原特异性GIF结合的抗原激发，或用抗CD3或T细胞受体的抗体所激发。
可用各种技术从该培养物中分离和基本提纯此人抗原特异性GIF。一种特别有用的技术是采用能与该抗原特异性GIF结合的抗原，比如，将其偶联于固相上而进行的所谓亲和提纯法。如果必要，该技术的一种改型是采用两个亲和性吸附步骤来基本上提纯此人抗原特异性GIF。按此法，分离基本上纯的人抗原特异性GIF的步骤包括：
(ⅰ)使杂交瘤细胞系与具有对人GIF特异活性的单克隆抗体反应；
(ⅱ)从该单克隆抗体中将人GIF洗脱；
(ⅲ)使该洗脱的GIF与和人抗原特异性GIF结合的抗原反应；
(ⅳ)从该抗原中将此人抗原特异性GIF洗脱；
(ⅴ)回收此人抗原特异性GIF。
此外，与抗该抗原特异性GIF的单克隆抗体如110BH3相连的免疫吸附剂可用来取代抗原偶联的免疫吸附剂。此分离基本纯的人抗原特异性GIF的步骤包括：
(ⅰ)使该杂交瘤细胞系培养物与和人抗原特异性GIF结合的单克隆抗体反应；
(ⅱ)从此单克隆抗体中将此人GIF洗脱；
(ⅲ)将被洗脱的GIF与具有对人GIF特异反应活性的单克隆抗体反应；
(ⅳ)从该单克隆抗体中将此人抗原特异性GIF洗脱；以及
(ⅴ)回收此人抗原特异性GIF。
通过将该杂交瘤细胞调到无血清培养基，如ABC来提纯人抗原特异性GIF是很方便的。在用抗-CD3进行亚克隆处理后，接着在Protein A涂覆的组织培养皿中培养此杂交瘤细胞系，培养物上清液中的结合抗原的GIF可用上述的离子交换色谱法提纯。在这样的条件下，分离基本纯的人抗原特异性GIF工艺包括：
(ⅰ)使此杂交瘤细胞系培养物上清液与一种阴离子交换基质接触；
(ⅱ)从该基质上将此人GIF洗脱；
(ⅲ)使此被洗脱的GIF与具有对人GIF特异活性的单克隆抗体反应，或与和人抗原特异性GIF结合的抗原反应，或与此二者反应；
(ⅳ)洗脱此人抗原特异性GIF；以及
(ⅴ)回收此人抗原特异性GIF。
这样，离子交换层析提纯法可与亲和性提纯法相结合使用，比如，如上所述，通过利用与该抗原特异性GIF结合的抗原，或利用具有对人GIF特异反应活性的一种抗体，或用此二者，来分离人抗原特异性GIF 。
按该优选实施方案，DEAE(二乙氨基乙基)Sepharose是用于提纯人抗原特异性GIF的基质。其它可用的离子交换材料包括任何市售的阴离子交换琼脂糖或纤维素，如多硫酸化琼脂糖，特别包括(但不限于)QAE(季胺)衍生物，Ecteola(表氯醇三乙醇胺)，TEAE(三乙氨乙基)衍生物和AE(氨乙基)纤维素。与这些不同的离子交换材料结合和从其上洗脱的特定参数是本技术领域中的普通技术人员熟知的，或不经过多的实验而可容易得知的。
当该杂交瘤细胞系上清液被加到用约20mM的盐，如NaCl所平衡的阴离子交换基质上时，大量的GIF将通过该柱，而残余物用浓度最高为约60mM的盐洗脱。就从DEAE洗脱而言，优选于10mM Tris中约含20mM-约60mM的NaCl浓度中进行。
在亲和提纯法中，特别有用的单克隆抗体是用细胞系388F1产生的单克隆抗体，或是用与细胞系388F1所产生的单克隆抗体具相同特异性的单克隆抗体，和由细胞系110BH3产生的单克隆抗体，或具有相同特异性的单克隆抗体。人抗原特异性和抗原非特异性的GIF的治疗用途
术语“抑制性的”指的是能减少接受治疗的人中的不希望的免疫反应的有害影响。术语“免疫抑制有效的”是指所用的人抗原特异性的或非特异性的GIF的量，该是足以抑制由不希望的免疫反应引起的疾病或症状。
施用本发明的人GIF的剂量范围是足以产生所需效果的范围，所述所需效果要使免疫反应的症状显示出某种程度的抑制。该剂量不应大到引起不利的副作用，如不希望的交叉反应、过敏反应等等。一般说来，该剂量应随患者的年龄、症状、性别和病的程度而变，而且可由本领域中的普通技术人员决定。且该剂量可由各内科医生根据禁忌症情况调节。剂量可从约0.001mg/kg/剂到约2mg/kg/剂，优选约0.001mg/kg/剂-约0.2mg/kg/剂范围内改变，每天施用1或多剂，施用1或几天。
本发明的人GIF可通过注射或在一段时间内输注而经肠胃外施用。本发明的人GIF可经静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液，悬浮液及乳液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇，植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯类，如油酸乙酯。含水载体包括水，乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，其中包括盐和缓冲基质。肠胃外用载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的林格氏液或固定油。静脉内注射载体包括流态的和营养补足剂、电解质补足剂(如以林格氏葡萄糖为基础的补足剂)等。还可有防腐剂和其它辅助剂，诸如，比如抗菌素、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体等。
本发明还涉及制备含本发明的人抗原特异的或抗原非特异的GIF的药物的或药用成份，该药物是被用来治疗对抗原的不希望的免疫反应的，其中该抗原是能够与本发明的人GIF结合的。
本发明的目的还在于单克隆抗体及产生该抗体的B-细胞杂交瘤，该抗体可特异性地与人GIF反应。此外，本发明提供可特异性地与抗原特异性GIF反应而不与非特异性GIF反应的单克隆抗体(以及B-细胞杂交瘤)。这种类型的代表性的单克隆抗体是110BH3。
如上所述，产生杂交瘤的技术是为本领域中普通技术人员所熟知的。简言之，本发明的B-细胞杂交瘤是通过用亲和提纯的人GIF给BALB/c小鼠免疫接种，随后再数次加强接种来制备的。最后一次免疫接种后的两周，从该动物获得脾细胞，将其转移于已被致死量辐照过的同源BALB/c小鼠体中。该同源受体用提纯的人GIF免疫接种两次，而在最后一次接种后两周，将该脾细胞与SP2/0-14AG骨髓瘤细胞系融合。为产生针对人GIF的单克隆抗体将杂交瘤进行筛选。
分离产生具有本发明的单克隆抗体反应活性的单克隆抗体的杂交瘤，可用确定所研究的该单克隆抗体的基本反应模式的常规筛分技术来完成。因此，如果被测试的单克隆抗体与人GIF反应，而不与小鼠GIF反应，那么该被测试的抗体和用本发明的杂交瘤所产生的抗体是等同的。
产生具有单克隆抗体388F1特异性的单克隆抗体或本发明的任意其它单克隆抗体的杂交瘤的分离可由本领域中普通技术人员，通过产生抗遗传型抗体来完成(Herlyn，et al.，Science.232：100，1986)。抗独特型抗体是这样的抗体：它能识别存在于该讨论中的杂交瘤产生的该单克隆抗体上的独特决定簇。这些决定簇位于该抗体的超变区中。它是与给定的表面决定簇结合的区，因此是反应该抗体的特异性的区。该抗独特型抗体可通过用讨论中的该单克隆抗体给一种动物免疫接种而制得。该经接种的动物将通过产生一种抗该独特型决定簇的抗体来辩识和应答这些接种抗体的独特型决定簇。将单一杂交瘤产生的单克隆抗体用于免疫第二动物，使第二动物产生对该单克隆抗体特异的抗独特型抗体。使用该抗独特型抗体，使鉴定具有与用于免疫的杂交瘤抗体相同独特型的其它克隆成为可能。从而大为简化，并减少为找到能产生具有本发明的单克隆抗体特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤所需的筛选工作量。
两种杂交瘤的单克隆抗体间独特型的一致性证明，该两种单克隆抗体就其识别同样表位决定簇而言，是相同的。因此，通过采用抗单克隆抗体上的表位决定簇的抗体，就可能鉴别表达该相同抗原决定簇特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤。
此外，无需过多的实验就可能评价一种单克隆抗体，确定它是否有与本发明的单克隆抗体相同的特异性，即通过确定该被测试单克隆抗体是否能防止本发明的单克隆抗体与一种特殊的抗体，比如人GIF(388F1与之有正常反应活性)相结合即可。如果该被检测单克隆抗体与388F1竞争，比如，所示388F1的结合下降，那么很可能这两种单克隆抗体均与相同抗原决定簇结合。类似的检测可用于单克隆抗体110BH3。
另一种确定一单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体(如388F1)的特异性的方法，是用一种抗原比如，人GIF预培育388F1(所述抗原与其有正常反应活性)，然后确定该被检测的单克隆抗体是否在其与该抗原结合的能力方面被抑制，如果该被检测的单克隆抗体被抑制，那么，十有八九，它具有与本发明的单克隆抗体相同的抗原决定簇特异性。
在一定的情况下，一种同型单克隆抗体就其诊断和治疗效果而言要远优于其它的单克隆抗体。单克隆抗体的特定同型物或可通过从该起始融合体中选择而直接制备，或通过采用同胞选择技术来分离分级转换变体用产生不同同型体单克隆抗体的亲本杂交瘤间接地制备(Steplewski，et al.，Proceedings of National Academy ofSciences，USA，82：888653，1985，Spira，et al.，Joumal ofImmunological Methods，74：307，1984)。因此，本发明的单克隆抗体可包括具有单克隆抗体388F1(由ATCCHB10472所产生)特异性的分级-转换变体。该HB10472细胞系在Rockyille Maryland的美国典型培养保藏中心(ATCC)于1990年6月4日之前已保藏了30年。
本发明所用的术语“抗体”的含义包括完整的分子及其断片，比如能结合该表位决定簇的Fab和F(ab′)2。
本发明的单克隆抗体还可被用在为提纯本文所述不同类型的人GIF的免疫亲和层析中。一种可使这类免疫亲和层析得以应用的方法是，比如，将本发明的单克隆抗体与(NBr-Sepharose-4B，Affigel(BioRad)，或Tresyl-activated Sepharose(Pharmacia)结合。这些同固相结合的单克隆抗体则可从其它蛋白质混合物中特异结合人GIF，使其能分离和提纯出来。该被结合GIF可用本领域普通技术人员所知的技术如，用离液序列高的试剂，低pH，或用脲从该亲和层析材料上洗脱。
在另一实施方案中，本发明提供一种基本上纯的融合多肽R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-R2，其中R1是载体肽，R2是由结构基因编码的一种多肽，X1是Lys或Arg，而X2是任何氨基酸。该“载体肽”或信号序列位于该融合肽序列的氨基末端。在真核生物的情况下，该载体肽被认为起着穿过内质网传输该融合肽的功能。分泌蛋白质则经高尔基体转送进分泌囊中，并进入细胞外间隙，或更好是进入外部环境中。可按本发明选用载体肽，包括含蛋白水解酶识别位点的前一原肽。可接受的载体肽包括降钙素或其它激素的氨基末端前区，该载体肽经受了侧面二元位点的分裂。以识别Lys-Arg分裂位点的激素原转化酶处理原降钙素。然而，应注意的是，本发明不限于用此肽作载体。有类似于本文所述的原降钙素性能的其它载体肽是为本领域中普通技术人员熟知的，或无需作过多的实验便可确定的。
在本发明的一个实施方案中，一种作为信号序列的载体肽被包括在表达载体中，具体位于邻近载体蛋白N-末端之处。此信号序列可使该融合蛋白被导向内质网。一般来说，该信号序列由约16-约29个氨基酸的前导序列组成，以两或三个极性残基开始，接着是高含量疏水性氨基酸，除此而外并无明显已知序列的保留。尽管用于本发明的实施例中的该载体利用了降钙素的前区，但其它能将该融合肽输至该内质网，然后输入外部环境中的信号序列在本发明中将同样有效。这类信号序列是为本领域中的普通技术人员熟知的。
本发明的载体肽包含具有二元改型(Lys-Arg)的蛋白水解酶识别位点，该二元改型(Lys-Arg)在P4和P6位含有附加的Arg/Lys残基。分裂识别位点的不同，意味着存在具蛋白水解特异性的不同的加工酶。优选分裂位点是有序列为X1-X2-X1-X2-Lys-Arg的约6个氨基酸，其中X1是Lys或Arg，而X2是任何氨基酸。此识别位点可产生，由结构基因编码的未所预料的高水平活性蛋白。
识别水解蛋白位点的加工酶的实例包括哺乳动物的酶、毛皮素、酵母前肽加工酶Kex2的同系物和其它的前激素转换酶(PCs)。优选本发明载体肽在该前体的分裂位点处含有一种有编码Arg/Lys-X2-Arg/Lys-X2-Lys-Arg的多核苷酸序列的蛋白水解酶识别位点。
本发明的融合多肽包括由一种结构基因编码的多肽，优选在该融合多肽的羧基末端进行。任何结构基因与该载体和分裂位点一起表达。在表达媒体中结构基因按可操作方式同载体和分裂位点连接，从而使该融合多肽作为单个单元表达。GIF是可被用来产生本发明融合多肽的结构基因的一个例子。
本发明提供一种基本纯的多肽。所谓“基本纯”指的是基本上不含其它蛋白、脂类、碳水化合物或其它随其天然产生的物质的多肽。本领域中技术人员可用标准的蛋白质提纯技术，如采用与该多肽的抗原决定簇结合的单克隆抗体的亲和层析法来提纯此多肽。该基本纯的多肽在聚丙烯酰胺凝胶上产生一条单一的主带。该多肽的纯度也可用氨基末端氨基酸序列分析来确定。只要该多肽的活性保持，则该多肽即包括其功能性断片。含有该多肽生物活性的较小的肽也包括在本发明中。
本发明还提供了编码该融合多肽的多核苷酸。这些多核苷酸包括DNA、cDNA和RNA序列。应理解为，编码全部或部分该融合多肽的所有多核苷酸。只要能编码其裂解产物具生物活性的多肽均可包括在本发明中。这类多核苷酸包括天然产生的，合成的和特意改变的多核苷酸。比如，该多核苷酸可经过指定位点的突变。该多核苷酸序列还包括反意序列和由于基因密码而退化的序列。有20种天然氨基酸它们大部分是由一个以上的密码子编码的。因此，所有的退化核苷酸序列都被包括在本发明中，只要该核苷酸序列编码的融合多肽的氨基酸序列功能不改变均可。
本发明还提供与本发明核苷酸序列互补的多核苷酸。“互补的”核苷酸序列将在能使该互补序列杂交的条件下与特异性的核苷酸序列杂交。这些条件包括温度、pH值、缓冲剂和核苷酸组成。比如，双链DNA分子的正链和负链是互补的核苷酸序列。本发明的多核苷酸包括长度至少为15个(一般为18个或更多的)碱基的片段，该片段选择性地与编码讨论中的多肽的基因组DNA杂交。选择性杂交表示选定某些条件(如温度、pH、缓冲剂)，这些条件可避免核苷酸序列与为其互补体的靶DNA非特异性结合。
可通过几种方法得到本发明的DNA序列。比如，可用本领域中普通技术人员熟知的杂交程序分离该DNA。这包括(但不限于)：1)将探针与基因组文库或cDNA文库杂交来测定共有核苷酸序列；2)表达文库的抗体筛选来测定共有的结构特性；3)通过聚合酶链反应(PCR)来合成。
采用标记的混合合成寡核苷酸探针进行的杂交法对筛选重组体克隆是有用的，其中每个探针与该杂交样品中的特异DNA序列能完全互补，而所述杂交样品包括变性双链DNA的异源混合物。对这类筛选而言，杂交优选在单链DNA或变性双链DNA上进行。杂交在测定下述来源衍生的cDNA克隆方面特别有用，该源即存在与讨论中的多肽相关的极少量mRNA序列之源。换言之，通过采用旨在避免非特异结合的严格的杂交条件，就可能，比如，通过靶DNA与混合物中作为其完整互补体的单个探针的杂交，而进行特异性cDNA克隆的放射自显影观察(Wallace et al.，Nucleic Acid Research，9：879，1981)。
例如，可通过将各种cDNA注射入卵母细胞，使cDNA基因产物有足够的时间表达，并且通过使用抗原非特异性GIF多肽的特异性抗体或使用GIF活性的功能分析来检测是否有所需的cDNA表达产物存在，从而对含抗原非特异性GIF的cDNA文库进行筛选。此外，可用抗原非特异性IgE多肽的特异性抗体从cDNA文库中间接筛选具有至少一个抗原决定簇的抗原非特异性GIF多肽。这类抗体可多克隆地或单克隆地产生，并可用于测定象征抗原非特异性GIF cDNA存在的表达产物。
只要能找到合适的探针，那么依赖于核酸杂交的筛选法，来自任何有机体的任何基因序列都能分离出来。与编码所讨论蛋白序列相应的寡核苷酸探针可化学合成。这要求必须知道氨基酸序列的短的，寡肽的延伸方式。编码蛋白的DNA序列可从基因密码推断出，然而必需考虑该密码的简并度。当简并该序列时，可能进行混合加成反应。这包括变性双链DNA的异源混合物。
产生编码多肽的特异DNA序列可通过：1)从基因组DNA中分离出双链DNA序列；2)化学制备一种能为讨论中的多肽提供所需密码子的DNA序列；3)通过从真核供体细胞分离出的mRNA的逆转录来体外合成双链DNA序列。在后一情况下，最终形成一种mRNA的双链DNA互补体，此双链DNA互补体一般称为cDNA。该三种产生用于重组过程的特异性DNA序列的方法中基因组DNA分离法最少普遍采用，尤其当希望得到哺乳动物多肽的微生物表达时由于存在内含子，则更是如此。
当所需的多肽产物的氨基酸残基的整个序列已知时，DNA序列的合成是常被选择的方法。当所需多肽的氨基酸残基的整个序列未知时，不可能直接合成DNA序列，而所选的方法是合成cDNA序列。分离讨论中的cDNA序列的标准程序是形成由质粒或噬菌体携带的cDNA文库，该文库是由富含具有高水平基因表达供体细胞的mRNA逆转录而生成的。当与聚合酶链反应技术相结合使用时，甚至极少的表达产物也能被克隆。在该多肽的氨基酸序列的主要部分已知的情况下，复制推定存在于该靶cDNA中序列的标记单链或双链DNA或RNA探针的产生，可被用于在已变性为单链形式的cDNA克隆拷贝物上进行的DNA/DNA杂交法中(Jay et al.，Nucl.Acid Res.11：2325，1983)。
用对该多肽特异性的抗体，可从一种cDNA表达文库，如λgt11中，间接筛选人表达具有至少一个抗原决定簇的多肽。这类抗体可多克隆地，或单克隆地产生，并用于测定象征由cDNA编码的蛋白存在的表达产物。
编码本发明该融合多肽的DNA序列，可通过DNA转移进适当宿主细胞中来体外表达。“宿主细胞”是载体可于其中增殖而其DNA可被表达的细胞。该术语也包括该主题宿主细胞的任何后代。应理解所有的后代可能与亲体细胞不相同，因为可能有在复制过程出现的突变。然而，在使用术语“宿主细胞”时，则包括这类后代。稳定转移法，即外源DNA持续地保持于该宿主中，是本领域中已知的。
按照本发明，该多核苷酸序列可被插入重组体表达载体中。术语“重组体表达载体”指的是质粒、病毒或其它本技术领域所知的载体，但这些载体是通过插入或掺入抗原非特异性GIF和载体肽之类的基因序列加以改变过的。这类表达载体含有促进该宿主插入基因序列有效转录的启动子序列。一般，该表达载体含有复制起点，启动子以及可使该转化细胞的表型选择进行的特异基因。适用于本发明的载体包括(但不限于)，在细菌中表达的T7基础表达载体(Rosenberg etal.，Gene56：125，1987)，在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J.Boil.Chem，263：3521，1988)及杆状病毒衍生的在昆虫细胞中表达的载体。该DNA片段可存在于按可操作方式连接于调节因子，如启动子(如T7，金属硫因，或多亲征杂种启动子)的载体中。
编码本发明多肽的多核苷酸序列在原核生物或真核生物中表达。宿主可包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物有机体。本发明优选的宿主是真核生物。在原核生物中表达具有真核或病毒序列的DNA序列的方法在本领域中是公知的。能在宿主中表达和复制的生物学上有功能的病毒和质粒DNA载体在本领域中也是已知的。这类载体被用来掺合本发明的DNA序列。优选本发明的宿主细胞自然地编码识别融合蛋白的分裂位点的酶。然而，如果表达所需融合多肽的该宿主细胞本来不具有识别该分裂位点的酶，那么编码这类酶的基因序列可随同该融合蛋白的多核苷酸序列一起被共同转染到该宿主细胞中。
带有重组体DNA的宿主细胞的转化可通过本领域中普通技术人员熟知的常规技术进行。在宿主是原核细胞，如E.coli的情况下，可用本领域中公知的方法在指数生长期后收获细胞，再用CaCl2处理，制备具有DNA摄取能力的适宜细胞。另外，也可使用MgCl2或RbCl。转化也可在形成该宿主细胞的原生质体后，或用电穿孔完成。
当该宿主是真核细胞时，磷酸钙共沉积之类的DNA转染法，常规的机械法(如微注射)，电穿孔包在脂质体中的质粒插入或病毒载体都可用。真核细胞可被编码本发明融合多肽的DNA序列，和编码可选择性表型，如单纯泡疹胸腺嘧啶激酶基因的第二异源DNA分子共同转染。其它的方法是采用一种真核病毒载体，如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒瞬时感染或转化真核细胞并表达该蛋白(EukapryoticViral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。
分离和提纯微生物或真核细菌表达的本发明多肽的技术，可以是通过任何常规手段，如制备层析分离和免疫学分离(如那些涉及利用单克隆或多克隆抗体的)来进行的技术。
上述公开内容一般性地描述了本发明。参考下面特定实施例将能得到更完整的理解，但这些实施例仅出于说明的目的，而并不以此限制本发明的范围。
                  实施例1制备产生人抗原特异性糖基化抑制因子(GIF)的杂交癌细胞系及提纯技术A.抗原
冷冻干燥的，来源于蜂毒的磷脂酶A2(PLA2)购自SigmaChemical Co(St Louis，Mo)。用King等人所述的方法(Arch.Biochem and Biophys.，172：661，1976)制备变性PLA2(-PLA2)及溴化氰处理PLA2。为制备D-PLA2，将5mg PLA2溶于0.1M的Tris HCl缓冲液中(pH8.6)，然后在有5mg/ml二硫苏糖醇存在时，于6M胍HCl化物中变性处理。在室温下18小时后，用碘乙酸将巯基羧甲基化。将该变性蛋白以0.02M的乙酸渗析，然后在-40℃下保存直至使用。为分裂PLA2中的蛋氨酸键，将10mg蜂毒PLA2溶于0.4ml蒸馏水中，然后加1.2ml含100mg CNBr的甲酸。在室温下2小时后，用H2O将此混合物稀释2倍，然后于Speed Vac中冷冻干燥。按制造商推荐的程序将天然PLA2与Tresyl活化的Sepharose(Pharmacia)偶联。除另有规定，一般是1mg蛋白与1mlSepharose偶联。B.抗体
提纯的人E骨髓瘤蛋白PS，得自杂交瘤H-1 DNP-E-26的单克隆鼠IgE(Liu，et al.，J.Immunol.，124：2728，1980)及抗-CD3单克隆抗体(OKT3)是先前发表的文章(Carini et al.，J.Immunol，Methods，127：221，1990)所述的相同制品。Dr.J.DeVries(DNAX Instituet of Molecular and Cellular Biology，Palo Alto.CA)善意提供含单克隆抗T-细胞受体αβ，WT31C(Spits，et al.，J.Immunol.，135：1922，1985)的腹水。抗兔脂调节素14189(Iwata，et al.，J.Immunol.，132：1286，1984)的小鼠单克隆抗体是与先前发表的文章(Askasaki，et al.，J.Immunol.，131：3172，1986)中所述的同样制品。专门提纯的抗小鼠IgG的，含有抗重(γ)链和抗轻链的山羊抗体先前已被陈述(Suemura，et al.J.Immunol，125，148，1980)。荧光素处理过的山羊抗小鼠IgG抗体购自Cappel。人IgG和抗脂调节素抗体(141B9)与CL-Sepharose 4B偶联；约5mg蛋白与1ml Sepharose偶联。C.细胞系
在富含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，50μM2-巯基乙醇和抗生素的RPMI1640培养基中培养RPMI8866成淋巴样细胞。小鼠T-细胞杂交瘤12H5细胞(Iwata等人，J.Immunol，140：25341988)被保持于前文(Huff，et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.，USA，129：509，1982)所述的高葡糖Dulbecco改良的Eagle′s培养基(DMEM)中。一种人成淋巴样细胞系CEM(BUC)细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏突变体从前已叙述过(Huff & Ishizaka，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：1514，1984)。D.细胞培养及杂交瘤的构建。
从对蜜蜂毒素过敏的患者中得到外周血，然后在Ficoll-Paque(Pharmacia)上离心分离得到该血的单核细胞(PBMC)。为激活抗原引发T-细胞，将PBMC悬浮于RPMI1640培养基中，浓度为3×106成核细胞/ml，然后在有10μg/ml D-PLA2或CNBr处理的PLA2存在时培养3天。回收非附着细胞，再悬浮于新鲜的培养基中(2×105细胞/ml)，然后用60单位/ml提纯的IL-2层析提纯的人IL-2，Electro-nucleonics，Silver Spring，MD)在有由Dr.J.Browning and B.Pepinsky(Biogen)善意提供的3μg/ml重组体人脂皮质素存在时培养4天。
为构建T-细胞杂交瘤，将用IL-2繁殖的1.2×107T-细胞与两倍数的BUC细胞(CEM的亚系)相混合。将被混合的细胞一起制成小球，然后通过聚乙二醇(1300-1600MW，Sigma)而融合。细胞融合的详细程序在先已被描述过(Huff.et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.81：1514，1984)。在含次嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)的DMEM中使细胞重悬浮，然后在96井板的每个井中接种5×104个细胞。杂交克隆以一周两次传代培养保持于完全DMEM中。为了刺激该T-细胞杂交瘤，细胞用8μg/ml OKT3在0℃处理40分钟，然后将该抗体处理的细胞(1×106/ml)接种于Limbro组织培养小井中(Flow Labs，McLean，VA)，该井已涂覆以10μg/ml抗-MGG3。经24小时培养后得到培养物上清液。E.测定CD3和TcR
于0℃，将杂交瘤细胞(1×106/样品)与8μg/ml OKT3或含抗-TcRαβ(WT31)，用含5％FCS和10μM NaN3的RPMI1640培养基按1∶1000稀释过的腹水一起保温40分钟。作为对照物，用同样浓度的小鼠IgG2a(Becton-Dickinson，同型对照物)处理相同细胞的等分试样。用含5％FCS的PBS将此细胞洗两次，然后用荧光素处理的抗小鼠IgG培养40分钟。洗涤后，用得自BectonDickinson的FACScan分析带有荧光的细胞。
利用包被有抗小鼠IgG的牛红细胞进行玫瑰花结试验鉴别CD3+杂交瘤细胞。用Wilhelm等人的方法(J.Immunol，Methods，90：89，1986)将抗体与红细胞偶联。简言之，用盐水将0.5ml装入的牛红细胞洗4次，然后重悬浮于0.75ml的0.5μg/ml提纯抗-MGG中；25μl的CrCl3(16.5mg CrCl3溶于5ml盐水)在轻柔的混合条件下被加至该细胞的悬浮液中，然后在30℃将该细胞悬浮液培育1小时。用盐水将此抗MGG结合的红细胞洗4次，然后再悬浮于5ml FCS中(约1×109红细胞/ml)。为测定CD3+细胞，将106杂交瘤的小球悬浮于含5％FCS和8μg/ml OKT3的80μl DPBS中。在0℃下45分钟后，将该细胞洗2次，再悬浮于80μl DPBS-5％FCS中，，然后将20μl抗MGG-包被的红细胞悬浮液和龙胆紫加至该悬浮液中。该混合物在200g条件下离心处理5分钟，然后将该离心管在0℃下培育2小时。将管中沉淀慢慢再悬浮，然后在显微镜下检测玫瑰花状细胞。F.CD3+细胞的富集
将用8μg/ml OKT3处理过的杂交瘤细胞(1.5×105细胞)与抗MGG结合的红细胞(约4×106红细胞)混合，通过上述方法形成玫瑰花状。将沉淀重悬浮，并施加于由60％和50％Percoll层构成的Percoll梯度的顶端。以1200RPM(700g)于室温将试管离心处理20分钟。用培养基将沉淀细胞洗两次，然后用0.83％NH4Cl缓冲液于0℃处理1分钟而将红细胞溶解。用DME培养基洗此细胞并将其重悬浮于该DME培养基中，然后培养以扩大该细胞种群。
通过细胞分拣进行进一步的CD3+细胞富集。将杂交瘤细胞用OKT3处理，再用荧光处理的抗-MGG染色。通过用FACSTAR(Becton-Dickinson)进行的细胞分拣选择染色阳性的细胞。G.提纯和测定IgE-BF
将T细胞杂交瘤的培养上清液经Diaflo YM100膜(Amicon Corp.Lexington，MA)过滤，滤液用YM5膜超滤而被浓缩10倍。用已介绍过的程序(Isnikaza & Sandberg，J.Immunol.，126：1692，1981)，用IgE结合的Sepharose提纯该滤液中的IgE-BF。按前述的方法(Kisaki，et al.，J.Immunol.，138：3345，1987)通过用人IgE-包覆的牛红细胞(E-IgE)对FcεR+B成淋巴样细胞系，RPMI8866细胞的玫瑰花结形成的抑制作用，评估培养物滤液中，或得自IgE-Sepharose的酸性洗脱液级份中的IgE-BF的存在。玫瑰花结形成细胞(RFC)与300RPMI8866细胞的比例分三次测定并以平均值±SD表达。
除用兔IgE包覆的牛红细胞作指示细胞外，通过同样的程序测定由12H5细胞形成的啮齿动物IgE-BF，而且用Nipportronngylusbrasiliensis感染的Lewis种鼠的隔膜淋巴节细胞被用作FcεR+B细胞源(Yodo & Ishizaka，J.Immunol.，124：1322，1980)。H. GIF的检测
利用T-细胞杂交瘤12H5细胞检测GIF(Iwata，et al.，J.Immunol.，140：2534，1988)。将该杂交瘤细胞的悬浮液与等体积的检测试样混合，然后将该细胞悬浮液用10μg/ml鼠IgE培养24小时。经CF50A膜过滤培养物上清液，含IgE-BF的滤液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级(Yodoi，et al.，J.Immunol.，125：1436，1980)。未结合的蛋白(流出物级分)和用0.2Mα甲基甘露糖苷洗脱的蛋白(洗脱物级分)均用玫瑰花结抑制技术评价IgE-BF的存在。当12H5细胞单用小鼠IgE培养时，通过该细胞形成的IgE-BF基本上全部与小扁豆植物凝血素Sepharose结合，然后用α基甘露糖苷洗脱而回收。这样，流出物/洗脱物级分间的玫瑰花结抑制百分比小于0.2。若将足量的GIF和小鼠IgE一起加到该12H5细胞培养物中，则大多数由该细胞形成的IgE-BF缺乏对小扁豆植物凝血素的亲和性，而都被回收到流出液级份中去(Iwata & Ishizaka，J.Immunol.，141：3270，1988)。因此，如果该流出物/洗脱物级分间的玫瑰花结抑制百分比为3.0或更高，则GIF记为(+)。I.GIF分级
为了确定得自杂交瘤的GIF是否对蜂毒PLA2有亲和性，将杂交瘤细胞的培养物滤液在抗原偶联的Sepharose上分级。用OKT3抗体(8μg/ml)处理杂交瘤细胞并将处理过的或未处理过的抗体细胞悬浮液8ml等分试样(1.5×106细胞/ml)在抗MGG涂覆的组织培养瓶中培养。将培养物悬浮液浓缩4倍，然后用0.4ml IgE-Sepharose吸附2ml试样。将流出物级分与0.5ml PLA2-Sepharose混合过夜，并将免疫吸附剂充填到小柱中。回收流出物级分后，用DPBS洗此柱，再用10ml甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱。通过先前所述的程序(Akasaki，et al.，J.Immunol.，136：3172，1987)在抗脂调节素(141B9)Sepharose上进行GIF部分提纯。J.确定磷脂酶抑制活性
按先前所述的程序(Uede，et al.，J.Immunol.，139：898，1983)用碱性磷酸酶处理亲和性提纯过的GIF。简言之，将1ml该制品用Tris-HCl缓冲液透析(pH8.2)，然后于室温与1单位不溶性碱性磷酸酶(小牛肠的，Sigma)混合2小时。离心分离后，将该上清液用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析。该经处理的碱性磷酸酶试样的磷脂酶A2抑制活性用以3H-油酸生物合成标记的E.coli和猪胰PLA2(Sigma)确定(Rothut，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，117：878，1983)。详细的方法载于Ohno等的文章中(Internat.Immunol.，1：425，1989)。简言之，猪胰PLA2(1×10-5单位)与GIF以150μl的总体积混合。于25℃，5分钟后，添加50μl3H-标记的E.coli(5000cpm)悬浮液，而后将此混合物于25℃培育5分钟。通过添加50μl2M HCl停止此反应，而后向该混合物中加50μl100mg/ml BSA。置于5500g条件下将此悬浮液离心分离1分钟。用闪烁光谱测量250μl上清液中的放射性。K.离子交换柱层析法
在无血清介质中的AC5细胞培养物上清液通过超滤被浓缩100倍。以10000rpm离心分离20分钟后，用蒸馏水将上清液稀释8倍，再用Tris调到pH8.0，而后立即于DEAE-Sepharose CL-6B(Pharmacia)柱上样(体积3ml)(该柱用10mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡过)。回收流出物(经其流过的)级分后，用4柱体积的10mM Tris-HCl缓冲液(含20mM NaCl)洗此柱，而后将洗液与该流过级分合并。用4柱体积pH8.0的10mM Tris-HCl缓冲液(分别含50mM、75mM、100mM、150mM和200mM NaCl)依次洗脱与此柱结合的蛋白。将各洗脱液级分浓缩并用Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)透析。L.凝胶过滤
将1ml于DBPS中的试样于与HPLC(Beckman System Gold)相连的Superose12柱(1.6×50cm，Pharmacia)上样。从该柱上用DPBS，以1ml/分的流量将蛋白洗脱，而后收集适宜的级分。该柱用人IgE(PS蛋白，MW：185000)，牛血清清蛋白(BSA，MW：67000)，卵蛋白(MW：43000)，大豆胰蛋白酶抑制因子(MW：20100)及细胞色素C(MW：12500)标定，除IgE外，全部标准蛋白均得自Sigma。标准蛋白的滞溜时间分别为41.97，52.08，55.135，62.097和71.67分。M.GIF的亲和性提纯
通过超滤将于完全DME培养基中的CL3克隆培养物上清液浓缩5倍，使该上清液经免疫吸附剂柱(5ml体积)循环过夜而将该上清液中的GIF吸附于141B9-Sepharose或抗-GIF Sepharose上(Iwata.，et al.，J.Immunol.，141：3270，1988)。用20柱体积DPBS洗此免疫吸附剂，而与吸附剂珠粒结合的蛋白则用pH3.0的0.1M甘氨酸HCl缓冲液洗脱而回收。得自231F1细胞的鼠GIF利用14189-Sepharose以同样方法提纯。
为了分离无蛋白培养基中的AC5细胞培养物上清液中的GIF，用超滤液将此上清液浓缩50-100倍。将得自DEAE-Sepharose柱的合宜的该上清液的级分浓缩至5-6ml，而后和与单克隆抗GIF抗体偶联的1.0-1.5ml Affigel10-免疫吸附剂，在4℃下混合过夜。该悬浮液被填充入小柱中，而该免疫吸附剂用40柱体积的DPBS洗涤。在某些实验中，该免疫吸附剂用40柱体积DPBS和20柱体积的含0.5M NaCl的PBS洗涤。与该免疫吸附剂结合的蛋白用含0.15M NaCl，pH3.0-3.2的0.05M甘氨酸HCl缓冲剂洗脱。N.用SDS-PAGE检测GIF
将经亲和性提纯的GIF对溶于去离子水中的0.01％SDS透析，而后在Specd vac(Savant Instruments，Hicksville，NY)中冷冻干燥。采用Laemmli系统(Laemmli，U.K.Nature，227：680，1970)以15％聚丙烯酰胺凝胶板进行SDS凝胶电泳分析试样。将凝胶固定，通过银染色(Ochs，et al.，Electrophoresis，2：304，1981)检测蛋白带。分子量标准物自Pharmacia获得。O.ELISA分析
为检测单克隆抗GIF抗体，采用稍加改变的，Steele等人所述的方法(J.Immunol.，142：2213，1989)。简言之，用100μg，以0.1M碳酸盐涂覆缓冲液(pH9.6)稀释的经亲和提纯的GIF，将Immulon1板(Dynatech)涂覆过夜。用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)在以下步骤的每一步之间将板洗3次。用PBS中的2％BSA将板封闭6-9小时。100微升每种试样然后被加至板中各井中，在4℃将板保持过夜。用碱性磷酸酶结合的山羊抗小鼠Ig(Zymed Lab，So.San Francisco.CA)及碱性磷酸酶底物(Sigma)检测小鼠Ig与该板的结合。加底物后，30分钟，以410nm滤光器于微板阅读器MR5000(Dynatech Lab)中读到ELISA信号。用ELISA分析，采用小鼠mAb同型物药盒(Zymed Lab)确定单克隆抗体的同型物。
为了测定亲和性提纯GIF制品级分中的GIF，一种生物素-抗生物素蛋白系统及放大法(Stanley et al.，J.Immunol.Methods，83：89，1985)被用来提高灵敏度。Maxi-Sorp微滴板(Nunc.Copenhagen，Denmark)用50μl各级分涂覆。在37℃2小时培育后，用Tween/PBS洗板，再用2％BSA于4℃封闭过夜。洗涤后，将50μl生物素结合的mAb141B9(200ng/ml)加至板中各井中，而后将板于37℃培育2小时。洗此板，而后向各井加50μl抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶共轭物的1∶1500稀释液(Zymed Lab)。37℃1小时培养后，通过放大系统(Stanley，et al.，J.Immunol.Methods，83：89，1985)(GIBCO-RBL，Bethesda，MD)测量与各井结合的碱性磷酸酶的量。ELISA信号于490nm波长处测定。
              实施例2
产生人抗原特异性GIF的杂交瘤的特征描述
如上所述，在有10μg/ml D-PLA2存在时，将对蜜蜂毒素敏感患者的PBMC培养3天，而后将激活的T-细胞在有3μl/ml重组体脂皮质素存在时，通过IL-2繁殖4天。然后将T-细胞与BUC细胞融合以构建杂交瘤。在此实验中，得到4个杂交瘤克隆。在完全DMEM中培养每个杂交瘤克隆，而后经YM100膜过滤培养物上清液。将滤液浓缩10倍，而后用12H5细胞估测GIF的存在。表1中所示的结果表明：4个杂交瘤克隆的2个主要分泌GIF。
            表I
        选择产生GIF的杂交瘤
                          3H-油酸释放   c
          GIF活性a       释放       抑制
杂交瘤    流出物/洗脱液   (cpm)      (％)
Cl1        0/26(-)         NO         -
Cl2        2/33(-)         390±27    4
Cl3        29/0(+)         257±25    37
Cl7        27/5(+)         303±17    26
对照组     0/31b          408±15    -a 每种克隆的培养物滤液被浓缩10倍。将1体积此滤液加至等体积的12H5细胞悬浮液中。然后该细胞在有10μg/ml小鼠IgE存在时培养24小时。该列中的数字代表小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱液级分的玫瑰花结抑制百分数。在不存在IgE-BF的情况下，IgE-RFC的比例为24.4±0.3(SD)％。b 单独用10μg/ml小鼠IgE培养12H5细胞，而后在小扁豆植物凝   血素Sepharose上将该培养物滤液分级。c 在141B9-Sepharose上将培养物滤液分级，而将得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液浓缩至原培养物上清液体积的1％。该试样用碱性磷酸酶处理，而后测定脱磷酸物质而得出抑制胰磷脂酶A2的能力。
用荧光细胞测量法和玫瑰花结实验技术估评CD3决定簇在该杂交瘤克隆CL3上的存在。该细胞用8μg/ml单克隆抗体OKT3处理，而后用荧光素化的山羊抗小鼠Ig染色。小于总细胞数10％的细胞被染色。还发现，仅有6-8％OKT3处理细胞同抗MGG结合的红细胞形成玫瑰花结。因而用实施例1中所述的玫瑰花结试验方法富集CD3+细胞。通过在Percoll层上的密度梯度离心作用将与抗MGG结合的红细胞形成玫瑰花结的细胞与不形成玫瑰花结的细胞分离，而后在DMEM中培养而扩增。将同样的程序重复3次，以富集CD3+细胞种群。用OKT3抗体处理最终细胞制品，随后用抗MGG包覆的红细胞培育表明80-90％的该细胞种群形成了玫瑰花结。约75％的该细胞被OKT3以细胞荧光测量法染色。然而，若培养该细胞两周经四代繁殖导致CD3+细胞衰减至约52％(以细胞荧光测量法测定)，则通过细胞分拣和通过培养使该细胞扩增，而使CD3+细胞种群进一步富集。在重复细胞分拣两次后，得到了稳定表达CD3的CL3种群。以OKT3和WT31(抗TcRαβ)进行该种群荧光染色表明，基本上100％的细胞表达CD3，而大部分细胞表达TcRαβ。将CD3+细胞种群和CD3-种群培养，利用12H5细胞估评培养物滤液中GIF的存在。GIF的活性在CD3+细胞培养物滤液中测得，而不能在CD3-种群的培养物滤液中测得。此结果表明GIF的来源是CD3+细胞。
由于小鼠GIF的特殊性能之一是，单克隆抗脂调节素(141B9)结合淋巴因子，所以决定应测定得自CL3细胞的人GIF是否被141B9结合的Sepharose吸附。培养CD3+、CL3克隆产生1升培养物上清液。经YM100膜过滤后，该滤液被浓缩至5ml，而后在1ml141-B9Sepharose上分级。回收该流出物级分后，用10柱体积DPBS洗此免疫吸附剂，而后用5柱体积pH3.0的甘氨酸-HCl缓冲液洗脱。对DPBS透析之后，利用12H5细胞来确定各级分中GIF活性物分布。表II所示的结果表明培养滤液中基本上全部GIF活性物都与141-B9Sepharose结合，而且可于酸性pH条件下洗脱而回收。
                       表II
         得自经抗脂调节素Sepharosea亲和性
             层析提纯的CL3克隆的人GIF得自141B9-                                   GIF活性cSepharoseb的级份   稀释度                 流出物/洗脱液流出物              1∶10                     0/31(-)洗脱液              1∶10                     0/35(-)洗涤液              1∶10                     42/0(+)
                1∶40                     45/0(+)
                1∶80                     39/0(+)培养基对照          -                         0/34a CL3克隆的培养物上清液经YM100膜过滤，滤液被浓缩200倍。取5ml该浓缩滤液在1ml141B9-Sepharose上分级。b 回收流出物级分后，该免疫吸附剂用5柱体积的DPBS洗涤，而后用5柱体积pH3.0的甘氨酸HCl缓冲液洗脱。c 采用12H5细胞，以同于表I所述程序测定GIF活性，该列中的数字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱液级分的玫瑰花结抑制百分比。不存在IgE-BF时，IgE-RFC的比例在此检测中为22.9±0.6(SD)％。(+)表示存在GIF。
先前的实验提供了证据：鼠GIF是一种磷脂酶抑制蛋白的磷酸化衍生物(Uede，et al.，J.Immunol.，139：898，1983)。因此，CL3克隆的培养物滤液中的GIF，可利用141B9-Sepharose提纯。其它三个克隆CL1、CL2、CL7的培养物滤液在该141B9-Sepharose上以相似的方式分级。得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液，用碱性磷酸酶处理，然后评价抑制由胰磷脂酶A2生物合成标记E.coli释放3H-油酸的能力(Rothut，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun，117：878，1983)。表I中所包括的结果表明，得自CL3和CL7经亲和性提纯的GIF具有磷脂酶抑制活性，而得自CL1和CL2的相同馏分却不能抑制磷脂酶A2。
                    实施例3
              GIF的抗原结合性能
先前的实验已表明：用IL-2，在有脂皮质素存在时繁殖的抗原激活T细胞，基本上释放出对蜂毒PLA2无亲和性的GIF，但CD3在同样细胞上的交联则导致与抗原结合的Sepharose有亲和性的GIF连同IgE-BF一起形成(carini.et al.，J.Immunol.Meth，127：221，1990)。基于这种发现，决定测定该CL3克隆是否产生抗原结合的GIF和IgE-BF。用OKT3于0℃处理此细胞，并将此抗体处理过的细胞(1.5×106细胞/ml)在抗MGG涂覆的小井中培养。作为对照物，将未处理的CL3细胞在该抗-MGG涂覆的小井中培养。经YM100膜过滤培养物上清液，而后用超滤将其浓缩7倍。用1ml IgE-Sepharose吸附此浓缩培养物滤液过夜，而后将2ml洗液和未结合的蛋白级分合并。彻底洗涤此IgE-Sepharose，再用甘氨酸HCl缓冲液洗脱。采用RPMI8866细胞作FcεR+细胞源，对该从IgE-Sepharose洗脱的级分作IgE-BF存在分析。
                      表III
          得自CL3克隆的GIF不能与蜂毒PLA2结合
                 PLA2-Sepharose中的GIF活性c处理a IgE-BFb   流出物     洗液      洗脱物
    (％)OK3     23        34/0(+)    21/0(+)    0/24(-)
    0         28/0(+)    22/13(±)  0/26(-)a 未处理的或CD3处理的细胞在抗MGG涂覆的井中培养。b 30ml培养物上清液经YM100膜过滤，将滤液浓缩至4ml。用1.0mlIgE-Sepharose吸附此试样。酸性洗脱物级分被调到4.0ml，而后通过玫瑰花结抑制试验作IgE-BF测定。不存在IgE-BF时的IgE-RFC比例为37.7±1.0％。c 1.0ml得自IgE-Sepharose的流出物级分在PLA2-Sepharose上分级。该流出物、洗液和酸性洗脱液级分被调到1.3ml，然后使用12H5细胞作GIF活性测定。该列中的数据表示小扁豆植物凝血素Sepharose上的流出物/洗脱物级分对玫瑰花结的抑制百分比。在无IgE-BF的情况下IgE-RFC的比例为21.7±0.6(SD)％。
表III所示的结果表明：抗-CD3-处理细胞形成IgE-BF，而非处理细胞则不能产生可检测量的IgE-BF。得自IgE-Sepharose的流出物级分被浓缩两倍，而后将1ml试样在0.25ml PLA2-Sepharose上分级该流出物，洗液和洗脱液级分被调到1.5ml，而后对样品作GIF活性评价。如表III中所示。得自未刺激的和抗-CD3-处理细胞的GIF都不能与PLA2-Sepharose结合。
人们认为得自抗-CD3-处理CL3细胞的GIF不与PLA2结合，可能与使用D-PLA2激活T-细胞有关。为了研究这种可能性，构建更多的蜂毒敏感患者的PBMC的T-细胞杂交瘤。这些T-细胞杂交瘤构建的方法与上述方法相同，只不过PBMC是用10μg/ml CNBr处理的PLA2，而不是用D-PLA2来刺激。该实验结果，得到22个杂交瘤克隆。对每个克隆培养物滤液的GIF分析表明，22个克隆中的10个都形成了GIF(结果未示出)。七个分泌GIF的克隆被用OKT3处理，而该抗体处理的细胞在抗-MGG涂覆的皿中培养。培养物滤液被浓缩4倍，然后用IgE-Sepharose吸附。
                  表IV
        以抗CD3处理的杂交瘤细胞a形成抗原结合的GIF
                               PLA2-Sepharosec中的GIF活性
克隆           IgE-BFb          流出物         洗脱液
                (％)
AC5              20              0/21(-)         31/0(+)
AF10             36              19/0(+)         0/21(-)
BA6              8               29/0(+)         0/24(-)
BE12             65              0/31(-)         25/0(+)
BF5              65              0/27(-)         20/0(+)
CB7              64              0/28(-)         17/0(+)
CE5              58              0/28(-)         35/0(+)a 1.2×107细胞用OKT3处理。细胞被再悬浮于8ml培养基中，而后接种于抗MGG涂覆的瓶中。培养物上清液被浓缩4倍，然后用IgE-Sepharose吸附。得自IgE-Sepharose的流出物则在PLA2-Sepharose上分级，而后测定流出物和洗脱液级份中的GIF活性。b 将得自IgE-Sepharose的酸性洗脱液级份进行IgE-BF存在分析。在无IgE-BG时，IgE-RFC的比例为26.3±0.6(SD)％。c 使用12H5细胞确定GIF活性。数据代表流出物/洗脱液级分(得自小扁豆植物凝血素Sepharose)对玫瑰花结抑制的百分比。在无IgE-BF时，IgE-RFC的比例为26.0±0.7(SD)％。(+)表示存在GIF。
如表IV中所示，得自7个克隆中6个的IgE-Sepharose酸性洗脱液级份含可检测量的IgE-BF，而后得自IgE-Sepharose的流出物级份在PLA2-Sepharose上分级，并将得自该免疫吸附剂的流出物和洗脱液级分作GIF活性测定。表IV中所示结果表明：7个克隆中的5个的GIF大部分与PLA2-Sepharose结合，并于酸性pH值条件下洗脱回收。为了证实CD3的交联对这些克隆产生抗原结合GIF是必要的，则将5个克隆在抗MGG包覆的细胞中培养而不用抗CD3处理。正如所预料的那样，培养物上清液不含IgE-BF，而该上清液中的GIF不能与PLA2-Sepharose结合。
本发明提供一种技术，它可使源自对蜂毒PLA2过敏患者的PBMC的产生GIF T-细胞种群得以开发，而且从该T细胞构建产生GIF的杂交瘤。代表性的杂交瘤表达CD3决定簇和TCRαβ，这表明：它们是T-细胞杂交瘤。此外，该杂交瘤上的TcR复合体看来是功能性的。亲体T-细胞(Carini，et al.，J.Immunol.Methods，127：221，1990)和该产生GIF的杂交瘤(表III、IV)在部份于基于CD3的交联而产生IgE-BF。通过单克隆抗体WT31和抗MGG的TcRαβ或CL3和AC5克隆的交联也导致了IgE-BF的形成(结果未示出)。代表性的CD3+杂交瘤的进一步检测表明：全部CL3、BE12、AC5及CB7克隆都表达CD4和CD8。由于用于构建该杂交瘤的BUC细胞是CD4+CD8-(来自Dr.J.Stobo的私人交流)，尚不清楚该杂交瘤的亲体T-细胞是否共表达CD4和CD8。
本实验表明：由于CD3在细胞上的交联，某些T-细胞杂交瘤产生结合抗原(PLA2)的GIF。此发现与这样的事实相一致：代表性的形成GIF的鼠杂交瘤，由于抗原激发的同源巨噬细胞的刺激，或细胞上的CD3交联，形成了结合抗原的GIF(Iwata&Ishizaka，J.Immunol.，141：3270，1988，Iwata et al.，J.Immunol.，143：3917，1989)，而且提示得自该两个种类的结合抗原的GIF间具有相似性。在鼠体系中，得自该杂交瘤的结合抗原的GIF以载体(抗原)特异性方式抑制体内的抗体反应。还发现来自该杂交瘤的结合抗原的GIF由结合抗原的多肽链和非特异的GIF组成(Jardieu andIshizaka，in Immune Regulation by Characterized Polypeptides，G.Goldstein，et al.，ed.Alan.R.Liss，New York，p.595，1987)，而且该结合抗原的链与效应子型的抑制T-细胞因子(TseF)的该链共用-共同的抗原决定簇14-12(Iwata，et al.，ibid，1989)。分别所作实验已表明，单克隆抗脂调节素抗体141-B9及抗-1-J抗体不仅结合GIF，而且还结合TseF和TsiF的非抗原结合链(I-J+链)(Jardieu，et al.，J.Immunol.，138：1494，1986，Steele，et al.，J.Immunol.，142：2213，1989)。这些发现综合起来提示：该结合抗原的GIF与TseF相同。代表性的鼠Ts杂交瘤71B4的亲体T细胞是通过接触过OVA的脾细胞，借助同源抗原的刺激而获得，接着在有GIF存在时，将该抗原激活的T细胞繁殖(Iwata&Ishizaka，J.Immunol.，141：3270，1988)。同样的方法被用于在本实验中获取人T-细胞杂交瘤的亲体细胞。实际上，得自人杂交瘤的非特异GIF和PLA2结合GIF都与141B9-Sepharose结合，先前的研究已表明，141B9-Sepharose也吸收鼠TsFs(Steele，et al.，J.Immunol.，142：2213，1989)。可能是，得自人T-细胞杂交瘤的结合PLA2的GIF代表人抗原特异性TseF。然而，仍然可能的是，该结合抗原的GIF可能是鼠TsiF的一种配对物。我们实验室的近期研究表明：典型的鼠辅助T-细胞克隆D10.G4.1可产生结合抗原的GIF，如果该细胞在有磷脂酶A2抑制因子存在时，经预培养而后被抗原(伴清蛋白)激发的抗原呈递细胞刺激的话(Ohno，et al.，Internat.Immunol.，2：257，1990)。还发现，这种结合抗原的GIF与对TsiF特异性的单克隆抗体14-30结合，(Ferguson and Iverson J.Immunol.，136：2896，1986)而不是与单克隆抗体14-12结合。Green等人(J.Mol.Cell Immunol，3：95，1987)还报导：由于UV-辐照的抗原激发的巨噬细胞的刺激，D10.G4.1克隆产生结合抗原的TsF，并报导：这种因子和附属的分子一起诱发效应基因型抗原特异性Ts的产生。由于得自过敏患者的PBMC含有辅助T-细胞，所以仍有可能的是，得自人杂交瘤的该结合抗原的GIF代表TsiF，而不是TseF。
Takeuchi等人(J.Immunol.，141：3010，1988)构建了得自已接触抗原KLH的个体的PBMC的Ts克隆，该个体已接受了大剂量同源抗原的重复注射。Modulin等人(Nature，322：459，1986)也构建了得自结节性麻疯患者的侵蚀斑的Ts克隆。然而，在本发明之前，效应基因分子介导的，源自人Ts细胞的抑制活性物(TsT)尚未被鉴别出来。人GIF和鼠GIF间的相似性提示得自人T-细胞杂交瘤的结合PLA2的GIF可代表得自人抑制T细胞的TsF。产生结合抗原的GIF的该T-细胞杂交瘤将便于该分子的生物化学的特征描绘。在小鼠中已反复证明：Ts以及TsF(结合抗原的GIF)在活体内抑制IgE抗体反应比抑制IgG抗体反应更有效(Ishizaka et al.，J.Immunol.，114：110，1975)。如果得自人T-细胞杂交瘤的结合过敏原的GIF实际上代表TsF，则有理由期望该T-细胞因子可抑制亲体T-细胞供体的IgE抗体反应。
                   实施例4
      制得产生杉树花粉特异性GIF的杂交瘤细胞系
在日本，日本杉花粉是主要的过敏原，它在人群中高比例地引起季节性的过敏性鼻炎和结膜炎。为进一步检验本发明的技术对其它抗原的通用性，将生成产生抗原特异性GIF的T-细胞和T-细胞杂交瘤的方法(如上所述)应用于取自对日本杉过敏原过敏患者的外周血单核细胞中。
在日本杉(Sugi，Cryptomeria japonica)中的主要过敏原是称为cryj-1的40KDa糖蛋白(Yasueda，et al.，Allergy and Clin.Immunol.，71：77，1983)。为了这些研究，将该过敏原从杉花粉提取物中，以稍加改动的该方法分离出来。简言之，花粉用乙醚脱油，然后用0.125M的碳酸氢铵萃取3次。萃取物中的碳水化合物用溴化十六烷基三甲铵去除。该提取物中的蛋白用80％的饱和硫酸铵沉淀，然后将此沉淀物溶于0.05M pH7.8的Tris-HCl缓冲液中。在彻底用Tris-HCl缓冲液透析后，将此蛋白部分于DEAE纤维素柱(DE-52，Whatman)上样，然后得到流过物级分。该级分经浓缩，以0.01M，pH5.0的乙酸盐缓冲液透析，然后于CM纤维素柱(CM-52，Whatman)上样，该柱是已用该缓冲液平衡过的。用该缓冲液洗此柱，而保留在柱中的蛋白用0.1M含0.3M氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱。该洗脱液中的蛋白通过Sephacryl S-200HR柱的凝胶过滤分级而得到含cryj-1的主要蛋白级分。在此馏分中的主要蛋白是42KDa，这是由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而确定的，而且该蛋白的N-末端氨基酸序列与cryj-1的序列相同。该蛋白以1.5mg/ml凝胶的量与Affigel10结合。
一种合成的磷脂酶A2抑制因子，2-(P-戊基肉桂酰基)-氨基-4-氯苯甲酸(ONO-RS-082，ONO Pharmaceutical Co.)被用来代替重组体人脂皮质素。先前的实验已表明：ONO-RS-82是磷脂酶A2的特异抑制因子，而且有利于在小鼠脾细胞培养中生成产生GIF的细胞(Ohno，et al.，International Immunology，1：425，1989)。当已接触过卵请蛋白的小鼠脾细胞被卵清蛋白刺激，而且抗原激活的T-细胞用IL-2在有2μM ONO-RS-82，或3μg/ml重组体人脂皮质素存在下繁殖时，则产生GIF的，抗原特异性T-细胞生成。抗原刺激的T-细胞和T-细胞杂交瘤的构建，除了将提纯的cryj-1被用作抗原和ONO-RS-82用作磷脂酶抑制因子外，其余基本上与上述方法相同。这样，从对日本杉花粉过敏患者的外周血中获得单核细胞，并被悬浮于含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基中。该单核细胞悬浮液(3×106细胞/ml)在有10μg/mlcryj-1存在时培养3天。非附着细胞被回收，并重悬浮于含10％FCS的RPMI培养基中(3×105细胞/ml)，而后在有60单位/ml人IL-2和2μM ONO-RS-82存在时培养4天。然后将按该法繁殖的细胞回收并与BUC细胞融合构建杂交瘤。
杂交瘤用该单克隆抗CD3抗体SPB-T26(Spits，et al.，Hybridoma2：423，1983)处理，而CD3在该细胞上的存在用免疫荧光法检测。通过有限稀释只有CD3+杂交瘤被亚克隆。
该CD3+杂交瘤克隆被保持于含10％FCS的完全DME培养基中，每种克隆的培养物上清液用12H5细胞作GIF存在分析。表V显示得自一个患者的各杂交瘤所得的结果。在三个杂交瘤31E9、31B7和32B4的培养物上清液中，检测出GIF活性。其它两杂交瘤31H6和31H3的上清液看来GIF活性较弱。这样，用抗CD3抗体，接着再用抗小鼠免疫球蛋白处理该产生GIF的杂交瘤，并将该细胞培养24小时。培养物上清液在cryj-1偶联的免疫吸附剂上分级。用12H5细胞测定免疫吸附剂流过物级分中GIF活性和酸性洗脱液级分中GIF活性。包括在表V中的结果表明：得自31E9细胞的GIF与cryj-1-Affigel结合，并可在酸性pH时洗脱而回收，而得自31B7细胞的GIF却不能与抗原偶联的免疫吸附剂结合。此结果表明：在抗CD3刺激下，31E9细胞产生具有对cryj-1亲和性的GIF。
                       表V
             产生人的杉过敏原特异性杂交瘤a杂交瘤克隆    ％玫瑰花结抑制b  cryj-1 Sepharose中的GIF活性c
         (流出物/洗脱液)     未结合           已结合无               0/23            0/29             -31H6             20/13(±)       5/20(-)          12/10(±)31A11            0/25(-)         ND               -31E9             28/5(+)         0/22(-)          20/0(+)31H3             23/12(±)       0/34(-)          38/16(±)31B7             32/5(+)         20/5(+)          4/24(-)31F7             0/26(-)         ND               -3284             22/0(+)         22/14(±)        38/22(±)a 表中的杂交瘤产生于两个分别的实验。b 未受刺激杂交瘤培养物上清液针对GIF的存在而筛分。12H5细胞的等分试样与各杂交瘤的培养物上清液一起，在有小鼠IgE存在时培育。12H5细胞培养物上清液经CF50A过滤以去除IgE，然后滤液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级。流出物和洗脱液级份中的IgE-BF用玫瑰花结抑制试验测定。列中的数字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱物级分引起的玫瑰花结抑制百分比。(+)、(-)号分别表示有无GIF。c 代表性的杂交瘤用抗-CD3抗体检测，而培养物上清液用cryj-1偶联的Affigel分级。在流过物级分(未结合)和酸性洗脱液(结合)级分中GIF活性物的存在用12H5细胞确定。12H5细胞培养物滤液在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级。数字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱液级分产生的该玫瑰花结抑制百分比。得自31E9细胞的GIF与cryj-1-Affigel结合，而且通过酸性pH洗脱被回收，而得自31B7细胞的GIF不能在该cryj-1-Affigel柱中存留。
                  实施例5产生对人GIF特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备及特征描述A.杂交瘤的构建和筛选
T-细胞杂交瘤CL3的培养物上清液中的人GIF，用抗-脂调节素(141-B9)-Sepharose提纯。经亲和性提纯的GIF在完全弗氏佐剂中混合，而BALB/c小鼠通过进行3次间隔两周的经腹膜内注射该抗原而被免疫接种。在最后一次免疫注射后两周，获取该经免疫小鼠的脾细胞，将1×107脾细胞移入已用625Rr射线照射过的同源BALB/c小鼠中。在细胞移入后即刻，及两周后用提纯的在不完全弗氏佐剂中的GIF免疫接种。加强注射后一周，它们的脾细胞与缺乏HPRT的B细胞系SP2/0-14AG融合。该细胞与作为喂养层的BALB/c巨噬细胞一起在HAT培养基中培养。在该培养物中得到的102个杂交瘤克隆进行选择，形成鼠免疫球蛋白者，并用ELISA分析接着利用12H5细胞的生物分析对形成Ig-的杂交瘤进行挑选，选择产生抗-GIF抗体者。
在ELISA检测中，Immunol I板被涂覆以亲和性提纯的GIF。对照井充以DPBS。在用2％BSA封闭井后，将培养物上清液加在每井上，然后采用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠Ig抗体测定鼠Ig与该井的结合。如表VI所示，11个杂交瘤克隆的培养物上清液给出很强的信号。
                    表VI
            产生抗GIF杂交瘤的选择a杂交瘤Ig                  ELISA               GIF活性c克隆       同型物    信号/对照物b         流出物/洗脱液无          -        0/0                    29/1 (+)334F        IgM      0.195/0.003            33/1(+)355C        IgM      0.388/0.012            28/0(+)338H        IgM      0.316/0.050            0/29(-)318H        IgM      0.149/0.046            0/31(-)388F1      IgG2a   0.892/0.100            0/28(-)476B        IgM      0.100/0.020            0/20(-)489G        IgM      0.174/0.00             7/15(？)481F        IgM      0.460/0.092            18/0(+)335C        IgM      0.203/0.073            0/27(-)419A        IgM      0.542/0.15             27/1(+)312F        IgM      0.533/0.029            14/8(±)培养基对照  -        0/0                    0/31a 在ELISA检测中为阳性的培养物上清液，被进行与得自CL3克隆的GIF结合能力的测定。b 在杂交瘤培养物上清液中的鼠Ig与GIF涂覆的井的结合，与同样上清液中的Ig与BSA涂过的井的非特异性结合的比较。光密度为410mμ。c 将提纯的GIF和杂交瘤的培养物上清液的混合物经YM100膜过滤，然后滤液作GIF活性测定。12H5细胞与小鼠IgE在有该滤液存在时一同培养。该细胞所形成的IgE-BF在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级，而得自此小扁豆植物凝血素偶联Sepharose的流出物和洗脱液级分中的IgE-BF进行玫瑰花结抑制评估。数字代表流出物-洗脱液级分的玫瑰花结抑制百分比，GIF改变由该细胞形成的IgE-BG的特性(顶柱对底柱)。(+)表示存在GIF。
用12H5细胞确定在11个杂交瘤克隆中的培养物上清液中抗-GIF的存在(Iwata，et al.，J.Immunol.，140：2534，1988)。用50％饱和硫酸铵沉淀，获得来自各克隆的培养物上清液和球蛋白因子。在以磷酸盐缓冲盐水透析后，该级分被调到原培养物上清液体积的1/5。用141B9Sepharose由CL3克隆制备亲和提纯的GIF等分试样。这些等分试样与同体积的得自各克隆的该球蛋白级分混合，然后于4℃将此混合物培育过夜。而后该混合物经YM100膜过滤，并测定GIF在该滤液中的存在。该12H5细胞的悬浮液等分试样与等体积的滤液混合，而将该细胞悬浮液在有10μg/ml小鼠IgE存在时培养24小时。通过CF50A膜过滤此培养物上清液以去除IgE，而该滤液中的IgE结合因子在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级。包括在表VI中的该实验的结果表明：GIF已被338H，318H，388F1，467B和335C克隆的培养物上清液去除，这表明，这些杂交瘤产生抗GIF。B.提纯带有单克隆抗GIF的人GIF
在产生对GIF的单克隆抗体的6个杂交瘤克隆中，仅388F1产生IgG抗体。该杂交瘤被亚克隆而后在含5％FCS的高葡萄糖Dulbecco培养基中培养。通过超滤将培养物上清液浓缩，而后利用Protein A-Sepharose去除该上清液中的IgG。将该单克隆抗体与Tresyl-激活的Sepharose偶联以制备免疫吸附剂。为确定该单克隆抗体是否能与结合抗脂调节素(14189)-Sepharose的相同分子结合，用该141-B9-Sepharose吸附培养物上清液中的GIF，而后通过酸性pH洗脱回收。然后将该亲和提纯制品用抗GIF(388F1)偶联Sepharose分级。获得该流出物级分后，用10柱体积Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗此免疫吸附剂柱，然后用甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱。系列稀释的流出物和洗脱液级分用12H5细胞测定GIF活性。表VII中所示结果表明：得自141B9-Sepharose的酸性洗脱物中的GIF与该抗GIF(388F1)-Sepharose结合，然后再用酸性pH洗脱回收。该结果表明抗脂调节素和抗GIF均结合人GIF。
                  表VII
部分提纯的人GIF在抗GIF(388F1)偶联的Sepharose上分级a得自388F1-                      GIF活性bSepharose的级分    稀释度      流出物/洗脱液流出物             1∶10          0/35(-)
               1∶20          0/29(-)洗脱物             1∶20          39/0(+)
               1∶40          26/0(+)未分级             1∶40          27/0(+)培养基对照                        0/27a CL-3克隆的培养物上清液中的GIF用抗脂调节素Sepharose提纯。亲和性提纯的GIF(1.5ml)在0.75ml388F1-偶联的Sepharose上分级。回收流出物级分后，用10柱体积的DPBS洗此柱，然后用3柱体积pH3.0的甘氨酸HCl洗脱。b 利用12H5细胞，以表IV中所述的相同方法评估GIF活性。该列中的数字表示得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱物引起玫瑰花结抑制的百分比。(+)表示存在GIF。
为确定抗人GIF是否能结合小鼠GIF，利用141B9-Sepharose提纯得自Ts杂交瘤、231F1细胞的小鼠GIF，然后该提纯的鼠GIF等分试样在141B9-Sepharose或388F1-Sepharose上分级。得到流出物级分后，用3柱体积DPBS洗该免疫吸附剂，再用3柱体积pH3.0的甘氨酸HCl缓冲液洗脱。如所期望的那样，全部GIF活性物被吸附于141B9Sepharose上，而后用酸性pH洗脱回收。流出物或洗液级分都不含GIF活性物。当同样的GIF制品在388F1-Sepharose上分级时，该流出物级分中测到微弱GIF活性。在用DPBS洗涤的洗液中测到大部份活性物，但该酸性洗脱液级分中不含可检测量的GIF活性物。这似乎是，小鼠GIF与抗人GIF结合亲和性极低，而且通过中性pH值洗涤即与此免疫吸附剂分离。这些结果表明，该单克隆抗体388F1对人GIF是特异的。C.通过离子交换层析提纯人GIF。
通过有限稀释使AC5细胞亚克隆，而且得到CD3+克隆。而后将这些细胞调到无血清ABC培养基中。CD3在此培养基中培养的亚克隆上的表达，通过荧光细胞计数被证实。将CD3+亚克隆培养物上清液浓缩10-30倍，测定该制品的系列稀释液中的GIF活性。基于这些结果，选择亚克隆(AC5-23)，因为这种亚克隆的10倍浓缩上清液的1∶3稀释液，便可使12H5细胞从形成糖基化IgE-BF转变成形成非糖基化的IgE-BF。
作过一些研究以便确定人GIF是否可用离子交换柱层析法提纯。将ABC培养基中的AC5亚克隆培养物上清液浓缩25倍。该浓缩培养物上清液10ml等分试样，被用Tris调到pH8.0，用蒸馏水稀释8倍，然后在DEAE-Sepharose柱上样。与其结合的蛋白用10mM Tris缓冲液洗脱，该缓冲液逐步提高NaCl浓度。每个级分被浓缩到10ml，然后作GIF活性分析。
                   表VIII
       GIF活性物在DEAE-Sepharose级分中的分布
级分          NTis HCl+     蛋白含量
              NaCl(mM)a      (μg)b    GIF活性c
1                20           65.5        21/0(+)
2                50           35.0        20/6(+)
3                75           42.5        7/20(-)
4                100          38.5        3/19(-)
5                150          41.5        0/21(-)
6                200          42.0        0/20(-)
培养基对照                                0/22(-)a AC5细胞的浓缩培养物上清液用蒸馏水稀释8倍，而后于DEAE-Sepharose柱上样。级分1代表通过物级分与用10mM Tris HClpH8.0(含20mM NaCl)洗涤的洗液合并的级分。该柱用含逐步增高NaCl浓度的10mM Tris HCl洗脱。b 各级分浓缩后回收的蛋白总量。在用含200mM NaCl的Tris HCl洗脱后，大量蛋白仍遗留在该柱中。c 用12H5细胞测GIF活性。数字代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱物级分产生的玫瑰花结抑制百分比。在无IgE-BF的情况下，RFC的比例是22.6±0.7(SD)％。(+)(-)表示有无GIF。
如表VIII中所示，在流过物级分中和在用5mM NaCl洗脱的级分中，而不在其它级分中检测出GIF活性。滴定开始两种级分的系列稀释液表明：该流过物级分的GIF活性比该50mM洗脱级分的高。
用各种培养物上清液所作的重复实验证明：培养物上清液中的GIF的大部分可从DEAE-Sepharose柱回收，条件是AC5细胞的培养物上清液被浓缩100倍，用蒸馏水稀释3倍，而后通过此柱。将流过物级分和用含50mM NaCl的10mM Tris缓冲液洗涤的洗液合并，然后浓缩至原有体积再于DEAE-Sepharose上样。滴定浓缩培养物上清液的系列稀释液和该流过物级分(50mM NaCl)中的GIF表明：两种试样的1∶30稀释液都可使12H5细胞从形成糖基化IgE-BF转换为形成未糖基化IgE-BF。还发现，该培养物上清液中75-80％的蛋白可通过DEAE-Sepharose而去除。
为了估计GIF的分子量，将0.5ml得自DEAE-Sepharose的浓缩流出物级分于Superose-12柱上样，而蛋白以1ml/分的流量洗脱。在此实验中，收集5ml各级分，而后用12H5细胞作各级分的GIF活性测定。在70-75分钟间回收的第9级分中测得GIF活性。由于第6和第8级分也有弱的活性，则第6、8、9级分的稀释液中均进行GIF活性测定。在1∶10的第9级分稀释液中检测出GIF，而其它级分的1∶2稀释液中却未检测出。这些结果说明：人GIF主要种的分子量在11KDa-18KDa范围内。为了更好地估计GIF分子大小，以相同的方式重复Superose-12上的凝胶过滤，不同之处只在于收集1ml级分或2.5ml级分。三个分别的实验表明：在68-72分钟间回收了大部分GIF。当用凝胶过滤法估测时GIF分子约为12-18KDa。
也作过通过SDS PAGA法鉴定GIF的研究。将2升ABC培养基中的杂交瘤培养物上清液浓缩100倍，而后在DEAE-Sepharose柱上分级。根据上述实验用去离子水将该浓缩的上清液稀释3倍，而后通过DEAE-Sepharose。将流出物级分浓缩，用人IgG-偶联的Sepharose预吸附，而后将该级分中的GIF在388F1-偶联的Affigel上通过亲和性层析法提纯。在某些实验中，得自免疫吸附剂的酸性洗脱液级分被调到pH8.0，而后重复用388F1-Affigel进行亲和性提纯。以SDSPAGE进行的亲和性提纯GIF制品分析在还原或非还原条件下完成。在还原条件下，该亲和性提纯物的主带有14KDa的分子量，而在非还原条件下则为15KDa。此外，还经常看到67KDa的带。部分亲和提纯制品以DPBS透析，然后滴定该制品中的GIF活性。假设在透析和冷冻干燥过程中100％地回收GIF，则施于SDS-PAGE上的试样应有1∶250的GIF效价。
进行过一些实验来测定14KDa蛋白和GIF间的关系。通过DEAE-Sepharose层析法，接着再用388F1-Affigel亲和性提纯法来提纯2升AC5克隆培养物上清液中的GIF。得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液被调到pH8.0，而后通过超滤而浓缩到1ml并在Sepharose12柱上分级。用12H5细胞将每2.5ml洗脱液测定活性。在此实验中，在67.5-70分钟之间的洗脱级分中测得大部分GIF活性。利用生物素偶联的mAb141-B9所作ELISA分析证实该级分中GIF的存在。因为ELISA信号很弱，仅含GIF的级分给出ELISA信号。将1ml含GIF的级分冷冻干燥，再用SDS PAGE分析，结果证实，14KDa肽存在于该含GIF的级分中。
              实施例6
          提纯小鼠GIF及氨基酸序列测定
从产生GIF的小鼠T细胞杂交瘤231F1细胞，用抗脂调节素单克隆抗体141B9提纯小鼠GIF(Iwata et al.，J.Immunol.，132：1286，1984)。利用FAST-r柱，从注射了杂交瘤141B9的BALB/c鼠的腹水中提纯该单克隆抗体141B9。将约10ml该制品中的IgG1与1ml Affgel10株粒偶联。为获得GIF，将231F1细胞在含10％Nu-血清的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(CollaborativeResearch)中培养。该培养物中的231F1细胞数达到1-2×106后，回收此细胞，重悬浮于无血清的DMEM中，其浓度为1.5×106细胞/ml，并培养48小时。通过超滤将该细胞培养物上清液浓缩1000倍，然后将10ml该浓缩培养物上清液与2ml141B9-偶联的Affigel，于4℃混合6-12小时。用含50mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液彻底地洗此免疫吸附剂，再用含500mM NaCl的同样的缓冲剂洗涤。用0.1M，pH3.0的乙酸钠缓冲液洗脱保留于该免疫吸附剂中的蛋白。亲和性提纯的GIF与1/10体积的100％(重量/体积)三氯乙酸混合。该混合物于-20℃下保持15分，以15000×g离心分离5分钟回收沉淀。该沉淀中的蛋白在15％聚丙烯酰胺/SDS凝胶中，在还原条件下电泳，然后以偏二氟乙烯(PVDF)膜(于10mM CAPS缓冲液中，pH11.0)进行电印迹试验。用Coomassie Brilliant Blue(CBB)染色的蛋白带显现后，切下14KDa带以便确定氨基酸序列。
将该PVDF固定的蛋白还原而后原位被S-羧甲基化，然后于30℃用含8％乙腈的90mM Tris缓冲液(pH9.0)中的1pmol无色杆菌属蛋白酶I(Wako Pure Chemicals)消化20小时。利用5μC8-300A柱(Waters)(用0.05％三氟乙酸水溶液作为流动相平衡过)通过反相HPLC分离已消化的肽。用0.02％三氟乙酸的2-丙醇液/乙腈(7∶3)的线性梯度液(2-50％)洗脱该肽。将显示214nm波长吸附的主肽峰收集，然后用气相序列分析仪(AppliedBiosgstems Model470A)，以经修改适于微测序的程序(Iwamatsu，et al.，J.Biochem，110：51-158，1991)进行该肽氨基酸序列分析。该被分离肽的氨基酸序列如下所示：肽         序列AP-1     (K)-I-G-G-A-Q-N-R-N-Y-S-K(SEQ ID NO：1)AP-23    (K)-L-L-C-G-L-L-S-D-R-L-H-I-S-P-D-R-V-Y-I-N
     (SEQ ID NO：2)
无色杆菌属蛋白酶I消化后，PVDF-保留的肽片段用100mM碳酸氢铵(pH7.8，含8％乙腈)中的2pmol内切蛋白酶ASP-N(Boehriger Mannheim)于30℃亚消化16小时。此消化之后，通过HPLC收集4种主要肽，然后按上述方法定序。每种肽的氨基酸序列如下：肽         序列AN-4     D-M-N-A-A-N-V-G-X-N-G-S-T-F-A(SEQ ID NO：3)AN-5     D-P-C-A-L-C-S-L-H-S-I-G-K(SEQ ID NO：4)AN-7     D-R-L-H-I-S-P-D-R-V-Y-I-N-Y-Y(SEQ ID NO：5)在AN-4中X表示未测到。
在内切蛋白酶ASP-N消化之后，保留在该膜上的肽用1pmol胰蛋白酶-TPCK(Worthington Biochemicol)，于含8％乙腈的100mM碳酸氢铵(pH7.8)溶液中，于30℃亚消化20小时。一种主要肽(T-1)被收集和测序。肽        序列T-1    P-M-F-I-V-N-T-N-V-P-R(SEQ ID NO：6)
该N-末端氨基酸序列通过注射小片PVDF固定蛋白于定序器(Shimazu PSQ-1)直接测序。N-末端    (M)-P-M-F-I-V-N-T-N-V-P-R-A-S-V(SEQ ID NO：7)
约85％的被分析肽显示N-末端蛋氨酸残基缺失。
                 实施例7
             cDNA克隆和鼠GIF序列测定
根据上述N-末端氨基酸序列和其它肽(AN-5)序列，合成寡核苷酸。曾尝试通过聚合酶链反应来放大部分cDNA，然后用所得的cDNA探测鼠cDNA文库。用于此PCR的合成引物是：
5’-ATGCCGATGTTCATCGTAAACACCAACGTGCCCCGC-3’(SEQID NO：8)
5’-GCCGATGCTGTGCAGGCTGCAGAGCGCGCACGGCTC-3’
(SEQ ID NO：9)
胞质RNA与产生GIF的鼠T杂交瘤231F1分离。用寡(dT)-纤维素提纯mRNA后，单链cDNA在mRNA模板上由231F1 RNA模板上的dT15启动的逆转录而合成。在标准条件下进行PCR。简言之，于94℃使该模板DNA变性1分钟，用上述的引物于约59℃退火1分钟，接着在72℃延展45秒。将在PCR中放大的0.2Kb片段连接在pCR1000载体(Invitrogen，La Jolla，CA)上，以便后续的克隆和DNA序列测定。在确定该片段的核苷酸序列后，该插入段因EcoRI消化而被切割，以便筛选鼠T细胞杂交瘤231F1细胞的cDNA文库，该杂交瘤是用Uni-ZAP cDNA合成药盒(Stratagene，La Jolla California)构建的。EcoRI识别位点与双链cDNA相接(而后它被XhoI消化)，并将cDNA连接于Uni-ZAP XR载体中。该cDNA文库通过与上述0.2Kb DNA杂交而被筛选。在筛选50万独立的克隆后，分离出7个克隆。所有7个克隆的限制性图谱表明它们是单一形式的。
通过标准双脱氧法，挑选出最长的克隆(0.65Kb)来进行DNA序列测定。鼠GIF的核苷酸序列及推断出的氨基酸序列示于图1中。下标线表示提纯鼠GIF的Edman降解中的被鉴别肽的位置。估计的GIF蛋白大小是13KDa，这与自T杂交瘤231F1细胞提纯的GIF大小相符。第一蛋氨酸密码子侧面的核苷酸序列有利于转译起始规则。该插入段长度为0.65Kb。鼠T-细胞和组织RNA的Northern印迹分析表明有0.65-0.70Kb单种mRNA存在，提示所得的cDNA是全长度的。还发现，该鼠GIF蛋白缺少信号肽，因为在核苷酸82的5′上游未发现蛋氨酸残基(图1)。
               实施例8
            分离编码人GIF的cDNA
用抗CD3抗体将人T细胞杂交瘤AC5染色。而产生GIF的CD3+亚克隆被用作mRNA的来源。重复在寡(dT)纤维素上的分级以分离mRNA，该mRNA随后被用作用ZAP-cDNA合成药盒合成cDNA的模板。连接EcoRI识别部位后，用XhoI消化双链cDNA，经Sepharyl S-400回旋柱过滤选择其大小。该cDNA然后被连接到Uni-ZAP XR载体中，以构建重组噬菌体文库。在该文库中，含一插入段的噬菌体比例是总噬菌体的88-96％。通过与编码鼠GIF的cDNA片段杂交，筛选此cDNA文库。用含鼠GIF-cDNA的噬菌粒培养E.coli XL1，然后提取该细菌中的DNA。质粒用离心法提纯，并用BamHI和XhoI消化。在琼脂糖上电泳后，提取500bp带，然后用Gene cleanII药盒(BIO101)提纯。该cDNA用购自Stratagene的Prime-It gold药盒以α-32P-ATP标记。
E.coli PLK-F用含5×104pfn的此文库培养，而噬菌体则被转到已涂覆有E.coli的尼龙膜(Duralose，Stratagene)上。将该膜置于LB底板上，并于37℃保温过夜。用0.5M NaOH处理后，用Tris中和，并用2×SSC洗涤，将此膜于80℃干燥，以固定DNA于该膜上。
为了筛选该cDNA文库，该膜用声处理鲑鱼精液DNA作预处理，然后用已于100℃加热5分钟的32P-标记小鼠GIF cDNA，于60℃培育过夜。该膜被洗2次，各次用含0.1％ SDS和0.1×SSC加0.1％SDS的6×SSC洗涤，而后于放射自显影照像底片上暴光。从阳性克隆中提取噬菌体，然后将筛选重复两次，以便分离阳性克隆。在筛选的200000个噬菌体中，分离了27个阳性克隆。为了证实该阳性噬菌体确实含与鼠GIF cDNA同源的cDNA，从每种阳性噬菌体克隆中获得噬菌粒DNA，在1％琼脂糖凝胶中电泳，在Zeta-探针膜中作印迹分析，然后与32P-标记的小鼠GIF cDNA杂交。
为确定人GIF cDNA的核苷酸序列，将得自各噬菌体克隆的噬菌粒用EcoRI及XhoI消化，然后电泳以得到该插入段。在27个克隆中，某些有0.5Kb插入段的克隆用双脱氧法定序。该插入段用SacI，PstI及SmaI消化，而片段在pUC19或pBluescript SK-载体中进行亚克隆。质粒DNA用碱性SDS法提纯，而克隆用序列Ver2(USB)定序。全长度cDNA(PNY106)的整个核苷酸序列示于图2。除了GIFcDNA中得自核苷酸390-392的密码是AAT(天冬酰胺)，而MIFcDNA有AGT(丝氨酸)密码子外，该序列与目的人MIF cDNA同源(Weiser et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：7522-7526，1989)。另一个区别在于：5′端非编码区(在pYN106中)是40碱基，这比MIF的长。
在几个杂交瘤中进行RNA酶保护分析，以确定用GIF cDNA检测的mRNA的结构中是否有重复。
                 实施例9
           在E.COLI中表达重组体GIFA.构建细菌表达体系
此实施例涉及人和鼠GIF多肽在E.coli中的表达。于EcoRI和XhoI位点插入BlueScript的人GIF cDNA用寡核苷酸引物退火。该引物为：
5’-AACCTTAAGAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATG
    CCGATGTTCATCGTAAACACCAACG-3’(SEO ID NO：10)
3’-CACCCGACCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTATCCCTAGGCAA-5’
    (SEQ ID NO：11)
用氨基磷酸酯法合成这些引物(McBride，et al.，TetrahedronLett.，24：245-248，1983)。该5′-端引物含Shine-Dalgano序列以便更好的表达细菌(Scherer，et al.，Nucl.Acids.Res.，8：3895-3950，1980)，而每种引物分别含AfIII及BamHI位点。
用聚合酶链反应(PCR)将人GIF cDNA放大(Mullis，et al.，Method in Enzymol，155：335-350，1987)。除另有注释外，各PCR循环中的变性步骤定为94℃1分钟，而延伸步骤在72℃2分钟。退火温度和时间随各种反应而有所不同，通常是根据同时进行的几种不同PCR所需温度时间加以估计得出的均衡值。
从琼脂糖凝胶分离的，经放大的cDNA片段用AfIII及BamHI消化，将连接物在独特AfIII及BamHI位点插入载带Trp启动子和TrpA终止子的pST811载体中(图3，日本专利公开63-269983)。这种被称为pTMK-hGIF(图4)的新质粒被转化进合宜的RR1E.coli宿主细胞。根据氨苄青霉素的抗药性选择含质粒的细胞(承载于pST811载体上的标记基因)。合成的寡核苷酸及整个人GIF基因的DNA序列由质粒DNA的DNA序列测定所证实。
用与人GIF相同的方法，从插入BlueScript的小鼠GIF cDNA构建小鼠GIF的细菌表达体系。使用PCR在鼠GIF cDNA两端产生AfIII和BamHI位点的引物是：
5’-AACCTTAAGAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATG
    CCTATGTTCATCGTGAACACCAATG-3’(SEQ ID NO：12)
3’-GCACCCGACCTTGCCAAGGTGGAAGCGAACTATCCCTAGGCAA-5’
    (SEQ ID NO：13)
在pST811载体中的含小鼠GIF cDNA的质粒被标为pTMK-mGIF。
另外，人或鼠编码序列可从pTMK-hGIF或pTMK-mGIF中通过用AfIII和BamHI酶切而回收，然后插入任何所需的，具有PL.lac，tac或OmpF启动子的细菌载体中，所用方法根据Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Maniatis，et al.，1982)一书所载，这些例举的载体，和本领域已知的其它细菌载体，可被转化入细菌宿主，和进行GIF表达。B.培养产生GIF的E.coli
载带质粒pTMK-hGIF或pTMK-mGIF的RR1E.coli于含50μg/ml氨苄青霉素的20ml Luria液体培养基中培养，而后于37℃生长过夜。该接种物培养物被无菌转移入1升由0.8％葡萄糖、0.4％酪蛋白氨基酸，10mg/升硫胺素及50mg/升氨苄青霉素组成的M9液体培养基中，而后于37℃培养3小时。最初培育结束时，加入40mg吲哚基丙烯酸，而后该培养物在37℃再培养5小时。
                实施例10
       提纯在E.coli中表达的重组体GIF产物
将约5g湿重的收获细胞悬浮于体积为30ml的水中，而后通过French-Press打碎(8000psi，重复4次)。在4℃，以15000×g离心处理10分钟分离出上清液和破碎的细胞沉淀。用水将此细胞沉淀洗2次。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，明显表明：大部分沉淀是人GIF蛋白。该上清液还含可溶性人GIF蛋白。可溶与不可溶的GIF之比约为1∶3。A.提纯可溶性GIF
可溶的GIF级分于-80℃冷冻过夜，而后慢慢地在室温下熔化。通过15000×g，15分钟的离心分离去除不可溶物。此步骤中，大部分细菌污染物可被去除。加50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)将该上清液调到pH6.0，而后将其于4℃下用20mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)平衡过的CM-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱(5×18cm)上样。以2ml/分的流量，用20mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)洗此柱，而后通过NaCl分步梯度液将蛋白洗脱。用20mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)的0.5NaCl液洗脱GIF。人GIF的纯度用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳估计并确定为高于95％。B.不可溶GIF的提纯和再合并
含不可溶人GIF的沉淀部份被悬浮于含6M胍HCl及25mM EDTA的10ml0.2M Tris-HCl缓冲液中(pH8.0)，然后通过轻柔的混合于室温下培育3小时使人GIF增溶。残留的不溶物通过15分钟15000g的离心处理去除。
可溶的GIF部份于用6M胍-HCl，25mN EDTA及0.2M Tris缓冲液(pH8.0)平衡过的Sephacryl S-200Super Fine(Pharmacia)柱(5×100cm)上样，然后在室温下以2ml/分的流量洗脱。当无效体积被洗脱后，按每级分10ml收集洗脱物，然后用Western印迹染色进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作GIF分析。用YM5微孔超滤膜将约120ml GIF阳性级分浓缩至5ml。
为了再合并增溶的GIF，于室温下，随慢慢搅拌，将该试样慢慢加至2升20mM Tris缓冲液(pH8.0)中。24小时后，用YM5膜将该混合物浓缩10倍。
为去除剩余的E.coli沾染物，将试样于用20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡的TSK DEAE-5PWD(Toyo Soda)柱(7.5×75cm)上样。上样后，用同样缓冲液洗此柱，而后于室温，以0.5ml/分的流量，用柱缓冲液中0-0.1M NaCl梯度液将GIF洗脱。含GIF的级分(如Western印迹确定的)用YM5膜浓缩。人GIF纯度用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳估测，并被测定纯度在95％以上。用上述同样方法提纯重组体鼠GIF。
                        实施例11
            氨基酸序列测定及重组体GIF分析A.重组体人GIF的氨基酸序列测定
经提纯的得自DEAE柱的重组体人GIF经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，再于PVDF膜上进行印迹分析。该膜用Ponceau S染色，而后从该膜上切下GIF带。用Shimazu PSQ-1蛋白定序仪确定该N-末端氨基酸序列。约60％重组体人GIF于N-末端有下列10个氨基酸：
1Met-2Pro-3Met-4Phe-5Ile-6Val-7Asn-8Thr-9Asn-10Val-
该序列与自人GIF的cDNA推导出的序列相同。约40％GIF缺失N-端基1Met残基。B.重组体鼠GIF的氨基酸分析。
将得自DEAE柱的提纯重组体鼠GIF，于含0.2％酚的2次蒸馏的5.7M HCl中，在110℃下，于真空管中水解24小时。此水解后试样被悬浮于0.02M HCl中，然后确定氨基酸组成(HITACHI835S氨基酸分析仪)。所得结果分析(表IX)总的看出：获得的Cys，Thr，Met及Trp残基数量比自cDNA序列推导出的要低，因为在水解过程中发生了降解作用。对His残基而言，较低值可能是由于从NH3分离不充分。在该氨基酸组成分析中，应用已知量的内部标准物如Leu，可将样本中的蛋白质定量于280nm波长处，重组体鼠GIF的消光系数为1.89。
                           表IX
               E.coli产生的mGIF的定量氨基酸组成
                    每摩尔蛋白的氨    每个分子预计
                    基酸组成摩尔数    的残基
氨基酸分子  组1      组2      组3
ASP＋ASN   10.19    10.12    10.31      14
GLU＋GLN   6.98     6.97     7.93       8
CYS        0.96     0.59     1.08       3
SER        9.11     9.03     9.12       9
GLY        8.98     8.97     8.78       9
HIS        0.000    1.70     1.86       3
ARG        5.07     4.81     4.84       4
THR        3.85     3.78     3.82       6
ALA        10.37    10.43    10.30      10
PRO        8.42     8.17     8.19       7
TYR        4.63     4.60     4.55       5
VAL        7.47     7.49     7.57       8
MET        3.13     3.03     3.05       4
ILE        6.14     6.09     6.10       6
LEU        11.00    11.00    11.00      11
PHE        4.28     4.02     4.35       4
TRP        0.00     0.00     0.00       1
LYS        2.92     2.95     2.87       3
              实施例12
        产生抗GIF的多克隆抗体
将三只兔每2-3周皮下注射于弗氏不完全佐剂中的100μg同样的GIF试样。114天后，收集该兔血清，然后用蛋白A亲和性层析法(Prosep-A，BioProcessing)提纯IgG。自25ml血清中得到约150mg IgG。该抗体识别鼠GIF和人GIF，并可用于Western印迹和提纯GIF。
              实施例13
       在哺乳动物细胞中表达重组体GIFA.构建哺乳动物细胞直接表达的表达系统
此例涉及人GIF多肽在哺乳动物细胞中的表达。于EcoRI和XhoI位点插入BlueScript的人GIF cDNA用寡核苷酸引物退火：5’-CCCAGATCTAAGCGGATGCCGATGTTCATCGTAAACACC-3’
(SEQ ID NO：14)3’-CCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTCCATGGCAA-5’(SEQ ID NO：15)
每种引物都含BgIII或KpnI位点。用PCR法将此人GIF cDNA放大，从琼脂糖凝胶中分离，用BgIII和KpnI消化。通过连接将片段插入经修饰的SRα载体(Takabe，et al.，Mol.Cell.Biol.，8：466-472，1988)，该载体在PstI位点后有BgIII位点。该质粒，称为SRα-hGIF(图5)，被转化进适宜的DH5E.coli细胞。以被载于SRα载体上的Amp′基因为基础选择含质粒的细胞。将质粒DNA与被培养的细胞分离，而整个人GIF基因的核苷酸序列用DNA序列测定证实。B.具有附加信号序列的哺乳动物表达系统的构建。
根据DNA结构分析，GIF看来不具有信号序列，所以构建另外的表达体系以便将信号序列引入GIF，从而可从此转染细胞经基本分泌途径，分泌该GIF多肽。很多分泌蛋白，包括多肽激素、生长因子及质粒蛋白作为前体而合成，并经受翻译后蛋白水解过程，该过程为其生物活性物质分泌和表达所必需。比如，人降钙素是由甲状腺的内分泌C细胞合成大前体分子前降钙素(Craig，et al.，Nature，295：345-347，1982)。前降钙素是由N-末端前区、降钙素及C-末端前区构成，在测二元位点处进行蛋白水解过程，便产生该降钙素肽(Burns，et al.，Mol，Endocrinol.，3：140-147，1989)。因此，据推测该前降钙素通过神经内分泌源的蛋白转化酶而裂解(Smeekens，et al.，J.Biol.Chem.265：2997-3000，1990；Proc.Natl.Acad.of Sci.，88：340-344，1991)。此外，人前降钙素的N-末端前区在-4位处有附加的Arg残基，而且在羧基末端处有Arg-Ser-Lys-Arg序列，该羧基末端是可被加工酶，毛皮素识别的分裂型主(Fuller，et al.，Science，246：482-486，1989)。
在本实施例中，人GIF cDNA在构架中与编码人降钙素前体N-末端前区的基因的3′端融合，并插入SRα载体中。人毛皮素cDNA也被克隆，而且插入SRα载体中。二载体均被转染为导致分泌成熟的人GIF的COS-1细胞(ATCC CRL1650)。1.cDNA的克隆
编码人前-降钙素(pro-CT)信号肽和N-末端前区的cDNA片段(Steerbergh，et al.，FASEB Letter，207：94，1986)用人降钙素cDNA作模板经PCR而扩增。mRNA从人甲状腺癌TT细胞(ATCCCRL1803)分离出来。而后逆转录成被用作PCR模板的cDNA。
如下所示有PstI位点的寡核苷酸引物被合成，而且人降钙素前体基因被放大。
5’AACTGCAGATGGGCTTCCAAAAGTTC-3’(SEQ ID NO：16)
3’-GACCTGTCGGGGTCTAGATTCGCCGACGTCCA-5’(SEC ID NO：17)
该被放大基因克隆进PstI消化的SRα载体。插入BlueScript的人GIF cDNA用下面的寡核苷酸引物退火。
5’-CCAGGATCTAAGCGGATGCCGATGTTCATCGTAAACACC-3’
    (SEQ ID NO：14)
3’-CCTTGTTGAGGTGGAAGCGGATTCCATGGCAA-5’(SEQ ID NO：15)
该引物分别有BgIII位点和KpnI位点。该放大基因编码Arg-Ser-Lys-Arg序列，接着再编码hGIF序列。然后该基因连接而插入BgIII和KpnI消化的SRα中，如前所述，该SRα具有人降钙素前体基因。这种新的质粒，标为SRα-hcGIF(图6)被转化进DH5E.coli细胞。将质粒DNA从被培养细胞中分离出，而整个人降钙素前体和人GIF基团的DNA序列通过DNA序列测定证实。
以同样的PCR扩增使人毛皮素cDNA克隆。多聚(A)+mRNA从人膀胱癌细胞系HT1376(ATCC，CRL1472)中分离，逆转录成cDNA，并被用作PCR模板。六种寡核苷酸引物(下示图1-6)根据公开的毛皮素cDNA序列(Fuller，et al.，Science，246：482，1989)，用ABI394DNA合成仪(Applied Biosystems，Inc.CA)制成。分别覆盖人毛皮素DNA的编码序列1-951，922-1604及1565-2385bp的三种DNA片段从相应的PCR产物中提纯。编码氨基末端蛋白序列的cDNA片段，用毗邻的cDNA片段，通过此二片段间的27bp重叠来退火。所得的cDNA混合物用相应于第-片段的5′端和第二片段3′端的引物再扩增。所得的1.6kb cDNA借助Bsp HI位点与编码剩余羧基末端毛皮素的第三cDNA片段连接。整体cDNA片段构件被亚克隆进TA克隆载体pCR1000(Invitrogen，La Jolla CA)。用Sequenase药盒(United States Biochemical Corp.，OH)确定人毛皮素cDNA序列。限制位点图和部分序列分析揭示，该被克隆的cDNA与先前报导的人毛皮素相同。含全长度人毛皮素的EcoRI-NotI片段被克隆入哺乳动物表达载体pEFneo，该pEFneo是将新表达单元插入改性的pEF-BOS产生的(Mizushima，et al.，Nucl.Acids Res.，18：5322，1990)。
用于通过PCR克隆人毛皮素cDNA的六种合成的寡核苷酸引物是：
                                        SEQ ID NO：F1 5’-AAGAATTCCCCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTG-3’       18F2 3’-GTGGTTGTCATAGATGTGCGACAGGTAG-5’                 19F3 5’-ACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCAT-3’                 20F4 3’-TACCCAAATTACTGACCCGGAAGTACTG-5’                 21F5 5’-ACTACTCCGCAGATGGGTTTA-3’                               22F6 3’-TTTCTGGTCTCGCGGGAGACTCTTAAGAA-5’                23
F1和F2被用于1-951毛皮素(furin)编码序列扩增，而F3和F4被用于扩增922-1604。用27bp重叠使两种PCR产物退火，而所得的cDNA通过F1和F4引物再扩增。1.6kb的衍生cDNA借助BspHI位点与放大F5和F6扩增的编码人毛皮素基因的片段1565-2385bp的cDNA片段。整个毛皮素cDNA被插入EcoRI消化的SRα载体中。这种称为SRα-hfnrin的新质粒被转化到DH5E.coli细胞。质粒DNA从培养细胞中分离，而该合成寡核苷酸和整个人毛皮素基因的DNA序列通过DNA序列测定证实。C.在COS-1细胞中表达GIF
该质粒SRα-hGIF或SRα-hcGIF加SRα-hfurin被转染入COS-1细胞。将质粒DNA以1μg/ml的浓度加至含10％Hank’sBSS、2％FCS、40μg/ml DEAE葡聚糖、100μM氯奎的DMEM/F12(1∶1)培养基中。此混合物被遍铺在培养皿中的COS-1细胞上，然后培养(5小时，37℃，5％CO)。培养后，细胞被洗涤并培养过夜(37℃，在含10％FCS的DMEM/F12(1∶1)培养基中)。再次洗涤后，在含20μg/ml牛胰岛素(Sigma)，20μg/ml人转铁蛋白(Sigma)，40mM单乙醇胺，0.1μM硒酸钠及1mg/ml BSA的无血清DMEM/F12培养基中，于37℃培养该细胞1周。作为对照物，将无插入段的载体转染入COS-1细胞。
用抗-鼠GIF多克隆抗体作Western印迹估计在此培养物上清液中的GIF量。产自SRα-hcGIF转染的COS-1细胞的此上清液，被表明含有成熟型GIF。与降钙素-GIF一起被表达的毛皮素裂解分泌GIF的降钙素前体序列。自COS-1细胞分泌的GIF量与降钙素前体一GIF分泌的量差不多。
本领域普通技术人员还可构建与SRα-hGIF或SRα-hcGIF相匹敌的其它的哺乳动物表达载体。人GIF编码序列可通过以BgIII和KpnI酶切而从SRα-hGIF或SRα-hcGIF中回收，然后通过连接而插入很多载体，如pCD(Okayama，et al.，Mol.Cell.Biol.，2：161，170，1982)，pCDM8(Seed，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：3365-3369，1987)，及pDSVE(US Ser.Nos.025，344and152，045)中。这些载体在适宜的宿主细胞，如CHO，3T3及BHK细胞中转化可导致GIF的表达。这是挑选较好载体系统，挑选有或无信号序列的GIF，cDNA，及挑选适宜宿主细胞以便增加GIF分泌的常规程序。D.构建分泌重组体截断肽，不与毛皮素cDNA共转染的独特融合表达载体。
毛皮素在多种组织中被表达，并似乎大多定位于高尔基区(Bresnaham，P.A.et al.，J.Cell.Biol.111：2851，1990；Mitsui，Y.，et al.，J.Biol.Chem.，266：16954，1991)，这表明，毛皮素或毛皮素类酶参与前蛋白裂解，以便经必要的分泌途径分泌成熟的蛋白。Smeekens等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.89：8822，1992)预言过毛皮素类酶在COS细胞中存在。因此，如果采用该酶的合适裂解型主COS细胞中的毛皮素类酶可用于处理重组体融合蛋白，以便分泌成熟肽。
一种Fc cDNA被用于设计有效的蛋白水解分裂位点的试验目的。人IgG的Fc片段没有信号肽，而编码Fc片段的cDNA片段不载带转译起始密码子ATG，该蛋白一般不能通过cDNA转染入哺乳动物细胞而表达。pro-CT被用于该Fc片段的载体肽，而该pro-CT的羧基末端的氨基酸序列被修改以便产生合适的，可被推测的COS-1细胞中的毛皮素类酶识别的裂解型主。根据先前的关于加工酶的裂解型主的信息，四种不同的氨基酸序列被引入pro-CT中。编码pro-CT的cDNA，通过以人降钙素cDNA作模板，用一个5′端引物(CT1)及4个列于表X的不同的3′端引物(CT2，CT3，CT4和CT5)的PCR而扩增。在不同位置引入几个碱基而将引物(CT2，CT3，CT4和CT5修饰，以便研究此种变化对COS-1细胞的推测内切蛋白酶加工效率的影响。
           表X
     人pro-CT的PCR扩增的寡核苷酸引物一览表
                     Met Gly Phe Gln Lys PheCT1(28MER)  GAAT TCT GTC ATG GGC TTC CAA AAG TTC
                                      ↓CT2(30MER)           -6  -5  -4  -3  -2  -1  +1
        Leu  Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg
        CTG  GAC AGC CCC AGA TCC AAG AGA TGT AGA
        GAC  CTG TCG GGG TCA AGG TCT TCT AGA TCTCT3(30MER)  Leu  Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg
        CTG  GAC AGA CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA
        GAC  CTG TCT GGG TAC AGG TTC TCT AGA TCTCT4(30MER)  Leu  Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg
        CTG  GAC AGA CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGA
        GAC  CTG TCT GGG TCT AGG TTC TCT AGA TCTCT5(30MER)  Leu  Asp Ser Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg
        CTG  GAC AGC CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA
        GAC  CTG TCG GGG TAC AGG TTC TCT AGA TCT
带虚线的箭头表示按5′-3′方向合成的引物。CT1编码pro-CT的氨基末端，而4个其它的引物编码pro-CT的羧基末端。带实线的箭头表示内切蛋白酶的酶切位点。CT2-CT5中的核苷酸序列AGATCTAGA被BgIII和XbaI识别。(SEQ ID NOS：24-32)
为构建质粒，将EcoRI限制性位点引入CT1中，并将BglII加Xba I限制性位点引入其它4种引物中。在生成4种相应的pro-CTcDNA片段后，将它们亚克隆入该质粒pBluescript II SK(+)(Stratagene)的EcoRI和Xba I位点。由于Not I变为该质粒载体上的Xba I后的相邻限制性位点，所以pro-CT cDNA可被EcoRI和Not I酶切。接着，4种不同的有突变3′端的pro-CT cDNA的每种被插入该哺乳动物表达载体pME18S中，该载体承载了嵌合反转录病毒启动子，SRα(Takabe，et al.，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988)。这种新质粒被称作pMEpro-CT(图7)。此载体由ⅰ)嵌合启动子SRα(由SV40启动子加该反转录病毒的长末端重复R区融合)，ⅱ)pro-CT，ⅲ)SV40早期多(A)附加信号组成。在pro-CT的羧基末端蛋白水解分裂位点之后，包括对Bgl II、Xba I及Not I的多种克隆位点。以便插入讨论中的外来基因。被Bgl II和Xba I识别的核苷酸序列(AGATCTAGA)编码该读框中的Arg-Ser-Arg残基。因此，外来cDNA可被引入并与此读框的pro-CT cDNA融合。
该Fc cDNA用PCR扩增法以两种28个核苷酸引物，G1和G2，和以得自人白血病细胞系ARH-77(ATCC，CRL1621)的多(A)+mRNA作模板获得。该5′端引物G1(5′-CTCTAGAGACAAAACTCACACATGC-3′)(SEQ ID NO：33)和3′端引物G2(5′-GGCGGCCGCCGCACTCATTTACCCGGAG-3′)(SEQ IDNO：34)分别含有下标线的Xba I位点和Not I位点。将这样获得的Fc cDNA亚克隆入质粒pBluescript II KS(+)的Xba I和Not I位点。该cDNA片段用ABI270A测序仪(Applied Biosystems Inc.，CA)测序。该Fc cDNA编码Asp残基开始序列，该残基位于铰链区三个Cys残基的第一个位(Ellison，et al.，Nucl.Acids Res.，10：4071，1982)。该cDNA于pro-CT区后框架内被插入pMEpro-CT。1.该嵌合蛋白的分泌和分裂
为了检测由pro-CT区和Fc片段构成的融合蛋白是否能从质粒转染的COS-1细胞以分泌形式而产生，使用含有编码仅带有二元Lys-Arg残基的pro-CT cDNA的嵌合质粒。将用抗-人IgG转染的细胞培养物上清液作免疫印迹分析表明：非还原条件下，约66KDa分子量处，还原条件下，37KDa分子量处才能检测到融合蛋白。用pMEpro-CT质粒DNA转染的细胞培养物上清液作类似的免疫印迹分析证实：不产生对抗-IgG CT具活性的蛋白。
根据非还原形式下主要蛋白的分子大小是还原形式下的此分子大小的约2倍这一发现，假设该融合蛋白必须作为二聚物蛋白被合成。由于在该pro-CT区中无Cys残基存在，所以此二聚物可由Fc片段的铰链区中的Cys残基间形成的二硫化物键产生。尽管如此，该蛋白的分子大小(作为二聚物是66KDa，作为单体是37KDa)表明：该蛋白代表由pro-CT和Fc片段构成的融合蛋白，而不是成熟的Fc片段。
借助不同的分裂型主将嵌合cDNA转染入COS-1细胞，来测定加工效率。免疫印迹分析表明：当嵌合质粒在裂解位点含编码二元Lys-Arg型主的Pro-CT cDNA时由适宜的蛋白水解裂解而释放的Fc片段检测不到。全部分泌的与抗IgG CT抗体反应的蛋白是还原条件下的37KDa融合蛋白。除Lys-Arg型主外，凡融合蛋白在P6位有Arg残基时，也获得类似的结果。除Lys-Arg型主外凡该融合蛋白于P4位有Arg残基时，也在被转染的COS-1细胞中检测到Fc片段。然而，成熟Fc片段仅代表能与抗-IgG反应的分泌蛋白的小部份。相反在pro-CT的羧基端的P4和P6位都有Arg残基的融合蛋白被最有效地处理使之分泌出成熟Fc片段。当用嵌合质粒转染COS细胞以便形成带有Arg-pro-Arg-Ser-Lys-Arg裂解型主的融合蛋白时，在上清液中，测到微量融合蛋白，和大量此融合蛋白片段以及大量成熟的Fc片段。这结果表明：COS细胞提供了识别Arg-X-Arg-X-Lys-Arg序列的加工酶。2. pMEpro-CT质粒对表达生物活性重组体GIF的用途
由于上述对Fc片段分泌作用的实验表明，在COS细胞中，设想的毛皮素类酶的分裂型主是Arg-X-Arg-X-Lys-Arg，所以将该序列用于形成生物活性重组体GIF。利用CT1和CT2引物进行PCR扩增pro-CT cDNA(见表X)，然后将此扩增的cDNA插入PME-pro-CT质粒中。通过上述针对SRαhcGIF的方法，将人GIF cDNA引入该质粒中，而后与pro-CT cDNA融合。该质粒转染入COS细胞导致了13KDa GIF的分泌。
                     实施例14
       提纯于哺乳动物细胞中表达的重组体GIF产物
为进行亲和性提纯，按制造商推荐的程序，将单克隆抗人GIF，388F1(Thomas，et al.，J.Immunol.，148：729，1992)，或抗重组体鼠GIF的多克隆兔抗体与Affigel10(Biorad)，或HiTrap NHS-激活的柱(Pharmacia)偶联。单克隆抗体(2-3mg)或多克隆抗血清的球蛋白级分(8-12mg)与1ml凝胶偶联。
在4℃，于该免疫吸附剂上进行培养物上清液的分级。以超滤将COS-1细胞的培养物上清液浓缩10-20倍，而后将10-15体积该浓缩上清液通过1体积的免疫吸附剂柱过夜。若浓缩物体积有限时，则将2-4体积的上清液与1体积免疫吸附剂混合过夜，而后将此悬浮液填入该柱中。此柱用7-10柱体积的PBS洗涤，而残留在该柱中的蛋白用3-4柱体积的甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱。在用Tris缓冲液将pH调到7-8之后，用SDS-PAGE分析此试样，而后通过银染色或用多克隆抗重组体GIF的Western印迹法测GIF。部分洗涤级分和酸性洗脱级分以RPMI1640培养液透析以便作生物检测。酸性洗脱液级分中的13KDa蛋白的纯度高于90％。
此外，哺乳动物细胞衍生的GIF用常规的柱层析法提纯。在此例中，100ml COS-1上清液被浓缩10倍，然后于PBS平衡的TSKG2000SW(Toyo Soda)柱(21.5×600mm)上样。该柱于室温下以3ml/分的流量运行。正如采用多克隆抗GIF抗体进行Western印迹测定结果所示，GIF在估计为低分子量级分中洗脱。合GIF的各级分被汇集，而后用超滤浓缩，然后于20mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡的TSK DEAE-5PW(Toyo Soda)柱上样。该柱以0.5ml/分的流量于室温下运行。上样之后，用相同的缓冲液洗此柱，并且在此洗涤步骤中回收GIF。E.coli衍生的GIF和COS-1衍生的GIF之间在与DEAE结合能力方面的差异，可用存在O-连接的糖基化或磷酸化来解释。
用Vydac Protein C4逆相柱(The Separations Group)(4.6×150mm)进行GIF的进一步提纯。将得自DEAE柱的GIF级分(10ml)于100mM乙酸铵缓冲液平衡的C4柱上样，然后以0.4ml/分的流量，于室温用柱缓冲液中0-90％的乙醇梯度液提纯GIF。GIF洗脱入含50-60％乙醇的级分中，而后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和用多克隆抗GIF抗体的Western印迹对其鉴定。
                  实施例15
               重组体GIF的生物活性A.重组体GIF的GIF活性的评价
用测试样的使鼠T细胞杂交瘤12H5细胞从产生糖基化IgE-结合因子(IgE-BF)转换成产生非糖基化IgE-BF的能力来评价重组体人GIF的糖基化抑制活性(Iwata and Ishizaka，J.Immunol.，141：3270，1988)。在此检测中，12H5细胞与10μg/ml小鼠IgE，在有或没有测试样品存在时培养24小时。经CF50A膜过滤培养物上清液以去除IgE。将此滤液通过小扁豆植物凝血素Sepharose柱，而后用2柱体积的DPBS洗此柱。残留在此柱上的蛋白用0.2Mα甲基甘露糖苷洗脱。与洗液合并的流过物级分和洗脱液级分分别以DPBS透析二天，而后将各级分浓缩。IgE-BF在各级分中的存在通过前述的方法(Yodoi，et al.，J.Immunol.，124：425，1980)以某一级分对带有以IgE包覆固定的牛红细胞的FcεR+B细胞形成玫瑰花结能力的抑制来评价。被线虫，钩虫brasiliensis感染的大鼠肠系膜淋巴节细胞被用作FcεR+细胞的来源。当12H5细胞与小鼠IgE单独培养时，基本上由该细胞产生的全部IgE-BF都与小扁豆植物凝血素Sepharose结合，而且通过甲基甘露糖苷洗脱而回收。这样，流出物/洗脱液馏份间的玫瑰花结抑制百分比小于0.2。如果将足量的GIF和小鼠IgE一起加到12H5细胞培养物中，则由此细胞所形成的IgE-BF的大部不存留于该小扁豆植物凝血素Sepharose中，并自流出物级分中回收。这样，如果流出物/洗脱物级分间的玫瑰花结抑制百分数之比为2.0或更高，则试验样品中的GIF记为(+)。
与质粒SRαhcGIF和SRα-furin共转染的COS-1细胞的培养物上清液有使12H5细胞从产生糖基化IgE-BF转换到产生非糖基化IgE-BF的能力。当用上述方法对20倍浓缩培养物上清液的一系列稀释液作GIF活性的评价时，该活性于1∶100的稀释液中测得。将浓缩上清液的4ml等分试样在2ml388F1(单克隆抗-GIF)偶联的Sepharose上分级；基本上全部活性物(＞75％)回收于酸性洗脱液级分中，其中只测到13KDa肽。用Western印迹鉴定出该蛋白是GIF。流过物和酸性洗脱液级分中的GIF生物活性滴定表明，该流过物级分中的活性物比洗脱液级分中回收的活性物1/10还小。要能检测出GIF活性则在洗脱液级分的最大稀释液中13KPa蛋白的浓度约为10ng/ml。
得自388F1 Affigel的酸性洗脱液级分，在与多克隆抗重组体mGIF的γ球蛋白级分偶联的Affigel上进一步分级。该级分中全部GIF生物活性物和13KDa肽均与该免疫吸附剂结合，并回收于酸性洗脱物级分中。该级分中的13KDa肽的浓度通过与作为对照物的E.coli衍生rGIF的一系列稀释液对比而估算。为测定GIF生物活性所必需的该蛋白最小浓度为5ng/ml。此结果综合地表明，活性重组体hGIF与单克隆抗-人GIF和与抗重组体GIF(13KDa)的多克隆抗体结合，而且可用酸性洗脱回收。
同样的培养物上清液在与单克隆抗-脂调节素141-B9偶联的Sepharose上分级。得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液级分仍有GIF活性物。
由于以pMEpro-CT-hGIF质粒转染COS-1细胞可得到人GIF(实施例13，D2)，所以将被转染的COS细胞的培养物上清液在388F1Affigel上分级，用酸性洗脱回收的13KDa肽进行GIF生物活性鉴定。以此法获得的10-20ng/ml13KDa肽对GIF活性测定足够了。此结果表明，实施例13D中所述的方法是形成高度生物活性GIF的有效方法。
为确定重组体hGIF的生物活性是否比得上杂交瘤衍生的GIF的生物活性，将产生GIF的人T细胞杂交瘤，31E9在DMEM中培养，而培养物上清液中的GIF使用与多克隆抗GIF抗体偶联的免疫吸附剂提纯。通过Western印迹估价酸性洗脱液级分中的13KDa GIF的浓度，并用12H5细胞标定该级分测GIF活性。结果表明，5-14ng/ml13KDa肽对使12H5细胞转变为产生非糖基化IgE-BF是足够的。因此看来就转换IgE-BF糖基化能力而言，重组体GIF与杂交瘤衍生的GIF差不多。该实验还表明，杂交瘤衍生的GIF与抗重组体GIF抗体反应。
由于先前的实验表明，当用碱性磷酸酶处理时鼠杂交瘤衍生的GIF生物活性提高了3-10倍(Ohno et al.，Internat，Immunol.，1：425，1989)，因此决定研究这种作用对重组体hGIF的生物活性的影响。将牛血清白蛋白以2mg/ml的浓度加至得自388F1-Affigel，亲和性提纯的rGIF中，然后以含0.1M NaCl的50mM TrisHCl缓冲液(pH8.2)透析。将该制品的一半与足量的不溶性碱性磷酸酶(Sigma)混合，得到5单位/ml的酶浓度，而后将此悬浮液于室温下轻轻混合2小时。此后，通过离心分离去除此酶，以RPMI1640培养液透析，然后将碱性磷酸酶处理过或未处理过的试样进行GIF活性测定。这些研究表明，未经处理的重组体GIF能以1∶30，稀释度转变12H5细胞使产生非糖基化IgE-BF，而以1∶60稀释度则不能，同时碱性-磷酸酶处理过的试样中的GIF活性可于1∶200的稀释度测得。
将E.coli转化而得，或以质粒SRαhGIF转染COS-1而得的重组体GIF制品，进行生物活性比较。由E.coli可溶级分衍生的提纯GIF(见实施例10A)，在388F1-Affigel，或多克隆抗-GIF偶联的Affigel上进一步分级，而后以酸性pH值洗脱而回收。
全部制品都在SDS-PAGE中给出13KDa单一带。通过银染色评估13KDa GIF的浓度，并用12H5细胞标定亲和性提纯GIF的GIF生物活性。该结果表明，要使细胞从产生糖基化IgE-BF转变为产生非糖基化IgE-BF，需要100-200ng/ml GIF。得自以质粒SRα-hGIF转染的COS-1细胞培养物上清液的GIF，还用S88F1-Affigel提纯，而后作GIF活性评估。对于转换12H5细胞而言，该13KDa GIF的最低浓度约为150ng/ml(表XI)。
                         表XI
             亲和提纯重组体GIF的生物活性重组体        免疫吸附剂   浓度a     GIF-        13KDa蛋白GIF                                   标定b      的最低浓度c
                       μg/ml                 ng/mlhcGIF         388F1         0.8       1∶100      8
          388F1接着     0.2       1∶40       5
          是多抗-GIF
          141B9         0.1       1∶10       10hGIF          388F1         1.5       1∶10       150E.coli-       388F1         2.0       1∶20       100衍生的GIF     未分级的      10.0      1∶10       1000
          多抗-GIF      2.0       1∶10       200a)各制品中的13KDa GIF蛋白浓度，以SDS-PAGE评估。b)用12H5细胞标定该制品的GIF活性。c)为使12H5细胞从形成糖基化IgE-BF，转换到形成非糖基化IgE-BF所需的13KDa的最低浓度。B.巨噬细胞移动抑制活性的缺少
由于GIF和MIF间cDNA核苷酸序列同源(Weiser，et al.，Supra，1989)，所以以GIF作MIF活性检测。人MIF抑制人单核细胞，豚鼠和小鼠的巨噬细胞的迁移，因此，用小鼠巨噬细胞确定重组体hGIF活性。将3ml消毒矿物油腹腔内注射入正常的BALB/c小鼠中，三天后回收腹腔渗出细胞。经FCS层离心分离回收单核细胞，而含约5×107单核细胞的细胞沉淀则被悬浮在预热过的，含15％FCS的DMEM中的50μl0.35％琼脂糖中。将1μg此悬浮液滴分散入平底96井微滴板各井的中心，该井在冰上保持5分钟。将含15％FCS的DMEM与欲被检测的样品，以100μl总体积加到各井中。一种试样作3或4次同样检测。用例象显微镜测量各液滴的直径。培育20-24小时后，测出移动细胞外区直径，而且计算出移动指数。用下面公式计算移动抑制百分比：移动抑制百分数＝[1－测试样品的移动指数/无样品的移动指数]
            ×100
用鼠γ-干扰素作阳性对照物评估rhGIF的MIF活性。用SRα-hcGIF和SRα-hfurin共转染的COS-1细胞得到重组体hGIF的系列稀释物，然后如上所述用388F1-Affigel进行亲和性提纯。即使该制品的GIF效价为1∶100，而最终以1∶8或1∶4稀释度也未测到明显的巨噬细胞移动。在同样实验中，1单位/ml IFNγ可抑制20-48％的巨噬细胞移动。
用琼脂滴中的人单核细胞(Remold.H.G and Menddis，A.D.，Methods in Enzymology，116：379，1985)用人MIF作阳性对照物证实了此结果。能使12H5细胞变得能形成未糖基化IgE-BF(以1∶100的稀释度)，并含约0.8μg/ml13KDa GIF肽的该重组体hGIF，却不能以1∶5的最终稀释度抑制人单核细胞的移动。此结果表明：在生物活性方面rhGIF与MIF不同。
                 实施例16
       用重组体hcGIF体外产生抗原特异性抑制T-细胞
先前的实验已表明，得自大鼠-小鼠T细胞杂交瘤23A4细胞的GIF有利于从已接触抗原的脾细胞产生抗原特异性抑制T细胞(Iwata，M.and Ishizaka，K；J.Immunol，141：3270，1988)。当为产生IgE抗体反应而用明矾吸附的卵清蛋白给BDF1鼠免疫接种时，它们的脾细胞主要分泌糖基化增强因子(GEF)，并因抗原刺激产生IgE增效因子(糖基化的IgE-BF)和结合抗原的GEF。如果该已接触抗原的脾细胞被卵清蛋白刺激，而抗原刺激的T细胞由IL-2在有GIF存在时繁殖，则此细胞分泌GIF。由于抗原刺激，这些细胞产生非糖基化IgE-BF和结合抗原的GIF，其后者以载体特异性方式抑制同源小鼠对DNP-OVA的抗体反应。为了更完全地研究此现象，决定确定重组体hcGIF是否有离体产生生成GIF的T细胞的能力。
用1μg吸附于氢氧化铝凝胶上的卵清蛋白(OVA)激发BDF1鼠以便产生IgE抗体反应。免疫后两周得到脾细胞，而悬浮液(5×106细胞/ml)用10μg/ml OVA培养三天以便激活已由抗原引发的T细胞。抗原激活细胞的等分试样(2.5×105细胞)用重组体鼠IL-2(50单位/ml)在有或无rhcGIF(0.25μg/ml)时繁殖。培养4天后，回收细胞，洗涤3次，以1.5×106细胞/ml的浓度再悬浮于新鲜培养基中。4ml从GIF(+)或GIF(-)培养物中回收的该细胞悬浮液，与8×105OVA激发的，有Iab和Iad的LB27.4细胞一起培育24小时，(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。抗原刺激的T细胞的培养物上清液用IgE偶联的Sepharose吸附，而IgE-BF通过酸性洗脱自此免疫吸附剂回收。然后得自该IgE-Sepharose的流过物级分在OVA偶联的Sepharose上分级。而结合OVA的因子用甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱而回收。得自IgE-Sepharose的洗脱物(即，IgE-BF)在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级以便确定该因子的性质。表XII中所示结果表明，得自单独用IL-2繁殖的T-细胞的IgE-BF的大部分结合于小扁豆植物凝血素Sepharose，而后用α-甲基甘露糖苷洗脱而回收。相反，在有hcGIF存在时用IL-2繁殖的T-细胞形成非糖基化的IgE-BF，它是不能在小扁豆植物凝血素Sepharose上存留的。
也评估GEF或GIF活性物与结合OVA的因子的联合。由于抗原刺激，单用IL-2繁殖的T-细胞形成结合OVA的GEF，而在有重组体GIF存在时繁殖的T-细胞则形成结合OVA的GIF(表XII)。已表明，得自这种T细胞的结合OVA的GIF能以抗原(载体)特异性的方式抑制BDF1小鼠的抗体反应(Iwata，M.and Ishizaka，K；J.Immunol.，1988)。因此，该重组体GIF有利于抑制T细胞的产生，该细胞产生抗原特异性抑制T细胞因子。
                  表XII
         以重组体hcGIF和IL-2生成产生GIF的细胞繁殖OVA特异性       IgE-BF的特性b       结合OVA的因子cT细胞a                                   GEF     GIFIL-2                    4/28               +       -IL-2+hcGIF              26/6               -       +a 在有或无重组体hcGIF存在时，用IL-2繁殖抗原刺激的T细胞。b 用IL-2繁殖的T细胞由抗原激发的LB27.4细胞刺激。上清液中的IgE-BF在小扁豆植物凝血素Sepharose上分级。数字代表流出物/洗脱液级分(分别得自小扁豆植物凝血素Sepharose)的玫瑰花结抑制百分比。c 得自OVA-Sepharose的酸性洗脱液级分，分别用12H5细胞和23A4细胞作GIF和GEF活性评估。
                  实施例17
            重组体GIF的体内活性重组体GIF的体内活性
先前的实验已表明：重复注射产生GIF的杂交瘤的培养物滤液的GIF富集级分于经免疫接种的鼠中，导致对IgE和IgG抗体反应的抑制，注射开始于接触抗原之日(Akasaki，M.，et al.，J.Immunol.，136：3172，1986)。为确定在体内重组体GIF是否具有同样效果，用实施例10和14中所述方法提纯表达于E.coli中的rhGIF(实施例10A)，和表达于COS-1细胞的rhGIF(实施例13A)至均一，然后评价它们抑制IgE和IgG1抗体反应的能力。通过i.p注射吸附于2mg明矾的0.2μg DNP-OVA给BDF1鼠免疫接种。重组体GIF于0、2、4、6、8、10及12天i.p.注射，然后通过ELISA测定血清中的抗-DNP抗体。
在此第一个实验中，PBS中的E.coli衍生的rGIF以每次注射18μg的剂量施用，而对照鼠只接受PBS注射。使12H5细胞从形成糖基化IgE-BF转换到形成非糖基化IgE-BF的最小rGIF浓度约为1μg/ml。
在对照和GIF处理的小鼠中，IgE抗体滴度在2周时达到最大值，然后下降，而IgG1抗-DNP抗体滴度在免疫接种后4-5周内持续上升。因此，2周时的IgE抗体滴度和4周时的IgG1抗体滴度被用于进行GIF处理组和未处理组间的对比。E.coli衍生的rGIF的效果
试样    N抗-DNP IgEa         IgG1b
对照    66.7±3.5             78.0
rGIF    31.5±1.3(p＜0.05)    4.5a免疫接种(μg/ml)后二同b免疫接种(μg/ml)后四周。
第二个实验中，将用SRα-hcGIF载体表达的，COS-1衍生的rhGIF，以每次注射2.5μg的剂量经腹膜给药。能转换12H5细胞使其形成非糖基化IgE-BF的hGIF最小浓度为0.2μg/ml。对照鼠仅用PBS注射。其结果示于下表：哺乳动物细胞系衍生的rGIF的效果
试样    N    抗-DNP IgEa(μg/ml)
对照    8    26±1.2
rGIF    5    0.70±0.55(p＜0.05)a免疫接种后2周
没有动物对GIF有不良反应。该实施例说明GIF的免疫抑制效果。
                  实施例18
        产生对抗原-特异性糖基化抑制因子的mABA.原料和方法1.抗原和抗体：
冷冻干燥的峰毒磷脂酶A2(PLA2)得自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。结晶的卵清蛋白(OVA)得自NutritionalBiochemical Corp.，Cl eveland，OH。相应于PLA2分子中的氨基酸残基13-28和25-40的合成肽由Pr.Howard Grey(Cytel Corp.，La Jolla，CA)提供。与PLA2分子中氨基酸19-35相应的肽由Kirin Pharmaceutical Laboratory，Maebashi，Japan合成。全部合成肽均由HPLC提纯，而且其氨基酸序列均被证实。
该单克隆抗人GIF抗体388F1(ATCC HB10472)于实施例5介绍。2.细胞系
实施例3中所述人T细胞杂交瘤细胞表达CD3和TCRαβ，而且主要分泌GIF。该细胞在含10％FCS、10％ NCTC135培养基(Gibco，Grand Island，NY)，10mM HEPES缓冲液，0.2μ/ml牛胰岛素(Sigma)，50μg/ml丙酮酸钠，150μg/ml草酰乙酸及抗生素的高葡萄糖DMEM中培养。
产生抗人GIF的B细胞杂交瘤，由已用亲和性提纯的结合抗原的GIF免疫接种(见后文)的BALB/c小鼠(Jackson Lab，BarHarbor，ME)的脾细胞构建。最后一次加强免疫后一周，通过已公开的方法(Iwata，et al.，J.Immunol.，132：1286，1984)使此脾细胞与次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏的Sp2/0AG14细胞(Schulman，et al.，Nature，271：269，1978)融合。通过有限稀释进行该杂交瘤的亚克隆。该杂交瘤保持在上述的完全DMEM中。3.GIF的分级与提纯：
将无血清培养基中未被刺激的AC5细胞培养物上清液中的非持异性GIF，在DEAE Sepharose柱上用层析法而富集。培养物上清液被浓缩20-100倍。用蒸馏水稀释3倍，用Tris调到PH8.0，然后通过已用含50mM NaCl的10mM Tris HCl缓冲液(pH8.0)平衡过的DEAESepharose(Pharmacia)柱。流过物级分与用缓冲液洗涤的洗液合并而后浓缩。原来的培养物上清液中的非特异性GIF，用388F1偶联的Affigel进行亲和性提纯。浓缩的培养物上清液经此免疫吸附剂再循环过夜。用30柱体积DPBS洗涤后，与此免疫吸附剂结合的蛋白用0.1M甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱而回收。
为产生结合抗原的GIF，通过CD3的交联刺激AC5细胞(Thomas，et al.，J.Immunol.，148：729，1992)。该细胞(5×106/ml)用5μg/ml单克隆抗-CD3(SPV-T3b)处理30分钟(于4℃)，然后该抗体处理的细胞于4℃用10μg/ml柱小鼠Ig培育30分钟。洗涤后，该细胞以2×106细胞/ml重悬浮于ABC培养基中，然后培养24小时。以超滤将培养物上清液浓缩10-15倍，而后经PLA2偶联的Sepharose柱再循环过夜。该柱用DPBS洗涤，存留于此柱中的蛋白通过0.1M甘氨酸HCl缓冲液(pH3.0)洗脱而回收。
亲和提纯的GIF通过经与HPLC(Beckman System Gold，Fulteron，CA)连接的Superose12柱(1.6×50cm，Pharmacia)以凝胶过滤而分级。用PBS，以0.85ml/分的流量将蛋白从此柱上洗脱。该柱用BSA(m.w.67,000)、OVA(m.w.43,000)、大豆胰蛋白酶抑制因子(m.w.20,1 00)和细胞色素C(m.w.12,500)校定。在某些实验中，亲和性提纯的GIF制品被还原及烷基化。于含0.15M NaCl的，0.05M Tris HCl缓冲液中将该GIF制品于室温下，用10mM的二硫苏糖醇培育1小时，而后用30％摩尔超量碘乙酰胺烷基化。将此还原和烷基化的试样于同样的Superose12柱上样，蛋白用PBS洗脱。4.ELISA检测
Nunc F板(Max Sorp，Nunc)中的每个井均用50μl GIF制品的系列稀释液涂覆于4℃过夜，每2井或3井为一组。在以下每个步骤(除加底物前的步骤外)之间用含0.05％Tween20(Sigma)磷酸盐缓冲盐水将这些板洗5次。在37℃用于Tween/PBS中的2％BSA将这些板封闭1小时。用一种放大系统测定mAb388F1与GIF的结合将50μl含150ng/ml生物素化的mAb388F1的PBS加于各井中。于37℃培育2小时后，然后洗涤，50μl适当稀释(1∶6000)的抗生蛋白链菌素偶联的碱性磷酸酶(Zymed)被加至各井中，而后将此板于37℃培育2小时。此板用含0.15M NaCl的0.05M Tris HCl缓冲液(pH7.5)中的0.05％Tween20洗涤，用50μl碱性磷酸酶底物培育30分钟，接着使用放大溶液(GIBGO/Bethesda Research Lab)将ELISA信号显现。以ELISA阅读器MR5000(Pynatech)测定490nm波长处的吸收率。
ELISA也用抗结合抗原的GIF进行。在Max Sorp板被GIF制品涂覆和用BSA封闭后，将50μg溶于PBS的mAb(200ng/ml)加于各井中，将该板于37℃培育2小时。视具体所试该mAb的同型物而异，或者将1∶3000稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgM(Biorad)或抗小鼠IgG(Zymed)加至各井，或者将1∶2000稀释度的HRP-偶联的抗小鼠IgG+A+M(Zymed)加至各井中。通过过氧化物酶底物(Zymed)显影ELISA信号，而后测定405nm波长处的吸收率。5.SDS-PAGE及免疫印迹
将亲和性提纯的GIF以0.01％SDS透析，而后冷冻干燥。试样用Laemei系统，以15％聚丙烯酰胺板状凝胶进行SDS凝胶电泳分析(Leamei，U.K.，Nature，227：680，1980)。通过银染色检测蛋白带(Ochs，et al.，Electrophoresis，2：304，1981)。为进行免疫印迹，在还原的条件下分析亲和性提纯的GIF。提纯的重组体GIF(得自E.coli)同时进行电泳，作为标准。SDS-PAGE凝胶中的蛋白于PVDF膜(Immobilon-P Milipore)上进行印迹分析，并用Blocker Blotto(Pierce)于4℃培养过夜而将该膜阻断。在用pH7.5的溶于PBS中的0.05％Tween20溶液洗涤后，用兔抗-rGIF的1μ/ml IgG级分处理此膜1小时(37℃)。兔IgG与蛋白带的结合使用HRP偶联的驴抗兔IgG和ECL Western印迹测定试剂(Amersham)，接着再用放射自显影法检测。X射线底片上的rGIF带位置被用作14KDa标准。B.制备对结合抗原的GIF具特异性的单克隆抗体
用抗CD3，接着用抗MGG处理AC5细胞，而后用PLA2偶联的Sepharose亲和性提纯该上清液中的结合抗原的GIF。该制品可于1∶30-1∶60的稀释度使12H5细胞从产生糖基化IgE-BF转换到产生非糖基化IgE-BF。通过i.p.注射0.1ml于CFA中的此制品，接着再5次增强注射不完全弗氏佐剂中的同样抗原给BALB/c小鼠免疫接种。最后一次增强注射后2周，将此动物杀死，而后将其脾细胞与B细胞系SP2/OAG14融合。
检测杂交瘤培养上清液的鼠Ig的存在。这些产生Ig的杂交瘤通过ELISA检测进一步检验其抗-GIF的存在。Maxi-Sorp各井被结合PLA2的GIF涂覆，而该培养物上清液中的小鼠Ig与GIF涂覆井的结合用HRP偶联的抗-鼠IgG+A+M确定。8种杂交瘤培养物上清液通过ECISA给出实质性的ELISA吸收率。8种杂交瘤上清液中抗GIF抗体的存在，用每种培养物上清液培养亲和提纯的，结合PLA2的GIF，接着将此混合物经Centricon100(Amersham)过滤而证实。将该滤液进行GIF活性检测表明，得自所有8种杂交瘤的抗体都与GIF结合，而结合PLA2的GIF滤液本身具有活性。
然后检查相同培养物上清液的抗非特异性GIF的单克隆抗体存在。Maxi-Sorp板以亲合性提纯的非特异GIF或抗原特异GIF涂覆，然后将每种B细胞杂交瘤的培养物上清液加到各井中。于37℃保温2小时后，洗涤各井，将1∶2000稀释度的HRP偶联山羊抗小鼠IgG+A+M加入各井中通过过氧化物酶底物将ELISA信号显影，再于405nm波长处测量。减去以GIF涂覆，并用HRP偶联的抗体和底物培育的对照井的吸收率。该实验结果表明，只有两种杂交瘤，即110和205，由于有结合PLA2的GIF(即抗原特异GIF)而给出实质上高于抗原非特异GIF引起的信号。通过有限稀释，使杂交瘤110和205亚克隆，而每个克隆的培养物上清液再通过ELISA试验测定单克隆抗体与结合PLA2的GIF之间的选择性结合。在反复亚克隆后，获得两种杂交瘤，即110BH3和205AD2的各亚克隆，其培养物上清液仅当具结合抗原的GIF时才给出ELISA信号。单克隆抗体110BH3是μk同型，而205AD2是。μk同型。
两种单克隆抗体都结合PLA2特异性GIF，但不能结合非特异的GIF，可以生物检测法来加以证实。GIF制品的等分试样用110BH3细胞或205AD2细胞的培养物上清液培育过夜，然后将该混合物经Centricon过滤。用12H5细胞测定该滤液中GIF活性表明，两种抗体均与结合PLA2的GIF结合，但不能与非特异GIF结合。接着，用1/3饱和度的硫酸铵液使其沉淀而自该杂交瘤培养物上清液中富集mAb110BH3，并将5mg IgM与1.5ml Sepharose偶联。将该得自AC5细胞的结合PLA2的GIF和非特异性GIF，在抗体偶联的Sepharose上分级。通过在PLA2偶联Sepharose上亲和性提纯。由抗CD3处理的AC5细胞培养物上清液制备结合PLA2的GIF，而非特异性GIF则用388F1偶联的Sepharose，由未经刺激的AC5细胞培养物上清液制备。表XIII中所示的结果表明，结合PLA2的GIF与免疫吸附剂结合，并通过酸pH值洗脱而回收，而非特异GIF不能存留在此免疫吸附剂上。
                   表XIII
        在110BH3偶联的Sepharose上分级GIF制品a
得自免疫吸附剂的            结合PLA2的GIF           非特异性   GIF
            级分b     稀释度    GIF活性c   稀释度     GIF活性c
未分级                 1∶10     25/0(+)     1∶30      28/0(+)
流过物                 1∶2      0/30(-)     1∶30      29/4(+)
洗液                   1∶2      0/23(-)     1∶2       3/32(-)
洗脱液                 1∶10     25/0(+)     1∶2       0/30(-)
培养液对照                       0/33                   1/30a 结合PLA2的GIF和非特异的GIF可分别以1∶10和1∶30的稀释度，使12H5细胞从形成糖基化IgE-BF转换成形成非糖基化IgE-BF。b 1ml GIF制品与0.25ml110BH3偶联的Sepharose混合。将流过物级分和1ml含DPBS的洗液合并(流过物级分)。用5mlBPBS洗柱(洗液)，而用pH3.0的1ml甘氨酸HCl缓冲液洗脱(洗脱液)。透析后，每个级分都浓缩至1.0ml以便作GIF检测。c 用12H5细胞确定GIF活性。列中的数字表示得自小扁豆值物凝血素Sepharose的流出物/洗脱液级分的玫瑰花结抑制百分比(c.f法)，(+)(-)表示GIF活性的存在与否。
作过种种用ELISA检测该结合抗原的GIF和非特异性GIF的尝试。用在DEAE-Sepharose柱上的离子交换柱层析法分级未刺激AC5细胞培养物上清液，富集非特异性GIF。带有含50mM NaCl的Tris缓冲液的流过物级分被浓缩。抗CD3刺激细胞的培养物上清液中的结合抗原因子，用PLA2偶联的Sepharose提纯，而酸性洗脱液中的因子在110BH3偶联的Sepharose上再分级。抗原特异性和非特异性GIF制品使12H5细胞从形成糖基化IgG-BF转换到形成未糖基化IgE-BF，稀释度为1∶60。接着，Max-Sorb井用该制品之一种的系列稀释液涂覆，而且，封闭后，将388F1或110BH3涂于该井。非特异性GIF和结合抗原的GIF制品使mAb388F1均给出ELISA信号，而mAb110-BH3只与结合抗原的因子反应，却不与非特异性GIF反应。因为在该检测中，当mAb以不相关IgG2a或IgM置换时便没有信号被检出，那么看来ELISA信号是由于mAb的特异性结合而出现。
用PLA2-Sepharose接着用110BH3-Sepharose得到了亲和提纯的上述结合抗原的因子，并通过SDS-PAGE分析此制品。用PLA2-偶联Sepharose，接着用110BH3偶联的Sepharose提纯结合抗原的GIF。得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液级分在有0.01％SDS存在时以蒸馏水透析，然后冷冻干燥。通过在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE和银染色分析该制品。在非还原条件下，该制品给出了三个主带：85KDa、66KDa、58KDa及一个次带13KDa。在还原条件下，85KDa带消失而测到若干新带。由于在还原条件下测到的主带之一是14KDa该迁移率相当于非特异性GIF的迁移率，于是进行分析，以确定此带是否为GIF。通过在110BH3-Sepharose上的亲和性色谱法从抗CD3刺激的AC5细胞培养物上清液中得到结合抗原的GIF的另一制品。使用12H5细胞从免疫吸附剂的流过物级分和酸性洗脱液级分的系列稀释液中标定GIF活性表明该培养物上清液中GIF活性物大部分与该免疫吸附剂结合，而且通过酸性洗脱被回收。在该洗脱液级分的1∶30稀释液中测得活性，而该流过物级分都给出1∶6的GIF效价。如表XIV中所示，mAb110BH3和205AD2二者均使该洗脱液级分给出ELISA信号。而流出物级分以该抗体给不出明显ELISA信号。然而当使用对非特异性GIF的抗体(388F1)时，尽管洗脱液级分含浓度非常高的GIF，而流过物级分仍可给出弱的，但明确的ELISA信号。然后在还原条件下进行SDS-PAGE，接着用抗rGIF的多克隆抗体作免疫印迹试验分析该洗脱液级分。将得自E.coli的重组体GIF涂于同样凝胶的下一个井中。在还原条件下电泳后，凝胶中的蛋白被转移到PVDF膜，该膜随后用抗rGIF的γ球蛋白级分处理。在两种膜中，被用作对照物的rGIF在X光底片上给出清晰的谱带(未示出)。由于分子量标志不包括任何小于18KDa的蛋白，所以在X射线底片上的rGIF带被用作13KDa标志。该结果表明，该抗体确实与13KDa带结合。13KDa带和非特异GIF间的关系通过分析非特异GIF而确定，该GIF是自未经刺激AC5细胞培养物上清液中，以亲和性层析法(在388F1偶联的Sepharose上进行)提纯的。通过SDS-PAGE和用抗-rGIF抗体的免疫印迹分析此非特异GIF制品表明，该制品也含与此抗体反应的13KDa蛋白。
                表XIV
       GIF活性和GIF抗原在得自110BH3-Sepharosea
           的流过物和洗脱液级分间的分布得自110BH3-          GIFb效价        ELISA信号Sepharose的级分                   205DA2c 110BH3c 388F1 d流过物               1∶3         0.063    0.093    0.36酸性洗脱物           1∶15        0.750    1.068    0.86a 抗CD3处理细胞培养物上清液被浓缩然后在110BH3-Sepharose上分级。各级分被浓缩至浓缩上清液的原体积，稀释2倍而后滴定GIF活性和进行ELISA检测。b 使12H5细胞从产生糖基化IgE-BF转换成产生非糖基化IgE-BF的级分的最大稀释度。c 在405nm波长处的吸收。d 在490nm波长处的吸收。
假定13KDa GIF和结合抗原的多肽链彼此联合形成结合抗原的GIF。如果情况如此，那么在生理学条件下，结合抗原的GIF的分子量要大于非特异性GIF的分子量。为检验这种可能性，将得自AC5细胞的结合PLA2的GIF用110-BH3-Sepharose部分提纯，而该制品经Superose12柱凝胶过滤被分级。各级分用mAb388F1和110BH3作ELISA分析，测定结合抗原的GIF。结果表明，用mAb388F1测出的GIF大部分是55.5和60.5分之间从该柱洗脱的，峰值在58.5分。该分子量，从其洗脱时间估计，是74KDa。正如预料的一样，用12H5细胞进行生物检测该级分含GIF活性。应注意到由于mAb110BH3，该含GIF的级分给出ELISA信号。此结果有力地说明，由mAb388F1所识别的抗原决定簇和由mAb110BH3所识别的抗原决定簇与同样的分子相联合。
如果结合抗原的GIF确实由结合抗原的链和非特异性GIF构成，那么该结合抗原的GIF可通过还原和烷基化处理被分解成单独的多肽。
为探讨这种可能性，将亲和性提纯的结合抗原的GIF于10mM DTT中还原。用碘乙酰胺烷基化后，将此试样于相同的Superose12柱上样，然后通过ELISA确定388F1-抗原和110BH3抗原的分布。此结果表明，被还原和烷基化的原料中的GIF约一半被回收于其洗脱时间与15KDa分子相应的级分中。由于当原始的结合抗原的GIF被分级时，同样的级分却不含GIF，所以15KDa看来是由此结合抗原的GIF衍生的。此实验还表明，由110BH3所识别的分子的两个峰值，若第一峰与原始的结合抗原的GIF相应，而第2峰的洗脱时间则与62-64KDa相应。由于用ELISA测定后一级分不含显著量的GIF，那么此级分中的蛋白应是引起抗原特异结合的结合抗原的GIF的裂解产物。C.结合抗原的GIF的抗原决定簇特异性
曾进行一些实验来证明结合PLA2的GIF对峰毒PLA2是特异性的。从抗CD3刺激的AC5细胞的培养物上清液中，用PLA2偶联的Sepharose，继以酸性pH洗脱结合的蛋白，提纯该结合抗原的GIF。将该制品的等分试样与OVA-偶联的Sepharose混合过夜，然后测定流过物和洗脱液级分中的GIF活性。正如期望的那样，基本上全部GIF活性物不能在OVA-Sepharose中存留，而是回收于流过物级分中。用DPBS洗OVA-Sepharose，而后用甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱该免疫吸附剂。然而在该酸性洗脱液级分中未测到GIF活性。
由于前面对得自鼠Ts杂交瘤383的结合PLA2的GIF所作实验已表明，该因子具有与代表蜂毒PLA2分子中的氨基酸残基19-34的肽的亲和活性，因此决定研讨得自AC5细胞的人结合抗原的GIF是否可与偶联了代表PLA2分子中的氨基酸19-35之合成肽的Sepharose相结合。如表XV中所示，基本上该制品中全部GIF活性物都被p19-35Sepharose吸收，并通过酸性pH的洗脱而回收。为证实抗原决定簇特异性，用0.2mg/ml代表氨基酸13-28、19-25或25-40的合成肽培育结合PLA2的GIF的等分试样6小时，每种混合物均被PLA2-Sepharose吸附。测定流过物级分和酸性洗脱液级分中的GIF活性表明，GIF与PLA2-Sepharose的结合被p13-28或p19-35所阻断，但不被p25-40阻断(表XV)。该结果被ELISA证实。当结合PLA2的GIF在存在或不存在p25-40的情况下均被PLA2-Sepharose吸附时，得自该免疫吸附剂的酸性洗脱液级分以110BH3可给出ELISA信号。而同时该流过物级分则不给出此信号。如果在有p19-25存在时，同样的结合PLA2的GIF被相同免疫吸附剂吸附，那么，该流出物级分，而不是酸性洗脱级分采用单克隆抗体可给出ELISA信号。综合这些结果表明，PLA2分子中的氨基酸 9-28的序列含有被结合抗原的GIF所识别的抗原决定簇。
                  表XV
          结合PLA2的GIF的抗原决定簇特异性例       免疫吸附剂      所加的肽            GIF活性c
                                 流过物级分  洗脱液级分1a    PLA2-Sepharose  无           2/28(-)     23/6(+)
   P19-35-Sepharose  无           3/30(-)     28/4(+)
   培养液对照        无           4/28        ——2b
   PLA2-Sepharose   无           0/28(-)     27/3(+)
                     P13-28       22/0(+)     0/23(-)
                     P19-35       20/5(+)     0/28(-)
                     P25-40       2/25(-)     23/0(+)
   培养液对照        无           3/24        ——a 其GIF效价为1∶10的6ml得自PLA2-Sepharose的酸性洗脱液级分，是在1.5ml与p19-35偶联的Sepharose上分级的，每种流过物、洗涤液和酸性洗脱液级分都被调到6.0ml，而其GIF活性用12H5细胞测定。b 其GIF效价为1∶30的，得自PLA2-Sepharose的酸性洗脱液级分的0.5ml等分试样，与0.5ml PLA2-Sepharose，在有或没有适宜的肽存在时混合过夜。得自PLA2-Sepharose的流过物级分和酸性洗脱液级分均被调到1.0ml，以RPMI1640培养液透析，然后作GIF活性测定。将1ml12H5细胞悬浮液与等体积的欲被检测的试样混合，然后在有IgE存在时培养。c 此值代表得自小扁豆植物凝血素Sepharose的流出物/洗脱液级分的玫瑰花结抑制百分数。(+)(-)表示存在或不存在GIF。材料的保藏
下列细胞系已在美国典型培养物保藏中心，1301RarklawnDrive，Rockvill，MD，USA(ATCC)保藏：
细胞系    ATCC 入藏号    保藏日
388F1    HB   10472    May31，1990
AC5       HB   10473    May31，1990
31E9      HB   11052    June2，1992
110BH3    HB   11345    May14，1993
这些寄存根据Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganism for thePurpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder(Budapest Treaty)条款进行，该条款保证存活培养物从保藏之日起保持30年。一旦相关之US专利公告，或对任何美国或外国应用专利之公众公开，无论哪一项先行公开，则任何公众可根据保证公众对该培养物后代享有永久和不受限制的获取权的该布达佩斯条约，通过ACTT，均能获得该生物体，并能保证根据35USC§122所授权的美国专利和商标局局长及按局长的具体执行规则所指定的个人，享有对该培养物后代的获取权(包括具体与886OG638相关的37CFR§1.14)。
本申请的受托人已同意，如果在适当的条件下培养时该培养保藏物死亡，遗失或损坏，将根据通知立即用同样的培养物之存活样品替换。保藏菌种获取权不能被解释成可违背经政府当局根据其专利法所授之权利而实施本发明的执照。
上述详细说明被认为足以使本领域中普通技术人员实施本发明。本发明不限于由已保藏的细胞系所限定的范围，因为保藏的例子旨在作本发明的某一方面的单一解释，而任何功能等同的细胞系均在本发明的范围之中。材料的保藏不构成这样一种认可；即本文所包含的陈述对使本发明的任何方面都能得以实施是不足的，这包括其最佳模式同时也不被解释为将权利要求的范围限制于其所代表的特定的说明之中。确实，除在本文中已展示和陈述过的之外，本发明的各种改变，若本领域中普通技术人员参照以上陈述，将是显而易见的，而这些改变也落在所附的权利要求范围之中。
                   序列概述SEQ ID NO：1是肽AP-1的氨基酸序列(第52页，第2行)；SEQ ID NO：2是肽AP-23的氨基酸序列(第52页，第4行)；SEQ ID NO：3是肽AN-4的氨基酸序列(第52页，第11行)；SEQ ID NO：4是肽AN-5的氨基酸序列(第52页，第12行)；SEQ ID NO：5是肽AN-7的氨基酸序列(第52页，第13行)；SEQ ID NO：6是肽T-1的氨基酸序列(第52页，第21行)；SEQ ID NO：7是鼠GIF的N-末端PVDF-固定的蛋白的氨基酸序列(第53页，第1行)；SEQ ID NO：8是用于鼠GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第53页，第8行)；SEQ ID NO：9是用于鼠GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第53页，第10行)；SEQ ID NO：10是用于人GIF cDNA克隆的5′→3′引物的核苷酸序列(第56页，第10行)；SEQ ID NO：11是用于人GIF cDNA克隆的3′→5′引物的核苷酸序列(第56页，第12行)；SEQ ID NO：12是用于在鼠GIF cDNA两端产生AflII和BamHI限制位点的5′→3′引物的核苷酸序列(第57页，第9和10行)；SEQ ID NO：13是用于在鼠GIF cDNA两端产生限制点位AftII和BamHI的3′→5′引物的核苷酸序列(第57页，第11行)；SEQ ID NO：14是用于在人GIF cDNA上产生BglII或KpnI位点的5′→3′引物的核苷酸序列(第62页，第6行)；SEQ ID NO：15是用于在人GIF cDNA上产生RglII或KpnI位点的3′→5′引物的核苷酸序列(第62页，第8行)；SEQ ID NO：16具有PstI的5′→3′引物的核苷酸序列(第63页，第21行)；SEQ ID NO：17具有PstI的3′→5′引物的核苷酸序列(第63页，第22行)；SEQ ID NO：18，20，和22是用于克隆人furin cDNA的5′→3′引物的核苷酸序列(第65页，第5，7和9行)；SEQ ID NO：19，21，和23是用于克隆人furin cDNA的3′→5′引物的核苷酸序列(第65页，第6，8和10行)；SEQ ID NO：24是人pro-ct的引物(CT1)的核苷酸序列(第68页，第4行)；SEQ ID NO：25是人pro-ct的引物(CT2)的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(第68页，第4行)；SEQ ID NO：26是人pro-ct的引物(CT2)的推断氨基酸序列；SEQ ID NO：27是人pro-ct的引物(CT3)的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(第68页，第4行)；SEQ ID NO：28是人pro-ct的引物(CT3)的推断氨基酸序列；SEQ ID NO：29是人pro-ct的引物(CT4)的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(第68页，第4行)；SEQ ID NO：30是人pro-ct的引物(CT4)的推断氨基酸序列；SEQ ID NO：31是人pro-ct的引物(CT5)的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(第68页，第4行)；SEQ ID NO：32是人pro-ct的引物(CT5)的推断氨基酸序列；SEQ ID NO：33是用于分离Fc cDNA的5′端引物，G1的核苷酸序列(第69页，第11和12行)；SEQ ID NO：34是用于分离Fc cDNA的3′端引物的核苷酸序列(第69页，第13行)；SEQ ID NO：35是鼠GIF的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(图1)；SEQ ID NO：36是鼠GIF的推断氨基酸序列(图1)；SEQ ID NO：37是人GIF的核苷酸序列(和推断氨基酸序列)(图2)：SEQ ID NO：38是人GIF的推断氨基酸序列(图2)。
                       序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：La Jolla Institute for Allergy and
           Immunology(ⅱ)发明名称：生产生物活性多肽的重组体的方法(ⅲ)序列数：38(ⅳ)通讯地址：
   (A)收信人：Spensley Horn Jubas&Lubitz
   (B)街道：1880Century Park East，Suite500
   (C)城市：Los Angeles
   (D)州：California
   (E)国家：USA
   (F)邮编：90067(ⅴ)计算机可读型式：
  (A)媒介类型：Floppy disk
   (B)计算机：IBM PC compatible
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(ⅵ)本申请资料：
   (A)申请号：PCT
   (B)申请日：1994，5，13
   (C)分类：(ⅷ)代理人/事务所信息：
   (A)姓名：Wetherell，Jr.，Ph.D.，John R.
   (B)登记号：31，678
   (C)参考/备审号：FD-2581
(ⅸ)电讯信息：
    (A)电话：(619)455-5100
    (B)传真：(619)455-5110(2)SEQ ID NO：1的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：11个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅶ)直接来源：
   (B)克隆：AP-1(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：肽
   (B)位置：1..11(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO：2的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅶ)直接来源：
    (B)克隆：AP-23
(ⅸ)特点：
    (A)名称/关键词：肽
    (B)位置：1..20
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg    1
   5               10                      15Val Tyr Ile Asn
        20(2)SEQ ID NO：3的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：15个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅶ)直接来源：
   (B)克隆：AN-4(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：肽
   (B)位置：1..15(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Xaa Asn Gly Ser Thr Phe Ala1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：4的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：13个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅶ)直接来源：
   (B)克隆：AN-5(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：肽
   (B)位置：1..13(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile Gly Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO：5的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：15个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽   (ⅶ )直接来源：
    (B)克隆：AN-7(ⅸ)特点：
    (A)名称/关键词：肽
    (B)位置：1..15(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：5：Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：6的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：11个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅶ )直接来源：
   (B)克隆：T-1(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：肽
   (B)位置：1..11(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：6：Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg1               5                   10(2)SEQ ID NO：7的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：15个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅶ)直接来源：
   (B)克隆：N-末端(ⅸ )特点：
   (A)名称/关键词：肽
   (B)位置：1..15(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：8的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：36个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..36(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：8：ATGCCGATGT TCATCGTAAA CACCAACGTG CCCCGC(2)SEQ ID NO：9的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：36个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..36(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：9：GCCGATGCTG TGCAGGCTGC AGAGCGCGCA CGGCTC                              36(2)SEQ ID NO：10的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：60个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..60(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：10：AACCTAAGA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TAATGCCGAT GTTCATCTAA AACACCAACG    60(2)SEQ ID NO：11的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：42个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..42(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：11：CACCCGACCT TGTTGAGGTG GAAGCGGATT ATCCCTAGGC AA                       42(2)SEQ ID NO：12的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：60个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..60(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：12：AACCTTAAGA AAAACCAAGG AGGTAATAAA TAATGCCTAT GTTCATCGTG AACACCAATG    60(2)SEQ ID NO：13的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：43个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..43(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：13：GCACCCGACC TTGCCAAGGT GGAAGCGAAC TATCCCTAGGCAA    43(2)SEQ ID NO：14的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：39个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..39(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：14：CCCAGATCTA AGCGGATGCC GATGTTCATC GTAAACACC       39(2)SEQ ID NO：15的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：32个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..32(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：15：CCTTGTTGAG GTGGAAGCGG ATTCCATGGC AA             32(2)SEQ ID NO：16的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：26个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..26(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：16：AACTGCAGAT GGGCTTCCAA AAGTTC                   26(2)SEQ ID NO：17的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：32个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..32(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：17：GACCTGTCGG GGTCTAGATT CGCCGACGTC CA              32(2)SEQ ID NO：18的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：33个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..33(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：18：AAGAATTCCC CCATGGAGCT GAGGCCCTGG TTG             33(2)SEQ ID NO：19的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..28(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：19：GTGGTTGTCA TAGATGTGCG ACAGGTAG          28(2)SEQ ID NO：20的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..28(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：20：ACACCAACAG TATCTACACG CTGTCCAT         28(2)SEQ ID NO：21的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..28(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：21：TACCCAAATT ACTGACCCGG AAGTACTG               28(2)SEQ ID NO：22的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：21个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..21(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：22：ACTACTCCGC AGATGGGTTT A                   21(2)SEQ ID NO：23的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：29个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..29(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：23：TTTCTGGTCT CGCGGGA6AC TCTTAAGAA           29(2)SEQ ID NO：24的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..28(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：24：GAATTCTGTC ATGGGCTTCC AAAAGTTC           28(2)SEQ ID NO：25的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：30个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：25：CTG GAC AGC CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGA    30Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：26的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：26：Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：27的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：30个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：27：CTG GAC AGA CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA      30Leu Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：28的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：28：Leu Asp Arg Pro Met Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：29的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：30个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ )特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：29：CTG GAC AGA CCC AGA TCC AAG AGA TCT AGA     30Leu Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：30的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：30：Leu Asp Arg Pro Arg Ser Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：31的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：30个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性   (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：31：CTG GAC AGC CCC ATG TCC AAG AGA TCT AGA     30Leu Asp Set Pro Met Ser Lys Arg Set Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：32的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：10个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：32：Leu Asp Ser Pro Met Set Lys Arg Ser Arg1               5                  10(2)SEQ ID NO：33的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：25个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)   (ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..25(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：33：CTCTAGAGAC AAAACTCACA CATGC          25(2)SEQ ID NO：34的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：1..28(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：34：GGCGGCCGCC GCACTCATTT ACCCGGAG               28(2)SEQ ID NO：35的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：635个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)   (ⅶ )直接来源：
   (B)克隆：鼠GIF(ⅸ )特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：82..426(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：35：GGCACGACGT CAGGTCCCTG GCTTGGGTCA CACCGCGCTT TGTACCGTCC TCCGGTCCAC      60GCTCGCAGTC TCTCCGCCAC C ATG CCT ATG TTC ATC GTC AAC ACC AAT GTT        111
                    Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val
                      1               5                  10CCC CGC GCC TCC GTG CCA GAG GGG TTT CTG TCG GAG CTC ACC CAG GAG        159Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln
             15                  20                  25CTG GCG CAG CGC ACC GGC AAG CCC GGA CAG TAC ATC GCA GTG CAC GTG        207Leu Ala Gln Arg Thr Gly Lys Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val
         30                  35                  40GTC CCG GAC CAG CTC ATG ACT TTT AGC GGC ACG AAC GAT CCC TGC GCC        255Val Pro Asp Gln Leu Met Thr Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala
     45                  50                  55CTC TGC AGC CTG CAC AGC ATC GGG AAG ATC GGT GGT GCC CAG AAC CGC        303Leu Cys Ser Leu His Ser Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg
 60                  65                  70AAC TAC AGT AAG CTG CTG TGT GGC CTG CTG TCC GAT CGC CTG CAC ATC        351Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile75                  80                  85                  90AGC CCG GAC CGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCT GCC AAC        399Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn
             95                 100                 105GTG GGC TGG AAC GGT TCC ACC TTC GCT TGAGTCCTGG CCCCACTTAC              446Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr Phe Ala
        110                 115CTGCACCGGT GTTCTTTGAG CCTCGCCTCT CCACGTAGTG TTCTGTGTTT ATCCACCGGT      506AGCGATGCCC ACCTTCGAGC CGGGAGAAAT AAATGGTTTA TAAGAGACCA AAAAAAAAAA      566AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA      626AAAAAAAAA                                                              635(2)SEQ ID NO：36的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：115个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：36：Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro1               5                  10                  15Glu Gly Phe Leu Ser GIu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Arg Thr Gly
         20                  25                  30Lys Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met
     35                  40                  45Thr Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser
 50                  55                  60Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu65                  70                  75                  80Cys Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr
             85                  90                  95Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser
    100                     105                 110Thr Phe Ala
    115(2)SEQ ID NO：37的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：557个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)股：单股
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)   (ⅶ)直接来源：
   (B)克隆：人GIF cDNA(ⅸ)特点：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：75..419(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：37：CAGGCACGTA GCTCAGCGGC GGCGCGGCGC GTGCGTCTGT GCCTCTGCGC GGGTCTCCTG      60GTCCTTCTGC CATC ATG CCG ATG TTC ATC GTA AAC ACC AAC GTG CCC CGC        110
            Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg
              1               5                  10GCC TCC GTG CCG GAC GGG TTC CTC TCC GAG CTC ACC CAG CAG CTG GCG        158Ala Ser Val Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala
     15                  20                  25CAG GCC ACC GGC AAG CCC CCC CAG TAC ATC GCG GTG CAC GTG GTC CCG        206Gln Ala Thr Gly Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val Mis Val Val Pro
 30                  35                  40GAC CAC GTC ATG GCC TTC GGC GGC TCC AGC GAG CCG TGC GCG CTC TGC        254Asp His Val Met Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys45                  50                  55                  60AGC CTG CAC AGC ATC GGC AAG ATC CGC GGC GCG CAG AAC CGC TCC TAC        302Ser Lau His Ser Ile Gly Lys Ile Arg Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr
             65                  70                  75AGC AAG CTG CTG TGC GGC CTG CTG GCC GAG CGC CTG CGC ATC AGC CCG        350Ser Lys Leu Leu Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro
         80                  85                  90GAC AGG GTC TAC ATC AAC TAT TAC GAC ATG AAC GCG GCC AAT GTG GGC        398Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly
     95                 100                 105TGG AAC AAC TCC ACC TTC GCC TAAGAGCCGC AGGGACCCAC GCTGTCTGCG           449Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala
110                 115CTGGCTCCAC CCGGGAACCC GCCGCACGCT GTGTTCTAGG CCCGCCCACC CCAACCTTCT      509GGTGGGGAGA AATAAACGGT TTAGAGACTA AAAAAAAAAA AAAAAAAA                   557(2)SEQ ID NO：38的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：115个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：蛋白(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：38：Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro1               5                  10                  15Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Lau Ala Gln Ala Thr Gly
         20                  25                  30Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp His Val Met
     35                  40                  45Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser
 50                  55                  60Ile Gly Lys Ile Arg Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu65                  70                  75                  80Cys Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr
             85                  90                  95Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser
        100                 105                 110Thr Phe Ala
    115

Claims (49)

1.产生基本上纯的，生物活性的，由结构基因编码的多肽的方法，该法包括：
a.培养由编码下式融合多肽的多核苷酸序列转化的真核细胞：
  R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-R2；
其中R1是载体肽，R2是由结构基因编码的多肽，X1是Lys或Arg，而X2是任何氨基酸；
b.分离基本纯的由该结构基因编码的多肽。
2.权利要求1的方法，其中该载体肽是蛋白前体的前区。
3.权利要求1的方法，其中该前区是降钙素前体衍生的。
4.权利要求1的方法，其中由该结构基因编码的该多肽是抗原非特异性糖基化抑制因子(GIF)。
5.权利要求1的方法，其中该GIF是鼠的。
6.权利要求1的方法，其中该GIF是人的。
7.产生基本纯的，生物活性GIF的方法，该法包括：
a.培养用含有以可操作方式连接的，编码GIF的多核苷酸的载体转染的宿主细胞；
b.分离此基本纯的，生物活性的GIF。
8.权利要求7的方法，其中编码GIF的多核苷酸，以可操作方式连接于编码下式多肽的多核苷酸上：
  R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-Arg]-；
其中R1是载体肽，X1是Lys或Arg，X2是任何氨基酸。
9.权利要求8的方法，其中该载体肽是一种蛋白前体的前区。
10.权利要求9的方法，其中该前区是降钙素前体衍生的。
11.权利要求7的方法，其中该GIF是鼠的。
12.权利要求7的方法，其中该GIF是人的。
13.抑制人对抗原的免疫反应的方法，该方法包括给人施用免疫抑制有效量的抗原非特异性GIF。
14.权利要求13的方法，其中该施用是肠胃外的。
15.权利要求14的方法，其中该肠胃外施用通过皮下、肌肉内、腹膜内、腔内，透皮或静脉注射进行。
16.权利要求13的方法，其中该施用以约0.001mg/公斤/剂-约2mg/公斤/剂的剂量进行。
17.权利要求13的方法，其中该施用以约0.001mg/公斤/剂-约0.2mg/公斤/剂的剂量进行。
18.一种药用组合物，它包含免疫抑制量的基本纯的抗原非特异性GIF和药学上惰性的载体。
19.权利要求18的药用组合物，其中该GIF是人的。
20.权利要求18的药用组合物，其中该GIF是鼠的。
21.下式的基本纯的融合多肽：
   R1-[X1-X2-X1-X2-Lys-arg]-R2其中R1是载体肽，R2是由一种结构基因编码的多肽，X1是Lys或Arg，X2是任何的氨基酸。
22.权利要求21的融合多肽，其中该载体肽是蛋白前体的前区。
23.权利要求22的融合多肽，其中该前区是降钙素前体衍生的。
24.权利要求21的融合多肽，其中由结构基因编码的多肽是抗原非特异性糖基化抑制因子(GIF)。
25.权利要求24的融合多肽，其中该GIF是鼠的。
26.权利要求24的融合多肽，其中该GIF是人的。
27.被分离的编码权利要求21的融合多肽的多核苷酸序列。
28.含权利要求27的多核苷酸的重组体表达载体。
29.权利要求28的载体，其中该载体是病毒。
30.权利要求28的载体，其中该载体是质粒。
31.含权利要求28的载体的宿主细胞。
32.权利要求31的宿主细胞，其中该宿主是真核生物。
33.权利要求32的宿主细胞，其中该宿主是COS。
34.与抗原特异性GIF上的抗原决定簇结合的单克隆抗体。
35.权利要求34的单克隆抗体，其中该单克隆抗体具有由ATCC入藏号HB11345的杂交瘤细胞系110BH3所产生的单克隆抗体的特异性。
36.权利要求34的单克隆抗体，其中该单克隆抗体是由ATCC入藏号HB11345的杂交瘤细胞系110BH3所产生的单克隆抗体。
37.一种被分离的编码抗原非特异性GIF的多核苷酸序列。
38.权利要求37的多核苷酸，其中该GIF序列选自由下列核酸序列所组成的组：
a.图1，其中T也可为U；
b.图2，其中T也可为U；
c.与图1和2互补的核酸序列，及
d.长度至少为15个碱基，而且可选择性地与编码GIF的基因组DNA杂交的a，b，或c的片段。
39.含权利要求37的多核苷酸序列的重组体载体。
40.权利要求39的载体。其中该载体是病毒。
41.权利要求39的载体。其中该载体是质粒。
42.含权利要求39的载体的宿主细胞。
43.权利要求42的宿主细胞，其中该宿主是原核生物。
44.权利要求43的宿主细胞，其中该宿主是E.coli。
45.权利要求42的宿主细胞，其中该宿主是真核生物。
46.权利要求45的宿主细胞，其中该宿主是COS细胞。
47.产生生物活性GIF的方法，该法包括：
a.培养权利要求42的宿主细胞，及
b.将基本纯的GIF从该培养物中分离。
48.权利要求47的方法，其中该宿主是真核生物。
49.权利要求48的方法，其中该宿主是COS细胞。
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