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CN1197966C - 肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、及其制备和用途 - Google Patents

肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、及其制备和用途 Download PDF

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CN1197966C CNB971951934A CN97195193A CN1197966C CN 1197966 C CN1197966 C CN 1197966C CN B971951934 A CNB971951934 A CN B971951934A CN 97195193 A CN97195193 A CN 97195193A CN 1197966 C CN1197966 C CN 1197966C
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Abstract

公开了一类DNA序列，它们编码能够结合于肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)的蛋白(即TRAF-结合蛋白)，及其由DNA序列编码的同种型、类似物、片段和衍生物，生产该DNA序列和蛋白的方法，以及这些DNA序列和蛋白质的用途。

Description

肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、 及其制备和用途
发明的领域
本发明涉及编码能与TRAF2结合的蛋白质的DNA序列，同时也涉及所编码的蛋白质，以及应用所述蛋白质和DNA序列来治疗或预防与NF-κB的诱导活性有关，及与由TRAF2或其它与该蛋白质结合的分子所介导的其它生理活性有关的病理状态。
发明的背景
肿瘤坏死因子/神经生长因子(TNF/NGF)受体超家族的特征，是其成员胞外结构域具有结构同源性。(Bazan，1993；Beulter和Van Huffel，1994；Smith等人.，1994)。除了p55 TNF受体和Fas/APO1这两个受体之外，这个受体家族的各成员的胞内结构域的结构没有呈现出明显的相似性。然而这些受体之间在功能上是很相近的，这提示这些受体分享了共同的信号传导途径。这种相似性的一个例子是几种属于TNF/NGF家族的受体都有激活转录因子NF-κB的能力。这种共同的能力应归功于细胞质蛋白，它能激活NF-κB，TNF受体相关因子2(TNF ReceptorAssociated Factor 2，简称为TRAF2)，使其与TNF/NGF家族的几个受体中结构不相似的胞内结构域发生结合。目前还不清楚TRAF2的作用机制，也不清楚针对其所结合的不同受体的应答是如何被协调的。
TRAF2是一个最近被阐述的蛋白质家族中的一员，这个家族包括几个已被确认的蛋白质如TRAF1、TRAF2(Rothe，M，Wong，s.c.，Hezen，W.J.和Goeddel，D(1994)细胞(Cell)78：681-692；PCT公开出版物WO95/33051)、TRAF3(ChengG.等人，(1995))和TRAD6(见Cao等人，1996a)。所有属于TRAF家族的蛋白质其C端氨基酸有高度的相同性，而N端可能没有相互联系。从TRAF2的简示图(图1)中可见，在其分子的C端部分含有一个环指基序和两个TFHIA样的锌指基序。在分子的C末端一半部分，含有被称为“TRAF结构域”的区域，其中包含一个位于264-358位氨基酸之间的潜在亮氨酸拉链区域(被称为N-TRAF)，同时还有一个延伸到结构域羧基端、位于359-501位氨基酸之间的部分(称为C-TRAF)，这个部分和TRAF结合于受体以及其他TRAF分子从而形成同源或异源二聚体有关。
转录因子(NF-κB)的活化是一种由某些TNF/NGF受体所引发并由TRAF2所介导的信号级联的表现形式。NF-κB包括与Rel癌基因同源的、能形成二聚体的蛋白家族中一些成员，当这些蛋白质处于二聚体形式时，就能起转录因子的作用。这些因子是普遍存在的，并且参与多种基因的表达调控。尽管NF-κB最初被鉴定为一种在处于Igκ轻链表达阶段的B细胞中的组成型因子，但是已知NF-κB主要作为可诱导的转录激活物起作用。在大多数已知的情况下，NF-κB作为一级因子(primary factor)发挥作用，即其活性的诱导是通过激活在细胞中早已存在并处于无活性形式的分子，而不是通过从头合成(而该合成又依赖于开启NF-κB基因的可诱导型转录因子)。NF-κB的效果是非常多效的。这些众多效果中的大多数具有共同的特征，即对应于胞外刺激能够非常快地被诱导。大多数可激活NF-κB的物质是免疫防御的诱导物，其中包括病毒和细菌的组份、调控免疫应答的细胞因子、紫外线等。因此，大多数被NF-κB调控的基因在免疫防御中都起作用(参见Blank等人，1992，Grilli等人，1993.Baeuerle和Henkel，1994，参见综述)。
NF-κB调控作用的一个主要特点是，这个因子能以非DNA结合形式存在于细胞质中，并能被诱导而转运到细胞核中，从而与DNA结合并且激活转录过程。NF-κB蛋白的这两种形式受到I-κB的调控，I-κB是一类含有重复结构域(而该结构域最初是在红细胞锚蛋白中被发现)的蛋白质(Gilmore和Morin，1993)。处于非激活形式时，NF-κB双聚体和I-κB分子结合在一起，后者使NF-κB双聚体留在细胞质中并防止和可结合于NF-κB的DNA序列发生相互作用而激活转录。将I-κB从NF-κB二聚体上解离下来，是在很多诱导因子作用下的活化过程中的关键步骤(Di Donato，等人，1995)。有关于这个调节过程的机理上的知识仍很有限。细胞对不同NF-κB诱导剂的应答特异性是如何被确定，也了解得很少。
肿瘤坏死因子(TNF)是最强的NF-κB诱导剂之一。有两种不同的TNF受体，p55和p75受体。它们的表达水平在不同的细胞独立地变化(Vandenabeele等，1995)。p75受体优先应答结合于细胞的TNF(表达的TNF有β-穿膜蛋白和可溶性蛋白)，而p55受体则可同样有效地应答可溶性TNF分子(Grell，等人，1995)。这两个受体的胞内结构域结构上没有相关性，并且与不同的细胞质蛋白结合在一起。然而，TNF的至少部分效应，其中包括TNF的杀细胞作用和NF-κB的诱导作用，都可以受这两个受体的诱导。这个特性是细胞特异性的。p55受体能够在所有对TNF表现出效应的细胞中诱导杀细胞作用或NF-κB激活作用。而p75受体只是在某些细胞中有这些作用。其它细胞尽管p75受体表达水平很高，但只有在p55受体刺激下后才能诱导这些作用(Vandenabeele等人，1995)。除了TNF受体之外，TNF/NGF受体家族中的其他多种受体，如CD30(McDonald等人，1995)、CD40(Berberich等人1994；Lalmanach-Girard等人，1993)，淋巴毒素β受体和在某些类型细胞中的FAS/APO1(Rensing-Ehl等人，1995)也能诱导NF-κB的激活作用。尽管事实上IL-1I型受体在结构上与TNF受体没有相似性，IL-1I型受体也能有效地引发NF-κB的激活作用，并且具有TNF受体的大多数功能。
在这些不同的受体被触发之后，NF-κB的激活是由于与NF-κB结合的I-κB分子发生诱导性磷酸化而引起的。这个磷酸化过程使I-κB被降解，这种降解极可能发生于蛋白酶体。对于引起I-κB磷酸化的激酶的本质以及触发受体后的激活机制，目前仍处于未知状态。但在最近两年人们获得了一些有关3种似乎参予磷酸化过程的受体相关蛋白(receptor-associated protein)的知识(参见图2a及6的图解说明)。一种最初由D.Goedolel以其同事(Rothe te al，1994)克隆的、被称为TRAF2的蛋白质，好象在由TNF/NGF家族的各类受体激活NF-κB的过程中起到中心作用。这个蛋白在高水平表达时本身可以激活NF-κB，该蛋白可结合于活化的p75TNF-受体(Rothe等人1994)、淋巴毒素β受体(Mosialos等人1995)、CD40(Rothe等人，1995a)和CD30(未发表数据)，并通过它们来介导NF-κB的诱导作用。TRAF2不能和p55 TNF受体结合，也不能和Fas/APO1结合。但是，它能和被称为TRADD的p55受体相关蛋白质相结合，而TRADD能结合于被称为MORT1的Fas/APO1相关蛋白(或称为FADD，见Boldin等人1995b和1996)。另一种与受体相互作用的蛋白称为RIP(见Stanger，等人1995)，它也能与TRAF2、FAS/APO1、TRADD、p55 TNF受体和MORT1发生相互作用。这样，尽管RIP与细胞毒性诱导(细胞死亡)相关，它与TRAF2相互作用的能力与NF-κB激活作用也有关，并且此外它也可以在导致NF-κB激活的路径中对FAS/APO1、MOTR-1、p55 TNF受体和TRADD与TRAF2相互作用上起增强作用(Hsu等人1995，Boldin等人，1995；Chinnalyan.等人1995，Varfolomeev，等人，1996；Hsu等人1996)。IL-1受体对NF-κB活化的引发与TRAF2无关，这一引发过程可能涉及到一种最近克隆的被称为IRAK的IL-1受体相关蛋白激酶(Croston等人1995)。TRAF2的作用机制尚不清楚。几种与TRAF2结合的胞质蛋白已经被鉴别出(Rothe等人，1994，Rothe等人，1995b)。但是从这些分子所得到的信息并没有提供任何线索，来说明象TRAF2这样一个本身没有酶活性的分子是通过何种途径来引发I-κB的磷酸化过程。对于不同受体激活TRAF2时细胞特异性模式的机制也没有信息，比如在两种TNF受体诱导NF-κB时所观察到的细胞特异性模式。
除了上述提到的以外，对于不同的TRAF蛋白而言，应当注意到TRAF2可结合于p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF受体，也能直接或非直接地通过其它上述的衔接蛋白(adaptor protein)而结合于TNF/NGF受体家族中的其它几种受体，例如对于FAS/APO1受体，衔接蛋白是MOTR-1、TRADD和RIP。因此，TRAF2对于NF-κB的激活过程是关键的(参见Wallach，1996)。然而，TRAF3实际上可抑制TNF/NGF受体家族中某些受体对NF-κB活化作用(参见Rothe等人，1995a)，而TRAF6则是在IL-1诱导NF-κB的过程中所必需的(Cao等人，1996a)。
因此，对于NF-κB的活化过程及其在维持细胞存活方面的重要性，以及与这一活化过程有关的各种胞内途径，至今仍未弄清。例如，不同的TRAF蛋白是如何直接或间接地参予其中？
此外，现在已知道TNF/NGF受体家族的不同成员及其相关的胞内信号传导途径(包括不同的衔接子、中介体(mediator)/调节蛋白)(例如，参见都未授权的，共同拥有的以色列专利申请No.114615，114986，115319，116588中的简要综述及参考文献)，比如TNF和FAS/APO1的配体对细胞是既有益又有害的。例如，TNF对机体防衔肿瘤及感染物方面有贡献，同时也能通过诱导杀灭病毒感染的细胞和肿瘤细胞，增加粒细胞的抗细菌活性而使机体从损伤中恢复过来，因此，在这些情况下TNF诱导的细胞杀伤作用是所需的。但是，过量的TNF也是有害的，比如在脓血性体克、厌食症、风湿性疾病、炎症和移植物-宿主排斥反应等疾病中，已知TNF是一个主要的病理因子。在这些情况下，TNF诱导的细胞杀伤作用就是不利的。例如，FAS/APO1配体也具有有益和有害的作用。FAS/APO1配体通过其受体在T细胞成熟过程中诱导自身反应T细胞发生死亡。也就是说，在T细胞的发育过程中杀死那些针对自身抗原的T细胞，以避免自身免疫疾病。此外，很多恶性细胞和HIV感染的细胞在其细胞表面携带FAS/APO1受体，因此就可用配体或针对受体的抗体来激活这些受体，从而激活该受体所介导的细胞死亡(细胞凋亡)的胞内途径，进而摧毁这些细胞。但是，FAS/APO1受体也可介导有害的作用，例如在某些疾病中如急性肝炎中，发现有不加控制地杀灭组织的现象，从而导致肝细胞的损坏。
综上所述，TNF/NGF受体家族一方面能诱导细胞凋亡途径，另一方面也可以诱导细胞存活途径(通过NF-κB诱导)。因此，显然在胞内的两种对立的途径之间，存在着精妙的平衡。例如，当需要最大限度地杀伤肿瘤细胞或其它受感染或病态的细胞时，它就需要让TNF和/或FAS/APO1配体只诱导细胞凋亡途径而不诱导NF-κB。相反，当需要保护细胞(比如在炎症、移植物-宿主反应、急性肝炎中)时，阻断由TNF和/或FAS/APO1配体对细胞凋亡的诱导作用，并且增强它们对NF-κB的诱导作用就是所有利的。相同地，在某些病理状态下，阻断由p75 TNF受体和IL-1受体所介导的胞内信号传导途径是有利的；而在另一些情况下，则需要增强这些胞内途径。
发明概述
本发明的目的是提供能与肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRAF)相结合的新型蛋白质，其中包括所有的同种型、类似物、片段或其衍生物。因为TRAF蛋白在对转录因子NF-κB激活过程的调节和介导中被涉及(这一激活过程是由上述的一些TNF/NGF受体以及其他物质所引发的)，因此，本发明的新蛋白通过与TRAF结合，就能够影响(调节或介导)由不同的配体(如TNF、FAS配体及其它配体)结合于受体结合所引发的胞内信号传导过程，例如通过直接或间接地结合于TRAF蛋白而调节/介导NF-κB激活过程。
因此，本发明中的新型蛋白是TRAF蛋白的胞内生物活性(如TRAF2、TRAF6对NF-κB活化的诱导和TRAF3对NF-κB活化的抑制作用)的直接调节剂(modulator)或中介体。
本发明中的新型蛋白同样也是多种直接或间接与TRAF作用的其它蛋白质的胞内生物活性的间接调节剂/中介体。(如FAS/APO1受体，p55 TNF受体、p75TNF受体、IL-1受体、和它们的相关蛋白如MORT-1，TRADD，RIP)。
本发明的另一目的是提供针对上述新型TRAF-结合蛋白(TRAF-bindingprotein)(其中包括其同种型、其类似物、其片段或其衍生物)的拮抗剂(如抗体、多肽、有机化合物、或甚至一些异构体)，在需要的时候，这些拮抗剂可用于抑制信号传导过程，更具体地是抑制NF-κB的活化及其在细胞生存中的有关的过程。同样地，当本发明的TRAF-结合蛋白或与其结合的TRAF-结合蛋白(如TRAF3)本身可抑制NF-κB的激活时，本发明的目的是提供针对这些TRAF-结合蛋白的拮抗剂，从而在需要时可激活信号传导过程，或更明确地是阻断对NF-κB活化的抑制进而增强NF-κB的激活。
本发明的进一步的目的是，应用上述TRAF-结合蛋白，其同种型、其类似物、其片段和其衍生物，来分离和鉴定那些可能涉及调节TRAF蛋白活性和/或上述受体活性的其他蛋白或因子(如其它那些能和TRAF结合并影响其活性的蛋白)，和/或来分离和鉴定出处于信号途径的上游或下游的其它受体或细胞蛋白，而所述的新颖蛋白、其类似物、其片段或其衍生物可与这些其他受体或细胞蛋白发生结合，且因此在其功能中也被牵涉到。
本发明的另一目的是提供一些抑制剂，这些抑制剂能被引入细胞，从而与新型TRAF-结合蛋白及其可能的同种型相结合或相互作用。这些抑制剂能抑制例如在NF-κB激活过程中与TRAF蛋白相关的活性，因而在需要时可抑制NF-κB的活化；或者可抑制NF-κB的活化过程中与TRAF有关的抑制性活性(如TRAF3的活性)，因而在需要时可增强NF-κB的活化。
此外，本发明的另一目的是运用上述的新型TRAF-结合蛋白、同种型和同种型、片段或其衍生物作为抗原，来制备针对它们的多克隆抗体或/和单克隆抗体。反过来，这些抗体可用于从不同来源(如细胞提抽物、转化细胞系)中纯化出新的蛋白质。
并且，这些抗体可用于诊断的用途，如在鉴定与细胞效应的功能异常相关的疾病，其中该细胞效应是由TRAF蛋白质直接介导，或由p55 TNF受体、FAS/APO1受体或其他相关受体和相关细胞蛋白(如MORT-1、TRADD、RIP)(它们通过与TRAF蛋白直接或间接的作用而调节/介导胞内过程)所介导的。
本发明的进一步目的是提供一种药物组合物，它含有上述TRAF蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物，以及提供含有上述抗体或其它拮抗剂的药物组合物。
根据本发明，分离出多种新型的TRAF-结合蛋白尤其是TRAF2结合蛋白。这些TRAF2结合蛋白可高特异性地结合于TRAF2(见下述的实施例)，因而是TRAF2胞内活性的调节剂或中介体。TRAF2在至少一种信号传递途径(即细胞生存或存活相关途径)中有调节或介导作用，在该途径中，TRAF2直接参于NF-κB的活化过程，而NF-κB在细胞存活中起中心作用。实际上，这些新蛋白的一种被称为“NIK”(NF-κB诱导激酶，NF-κB inducing kinase)的蛋白可与TRAF2相结合并刺激NF-κB的活性。NIK是一种激酶，它和几种MAPKK激酶有序列相似性(见下)。另外，因为TRAF2能直接或间接地与上述的p55 TNF受体、p75 TNF受体、FAS/APO1受体和它们的相关蛋白MORT-1、TRADD和RIP发生相互作用，因此TRAF2也是由受体所致的NF-κB诱导或激活活性的调节剂或中介体。因此，TRAF2还是由这些受体及其相关蛋白所介导的细胞存活途径(和细胞死亡途径相对)的调节剂或中介体，所以这些受体和/或蛋白与TRAF2相互作用的程度对这些受体的活性结果(一旦被配体激活后)有很大影响，也就是说，对细胞是存活还是死亡有很大影响。因此，本发明的蛋白质(例如NIK)，在TRAF2和其他的、与TRAF2相互作用的蛋白/受体之间的相互作用方面，起着关键的角色，因为象NIK这样的蛋白通过与TRAF2发生特异性的结合，可调节TRAF2的活性和/或让它们的活性被与TRAF2的相互作用所调节。
TRAF-结合蛋白，例如TRAF2结合蛋白(其中包括NIK)，已运用双杂交法体系被分离和克隆出，被部分或全部测序，并且被定性，而且正如以下详述的那样，是高度特异性的TRAF2结合蛋白，因而是TRAF2特异性的调节剂/中介体。
正如全文所述，TRAF蛋白的活性(例如TRAF2的活性)，包括其在细胞存活途径中，特别是涉及NF-κB的诱导/激活过程中的调节/介导活性。同样，正如全文所述，TRAF-结合蛋白(尤其是TRAF2结合蛋白)，其活性包括通过特异性与TRAF(特别是TRAF2)结合而产生的对TRAF(尤其是TRAF2)的调节/介导活性。这种调节/介导包括对细胞存活途径，尤其是TRAF蛋白(特别是TRAF2)被直接或间接地涉及的，与NF-κB诱导/活化相关的那些途径。因此，TRAF-或TRAF2-结合蛋白可被认为是所有上述蛋白以及其他一些蛋白的调节剂/中介体，所述的其他一些蛋白是在细胞存活中(特别是NF-κB活化/诱导过程中)所涉及的并且可与TRAF2(或其它TRAF蛋白)结合，或与TRAF2(或其它TRAF蛋白)发生直接或间接相互作用的。
因此，本发明提供一种DNA序列，该序列编码可以和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)分子结合的蛋白质。
本发明DNA序列的另一个例子是编码能与TRAF2结合的蛋白质的序列。
本发明DNA序列的另一个例子是，编码能至少与TRAF2氨基酸序列中222-501位氨基酸残基相结合的蛋白质的序列。
本发明中DNA序列的其它例子包括：
(a)本文命名为克隆9的cDNA序列，它含有图3a所示的核苷酸序列；
(b)本文命名为克隆10的cDNA序列，它含有图4所示的核苷酸序列；
(c)本文命名为克隆15的cDNA序列，它含有图5a所示的核苷酸序列；
(d)序列(a)-(c)的片段，该片段编码能至少与TRAF2中222-501的氨基酸序列相结合的生物活性蛋白质；
(e)在中等严紧条件下能与(a)-(d)的序列发生杂交的DNA序列，并且该序列编码能至少与TRAF2中222-501氨基酸序列相结合的生物活性蛋白质；和
(f)因遗传密码子而成为(a)-(e)中所限定的DNA序列的简并序列的DNA序列，并且该DNA序列编码能至少与TRAF2中222-501氨基酸序列相结合的生物活性蛋白质。
而且，上述本发明的DNA序列的其它例子还包括：
从本文命名的cDNA克隆9与克隆15中所含的序列中所选出的DNA序列；
一种DNA序列，该DNA序列编码也可调节NF-κB活性的蛋白质。
从本文命名为cDNA克隆10中所含的序列中所选出的DNA序列。
本发明的上述DNA序列中的另一种优选例子是这样的DNA序列，该序列含有编码NIK蛋白(NF-κB诱导激酶)的DNA序列。
本发明的编码NIK蛋白的上述DNA序列的例子包括：
i)编码NIK、其同种型、其片段或其类似物的DNA序列，所述的NIK、其同种型、其片段或其类似物能够与TRAF2结合并且能够调节NF-κB的活性；
ii)在i)中所述的DNA序列，该序列从下列中选出：
a).从天然NIK蛋白序列中衍生出的cDNA序列；
b).能在中等严紧条件下与DNA序列发生杂交，并且编码生物活性NIK的DNA序列；以及
c.因遗传密码子而与(a)和(b)中所限定的序列简并的，并能编码生物活性NIK蛋白的DNA序列；
(iii)在上述(i)或(ii)中的DNA序列，该序列含有图6中所示的至少部分序列，并且编码至少一种活性的NIK蛋白、同种型、类似物或片段，
(iv)在上述(iii)中的DNA序列，该序列编码的NIK蛋白、同种型、类似物或片段具有图6中所示的至少部分氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了上述的本发明DNA序列所编码的蛋白或多肽的，以及该蛋白和多肽的同种型、类似物、其片段或其衍生物，只要它们能和TRAF2结合，较佳地至少能与TRAF2中222-501氨基酸序列结合。本发明的这些蛋白/多肽，及其同种型、其类似物、其片段或其类似物的例子包括：
(a).由本文命名的克隆10所编码的蛋白质；
(b).一种蛋白、其同种型、其片段、其类似物和衍生物，它们是由上述编码所述的NIK蛋白、同种型、类似物、片段或其衍生物的DNA序列所编码的NIK蛋白、同种型、片段、类似物和衍生物；并且，
(c).NIK蛋白、其同种型、其片段、其类似物和衍生物，它们是由上述编码所述NIK蛋白、同种型、类似物、片段或其衍生物的DNA序列所编码的NIK蛋白、同种型、片段、类似物和衍生物，其中该蛋白、其同种型、其片段和衍生物应至少有图6所示的部分氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种含有本发明任何上述DNA序列的载体，它能在选自原核细胞和真核细胞的宿主细胞中表达；还提供了含有该载体的转化的原核细胞和真核细胞。
本发明也提供产生本发明任何上述DNA序列所编码的蛋白质、其同种型、其类似物、其片段或衍生物的方法，该方法包括：将上述转化的宿主细胞在适合表达该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物的条件下生长，按需要进行翻译后加工，从而获得该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物，以及分离该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物。
在另一方面，本发明提供了特异性针对上述TRAF-结合蛋白、其类似物、其同种型、其片段或其衍生物，或特异性针对上述的NIK蛋白、其同种型、其类似物，其片段或其衍生物的抗体或活性片段或衍生物。
在一个不同方面，本发明提供了下列筛选方法：
(i)一种筛选能与本发明蛋白结合的配体的方法，如上所述，其中包括其同种型、其类似物、其片段或衍生物，这方法包括：将附着有所述蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物的亲合层析基质，与细胞抽提物接触，从而使配体被吸附在该基质上，然后洗脱，分离并分析该配体。
(ii)一种筛选DNA序列的方法，该序列编码能与本发明蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物结合的配体。该方法包括：采用酵母双杂交程序，其中编码该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物的DNA序列被一种杂交载体所携带，来源于cDNA或基因组DNA文库的序列被第二种杂交载体所携带；用所述载体转化酵母细胞，分离出阳性的转化细胞，以及抽取该第二种杂交载体以获取编码该配体的序列。
类似地，这里也提供一种分离和鉴定出，如上所述能直接与TRAF2结合的本发明蛋白、其同种型、其类似物、其片段的方法，该方法包括：应用酵母双杂交法，编码该TRAF2的序列被一种杂交载体所携带，来源于cDNA或基因组DNA文库的序列被第二种杂交载体所携带，用该载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化细胞，和抽提该第二种杂交载体，以得到编码与TRAF2结合的蛋白的序列。
在本发明的另一个方面，这里提供一种在细胞中调节或介导NF-κB活性，或由TRAF2或与本发明上述的蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物发生结合的其他分子所调节或介导的其它胞内信号传导活性的方法，该方法包括：将一种或多种该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物，以适合胞内导入的形式导入细胞，或者将编码该一种或多种蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物的DNA序列，以合适的携带该序列的载体形式导入细胞，该载体能将该序列插入该细胞，使该序列在该细胞中表达。
对于上述的在细胞中调节/介导由TRAF2或其它分子所调节或介导的NF-κB活性或其它胞内信号传导途径活性的方法，其例子包括：
i)一种上述方法，其中对细胞进行处理包括：用编码该蛋白、其同种型、其片段、其类似物或其衍生物的DNA序列，以合适的携带该序列的载体形式导入细胞，该载体能将该序列插入细胞，从而使该序列在该细胞中表达。
ii)一种上述方法，其中对细胞进行处理是通过用重组动物病毒载体转染该细胞，它包括步骤：
(a)构建重组动物病毒载体，该载体携带编码病毒表面蛋白(配体)的序列，该蛋白能与该待处理细胞表面的特定细胞表面受体相结合；还携带第二种编码选自本发明蛋白、其同种型、其类似物、其片段和其衍生物的一种蛋白质的序列，当该它们在细胞中表达时，能调节/介导TRAF2或其它该类分子所调节或介导的NF-κB活性或其它胞内信号传导活性；和
(b)使用(a)中的载体转染该细胞。
同样，本发明也提供了调节TRAF2对细胞的调节/介导作用的方法，该方法包括：用本发明前面所述的抗体、或其活性片段、或其衍生物来处理细胞，该处理是施用含该抗体、其活性片段、或其衍生物的合适组合物，其中当该细胞的TRAF2结合蛋白或其部分暴露在胞外表面时，该组合物被配制成适合胞外施用，而当该TRAF2结合蛋白处于胞内时，该组合物被配制成适合胞内施用。
本发明的调节TRAF2对细胞的调节/介导活性的其他方法包括：
(i)一种方法，它包括：用一段寡核苷酸序列来处理该细胞，该寡核苷酸序列具有编码TRAF2结合蛋白的至少部分DNA序列的反义序列，该DNA序列可以是本发明前述任一种DNA序列，而且该寡核苷酸序列能阻断TRAF2结合蛋白的表达。
(ii)如(i)中所述的方法，该寡核苷酸通过上述的重组病毒引入细胞，其中该病毒的第二种序列编码该寡核苷酸。
(iii)一种方法，它包括应用核酶的程序，其中将编码核酶序列的载体，按允许该核酶序列在细胞中表达的方式引入细胞，其中该核酶能与编码本发明上述TRAF2结合蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物的细胞mRNA序列发生相互作用，而且当该核酶序列在细胞中表达时，它会与该细胞mRNA相互作用并切断该mRNA，结果导致该细胞中该TRAF2结合蛋白的表达受到抑制。
这里应该提出，对于本发明所有前述的方法，所指的本发明蛋白质可以特指NIK，或NIK、其同种型、其类似物，其片段或其衍生物中的至少一种。
在本发明的上述方法及其例子中，这里还包括一种预防或治疗与TRAF2或其它分子(本发明中的蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物可与该“其他分子”结合)所介导的NF-κB诱导或其它活性相关的病症。该方法包括：给需要治疗的病人施用有效量的本发明蛋白质、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物，或编码上述物质的DNA序列，或者能破坏该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物与TRAF2和其他分子(本发明中的蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物可与该“其他分子”结合)的相互作用的分子。在本发明的这个方法中，应用于所需病人身上的蛋白质可以具体地是由克隆10所编码的蛋白质，NIK，NIK的同种型、类似物、片段或衍生物，或编码所述物质的DNA序列。克隆10所编码的蛋白质有抑制NF-κB诱导的作用，NIK的其它片段也有该作用，而且NIK还可诱导NF-κB激活。
在本发明的另一方面，提供了调节TRAF2的细胞调节/介导功能的药物组合物，它包括至少一种本发明TRAF2结合蛋白、其生物活性片段、其类似物、其衍生物或它们混合物作为活性成份。
本发明中其他药物组合物或其例子包括：
(i)调节TRAF2的细胞调节/介导功能的药物组合物，它包括重组动物病毒载体作为活性成份，该重组动物病毒载体编码能和细胞表面受体结合蛋白质，并编码至少一种本发明的TRAF2结合蛋白、其同种型、其活性片段或其类似物。
(ii)调节TRAF2的细胞调节/介导功能的药物组合物，它包括一种寡聚核苷酸作为活性成份，该寡核苷酸编码本发明TRAF2结合蛋白mRNA序列的反义序列。
上述药物组合物的另一例子，就是预防或治疗与TRAF2或其它与本发明蛋白质、其类似物、其同种型、其片段或衍生物发生结合的分子所介导的NF-κB激活或其它活性相关的病症的药物组合物。该组合物包括有效量本发明蛋白质、其类似物、其同种型、其片段或衍生物，或者编码它们的DNA片段、或者能破坏该蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物与TRAF2或其他分子(本发明中的蛋白、其同种型、其类似物、其片段或其衍生物可与该“其他分子”结合)的相互作用的分子。在另一例子中，该药物组合物包括有效量的克隆10所编码的蛋白，NIK，及NIK的同种型、类似物、衍生物或片段、或者编码这些蛋白的DNA序列。
在另一例子中，本发明提供一种药物组合物，该组合物可用于预防或治疗与NF-κB诱导相关，或与TRAF2或可与NIK结合的其他分子所介导的其它活性相关的病症，该药物组合物含有能干扰NIK的蛋白激酶活性的分子。在这种组合物中，干扰分子可以是有效量的、在活性位点残基处突变的NIK，而该突变的NIK可干扰天然NIK，特别是NIK的激酶活性。
一种与NF-κB诱导(异常)有关的已知病症是AIDS，而其它有关病症有例如自身免疫疾病和肿瘤。
本发明更进一步的方面和实例是：
(i)一种鉴定和生产能调节TRAF2的细胞调节/介导功能的配体的方法，它包括：
a)筛选配体，该配体能和至少含有TRAF2中222-501氨基酸残基的TRAF2片段的多肽相结合；
b)对于该筛选步骤发现的，能够结合但不是TRAF2，也不是TNF/NGF受体家族中的受体部分的配体，进行鉴定和定性；和
c)用基本分离和纯化的形式产生该配体。
(ii)一种鉴定和生产能调节本发明的蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物所调节/介导的细胞活性的配体方法，它包括：
a)筛选能和含有图6所示的至少部分NIK序列的多肽相结合的配体；
b)对于该筛选步骤发现的，能够结合但不是TRAF2，也不是TNF/NGF受体家族中的受体部分的配体，进行鉴定和定性；和
c)以基本分离和纯化的形式产生该配体。
(iii)一种鉴定和生产能调节NIK所调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：
a)筛选能和含有图6所示的至少部分NIK序列的多肽相结合的配体；
b)对于该筛选步骤发现的，能够结合但不是TRAF2，也不是TNF/NGF受体家族中的受体部分的配体，进行鉴定和定性；和
c)以基本分离和纯化的形式产生该配体。
(iv)一种鉴定和生产能直接或间接地调节NIK所调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：
a)筛选能调节NIK所调节/介导的活性的分子；
b)鉴定和定性该分子；和
c)以基本分离和纯化形式产生该分子。
(v)一种鉴别和生产能直接或间接地调节本发明蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物所调节/介导的细胞活性的分子的方法，该方法包括：
a)筛选能调节本发明蛋白、其同种型、其类似物、其片段或衍生物所调节/介导的活性的分子；
b)鉴定和定性该分子；和
c)以基本分离和纯化的形式产生该分子。
还提供了本发明的其他方面及实例，正如后文中发明详述中所描述的那样。
应当指出，全文中所使用的下列术语“TRAF(或TRADS)对细胞的调节/介导效应”和说明书中的其它描述如“调节/介导”，应理解为包括体内处理和体外处理作用，而且还包括抑制作用或增强/强化作用。
附图简单说明：
图1是TRAF2分子结构的示意图。
图2a-b用图示扼要地显示在NF-κB激活过程中所涉及的一些蛋白质，其中包括本发明新的TRAF-结合蛋白(如NIK)。其中(a)是部分示意图；(b)则是更全面的示意图。
图3显示了克隆9的5′端核苷酸序列(图3A-3C)和由此推断的所编码的氨基酸序列(图3D)。
图4显示了克隆10的核苷酸序列。
图5a-b显示了克隆15的核苷酸序列(a)和由此推断的所编码的氨基酸序列(b)。
图6显示了NIK的核苷酸序列及其推断的氨基酸序列。
图7显示了NIK的蛋白序列和小鼠蛋白激酶mMEKK(小鼠MAPK或ERK激酶激酸)以及一些其它激酶的蛋白序列之间的序列比较。对应于蛋白激酶保存基序I至XI的区域被标出。
本发明的详细描述：
本发明涉及编码能与肿瘤坏死因受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)分子相结合的蛋白质的DNA序列，以及其所编码的蛋白。
在一个优选实例中，本发明涉及本文命名为克隆9、克隆10和克隆15(分别由图3a，图4和图5a表示)的cDNA序列，这些cDNA编码能和TRAF2结合的蛋白质的序列，还涉及这些cDNA序列所编码的蛋白质。
在另一个优选实例中，本发明涉及编码NIK蛋白的DNA序列，及NIK蛋白本身。
上述的DNA序列及其推导的氨基酸序列表示了新的序列；它们没有在“GENEBANK”或“PROTEWBANK”等DNA或氨基酸序列数据库中出现。
本发明的范围还包括上述DNA序列的片段，以及能在中等严紧条件下杂交于这些序列或其片段的DNA序列，只要它们编码能与至少TRAF2中222-501氨基酸序列相结合的生物活性蛋白质或多肽。
本发明还涉及从因遗传密码子而与上述DNA序列简并的DNA序列，并且该DNA序列能编码有生物活性的能至少与TRAF2中222-501氨基酸序列结合的蛋白或多肽。
关于TRAF2，应该注意到，通过直接或间接地与TRAF2缔合，TNF/NGF受体家族中几个成员能激活转录因子NF-κB，因此TRAF2是这些受体的衔接蛋白，并且也可认为TRAF2是这些受体诱导NF-κB激活活性的调节剂/中介体(见图2b的示意图)。另一种受体即IL-1受体可不依赖于TRAF2地激活NF-κB。本发明优选TRAF2结合蛋白的一个例子是NIK蛋白，它可非常特异地和NIK结合，并激活NF-κB。NIK是序列与数种MAPKK激酶相似的丝氨酸/苏氨酸激酶(见下面的实施例)。根据本发明中产生的、缺乏NIK激酶活性的NIK类似物或突变蛋白(见实施例)，当这些类似物/突变蛋白在细胞中表达时，它们不能激活NF-κB。此外，当这样的NIK类似物/突变蛋白(mutein)在细胞中表达时，也可阻断了由TNF或其他诱导因子如细菌内毒素LPS、forbol豆蔻酸乙酸酯(forbol myristateacetate)(一种蛋白激酶C激活物)和HTLV-1蛋白TAX所诱导的NF-κB激活。TNF通过两种TNF受体(p55和p75 TNF受体)的任一个来诱导NF-κB的活性，因而似乎NIK类似物/突变蛋白也可通过这些受体来阻断对NF-κB激活。同样，TNF和FAS/APO1受体的配体也可通过相应的受体(FAS/APO1受体)来诱导NF-κB的活性，而这种诱导也被NIK类似物/突变蛋白所阻断。另外，上述的受体有衔接蛋白TRADD、RIP和MORT1，这些衔接蛋白也被诱导NF-κB活性，但这种诱导也可被NIK突变蛋白/诱导物阻断。另外，这类NIK突变蛋白/类似物还可阻断由IL-1对NF-κB的诱导作用(通过IL-受体发挥功能)。因此，可以认为NIK参与了TNF/NGF家族受体和IL-1受体所共有的NF-κB诱导的级联途径。NIK似乎还可能通过直接增强I-κB磷酸化来直接诱导NF-κB的活性。从现有的观察发现，缺乏激酶活性的上述NIK类似物/突变蛋白(也称作显性阴性突变蛋白)，当它们在细胞中表达时不会以任何形式影响TNF所诱导的 Jun激酶活化，这提示NIK只特异性地增强I-κB的磷酸化，而对 Jun磷酸化过程中所涉及MAP激酶没有影响。
因此，本发明涉及编码有生物活性的TRAF-结合蛋白，如TRAF2结合蛋白，(比如NIK)，以及它们的同种型、片段和衍生物的DNA序列，并且涉及被编码的蛋白的同种型、片段和衍生物。这些同种型、片段和衍生物的制备可采用标准方法(参见例如Sambrook等人，1989)，其中在DNA编码序列中，一个或多个密码子被删除、添加或被其它密码子所取代，从而使产生的编码类似物与天然蛋白质相比至少有一个氨基酸残基不同。可接受的类似物是那些保留至少能和TRAF2结合的能力，且具有或没有介导其它结合或酶活性的能力的类似物，例如可与TRAF2结合但不传导信号(即不结合于下游的蛋白或其它因子，或不催化依赖于信号的反应)的类似物。用这种方式，可以产生产生具有所谓的显性阴性效应的类似物，也就是说在与TRAF2结合方面，或在上述结合之后的信号传递过程方面有缺陷的类似物。这样的类似物可用于，例如通过与天然TRAF2结合蛋白的竞争，而抑制CD40、p55 TNF和p75 TNF、FAS/APO1和其它相关受体的效应，以及抑制上述各种受体相关蛋白(衔接蛋白)所介导的效应。同样地，还可产生所谓的显性阳性(dominant-positive)类似物，它们可被用于增强TRAF2的效应，这些类似物可具有相同或更好的TRAF2结合性能，以及与天然TRAF2结合蛋白相比同样或更好的信号传导性能。按类似方式，有生物活性的本发明克隆的片段也可用上述的制备类似物的方法进行生产。本发明的合适的DNA序列片段是指这样的片段，它们编码保留TRAF2结合能力或能介导上述的其它结合或酶活性的蛋白或多肽。因此，正如上述类似物那样，也可产生具有显性阴性效应或显性阳性效应的本发明编码蛋白质的片段。类似地，还可通过标准方法修饰这些蛋白、或其类似物或片段的一个或多个氨基酸侧链基团，或者通过将这些蛋白、其类似物或片段偶连于其他分子(如抗体、酶、报道分子等)，从而制备衍生物，正如本领域众所周知的那样。
在本发明上述的编码TRAF-结合蛋白(如TRAF2结合蛋白，比如NIK)、其同种型、其类似物、其片段或衍生物的DNA序列中，还包括，作为本发明的一个实例，能与衍生自天然编码TRAF-结合蛋白编码区域的的cDNA序列杂交的DNA序列(其中该杂交是在中等严紧条件下进行)，而且该可杂交的DNA序列编码具生物活性的TRAF-结合蛋白。因此，这些可杂交的DNA序列包括与天然编码TRAF-结合蛋白的cDNA序列(如编码TRAF2结合蛋白的cDNA序列，例如NIK的cDNA序列)有相对较高同源性的DNA序列，并因而代表了TRAF-结合蛋白样的序列，该TRAF-结合蛋白样的序列可以是例如：编码各种TRAF-结合蛋白同种型的天然衍生序列，或属于一组TRAF-结合蛋白样序列且编码蛋白的天然存在的序列(该TRAF-结合蛋白样序列编码具有TRAF-结合蛋白(如TRAF2结合蛋白，比如NIK)活性的蛋白质)。此外，这些序列还包括非天然存在的、合成的序列，该序列与天然TRAF-结合蛋白cDNA序列相似但掺入了几处所需要的修饰。因此，这类合成的序列包括所有可能的序列，而该序列编码TRAF-结合蛋白(如TRAF2结合蛋白，比如NIK)的类似物、片段和衍生物(都具有TRAF-结合蛋白活性)。
为获取上述的天然存在的TRAF-结合蛋白样序列，可对从不同组织中获取的天然衍生的DNA或mRNA样品，用标准的方法进行筛选和分离，其中运用天然TRAF-结合蛋白的cDNA或片段为探针(参见例如Sambrook等人所述的标准方法，1989)。
同样地，为获取编码TRAF-结合蛋白(如TRAF2结合蛋白，比如NIK)的类似物、片段或衍生物的各种合成的TRAF-结合蛋白样序列，可以使用众多的标准方法，正如下文详细描述的有关制备这些衍生物、片段和类似物的方法。
“基本对应于”TRAF-结合蛋白的多肽或蛋白质不仅包括TRAF-结合蛋白TRAF-结合蛋白，也包括是TRAF-结合蛋白的类似物的多肽或蛋白。
基本对应于TRAF-结合蛋白的类似物，是在TRAF-结合蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸被其它氨基酸所取代、或被删除、或被插入而形成的多肽，只要所得的蛋白质基本上呈现出与其所对应TRAF-结合蛋白的同样或更好的生物活性。
为了基本对应于TRAF-结合蛋白，在TRAF-结合蛋白(如异构体)序列中的变化通常较小。虽然变化的疏密可以多于10个，但优选地不多于10个，更佳地不多于5个，最佳地不多于3个这样的变化。尽管任何技术都可运用于发现有潜在生物学活性且基本对应于TRAF-结合蛋白的蛋白质，但是一种这样的方法是对编码该蛋白质的DNA运用传统的诱变方法，从而产生一些修饰形式。然后，被这些克隆表达的蛋白，根据它们能否与TRAF蛋白(如TRAF2)结合以及能否调节TRAF(如TRAF2)在上述胞内途径的调节/介导中的活性而加以筛选。
“保守的”变化是指那些不会造成蛋白质活性变化的变化，这些变化通常首先被筛选，因为这种变化预计不会明显改变蛋白的大小、电荷或结构，因而预计不改变生物特性。
TRAF-结合蛋白的保守替代形式包括：在多肽中至少一个氨基的残基被保守地用另一不同氨基酸所取代而形成的类似物。较佳地，这种取代是根据表1A中下列清单进行。这些取代形式可用常规实验方法进行测定，从而使合成的多肽分子在保持TRAF-结合蛋白的生物活性的同时又在结构和功能性质的有所变化。
                         表  IA
原来的残基               代表性的取代残基
Ala                      Gly；Ser
Arg                      Lys
Asn                      Gln；His
Asp                      Glu
Cys                      Ser
Gln                      Asn
Glu                      Asp
Gly                      Ala；Pro
His                      Asn；Gln
Ile                      Leu；Val
Leu                      Ile；Val
Lys                      Arg；Gln；Glu
Met                      Leu；Tyr；Ile
Phe                      Met；Leu；Tyr
Ser                      Thr
Thr                      Ser
Trp                      Tyr
Tyr                      Trp；Phe
Val                      Ile；Leu
或者，另一类TRAF-结合蛋白的替换形式是在多肽中删去至少一个氨基酸残基，然后再根据下表IB在其位置上插入不同残基而产生的替换形式。可进行的多肽替换类型，可根据对不同物种中同源蛋白之间氨基酸变化频率的分析结果，例如Schulz等人.，G.E.， 《蛋白质结构原理》(Principles of Protein Structure)，springer-Verlag，New York，NY，1798中的表1-2，以及Creighton，T.E.， 《蛋白质： 结构和分子性能》(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman &Co.，San Francisco，CA 1983中的图3-9中给出的分析结果。根据这一分析，保守性替换改变被定义为下列5组中任一组内的氨基酸残基互换。
                      表  IB
1.小的、脂族的、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)
2.极性的、带负电荷的残基以及它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln
3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg，Lys
4.大的、脂族的、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和
5.大的、芳族残基：Phe、Tyr、Trp。
在上述括号中的3个氨基酸残基在蛋白质结构中有特殊作用。Gly是唯一没有侧链的残基，因而它将柔韧性赋予肽链。然而，这会有助于形成除α-螺旋之外的二级结构。Pro因其不同寻常的几何结构，会有力地约束肽链，并且通常会促进类似β-转角的结构，而在某些例子中Cys能够参与二硫键的形成(二硫键的形成在蛋白质折叠中是至关重要的)。应注意，Schulz等人(同上)将上面的第1和第2组合二为一。还应注意，Tyr因其有形成氢键的可能，因此与Ser和Thr等有显著的亲近关系。
根据本发明进行的保守性氨基酸取代，例如上面所陈述的，都是本领域中已知的，并且预期在氨基酸取代之后可以维持多肽的生物学特性和结构性能。本发明的大多数缺失和取代形式是那些不导致蛋白质或多肽分子的特性发生根本变化的类型。“特性”以非包含方式(non-inclusive)被定义，从而定义了二级结构的变化(如α-螺旋或β-折叠)和生物活性的变化(如结合于TRAF蛋白和/或TRAF蛋白对细胞死亡的介导作用)。
在蛋白质中产生氨基酸替换的例子包括如何已知的方法程序，它们可用于获得与TRAF结合的蛋白质以便用于本发明，其中包括例如在授予Mark等人的美国专利RE 33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的美国专利5,116,943；授予Namen等人的美国专利4,965,195；授予Chong等人的美国专利4,879,111；授予Lee等人的美国专利5,017,691等中给出的方法，以及在美国专利No.4,904,584(Shaw等人)中给出的用赖氨酸进行替换的蛋白质。
除了上述的不会明显改变TRAF-结合蛋白(TRAF-binding protein)的活性的保守性替换形式之外，那些会导致TRAF-结合蛋白类似物的生物活性增加的保守性替换形式或保守性稍低而随机性更高的改变形式，也在本发明范围之内。
当需要证实替换或缺失的确切效应时，本领域技术人员知道，可以通过常规的结合分析或细胞死亡分析来评估替换、缺失等的效应。用标准测试方法进行筛选并不涉及需要过度的实验。
在遗传水平，这些类似物的制备通常可以这样进行：对编码TRAF-结合蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变，从而产生编码类似物的DNA，随后合成DNA并在重组细胞培养中表达多肽。类似物通常表现出与天然存在的蛋白质相同或更高的生物活性。Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublications and Wiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989，
制备所述的TRAF-结合蛋白，或者制备因已知的密码子简并性所允许的变化而能编码相同多肽但与天然序列有所不同的其他核苷酸序列，都可以通过定点诱变编码早先制备的天然TRAF-结合蛋白或类似物的DNA而实现。定点诱变可以通过使用特异性的寡核苷酸序列来产生类似物，其中该特异性的寡核苷酸序列具有所需突变的DNA序列以及足够数目的相邻核苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂度(complexity)的引物，从而在被横跨的缺失连接处的两侧形成稳定的双链体。通常，优选的是长度约20-25个核苷酸的引物，并且在被改变的序列的每一侧有约5-10个互补核苷酸。一般，定点诱变技术是本领域中众所周知的，代表性的例子有Adelman等人， DNA，2：183(1983)，该文献的公开内容在此引用作为参考。
正如人们知晓的那样，定点诱变技术通常要采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括：载体如M13噬菌体，例如在Messing等人， Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton，Elsevier，Amsterdam编辑(1981)中所公开的那样，该文献在此引用作为参考。这些噬菌体是可方便地在市场上购得，而且它们的使用方法通常是本领域技术人员所熟知的。或者，也可使用含有单链噬菌体复制起点的质粒载体来获得单链DNA(Veira等人， Meth.Enzymol.153：3，1987).
通常，所述的定点诱变是这样进行的：先获得一单链载体，该载体在其序列中含有编码有关多肽的DNA序列。具有所需突变序列的寡核苷酸引物，可用自动的DNA/寡核苷酸合成法进行人工制备。然后将该引物与单链的、含有蛋白质编码序列的载体进行退火，然后在有DNA聚合作用的酶如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段的作用下，完成突变链的合成。这样，突变序列和第二条链就具有所需的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞，如大肠杆菌JM101细胞，并选择含有带突变序列的重组载体的克隆。
在选出了这样的克隆之后，可以取出突变的TRAF-结合蛋白的序列，并至于合适的载体中，该载体通常是可用于转染合适宿主的转移载体或表达载体。
因此，还可使用已知的DNA或RNA扩增技术，如PCR和化学寡核苷酸合成技术，在体外、原位和/或活体内检测、获得和/或修饰编码TRAF-结合蛋白的基因或核酸。PCR可以通过重复的DNA聚合酶反应来扩增特异的DNA序列(数目发生增加)。该反应可用作克隆的替换手段；而全部所需要的就是有关核酸序列的知识。为了进行PCR，可设计与感兴趣的序列互补的引物。然后通过自动的DNA合成法来制得这些引物。因为引物可被设计成与基因的任何部分杂交，因此可创造一些能够容忍互补碱基对存在错配的条件。扩增这些错配区域可导致合成出诱变的错误，该产物可导致产生具有新特性的肽(即定点诱变)。还请参见例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通过联合互补DNA(cDNA)合成技术，并使用反转录酶和PCR反应，可将RNA用作原料来合成催乳素受体的胞外域，而不经过克隆。
此外，PCR引物可被设计成含有新的限制性位点或具有其他特征，例如在位于待扩增的基因片段末端处的终止密码子。在扩增的基因序列的5′和3′端安置限制性位点，可以使编码TRAF-结合蛋白或其片段的基因片段能按需要被设计，以便连接于其他序列和/或其他载体的克隆位点。
PCR及其他扩增RNA和/或DNA的方法是本领域众所周知的，并且根据此处所给出的讲授和指导内容，可以根据本发明进行使用而不需过分的实验。已知的DNA或RNA的扩增方法包括(但并不限于)：聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增方法(参见，例如授予Mullis等人的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等人的美国专利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利5,142,033；授予Wilson等人的美国专利5,122,464；授予Innis的美国专利5,091,310；授予Gyllensten等人的美国专利5,066,584；授予Gelfand等人的美国专利4,889,818；授予Silver等人的美国专利4,994,370；授予Biswas的美国专利4,766,067；授予Ringold的美国专利4,656,135；和Innis等人编辑的《 PCR Protocols：A Guide to Method and Applications》)，以及RNA介导的扩增方法，其中使用对靶序列而言反义的RNA作为模板来合成双链DNA(授予Malek等人的美国专利No.5,130,238，其商品名为NASBA)；以及结合了DNA扩增和抗体标记技术的免疫-PCR(Ruzicka等人， 科学(Science)260：487(1993)；Sano等人，科学(Science)258：120(1992)；Sano等人， 生物技术(Biotechniques)9：1378(1991))。这些专利和对比文献的全部内容在此完全引用作为参考。
按类似的方式，TRAF-结合蛋白的生物活性片段(如任何一种TRAF2-结合蛋白(例如NIK或其同种型)的片段)，可以参考TRAF-结合蛋白类似物如上所述进行制备。合适的TRAF-结合蛋白片段是那些保留TRAF-结合蛋白能力，并能介导TRAF蛋白或其他与TRAF蛋白直接或间接相关的蛋白的生物活性的片段。因此，可以如上制备相对于类似物具有显性阴性效应或显性阳性效应的TRAF-结合蛋白片段。应注意，这些片段代表了本发明的一类特殊的类似物，就是说它们是衍生自全长TRAF-结合蛋白序列的TRAF-结合蛋白的一部分(如任何一种TRAF2-结合蛋白(例如NIK或其同种型)的片段)，每种片段或这样的部分具有任一上述所需的活性。例如，这样的片段可以是肽。
类似地，衍生物的制备还可通过标准修饰技术对TRAF-结合蛋白及其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基侧链进行修饰，或者通过将TRAF-结合蛋白及其类似物或片段偶连于其他分子例如抗体、酶、受体等，这些技术都是本领域中熟知的。因此，如本文所用，“衍生物”覆盖了用本领域已知手段对位于残基侧链的官能团或N-端或C-端基团进行修饰而制得的衍生物，而且这些衍生物被包括在本发明之内。衍生物可以具有化学分子部分，例如碳水化合物或磷酸残基，只要这样的组份具有与TRAF-结合蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括：羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通过与氨或与伯胺或仲胺的反应)、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基(alkanoyl)或碳环类的芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离的羟基(例如丝氨酰或苏氨酰)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
术语“衍生物”用于仅包括那些不将20个常见的天然存在的氨基酸中某一氨基酸改变为另一氨基酸的衍生形式。
TRAF-结合蛋白是蛋白质或多肽，即氨基酸残基序列。根据本文的定义，由更长的且包括了TRAF-结合蛋白全长序列的序列所构成的多肽，也被包括在该多肽的范围之内，只要所添加的部分不影响本发明的基本和新颖的特性，即它们保留或提高了TRAF-结合蛋白的生物活性，或者它们能够被切割以形成具有TRAF-结合蛋白生物活性的蛋白质或多肽。因此，本发明包括，例如TRAF-结合蛋白与其他氨基酸或肽形成的融合蛋白。
如上所述，应理解上述的本发明“TRAF-结合”蛋白是任何能够在细胞内结合并介导/调控TRAF蛋白质活性的蛋白质。具体的例子是TRAF2-结合蛋白，如上所述，它能够调控或介导与TRAF2相关的胞内信号传导活性，尤其是TRAF2在诱导NF-κB活性方面所涉及的活性，具体地这发生在TRAF2与TNF/NGF受体家族的不同成员和/或它们的相关衔接子相互作用之后(正如上面和下面详细描述的那样)。这类TRAF2-结合蛋白的一个具体例子是NIK蛋白及其类似物、片段等(参见实施例)，它们会非常特异地结合于TRAF2，并且在诱导NF-κB活性方面有直接作用，并且有各种NIK显性-负面作用的类似物/突变蛋白可阻断该活性。
所有上述的修饰形式都在本发明范围之内，只要它们使所编码的蛋白质或多肽或其类似物和衍生物保留了至少结合于TRAF2的222-501位氨基酸序列的能力。
所有的本发明蛋白质和多肽，因为能够结合于TRAF2，因此被认为是TRAF2信号传导的中介体或调节剂。因此，本发明的所述分子在例如信号传导过程中起作用，而在该信号传导过程中TRAF2配体与CD30、CD40、淋巴毒素β(LT-β)受体、p55或p75 TNF受体的结合，以及与本文上述的其他受体和衔接子蛋白结合，会导致激活转录因子NF-κB。特别感兴趣的是蛋白质NIK和NIK蛋白片段，它们由本发明的克隆10编码；对NIK和该克隆10所编码的蛋白质(最初称为NMPI)进行详细的序列分析，发现所编码的氨基酸序列具有对应于Ser/Thr蛋白质激酶特有的I-XI保守基序，这使该蛋白质具有这一功能。
新的克隆蛋白质、其类似物、其片段和衍生物具有众多可能的用途，例如：
(i)在需要增强功能的情况下，例如在需要TRAF2的诱导效应的抗肿瘤或免疫刺激应用中，它们可用于模拟或增强NF-κB活性，TRAF2及与TRAF2结合的受体的功能。在这种情况下，可将增强了TRAF2或其受体效应的本发明蛋白质、其类似物、其片段或衍生物，用本身已知的标准程序引入细胞。例如，因为本发明的DNA克隆所编码的蛋白质是胞内的，而且它们应当仅被引入需要TRAF2效应的细胞中，所以需要一种将这些蛋白质特异地引入细胞的体系。一种做法是构建一个重组动物病毒，例如衍生自痘苗病毒(Vaccinia)的病毒，并在其DNA中引入下列两个基因：编码配体的基因，该配体可结合于该细胞特异表达的细胞表面蛋白，例如可特异地结合于某些细胞(如CD4淋巴细胞和相关的白血病)的AIDs(HIV)病毒gp120蛋白，或任何其他能特异地结合于携带受体的细胞(该受体可结合于TRAF2)的配体，从而使重组的病毒载体能够结合于这些细胞；编码本发明蛋白的基因。这样，在病毒表面上表达的可与细胞表面结合的蛋白，就能使蛋白特异性地导向肿瘤细胞或其他携带受体的细胞，随后通过将蛋白质编码序列引入细胞，然后一旦该蛋白在细胞中表达就可提高受体或TRAF2的效应，从而在这些细胞中引发所需的免疫-刺激效应。可用标准程序来构建这些重组的动物病毒(参见例如Sambrook等人，1989)。另一种可能性是将可被细胞吸收的、编码蛋白的序列以寡核苷酸形式引入，然后在细胞中表达。
(ii)它们可用于抑制NF-κB活性、TRAF2及与TRAF2结合的受体的效应，例如在组织损伤(如在AIDS、脓毒性休克或移植物-宿主的排异反应)的情况下，在这些情况下需要对诱导的胞内信号传导进行阻断。在这类情况下，例如可以用标准程序，将具有本发明蛋白的反义编码序列的寡核苷酸引入细胞，该寡核苷酸可有效地阻断编码蛋白质的mRNA的翻译，从而阻断它们的表达并导致抑制不利的效应。或者，可以使用其他的寡核苷酸，该寡核苷酸保留结合于TRAF2的能力并且该结合可干扰其他分子与TRAF2蛋白的结合，而同时又不介导该分子的激活或调节作用。具有这些特性时，该分子可扰乱TRAF2与其天然配体的相互作用，因而可作为消除TRAF2的介导效应(如激活NF-κB等)的抑制物。这些寡核苷酸可用上述的重组病毒方法引入细胞，病毒携带的第二条序列就是该寡核苷酸序列。
另一种可行方法是，使用对本发明蛋白特异性的抗体来抑制它们的胞内信号传导活性。
另一种抑制不利效应的方法是最近开发出的核酶法。核酶是催化性的RNA分子，它可特异性地切割RNA。可对核酶进行工程改造，以切割所选择的目标RNA，例如编码本发明蛋白质的mRNA。这类核酶具有对蛋白质的mRNA特异性的序列，而且能够与其相互作用(互补结合)，然后切割mRNA，结果导致蛋白质表达的下降(或完全消失)，其中表达的下降水平取决于在靶细胞中核酶的表达水平。为了将核酶引入选定的细胞(例如携带TRAF2结合蛋白的细胞)，可以使用任何合适的载体，例如质粒、动物病毒(反转录病毒)载体，它们通常可用于该目的(参见上面的(i)，其中病毒含有编码所选择的核酶序列的cDNA，作为第二条序列)。(有关综述，与核酶等有关的方法，可参见Chen等人，1992；Zhao和Pick，1993)。
(iii)它们可用于分离、鉴别和克隆其他能够与它们结合的蛋白质，例如那些在胞内信号传导过程中所涉及的、位于TRAF2下游的其他蛋白质。例如，编码本发明蛋白质的DNA序列可用于酵母双杂交体系中，在该体系中编码出的蛋白质被用作“诱饵”，从而从cDNA文库或基因组DNA文库中分离、克隆和鉴别出其他序列(“猎物”)，该其他序列编码能结合于克隆蛋白的蛋白质。用相同的方法，还可以确定本发明的蛋白质是否能够结合于其他细胞蛋白质，例如TNF/NGF受体超家族中的其他受体。
(iv)编码的蛋白质、其类似物、其片段或衍生物还可用于分离、鉴别和克隆出相同类别的其他蛋白质，即那些能够结合于TRAF2或功能相关蛋白的、并在胞内信号传导过程中涉及的蛋白质。在这种应用中，可使用上述的酵母双杂交体系，或者使用最近开发的、在PCR克隆之后采用非严紧的Southern杂交体系。
(v)另一种利用本发明的编码蛋白质、其类似物、其片段或衍生物的方法是，在亲和色谱法中使用它们来分离和鉴别其他的、那么被它们结合的蛋白质或因子，例如与TRAF2相关的蛋白质或者在胞内信号传导过程中所牵涉的其他蛋白质或因子。在该方法中，本发明的编码蛋白质、其类似物、其片段或衍生物，可以各自被附着于亲和色谱基质上，然后与细胞提取物或分离出的、怀疑在胞内信号传导过程的涉及的蛋白质或因子接触。在亲和色谱之后，对结合于本发明蛋白质、其类似物、其片段或衍生物上的其他蛋白质或因子进行洗脱、分离和定性研究。
(vi)如上所述，本发明蛋白质、其类似物、其片段或衍生物可以被用作免疫原(抗原)，以产生特异性的抗体。这些抗体也可用于纯化用途，将本发明的蛋白质从细胞提取物或从能产生本发明蛋白、其类似物或片段的转化细胞系中纯化出来。此外，这些抗体可用于诊断用途，以鉴别与受体系统的功能异常相关的疾病，其中它们发挥了过高或过低的TRAF2-诱导细胞效应。因此，只要这些失调是与涉及本发明蛋白质的胞内信号系统的功能异常有关，这些抗体就可作为重要的诊断工具。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、针对能够以可溶或固定形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体，以及它们的片段，例如能够结合抗原的、缺少完整抗体的Fc区的Fab和F(ab′)2片段。
(vii)用于本发明的抗体，包括抗体片段，可用于在样品中定量或定性地检测本发明克隆，或者用于检测是否存在表达本发明克隆的细胞。这可以采用荧光标记的抗体和免疫荧光技术，并结合光学显微计量检测、流式细胞计量检测或荧光计量检测术而加以实现。
用于本发明的抗体(或其片段)可在组织学上被采用，如在免疫荧光或免疫电子显微术中，以便原位检测本发明的克隆。原位检测可这样进行：从病人上取一份组织样品，然后将标记的本发明抗体提供给该样品。抗体(或其片段)的提供宜通过将标记的抗体(及其片段)施涂或覆盖在生物样品上。通过使用这一程序，不仅可以确定是否存在克隆，而且可以确定其在受检组织中的分布。使用本发明，一般技术人员会知道，各种不同的组织学方法(例如染色程序)都能被改动以实现这种原位检测。
这些分析本发明克隆的方法通常包括：将生物样品如生物液体、组织提取物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或在组织培养中孵育过的细胞，和能鉴别该编码蛋白质的可检测标记抗体一起温育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种技术来检测抗体。
(viii)本发明的编码蛋白因为能够结合于其他胞内蛋白质，所以还可被用作众多其他蛋白质的间接调节剂，而这些其他胞内蛋白质可直接地结合于另一些胞内蛋白或跨膜蛋白的胞内结构域。
对于为了调节这些其他的胞内蛋白质或跨膜蛋白的胞内结构域，可用众多方法将本发明蛋白质引入细胞，例如在上述(ii)中所述的方法。
还应注意，本发明蛋白质的分离、鉴别和定性可以用熟知的标准筛选程序进行。例如，这些筛选程序中的一种是酵母双杂交程序，它可用于鉴别本发明蛋白。同样，也可采用其他程序例如亲和色谱、DNA杂交法等(这些都是本领域中熟知的方法)来分离、鉴别和定性研究本发明的蛋白质，或者分离、鉴别和定性研究其他能够结合于本发明蛋白的蛋白质、因子、受体等。
此外，被发现的能结合于本发明蛋白的蛋白质，其本身也能按上述或下述的使用本发明蛋白的类似方式被利用，以分离、鉴别和定性研究其他蛋白质、因子等。而这些蛋白质和因子等可结合于本发明蛋白的，代表了在相关的信号传导过程的更下游所涉及的因子，或者有信号传导活性并因此代表了在不同的信号传导过程中所涉及的蛋白质。
本发明的DNA序列和所编码的蛋白质，可用任何标准的重组DNA方法(参见例如Sambrook等人，1989)进行生产，其中用合适的含有蛋白质编码序列的真核或原核载体来转化合适的真核或原核宿主细胞。因此，本发明还涉及这些用于生产本发明代表的表达载体和转化的宿主细胞。如上所述，这些蛋白质还包括它们的生物活性类似物、其片段和衍生物，因此编码它们的载体也包括编码这些蛋白质的类似物和片段的载体，而转化的宿主细胞包括那些产生这些类似物和片段的宿主细胞。这些蛋白质的衍生物是由转化的宿主细胞产生的，通过对蛋白质或其类似物或其片段进行标准的修饰而产生的衍生物。
本发明还涉及调节TRAF2的介导效应的药物组合物。该药物组合物含有一种或多种下列物质作为活性成分：(i)被亚克隆在合适的表达载体中的本发明的一种或多种DNA序列，或其片段；(ii)本发明的蛋白质、其生物活性片段、类似物、衍生物或它们的化合物；(iii)编码本发明蛋白质、其生物活性片段、类似物或衍生物的重组动物病毒载体。
该药物组合物可根据待治疗的疾病并以对病人有益的剂量(取决于体重和其他考虑因素)进行施用，这可以由医务人员确定。
如上所述，本发明的TRAF-结合蛋白的一个具体例子是TRAF2-结合蛋白NIK。本发明的发现是：NIK能特异性地结合于TRAF2并因而是TRAF2的中介体/调节剂，因此NIK能够介导/调节TRAF2在NF-κB激活过程中的活性，所以它在细胞存活途径中所起的可能作用(其中TRAF2独立地或与其他蛋白质(如p55TNF和p75 TNF受体、FAS/APO1受体、MORT-1、RIP和TRADD)一起发挥功能)。基于该发现，按需要设计出能够增强或因子TRAF2-NIK相互作用的药物是至关重要的。例如，当需要增加TNF所诱导的细胞毒性时，就可以通过抑制TRAF2-NIK的相互作用或通过特异性地抑制TRAF2和/或NIK，从而抑制NF-κB的诱导作用。同样，例如当需要抑制TNF所诱导的细胞毒性时，就可以通过增加TRAF2-NIK的相互作用或通过增加TRAF2和/或NIK对NF-κB的特异性诱导，从而增加NF-κB的诱导作用。这类药物对许多疾病有很大帮助。这其中(请参见上面的论述)包括：急性肝炎，其中对肝脏的急性损伤似乎反映了在受Fas受体诱导之后FAS/APO1受体所介导的肝脏细胞死亡情况；自身免疫所诱导的细胞死亡，例如会导致糖尿病的胰腺β Langerhans细胞死亡；在移植物排异(如肾脏、心脏和肝脏)中细胞死亡；在多发性硬化症中的脑少突胶质细胞死亡；和AIDS所诱导的T细胞自杀，这造成AIDS病毒的增殖并导致AIDS病。
在这种情况下，需要抑制FAS/APO1受体所介导的细胞毒(细胞程序死亡，或称细胞凋亡)途径，并通过TRAF2和TRAF2-NIK相互作用来增强FAS/APO1受体所介导的NF-κB诱导作用。一种做法是增加细胞中NIK的数量，或者增加TRAF2和NIK的数量，这样就增加由NIK-所介导或TRAF2-NIK-所介导的、对NF-κB激活的诱导作用，从而是NF-κB激活水平更高，进而使细胞存活度更高；或者这样就可以增加FAS/APO1受体和TRAF2(或TRAF2-NIK)之间的直接或间接作用，结果使FAS/APO1受体与细胞毒中介体(如MACH，参见图2b的示意图)的相互作用下降，从而提高对NF-κB激活的诱导作用，进而提高细胞存活度。
相反，例如在肿瘤和受感染细胞(参见上面的论述)的情况下，会需要增加FAS/APO1受体所介导的细胞毒性，以增加细胞死亡。在这种情况下，就需要抑制FAS/APO1受体与TRAF2(或T2-NIK)之间的相互作用和/或直接抑制NIK，从而降低对NF-κB激活的诱导作用。
NIK或其一种或多种可能的同种型、类似物或片段，可能可以作为NIK本身或NIK-TRAF2相互作用的“天然”抑制剂，并因此可以作为对NF-κB激活的诱导作用的抑制剂。因此，这些抑制剂可用作如上所述的特异性抑制剂，例如在需要增加TNF或FAS/APO1受体的细胞毒效应以增加细胞死亡的情况下所使用的抑制剂。事实上，正如下面例示的那样，各种不同的NIK类似物和突变蛋白已经根据本发明被分离出来，它们是激酶缺陷型的类似物/突变蛋白，并且能够阻断TNF受体、FAS/APO1受体及其相关的TRADD、RIP和MORTI所介导的对NF-κB激活的诱导作用；阻断IL-1受体所介导的诱导作用(该激活作用是通过NIK，但是不依赖于TRAF2)；以及阻断细菌内毒素(LPS)、forbol豆蔻酸乙酸酯(forbolmyristate acetate)、HTLV-1蛋白TAX所介导的诱导作用。同样，还可筛选其他物质如肽、有机化合物、抗体等，以获得能够抑制TRAF2-NIK相互作用或NIK活性的特异性药物。
按类似方式，在如上所述的各种需要增加NF-κB激活作用的情况下，可以例如通过本文上述的各种标准方法(例如将编码NIK和/或TRAF2的DNA引入细胞以诱导更高的表达，或者制备合适的含有NIK和/或TRAF2的制剂以便直接引入细胞，或者通过本领域技术人员抑制的任何其他方法)，来增加NIK和/或TRAF2在细胞中的数量。同样，还可筛选其他物质如肽、有机化合物等，以获得能够增强NIK活性或TRAF2-NIK相互作用的特异性药物。
一种如何来设计NIK-TRAF2相互作用的肽抑制剂的、不起限定作用的例子，是根据早先对ICE或ICE样蛋白酶的肽抑制剂、ICE的底物特异性的研究结果以及通过肽合成技术进行表位分析的策略。已发现，ICE有效切割某个肽的最低要求，涉及在切割位点左侧的4个氨基酸，并且在P1位置强烈优选天冬氨酸并且在P1位的右侧有足够的甲胺(Sleath等人，1990；Howard等人，1991；Thomberry等人，1992)。此外，一种缩写为Ac-DEVD-AMC的荧光团底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰(coumaryl)-7-酰胺)，对应于在FAS-R刺激和其他凋亡过程(Kaufmann，1989；Kaufmann等人，1993；Lazebnik等人，1994)之后不久在细胞中发现的被切割的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，而且该底物可被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一个成员)和MACH蛋白酶有效地切割。
因为在底物的P1位的Asp显得很重要，因此第四个氨基酸残基为Asp并且在前3个残基位置上有各种不同组合的四肽，便可以被快速地筛选是否能结合于蛋白酶的活性位点，例如采用Geysen开发的技术(Geysen，1985；Geysen等人，1987)，在该技术中对位于固相载体上的大量肽进行筛选，确定它们是否与抗体有特异性的相互作用。MACH蛋白酶与特异性肽的结合，可用本领域技术人员技能范围之内各种熟知的检测方法，例如放射标记法，进行检测。已表明，Geysen的这种方法能够在每个工作日至少测试4000种肽。
按类似的方式，确定TRAF2与NIK之间(或任何TRAF2蛋白与TRAF2结合蛋白之间)相互作用的准确的结合区域或者同源区域可以被阐明，然后可以筛选能用于阻断该相互作用的肽，例如合成的、序列类似子结合区域或互补于结合区域的肽，从而使该肽能够与天然NIK(或TRAF2结合蛋白)竞争与TRAF2(或TRAF)的结合。
因为设计能够选择性地抑制TRAF2-NIK(或TRAF-TRAF-结合蛋白)之间的相互作用，而不干扰胞内信号传导途径所涉及的其他成员(例如细胞死亡途径中的MACH蛋白酶，它是CED3/ICE蛋白酶家族的成员)的细胞生理死亡过程的肽抑制剂是有利的，所以可进一步合成在分析(例如上述的某种分析)中能结合于TRAF2(或TRAF)或NIK(或TRAF-结合蛋白)的肽库(pool)，以便作为荧光底物肽来测试与这些其他蛋白质的选择性结合情况，从而选择出仅对TRAF2/NIK(或TRAF/TRAF-结合蛋白)特异的种类。例如，然后，经确定对TRAF2/NIK特异的肽可以被修饰以提高细胞通透性并可逆或不可逆地抑制TRAF2和/或NIK的活性。Thomberry等人(1994)报道了一种四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2，6-(CF3)]Ph，它是ICE的强失活剂。类似地，Milligan等人(1995)报道，具有氯甲基酮基团的四肽抑制剂(不可逆地)或具有醛基团的四肽抑制剂(可逆地)会抑制ICE。此外，已表明苄氧基羧基-Asp-CH2OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等人，1995)。因此，按类似方式，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(O)-DCB基团，对选择性地结合于例如TRAF2或NIK的四肽进行修饰，以产生抑制TRAF2/NIK活性的肽抑制剂。此外，为了提高通透性，例如可以对肽进行化学修饰或衍生处理，以提高它们通过细胞膜的通透性，并协助将这些肽运送通过膜而加入细胞质。Muranishi等人(1990)报道了用月桂酸对促甲状腺释放激素进行衍生处理，形成了一种亲脂的、具有良好的通过细胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等人(1991)还报道，将甲硫氨酸氧化成亚砜并用其酮亚甲基异酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽键，以帮助肽通过细胞膜。这些方法仅仅是本领域技术人员技能之内的、已知的修饰和衍生方法中的一部分而已。
此外，能够抑制例如NIK活性(通过抑制NIK-TRAF2相互作用等，TRAF蛋白和TRAF-结合蛋白之间相互作用)的药物或肽抑制剂，可以与协助进入细胞的分子进行偶连或复合。
美国专利No.5,149,782公开，可将待运输通过细胞膜的分子与膜共混剂(blending agent)偶连在一起，这些膜共混剂有例如融合多肽、形成离子通道的多肽、其他膜多肽、和长链脂肪酸如肉豆蔻酸和棕榈酸。这些膜共混剂将分子偶连物插入细胞膜的脂类双分子层中，然后协助它们进入细胞质。
Low等人的美国专利5,108,921回顾了通过受体介导的内吞机制，来跨膜运送分子(例如(但并不限于)蛋白质、核酸)的已有方法。这些受体系统包括那些识别下列物质的系统：半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、钴胺传递蛋白(维生素B12)、α-2巨球蛋白、胰岛素和其他的肽生长因子如表皮生长因子(EGF)。Low等人讲授，营养物的受体如生物素和叶酸的受体，可有利地被用于增强通过细胞膜的运输，因为在大多数细胞的膜表面上存在多种生物素和叶酸受体并且有相应受体介导的跨膜运输过程。因此，待输送入细胞质的化合物与配体如生物素或叶酸所形成的复合物，与具有生物素或叶酸受体的细胞膜接触之后，就启动了受体所介导的跨膜运输机制并从而允许所需的化合物进入细胞。
已知ICE能够容忍P2位置上自由替换，而且这种对自由替换的容忍性被加以利用，以开发有力的和高选择性的、具有生物素标记的亲和标记物(Thornberry等人，1994)。因此，可以对P2位以及可能可以对四肽抑制剂的N-端进行修饰或衍生处理，例如添加生物素分子，从而提高这些肽抑制剂通过细胞膜的通透性。
此外，在本领域中知晓，可以将所需的肽序列与引导肽/信号肽序列融合在一起以产生“嵌合肽”，这样就能够使“嵌合肽”被运输穿过细胞膜而进入细胞质。
正如肽领域的技术人员所知道的那样，根据本发明，抑制TRAF-TRAF-结合蛋白的相互作用(如TRAF2-NIK相互作用)的肽抑制剂，包括肽模拟型的药物和抑制剂，它们可以被快速地加以筛选，以确定是否结合于例如TRAF2/NIK，从而设计出可能更稳定的抑制剂。
还应理解，上述的用于协助或增强肽抑制剂被运输穿过细胞膜的相同手段，也可被用于TRAF-结合蛋白，例如NIK，其类似物、其片段或其同种型，以及在胞内发挥功效的其他肽和蛋白质。
至于在此处全文中提及的抗体，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、嵌合抗体、针对能够以可溶或固定形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及用各种已知技术产生的它们的片段，例如(但并不限于)：酶切、肽合成或重组技术。
多克隆抗体是异质的抗体分子群体，它们来自用抗原免疫的动物血清。单克隆抗体含有基本上均质的、对抗原特异的抗体群体，该群体含有基本相似的表位结合位点。可用本领域技术人员已知的方法来获得单克隆抗体。参见例如Kohler和Milstein， 自然，256：495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等人编，Harlow and Lane，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)；和Colligan等人编， Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，这些文献的内容都全部在此引用作为参考。这些抗体可以是任何种类的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它们的任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内进行培养。在体内或原位下生产高效价单克隆抗体，是目前优选的生产方法。
嵌合抗体是这样的分子，该分子的不同部分来自不同的动物物种，例如具有鼠单克隆抗体的可变区以及人的免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体重要用于降低应用中的免疫原性以及增加产量，例如在杂交瘤产生的鼠单克隆抗体具有更高的效价但在人中也具有更高免疫原性的情况下，可以使用这种人/鼠嵌合mAbs。嵌合抗体及其生产方法是本领域中已知的(Cabilly等人， 美国科学院院报81：3273-3277(1984)；Morrison等人， 美国科学院院报81：6851-6855(1984)；Boulianne等人， 自然(Nature)，312：643-646(1984)；Cabilly等人，欧洲专利申请125023(1984年11月14日出版)；Neuberger等人， 自然(Nature)，314：268-270(1985)；Taniguchi等人，欧洲专利申请171496(1985年2月19日出版)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日出版)；Neuberger等人，PCT申请WO 8601533(1986年3月13日出版)；Kudo等人，欧洲专利申请184187(1986年6月11日出版)；Sahagan等人， 免疫学杂志(J.Immunol.)137：1066-1074(1986)：Robinson等人，国际专利申请No.WO8702671(1987年5月7日出版)；Liu等人，美国科学院院报84：3439-3443(1987)；Sun等人， 美国科学院院报84：214-218(1987)；Better等人， 科学(Science)240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，同上)。这些文献全部在此引用作为参考。
抗独特型(抗-Id)抗体是这样的抗体，它识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体的制备，是通过免疫与单克隆抗体来源动物相同物种和基因型的动物(例如小鼠品种)，其中该单克隆抗体就是制备的抗-Id所要针对的。被免疫的动物会识别免疫抗体的独特型决定簇，并通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而进行应答。参见例如美国专利No.4,699,880，该专利全部在此引用作为参考。
抗-Id抗体还可用作“免疫原”，在另一动物中诱导免疫应答，以产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id抗体与最初诱导抗-Id的单克隆抗体在表位方面会相同。因此，通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体，可以鉴别出表达具有相同特异性的抗体的克隆。
因此，本发明的针对TRAF-结合蛋白、其类似物、其片段或衍生物(如NIK、其同种型、类似物、片段或衍生物)的单克隆抗体，可用于在合适的动物如BALB/c小鼠中诱导产生抗-Id抗体。可使用来自该被免疫小鼠的脾细胞，来产生分泌抗-Id mAb的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id mAb还可被偶连于载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)，然后再用于免疫其他的BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗体，该抗体具有最初单克隆抗体的结合特性，并对上述的TRAF-结合蛋白、其类似物、其片段或其衍生物的表位是特异的。
这样，抗-Id mAb就具有它们自有的独特型表位，即结构上与被评估的表位相类似的“独特位(idiotope)”，如GRB蛋白-a。
术语“抗体”还包括完整分子及其片段，例如能够结合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，能够快速地从循环系统中被清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合特性(Wahl等人， J.Nucl.Med.24： 316-325(1983))。
应理解，根据本文公开可用于完整抗体分子的方法，本发明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他的抗体片段，也可用于检测和定量分析TRAF-结合蛋白。这些片段通常可使用例如木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)，通过蛋白酶水解切割而产生。
如果抗体能特异性地与某分子反应从而使该分子与抗体结合，那么就称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指任何分子中能够被抗体识别而且也能被抗体结合的部分。表位或“抗原决定簇”通常是由分子表面的化学活性基团如氨基酸或糖的侧链所构成，而且具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。
“抗原”是能够被抗体结合的、并且还能诱导动物产生抗体(该抗体能够结合于该抗原的表位)的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个表位。上述的特异反应指抗原会以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不会与大量由其他抗原所产生的其他抗体反应。
本发明的有用的抗体(包括抗体片段)可用于在样品中定量或定性地检测TRAF-结合蛋白(如NIK)，或者检测是否存在表达本发明TRAF-结合蛋白的细胞。这可以用免疫荧光技术，采用荧光标记的抗体(参见下面)并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。
用于本发明的抗体(或其片段)可在组织学上被采用，如在免疫荧光或免疫电子显微术中，以便原位检测本发明的TRAF-结合蛋白。原位检测可这样进行：从病人上取一份组织样品，然后将标记的本发明抗体提供给该样品。抗体(或其片段)的提供宜通过将标记的抗体(及其片段)施涂或覆盖在生物样品上。通过使用这一程序，不仅可以确定是否存在TRAF-结合蛋白，而且可以确定其在受检组织中的分布。使用本发明，一般技术人员会很容易地知道，各种不同的组织学方法(例如染色程序)都能被改动以实现这种原位检测。
这些分析本发明TRAF-结合蛋白的方法通常包括：将生物样品如生物液体、组织提取物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或在组织培养中孵育过的细胞，在能够鉴别TRAF-结合蛋白的可检测标记抗体存在下一起温育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种检测抗体。
生物样品可以用固相载体或载体如硝酸纤维素，或者用能够固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相载体或载体进行处理。然后用合适的缓冲液洗涤载体，再根据本发明如上所述的那样用可检测的标记抗体进行处理。再用缓冲液第二次洗涤固相载体或载体，以去除未结合的抗体。接着用常规方法，检测该固相载体或载体上所结合的标记的数量。
“固相载体”、“固体载体”、“载体”指任何能够结合抗原或抗体的载体材料。熟知的载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的或改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。对于本发明目的，载体的性质可以是不溶的，或者有某些程度的可溶性。载体材料几乎可以包括所有可能的结构构型，只要所偶连的分子能够结合于抗原或抗体。因此，载体的结构可以是球形(如珠)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。或者，表面可以是平坦的，如板、测试条带等。优选的载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员会知道可用于结合抗体或抗原的其他合适载体，并且能够通过常规实验来确定这些载体。
如上所述的本发明某批抗体的结合活性，可以用众所周知的方法进行测定。通过采用常规实验，本领域技术人员能够确定每次测定的操作条件和最佳分析条件。
其他的步骤，诸如洗涤、搅拌、振荡、过滤等，可以被增加到分析方法中，并且这些步骤都是常规的或是具体情况下所必需的。
在本发明的抗体能够被可检测地标记的情况下，一种方法是将该抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶暴露于合适的底物时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学分子。能够用于可检测地标记抗体的酶包括(但并不限于)：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、丙糖磷酸酯异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱脂酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测的实现，还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较。
检测还可用各种其他的免疫分析方法实现。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，就可以通过通过施用放射免疫分析(RIA)而检测R-PTP酶。对于RIA的完善描述可在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.S.等人，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其参见Chard，T.所写的标题为“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques(放射免疫分析和相关技术的介绍)”的章节，该文献在此引用作为参考。放射性同位素可用g计数器或闪烁计数器等设备，或通过放射性自显影而进行检测。
还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出其存在与否。在最常用的荧光标记化合物中，有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、绿脓菌素、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和胺荧。
抗体还可以用发出荧光的金属如152E或其他镧系金属进行标记。可用这些金属的螯合基团如二乙三胺五乙酸(ETPA)使之附着于抗体。
还可以通过将抗体偶连于化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，带有化学发光标记的抗体的存在与否，可通过检测在化学反应过程中产生发光的情况而进行检测。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、热(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在，可通过检测发光而加以确定。用于标记用途的主要生物发光化合物是荧光素(luciferin)、荧光素酶和水母蛋白。
本发明的抗体分子可用于免疫测量分析，也以“双位点”或“夹心”分析为人们已知。在典型的免疫测量分析中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相载体或载体上，然后加入一定量可检测的被标记可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相载体抗体、抗原和标记抗体之间消除的三元复合物。
典型的(且优选的)免疫测量分析包括“正向”分析法，在该分析法中固定在固相上的抗体先与测试样品接触，从而通过形成二元的固相抗体-抗原复合物而将抗原从样品中取出。在温育合适时间之后，洗涤固相载体或载体以去除残留的液体样品(包括未反应的抗原)(如果有的话)，然后再与含有未知数量的标记抗体(作为“报道分子”)的溶液接触。在第二次温育以便让标记抗体，与通过未标记抗体而结合于固相载体或载体上的抗原进行复合之后，第二次洗涤固相载体或载体，以去除未反应的标记抗体。
在另一种“夹心”分析法(该方法可与本发明的抗原一起使用)中，使用所谓的“同时”和“反向”分析。同时分析涉及一个温育步骤，因为固定于固相载体或载体的抗体和标记抗体被同时加入到测试样品中。在温育结束之后，洗涤固相载体或载体以去除残留的液体样品或未复合的标记抗体。然后再象常规“正向”夹心分析那样，测定与固相载体或载体相连的标记抗体的存在与否。
在“反向”分析中，按步骤先将标记抗体溶液加至液体样品中，然后在温育适当时间之后，再加入固定于固相载体或载体的未标记抗体。在第二次温育之后，以常规方式洗涤固相载体，以洗去残留的测试样品和未反应的标记抗体溶液。再象“同时”或“正向”分析那样测定与固相载体或载体相连的标记抗体的存在与否。
如上所述，本发明还涉及含有重组动物病毒载体的药物组合物，该载体编码TRAF-结合蛋白，还编码能够结合于特定靶细胞(如癌症细胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，从而能引导TRAF-结合蛋白相连插入到细胞中。本发明的另一类药物组合物是含有一种或多种下列物质作为活性成分：(a)具有TRAF-结合蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列；或(b)阻断TRAF-结合蛋白与TRAF相互作用的药物。
本发明的药物组合物含有足够数量的活性成分以达到其所需用途。此外，药物组合物还可含有合适的药学上可接受的载体，其中包括赋形剂和辅助剂，它们可协助将活性化合物加工成可作为药物使用的制剂，并且它们可使制剂给所需对象施用时更稳定。这些都是本领域技术人员熟知的。
TRAF-结合蛋白及其同工型或同种型，被怀疑在不同组织中以明显不同的水平进行表达，而且与各种在胞内信号传导途径所涉及的其他蛋白质的表达相类似，具有不同形式(pattern)的同种型。这正如在上述共同拥有且都未审定的专利申请中所指出的那样。这些差别可能对FAS/APO1-配体和TNF应答的组织特异性特征有影响。正如其他CED3/ICE同系物(Wang等人，1994；Alnemri等人，1995)，本发明人在以前(在上述的专利申请中)已表明，含有不完整CED3/ICE区域的MACH同种型(如MACHα3)，被发现对共表达的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；它们还被发现可阻断FAS/APO1和p55-R的死亡诱导过程。在细胞中表达这些抑制性的同种型可形成一个细胞自我保护机制，以对付FAS/APO1介导的和TNF介导的细胞毒性。MACH同种型的广泛非均一性(这种非均一性超过了CED3/ICE家族中任何其他蛋白酶中所观察到的情况)，应能允许对活性MACH同种型的功能进行极其精细的调节。
根据本发明，已分离出一种TRAF-结合蛋白(即TRAF2-结合蛋白NIK)的类似物/突变蛋白。这些NIK类似物/突变蛋白(参见上面的论述和下面的实施例)可抑制NIK所介导的作用，并可抑制TNF受体、FAS/APO1受体、其相关蛋白、IL-1受体和其他物质所介导的对NF-κB激活的诱导作用。因此，如上所述，按照它们与TRAF蛋白的相互作用以及它们对TRAF蛋白或TRAF所介导的胞内信号传导所造成的影响，TRAF-结合蛋白或有可能其同种型在不同的组织中有不同的效应。
还有可能某些可能的TRAF-结合蛋白同种型有其他功能。例如，NIK或某些NIK类似物或同种型还可作为某些分子的停靠位点，而这些分子是在其他的，例如FAS/APO1和TNF受体通过与TRAF2的相互作用或甚至不依赖TRAF2而发挥非细胞毒效应中所涉及的分子。
因为FAS/APO1和TNF受体独特的能够造成细胞死亡的能力，以及TNF受体能够引发其他导致组织毁灭的活性的能力，所以这些受体功能发生异常对生物体就特别有害。事实上，这些受体的功能过度或缺陷都会导致在病理上表现出各种病症(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鉴别出参与受体信号传导活动的分子并找出调控这些分子活性的方法，就能够指明新的治疗途径。考虑到TRAF蛋白(如TRAF2)及在FAS/APO1介导和TNF介导的NF-κB激活过程中TRAF与TRAF-结合蛋白相互作用(如TRAF2与NIK的相互作用)，设计能够阻断TRAF-TRAF-结合蛋白相互作用(如TRAF2与NIK的相互作用)的药物是至关重要的，当需要杀灭细胞(通过抑制NF-κB激活)。与之相反，当需要保留细胞时，就应加强这种相互作用(增强NF-κB激活)。
该药物组合物可根据待治疗的疾病，以对病人有益的剂量(取决于体重和其他考虑因素)进行施用，这些可以由医务人员确定。
本发明还涉及能够结合于本发明的TRAF-结合蛋白并从而能够调控/或介导TRAF-结合蛋白活性的蛋白质或其他配体。这些蛋白质或配体可用上述的任何方法进行筛选、分离和产生。例如，可以分离出大量新的、能够结合于本发明NIK蛋白的配体(包括蛋白质)(这些新的蛋白质/配体不包括已知的TRAF2以及可能的IκB，如果NIK确实结合IκB)。
正如上面详细论述，这些新的TRAF-结合蛋白-结合蛋白/配体如NIK-结合蛋白，可以作为例如NIK所介导的活性或例如TRAF2-NIK相互作用所介导的活性的抑制剂或增强剂(enhancer)，因此在上述的各种病理和其他情况中有重要作用。TRAF-结合蛋白-结合蛋白/配体的另一功能是作为特异性的试剂用于纯化TRAF-结合蛋白，例如通过亲和色谱，其中将这些新的结合蛋白/配体附着在合适的色谱基质上，形成固相或亲和载体/基质，然后让含有TRAF-结合蛋白(如NIK)的溶液、提取物等通过该载体/基质，从而以这种方式协助纯化。目前，这些亲和色谱方法是本领域中众所周知的并且通常是标准程序。
同样，本发明的所有上述TRAF-结合蛋白、其类似物、其片段、其同种型和衍生物，可用于通过亲和色谱来纯化各种与它们发生结合的TRAF蛋白。例如，TRAF2-结合蛋白如NIK、其类似物、其片段和NIK的突变蛋白(参见下面的实施例)可用于亲和色谱纯化TRAF2。因此，按与本发明的NIK蛋白、其类似物/突变蛋白被分离和生产的相同方式(参见下面的实施例)，通过使用这些方法和任何其他本领域技术人员显而易见的等价方法，可以鉴别和生产出其他的TRAF2-结合蛋白。这类鉴别和生产TRAF-结合蛋白如TRAF2-结合蛋白的方法会包括筛选步骤，在该步骤中TRAF(如TRAF2)蛋白、或至少其特异性部分(如TRAF2中在氨基酸222-501之间的部分)被用作底物或“诱饵”，以获得能够与其结合的蛋白质或其他配体；随后是鉴别和定性研究这样获得的这些蛋白质/配体；然后是产生基本上处于分离或纯化形式的该蛋白质/配体。所有这些步骤都是本领域技术人员熟知的，并且在本文的上面和下面有详细描述。
现在结合下面不起限定作用的实施例和附图，更详细地描述本发明。
还应注意的是，下列程序以及在下列实施例中所用的其他程序，在本发明人以前关于其他胞内信号传导蛋白和途径的出版物(参见例如Boldin等人，1995a、1995b和Boldin等人1996)中已有详细描述：i)双杂交筛选和双杂交半乳糖苷酶表达测试；ii)蛋白质的诱导表达、代谢标记和免疫沉淀；iii)体外结合；iv)细胞毒性的测定；和v)Northern分析和序列分析。这些程序在共同拥有和都未审定的以色列申请No.114645、114986、115319、116588、117932和120367，以及相应的PCT申请No.PCT/US96/10521中也有详细描述。因此，所有这些出版物和专利申请的全部公开内容在本申请中被完全引用而包括，至少只要涉及详细的实验程序时被引用而包括。
实施例
材料和方法
i)cDNA库
a)B细胞cDNA库
使用来自人B细胞并用寡dT为引物所构建的文库(Durfee等人，1993)。将文库的cDNA插入基于pACT的载体pSE1107的XhoI位点中，与GAL4激活结构域相融合。
b)λgt10睾丸cDNA库
使用来自人睾丸的cDNA库。该文库是随机的六聚核苷酸所引发的文库，平均插入片段大小为200-400bp。
ii)酵母菌株
在转化和筛选中使用两种酵母菌株：HF7c菌株被用于双杂交筛选，SFY526菌株被用于β-半乳糖苷酶分析。两种菌株都携带营养缺陷型标记trp1和leu2，就是说这些酵母菌株不能在缺少色氨酸和亮氨酸的极限合成培养基中生长，除非它们被含有这些基因(TRP1，LEU2)的野生型的质粒所转化。这两种酵母菌株在其GAL4和GAL80基因中携带缺失突变(分别为gal4-542和gal80-538突变)。
SFY526和HF7c菌株在它们的基因型中携带lacZ报道基因，在SFY526菌株中被融合于UAS和GAL1启动子的TATA部分，在HF7c中3个拷贝的GAL417聚的共有序列和CYC1启动子的TATA部分被融合于lacZ。GAL1 UAS和GAL417聚体都会对GAL4转录激活物作出响应。此外，HF7c菌株携带融合于UAS和GAL1启动子的TATA部分的HIS3报道基因。
iii)人TRAF2的克隆
人TRAF2是从HL60 cDNA库中，通过PCR而克隆的(对于TRAF2序列和其他细节，请参见Rothe等人，1994；Rothe等人1995a；Cheng等人，1996；Hsu等人1996；和Wallach，1996)。使用的引物是：a)30聚的正向引物CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC，该引物对应于hTRAF2中从第一个甲硫氨酸(带下划线)开始的编码序列，并包含带BamHI位点的接头；b)32聚的反向引物GGTCGAC TTA GAGCCCTGTC AGGTCCACAA TG，该引物含有hTRAF2基因的终止密码子(带下划线)，并且在接头中有SalI限制性位点。PCR程序是最初变性步骤为94℃，2分钟，随后为30个循环，每个循环为94℃1分钟，64℃1分钟和72℃40秒。扩增出的人TRAF2然后被插入到pGBT9载体的BamHI-SalI位点中，与GAL4 DNA结合域相连。
iv)B细胞文库的双杂交筛选
双杂交筛选是一种用于鉴别与某一特定分子(该分子被用作“诱饵”)有关的因子的技术(参见上述出版物和专利申请中的细节)。在本发明中，被克隆入载体pGBT9中的TRAF2被用作诱饵。TRAF2与筛选的B细胞cDNA文库在酵母菌株HF7c中共表达。PCR所克隆的TRAF2是与GAL4 DNA结合域相融合的重组蛋白，而被筛选的cDNA文库被融合于pSE1107载体中的GAL4激活结构域。在HF7c中的报道基因是HIS3，它被融合于会对GAL4转录激活物作出响应的GAL1启动子上游的激活序列(UAS)。含有pGBT9和pSE1107两种质粒的转化子会因能在无色氨酸和亮氨酸的平板上生长而被选择出。在第二个步骤中，表达两种杂合蛋白(这两种蛋白会相互作用，从而激活GAL1-HIS3)的克隆，被从平板上挑出，其中该平板不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并且含有50mM 3-氨基三唑(3AT)。
v)β-半乳糖苷酶分析
按照Clontech Laboratories′s手册(对于细节，可参见上述的出版物和专利申请)，对双杂交筛选中被挑出的阳性克隆，在SFY526酵母细胞中进行lacZ显色测试。简而言之，让转化子在30℃生长2-4天，直到直径达到约2毫米，然后将其转移至Whatman滤膜上。对滤膜进行冻/融处理以使细胞通透化，然后再浸泡在含有0.33毫克/毫升X-gal和0.35mMβ-巯基乙醇的缓冲液(16.1毫克/毫升Na2HPO4·7H2O；5.5毫克/毫升NaH2PO4·H2O；0.75毫克/毫升KCl；0.75毫克/毫升MgSO4·7H2O，pH＝7)。监视克隆是否显现蓝色，出现蓝色就表示诱导了β-半乳糖苷酶。
vi)克隆cDNA的表达
构建两种表达载体；
a)基于pUHD10-3载体，它含有克隆9、10或15中任一克隆的开放阅读框(ORF)，并且该ORF与血凝素(Hemeaglutinine，HA)表位相融合。
b)基于pUHD10-3的载体，在该载体中FLAG的八肽序列被正好插入克隆的TRAF2前面，因而被命名为FLAG/B6/TRAF2。
用标准的磷酸钙法(例如在Ausubel F.M.等人编的 Current Protocols in Molecular Biology中所述的方法)，将含有克隆9、10或15中任一ORF的构建物转染入HeLa-Bujard细胞(对于这些细胞，参见Gossen，M.和Bujard，M.(1992))，该转染或者是单独进行，或者是与FLAG/B6/TRAF2进行共转染。
vii)荧光素酶分析
通常，通过用冷PBS洗涤3次，然后再悬浮于400微升抽提缓冲液(0.1MK2HPO4/KH2PO4，pH＝7.8；1mM DTT)而收获5×105个转染细胞。通过在液氮中冰冻然后融化3次而使细胞裂解。离心除去细胞碎片(10,000×g，5分钟)。对于荧光素酶分析，将200微升荧光素酶缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，15mMK2HPO4/KH2PO4，pH＝7.8；15mM MgSO4，4mM EGTA，2mM ATP，1mM DTT)加至50微升裂解液中。随后，将100微升0.2mM D-荧光素、25mM甘氨酰甘氨酸、1mM DTT加至反应体系。用Lumitron发光计装置，通过读取10秒内的累积光发射，而测定荧光素酶活性(对于其他细节，可参见上述的出版物和专利申请)。
实施例1：新克隆9、10和15的克隆过程
用在材料和方法(iv)中所述的双杂交技术，筛选B细胞的cDNA库中是否有与TRAF2相关的蛋白。只有在既表达TRAF2又表达能够与TRAF2作用的蛋白质的转化子中，GAL4 DNA结合域和转录激活域才会在一起。结果就是表达基因被激活并表达，在该例子中表达基因是融化于UAS和GAL1启动子的TATA部分的HIS。
筛选产生了约2000个能够在Trp-、Leu-、His-3AT平板上生长的克隆。从165个随机挑选的克隆所制备的DNA，被用于与克隆在pGBT9载体中的TRAF2一起共转染SFY526酵母菌株。如材料和方法(v)中所述，对转化的SFY526进行β-半乳糖苷酶活性分析。显现的蓝色表示酵母菌落含有一cDNA，而该cDNA编码能结合于TRAF2的蛋白质或多肽。
双杂交筛选的结果、挑选的克隆在3AT平板上的生长能力以及在显色测试测得的诱导lacZ的能力，都总结在表II。在所挑选的阳性克隆中，2个是编码已知蛋白的cDNA：TRAF2本身能够自我缔合并形成同二聚体，以及淋巴毒素β-受体(已表明其胞内结合域可结合TRAF2)。有3种克隆的cDNA(克隆9、10和15)是新的。
阳性克隆在结合特异性测试中被进一步检查，即检查它们与无关诱饵的相互作用情况。如表2所示，克隆9和10仅与TRAF2反应而不结合于被检查的多种无关蛋白中任何一种。另一方面克隆15不结合于MORT1，也不结合于p55和p75 TNF受体的胞内结构域，但与核纤层蛋白(lamin)和细胞周期蛋白D(Cycline D)发生弱结合。
为了缩小与克隆9、10和15反应的TRAF2分子的区域，制备了另两个构建物。一个构建物包括TRAF2分子的N端部分，即氨基酸1-221，该部分包括了环指和锌指基序。第二个构建物仅含有分子的C末端部分，即氨基酸222-501，它覆盖了“TRAF结合域”和额外的42个氨基酸。在双杂交测试中将这两种构建物用作诱饵。结果清楚地显示，尽管克隆9、10和15不与含有TRAF2分子的氨基酸1-221的构建物发生作用，但是它们都与含有“TRAF结构域”的C末端构建物结合，而且结合效率与它们结合于全长TRAF2分子相同。
                                表II：将TRAF2用作“诱饵”进行双杂交筛选的结果总结，
                                         在该筛选中挑选出克隆9、10和15
在50mM 3AT上的生长情况     显色测试(分钟)   ID/克隆名称根据测序加以限定   独立克隆的数目
+++     10分钟   TRAF2   150
++     20分钟   新克隆编号9   6
+++     15分钟   新克隆编号10   2
++++     10分钟   淋巴毒素β受体   2
+     15分钟   新克隆编号15   5
    表III：特异性测试(在双杂交测试中与无关诱饵的相互作用)
                              克  隆
诱饵             克隆9               克隆10              克隆15
核纤层蛋白        -                    -                    -
细胞周期蛋白D     -                    -                    -
p75-IC            -                    -                    -
p55-IC            -                    -                    -
MORT1             -                    -                    -
TRAF2             +++                  +++                  +++
将数个PCR步骤应用于克隆10，从cDNA文库(该文库是用人组织RNA获得的)中获得全长的cDNA。该蛋白被命名为NIK，即“NF-κB诱导激酶(NF-κBinducing kinase)”，因为事实上它含有蛋白激酶区域(参见下文)。应注意，克隆10的序列在最初被分析时(在通过PCR获得NIK之前)，被观察到编码一个最初被称为NMPI的蛋白质(参见共同拥有且未审定的IL 117800)。观察到，该NMPI或克隆10所编码的蛋白具有对应于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶特有的I-XI保守基序的序列。
实施例2：对新克隆进行测序
对3个新的cDNA克隆(克隆9、10和15)进行纯化，并在大肠杆菌中进行纯化，然后对它们的DNA进行序列分析。发现所有这3种克隆都是部分cDNA克隆。
克隆9、10和15的总长分别约为2000、2700和1300碱基对。
图3和5显示了克隆9和15的被测序部分，图4显示了克隆10的全长序列。
图5a-b显示了从5′和3′端测序得到的克隆15的全部核苷酸序列(a)以及推导出的由此编码氨基酸(b)。克隆15是一个部分cDNA克隆，它被发现编码一个172氨基酸的长蛋白质。
克隆9和15是部分cDNA克隆，它们DNA编码序列的大部分5′端部分。推导出的氨基酸序列示于图3b、4b和5b，它们都从各自克隆的第一个核苷酸开始。
克隆10(一个部分cDNA克隆)的序列被最充分地进行了研究，它编码如上所述的NMPI蛋白，该蛋白含有Ser/Thr蛋白激酶基序。如上所述，用克隆10通过PCR而获得的全长cDNA克隆，揭示出上述的新的TRAF2结合激酶NIK。
NIK的全长核苷酸序列和推导的氨基酸序列示于图6，其中在232位核苷酸的起始密码子ATG用下划线标出，在3073位核苷酸处的终止密码子用星号标出。图6中测得的NIK克隆的全长序列长4596个核苷酸，其中含有NIK编码序列，它编码947个氨基酸残基的NIK蛋白。
数据库检索揭示，NIK的新氨基酸序列与一组激酶有特别高的同源性，在这些激酶中有数种已知是MAP激酶激酶激酶。
图7显示了与下列序列的序列对比情况：
小鼠MEKKK(S1)，
BYR2(S2)，
Tpl-2(S3)，
Ewing氏肉瘤癌基因(S4)，
SS3(S5)，
(STE11)(S6)，
(NPK1)(S7)，
(BCK1)(S8)，和
(NIK)(S9)，
这些激酶中的某些种类，因为它们在突变形式下具有癌基因活性而被鉴别出。
实施例3：克隆cDNA的表达以及与TRAF2一起进行免疫沉淀
如材料和方法(iv)中所述的那样，用在基于pUHD10-3的表达载体中的、带有FLAG标记的TRAF2，以及含有融合于HA表位的克隆9、10或15中任一ORF的构建物转染HeLa-Bujard细胞。然后，细胞在添加有10％小牛血清并加入35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中生长24小时。在该温育时期结束时，在放射免疫沉淀缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5/150mM NaCl，1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，1％脱氧胆酸盐，1％SDS，和1mM EDTA；1毫升/5×105细胞)中裂解细胞。通过与无关的兔抗血清和蛋白质G-Sepharose珠(Pharmacia，Sweden)一起温育而对裂解液进行预清除。通过将各份裂解液与抗-FLAG(购自Eastman Kodak Co.)或抗-HA(克隆12CA5，(Field，J.等人(1988))单克隆抗体一起在4℃温育1小时，而进行免疫沉淀。表达的蛋白质在SDS-PAGE上进行分析，然后进行放射性自显影。
这些实验的结果显示，作为部分cDNA的克隆9、10和15分别编码分子量约为50-65，45和26kDa的蛋白质。
没有检测到克隆15与TRAF2的相互作用，但是克隆9和10(NIK)所编码的蛋白质以及全长NIK，都与TRAF2蛋白一起被免疫共沉淀。如上所述细胞样品用TRAF2和这两种克隆中任一克隆进行共转染，然后用抗-FLAG或抗-HA抗体进行免疫沉淀，随后进行SDS-PAGE分析，其结果显示在每个泳道中有3个条带；一个条带对应于克隆9或10所编码的蛋白，另两个条带是42或44kDa的对应于TRAF2蛋白的双联体。
实施例4：功能测试
通过凝胶阻滞分析，已发现NIK有NF-κB诱导作用。典型地，用10微克pcDNA3中的克隆10(图7，泳道1)、或用3微克含有p75 TNF受体的cDNA的pcDNA3(图7，泳道3)、或用克隆10(10微克)和p75 TNF受体(3微克)两者(图7，泳道2)来转染0.5-1×106 293 EBNA细胞。在每种转染中，将“空白的”pcDNA3载体将转染DNA的重量调至15微克。将用15微克pcDNA3载体单独转染的293EBNA细胞作为对照(图7，泳道4)。细胞在添加10％小牛血清的DMEM培养基上生长24小时，然后收获，并根据Schreiber等人的方法(Schreiber，E.等人，1989)进行处理。样品在5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用一套32P放射性标记的、对应于NF-κB结合位点的寡核苷酸作为探针(探针是GATGCCATTG GGGAITTCCT CTTT和CAGTGAAGAG GAAATCCCCA ATGG)。
如表IV所示，与TRAF2相比，NIK更有效地诱导NF-κB。另一方面，克隆10完全没有该效应。
还如下进行报道基因分析：
如表IV和V所示，用pcDNA3载体(该载体含有连于荧光素酶报道基因的HIVLTR)，与仅含有p75 TNF受体的cDNA的pcDNA3质粒，或与仅含有克隆10 cDNA的pcDNA3质粒，或与含有p75 TNF受体的cDNA的pcDNA3质粒和pcDNA3质粒一起共转染293 EBNA相比。
在表V中的结果表明：
a)克隆10的转染不能激活NF-κB诱导，而NIK却可强烈激活。
b)克隆10及NIK(其中活性位点赖氨酸被丙氨酸替换(NIK*))，可强烈抑制表IV中第一列中列出的cDNA对NF-κB的诱导作用。
缺失NIK的3′UTR(NIK-3′UTR)可大大增加其表达，并且因此以该变异形式表达时可大大增加其阻断NF-κB诱导的能力。
                                                  表  IV
                         NIK对NF-κB的激活作用，凝胶-阻滞分析。数字是用“磷酸成像器
                              (phosphoimager)”板检测到的放射性衰变事件的计数。
转染的cDNA 计数 面积(平方毫米)
空白载体 327 70.7
TRAF2 3411 70.7
NIK 6532 70.7
克隆10 343 70.7
                                                  表  V
                         克隆10、NIK-K-(突变子)对由TRAF2、TRADD、MORT1/FADD、TNFR-i、
                         TNFR-II、TNFR-I/FAS嵌合蛋白、RIP过度表达所造成的NF-κB诱导的显性阴
                                  性效应，以及NIK对NF-κB的激活作用。荧光素酶测试
  NF-κB诱导物   空白载体   NIK   NIK-3′UTR   克隆10   NIK*     NIK*-3′UTR     TRAF2225-501氨基酸
  TRAF2   300   1000   25   30     ND
  TRADD   300   800   1000   100   100     5     ND
  MORT1/FADD   300   1000   25   80     90
  TNFR-I   200   800   1000   50   100     5     ND
  TNFE-II   200   750   800   20   90     6     ND
  FAS嵌合蛋白   300   1200   25   50     30
  RIP   300   800   75   60     ND
  NIK   500   100     10     ND
  TNF   200   80
  RelA   1000   ND   ND   1000   ND     ND     ND
实施例5：NIK的其他特性
除了上面实施例2的特异性测试之外，对NIK结合特性的进一步双杂交测试揭示(数据未列出)，最初分离的NIK的部分克隆(NIK 624-947)可特异性地结合于TRAF2的C末端区域(C-TRAF结构域)。与之相反，全长NIK可结合于C-TRAF结构域及其上游区域(N-TRAF结构域)。NIK也不结合于TRAF3。此外，含有TRAF2的C-TRAF结构域和TRAF3的N端部分的嵌合分子，能够结合于这个部分NIK分子(NIK624-947)，但是不结合于全长NIK。这表明，全长NIK结合于TRAF2同时需要TRAF2的C-TRAF和N-TRAF结构域。
此外，NIK不能自身缔合，也不能结合于下列物质的胞内结构域：p55和p75 TNF受体；CD40受体(TNF/NGF受体家族的成员)；和FAS/APO1(CD95受体)。NIK也不结合于与这些受体缔合的胞内蛋白质，例如TRADD、MORT1和RIP。这些结果，与表II中列出的有关克隆9、10和15所编码蛋白质的结合特异性的结果是相关的。在不同受体和蛋白质之间的各种不同相互作用在图2a和图2b中被示意性地画出，其中图2b更完整。
Northern印迹分析揭示，只有一个NIK的转录物在不同水平的各种组织中表达，该转录物的大小约为5000核苷酸，这与克隆的NIK cDNA的大小几乎相同(如上所述，参见图6)。
此外，如上所述在克隆10所编码的蛋白质(最初命名为NMPI)方面，全长NIK蛋白也具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基序，还基序与数种MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)的基序相似，这可从图7中序列对比中看出。
NIK激酶活性的体外测试揭示，NIK可自我磷酸化，但是当活性位点赖氨酸和相邻的赖氨酸被丙氨酸替换时(命名为NIK KK429-430AA的NIK类似物或突变蛋白，表示在第429位和430位的赖氨酸被丙氨酸所替换)，就不能自我磷酸化。这与上面实施例4中给出的和表IV所示的有关NIK*突变蛋白的结果是相关联的。
如上所述，NIK在293 EBNA细胞中的过度表达，能比TRAF2的过度表达更大程度地诱导NF-κB，但是NIK片段(NIK624-947)的过度表达并不能导致NF-κB被激活。此外，上述的NIK类似物/突变蛋白NIK KK429-430AA在这些细胞中过度表达时，也不能导致NF-κB激活。因此，NIK对NF-κB的诱导作用取决于NIK完整的激酶功能。与之相反，RIP(参见图2a，b)(它也具有激酶结构域)的激酶活性因突变而失去时，它仍能诱导NF-κB的激活。
因NIK过度表达而导致的NF-κB激活作用，可以与用TNF处理细胞所产生的激活作用相区分开，因为在TNF或TRAF2过度表达时，NIK所激活的NF-κB的主要组份是p50和p65。NIK的过度表达导致IκBα的降解，而用N-乙酰基-Leu-Leu-正亮氨醇(norleucinol)(ALLN)阻断这种降解时，会导致积累SDS-PAGE迁移速度更慢的IκB分子，这表明是磷酸化的IκBα。
其他测试还揭示，NF-κB能够在293-EBNA细胞中被TNF以及被p55和p75 TNF受体的过度表达、或p55 TNF受体的胞内结构域被FAS/APO1受体的胞内结构域所替换而形成的p55 TNF受体的过度表达而激活。NF-κB还可被TRAF2、TRADD、RIP或MORT1的过度表达所激活，但是缺少MORT1“死亡结构域”上游区域的MORT1缺失突变对比不能激活NF-κB。如上所述，全长NIK可诱导NF-κB的激活，但是NIK突变蛋白NIK KK429-430AA和NIK片段(NIK624-947)都不能诱导NF-κB的激活。另外，在293-EBNA细胞中将NIK KK429-430AA突变蛋白或NIK 624-947与任何上述的其他物质(即受体或相关蛋白)一起表达时，会使这些物质阻断NF-κB激活的诱导过程，这表明NIK活性是该NF-κB诱导过程中直接牵涉的。同样，上面观察到的无活性NIK分子的抑制作用与IκB减少程度较低相关。
NF-κB还可被IL-1激活(参见图2b的示意图)。这种效应明显是与TRAF2无关的(IL-1不结合TRAF2，而且IL-1的效应也不能被TRAF2显性阴性突变蛋白的表达所阻断)。然而，这种IL-1效应可因表达NIK突变蛋白而被抑制。此外，在293-EBNA细胞中表达p65 Rel同系物时所观察的NF-κB活性，不受激酶缺陷型NIK突变蛋白表达的影响，这表明，NIK并不直接影响Rel蛋白的功能，但是参与它们的受体所诱导的激活过程。
TNF的细胞毒活性(明显受到MOR-1相关蛋白酶MACH的介导，参见图2b)会受到某些NF-κB可诱导基因的负调控。NF-κB所介导的基因诱导作用和MACH的激活作用之间相互拮抗的结果，可以解释为什么TNF本身以及IL-1能够诱导细胞对TNF细胞毒性产生抗性。与此相符，根据本发明已发现，在293-EBNA细胞中表达NIK显性阴性突变蛋白可显著地增加细胞被TNF杀灭的易感性，而天然(全长的、野生型)NIK的过度表达可抑制由TNF或因p55 TNF受体过度表达所造成细胞被杀灭的情况(p55 TNF受体的胞内结构域含有“死亡结构域”区域，当它在细胞中表达时，在没有任何TNF存在下也能诱导其自有的细胞毒性-参见上述的本发明人的出版物，以及共同拥有的、未审定的申请)。
实施例6：对NIK生物活性的进一步功能测试
根据本发明，已发现NIK显性阴性突变蛋白的表达，也能阻断其他诱导剂在293-EBNA细胞中对NF-κB激活的诱导作用：(i)熟知的细菌内毒素，脂多糖(LPS)；(ii)熟知的forbol豆蔻酸乙酸酯(forbol myristate acetate)，它是一种抑制的蛋白激酶C的激活物；(iii)HTLV-1蛋白TAX。
此外，已发现，在293-EBNA细胞中表达显性阴性突变蛋白，对于TNF所诱导的 Jun激酶激活作用没有影响。这表明，NIK以特异的并且可能直接的方式发挥作用以增强IκB的磷酸化，而不影响Jun磷酸化过程中所涉及的MAP激酶。
考虑到所有上述的内容，NIK的激酶活性是信号级联放大过程的一部分，它负责NF-κB的激活，并且该级联过程对于两种TNF受体，FAS/APO1受体和IL-1受体而言是共同的。NIK似乎在该级联中发挥特殊作用。NIK结合于TRAF2，会使NIK能够受到TNF受体和FAS/APO1受体的影响。与MAP激酶级联相类比，一旦被TRAF2募集到受刺激的受体，NIK可以作为激酶(MAPKKKK)的底物，从而当NIK被磷酸化时，它就使其他激酶磷酸化并激活它们(或者通过直接使IκB磷酸化而直接诱导NF-κB激活)。IL-1所诱导的NF-κB激活与TRAF2无关，因此IL-1受体对NIK的激活租用可以被另一蛋白IRAK所介导，也可被结合IRAK的TRAF6所介导(参见Cao等人1996a，以及图2b的示意图)。IRAK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它在受刺激之后被募集到IL-1受体(Cao等人，1996b)。如上所述，NIK的靶目标，或者由NIK所激活的激酶级联反应的靶目标可能是IκB。NIK还可使TRAF蛋白和与其结合的调控蛋白(如TANK-I/TRAF)磷酸化(参见Cheng和Baltimore，1996；Rothe等人，1996)，从而形成其他蛋白的停靠位点。
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68. Zhao，J.J.和Pick，L.(1993)自然(Nature)365：448-451.
                       序列表
(1)一般信息：
    (i) 申请人：
          (A)姓名：依达研究发展有限公司
          (B)街道：Weizmann Institute of Science
          (C)城市：P.O.B.95
          (D)州：Rehovot
          (E)国家：以色列
          (F)邮政编码(邮编)：76100
          (G)电话：+972-8-9344093
          (H)传真：+972-8-9470739
          (A)姓名：David Wallach
          (B)街道：24 Borochov Street
          (C)城市：Rehovot
          (E)国家：Israel
          (F)邮政编码(邮编)：76406
          (A)姓名：Nikolai Malinin
          (B)街道：Beit Clore，Weizmann Institute of Science
          (C)城市：Rehovot
          (E)国家：Israel
          (F)邮政编码(邮编)：76100
          (A)姓名：Mark Boldin
          (B)街道：Beit Clore，Weizmann Institute of Science
          (C)城市：Rehovot
          (E)国家：Israel
          (F)邮政编码(邮编)：76100
          (A)姓名：Andrei Kovalenko
          (B)街道：Beit Clore，Weizmann Institute of Science
          (C)城市：Rehovot
          (E)国家：Israel
          (F)邮政编码(邮编)：76100
          (A)姓名：Igor Mett
          (B)街道：60 Levin Epstein街道
          (C)城市：Rehovot
          (E)国家：Israel
          (F)邮政编码(邮编)：76462
   (ii) 发明名称：肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂，及其制备和用途
   (iii)序列数目：11
   (iv) 计算机可读形式：
          (A)记录介质类型：软盘
          (B)计算机：IBM PC兼容型
          (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
          (D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)
   (v)  本申请资料：
          申请号：PCT/IL97/00117
   (vi) 在先申请资料：
          (A)申请号：IL 117800
          (B)申请日：02-4月-1996
   (vi) 在先申请资料：
          (A)申请号：IL 119133
          (B)申请日：26-8月-1996
(2)SEQ ID NO：1的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：1906碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：cDNA
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
CATTGGGTCA CGCGGTGGCG GCGCTCTAGA ATAGTGGATC CCCCGGGCTG CAGGAATTCG    60
ATTCGAGGCC ACGAAGGCCG GCGGCGCGGC GCANGCACCG GCCCGGGGAN AGGCNCCATG    120
AGCGGATCNC NGAACNATGA CAAAAGACAA TTTCTGCTGG AGCGACTGCT GGATGCAGTG    180
AAACAGTGCC AGATCCGCTT TNGAGGGAGA AAGGAGATTG CCTCGGATTC CGACAGCAGG    240
GTCACCTGTC TGTGTGCCCA GTTTGAAGCC GTCCTGCAGC ATGGCTTGAA GAGGAGTCGA    300
GGATTGGCAC TCACAGCGGC AGCGATCAAG CAGGCAGCGG GCTTTGCCAG CAAAACCGAA    360
ACAGAGCCCG TGTTCTGGTA CTACGTGAAG GAGGTCCTCA ACAAGCACGA GCTGCAGCGC    420
TTCTACTCCC TGCGCCACAT CGCCTCAGAC GTGGGCCGGG GTCGCGCCTG GCTGCGCTGT    480
GCCCTCAACG AACACTCCCT GGAGCGCTAC CTGCACATGC TCCTGGCCGA CCGCTGCAGG    540
CTGAGCACTT TTTATGAAGA CTGGTCTTTT GTGATGGATG AAGAAAGGTC CAGTATGCTT    600
CCTACCATGG CAGCAGGTCT GAACTCCATA CTCTTTGCGA TTAACATCGA CAACAAGGAT    660
TTGAACGGGC AGAGTAAGTT TGCTCCCACC GTTTCAGACC TCTTAAAGGA GTCAACGCAG    720
AACGTGACCT CCTTGCTGAA GGAGTCCACG CAAGGAGTGA GCAGCCTGTT CAGGGAGATC    780
ACAGCCTCCT CTGCCGTCTC CATCCTCATC AAACCTGAAC AGGAGACCGA CCCTTGCCTG    840
TCGTGTCCAG GAATGTCAGT GCTGATGCCA AATGCAAAAA GGAGCGGAAG AAGAAAAAGA    900
AAGTGACCAA CATAATCTCA TTTGATGATG AGGAAGATGA GCAGAACTCT GGGGACGTGT    960
TTAAAAAGAC ACCTGGGGCA GGGGAGAGCT CAGAGGACAA CTCCGACCGC TCCTCTGTCA    1020
ATATCATGTC CGCCTTTGAA AGCCCCTTCG GGCCTAACTC CAATGGAATC AGAGCAGCAA    1080
CTCATGGAAA ATTGATTCCC TGTCTTTGAA CGGGGAGTTT GGGTACCAGA AGCTTGATGT    1140
GAAAAGCATC GATGATGAAG ATGTGGATGA AAACGAAGAT GACGTGTATG GAAACTCATC    1200
AGGAAGGAAG CACAGGGGCC ACTCGGAGTC GCCCGAGAAG CCACTGGAAG GGAACACCTG    1260
CCTCTCCCAG ATGCACAGCT GGGCTCCGCT GAAGGTGCTG CACAATGACT CCGACATCCT    1320
CTTCCCTGTC AGTGGCGTGG GCTCCTACAG CCCAGCAGAT GCCCCCCTCG GAAGCCTGGA    1380
GAACGGGACA GGACCAGAGG ACCACGTTCT CCCGGATCCT GGACTTCGGT ACAGTGTGGA    1440
AGCCAGCTCT CCAGGCCACG GAAGTCCTCT GAGCAGCCTG TTACTTCTGC CTCAGTGCCA    1500
GAGTCCATGA CAATTAGTGA ACTGCGCCAG GCCACTGTGG CCATGATGAA CAGGAAGGAT    1560
GAGCTGGAGG AGGAGAACAG ATCACTGCGA AACCTGCTCG ACGGTGAGAT GGAGCACTCA    1620
GCCGCGCTCC GGCAAGAGGT GGACACCTTG AAAAGGAAGG TGGCTGAACA GGAGGAGCGG    1680
CAGGGCATGA AGGTCCAGGC GCTGGCCAGC TATCTTTGCT ATTTTGTGAG GAGATTCTAA    1740
CCCCACGTGA GAACCATGTG GTGGAGAAAT GGAGGGAGAG AGAAATCCAA CAGTTCCTGA    1800
TAGTCTCATT  TGAGCTCCTG  GATCCAGTCT  TTCCTGAAGC  TGTGTTTCCT  CTGGACTTTT    1860
CATGTATGTG  AGCCAATAAA  TTGCTTTCAT  TCCTTGAAAA  AAAAAA                    1906
(2)SEQ ID NO：2的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：604氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Xaa Thr Gly Pro Gly Xaa Gly Xaa Met Ser Gly Ser Xaa Asn Xaa Asp
1               5                   10                  15
Lys Arg Gln Phe Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Gln Cys
            20                  25                  30
Gln Ile Arg Phe Xaa Gly Arg Lys Glu Ile Ala Ser Asp Ser Asp Ser
        35                  40                  45
Arg Val Thr Cys Leu Cys Ala Gln Phe Glu Ala Val Leu Gln His Gly
    50                  55                  60
Leu Lys Arg Ser Arg Gly Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ile Lys Gln
65                  70                  75                  80
Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr Glu Thr Glu Pro Val Phe Trp Tyr
                85                  90                  95
Tyr Val Lys Glu Val Leu Asn Lys His Glu Leu Gln Arg Phe Tyr Ser
            100                 105                 110
Leu Arg His Ile Ala Ser Asp Val Gly Arg Gly Arg Ala Trp Leu Arg
        115                 120                 125
Cys Ala Leu Asn Glu His Ser Leu Glu Arg Tyr Leu His Met Leu Leu
    130                 135                 140
Ala Asp Arg Cys Arg Leu Ser Thr Phe Tyr Glu Asp Trp Ser Phe Val
145                 150                 155                 160
Met Asp Glu Glu Arg Ser Ser Met Leu Pro Thr Met Ala Ala Gly Leu
                165                 170                 175
Asn Ser Ile Leu Phe Ala Ile Asn Ile Asp Asn Lys Asp Leu Asn Gly
            180                 185                 190
Gln Ser Lys Phe Ala Pro Thr Val Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ser Thr
        195                 200                 205
Gln Asn Val Thr Ser Leu Leu Lys Glu Ser Thr Gln Gly Val Ser Ser
    210                 215                 220
Leu Phe Arg Glu Ile Thr Ala Ser Ser Ala Val Ser Ile Leu Ile Lys
225                 230                 235                 240
Pro Glu Gln Glu Thr Asp Pro Cys Leu Ser Cys Pro Gly Met Ser Val
                245                 250                 255
Leu Met Pro Asn Ala Lys Arg Ser Gly Arg Arg Lys Arg Lys Xaa Pro
            260                 265                 270
Thr Xaa Ser His Leu Met Met Arg Lys Met Ser Arg Thr Leu Gly Thr
        275                 280                 285
Cys Leu Lys Arg His Leu Gly Gln Gly Arg Ala Gln Arg Thr Thr Pro
    290                 295                 300
Thr Ala Pro Leu Ser Ile Ser Cys Pro Pro Leu Lys Ala Pro Ser Gly
305                 310                 315                 320
Leu Thr Pro Met Glu Ser Glu Gln Gln Leu Met Glu Asn Xaa Phe Pro
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Gly Val Trp Val Pro Glu Ala Xaa Cys Glu Lys His
            340                 345                 350
Arg Xaa Xaa Arg Cys Gly Xaa Lys Arg Arg Xaa Arg Val Trp Lys Leu
        355                 360                 365
Ile Arg Lys Glu Ala Gln Gly Pro Leu Gly Val Ala Arg Glu Ala Thr
    370                 375                 380
Gly Arg Glu His Leu Pro Leu Pro Asp Ala Gln Leu Gly Ser Ala Glu
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ala Gln Xaa Leu Arg His Pro Leu Pro Cys Gln Trp Arg Gly
                405                 410                 415
Leu Leu Gln Pro Ser Arg Cys Pro Pro Arg Lys Pro Gly Glu Arg Asp
            420                 425                 430
Arg Thr Arg Gly Pro Arg Ser Pro Gly Ser Trp Thr Ser Val Gln Cys
        435                 440                 445
Gly Ser Gln Leu Ser Arg Pro Arg Lys Ser Ser Glu Gln Pro Val Thr
    450                 455                 460
Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser Met Thr Ile Ser Glu Leu Arg Gln Ala
465                 470                 475                 480
Thr Val Ala Met Met Asn Arg Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg
                485                 490                 495
Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu His Ser Ala Ala Leu
            500                 505                 510
Arg Gln Glu Val Asp Thr Leu Lys Arg Lys Val Ala Glu Gln Glu Glu
        515                 520                 525
Arg Gln Gly Met Lys Val Gln Ala Leu Ala Ser Tyr Leu Cys Tyr Phe
    530                 535                 540
Val Arg Arg Phe Xaa Pro His Val Arg Thr Met Trp Trp Arg Asn Gly
545                 550                 555                 560
Gly Arg Glu Lys Ser Asn Ser Ser Xaa Xaa Ser His Leu Ser Ser Trp
                565                 570                 575
Ile Gln Ser Phe Leu Lys Leu Cys Phe Leu Trp Thr Phe His Val Cys
            580                 585                 590
Glu Pro Ile Asn Cys Phe His Ser Leu Lys Lys Lys
        595                 600
(2)SEQ ID NO：3的信息：
   (i) 序列特征：
       (A)长度：2631碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：cDNA
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
CCCCTCTCAC AGCCCAGGCC ATCCAAGAGG GGCTGAGGAA AGAGCCCATC CACCGCGTGT    60
CTGCAGCGGA GCTGGGAGGG AAGGTGAACC GGGCACTACA GCAAGTGGGA GGTCTGAAGA    120
GCCCTTGGAG GGGAGAATAT AAAGAACCAA GACATCCACC GCCAAATCAA GCCAATTACC    180
ACCAGACCCT CCATGCCCAG CCGAGAGAGC TTTCGCCAAG GGCCCCAGGG CCCCGGCCAG    240
CTGAGGAGAC AACAGGCAGA GCCCCTAAGC TCCAGCCTCC TCTCCCACCA GAGCCCCCAG    300
AGCCAAACAA GTCTCCTCCC TTGACTTTGA GCAAGGAGGA GTCTGGGATG TGGGAACCCT    360
TACCTCTGTC CTCCCTGGAG CCAGCCCCTG CCAGAAACCC CAGCTCACCA GAGCGGAAAG    420
CAACCGTCCC GGAGCAGGAA CTGCAGCAGC TGGAAATAGA ATTATTCCTC AACAGCCTGT    480
CCCAGCCATT TTCTCTGGAG GAGCAGGAGC AAATTCTCTC GTGCCTCAGC ATCGACAGCC    540
TCTCCCTGTC GGATGACAGT GAGAAGAACC CATCAAAGGC CTCTCAAAGC TCGCGGGACA    600
CCCTGAGCTC AGGCGTACAC TCCTGGAGCA GCCAGGCCGA GGCTCGAAGC TCCAGCTGGA    660
ACATGGTGCT GGCCCGGGGG CGGCCCACCG ACACCCCAAG CTATTTCAAT GGTGTGAAAG    720
TCCAAATACA GTCTCTTAAT GGTGAACACC TGCACATCCG GGAGTTCCAC CGGGTCAAAG    780
TGGGAGACAT CGCCACTGGC ATCAGCAGCC AGATCCCAGC TGCAGCCTTC AGCTTGGTCA    840
CCAAAGACGG GCAGCCTGTT CGCTACGACA TGGAGGTGCC AGACTCGGGC ATCGACCTGC    900
AGTGCACACT GGCCCCTGAT GGCAGCTTCG CCTGGAGCTG GAGGGTCAAG CATGGCCAGC    960
TGGAGAACAG GCCCTAACCC TGCCCTCCAC CGCCGGCTCC ACACTGCCGG AAAGCAGCCT    1020
TCCTGCTCGG TGCACGATGC TGCCCTGAAA ACACAGGCTC AGCCGTTCCC AGGGGATYTG    1080
NCCAGCCCCC CGGCTCARCA GNTGGGAACC AGGGCCTCGN CAGCNAGCNA AGGTNGGGGG    1140
CAAGCNAGAA TGCCTCCCAG GATTTCACAN CCTGAGCCCN TGCCCCANCC CTGCTGAADA    1200
AAACAYTNCC GCCACGTGAA GAGACAGAAG GAGGATGGNC AGGAGTTNNA CCTYGGGGAA    1260
ACAAAACAGG GATCTTTNTT CTGCCCCTGC TCCAGTNCGA GTTGGCCTGN ACCCGCTTGG    1320
ANTCAGTGAC CATTTGTTGG CAGANCAGGG GAGAGCAGCT TCCAGCCTGG GTCAGAAGGG    1380
GTGGGCGAGC CCTTCGGCCC CTCACCCTNC CAGGCTGCTG TGNAGAGTGT CAAGTGTGTA    1440
AGGGNCCCAA ANCTCAGGNT TCAGTGCAGA ACCAGGTNCA GCAGGTATGC CCGCCCGNTA    1500
GGTTAANNGG GGGCCCTCTN AAACCCCTTG CCTNGGCCTN CACCTNGGCC AGCTCANCCC    1560
CTTTTGGGTG TAGGGGAAAA GAATGCCTGA CCCTGGGAAG GCTWCCCTGG TAGAATACAC    1620
CACACTTTTC AGGTTGTTGC AACACAGGTC CTGAGTTGAC CTCTGGTTCA GCCAAGGACC    1680
AAAGAAGGTG TGTAAGTGAA GTGGTTCTCA GTNCCCCAGA CATGTGCCCC TTTGCTGCTG    1740
GCTACCACTC TTCCCCAGAG CAGCAGGCCC CGAGCCCCTT CAGGCCCAGC ACTGCCCCAG    1800
ACTCGCTGGC ACTCAGTTCC CTCATCTGTA AAGGTGAAGG GTGATGCAGG ATATGCCTGA    1860
CAGGAACAGT CTGTGGATGG ACATGATCAG TGCTNAAGGN AAAGCAGCAG AGAGAGACGY    1920
TCCGGCGCCC CAGNCCCCAC TNATCAGTGT NCCAGCGTGC TNGGTTNCCC CAGNAGCACA    1980
GCTNCAGNCA TCANCACTGA CACTNCACCC TNGCCCTGCC CCTNGGCCAN GAGGGTACTG    2040
CCGNACGGCA CTTTGCACNT CTGATGNACC TCAAAGCACT TTCATGGCTN GCCCTCTNNG    2100
GCAGGGNCAG GGNCAGGGNC AGTGACANCT GTAGGNAGCA TANGCAANGC CAGGAGATGG    2160
GGTGNAAGGG ANCACAGTCT TGAGCTGTCC ANCATGCATG TGACTNCCTC AAACCTCTTN    2220
NCCAGNATTT CTCTAAGAAT AGCANCCCCC TTNCCCCATT GCCCCAGCTT AGCCTCTTCT    2280
CCCAGGGGAG CTANCTCAGG ACTCACGTAG CATTAAATCA GCTGTGNAAT CGTCAGGGGG    2340
TGTCTGCTAG CCTCAACCTC CTGGGGCAGG GGACGCCGAG ACTCCGTGGG AGAAGCTCAT    2400
TCCCACATCT TGCCAAGACA GCCTTTNGTC CAGCTGTCCA CATTGAGTCA GACTGCTCCC    2460
GGGGAGAGAG CCCCGGCCCC CAGCACATAA AGAACTGCAG CCTTGGTACT GCAGAGTCTG    2520
GGTTGTAGAG AACTCTTTGT AAGCAATAAA GTTTGGGGTG ATGACAAATG TTAAAAAAAG    2580
GCCTTCGTGG CCTCGAATCA AGCTTATCGA TACCGTCGAC CTCGAGGGGG G             2631
(2)SEQ ID NO：4的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：1253碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
CATTGGAGTC ACGCGGTGGC GGCGCTCTAG AATAGTGGAT CCCCGGGCTG CANGGAATTC    60
GATTCGAGCC CACGAAGGCC CCTTCTTCTG TGGTCGCGGC ACGTTTACAG CCGCAAGCAC    120
CCAGCGGCAG CTGAAGGAGG CTTTTGAGAG GCTCCTGCCC CAGGTGGAGG CGGCCCGCAA    180
GGCCATCCGC GCCGCTCAGG TGGAGCGCTA TGTGCCCGAA CACGAGCGAT GCTGCTGGTG    240
CCTGTGCTGC GGCTGTGAGG TGCGGGAACA CCTGAGCCAT GGAAACCTGA CGGTGCTGTA    300
CGGGGGGCTG CTGGAGCATC TGGCCAGCCC AGAGCACAAG AAAGCAACCA ACAAATTCTG    360
GTGGGAGAAC AAAGCTGAGG TCCAGATGAA AGAGAAGTTT CTGGTCACTC CCCAGGATTA    420
TGCGCGATTC AAGAAATCCA TGGTGAAAGG TTTGGATTCC TATGAAGAAA AGGAGGATAA    480
AGTGATCAAG GAGATGGCAG CTCAGATCCG TGAGGTGGAG CAGAGCCGAC AGGAGGTGGT    540
TCGGTCTGTC TTAGAGCCTC AGGCAGTGCC AGACCCAGAA GAGGGCTCTT CAGCACCTAG    600
AAGCTGGAAA GGGATGAACA GCCAAGTAGC TTCCAGCTTA CAGCAGCCCT CAAATTTGGA    660
CCTGCCACCA GCTCCAGAGC TTGACTGGAT GGAGACAGGA CCATCTCTGA CATTCATTGG    720
CCATCAGGAT ATACCAGGAG TTGGTAACAT CCACTCAGGT GCCACACCTC CCTGGATGAT    780
CCAAGATGAA GAATACATTG CTGGGAACCA AGAAATAGGA CCATCCTATG AAGAATTTCT    840
TAAAGAAAAG GAAAAACAGA AGTTGAAAAA ACTCCCCCCA GACCGAGTTG GGGCCAACTT    900
TGATCACAGC TCCAGGACCA GTGCAGGCTG GCTGCCCTCT TTTGGGCCGC GTCTGGAATA    960
ATGGACGCCG CTGGCAGTCC AGACATCAAC TCCAAAACTG AAGCTGCAGC AATGAAGAAG    1020
CAGTCACATA CAGAAAAAAG CTAATCATGC TCTCTACCAA CTACCATGAG GCTAAAAGCC    1080
AAAGTCAACC AAACCCCTAT TATACCTTCC ACCCAAATTC TTTATCATTG TCTTTCTTAG    1140
GAAACAGACA TACTCATTCA TTTGATTTAA TAAAGTTTTA TTTTTCGGCC TTCGTGGCCT    1200
CGAATCAAGC TTATCGATAC CGTCGACCTC GAGGGGGGGC CGTACCCACT TTT           1253
(2)SEQ ID NO：5的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：417氨基酸
     (B)类型：氨基酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Ile Gly Val Thr Arg Trp Arg Arg Ser Arg Ile Val Asp Pro Arg Ala
1               5                   10                  15
Ala Xaa Asn Ser Ile Arg Ala His Glu Gly Pro Phe Phe Cys Gly Arg
            20                  25                  30
Gly Thr Phe Thr Ala Ala Ser Thr Gln Arg Gln Leu Lys Glu Ala Phe
        35                  40                  45
Glu Arg Leu Leu Pro Gln Val Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ile Arg Ala
    50                  55                  60
Ala Gln Val Glu Arg Tyr Val Pro Glu His Glu Arg Cys Cys Trp Cys
65                  70                  75                  80
Leu Cys Cys Gly Cys Glu Val Arg Glu His Leu Ser His Gly Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Val Leu Tyr Gly Gly Leu Leu Glu His Leu Ala Ser Pro Glu His
            100                 105                 110
Lys Lys Ala Thr Asn Lys Phe Trp Trp Glu Asn Lys Ala Glu Val Gln
        115                 120                 125
Met Lys Glu Lys Phe Leu Val Thr Pro Gln Asp Tyr Ala Arg Phe Lys
    130                 135                 140
Lys Ser Met Val Lys Gly Leu Asp Ser Tyr Glu Glu Lys Glu Asp Lys
145                 150                 155                 160
Val Ile Lys Glu Met Ala Ala Gln Ile Arg Glu Val Glu Gln Ser Arg
                165                 170                 175
Gln Glu Val Val Arg Ser Val Leu Glu Pro Gln Ala Val Pro Asp Pro
            180                 185                 190
Glu Glu Gly Ser Ser Ala Pro Arg Ser Trp Lys Gly Met Asn Ser Gln
        195                 200                 205
Val Ala Ser Ser Leu Gln Gln Pro Ser Asn Leu Asp Leu Pro Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Leu Asp Trp Met Glu Thr Gly Pro Ser Leu Thr Phe Ile Gly
225                 230                 235                 240
His Gln Asp Ile Pro Gly Val Gly Asn Ile His Ser Gly Ala Thr Pro
                245                 250                 255
Pro Trp Met Ile Gln Asp Glu Glu Tyr Ile Ala Gly Asn Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Gly Pro Ser Tyr Glu Glu Phe Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Leu
        275                 280                 285
Lys Lys Leu Pro Pro Asp Arg Val Gly Ala Asn Phe Asp His Ser Ser
    290                 295                 300
Arg Thr Ser Ala Gly Trp Leu Pro Ser Phe Gly Pro Arg Leu Glu Xaa
305                 310                 315                 320
Trp Thr Pro Leu Ala Val Gln Thr Ser Thr Pro Lys Leu Lys Leu Gln
                325                 330                 335
Gln Xaa Arg Ser Ser His Ile Gln Lys Lys Ala Asn His Ala Leu Tyr
            340                 345                 350
Gln Leu Pro Xaa Gly Xaa Lys Pro Lys Ser Thr Lys Pro Leu Leu Tyr
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Lys Phe Phe Ile Ile Val Phe Leu Arg Lys Gln Thr Tyr
    370                 375                 380
Ser Phe Ile Xaa Phe Asn Lys Val Leu Phe Phe Gly Leu Arg Gly Leu
385                 390                 395                 400
Glu Ser Ser Leu Ser Ile Pro Ser Thr Ser Arg Gly Gly Arg Thr His
                405                 410                 415
Phe
(2)SEQ ID NO：6的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：4596碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
AGCGGGGGGA CTGTGCCGTG TGGAACGTGT AGCTGTTGAA GGTGGACTCT GTTACCATTG    60
AGGATGTTTG GAGGATGAGT ATGTGTGGCA GAGGCACACA TAAACAGGCA GAGACCCTTT    120
GCCCCTGCCT TTCTCCCCCA ACCCAAGGCT GACCTGTGTT CTCCCAGGTC TGGGATTCTA    180
AGTGACCTGC TCTGTGTTTG GTCTCTCTCA GGATGAGCAC AAGCCTGGGA GATGGCAGTG    240
ATGGAAATGG CCTGCCCAGG TGCCCCTGGC TCAGCAGTGG GGCAGCAGAA GGAACTCCCC    300
AAGCCAAAGG AGAAGACGCC GCCACTGGGG AAGAAACAGA GCTCCGTCTA CAAGCTTGAG    360
GCCGTGGAGA AGAGCCCTGT GTTCTGCGGA AAGTGGGAGA TCCTGAATGA CGTGATTACC    420
AAGGGCACAG CCAAGGAAGG CTCCGAGGCA GGGCCAGCTG CCATCTCTAT CATCGCCCAG    480
GCTGAGTGTG AGAATAGCCA AGAGTTCAGC CCCACCTTTT CAGAACGCAT TTTCATCGCT    540
GGGTCCAAAC AGTACAGCCA GTCCGAGAGT CTTGATCAGA TCCCCAACAA TGTGGCCCAT    600
GCTACAGAGG GCAAAATGGC CCGTGTGTGT TGGAAGGGAA AGCGTCGCAG CAAAGCCCGG    660
AAGAAACGGA AGAAGAAGAG CTCAAAGTCC CTGGCTCATG CAGGAGTGGC CTTGGCCAAA    720
CCCCTCCCCA GGACCCCTGA GCAGGAGAGC TGCACCATCC CAGTGCAGGA GGATGAGTCT    780
CCACTCGGCG CCCCATATGT TAGAAACACC CCGCAGTTCA CCAAGCCTCT GAAGGAACCA    840
GGCCTTGGGC AACTCTGTTT TAAGCAGCTT GGCGAGGGCC TACGGCCGGC TCTGCCTCGA    900
TCAGAACTCC ACAAACTGAT CAGCCCCTTG CAATGTCTGA ACCACGTGTG GAAACTGCAC    960
CACCCCCAGG ACGGAGGCCC CCTGCCCCTG CCCACGCACC CCTTCCCCTA TAGCAGACTG    1020
CCTCATCCCT TCCCATTCCA CCCTCTCCAG CCCTGGAAAC CTCACCCTCT GGAGTCCTTC    1080
CTGGGCAAAC TGGCCTGTGT AGACAGCCAG AAACCCTTGC CTGACCCACA CCTGAGCAAA    1140
CTGGCCTGTG TAGACAGTCC AAAGCCCCTG CCTGGCCCAC ACCTGGAGCC CAGCTGCCTG    1200
TCTCGTGGTG CCCATGAGAA GTTTTCTGTG GAGGAATACC TAGTGCATGC TCTGCAAGGC    1260
AGCGTGAGCT CAAGCCAGGC CCACAGCCTG ACCAGCCTGG CCAAGACCTG GGCAGCACGG    1320
GGCTCCAGAT CCCGGGAGCC CAGCCCCAAA ACTGAGGACA ACGAGGGTGT CCTGCTCACT    1380
GAGAAACTCA AGCCAGTGGA TTATGAGTAC CGAGAAGAAG TCCACTGGGC CACGCACCAG    1440
CTCCGCCTGG GCAGAGGCTC CTTCGGAGAG GTGCACAGGA TGGAGGACAA GCAGACTGGC    1500
TTCCAGTGCG CTGTCAAAAA GGTGCGCCTG GAAGTATTTC GGGCAGAGGA GCTGATGGCA    1560
TGTGCAGGAT TGACCTCACC CAGAATTGTC CCTTTGTATG GAGCTGTGAG AGAAGGGCCT    1620
TGGGTCAACA TCTTCATGGA GCTGCTGGAA GGTGGCTCCC TGGGCCAGCT GGTCAAGGAG    1680
CAGGGCTGTC TCCCAGAGGA CCGGGCCCTG TACTACCTGG GCCAGGCCCT GGAGGGTCTG    1740
GAATACCTCC ACTCACGAAG GATTCTGCAT GGGGACGTCA AAGCTGACAA CGTGCTCCTG    1800
TCCAGCGATG GGAGCCACGC AGCCCTCTGT GACTTTGGCC ATGCTGTGTG TCTTCAACCT    1860
GATGGCCTGG GAAAGTCCTT GCTCACAGGG GACTACATCC CTGGCACAGA GACCCACATG    1920
GCTCCGGAGG TGGTGCTGGG CAGGAGCTGC GACGCCAAGG TGGATGTCTG GAGCAGCTGC    1980
TGTATGATGC TGCACATGCT CAACGGCTGC CACCCCTGGA CTCAGTTCTT CCGAGGGCCG    2040
CTCTGCCTCA AGATTGCCAG CGAGCCTCCG CCTGTGAGGG AGATCCCACC CTCCTGCGCC    2100
CCTCTCACAG CCCAGGCCAT CCAAGAGGGG CTGAGGAAAG AGCCCATCCA CCGCGTGTCT    2160
GCAGCGGAGC TGGGAGGGAA GGTGAACCGG GCACTACAGC AAGTGGGAGG TCTGAAGAGC    2220
CCTTGGAGGG GAGAATATAA AGAACCAAGA CATCCACCGC CAAATCAAGC CAATTACCAC    2280
CAGACCCTCC ATGCCCAGCC GAGAGAGCTT TCGCCAAGGG CCCCAGGGCC CCGGCCAGCT    2340
GAGGAGACAA CAGGCAGAGC CCCTAAGCTC CAGCCTCCTC TCCCACCAGA GCCCCCAGAG    2400
CCAAACAAGT CTCCTCCCTT GACTTTGAGC AAGGAGGAGT CTGGGATGTG GGAACCCTTA    2460
CCTCTGTCCT CCCTGGAGCC AGCCCCTGCC AGAAACCCCA GCTCACCAGA GCGGAAAGCA    2520
ACCGTCCCGG AGCAGGAACT GCAGCAGCTG GAAATAGAAT TATTCCTCAA CAGCCTGTCC    2580
CAGCCATTTT CTCTGGAGGA GCAGGAGCAA ATTCTCTCGT GCCTCAGCAT CGACAGCCTC    2640
TCCCTGTCGG ATGACAGTGA GAAGAACCCA TCAAAGGCCT CTCAAAGCTC GCGGGACACC    2700
CTGAGCTCAG GCGTACACTC CTGGAGCAGC CAGGCCGAGG CTCGAAGCTC CAGCTGGAAC    2760
ATGGTGCTGG CCCGGGGGCG GCCCACCGAC ACCCCAAGCT ATTTCAATGG TGTGAAAGTC    2820
CAAATACAGT CTCTTAATGG TGAACACCTG CACATCCGGG AGTTCCACCG GGTCAAAGTG    2880
GGAGACATCG CCACTGGCAT CAGCAGCCAG ATCCCAGCTG CAGCCTTCAG CTTGGTCACC    2940
AAAGACGGGC AGCCTGTTCG CTACGACATG GAGGTGCCAG ACTCGGGCAT CGACCTGCAG    3000
TGCACACTGG CCCCTGATGG CAGCTTCGCC TGGAGCTGGA GGGTCAAGCA TGGCCAGCTG    3060
GAGAACAGGC CCTAACCCTG CCCTCCACCG CCGGCTCCAC ACTGCCGGAA AGCAGCCTTC    3120
CTGCTCGGTG CACGATGCTG CCCTGAAAAC ACAGGCTCAG CCGTTCCCAG GGGATTGCCA    3180
GCCCCCCGGC TCACAGTGGG AACCAGGGCC TCGCAGCAGC AAGGTGGGGG CAAGCAGAAT    3240
GCCTCCCAGG ATTTCACACC TGAGCCCTGC CCCACCCTGC TGAAAAAACA TCCGCCACGT    3300
GAAGAGACAG AAGGAGGATG GCAGGAGTTA CCTGGGGAAA CAAAACAGGG ATCTTTTTCT    3360
GCCCCTGCTC CAGTCGAGTT GGCCTGACCC GCTTGGATCA GTGACCATTT GTTGGCAGAC    3420
AGGGGAGAGC AGCTTCCAGC CTGGGTCAGA AGGGGTGGGC GAGCCCTTCG GCCCCTCACC    3480
CTCCAGGCTG CTGTGAGAGT GTCAAGTGTG TAAGGGCCCA AACTCAGGTT CAGTGCAGAA    3540
CCAGGTCAGC AGGTATGCCC GCCCGTAGGT TAAGGGGGCC CTCTAAACCC CTTGCCTGGC    3600
CTCACCTGGC CAGCTCACCC CTTTTGGGTG TAGGGGAAAA GAATGCCTGA CCCTGGGAAG    3660
GCTCCCTGGT AGAATACACC ACACTTTTCA GGTTGTTGCA ACACAGGTCC TGAGTTGACC    3720
TCTGGTTCAG CCAAGGACCA AAGAAGGTGT GTAAGTGAAG TGGTTCTCAG TCCCCAGACA    3780
TGTGCCCCTT TGCTGCTGGC TACCACTCTT CCCCAGAGCA GCAGGCCCCG AGCCCCTTCA    3840
GGCCCAGCAC TGCCCCAGAC TCGCTGGCAC TCAGTTCCCT CATCTGTAAA GGTGAAGGGT    3900
GATGCAGGAT ATGCCTGACA GGAACAGTCT GTGGATGGAC ATGATCAGTG CTAAGGAAAG    3960
CAGCAGAGAG AGACGTCCGG CGCCCCAGCC CCACTATCAG TGTCCAGCGT GCTGGTTCCC    4020
CAGAGCACAG CTCAGCATCA CACTGACACT CACCCTGCCC TGCCCCTGGC CAGAGGGTAC    4080
TGCCGACGGC ACTTTGCACT CTGATGACCT CAAAGCACTT TCATGGCTGC CCTCTGGCAG    4140
GGCAGGGCAG GGCAGTGACA CTGTAGGAGC ATAGCAAGCC AGGAGATGGG GTGAAGGGAC    4200
ACAGTCTTGA GCTGTCCACA TGCATGTGAC TCCTCAAACC TCTTCCAGAT TTCTCTAAGA    4260
ATAGCACCCC CTTCCCCATT GCCCCAGCTT AGCCTCTTCT CCCAGGGGAG CTACTCAGGA    4320
CTCACGTAGC ATTAAATCAG CTGTGAATCG TCAGGGGGTG TCTGCTAGCC TCAACCTCCT    4380
GGGGCAGGGG ACGCCGAGAC TCCGTGGGAG AAGCTCATTC CCACATCTTG CCAAGACAGC    4440
CTTTGTCCAG CTGTCCACAT TGAGTCAGAC TGCTCCCGGG GAGAGAGCCC CGGCCCCCAG    4500
CACATAAAGA ACTGCAGCCT TGGTACTGCA GAGTCTGGGT TGTAGAGAAC TCTTTGTAAG     4560
CAATAAAGTT TGGGGTGATG ACAAATGTTA AAAAAA     4596
(2)SEQ ID NO：7的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：947氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Met Ala Val Met Glu Met Ala Cys Pro Gly Ala Pro Gly Ser Ala Val
1               5                   10                  15
Gly Gln Gln Lys Glu Leu Pro Lys Pro Lys Glu Lys Thr Pro Pro Leu
            20                  25                  30
Gly Lys Lys Gln Ser Ser Val Tyr Lys Leu Glu Ala Val Glu Lys Ser
        35                  40                  45
Pro Val Phe Cys Gly Lys Trp Glu Ile Leu Asn Asp Val Ile Thr Lys
    50                  55                  60
Gly Thr Ala Lys Glu Gly Ser Glu Ala Gly Pro Ala Ala Ile Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ile Ala Gln Ala Glu Cys Glu Asn Ser Gln Glu Phe Ser Pro Thr Phe
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Ile Phe Ile Ala Gly Ser Lys Gln Tyr Ser Gln Ser Glu
            100                 105                 110
Ser Leu Asp Gln Ile Pro Asn Asn Val Ala His Ala Thr Glu Gly Lys
        115                 120                 125
Met Ala Arg Val Cys Trp Lys Gly Lys Arg Arg Ser Lys Ala Arg Lys
    130                 135                 140
Lys Arg Lys Lys Lys Ser Ser Lys ser Leu Ala His Ala Gly Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Lys Pro Leu Pro Arg Thr Pro Glu Gln Glu Ser Cys Thr Ile
                165                 170                 175
Pro Val Gln Glu Asp Glu Ser Pro Leu Gly Ala Pro Tyr Val Arg Asn
            180                 185                 190
Thr Pro Gln Phe Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Gly Leu Gly Gln Leu
        195                 200                 205
Cys Phe Lys Gln Leu Gly Glu Gly Leu Arg Pro Ala Leu Pro Arg Ser
    210                 215                 220
Glu Leu His Lys Leu Ile Ser Pro Leu Gln Cys Leu Asn His Val Trp
225                 230                 235                 240
Lys Leu His His Pro Gln Asp Gly Gly Pro Leu Pro Leu Pro Thr His
                245                 250                 255
Pro Phe Pro Tyr Ser Arg Leu Pro His Pro Phe Pro Phe His Pro Leu
            260                 265                 270
Gln Pro Trp Lys Pro His Pro Leu Glu Ser Phe Leu Gly Lys Leu Ala
        275                 280                 285
Cys Val Asp Ser Gln Lys Pro Leu Pro Asp Pro His Leu Ser Lys Leu
    290                 295                 300
Ala Cys Val Asp Ser Pro Lys Pro Leu Pro Gly Pro His Leu Glu Pro
305                 310                 315                 320
Ser Cys Leu Ser Arg Gly Ala His Glu Lys Phe Ser Val Glu Glu Tyr
                325                 330                 335
Leu Val His Ala Leu Gln Gly Ser Val Ser Ser Ser Gln Ala His Ser
            340                 345                 350
Leu Thr Ser Leu Ala Lys Thr Trp Ala Ala Arg Gly Ser Arg Ser Arg
        355                 360                 365
Glu Pro Ser Pro Lys Thr Glu Asp Asn Glu Gly Val Leu Leu Thr Glu
    370                 375                 380
Lys Leu Lys Pro Val Asp Tyr Glu Tyr Arg Glu Glu Val His Trp Ala
385                 390                 395                 400
Thr His Gln Leu Arg Leu Gly Arg Gly Ser Phe Gly Glu Val His Arg
                405                 410                 415
Met Glu Asp Lys Gln Thr Gly Phe Gln Cys Ala Val Lys Lys Val Arg
            420                 425                 430
Leu Glu Val Phe Arg Ala Glu Glu Leu Met Ala Cys Ala Gly Leu Thr
        435                 440                 445
Ser Pro Arg Ile Val Pro Leu Tyr Gly Ala Val Arg Glu Gly Pro Trp
    450                 455                 460
Val Asn Ile Phe Met Glu Leu Leu Glu Gly Gly Ser Leu Gly Gln Leu
465                 470                 475                 480
Val Lys Glu Gln Gly Cys Leu Pro Glu Asp Arg Ala Leu Tyr Tyr Leu
                485                 490                 495
Gly Gln Ala Leu Glu Gly Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Arg Ile Leu
            500                 505                 510
His Gly Asp Val Lys Ala Asp Asn Val Leu Leu Ser Ser Asp Gly Ser
        515                 520                 525
His Ala Ala Leu Cys Asp Phe Gly His Ala Val Cys Leu Gln Pro Asp
    530                 535                 540
Gly Leu Gly Lys Ser Leu Leu Thr Gly Asp Tyr Ile Pro Gly Thr Glu
545                 550                 555                 560
Thr His Met Ala Pro Glu Val Val Leu Gly Arg Ser Cys Asp Ala Lys
                565                 570                 575
Val Asp Val Trp Ser Ser Cys Cys Met Met Leu His Met Leu Asn Gly
            580                 585                 590
Cys His Pro Trp Thr Gln Phe Phe Arg Gly Pro Leu Cys Leu Lys Ile
        595                 600                 605
Ala Ser Glu Pro Pro Pro Val Arg Glu Ile Pro Pro Ser Cys Ala Pro
    610                 615                 620
Leu Thr Ala Gln Ala Ile Gln Glu Gly Leu Arg Lys Glu Pro Ile His
625                 630                 635                 640
Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Gly Gly Lys Val Asn Arg Ala Leu Gln
                645                 650                 655
Gln Val Gly Gly Leu Lys Ser Pro Trp Arg Gly Glu Tyr Lys Glu Pro
            660                 665                 670
Arg His Pro Pro Pro Asn Gln Ala Asn Tyr His Gln Thr Leu His Ala
        675                 680                 685
Gln Pro Arg Glu Leu Ser Pro Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Glu
    690                 695                 700
Glu Thr Thr Gly Arg Ala Pro Lys Leu Gln Pro Pro Leu Pro Pro Glu
705                 710                 715                 720
Pro Pro Glu Pro Asn Lys Ser Pro Pro Leu Thr Leu Ser Lys Glu Glu
                725                 730                 735
Ser Gly Met Trp Glu Pro Leu Pro Leu Ser Ser Leu Glu Pro Ala Pro
            740                 745                 750
Ala Arg Asn Pro Ser Ser Pro Glu Arg Lys Ala Thr Val Pro Glu Gln
        755                 760                 765
Glu Leu Gln Gln Leu Glu Ile Glu Leu Phe Leu Asn Ser Leu Ser Gln
    770                 775                 780
Pro Phe Ser Leu Glu Glu Gln Glu Gln Ile Leu Ser Cys Leu Ser Ile
785                 790                 795                 800
Asp Ser Leu Ser Leu Ser Asp Asp Ser Glu Lys Asn Pro Ser Lys Ala
                805                 810                 815
Ser Gln Ser Ser Arg Asp Thr Leu Ser Ser Gly Val His Ser Trp Ser
            820                 825                 830
Ser Gln Ala Glu Ala Arg Ser Ser Ser Trp Asn Met Val Leu Ala Arg
        835                 840                 845
Gly Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser Tyr Phe Asn Gly Val Lys Val Gln
    850                 855                 860
Ile Gln Ser Leu Asn Gly Glu His Leu His Ile Arg Glu Phe His Arg
865                 870                 875                 880
Val Lys Val Gly Asp Ile Ala Thr Gly Ile Ser Ser Gln Ile Pro Ala
                885                 890                 895
Ala Ala Phe Ser Leu Val Thr Lys Asp Gly Gln Pro Val Arg Tyr Asp
            900                 905                 910
Met Glu Val Pro Asp Ser Gly Ile Asp Leu Gln Cys Thr Leu Ala Pro
        915                 920                 925
Asp Gly Ser Phe Ala Trp Ser Trp Arg Val Lys His Gly Gln Leu Glu
    930                 935                 940
Asn Arg Pro
945
(2)SEQ ID NO：8的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：30碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其他核酸
        (A)描述：/desc＝″寡核苷酸PCR引物″
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
CAGGATCCTC ATGGCTGCAG CTAGCGTGAC                                      30
(2)SEQ ID NO：9的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：32碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其他核酸
        (A)描述：/desc＝″寡核苷酸PCR引物″
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GGTCGACTTA GAGCCCTGTC AGGTCCACAA TG                                    32
(2)SEQ ID NO：10的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：24碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其他核酸
        (A)描述：/desc＝″寡核苷酸探针″
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
GATGCCATTG GGGATTTCCT CTTT                                             24
(2)SEQ ID NO：11的信息：
   (i)序列特征：
        (A)长度：24碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其他核酸
        (A)描述：/desc＝″寡核苷酸探针″
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
CAGTAAAGAG GAAATCCCCA ATGG                                             24

Claims (41)

1.一种DNA序列，其特征在于，它编码能够结合于肿瘤坏死因子相关因子即TRAF分子的蛋白质，该DNA序列选自下组：
(a)克隆10的cDNA序列，它含有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
(b)序列(a)的片段，该片段编码能够结合于TRAF2中至少222-501位氨基酸序列的生物活性蛋白。
2.如权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，该TRAF分子是TRAF2。
3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，该编码的蛋白质可与至少TRAF2中222-501位氨基酸序列结合。
4.编码蛋白质NIK或其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物的DNA序列，其特征在于，所述蛋白NIK或其类似物能够结合于TRAF2并且能够调控NF-κB的活性，蛋白质NIK具有SEQID NO：7所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的DNA序列，其特征在于，它衍生自天然NIK蛋白编码区域的cDNA序列。
6.如权利要求4或5所述的DNA序列，其特征在于，它包括SEQ ID NO：6所示序列的至少一部分，并且该序列编码至少一种活性NIK蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物。
7.如权利要求6所述的DNA序列，其特征在于，它编码具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的NIK蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA序列。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，它能够在真核宿主细胞中被表达。
10.如权利要求8所述的载体，其特征在于，它能够在原核宿主细胞中被表达。
11.转化的真核或原核宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求10所述的载体。
12.由权利要求1所述的DNA序列所编码的TRAF-结合蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，其特征在于，该蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物能够结合于至少TRAF2氨基酸222-501位之间的TRAF2蛋白片段。
13.如权利要求12所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质是由克隆10所编码的蛋白质。
14.由权利要求4所述的DNA序列所编码的蛋白质NIK、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，其特征在于，它是具有SEQ ID NO：7所示序列的NIK蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物。
15.一种生产权利要求12所述的蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物的方法，其特征在于，它包括：在适合表达该蛋白质、其类似物的条件下，让权利要求11所述的转化宿主细胞生长；按需要进行翻译后的修饰，从而获得蛋白质、其类似物；分离出该表达的蛋白质、其类似物。
16.一种抗体，其特征在于，它们对权利要求12的TRAF-结合蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物特异。
17.一种调控或介导受TRAF2调控或介导的胞内信号传导活性的方法，其特征在于，该方法包括：处理该细胞，通过向该细胞中引入处于适合胞内诱导形式的一种或多种权利要求12所述的蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，或者通过向该细胞中引入编码该一种或多种该蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物的DNA序列，该DNA序列处于合适的携带该序列的载体中，该载体能够将该序列插入到细胞中从而使该序列在细胞中表达。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该处理细胞步骤包括：将编码该蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物的DNA序列，以携带该序列的合适载体形式引入细胞，其中该载体能够将该序列插入细胞，使该序列在细胞中表达。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，该处理细胞的步骤是通过用重组的动物病毒载体转染该细胞，其中包括步骤：
(a)构建重组动物病毒载体，该载体携带编码病毒表面蛋白即配体的序列，该病毒表面蛋白能够结合于待处理的该细胞表面上的特异性细胞表面受体，该载体还含有第二种编码蛋白质的序列，所述蛋白质选自权利要求12所述的蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，而且所述蛋白质在细胞中表达时能够调控/介导由TRAF2或其他该类分子所调控/介导的其他胞内信号传导活性；和
(b)用(a)中的该载体感染该细胞。
20.一种调控或介导细胞内NF-κB活性，或其他受TRAF2调控或介导的胞内信号传导活性的方法，其特征在于，该方法包括：处理该细胞，通过向该细胞中引入处于适合胞内诱导形式的一种或多种权利要求14所述的蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，或者通过向该细胞中引入编码该一种或多种该蛋白质、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物的DNA序列，该DNA序列处于合适的携带该序列的载体中，该载体能够将该序列插入到细胞中从而使该序列在细胞中表达。
21.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的方法，其特征在于，该方法包括：用权利要求16所述的抗体处理该细胞，该处理是通过将合适的，含有该抗体的组合物施用于该细胞，其中当该细胞的TRAF-结合蛋白暴露于胞外表面时，该组合物被制成适于在胞外施用；当该TRAF-结合蛋白是胞内时，该组合物被制成适于在胞内施用。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体对具有SEQ ID NO：7所示序列的NIK或其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物中至少一种特异。
23.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的方法，其特征在于，该方法包括：用寡核苷酸序列处理该细胞，该寡核苷酸具有权利要求1所述的编码TRAF-结合蛋白的DNA序列的反义序列，而且该寡核苷酸能够阻断TRAF-结合蛋白的表达。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，该寡核苷酸序列通过动物病毒载体被引入细胞，该载体携带编码病毒表面蛋白即配体的序列，该病毒表面蛋白能够结合于待处理的该细胞表面上的特异性细胞表面受体，而该病毒的第二条序列编码该寡核苷酸序列。
25.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的方法，其特征在于，该方法包括：用寡核苷酸序列处理该细胞，该寡核苷酸具有权利要求4所述的编码TRAF-结合蛋白的DNA序列的反义序列，而且该寡核苷酸能够阻断TRAF-结合蛋白的表达。
26.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的方法，其特征在于，该方法包括：应用核酶程序，其中将一核酶序列引入该细胞，使核酶序列在该细胞中表达，而该核酶序列能够与编码权利要求12所述的TRAF-结合蛋白的细胞mRNA序列作用，当该核酶序列在细胞中表达时，它会与该细胞mRNA序列作用并切割mRNA该序列，导致在该细胞中抑制TRAF-结合蛋白的表达。
27.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的方法，其特征在于，该方法包括：应用核酶程序，其中将一核酶序列引入该细胞，使核酶序列在该细胞中表达，而该核酶序列能够与编码权利要求14所述的TRAF-结合蛋白的细胞mRNA序列作用，当该核酶序列在细胞中表达时，它会与该细胞mRNA序列作用并切割mRNA该序列，导致在该细胞中抑制TRAF-结合蛋白的表达。
28.一种分离和鉴别权利要求12所述的，能够直接结合于TRAF2的蛋白质的方法，其特征在于，它包括：应用酵母双杂交程序，其中编码该TRAF2的序列被一种杂交载体所携带，而来自cDNA库或基因组DNA库的序列被第二种杂交载体所携带，然后用这些载体转化酵母宿主细胞，并分离阳性转化细胞，随后抽提出该第二种杂交载体，从而获得编码与TRAF2结合的蛋白质的序列。
29.一种分离和鉴别权利要求14所述的，能够直接结合于TRAF2的蛋白质的方法，其特征在于，它包括：应用酵母双杂交程序，其中编码该TRAF2的序列被一种杂交载体所携带，而来自cDNA库或基因组DNA库的序列被第二种杂交载体所携带，然后用这些载体转化酵母宿主细胞，并分离阳性转化细胞，随后抽提出该第二种杂交载体，从而获得编码与TRAF2结合的蛋白质的序列。
30.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的药物组合物，其特征在于，它含有编码权利要求12所述的TRAF-结合蛋白，其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物或它们的混合物，作为活性成分。
31.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的药物组合物，其特征在于，它含有重组的动物病毒载体作为活性成分，该病毒载体编码能够结合于细胞表面受体的蛋白，并且编码权利要求12所述的TRAF-结合蛋白或其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物。
32.一种调节TRAF2对细胞的调控/介导效应的药物组合物，其特征在于，它含有寡核苷酸序列作为活性成分，该寡核苷酸编码权利要求1所述的TRAF-结合蛋白反义序列。
33.一种药物组合物，它用于预防或治疗与TRAF2所介导的活性有关的病理状况，其特征在于，该组合物含有有效量的克隆10所编码的蛋白质、或编码该蛋白的DNA分子、或能够破坏克隆10所编码的该蛋白与TRAF2的相互作用的分子。
34.一种药物组合物，它用于预防或治疗与NF-κB诱导作用，或与TRAF2所介导的活性有关的病理状况，其特征在于，该组合物含有有效量的具有SEQ IDNO：7所示序列的NIK蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物，或编码这些物质的DNA分子，或能够破坏该NIK蛋白、其氨基酸序列中有不超过10个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入的类似物与TRAF2的相互作用的分子。
35.一种药物组合物，它用于预防或治疗与NF-κB诱导作用，或与TRAF2所介导的活性有关的病理状况，其特征在于，该组合物含有能够干扰NIK的蛋白激酶活性的分子，所述NIK具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列。
36.一种筛选方法，它用于筛选能够结合于权利要求12所述蛋白的配体，其特征在于，该方法包括：将附着有所述蛋白的亲和色谱基质与细胞提取物接触，从而使配体结合于该基质，然后洗脱、分离和分析该配体。
37.一种筛选方法，它用于筛选能够结合于权利要求12所述蛋白的配体，其特征在于，该方法包括：应用酵母双杂交程序，其中编码该蛋白的序列被一种杂交载体所携带，而来自cDNA库或基因组DNA库的序列被第二种杂交载体所携带，然后用这些载体转化酵母宿主细胞，并分离阳性转化细胞，随后抽提出该第二种杂交载体，从而获得编码该配体的序列。
38.一种鉴别和生产配体的方法，该配体能够调节TRAF2所调节/介导的细胞活性，其特征在于，该方法包括：
a)筛选能够结合于多肽的配体，该多肽含有至少TRAF2氨基酸残基222-501位的一部分TRAF2；
b)对该筛选步骤所得到的能够结合的、且不是TRAF2或TNF/NGF受体家族中受体部分的配体，进行鉴别和定性；
c)生产处于基本分离和纯化形式的该配体。
39.一种鉴别和生产配体的方法，该配体能够调节权利要求12所述蛋白所调节或介导的细胞活性，其特征在于，该方法包括：
a)筛选能够结合于多肽的配体，该多肽含有SEQ ID NO：7所示NIK序列；
b)对该筛选步骤所得到的能够结合的、且不是TRAF2或TNF/NGF受体家族中受体部分的配体，进行鉴别和定性；
c)生产处于基本分离和纯化形式的该配体。
40.一种鉴别和生产分子的方法，该分子能够直接或间接地调节NIK所调节/介导的细胞活性，其特征在于，该方法包括：
a)筛选能够调节具有SEQ ID NO：7所示序列的NIK所调节/介导的活性的分子；
b)对该分子进行鉴别和定性；
c)生产处于基本分离和纯化形式的该分子。
41.一种鉴别和生产分子的方法，该分子能够直接或间接地调节权利要求14所述蛋白所调节/介导的细胞活性，其特征在于，该方法包括：
a)筛选能够调节权利要求14蛋白所调节/介导的活性的分子；
b)对该分子进行鉴别和定性；
c)生产处于基本分离和纯化形式的该分子。
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