SK287889B6

SK287889B6 - Isolated polypeptide that binds to TRAF2 and modulates activity of NF-B, DNA sequence encoding its, pharmaceutical composition containing them and their use

Info

Publication number: SK287889B6
Application number: SK50016-2007A
Authority: SK
Inventors: David Wallach; Nikolai Malinin; Mark Boldin; Andrei Kovalenko; Igor Mett
Original assignee: Yeda Research And Development Co., Ltd.
Priority date: 1996-04-02
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2012-03-02
Also published as: DE69738370D1; HU226328B1; JP4180114B2; EE9800322A; HK1018910A1; DE69738370T2; CA2250085A1; US20090291888A1; ATE380866T1; UA71889C2; PT894130E; ES2294796T3; US7485456B1; HUP9902429A3; WO1997037016A1; CZ318398A3; NO984551D0; BR9708518A; CA2250085C; CZ298866B6

Abstract

The present invention relates to DNA sequences encoding proteins capable of binding to TRAF2; further relates to thus encoded proteins, the use of said proteins and DNA sequences for the manufacture of a medicament for treating or preventing pathologies associated with induction of NF-kappaB or other activity mediated TRAF2 or other molecules which bind to the protein.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka sekvencií DNA, kódujúcich proteíny, ktoré sú schopné väzby s TRAF2; ďalej sa týka takto kódovaných proteínov, použitia uvedených proteínov a sekvencií DNA na výrobu liekov na liečenie alebo prevenciu patologických stavov, spojených s indukciou NF-κΒ, alebo s inou aktivitou, sprostredkovanou TRAF2, alebo inými molekulami, ku ktorým sa uvedené proteíny viažu.

Doterajší stav techniky

Nadčeľaď receptorov faktorov nekrotizujúcich nádory (tumour necrosis factors, TNF)/rastových nervových faktorov (nerve growth factors, NGF) je definovaná štruktúrnou homológiou extracelulámych domén ich členov (Bazan, 1993; Beutler a van Huffel, (1994); Smith et al., (1994)). S výnimkou dvoch receptorov, receptora p55 TNF a FAS/APO1, nevykazujú rôzne jedince tejto receptorovej čeľade zrejmú podobnosť štruktúry ich vnútrobunkových domén. Medzi uvedenými receptormi však jestvuje značná funkčná podobnosť, čo poukazuje na spoločné signálne cesty. Jedným z príkladov tejto podobnosti môže byť schopnosť viacerých receptorov čeľade TNF/NGF aktivovať transkripčný faktor NF-κΒ. Uvedená spoločná schopnosť sa pripísala schopnosti cytoplazmového proteínu, ktorý aktivuje NF-κΒ, faktora 2, združeného s receptorom TNF (TNF Receptor Associated Factor 2, TRAF2), viazať sa k štruktúrne rozdielnym intracelulámym doménam viacerých receptorov z uvedenej čeľadeTNF/NGF. Akým mechanizmom TRAF2 pôsobí a aká je jeho reakcia na rôzne receptory, ku ktorým sa koordinačne viaže, doteraz nie je známe.

TRAF2 je členom nedávno opísanej skupiny proteínov, označenej TRAF, ktorá zahŕňa viaceré proteíny, bližšie určené napríklad ako TRAF 1, TRAF2 (Rothe, M., Wong, S.C., Henzel, W.J. a Goeddel, D., Celí 78, 681 až 682 (1994); zverejnená prihláška WO 95/33 051)), TRAF 3 (Cheng, G. et al. (1995)), a TRAF 6 (pozri Cao et al., (1996a)).

Všetky proteíny, ktoré patria do skupiny TRAF, majú v C-terminálnych doménach vysoký stupeň zhodnosti aminokyselín. Ako je zrejmé z schematického znázornenia TRAF2 (obr. 1), uvedená molekula v jej C-terminálnej oblasti obsahuje ring finger zoskupenie a dve XXzinc finger zoskupenia, podobné TFIIIA. C-terminálna polovica molekuly zahŕňa oblasť, ktorá je známa ako „doména TRAF“, obsahujúca potenciálnu leucínovú „zipper“ oblasť medzi aminokyselinami 264 až 358 (označenú N-TRAF) a ďalšiu časť v smere karboxy-zakončenia domény medzi 359. až po 501. aminokyselinou (označenú C-TRAF), ktorá je zodpovedná za väzbu TRAF k receptorom a k ďalším molekulám TRAF za vzniku homo- alebo heterodimérov.

Aktivácia transkripčného faktora NF-κΒ je jedným z prejavov signálnej kaskády, iniciovanej niektorými z TNF/NGF receptorov a sprostredkovaných TRAF2. NF-κΒ zahŕňa členy skupiny proteínov tvoriacich diméry s homológiou k Rel onkogénu, ktoré, v ich dimémej forme, pôsobia ako transkripčné faktory. Tieto faktory sa vyskytujú všade a zúčastňujú sa na regulácii expresie mnohých génov. Hoci boli pôvodne označené ako faktor, ktorý je konštitutívne prítomný v B-bunkách v štádiu expresie IgK ľahkého reťazca, NF-κΒ je známy najmä pre jeho účinok ako indukovateľný transkripčný aktivátor. Vo väčšine známych prípadov sa NF-κΒ správa ako primárny faktor, menovite indukcia jeho aktivity prebieha aktiváciou molekúl, prítomných už v neaktívnej forme bunky, skôr ako by bol de-novo syntetizovaný, čo sa naopak vzťahuje na indukovateľné transkripčné faktory, ktoré napádajú NF-κΒ gén XX tum-on the NF-κΒ. Účinok NF-κΒ je vysoko pleiotrópny. Väčšina z týchto početných účinkov má spoločnú vlastnosť v tom, že sú rýchlo indukovateľné ako reakcia na extracelulámy podnet. Väčšina NF-κΒ aktivačných činidiel sú induktory imunitnej obrany vrátane zložiek vírusov a baktérií, cytokínov, ktoré regulujú imunitnú reakciu, U V svetla a ďalších. Podľa uvedeného mnohé z génov regulovaných NF-κΒ prispievajú k imunitné obrane (pozri prehľadné práce Blank et al. (1992); Grilli et al. (1993); Baeuerle a Henkel (1994)).

Jedným z hlavných znakov NF-κΒ -regulácie je, že tento faktor môže jestvovať v cytoplazmovej ne-DNA väzbovej forme, ktorá môže byť indukovaná na translokáciu k jadru, viazať DNA a aktivovať transkripciu. Uvedená dvojitá forma NF-κΒ -proteínov je regulovaná I-κΒ, čo je skupina proteínov, obsahujúcich repeticie domény, ktoré boli pôvodne rozlíšené v erytrocytovom proteíne ankyríne (Gilmore a Morin (1993)). Uvedený NF-κΒ dimér v nestimulovanej forme sa nachádza združený s I-κΒ molekulou, ktorá je na diméri uložená v cytoplazmovej polohe a zabraňuje jeho reakcii s NF-κΒ-väzbovou DNA-sekvenciou a aktivácii transkripcie. Disociácia I-κΒ z NF-κΒ diméru predstavuje kritický krok aktivácie pri mnohých z indukčných činidiel (DiDonato et al. (1995)). Poznatky o mechanizme, ktorý umožňuje túto reguláciu, sú stále obmedzené. Rovnako je málo poznatkov na pochopenie cesty, ktorou je určená špecifickosť bunky z hľadiska reakcií na rôzne NF-xB-indukčné činidlá.

Jedným z najviac účinných indukčných činidiel NF-κΒ je cytokínový nádor nekrotizujúci faktor (Tumor Necrosis Factor, TNF). Jestvujú dva rôzne TNF receptory, receptor p55 a receptor p75. Úroveň ich expresie sa mení nezávisle od druhu buniek (Vandenabeele et al., (1995)). Receptor p75 reaguje prednostne na bunkou viazanú formu TNF (TNF je exprimovaný aj ako beta-transmembránový proteín, aj ako rozpustný proteín), zatiaľ čo receptor p55 reaguje rovnako účinne na rozpustné molekuly TNF (Grell et al.(1995)). Vnútrobunkové domény uvedených dvoch receptorov nemajú štruktúrnu podobnosť a viažu rozdielne cytoplazmatické proteíny. Jednako však, najmenej časť účinku TNF vrátane cytocidálneho účinku TNF a indukcie NF-kB môže byť spôsobená obidvoma uvedenými druhmi receptorov. Tento jav je bunkovo špecifický. Uvedený receptor p55 je schopný indukovať cytocidálny efekt alebo aktiváciu NF-κΒ vo všetkých bunkách, ktoré tieto účinky prejavujú ako reakciu na TNF. Receptor p75-R môže mať uvedené účinky iba pri niektorých bunkách. Iné bunky, hoci exprimujú vysoké hladiny p75-R, vykazujú indukciu uvedených účinkov iba ako reakciu na stimuláciu receptora p55 (Vandenabeele et al. (1995)). Popri TNF receptorov sú aj iné receptory zo skupiny receptorov TNF/NGF,ktoré sú schopné tiež indukovať aktiváciu NF-κΒ: CD30 (McDonald et al. (1995)), CD40 (Berberich et al. (1994)); Lalmanach-Girard et al., (1993)), lymfotoxínový beta-receptor a pri niektorých typoch buniek FAS/APO1 (Rensing-Ehl et al. (1995)). Receptor IL-1 typu I tiež účinne spúšťa aktiváciu NF-κΒ, má väčšinu účinkov obdobných receptorom TNF napriek tomu, že s nimi nemá nijakú štruktúrnu podobnosť.

Aktivácia NF-κΒ po spustení rôznymi receptormi je dôsledkom vyvolanej fosforylácie I-kB molekúl, združenými s NF-κΒ. Fosforylácia vedie k degradácii I-κΒ, čo najvhodnejšie nastáva v proteasome XX. Podstata kinázy, ktorá fosforyluje I-κΒ a mechanizmus aktivácie po spustení receptorom nie sú doteraz známe. V posledných dvoch rokoch sa však získali niektoré poznatky o identite troch receptorovo združených proteínov, o ktorých sa predpokladá, že sa zúčastňujú na iniciácii fosforylácie (pozri grafické znázornenie na obr. 2a a 6). Usudzuje sa, že ústrednú úlohu pri aktivácii rôznymi receptormi zo skupiny TNF/NGF má proteín, nazvaný TRAF2, pôvodne klonovaný D. Goddelom a jeho kolegami (Rothe et al. (1994)). Ak je uvedený proteín exprimovaný vo vysokých úrovniach koncentrácií, sám môže spustiť aktiváciu NF-κΒ, viazať sa k aktivovanému p75 TNF-R (Rothe et al. (1994)), lymfotoxínovému béta receptoru (Mosialos et al. (1995)), CD40 (Rothe et al. (1995a)) a CD30 (nepublikované údaje) a nimi sprostredkovať indukciu NF-κΒ. TRAF2 sa neviaže k p55 TNF receptoru ani k FAS/APO1, ale môže sa viazať k proteínu združenom s receptorom p55; tento proteín sa označuje TRADD a má schopnosť viazať sa k proteínu združenému s FAS/APO1, ktorý sa označuje MORT1 (alebo FADD - pozri Boldin et al. (1995b) a (1996)). Iný proteín, ktorý vstupuje do interakcie s receptormi, označovaný RIP (pozri Stanger et al.(1995)), je schopný vstúpiť do interakcie tiež s TRAF2, ako aj s FAS/APO1, TRADD, p55 TNF receptorom a MORT-1. Kým RIP je spojený s indukciou bunkovej cytotoxickosti (bunková smrť), potom jeho schopnosť vstupovať do interakcie s TRAF2 implikuje tiež jeho zapojenie do aktivácie NF-κΒ a môže navyše slúžiť tiež na zvýšenie interakcie medzi FAS/APO1, MORT-1, p55 TNF receptorom a TRADD s TRAF2 reakčnou cestou, vedúcou k aktivácii NF-κΒ. Uvedené súvislosti zjavne umožňujú spúšťanie NF-κΒ aktivácie účinkom p55 TNF receptora a FAS/APO1 (Hsu et al. (1995); Boldin et al.(1995); Chinnalyan et al. (1995); Varfolomeev et al. (1996); Hsu et al. (1996)). Spúšťanie aktivácie NF-κΒ receptorom IL-1 nastáva nezávisle od TRAF2 a môže zahŕňať kinázu, nedávno klonovanú proteínom združeným s IL-1 receptorom, označovanú IRAK (Croston et al., (1995)).

Akým mechanizmom pôsobí TRAF2 nie je doteraz jasné. Niektoré cytoplazmatické molekuly, ktoré sa viažu s TRAF2 už boli identifikované (Rothe et al., (1994); Rothe et al., (1995b)). Informácie o týchto molekulách však neposkytujú nijaké náznaky o dráhe, ktorou TRAF2 začína fosforyláciu I-κΒ, pretože samotný TRAF2 nevykazuje nijakú enzymatickú aktivitu. Doteraz chýbajú informácie tiež o mechanizme, ktorý určuje bunkovo špecifický obraz aktivácie TRAF2 rôznymi receptormi tak, ako bol pozorovaný pri indukcii NF-κΒ uvedenými dvoma TNF receptormi.

Okrem už uvedeného o rôznych TRAF proteínoch treba navyše poznamenať, že TRAF2 sa viaže s p55 (CD120a) a p75(CD120b) TNF receptormi, ako aj s viacerými receptormi zo skupiny TNF/NGF receptorov buď priamo, alebo nepriamo cez ďalšie adaptorové proteíny, ako už bolo uvedené, napríklad ako FAS/APO1 receptor a adaptorové proteíny MORT-1, TRADD a RIP. Pri aktivácii NF-κΒ je rozhodujúci TRAF2 sám osebe (pozri Wallach (1996)). Aktiváciu NF-κΒ niektorými receptormi zo skupiny receptorov TNF/NGF však inhibuje TRAF3 (pozri Rothe et al. (1995a)), zatiaľ čo na indukciu NF-κΒ receptorom IL-1 sa vyžaduje TRAF6 (pozri Cao et al. (1996a)).

V súvislosti s aktiváciou NF-κΒ a jej dôležitosťou so zachovaním životaschopnosti buniek, neboli doteraz celkom jasne vyriešené rôzne intraceluláme reakčné cesty tejto aktivácie, napríklad to, ako sa rôzne TRAF proteíny priamo alebo nepriamo zúčastňujú na týchto pochodoch.

Ďalej, ako je teraz známe pri niektorých členoch receptorovej skupiny TNF/NGF a pre s nimi združené intraceluláme signálne dráhy vrátane rôznych adaptorov, mediátorových/modulátorových proteínov (pozri prehľady a odkazy napríklad v spoluvlastnených závislých prihláškach izraelských patentov číslo 114 615, 114 986, 115 319, 116 588), môže napríklad ligand TNF a FAS/APO1 mať podporný alebo aj ničivý účinok na bunky. TNF napríklad prispieva k obrane organizmu proti nádorom a infekčným látkam a prispieva na zotavenie z úrazov indukciou ničenia nádorových buniek a vírusom nakazených buniek, zvyšuje protibakteriálnu aktivitu granulocytov. V týchto prípadoch je uvedené, s TNF indukované, ničenie buniek želateľné. Nad3 bytok TNF však môže byť ničivý a ako je o samotnom TNF známe, má významnú patogénnu úlohu v značnom počte ochorení, ako sú septický šok, anorexia, reumatické choroby, zápaly a reakcie štepov s príjemcom. V takých prípadoch je s TNF indukované ničenie buniek nežiaduce. Uvedený FAS/APO1 ligand má napríklad tiež želateľné, ale aj nežiaduce účinky. Tento ligand indukuje cez jeho receptory ničenie autoreaktívnych T buniek v priebehu dozrievania T buniek, to znamená ničenie T buniek, ktoré rozpoznávajú vlastné antigény v priebehu ich vývoja a tak chránia pred autoimúnnymi ochoreniami. Ďalej, rôzne malignantné bunky a HIV- nakazené bunky nesú na svojom povrchu FAS/APO1 receptor a môžu tak byť zničené aktiváciou tohto receptora jeho ligandom alebo protilátkou k nemu špecifickou, a tak je týmto receptorom sprostredkúvaná aktivácia intracelulámej cesty odumierania buniek (apoptosis). Receptor FAS/APO1 však môže mať aj ničivý účinok, napríklad neovládané ničenie tkaniva, ktoré sa pozoruje pri niektorých ochoreniach, ako je akútna hepatitída, čo je spojené s deštrukciou pečeňových buniek.

Z hľadiska uvedených poznatkov, najmä toho, že receptory skupiny TNF / NGF môžu indukovať reakčnú dráhu ničenia buniek na jednej strane a na druhej strane môžu indukovať cestu prežitia buniek (cez indukciu NF-κΒ), zrejme jestvuje jemná rovnováha, intraceluláme medzi týmito dvoma protichodnými reakčnými dráhami. Ak je napríklad želateľné dosiahnuť čo najväčšiu deštrukciu rakovinových buniek alebo inak infektovaných alebo chorých buniek, bude cieľom mať ligand TNF a/alebo FAS/APO1 indukujúci iba reakčnú cestu ničenia buniek bez indukcie NF-κΒ. Obrátene, ak je želateľné chrániť bunky, ako je to napríklad pri zápalových ochoreniach, pri reakciách štepu s hostiteľom, alebo pri akútnej hepatitíde, je cieľom zamedziť indukcii ničenia buniek TNF a/alebo FAS/APO1 ligandom a miesto toho podporiť indukciu NF-κΒ. Podobne, v určitých patologických podmienkach bude želateľné blokovať intraceluláme signálne cesty, sprostredkované receptormi p75 a IL-1, zatiaľ čo v iných podmienkach bude cieľom tieto intraceluláme reakčné cesty podporiť.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je izolovaný polypeptid, ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ, ktorý obsahuje:

a) aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2;

b) aminokyselinovú sekvenciu fragmentu a), ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-kB;

c) aminokyselinovú sekvenciu analógu a) alebo b), ktorý nemá viac ako desať zmien v aminokyselinovej sekvencii a) alebo b), pričom každá takáto zmena je substitúciou, deléciou alebo inzerciou aminokyseliny, pričom tento analóg sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-kB.

Zároveň je súčasťou podstaty vynálezu aj izolovaná DNA sekvencia kódujúca skôr uvedený polypeptid, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej:

(i) cDNA sekvenciu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:1;

(ii) fragment sekvencie (i), ktorý kóduje polypeptid viažuci sa na TRAF2 a modulujúci aktivitu NF-kB.

Nové proteíny podľa tohto vynálezu sú nepriame modulátory/mediátory intracelulámej biologickej aktivity rôznych ďalších proteínov, ktoré sú schopné vstupovať do interakcie s receptorom TRAF proteínov priamo, alebo nepriamo (napríklad s FAS/APO1 receptorom, p55 TNF receptorom, p75 TNF receptorom, IL-1 receptorom a s nimi združenými proteínmi, ako je napríklad MORT-1, TRADD, RIP).

Vynález ďalej zahŕňa antagonísty (napríklad protilátky, peptidy, organické zlúčeniny, alebo aj niektoré izoformy) k uvedeným novým proteínom, viažucich sa k TRAF vrátane izoforiem, analógov, fragmentov a ich derivátov, ktoré sa môžu použiť na inhibíciu signálneho procesu, alebo, bližšie, na inhibíciu aktivácie NF-κΒ a jeho zapojenia v životných procesoch bunky, ak sa také ovplyvnenie vyžaduje. Podobne, keď sa proteíny podľa tohto vynálezu, viažuce sa k TRAF, alebo proteín TRAF, ku ktorému sa viažu (napríklad TRAF3), sú samy inhibítormi aktivácie NF-κΒ, potom je požiadavka mať antagonísty k týmto TRAF-väzbovým proteínom, aby aktivovali signálny proces, bližšie, aby blokovali inhibíciu aktivácie NF-κΒ a tým sa zvýšila aktivácia NF-κΒ, ak sa taká aktivácia vyžaduje.

Vynález ďalej zahŕňa použitie uvedených nových TRAF-väzbových proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov, a ich derivátov, na izoláciu a charakterizáciu ďalších proteínov alebo faktorov, ktoré môžu byť zapojené do regulácie TRAF-proteínovej aktivity a/alebo do uvedenej receptorovej aktivity, napríklad ďalšie proteíny, ktoré môžu viazať TRAF proteíny a ovplyvňovať ich aktivitu, a/alebo na izoláciu a identifikáciu ďalších receptorov, alebo ďalších bunkových proteínov v smere alebo proti smeru v signálnom procesoch, ku ktorým sa tieto nové proteíny, analógy, fragmenty, a ich deriváty viažu, a preto sú aj zapojené do ich funkcií.

Vynález ďalej zahŕňa inhibítory, ktoré môžu byť vložené do buniek tak, aby viazali alebo vstupovali do interakcie s novými TRAF-väzbovými proteínmi a ich možnými izoformami; uvedené inhibítory môžu spôsobovať inhibíciu aktivity spojenej s TRAF-proteínmi, napríklad v aktivácii NF-κΒ a preto, ak sa to vyžadu4 je, môžu inhibovať aktiváciu NF-κΒ; alebo môžu pôsobiť inhibičné na inhibičné aktivity spojené s TRAF (napríklad TRAF3) pri aktivácii NF-κΒ, a preto, ak sa vyžaduje, môžu zvyšovať NF-κΒ aktiváciu.

Vynález ďalej zahŕňa použitie uvedených nových TRAF väzbových proteínov, izoforiem a analógov, fragmentov, a ich derivátov ako antigény na prípravu ich polyklonových a/alebo monoklonových protilátok. Protilátky môžu byť naopak použité, napríklad, na čistenie nových proteínov z rôznych zdrojov, ako sú bunkové extrakty alebo transformované bunkové línie.

Ďalej, uvedené protilátky sa môžu použiť na diagnostické účely, napríklad na identifikáciu porúch súvisiacich s abnormálnym priebehom bunkových funkcií, sprostredkovaných priamo proteínmi TRAF, alebo sprostredkovanými p55 TNF receptorom, FAS/APO1 receptorom, alebo inými príbuznými receptormi a s nimi združenými bunkovými proteínmi (napríklad MORT-1, TRADD, RIP), ktoré pôsobia priamo alebo nepriamo na moduláciu/mediáciu intracelulámych dejov cez interakcie s TRAF proteínmi.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické kompozície, obsahujúce uvedené nové proteíny, izoformy, alebo analógy, fragmenty, alebo ich deriváty, ako aj farmaceutické kompozície uvedených protilátok alebo iných antagonistov.

Podľa tohto vynálezu sa izolovalo viacero nových TRAF-väzbových proteínov, najmä TRAF2-väzbových proteínov. Uvedené TRAF2 väzbové proteíny majú vysokú špecifickosť väzby k TRAF2 (pozri ďalej uvedené príklady), a preto sú modulátormi alebo mediátormi TRAF2 intracelulámej aktivity. TRAF2 je zapojený do modulácie alebo mediácie najmenej jednej intracelulámej signálnej dráhy, ktorá je obdobná dráham na prežitie buniek alebo dráham ich životaschopnosti, v ktorých je TRAF2 v priamom spojení s aktiváciou NF-kB, ktorý má kľúčovú úlohu v živote bunky. Jeden z nových proteínov, označený NIK („NF-κΒ inducing kinase“, NIK, „NF-κΒ indukujúci kinázu“) sa skutočne viaže k TRAF2 a stimuluje aktivitu NF-κΒ. NIK je kináza, ktorá sa vyznačuje sekvenčnou podobnosťou s niektorými MAPKK kinázami (pozri v ďalšom texte). Tým, že TRAF2 je schopný interakcie priamo alebo nepriamo s uvedeným p55 TNF receptorom, p75 TNF receptorom, FAS/APO1 receptormi a s proteínmi MORT-1, TRADD a RIP, ktoré sú s nimi združené, je tiež mediátorom (sprostredkovateľom) alebo modulátorom indukcie NF-κΒ alebo aktivácie aktivity, vlastnej týmto receptorom. TRAF2 je preto modulátor/mediátor dráhy prežitia bunky (ako protiklad dráhy smrti bunky), sprostredkovanej týmito receptormi a s nimi združenými proteínmi a rozsah interakcie medzi týmito receptormi a/alebo proteínmi s TRAF2 je dôležitým faktorom v celkovej aktivite týchto receptorov (už aktivovaných ich ligandmi) najmä vtedy, ak bunky majú žiť, alebo zahynúť. Podľa uvedeného majú proteíny podľa tohto vynálezu, napríklad NIK, kľúčovú úlohu v uvedenej interakcii medzi TRAF2 a ďalšími proteínmi/receptormi, s ktorými TRAF2 vstupuje do interakcie; proteíny, ako je NIK, špecifickou väzbou k TRAF2 bude modulovať jeho aktivitu a/alebo aktivita proteínov bude modulovaná cez interakciu s TRAF2.

Uvedené TRAF-väzbové proteíny, ako sú napríklad TRAF-väzbové proteíny vrátane NIK, sa izolovali a klonovali s použitím dvoj hybridného systému, čiastočne a celkom sekvenované; ďalej sa charakterizovali a ako sa v ďalšom ukázalo, sú to vysoko špecifické TRAF2-väzbové proteíny, a preto aj špecifické TRAF2 modulátory/mediátory.

V tomto texte používaný výraz TRAF proteínová aktivita, napríklad aktivita TRAF2, zahŕňa jeho aktivitu pri modulácii/mediácii na dráhe prežitia bunky, a najmä čo sa týka indukcie/aktivácie NF-κΒ. Podobne sa v tomto texte používa výraz aktivita TRAF-väzbového proteínu, najmä TRAF2-väzbového proteínu vo význame, ktorý zahŕňa moduláciu/mediáciu aktivity TRAF, najmä aktivity TRAF2 v dôsledku špecifickej väzby k TRAF, najmä TRAF2 proteínom; táto modulácia/mediácia vrátane modulácie/mediácie životných dráh bunky (celí survival pathways) a najmä tých, ktoré sú vo vzťahu s NF-κΒ aktiváciou/indukciou, v ktorej sú TRAF proteíny, najmä TRAF2 proteín zapojené priamo alebo nepriamo a tak sa TRAF-, alebo TRAF2 väzbové proteíny môžu považovať ako nepriame modulátory/mediátory všetkých uvedených proteínov a možno aj celého radu ďalších, ktoré sú v spojení s prežívaním bunky, najmä s aktiváciou/indukciou NF-κΒ a s ktorými sa viaže TRAF2 (alebo iné TRAF proteíny), alebo s ktorými TRAF2 (alebo iné TRAF proteíny) vstupujú do interakcie priamym alebo nepriamym spôsobom.

Jedným uskutočnením vynálezu je teda izolovaný polypeptid, ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ, a obsahuje:

a) aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2;

b) aminokyselinovú sekvenciu fragmentu a), ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ;

c) aminokyselinovú sekvenciu analógu a) alebo b), ktorý nemá viac ako desať zmien v aminokyselinovej sekvencií a) alebo b), pričom každá takáto zmena je substitúciou, deléciou alebo inzerciou aminkyseliny, pričom tento analóg sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ; alebo

d) derivát a), b) alebo c), ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ.

Výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka polypeptidu s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO:2.

Predmetom predloženého vynálezu je aj DNA sekvencia kódujúca ktorýkoľvek z definovaných polypeptidov.

Táto izolovaná DNA sekvencia kódujúca polypeptid, ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-B, je vybraná zo skupiny obsahujúcej:

(i) cDNA sekvenciu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:1;

(ii) fragment sekvencie (i), ktorý kóduje polypeptid viažuci sa na TRAF2 a modulujúci aktivitu NF-κΒ;

(iii) DNA sekvenciu schopnú hybridizovať so sekvenciou podľa (i) až (ii) v stredne prísnych podmienkach a kódujúcu polypeptid viažuci sa na TRAF2 a modulujúci aktivitu NF-κΒ; a (iv) akúkoľvek DNA sekvenciu líšiacu sa od sekvencií definovaných v (i) až (iii), ktorá kóduje definovaný polypeptid.

Jedno výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka izolovanej DNA sekvencie, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:1.

Predmetom predloženého vynálezu je aj vektor obsahujúci definovanú DNA sekvenciu. A to vektor, ktorý je schopný exprimovať sa v eukaryotickej hostiteľskej bunke alebo vektor, ktorý je schopný exprimovať sa v prokaryotickej hostiteľskej bunke.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu sú eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky transformované definovaným vektorom.

Predložený vynález sa týka aj spôsobu produkcie TRAF-viažuceho proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógu alebo derivátu, ktorý zahŕňa pestovanie transformovanej hostiteľskej bunky v podmienkach vhodných na expresiu tohto proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógu alebo derivátu, účinnú post-translačnú modifikáciu, ak je to nevyhnutné na získanie tohto proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógu alebo derivátu, izoláciu exprimovaného proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógu alebo derivátu.

Vynález ďalej zahŕňa protilátky alebo ich aktívne fragmenty alebo deriváty, špecifické pre definovaný polypeptid.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie definovaného polypeptidu na moduláciu alebo sprostredkovanie aktivity NF-κΒ, alebo akejkoľvek inej vnútrobunkovej signálnej aktivity modulovanej alebo sprostredkovanej s TRAF2, v bunkách, pričom sa do buniek zavádza jeden alebo viacero týchto polypeptidov vo forme vhodnej na vnútrobunkové zavádzanie, alebo sa do buniek zavádza DNA sekvencia kódujúca jeden alebo viacero takýchto polypeptidov, vo forme vhodného vektora nesúceho túto sekvenciu, ktorý je schopný účinne začleniť túto sekvenciu do buniek spôsobom, pri ktorom sa v bunkách sekvencia exprimuje.

V jednom uskutočnení predloženého vynálezu sa bunka transfekuje s rekombinantným živočíšnym vírusovým vektorom zahŕňajúc nasledujúce kroky:

a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu, ktorá kóduje vírusový povrchový proteín - ligand, schopný viazať sa na špecifický bunkový povrchový receptor na povrchu buniek, ktoré sa majú transfekovať, a druhú sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov, ktoré, keď sa exprimujú v týchto bunkách, sú schopné modulovať/sprostredkovať aktivitu NF-κΒ alebo akúkoľvek inú vnútrobunkovú signálnu aktivitu modulovanú/sprostredkovanú prostredníctvom TRAF2 alebo ostatnými uvedenými molekulami; a

b) infikovanie buniek s vektorom podľa a).

Predmetom predloženého vynálezu je aj použitie definovanej protilátky na modulovanie účinku modulovaného/sprostredkovaného prostredníctvom TRAF2 na bunky, pričom na bunky sa aplikuje vhodný prostriedok obsahujúci tieto protilátky, ich aktívne fragmenty alebo deriváty, pričom keď je TRAF2-väzobný proteín týchto buniek alebo jeho časti exponovaný na extracelulárnom povrchu, prostriedok je formulovaný na extracelulámu aplikáciu, a keď sú TRAF2-väzobné proteíny intraceluláme, prostriedok je formulovaný na intracelulámu aplikáciu.

Vynález zahŕňa aj použitie oligonukleotidovej sekvencie kódujúcej antisense sekvenciu najmenej časti DNA sekvencie, kódujúcej definovaný polypeptid, na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, pričom sa na bunky pôsobí touto oligonukleotidovou sekvenciou, a táto sekvencia je schopná blokovať expresiu TRAF2-väzobného proteínu.

V jednom výhodnou uskutočnení uvedeného použitia sa oligonukleotidová sekvencia zavádza do buniek prostredníctvom rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín - ligand, ktorý je schopný viazať sa na špecifický bunkový povrchový receptor na povrchu buniek, na ktoré sa má pôsobiť, a druhú sekvenciu kódujúcu uvedenú oligonukleotidovú sekvenciu.

Ďalší predmet vynálezu sa týka použitia definovaného polypeptidu na modulovanie TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, pričom sa aplikuje ribozýmový postup, pri ktorom sa vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou uvedený polypeptid, zavádza do buniek vo forme, ktorá umožňuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, a pri exprimovaní ribozýmovej sekvencie v bunkách, táto interaguje s uvedenou bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi túto mRNA sekvenciu, čím inhibuje expresiu TRAF2-väzobného proteínu v bunkách.

Ďalší predmet vynálezu zahŕňa spôsob izolácie a identifikácie definovaného polypeptidu schopného priamo sa viazať na TRAF2, pričom pri tomto spôsobe sa aplikuje kvasinkový dvojhybridný postup, pri ktorom je sekvencia kódujúca TRAF2 nesená jedným hybridným vektorom, a sekvencia z cDNA knižnice alebo z genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom tieto vektory sa potom použijú na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, následne sa extrahuje druhý hybridný vektor na získanie sekvencie kódujúcej protein, ktorý sa viaže na TRAF2.

Predložený vynález ďalej zahŕňa farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, ktorý obsahuje ako účinnú zložku najmenej jeden z definovaných polypeptidov.

Predložený vynález ďalej zahŕňa farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, ktorý obsahuje ako účinnú zložku rekombinantný živočíšny vektor kódujúci protein, ktorý je schopný viazať sa na bunkový povrchový receptor, a kódujúci najmenej jeden z definovaných polypeptidov.

Predložený vynález ďalej zahŕňa farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, ktorý obsahuje ako účinnú zložku oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense sekvenciu mRNA kódujúcej skôr definovaný polypeptid.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie definovaného polypeptidu na výrobu liečiva na prevenciu alebo liečenie patologického stavu asociovaného s NF-κΒ indukciou alebo s akoukoľvek inou aktivitou sprostredkovanou prostredníctvom TRAF2 alebo inými molekulami, na ktoré sa viaže takýto polypeptid, pričom takéto použitie zahŕňa podávanie účinného množstva polypeptidu alebo DNA molekuly, ktorá ho kóduje, pacientovi, ktorý to potrebuje.

Ďalej predložený vynález zahŕňa spôsob skríningu ligandu schopného viazať sa na definovaný polypeptid, ktorý zahŕňa uvedenie afinitnej chromatografickej matrice, na ktorú je pripojený polypeptid, do kontaktu s bunkovým extraktom na naviazanie ligandu na túto matricu, a eluovanie, izoláciu a analýzu ligandu.

Ďalej predložený vynález zahŕňa spôsob skríningu DNA sekvencie kódujúcej ligand schopný viazať sa na definovaný polypeptid, ktorý zahŕňa aplikáciu kvasinkového dvoj hybridného postupu, pri ktorom je sekvencia kódujúca polypeptid nesená jedným hypridným vektorom a sekvencie z cDNA alebo z genomickej DNA knižnice sú nesené druhým hybridným vektorom, transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek týmito vektormi, izoláciu pozitívne transformovaných buniek a extrakciu druhého hybridného vektora na získanie sekvencie kódujúcej uvedený ligand.

Ďalšie výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka spôsobu identifikácie a produkcie molekuly schopnej priamo alebo nepriamo modulovať bunkovú aktivitu modulovanú alebo sprostredkovanú definovaným polypeptidom, pričom tento spôsob zahŕňa:

(a) skríning molekuly schopnej modulovať aktivity modulované/sprostredkované týmto polypeptidom;

(b) identifikáciu a charakterizáciu tejto molekuly; a (c) produkciu molekuly v podstate v izolovenej a purifikovanej forme.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je anti-sense oligonukleotid pozostávajúci zo sekvencie komplementárnej s aspoň časťou mRNA kódujúcej TRAF2-väzobný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2, pričom tento anti-sense oligonukleotid je schopný účinne blokovať transláciu uvedenej mRNA.

Vynález ďalej zahŕňa tiež ďalšie hľadiská a uskutočnenia, ako vyplývajú z ďalej uvedeného podrobného opisu vynálezu.

Treba poznamenať, že tam, kde sa používajú v tomto spise výrazy „modulácia/sprostredkovanie TRAF (alebo TRAF2) účinku na bunky“ a akékoľvek ďalšie špecifické použitia výrazov „modulácia/sprostredkovanie“ sa tieto chápu tak, že zahŕňajú pôsobenie in vitro, ako aj in vivo, a ďalej tiež zahŕňajú inhibíciu alebo zvýšenie/posilnenie.

Vynález sa týka sekvencii DNA, kódujúcich proteíny, ktoré sú schopné väzby k molekule faktora združeného s receptorom nádorového nekrotizujúceho faktora (TRAF); ďalej sa týka nimi kódovaných proteínov.

Vo výhodnom uskutočnení sa vynález týka cDNA sekvencii, označovaných v tomto spise ako kloň 9, kloň 10 a kloň 15 (sú vyznačené v obr. 3a, 4 a 5a), ktoré kódujú pre proteíny schopné väzby k TRAF2; ďalej sa týka proteínov, kódovaných uvedenými sekvenciami.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa vynález týka sekvencie DNA, kódujúcej protein NIK a ďalej aj samotného proteínu NIK.

Uvedené DNA a uvedené odvodené aminokyselinové sekvencie sú nové sekvencie; nenachádzajú sa v bankách údajov DNA alebo aminokyselinových sekvencii „GENEBANK“ alebo v „PROTEIN BANK“.

V rozsahu vynálezu sú tiež zahrnuté fragmenty uvedených sekvencii DNA a sekvencie DNA, schopné hybridizácie na také sekvencie alebo ich časti, ktoré za stredne prísnych podmienok kódujú biologicky aktívny protein, alebo polypeptid, schopný väzby k najmenej 222. až 501. aminokyseline sekvencie faktora TRAF2.

Vynález sa týka tiež sekvencie DNA, ktorá je degenerovaná ako následok genetického kódu na uvedené sekvencie DNA a ktorá kóduje biologicky aktívny protein alebo polypeptid, schopný väzby k najmenej 222. až 501. aminokyseline sekvencie faktora TRAF2.

V spojitosti s TRAF treba poznamenať, že niekoľko členov z receptorovej skupiny TNF/NGF aktivuje transkripčný faktor NF-κΒ priamym alebo nepriamym združením s TRAF2, ktorý je tak adaptorovým proteínom týchto receptorov a môže sa tak považovať tiež za modulátora/sprostredkovateľa indukcie aktivačnej NF-κΒ aktivity týchto TNF/NGF receptorov (pozri schému na obr.2 b). Iný receptor, receptor IL-1, aktivuje NF-κΒ nezávisle od TRAF2. Jedno z uskutočnení výhodného TRAF väzbového proteínu v zhode s týmto vynálezom je NIK proteín, ktorý viaže NIK výnimočne špecifickým spôsobom a stimuluje NF-κΒ aktivitu. NIK je serínová/treonínová kináza, ktorá má sekvenčnú podobnosť s viacerými MAPKK kinázami (bližšie pozri v ďalej uvedených príkladoch). Analógy alebo mutanty NIK, produkované podľa tohto vynálezu (pozri príklady) nemajú - ak sú tieto analógy/mutanty exprimované v bunkách - dostatočnú kinázovú ativitu, ako má NIK a nepostačujú na stimuláciu NF-κΒ aktivácie. Ďalej, ak sú uvedené analógy/mutanty exprimované v bunkách, blokujú tiež s TNFvyvolávanú NF-κΒ indukciu, ako aj indukciu ďalšími indukčné pôsobiacimi látkami, ako je bakteriálny endotoxín FPS, acetát-myristát forbolu (aktivátor proteínovej kinázy C) a HTFV-1 proteín TAX. TNF indukcia aktivity NF-κΒ je cez ktorýkoľvek z dvoch TNF receptorov (receptory TNF p55 a p75), a preto sa usudzuje, že analógy/mutanty NIK blokujú indukciu aktivácie NF-κΒ cez tieto receptory. Podobne, TNF a FAS/APO1 receptorový ligand môžu tiež indukovať NF-κΒ aktivitu cez príbuzný receptor, cez receptor FAS/APO1, ktorého indukcia sa tiež blokuje analógmi/mutantmi NIK. Uvedené receptory navyše majú adaptorové proteíny TRADD, RIP a MORT1, ktoré všetky tiež môžu indukovať NF-κΒ aktivitu, ale ktorých indukcia je tiež blokovaná mutantmi/analógmi NIK. Uvedené mutanty/analógy NIK navyše blokujú tiež IL-1 spôsobovanú NF-κΒ indukciu (prebiehajúcu cez IL-1 receptor). Podľa uvedeného vyplýva, že NIK sa zúčastňuje v kaskáde NF-κΒ indukcie, čo je bežné pri receptoroch skupiny TNF/NGF a pri receptore IL-1. Usudzuje sa, že NIK pôsobí tiež priamo pri indukcii NF-κΒ aktivácie, pravdepodobne zosilnením priamo I-kB fosforylácie. Zo súčasných pozorovaní vyplýva, že uvedené analógy/mutanty NIK, keď sú exprimované v bunkách, tým, že strácajú kinázovú aktivitu (tiež sú označované ako dominantne-negatívne mutanty) neovplyvňujú nijakým spôsobom s TNF indukovanú aktiváciu kinázy Jun; táto skutočnosť poukazuje na to, že MIK pôsobí špecificky na posilnenie fosforylácie I-κΒ bez ovplyvnenia MAP kinázy, ktorá je spojená s fosforyláciou Jun.

Vynález sa teda týka sekvencií DNA, kódujúcich biologicky aktívne TRAF-väzbové proteíny, napríklad TRAF2-väzbové proteíny, ako je napríklad NIK, ako aj jeho analógy, fragmenty a jeho deriváty, a analógy, fragmenty a deriváty proteínov nimi kódované. Príprava uvedených analógov, fragmentov a derivátov je možná bežnými postupmi (pozri napríklad Sambrook et al., (1989)), v ktorých v DNA- kódujúcich sekvenciách možno deletovať jeden alebo viac kodónov, pridať alebo nahradiť inými, aby sa získal kódovaný analóg, ktorý má vzhľadom na prírodný proteín najmenej jeden aminokyselinový zvyšok zmenený. Vhodné analógy sú tie, ktoré si zachovávajú pri najmenšom schopnosť väzby k TRAF2 s, alebo bez sprostredkovania niektorou ďalšou enzymatickou aktivitou, napríklad analógy, ktoré viažu TRAF2, ale neposkytujú signál, čo znamená neviažu sa k ďalšiemu proteínu v smere alebo k ďalšiemu faktoru, alebo nekatalyzujú signálne závislú reakciu. Týmto spôsobom sa môžu pripraviť analógy, ktoré majú takzvaný dominatne-negatívny účinok, menovite analóg, ktorý je nedostatočný buď vo väzbe k TRAF2, alebo v následnej signalizácii po takej väzbe. Také analógy možno napríklad použiť na inhibíciu účinkov CD40, p55 TNF ap75 TNF (FAS/APO1 a ďalších príbuzných receptorových účinkov, ako aj ovplyvnené sprostredkovanie rôznymi, s receptormi združenými, proteínmi (adaptory), ako už bolo uvedené, v porovnaní s prírodnými TRAF2-väzbovými proteínmi. Obdobne možno pripraviť takzvané dominantne-pozitívne analógy, ktoré môžu slúžiť na posilnenie účinku TRAF2. Tieto majú rovnaké alebo lepšie TRAF2-väzbové vlastnosti a rovnaké alebo lepšie signálne vlastnosti ako prírodné TRAF2-väzbové proteíny. Obdobným spôsobom, možno pripravovať biologicky aktívne fragmenty klonov podľa tohto vynálezu, ako sa uvádza v súvislosti s prípravou analógov. Vhodné fragmenty sekvencií DNA podľa tohto vynálezu sú tie, ktoré kódujú proteín alebo polypeptid, uchovávajúci TRAF2väzbovú schopnosť, alebo ktorý môže sprostredkovať akúkoľvek inú väzbovú alebo enzymatickú aktivitu, ako sa uvádzajú. Podľa uvedeného sa môžu pripraviť fragmenty kódovaných proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré majú dominantne-negatívny alebo dominantne-pozitívny účinok, ako sa uviedlo pri analógoch. Podobne sa môžu pripraviť deriváty v odbore dobre známymi spôsobmi bežnou modifikáciou vedľajších skupín jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov proteínov, ich analógov alebo fragmentov, alebo združením proteínov, ich analógov alebo fragmentov s inou molekulou, napríklad s molekulou protilátky, enzýmu, receptora a podobne.

K uvedeným sekvenciám DNA podľa tohto vynálezu, ktoré kódujú TRAF-väzbový proteín (napríklad TRAF2-väzbový proteín, ako je napríklad NIK), jeho izoformu, analóg, fragment alebo jeho derivát sa ako uskutočnenie tohto vynálezu tiež zahŕňa sekvencia DNA, schopná hybridizácie s cDNA sekvenciou, odvodenou z kódujúcej oblasti prírodného TRAF-väzbového proteínu, v ktorom sa vykoná hybridizácia v stredne prísnych podmienkach, a ktorého hybridizovateľné sekvencie kódujú biologicky aktívny TRAF-väzbový proteín. Uvedené hybridizovateľné sekvencie DNA preto zahŕňajú sekvencie DNA, ktoré majú pomerne vysokú homológiu s cDNA sekvenciou prírodných TRAF-väzbových proteínov (napríklad cDNA sekvencia TRAF28 väzbového proteínu, ako je napríklad cDNA sekvencia NIK-u) a samy osebe predstavujú sekvencie, podobné TRAF-väzbovým proteínom, ktoré môžu byť odvodené napríklad z prírodných sekvencií, kódujúcich rôzne TRAF-väzbové proteínové izoformy, alebo v prírode sa nachádzajúce sekvencie kódujúcich proteínov, ktoré majú aktivitu TRAF-väzbových proteínov (napríklad TRAF2-väzbového proteínu, ako je napríklad NIK). Ďalej, tieto sekvencie môžu tiež zahŕňať napríklad v prírode sa nenachádzajúce synteticky pripravené sekvencie, ktoré sú podobné prírodnej TRAF-väzbovej proteínovej cDNA sekvencií, ale majú zabudované niekoľko vhodných modifikácií. Uvedené syntetické sekvencie preto zahŕňajú všetky možné kódujúce sekvencie analógov, fragmentov a derivátov TRAF-väzbových proteínov (napríklad TRAF2 väzbové proteíny, ako je napríklad NIK), ktoré majú aktivitu TRAF-väzbových proteínov.

Na získanie rôznych, skôr uvedených, v prírode sa nachádzajúcich sekvencií podobných TRAF-väzbovým proteínom sa môžu použiť v odbore bežné spôsoby skríningu a izolácie prírodných DNA alebo RNA vzoriek z rôznych tkanív s použitím prírodnej cDNA prírodného TRAF-väzbového proteínu, alebo jeho časti ako sondy (pozri napríklad bežné spôsoby, uvádzané v Sambrook et al., (1989)).

Podobne na prípravu uvedených syntetických sekvencií, podobných TRAF-väzbovým proteínom, kódujúcich analógy, fragmenty alebo deriváty TRAF-väzbových proteínov (napríklad TRAF2-väzbový proteín, ako je napríklad NIK), sa môže použiť celý rad bežných spôsobov, ako sa podrobnejšie uvádzajú v ďalšom texte, ktorý sa týka prípravy takých analógov, fragmentov a derivátov.

Polypeptid alebo proteín, „v podstate zodpovedajúci“ TRAF-väzbovému proteínu zahŕňa nielen TRAF-väzbový proteín, ale aj polypeptidy alebo proteíny, ktoré sú analógmi TRAF-väzbového proteínu.

Analógy, ktoré v podstate zodpovedajú TRAF-väzbovému proteínu, sú tie polypeptidy, v ktorých jedna alebo viac aminokyselín aminokyselinových sekvencií TRAF-väzbového proteínu bolo nahradených inou aminokyselinou, deletovaných a/alebo inzertovaných, za predpokladu, že výsledný proteín má v podstate rovnakú alebo vyššiu biologickú aktivitu ako TRAF-väzbový proteín, ktorému zodpovedá.

Aby sekvencia TRAF-väzbových proteínov, ako sú izoformy, v podstate zodpovedala TRAF-väzbovému proteínu, zmeny v sekvencií sú vo všeobecnosti pomerne malé. Hoci počet zmien môže byť viac ako desať, výhodné je, ak ich počet nebude viac ako desať, výhodnejšie nie viac ako päť a najvýhodnejšie nie viac ako tri zmeny. Na vyhľadávanie potenciálne biologicky aktívnych proteínov, ktoré v podstate zodpovedajú TRAF-väzbovým proteínom, možno použiť ktorúkoľvek techniku; jednou z uvedených techník je bežná mutagenézna technika na DNA, kódujúcej proteín. Uvedenými klonmi exprimované proteíny sa potom môžu vytriediť podľa ich schopnosti viazať sa k TRAF proteínom (napríklad TRAF2) a podľa modulácie aktivity TRAF proteínu (napríklad TRAF2) pri modulácii/sprostredkovaní intracelulámych dráh, ako sa uvádza skôr.

„Konzervatívne“ zmeny sú také zmeny, pri ktorých sa neočakáva, že zmenia aktivitu proteínu a sú zvyčajne prvé pri skríningu, pretože sa pri nich nepredpokladá zmena veľkosti, náboja alebo konfigurácie proteínu a tak sa neočakáva, že by zmenili jeho biologické vlastnosti.

Konzervatívne substitúcie TRAF-väzbových proteínov zahŕňajú analóg, v ktorom najmenej jeden aminokyselinový zvyšok bol konzervatívne nahradený inou aminokyselinou. Takéto substitúcie sa výhodne vykonajú v zhode so zoznamom, ako je uvedený v tabuľke IA; uvedené substitúcie môžu byť určené bežným experimentálnym postupom tak, aby poskytli modifikované štruktúrne a funkčné vlastnosti syntetizovanej polypeptidovej molekuly, ale aby sa zachovala biologická aktivita, charakteristická pre TRAF-väzbový proteín.

TabuľkaIA

Pôvodný zvyšok	Príklad substitúcie	Pôvodný zvyšok	Príklad substitúcie	Pôvodný zvyšok	Príklad substitúcie
Ala	Gly; Ser	Gly	Ala;Pro	Ser	Thr
Arg	Lys	His	Asn;Gln	Thr	Ser
Asn	Gln;His	íle	Leu;Val	Trp	Tyr
Asp	Glu	Leu	Ile;Val	Tyr	Trp;Phe
Cys	Ser	Lys	Arg;Gln;Glu	Val	Ile;Leu
Gin	Asn	Met	Leu;Tyr;Ile
Glu	Asp	Phe	Met;Leu;Tyr

Inou skupinou substitúcií TRAF-väzbového proteínu sú voliteľne také substitúcie, v ktorých najmenej jeden aminokyselinový zvyšok polypeptidu bol odstránený a na jeho miesto bol vložený iný zvyšok v zhode s tabuľkou IB. Možné typy substitúcií v polypeptide môžu byť založené na analýze frekvencií aminokyselinových zmien medzi homológnym proteínom iného druhu, ako sú proteíny uvedené v tabuľke 1-2 v knihe Schulza et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, (1988) a na obrazoch 3 až 9 v knihe Creightona, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francis9 co, C A (1983). Na základe takýchto analýz sú tu určené voliteľné konzeravtívne substitúcie ako výmeny v rámci jednej z nasledujúcich piatich skupín.

Tabuľka IB

Skupina	Substitujúce zvyšky
1	nízke alifatické, nepoláme alebo slabo poláme zvyšky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2	Poláme zvyšky s negatívnym nábojom a ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin
3	Poláme zvyšky s kladným nábojom: His, Arg, Lys
4	vyššie alifatické nepoláme zvyšky: Met, Leu, Ue, Val (Cys)
5	Veľké aromatické zvyšky: Phe, Tyr, Trp

Tri aminokyselinové zvyšky uvedené v Tab. IB v zátvorkách majú špeciálnu úlohu v architektúre proteínov. Gly je jediný proteín, ktorý nemá vedľajší reťazec a tak jeho reťazec je značne flexibilný. To však vedie k podpore vzniku inej sekundárnej štruktúry, ako je α-závitovka. Pro silne obmedzuje reťazec pre jeho nezvyčajnú geometriu a vo všeobecnosti má snahu podporovať podobné ako β-otáčavé štruktúry, hoci Cys v niektorých prípadoch môže byť schopný sa zúčastňovať na vzniku disulfidovej väzby, ktoré je dôležitá pri skladaní proteínov. Upozorňujeme, že Schulz et al., ibid, spája uvedené skupiny I a 2. Treba tiež poznamenať, že Tyr má pre jeho potenciál vytvárať vodíkovú väzbu .významnú príbuznosť s Ser a Thr a ďalšími.

Konzervatívne aminokyselinové substitúcie podľa tohto vynálezu, napríklad ako sa uvádzajú skôr, sú v odbore známe a prepokladá sa, že aj po amino-kyselinovej substitúcii zachovávajú biologické a štruktúrne vlastnosti polypeptidu. Väčšina delécií a substitúcií podľa tohto vynálezu sú také, pri ktorých nenastávajú radikálne zmeny v charaktere proteínovej alebo polypeptidovej molekuly. „Charakter“ je definovaný neinkluzívnym spôsobom aby definoval aj zmeny v sekundárnej štruktúre, napríklad α-závitovku alebo β-list, ako aj zmeny v biologickej aktivite, napríklad vo väzbovosti k TRAFproteínom a /alebo v sprostredkovaní TRAF-proteínového účinku na smrť buniek.

Príklady uskutočnení aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré možno použiť na prípravu analógov TRAF-väzbových proteínov na použitie podľa tohto vynálezu zahŕňajú ktorékoľvek známe reakčné kroky, ako sú uvádzané v patente USA RE 33 653, 4 959 314, 4 588 585 a 4 737 462 od Marka et al.; 5 116 943 od Kothsa et al.; 4 965 195 od Namena et al.; 4 879 111 od Chonga et al., a 5 017 691 od Lee et al; a lyzínom substituované proteíny, uvádzané v patente USA 4 904 584 (Shaw et al.).

Popri skôr diskutovaných konzervatívnych substitúciách, ktoré nemenia významne aktivitu TRAF-väzbového proteínu, sú v rozsahu tohto vynálezu zahrnuté tiež konzervatívne substitúcie alebo menej konzervatívne a viac náhodné zmeny, ktoré vedú k zvýšeniu biologickej aktivity analógov TRAF-väzbových proteínov.

Na potvrdenie presného účinku substitúcie alebo delécie odborník v danom odbore uznáva, že účinok substitúcie (substitúcií), delécie (delécií) a podobných zmien sa hodnotí bežnými väzbovými pokusmi s vyhodnocovaním prežitia a smrti buniek. Skríning pomocou uvedených postupov nevyžaduje nepotrebné experimentovanie.

Na genetickej úrovni sa uvedené analógy vo všeobecnosti pripravia polohovo-usmemenou mutagenézou nukleotidov v DNA, kódujúcej TRAF-väzbový proteín, pričom sa produkuje DNA, kódujúca uvedený analóg; potom sa syntetizuje DNA a exprimuje polypeptid v rekombinantnej bunkovej kultúre. Uvedené analógy typicky vykazujú kvalitatívne rovnakú alebo vyššiu biologickú aktivitu ako proteíny, vyskytujúce sa v prírode (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; Sambrook et al., Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)).

Príprava TRAF-väzbových proteínov v zhode s uvedenou alebo voliteľnou nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou rovnaký polypeptid, ale odlišujúcich sa od prírodnej sekvencie v dôsledku zmien umožnených známym degenerovaním genetického kódu sa môže uskutočniť polohovo-špecifickou mutagenézou DNA, ktorá kóduje vopred pripravený analóg alebo prírodnú verziu TRAF-väzbového proteínu. Polohovo-špecifická mutagenéza umožňuje produkciu analógov použitím špecifických oligonukleotidových sekvencii, ktoré kódujú sekvenciu DNA vyžadovanej mutácie, ako aj dostatočný počet susedných nukleotidov, čím sa získa sekvencia primeru dostatočnej veľkosti a sekvenčnej úplnosti, aby vytvárala stabilný duplex priečne na obidvoch stranách delečného spoja. Výhodná dĺžka primeru je typicky okolo 20 až 25 nukleotidov, s približne 5 až 10 komplementárnymi nukleotidmi na každej strane zmenenej sekvencie. Vo všeobecnosti je technika polohovo-špecifickej mutagenézy v odbore dobre známa, čo možno uviesť na príklade publikácií, ako je Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), ktorej zverejnenie sa tu zahŕňa týmto odkazom.

Technika polohovo-špecifickej mutagenézy typicky využíva fágový vektor, ktorý jestvuje v obidvoch formách: jednovláknovej aj dvojvláknovej forme. Typické vektory, ktoré sú užitočné pri polohovo usmeme10 nej mutagenéze zahŕňajú napríklad fág M13, čo zverejnil Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Ed.: Walton A., Elsevier, Amsterdam (1981); táto publikácia sa zahŕňa týmto odkazom. Tieto fágy sú komerčne ľahko dostupné a ich použitie je všeobecne dobre známe odborníkom v danej oblasti. Voliteľne sa na prípravu jednovláknových DNA môžu použiť plazmidové vektory, ktoré obsahujú jednovláknový fágový replikačný začiatok (Veira et al., Meth. Emzymol. 153. 3 (1987)).

Vo všeobecnosti sa v zhode s doteraz uvedeným môže polohovo usmernená mutagenéza vykonať najprv získaním jednovláknového vektora, ktorý zahŕňa v rámci jeho sekvencie sekvenciu DNA, ktorá kóduje relevantný polypeptid. Automatizovanou DNA/nukleotidovou syntézou sa synteticky pripraví oligonukleotidový primér, ktorý nesie vyžadovanú mutantnú sekvenciu. Tento primér sa potom spracuje s vektorom, obsahujúcim jednovláknovú proteínovú sekvenciu a na dokončenie syntézy vlákna s mutáciou sa vystaví účinku DNA-polymerizujúcich enzýmov, ako je Klenow fragment polymerázy I E. coli. Mutantná sekvencia a druhé vlákno nesú vyžadovanú mutáciu. Tento heteroduplexný vektor sa potom použije na transformáciu vhodných buniek, ako sú bunky JM 101 E. coli; selektujú sa klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory, ktoré sú nositeľmi mutantných usporiadaní sekvencii.

Mutantná sekvencia TRAFG-väzbového proteínu sa po selekcii klonu môže odobrať a vložiť do príslušného vektora, všeobecne do prenosového alebo expresného vektora takého typu, ktorý sa môže použiť na transfekciu vhodného hostiteľa.

Použitím známych DNA alebo RNA amplifikačných techník, ako je PCR a oligonukleotidová syntéza možno in vitro, in situ a/alebo in vivo tiež detegovať, pripraviť a/alebo modifikovať génovú alebo nukleovú kyselinu, kódujúcu pre TRAF-väzbový protein. PCR umožňuje amplifikáciu špecifických sekvencii opakovaním DNA polymerázových reakcií. Tieto reakcie sa môžu použiť ako náhrada klonovania; všetko, čo na to treba, je znalosť sekvencie nukleových kyselín. Na vykonanie PCR sa označili priméry, ktoré sú komplementárne k predmetnej sekvencii. Uvedené priméry sa potom ďalej generovali automatizovanou DNA syntézou. Nakoľko sa priméry môžu označiť tak, aby hybridizovali ktorúkoľvek časť génu, podmienky sa vyberú tak, aby sa mohli tolerovať nesúlady (mismatches) v párovaní komplementárnych báz. Amplifikácia týchto nesúladných oblastí môže viesť k syntéze mutagenizovaných produktov, ktorých výsledkom je generácia peptidu s novými vlastnosťami (polohovo usmernená mutagenéza). Pozri tiež napríklad Ausubel, ibid, Ch. 16. Ako východiskový materiál na syntézu extracelulámej domény prolaktínového receptora bez klonovania možno tiež použiť RNA, ak sa spojí syntéza komplementárnej DNA (cDNA) s použitím reverznej transkriptázy, s PCR.

Priméry PCR sa ďalej môžu vyznačiť tak, aby zahŕňali nové reštrikčné miesta, alebo ďalšie znaky, ako sú terminačné kodóny na koncoch amplifikovaného génového segmentu. Umiestenie reštrikčných miest na 5 'a 3' koncoch amplifikovanej génovej sekvencie umožňuje, aby génové segmenty, kódujúce TRAF-väzbový protein, alebo jeho fragment, boli vo vektoroch ako zvyčajne použiteľné na ligáciu ďalších sekvencii a/alebo klonovacích miest.

PCR a ďalšie spôsoby amplifikácie RNA a/alebo DNA sú v odbore dobre známe a môžu sa bez nadmerného experimentovania použiť v zhode s týmto vynálezom, s využitím usmernenia a návodov z tohto textu. Známe spôsoby amplifikácie DNA alebo RNA zahŕňajú, ale nie sú na uvedené obmedzené, polymerázovú reťazcovú reakciu (PCR) a príbuzné amplifikačné postupy (pozri napríklad patenty USA 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159, 4 965 188 od Mullisa et al.; 4 795 699 a 4 921 794 od Tabora et al.; 5 142 033 od Innisa; 5 122 464 od Wilsona et al.; 5 091 310 od Innisa; 5 066 584 od Gyllenstena et al.; 4 889 818 od Gelfanda et al.; 4 994 370 od Silvera et al.; 4 766 067 od Biswasa; 4 656 134 od Ringolda; a Innis et al., Eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA sprostredkovanú amplifikáciu, ktorá využíva protismemú RNA na terčovú sekvenciu ako templát na syntézu dvojvláknovej DNA (patent USA 5 130 238 od Maleka et al., s obchodným názvom NASBA); a imuno-PCR, ktorá kombinuje použitie DNA amplifikácie s protilátkovým značením (Ružička et al., Science 260. 487 (1993); Sano et al., Science 258. 120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9, 1378 (1991)); obsah uvedených patentov a literatúry sa v celosti zahŕňa týmto odkazom.

Obdobným spôsobom, ako sa uvádza skôr pre analógy TRAF-väzbových proteínov sa môžu pripraviť biologicky aktívne fragmenty TRAF-väzbových proteínov (napríklad niektorých z TRAF2-väzbových proteínov, ako je napríklad NIK, alebo jeho izoformy). Vhodné fragmenty TRAF-väzbových proteínov sú také, ktoré si uchovávajú väzbovú schopnosť TRAF-väzbových proteínov a ktoré môžu priamo alebo nepriamo sprostredkovať biologickú aktivitu TRAF proteínov alebo iných proteínov, združených s proteínmi TRAF. Podľa uvedeného sa môže pripraviť fragment TRAF väzbového proteínu, ktorý má dominantne negatívny alebo dominantne pozitívny účinok, obdobne ako sa uvádza skôr pre analógy. Treba poznamenať, že tieto fragmenty predstavujú podľa tohto vynálezu osobitnú skupinu analógov; sú definované ako časti TRAF-väzbových proteínov, odvodených z úplných sekvencii TRAF-väzbových proteínov (napríklad z niektorého z TRAF2-väzbových proteínov, napríklad z NIK alebo jeho izoforiem), každá taká časť či fragment má každú z uvedených vyžadovaných aktivít. Takým fragmentom môže byť napríklad peptid.

Podobne, sa môžu pripraviť deriváty bežnými modifikáciami vedľajších skupín jednej alebo viacerých aminokyselinových zvyškov TRAF-väzbového proteínu, jeho analógov alebo fragmentov, alebo spojením TRAF-väzbového proteínu, jeho analógov alebo fragmentov s ďalšou molekulou, napríklad protilátky, enzýmu, receptora a podobne, spôsobmi, ktoré sú v odbore dobre známe. Výraz „deriváty“ sa v tomto texte používa tak, že zahŕňa deriváty, ktoré sa môžu pripraviť z funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú na vedľajších reťazcoch zvyškov, alebo na terminálnych N- alebo C- skupinách, spôsobmi, ktoré sú v odbore známe a ktoré sa zahŕňajú do tohto vynálezu. Deriváty môžu mať chemickú stavbu glycidových alebo fosfátových zvyškov za predpokladu, že také zoskupenia majú rovnakú alebo vyššiu biologickú aktivitu, ako je aktivita TRAF-väzbových proteínov.

Deriváty môžu napríklad zahŕňať alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín, pripravené reakciou s amoniakom alebo s primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, N-acylderváty alebo voľné amínové skupiny aminokyselinových zvyškov vytvorené s acylovými zoskupeniami (napríklad alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny), alebo O-acyl deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylové alebo treonylové zvyšky), vytvorené s acylovými zoskupeniami.

Výraz „derivát“ je mienený tak, že zahŕňa iba tie deriváty, v ktorých sa nezamieňa jedna aminokyselina za inú z dvadsiatich bežne sa vyskytujúcich prírodných aminokyselín.

TRAF-väzbový proteín je proteín alebo polypeptid, to znamená sekvencia aminokyselinových zvyškov. Polypeptid obsahujúci väčšiu sekvenciu, ktorá zahŕňa úplnú sekvenciu TRAF-väzbového proteínu, v zhode s definíciami v tomto vynáleze, sa tiež považuje za zahrnutý vo význame takého polypeptidu potiaľ, pokiaľ jeho zväčšenie neovplyvňuje základné a nové vlastnosti podľa tohto vynálezu, to znamená, ak buď zachováva alebo zvyšuje biologickú aktivitu TRAF-väzbového proteínu, alebo môže byť štiepený na proteín alebo polypeptid s biologickou aktivitou TRAF-väzbového proteínu. Potom napríklad sa rozumie, že tento vynález zahŕňa fúzové proteíny TRAF-väzbového proteínu s ďalšími aminokyselinami alebo peptidmi.

Ako už bolo uvedené, uvedený výraz „TRAF-väzbové“proteíny treba chápať tak, že podľa tohto vynálezu sú to akékoľvek proteíny, ktoré môžu viazať a intraceluláme sprostredkovať/modulovať aktivitu ktoréhokoľvek TRAF proteínu. Konkrétne príklady sú TRAF2-väzbové proteíny, ktoré môžu modulovať alebo sprostredkovať s TRAF2 združenú intracelulámu signálnu aktivitu, ako sa uvádza, najmä pokiaľ sa týka účasti TRAF2 v indukcii NF-κΒ aktivity, konkrétne interakciou medzi TRAF2 a rôznymi členmi skupiny TNF/NGF receptorov a/alebo s nimi združenými adaptorovými proteínmi, ako sa podrobnejšie uvádza aj v ďalšom texte. Špecifickým príkladom uvedených TRAF2-väzbových proteínov je proteín NIK a jeho rôzne analógy, fragmenty a ďalšie (pozri príklady), ktorý sa javí ako vysoko špecifický pri väzbe TRAF2 a ako priamo pôsobiaci pri indukcii NF-κΒ aktivity, s rôznymi NIK dominantne negatívnymi analógmi/mutantmi, blokujúcimi uvedenú aktivitu.

Všetky uvedené modifikácie sú v rozsahu tohto vynálezu za predpokladu, že si uchovávajú schopnosť kódovať proteíny alebo polypeptidy, alebo ich analógy a ich deriváty na väzbu k najmenej 222. až 501. aminokyseline sekvencie TRAF2.

Všetky proteíny a polypeptidy podľa tohto vynálezu sa vďaka ich účinnej schopnosti väzby k TRAF2 považujú za mediátory alebo modulátory signalizácie TRAF2. Uvedené molekuly podľa tohto vynálezu samy osebe majú úlohu napríklad v signálnom procese, v ktorom viazanie TRAF2 ligandu k CD30, CD40, lymfotoxí-novému beta (LT-β) receptoru, p55 alebo p75 receptorom, ako aj ďalším receptorom a adaptorovým proteínom, uvedeným skôr, vedie k aktivácii transkripčného faktora NF-κΒ. Zaujímavý je najmä proteín NIK a čiastkový proteín NIK, kódovaný klonom 10 podľa tohto vynálezu; podrobná sekvenčná analýza NIK a tohto vynájdeného klonom 10 kódovaného proteínu (pôvodne označeného NMPI) objasnila kódované aminokyselinové sekvencie, zodpovedajúce I. až XI. konzervatívnym zoskupeniam, charakteristickým pre Ser/Thr proteínové kinázy, a tak určila funkciu tohto proteínu.

Nové klony proteínov, ich analógov, fragmentov a derivátov majú množstvo možných použití, napríklad:

(i) môžu sa použiť na zníženie alebo zvýšenie aktivity NF-κΒ, funkcie TRAF2 a receptorov, ku ktorým sa viažu, v situáciách, keď je vyžadovaná zvýšená ich funkcia; to nastáva napríklad pri protinádorových alebo imunostimulačných aplikáciách, keď sa vyžadujú vplyvy, indukované účinkom TRAF2. V tomto prípade sa môžu proteíny podľa tohto vynálezu, ich analógy, fragmenty alebo deriváty, ktoré zvyšujú účinky TRAF2 alebo receptorov, vložiť do buniek bežnými spôsobmi, známymi per se. Napríklad, ak proteíny kódované DNA klonmi podľa tohto vynálezu sú intraceluláme a majú byť vložené iba do buniek, v ktorých sa vyžaduje účinok TRAF2, potom je nevyhnutný systém na špecifické vloženie týchto proteínov do buniek. Jeden spôsob, ako to dosiahnuť, je vytvorenie rekombinantného živočíšneho vírusu, napríklad vírusu odvodeného z Vaccinia·, do jeho DNA sa vložia dva gény: gén, kódujúci ligand, ktorý sa špecificky viaže k proteínom povrchu bunky, exprimovaný bunkami, ako je napríklad gpl20 proteín vírusov AIDS (HIV), ktorý sa špecificky viaže k niektorým bunkám (k CD4 lymfocytom a príbuzným leukémiám) alebo akýkoľvek iný ligand, ktorý sa špecificky viaže k bunkám, ktoré sú nositeľmi receptora, ktorý viaže TRAF2 tak, že rekombinantný vírusový vektor bude schopný väzby s uvedenými bunkami; a gén, kódujúci proteíny podľa tohto vynálezu. Expresia proteínu viažuceho sa na povrch bunky potom na povrchu vírusu špecificky zasiahne vírus v nádorovej bunke alebo v inej bunke nesúcej receptor; potom sa proteíny kódujúce sekvencie vložia do buniek cez vírus a po expresii v bunkách je výsledkom zosilnenie receptora alebo účinku TRAF2, čo vedie k vyžadovanému imunostimulačnému účinku v týchto bunkách. Konštrukcia uvedených rekombinantných živočíšnych vírusov sa vykoná bežnými spôsobmi (pozri napríklad Sambrook et al., (1989)). Iná možnosť je vložiť sekvenciu kódovaných proteínov vo forme oligonukleotidov, ktoré môžu byť absorbované bunkami a v nich exprimované.

(ii) Môžu sa použiť na inhibíciu NF-κΒ aktivity, účinkov TRAF2 alebo receptora, ktorý ho viaže, napríklad v prípadoch poškodenia tkaniva, ako je AIDS, septický šok alebo odmietavá reakcia hostiteľa proti štepu, pri ktorej sa vyžaduje blokovať vyvolanú intracelulámu signalizáciu. V tejto situácii možno napríklad vložiť bežnými spôsobmi do buniek oligonukleotidy, ktoré majú protismemú kódujúcu sekvenciu proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré budú účinne blokovať transláciu mRNA, kódujúcich proteíny a tým blokovať ich expresiu, ktorá vedie k inhibícii nežiaduceho účinku. Alternatívne sa môžu použiť ďalšie oligonukleotidy; oligonukleotidy, ktoré si zachovávajú svoju schopnosť väzby k TRAF2 takým spôsobom, že interferujú s väzbou molekúl k uvedenému proteínu, zatiaľ čo súčasne nesprostredkúvajú nijakú aktiváciu alebo moduláciu tejto molekuly. Uvedené molekuly s týmito vlastnosťami môžu rušiť interakciu TRAF2 s jeho prirodzeným ligandom, a preto môžu pôsobiť ako inhibítory, schopné odstraňovať vplyvy sprostredkované TRAF2, ako je napríklad aktivácia NF-κΒ. Uvedené oligonukleotidy sa môžu do buniek vložiť použitím uvedeného prístupu s rekombinantným vírusom, druhá sekvencia nesená vírusom je potom oligonukleotidová sekvencia.

Ďalšia možnosť je použitie protilátok, špecifických k proteínom podľa tohto vynálezu, na inhibíciu ich intracelulámej signálnej aktivity.

Ešte ďalší spôsob inhibície nežiaducich účinkov je nedávno vyvinutým ribozýmovým prístupom. Ribozýmy sú katalytické RNA molekuly, ktoré sú schopné špecificky štiepiť RNA. Ribozýmy môžu byť zostrojené tak, aby štiepili cieľové RNA podľa výberu, napríklad mRNA kódujúce proteíny podľa tohto vynálezu. Ribozýmy majú mať sekvenciu špecifickú pre mRNA proteínov a majú byť schopné vstupovať s nimi do interakcie (komplemntáma väzba), potom nasleduje štiepenie mRNA, čoho výsledkom je zníženie (alebo úplná strata) expresie proteínov; úroveň poklesu expresie bude závislá od úrovne ribozýmovej expresie v terčových bunkách. Na zavedenie ribozýmov do vybraných buniek (napríklad do buniek, ktoré nesú TRAF2-väzbové proteíny) sa môže použiť ktorýkoľvek vhodný vektor, napríklad plazmid, živočíšne vírusové (retrovirus) vektory, ktoré sa zvyčajne používajú na tento účel (pozri tiež odsek (i), kde vírus má ako druhú sekvenciu cDNA, kódujúcu vybranú ribozýmovú sekvenciu). (Prehľadné práce, spôsoby a podobné, pozri Chen et al., (1992); Zhao a Pick, (1993)).

(iii) Môžu sa použiť na izoláciu, identifikáciu a klonovanie ďalších proteínov, ktoré sú schopné ich viazať, napríklad ďalších proteínov, ktoré sú v smere TRAF2 a sú zapojené do intracelulámeho signálneho procesu. DNA sekvencie, kódujúce proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu napríklad použiť v kvasinkových dvoj-hybridných systémoch v ktorých sa uvedené kódované proteíny môžu použiť ako „návnada“ („bait“) na izoláciu, klonovanie a identifikáciu ďalších sekvencii („koristí“ („preys“) kódujúcich proteínov z cDNA knižnice alebo genómovej knižnice, ktoré sa môžu viazať ku klonovým proteínom. Rovnakým spôsobom sa môže tiež stanoviť, či sa proteíny podľa tohto vynálezu môžu viazať k ďalším bunkovým proteínom, napríklad k ďalším receptorom skupiny TNF / NGF receptorov.

(iv) Uvedené kódované proteíny, ich analógy, fragmenty alebo ich deriváty sa môžu použiť tiež na izoláciu, identifikáciu a klonovanie ďalších proteínov z rovnakej skupiny proteínov, to znamená proteínov, ktoré sa viažu k TRAF2 alebo k funkčne príbuzným proteínom a sú zapojené v intracelulámom signálnom procese. Pri tomto použití sa môže použiť už uvedený kvasinkový dvojhybridný systém, alebo sa môže použiť nedávno vyvinutý systém, využívajúci nestringentnú hybridizáciu Southemovým prenosom s nasledujúcim PCR klonovaním (Wilks et al. (1989)).

(v) Ďalší prístup k využití uvedených kódovaných proteínov podľa tohto vynálezu, ich analógov, fragmentov alebo ich derivátov je ich použitie v postupoch afinitnej chromatografie na izoláciu a identifikáciu iných proteínov alebo faktorov, ku ktorým sú schopné sa viazať, napríklad na izoláciu a identifikáciu proteínov príbuzných k TRAF2 alebo iných proteínov alebo faktorov, zapojených do intracelulámeho signálneho procesu. Pri tomto použití sa proteíny, ich analógy, fragmenty alebo ich deriváty podľa tohto vynálezu môžu jednotlivo naviazať na afinitne chromatografickú matricu a potom priviesť do styku s bunkovými extraktmi alebo izolovanými proteínmi alebo faktormi, považovanými za také, ktoré sú zapojené do intracelulámeho signálneho procesu. Po rozdelení afinitnou chromatografiou sa uvedené iné proteíny, ich analógy, fragmenty alebo deriváty podľa tohto vynálezu môžu eluovať, izolovať a charakterizovať.

(vi) Ako už bolo uvedené, uvedené proteíny, ich analógy, fragmenty alebo ich deriváty podľa tohto vynálezu môžu sa použiť tiež ako imunogény (antigény) na produkciu k nim špecifických protilátok. Tieto protilátky sa môžu použiť tiež na čistenie proteínov podľa tohto vynálezu buď z bunkových extraktov, alebo z transformovaných bunkových línií, ktoré produkujú uvedené proteíny, ich analógy alebo ich fragmenty. Tieto protilátky možno ďalej použiť na diagnostické účely na identifikáciu porúch spojených s abnormálnymi funkciami receptorového systému, pri ktorých ich spôsobujú, napríklad, hyperaktívne alebo hypoaktívne, s TRAF2 indukované, činnosti bunky. Ak uvedené poruchy môžu súvisieť so zle pracujúcim intracelulámym signálnym systémom, v ktorom sú zapojené proteíny z tohto vynálezu, tak uvedené protilátky budú slúžiť ako významný diagnostický prostriedok. Výraz „protilátka“ sa používa v takom význame, že zahŕňa polyklonové protilátky, monoklonové protilátky (mAbs), chimérové protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky k protilátkam, ktoré môžu byť značené v rozpustnej alebo viazanej forme, ako aj ich fragmenty, ako sú napríklad Fab a F(ab')2-fragmenty bez Fc fragmentu úplnej protilátky, ktoré sú schopné viazať antigén.

(vii) Uvedené protilátky vrátane fragmentov protilátok, ktoré sú užitočné v tomto vynáleze sa môžu použiť na kvantitatívne stanovenie a kvalitatívny dôkaz klonov z tohto vynálezu vo vzorke, alebo na dôkaz prítomnosti buniek, ktoré exprimujú uvedené klony z tohto vynálezu. Môže sa to vykonať imuno-fluorescenčnými technikami, využívajúcimi fluorescenčné značenú protilátku v spojení s detekciou pomocou svetelnej mikroskópie, prietočnou cytometriou alebo fluorometricky.

Uvedené protilátky (alebo ich fragmenty), užitočné v tomto vynáleze, sa môžu využiť histologický, ako napríklad v imunofluorescencii alebo v imunoelektrónovej mikroskópii, na detekciu in situ klonov podľa tohto vynálezu. Detekcia in situ sa môže vykonať odobratím histologickej vzorky pacienta a dodaním značenej protilátky podľa tohto vynálezu do uvedenej vzorky. Uvedená protilátka ( alebo jej fragment) sa výhodne dodáva nanesením alebo prevrstvením značenej protilátky (alebo fragmentu) na biologickú vzorku. Použitím uvedeného postupu možno stanovovať nielen prítomnosť určitých klonov, ale tiež ich rozdelenie na skúšanom tkanive. Pri používaní tohto vynálezu si bežne skúsení odborníci v danej oblasti uvedomia, že každý z početných rozdielnych histologických postupov (ako sú napríklad farbiace postupy) možno modifikovať tak, aby sa dosiahla detekcia in situ.

Uvedené skúšky na klony podľa tohto vynálezu typicky zahŕňajú inkubáciu biologickej vzorky, ako je napríklad biologická tekutina, tkanivový extrakt, čerstvo odobraté bunky, ako sú lymfocyty alebo leukocyty, alebo bunky, ktoré boli inkubované v tkanivových kultúrach, za prítomnosti detekovateľne značenej protilátky, schopnej identifikovať kódované proteíny; ďalej zahŕňajú detekciu protilátky jednou z mnohých technik, ktoré sú v danom odbore dobre známe.

(vii) Kódované proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu použiť tiež ako nepriame modulátory mnohých z ďalších proteínov pre ich schopnosť väzby k ďalším intracelulámym proteínom; uvedené ďalšie intarcelulárne proteíny ešte priamo viažu ďalšie intraceluláme proteíny alebo intraceluláme domény transmembránových proteínov.

Na účely modulácie uvedených ďalších intracelulámych proteínov alebo intracelulámych domén transmembránových proteínov sa môžu proteíny podľa tohto vynálezu vložiť do buniek viacerými spôsobmi, ako sa uvádza v časti (ii).

Treba tiež poznamenať, že izolácia, identifikácia a charakterizácia proteínov podľa tohto vynálezu sa môže vykonať použitím ktoréhokoľvek zo známych bežných skríningových postupov. Jeden z týchto skríningových postupov je napríklad kvasinkový dvojhybridný postup, ktorý sa použil na identifikáciu proteínov podľa tohto vynálezu. Na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu proteínov podľa tohto vynálezu, alebo na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov, receptorov a podobných, ktoré sú schopné sa viazať k proteínom podľa tohto vynálezu, môžu sa podobne použiť ďalšie postupy, ako je afinitná chromatografia, DNA hybridizačné postupy, a ďalšie, ako sú dobre známe v danom odbore.

Proteíny, pri ktorých sa zistilo, že sa viažu k proteínom podľa tohto vynálezu, sa navyše môžu samy použiť podobným spôsobom ako proteíny podľa tohto vynálezu, ako sa uviedlo a uvádza sa ďalej, na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov a ďalších, ktoré sú schopné väzby k proteínom z tohto vynálezu; uvedené proteíny môžu predstavovať faktory zapojené ďalej v smere v združenom signálnom procese, alebo proteíny, ktoré môžu mať ich signálne aktivity, a preto predstavujú proteíny zapojené v určitom signálnom procese.

Uvedené sekvencie DNA a kódované proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť niektorým bežným rekombinantným DNA spôsobom (pozri napríklad Sambrook, et al., (1989)), v ktorom sa vhodné eukaryotické alebo prokaryotické bunky transformujú príslušnými eukaryotickými alebo prokaryotickými vektormi, obsahujúcimi sekvencie, kódujúce pre uvedené proteíny. Podľa uvedeného sa tento vynález týka tiež expresie vektorov a transformovaných hostiteľov na prípravu poteínov podľa tohto vynálezu. Ako už bolo uvedené, tieto proteíny zahŕňajú tiež ich biologicky aktívne analógy, fragmenty a ich deriváty a tak vektory, ktoré ich kódujú, tiež zahŕňajú vektory, kódujúce analógy a fragmenty týchto proteínov; transformovaní hostitelia zahŕňajú takých hostiteľov, ktorí produkujú uvedené analógy a fragmenty. Deriváty týchto proteínov sú deriváty, ktoré sú produkované bežnou modifikáciou proteínov alebo ich analógov, alebo fragmentov, produkovaných transformovaným hostiteľom.

Tento vynález sa týka tiež farmaceutických kompozícií na moduláciu účinkov sprostredkovaných s TRAF2. Farmaceutické kompozície obsahujú ako aktívnu zložku jednu alebo viac z nasledujúcich: (i) jednu alebo viac DNA sekvencii podľa tohto vynálezu, alebo ich častí, subklonované do vhodného expresného vektora; (ii) proteín podľa tohto vynálezu, jeho biologicky aktívne fragmenty, analógy, deriváty, alebo ich zmes; (iii) rekombinantný vektor živočíšneho vírusu, kódujúci pre proteín podľa tohto vynálezu, jeho biologicky aktívne fragmenty, analógy alebo jeho deriváty.

Uvedené farmaceutické kompozície sa použijú v závislosti od choroby, ktorú treba liečiť v množstvách prospešných pre pacienta, v závislosti od telesnej hmotnosti pacienta a od ďalších okolností, ako určí lekár.

Ako už bolo uvedené, jedno zo špecifických uskutočnení TRAF-väzbových proteínov podľa tohto vynálezu je TRAF2-väzbový proteín NIK. Vychádzajúc z poznatkov v zhode s týmto vynálezom, že NIK sa špecificky viaže k TRAF2 a sám osebe je mediátorom/modulátorom TRAF2, potom NIK môže tak sprostredkovať/modulovať TRAF2-aktivitu pri aktivácii NF-κΒ; preto jeho možná úloha v dráhe prežitia bunky je v tom, že TRAF2 pôsobí nezávisle, alebo v spojení s ďalšími proteínmi (napríklad s p55 TNF a p75 TNF receptormi, FAS/APO1 receptorom, MORT-1, RIP a TRADD), čo je dôležité pri navrhovaní liekov, ktoré môžu podľa požiadavky zvýšiť alebo potláčať interakcie medzi TRAF2 a NIK. Ak sa napríklad vyžaduje zvýšiť bunkovú cytotoxickosť, vyvolanú s TNF, bude treba inhibovať indukciu NF-κΒ inhibíciou interakcie TRAF2 - NIK, alebo inhibíciou TRAF2 a/alebo NIK špecificky. Ak sa podobne vyžaduje napríklad inhibovať bunkovú cytotoxickosť vyvolanú s TNF, bude treba posilniť indukciu NF-κΒ posilnením interakcie TRAF2 - NIK, alebo posilnením TRAF2- a/alebo NIK- špecifickej NF-κΒ indukcie. V skutočnosti je veľa chorôb, pri ktorých uvedené liečiva môžu veľmi pomáhať. Medzi inými (pozri tiež diskusiu skôr) je to akútna hepatitída, pri ktorej sa usudzuje, že akútne poškodenie pečene sa zdá byť odrazom FAS/APO1 receptorom sprostredkovaného hynutia buniek pečene po indukcii Fas ligandom; ďalej, autoimunitné vyvolaná smrť buniek, ako je uhynutie β-Langerhansových buniek pankreasu, ktoré má za následok diabetes; hynutie buniek pri odmietaní štepu (napríklad pri transplantácii obličky, srdca a pečene); hynutie oligodendrocytov mozgu pri skleróze multiplex; a AIDS-inhibovaná samovražda T buniek, čo spôsobuje proliferáciu vírusu AIDS, a preto ochorenie AIDS.

V takých prípadoch sa bude vyžadovať, aby sa inhibovala dráha FAS/APO1 receptorovo sprostredkovanej bunkovej cytotoxickosti (apoptosis) a aby sa zosilnila FAS/APO1 receptorovo sprostredkúvaná indukcia NF-κΒ cez interakciu TRAF2 a TRAF2-NIK. Jeden spôsob, ako to dosiahnuť, je zvýšenie množstva NIK v bunkách, alebo zvýšenie množstva TRAF2 a NIK tak, že sa s NIK- alebo TRAF2-NIK-sprostredkovaná indukcia aktivácie NF-κΒ zvýši, čím sa dosiahne vyššia úroveň aktivácie NF-κΒ a tým aj prežitia buniek; alebo tak, že sa zvýši priama alebo nepriama interakcia medzi FAS/APO1 receptorom a TRAF2 (alebo TRAF2-NIK), čoho výsledkom je zníženie receptorových interakcií FAS/APO1 s bunkovými mediátormi cytotoxockosti (napríklad MACH, pozri schému na obr. 2b), čo má opäť za následok zvýšenie indukcie NF-κΒ aktivácie a podporu prežitia buniek.

Naopak, v prípade nádorov a infikovaných buniek (pozri tiež diskusiu skôr), sa bude napríklad vyžadovať zvýšenie bunkovej cytotoxickosti sprostredkovanej receptorom FAS/APO1, aby sa zvýšilo hynutie buniek. V tomto prípade sa bude vyžadovať, aby sa inhibovali interakcie FAS/APO1 receptor - TRAF2 (alebo -TRAF2-NIK) a/alebo inhibícia priamo NIK, a tým sa znížila indukcia NF-κΒ aktivity.

Je možné, aby NIK, alebo jedna, alebo viac jeho možných izoforiem, analógov alebo fragmentov mohli slúžiť ako „prírodné“ inhibítory samotného NIK, alebo interakcie NIK-TRAF2, a tak slúžiť ako inhibítory indukcie NF-κΒ aktivácie. Také inhibítory možno potom využiť ako špecifické inhibítory uvedené skôr, napríklad ako inhibítory, ak sa vyžaduje, na zvýšenie bunkových cytotoxických účinkov TNF alebo ligandu FAS/APO1 receptora, aby sa zvýšilo hynutie buniek. Ako sa na príklade v ďalšom texte uvádza, rôzne analógy a mutanty NIK sa skutočne izolovali v zhode s týmto vynálezom; sú to analógy/mutanty deficitné kinázou, ktoré sú schopné blokovať indukciu NF-κΒ aktivácie, sprostredkovanej receptormi TNF, FAS/APO1 receptorom, s nimi združenými proteínmi TRAD, RIP a MORT1; ako aj sprostredkované s IL-1 receptorom (ktorého aktivácia je cez NIK, ale nezávislá od TRAF2); a tiež sprostredkované bakteriálnym toxínom (LPS), acetátom-myristátom forbolu a HLTV-1 proteínom TAX. Podobne sa skríningu môžu podrobiť aj ďalšie látky, ako sú peptidy, organické zlúčeniny, protilátky a podobné tak, aby sa získali špecifické liečivá, ktoré sú schopné inhibície TRAF2-NIK interakcie alebo inhibície aktivity NIK.

Ak sa v rôznych situáciách vyžaduje zvýšenie aktivácie NF-κΒ, ako sa uvádza, možno podobným spôsobom napríklad zvýšiť množstvo NIK a/alebo TRAF2 v bunkách rôznymi známymi postupmi, ako sa uvádzajú (napríklad vložením DNA, kódujúcej NIK a/alebo TRAF2 do buniek, alebo akoukoľvek inou cestou, známou odborníkom v danej oblasti). Na výber špecifických liečiv, ktoré sú schopné zvyšovať aktivitu NIK alebo zvyšovať TRAF2-NIK interakcie, sa podobne môžu podrobiť skríningu aj ďalšie látky, ako sú peptidy, organické zlúčeniny a podobné.

Ako sa môžu zostrojiť a podrobiť skríningu peptidové inhibítory s NIK-TRAF2 interakciou uvádza príklad, ktorý však neobmedzuje rozsah tohto vynálezu, a ktorý je založený na skorších štúdiách peptidových inhibítorov ICE alebo ICE proteáz, substrátovej špecifickosti ICE a stratégiách epitopovej analýzy s použitím syntézy peptidu. Zistilo sa, že minimálna požiadavka pre účinné štiepenie peptidu s ICE je prítomnosť štyroch aminokyselín vľavo od štiepneho miesta s vysokou preferenciou aspartovej kyseliny v polohe P, a vpravo postačuje metylamín v polohe P! (Sleah et al., (1990); Howard et al., (1991); Thomberry et al., (1992)). Ďalej sa zistilo, že fluorogénny substrátový peptid (tetrapeptid), acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metyl-kumaryl-7-amid), skrátene Ac-DEVD-AMC, zodpovedajúci sekvencii v poly-(ADP-ribóza)polymeráze (PARP), sa v bunkách krátko po stimulácii FAS-R štiepi (Kaufmann (1989); Kaufmann et al., (1993); Lazebnik et al., (1994)) a že je účinne štiepený s CPP32 (člen proteázovej skupiny CED3/ICE) a MACH proteázami.

Kedže Asp v polohe P, substrátu sa považuje za dôležitú, potom sa tetrapeptidy s Asp ako štvrtým aminokyselinovým zvyškom a rôzne kombinácie aminokyselín v polohách troch prvých zvyškov môžu rýchlo vytriediť podľa väzby k aktívnemu miestu použitej proteázy, napríklad spôsobom vyvinutým Geysenom (Geysen, (1985); Geysen et al., (1987)); uvedeným spôsobom sa na tuhom nosiči vykonal skríning značného počtu peptidov na špecifické interakcie s protilátkami. Väzba MACH proteáz k špecifickým peptidom sa môže detegovať celým radom známych detekčných spôsobov, známych odborníkom v danej oblasti, ako je rádioznačkovanie a podobné postupy. Tento Geysenov spôsob sa ukázal ako vhodný pri skúškach viac ako 4 000 peptidov v priebehu pracovného dňa.

Podobným spôsobom sa môže objasniť presná väzbová oblasť alebo homológna oblasť, ktorá určuje uvedenú interakciu medzi TRAF2 a NIK (alebo ktorýmkoľvek iným TRAF proteínom a TRAF-väzbovým proteínom); polypeptidy sa potom môžu podrobiť skríningu, ktorý môže slúžiť na blokovanie tejto interakcie napríklad pri syntetizovaných peptidoch, ktoré majú podobné sekvencie, ako sú sekvencie väzbovej oblasti, alebo sekvencie k nim komplementárne a tým môžu súťažiť (konkurovať) s prírodným NIK (alebo TRAF-väzbovým proteínom) pri viazaní k TRAF2 (alebo TRAF).

Preto môže byť výhodné konštruovať peptidové inhibítory, ktoré selektívne inhibujú TRAF2-NIK (alebo TRAF-TRAF väzbový protein) interakcie bez interferencie s fyziologickými procesmi hynutia buniek, v ktorých sú zapojení iní účastníci intracelulámej signálnej dráhy, napríklad MACH proteázy dráhy hynutia buniek, ktoré sú členmi skupiny CED3/ICE proteáz zo zoskupenia peptidov viažucich s k TRAF2 (alebo k TRAF), alebo NIK (alebo TRAF-väzbové proteiny); pri skúškach, ako sú opísané, môžu byť peptidové inhibítory ďalej syntetizované na skúšku selektívnej väzby k uvedeným ďalším proteínom ako fluorogénny substrát s cieľom výberu iba takých proteínov, ktoré sú špecifické pre TRAF2/NIK (alebo TRAF/TRAF-väzbový protein). Peptidy, pri ktorých sa dokázalo, že sú špecifické napríklad pre TRAF2/NIK, sa na posilnenie bunkovej permeability a inhibíciu uvedenej aktivity TRAF2 a/alebo NIK potom môžu alebo vratne, alebo nevratne modifikovať. Thomberry et al., (1994) uviedol, že tetrapeptid (acyloxy)metylketón Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC(O)-[2,6-(CF₃)₂]Ph bol silným inaktivátorom ICE. Podobne Milligan et al., (1995) uviedol, že tetrapeptidové inhibítory, ktoré majú chlórmetylketónové (nevratne) alebo aldehydové (vratne) skupiny inhibovali ICE. Navyše sa ukázalo, že benzyloxykarboxyl-Asp-CH₂OC-(O)-2,6-dichlórbenzén (DCB) tiež inhibuje ICE (Mashima et al., (1995)). Obdobným spôsobom a v zhode s už uvedeným sa tetrapeptidy, ktoré sa selektívne viažu k napríklad TRAF2 alebo NIK sa môžu modifikovať napríklad aldehydovou skupinou, chlórmetylketónovou, (acyloxy)metylketónovou, alebo CH₂OC-(O)-DCB skupinou, čím sa vznikne peptidový inhibítor TRAF2/NIK aktivity. Na zlepšenie permeability sa peptidy ďalej môžu modifikovať, napríklad chemicky, alebo sa na zvýšenie permeability cez bunkovú membránu a uľahčenie transportu uvedených peptidov cez membránu a do cytoplazmy môžu pripraviť ich deriváty. Muranishi et al., (1991) uvádza derivatizáciu tyrotropín uvoľňujúceho hormónu s laurylovou kyselinou za vzniku lipofilného lauroylderivátu s dobrými penetračnými vlastnosťami cez bunkovú membránu. Zacharia et al., (1991) uvádza, že oxidácia metionínu na sulfoxid a náhrada peptidovej väzby s jeho ketometylénovým izoesterom (COCH₂) tiež uľahčuje transport peptidu cez bunkovú membránu. To sú iba niektoré zo známych modifikácií a príkladov derivátov, ktoré sú dobre známe odborníkom v danej oblasti.

Pri liečive alebo peptidových inhibítoroch, ktoré sú schopné inhibovať aktivitu napríklad NIK inhibíciou NIK-TRAF2 interakcie, a podobných, možno interakciu medzi TRAF proteínmi a T RAF-väzbovými proteínmi ďalej uľahčovať spájaním alebo tvorbou komplexov s molekulami, ktoré podporujú vnikanie do bunky.

Patent USA 5 149 782 zverejňuje spojenie molekuly, ktorá sa má transportovať bunkovou membránou s činidlom, ktoré splýva s membránou, ako sú fúzogenné peptidy, peptidy vytvárajúce iónové kanály, iné membránové polypeptidy a mastné kyseliny s dlhým reťazcom, napríklad kyselina myristová, kyselina palmitová. Uvedené činidlá vložia molekulové konjugáty do lipidovej dvojvrstvy bunkových membrán a uľahčujú ich vniknutie do cytoplazmy.

Low et al., v patente USA 5 108 921 podáva prehľad vhodných spôsobov na transmembránový prísun molekúl, ako sú, ale nie iba, proteiny a nukleové kyseliny, mechanizmom receptorom sprostredkovanej endocytotickej aktivity. Tieto receptorové systémy zahŕňajú také receptorové systémy, ktoré rozpoznávajú galaktózu, manózu, 6-fosfát manózy, transferin, asialoglykoproteín, transkobalamín (vitamín B,₂), a-2 makroglobulíny, inzulín a ďalšie peptidové rastové faktory, ako je epidermálny rastový faktor (EGF). Low et al., usudzuje, že výživné receptory, ako sú receptory pre biotín a folát sa môžu výhodne použiť na podporu transportu bunkovou membránou, pretože majú vhodné rozmiestenie a početnosť biotínových a folátových receptorov na povrchoch membrán väčšiny buniek a na podporu združenými receptormi sprostredkovaných membránových transportných procesov. Komplex, vytvorený medzi zlúčeninou, ktorá sa má dopraviť do cytoplazmy a ligandom, ako je biotín alebo folát, prichádza tak do styku s membránou bunky, ktorá obsahuje bio16 tínové a folátové receptory na iniciáciu receptorom sprostredkovaného transmembránového transportného mechanizmu, čím sa umožňuje prísun vyžadovanej zlúčeniny do bunky.

ICE je známy tým, že má schopnosť tolerovať liberálne substitúcie v polohe P₂ a táto tolerancia k liberálnym substitúciám sa využila na vývoj účinnej a afmitnej značky s vysokou selektivitou, obsahujúcej biotínové zakončenie (Thomberry et al., (1994)). V dôsledku toho na zvýšenie permeability týchto peptidových inhibítorov bunkovou membránou môže byť poloha P₂, možno aj N-zakončenie tetrapeptidového inhibítora modifikované alebo derivatizované, napríklad pridaním biotínovej molekuly.

Ďalej je v odbore známe, že fúzia vyžadovanej peptidovej sekvencie s hlavnou/signálnou peptidovou sekvenciou vytvorením „chimérového peptidu“ umožní, aby sa uvedený „chimérový peptid“ transportoval cez bunkovú membránu do cytoplazmy.

Ako sa uznáva odborníkmi v oblasti peptidov, pod peptidovými inhibítormi interakcie TRAF-TRAFväzbový proteín, napríklad interakcie TRAF2-NIK podľa tohto vynálezu sa rozumie, že zahŕňajú peptidomimetické liečiva alebo inhibítory, ktoré sa môžu tiež skríningom rýchlo vytriediť, napríklad podľa väzby k TRAF2/N1K, s cieľom konštrukcie možno ešte stabilnejších inhibítorov.

Je vítané, že rovnaké prostriedky na uľahčenie alebo posilnenie transportu peptidových inhibítorov bunkovými membránami, ako boli použité, možno rovnako použiť aj pre TRAF-väzbové proteíny, napríklad pre NIK, jeho analógy, fragmenty, alebo jeho izoformy samotné, ako aj pre ďalšie peptidy a proteíny, ktoré svoje účinky prejavujú vnútri buniek.

Pokiaľ sa týka výrazu protilátky, používaného v tomto texte, výraz „protilátka“ sa chápe tak, že zahŕňa polyklonové protilátky, monoklonové protilátky (mAbs), chimérové protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky k protilátkam, ktoré môžu byť značené v rozpustnej alebo viazanej forme, ako aj ich fragmenty, pripravené ktoroukoľvek známou technikou, ako napríklad je, ale nie iba, enzymatické štiepenie, peptidová syntéza alebo rekombinantné techniky.

Polyklonové protilátky sú heterogénne populácie proti látkových molekúl, odvodených zo séra živočíchov, imunizovaných antigénom. Monoklonové protilátky obsahujú v podstate homogénnu populáciu protilátok, špecifických k antigénom, ktorých populácie obsahujú v podstate podobné epitopové väzbové miesta. Monoklonové protilátky sa môžu pripraviť spôsobmi, známymi odborníkom v danej oblasti. Pozri napríklad Kohler a Milstein, Náture 256. 495 až 497 (1975); patent USA 4 376 110; Ausubel et al., Eds. Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., Eds., Current Protocol of Immunology, Green Publishing Association, a Wiley Interscience NY, (1992 až 1996); obsah týchto publikácií sa tu v celosti zahŕňa týmto odkazom. Uvedené protilátky môžu pochádzať z ktorejkoľvek imunoglobulínovej skupiny vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, G1LD a z ktorejkoľvek ich podskupiny. Hybridómy, produkujúce mAbs z tohto vynálezu sa môžu kultivovať in vitro alebo in vivo. Produkcia vysokých titrov monoklonových protilátok in vivo alebo in vitro je súčasne výhodným spôsobom produkcie podľa tohto vynálezu.

Chimérové protilátky sú molekuly, ktorých rôzne časti sú odvodené z rôznych živočíšnych druhov, ako sú napríklad protilátky s vymeniteľnou oblasťou, odvodenou z protilátky myši a so stálou oblasťou z ľudského imunoglobulínu. Chimérové protilátky sú používané primárne na znižovanie imunogenicity pri použití protilátok a na zvýšenie výťažkov v produkcii, napríklad sa používajú chimérové ľudské/myšacie monoklonové protilátky (mAbs) vtedy, keď monoklonové protilátky myši dávajú vyššie výťažky z hybridómov, ale vyššiu imunogenitu u ľudí. Chimérové protilátky a spôsoby ich produkcie sú v odbore známe (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3273 až 3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Avad. Sci. USA 81, 6851 až 6855 (1984); Bouliane et al., Náture 312. 643 až 646 (1984); Cabilly et al., prihláška Európskeho patentu 125 023 (zverejnená 14. novembra 1984); Neuberger et al., Náture 314. 268 až 270 (1985); Taniguchi et al., prihláška Európskeho patentu 171 496 (zverejnená 19. februára 1985); Morrison et al., prihláška Európskeho patentu 173 494 (zverejnená 5. marca 1986); Neuberger et al., PCT prihláška WO 8 601 533 (zverejnená 13. marca 1986); Kudo et al., prihláška Európskeho patentu 184 187 (zverejnená 11. júna 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137. 1066 až 1074 (1986); Robinson et al. prihláška medzinárodného patentu WO 8 702 671 (zverejnená 7. mája 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439 až 3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Avad. Sci. USA 84, 214 až 218 (1987); Better et al., Science 240, 1041 až 1043 (1988); a Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, uvedený už hore). Uvedené spisy sa v celosti zahŕňajú v tomto vynáleze odkazom.

Uvedená anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, ktorá rozpoznáva špecifické determinanty všeobecne združené s antigénovým väzbovým miestom protilátky. Id protilátka sa môže pripraviť imunizáciou živočícha rovnakého druhu a genetického typu (napríklad z kmeňa myší) ako zdroja mAb, ku ktorej sa antiId pripravuje. Imunizovaný živočích potom rozpoznáva a poskytuje reakciu na idiotypové determinanty imunizujúcej protilátky produkciou protilátky k týmto idiotypovým determinantom (uvedená anti Id-protilátka). Pozri napríklad patent USA 4 699 880, ktorý sa v celosti zahŕňa týmto odkazom.

Uvedená Id-protilátka sa môže použiť tiež ako „imunogén“ na indukciu imunitnej odpovede ešte pri iných živočíchoch, produkujúcich takzvanú ant-anti-Id protilátku. Uvedená anti-anti-Id môže byť epitopicky indentická s pôvodnou mAb, ktorá indukuje uvedenú anti-Id. Použitím týchto protilátok k idiotypovým determinantom monoklonových protilátok je potom možné identifikovať ďalšie klony, exprimujúce protilátky so zhodnou špecifickosťou.

Monoklonové pritilátky, generované proti TRAF-väzbovým proteínmom, analógom, fragmentom alebo ich derivátom (napríklad NIK, jeho izoformám, analógom, fragmentom alebo jeho derivátom) z tohto vynálezu, môžu sa v zhode s doteraz uvedeným použiť na indukciu anti-Id protilátok vo vhodných živočíchoch, ako sú napríklad BALB/c myši. Na produkciu anti-Id hybridom, vylučujúcich anti-Id sa použijú slezinové bunky uvedených imunizovaných myší. Ďalej, anti-Id protilátky sa môžu viazať s nosičom, ako je napríklad prísavný hemokyanín („keyhole limpet hemocyanin“, KLH) a použiť na imunizáciu ďalších BALBV/c myší. Séra týchto myší budú obsahovať anti-anti-Id protilátky, ktoré majú väzbové vlastnosti pôvodnej monoklonovej protilátky, špecifickej k epitopu uvedeného TRAF-väzbového proteínu, alebo jeho analógov, fragmentov a ich derivátov.

Uvedené anti-Id monoklonové protilátky majú im vlastné idiotypové epitopy, „idiotopy“, štruktúrne podobné hodnoteným epitopom, ako je napríklad GRB proteín-a.

Do výrazu „protilátka“ sa tiež zahŕňajú intaktné molekuly, ako aj ich fragmenty, ako sú napríklad Fab a F(ab')₂, ktoré sú schopné viazať antigén. Fragmenty Fab a F(ab')₂ s nedostatočným fragmentom Fc intaktnej molekuly sa pri cirkulácii rýchlejšie čistia a môžu mať menej nešpecifických tkanivových väzieb ako intaktná protilátka (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24, 316 až 325 (1983)).

Bude výhodné, ak sa Fab a F(ab')₂ a ďalšie fragmenty protilátok, užitočných podľa tohto vynálezu použijú na detekciu a kvantifikáciu TRAF-väzbového proteínu spôsobmi pre intaktné protilátkové molekuly, objasnenými skôr. Také fragmenty sú typicky produkované proteolytickým štiepením s použitím enzýmov, ako je napríklad papaín (na produkciu fragmentov Fab) alebo pepsín (na produkciu fragmentov F(ab')₂).

Ak sa uvádza, že protilátka ,je schopná väzby“ molekuly, znamená to, že je schopná špecificky reagovať s uvedenou molekulou, čím sa molekula viaže k protilátke. Výraz „epitop“ sa vzťahuje na takú časť akejkoľvek molekuly, schopnej sa viazať protilátkou, ktorá môže byť uvedenou protilátkou rozpoznávaná. Epitopy, „antigénové determinanty“ zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl, ako sú aminokyseliny alebo vedľajšie reťazce sacharidov a majú špecifický trojrozmerný štruktúrny charakter, ako aj špecifický nábojový charakter.

„Antigén“ je molekula alebo časť molekuly, ktorá je schopná, aby bola viazaná protilátkou, ktorá je ďalej schopná indukovať živočícha, aby produkoval protilátku, schopnú väzby k epitopu uvedeného antigénu. Antigén môže mať jeden alebo viac epitopov. Uvedený výraz špecifická reakcia znamená, že antigén bude reagovať vysoko selektívnym spôsobom s jemu zodpovedajúcou protilátkou a nie s mnohými inými protilátkami, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Uvedené protilátky vrátane fragmentov protilátok, užitočné podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na kvantitatívne stanovenie alebo kvalitatívny dôkaz TRAF-väzbového proteínu (napríklad NIK) vo vzorke, alebo na dôkaz prítomnosti buniek, ktoré exprimujú TRAF-väzbový proteín podľa tohto vynálezu. Dôkazy alebo stanovenia sa môžu vykonať imunofluorescenčnými technikami s využitím fluorescenčné značených protilátok (pozri v ďalšom texte) v spojení so sveteľnou mikroskopiou, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickou detekciou.

Uvedené protilátky (alebo ich fragmenty), užitočné podľa tohto vynálezu, sa môžu využiť histologický, napríklad v imunofluorescenčnej alebo elektrónovej mikroskópii, na in situ detekciu TRAF-väzbového proteínu podľa tohto vynálezu. Detekcia in situ sa môže vykonať odberom histologických vzoriek od pacienta, a pridaním značenej protilátky podľa tohto vynálezu k uvedenej vzorke. Protilátka (alebo jej fragment) sa výhodne pridá náterom alebo prevrstvením biologickej vzorky značenou protilátkou (alebo jej fragmentom). Použitím uvedeného postupu možno stanoviť nielen prítomnosť TRAF-väzbového proteínu, ale tiež jeho rozdelenie v skúšanom tkanive. Pri použití tohto vynálezu si môžu bežne skúsení v tejto oblasti uvedomiť, že ktorúkoľvek z množstva rôznych histologických metód (ako sú napríklad farbiace postupy) možno modifikovať tak, aby sa dosiahla detekcia in situ.

Skúšobné postupy na dôkaz a/alebo stanovenie TRAF-väzbového proteínu podľa tohto vynálezu typicky zahŕňajú inkubáciu biologickej vzorky, napríklad biologickej tekutiny, tkanivového extraktu, čerstvo vypestovaných buniek, ako sú lymfocyty alebo leukocyty, alebo buniek po kultivácii v tkanivovej kultúre, za prítomnosti dokázateľného množstva značenej protilátky, schopnej identifikovať uvedený TRAF-väzbový proteín, a ďalej zahŕňajú detekciu protilátky niektorou z mnohých technik, známych v danom odbore.

Biologická vzorka sa môže spracovať na tuhej podložke alebo na nosiči, ako je nitrocelulóza, alebo na iných tuhý podložkách alebo nosičoch, ktoré sú schopné mobilizovať bunky, časti buniek, alebo rozpustné proteíny. Podložka alebo nosič sa potom môže premývať vhodným tlmivým roztokom a následne spracovaním s detekovateľne značenou protilátkou v zhode s týmto vynálezom, ako sa uvádza skôr. Tuhá podložka alebo nosič sa potom môže premyť druhý raz s tlmivým roztokom na odstránenie neviazanej protilátky. Množstvo viazanej značky na uvedenej podložke alebo nosiči sa potom stanoví bežnými spôsobmi.

Výrazmi „tuhá podložka“, „tuhý nosič“, „podložka“, alebo „nosič“ sa rozumie akákoľvek podložka alebo nosič, schopný viazať antigén alebo protilátku. Všeobecne známe podložky alebo nosiče zahŕňajú napríklad sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, amylázový nylon, prírodné a modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Na účely tohto vynálezu môže byť povaha nosiča taká, že nosič je čiastočne rozpustný alebo nerozpustný. Materiál podložky môže mať prakticky akúkoľvek možnú štruktúrnu konfiguráciu, pokiaľ je viazaná molekula schopná viazať sa k antigénu alebo k protilátke. Konfigurácia podložky alebo nosiča môže byť potom sférická, ako sú perličky, valcová, ako je vnútorný povrch skúšobných rúrok, alebo vonkajší povrch tyče. Voliteľne môže byť povrch plochý, ako sú listy, skúšobné prúžky a podobne. Výhodné podložky alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové perličky. Na viazanie protilátky alebo antigénu odborníci v danej oblasti poznajú ešte ďalšie vhodné nosiče, alebo sú ich schopní zistiť bežným experimentovaním.

Väzbovú aktivitu danej dávky protilátky podľa tohto vynálezu, ako je uvedené, možno stanoviť všeobecne známymi spôsobmi. Skúsení v danom odbore sú schopní pomocou bežných experimentov určiť pracovné a optimálne podmienky pre každé stanovenie.

Do postupu skúšky sa môžu v jednotlivých situáciách zahrnúť ďalšie experimentálne kroky, ako je premývanie, miešanie, trepanie, filtrovanie a podobné, ak sú uvedené kroky zaužívané alebo potrebné.

Jedným zo spôsobov, ktorým sa môže protilátka v zhode s týmto vynálezom detekovateľne značiť je viazanie uvedenej protilátky s enzýmom a použitie v enzýmovej imunoanalýze (EIA). Ak je tento enzým potom exponovaný vhodným substrátom, reaguje s týmto substrátom takým spôsobom, že produkuje chemické zoskupenie, ktoré sa môže detegovať, napríklad spektrofotometricky, fluorometricky, alebo vizuálnym porovnávaním. Na detekovateľne označenie protilátky enzýmami možno použiť napríklad, ale nie iba, malonátovú dehydrogenázu, stafylokokovú nukleázu, delta-5-steroidovú izomerázu, alkoholovú dehydrogenázu kvasiniek, alfa-glycerofosfátovú dehydrogenázu, triózovú fosfátovú izomerázu, chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukózovú oxidázu, beta-galaktozidázu, ribonukleázu, areázu, katalázu, glukózovú6-fosfátovú dehydro-genázu, glukoamylázu a acetylcholínovú esterázu. Detekcia sa môže vykonať kolorimetrickými spôsobmi s použitím chromogénneho substrátu pre enzým. Detekcia sa môže vykonať tiež vizuálnym porovnávaním rozsahu enzymatickej reakcie v substráte v porovnaní s obdobne pripravenými štandardmi.

Detekcia sa môže vykonať použitím ktorejkoľvek z rôznych ďalších imunoanalýz. Napríklad, rádioaktívnym značením protilátok alebo fragmentov protilátok možno detegovať R-PTP-ázy použitím rádioimunoanalýzy (RIA). Dobrý opis spôsobu RIA možno nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology (Work, T. S. et al., North Publishing Company, NY (1978)) s osobitným odkazom na kapitolu, nazvanú „An introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques“ od autora Chard, T., ktorá sa tu zahŕňa týmto odkazom. Rádioaktívne izotopy sa môžu detegovať použitím g-čítača alebo scintilačného čítača, alebo autorádiografiou.

Protilátku možno podľa tohto vynálezu tiež značiť fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená zlúčenina vystaví účinku svetla s vhodnou vlnovou dĺžkou, jej prítomnosť sa prejaví fluorescenciou. Medzi najviac používané fluorescenčné značkujúce zlúčeniny patrí izotiokyanát, rodamín, fykoerytrín, pykokyanín, alofykokyanín, o-ftaldehyd a fluorescamín.

Protilátka sa môže detekovateľne označiť tiež použitím fluorescenciu vyžarujúcich kovov, ako je napríklad ¹⁵²E, alebo ďalších zo skupiny lantanidov. Tieto kovy možno viazať k protilátke s využitím skupín, ktoré uvedený kov viažu vo forme chelátu, ako je napríklad dietyléntriamínpentaoctová kyselina (ETPA).

Protilátka sa môže detekovateľne označiť tiež jej spojením s chemoluminiscenčnou zlúčeninou. Prítomnosť chemoluminoscenčne značenej protilátky sa potom prejaví prítomnosťou luminiscencie, ktorá vzniká v priebehu chemickej reakcie.

Príklady výhodných chemoluminoscenčne značkujúcich zlúčenín sú luminol, izoluminol, akridíniový ester, imidazol, akridíniová soľ a ester kyseliny oxálovej.

Podobne sa na značenie protilátky podľa tohto vynálezu môže použiť bioluminiscenčná zlúčenina. Bioluminiscencia je druh chemoluminiscencie, zisťovanej v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemoluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu sa stanoví detekciou prítomnosti luminiscencie. Dôležité bioluminiscenčné zlúčeniny, vhodné na tento účel sú luciferín, luciferáza a ekvorín.

Molekula protilátky podľa tohto vynálezu sa môže prispôsobiť na použitie v imunometrickej analýze, známej tiež ako „dvojmiestna“ alebo „sendvičová“ analýza. Pri typickej imunometrickej analýze sa známe množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) viaže na tuhú podložku alebo nosič a potom sa pridá detekovateľne značená rozpustná protilátka; vzniká temámy komplex medzi tuhou fázou s protilátkou, antigénom a značenou protilátkou, ktorý umožňuje detekciu a/alebo kvantitatívne stanovenie.

Typické a výhodné imunometrické analýzy zahŕňajú „vpred“ analýzy, pri ktorých sa protilátka, viazaná na tuhej fáze najprv privádza do styku so skúšanou vzorkou, aby sa extrahoval antigén zo vzorky, vzniknutý vo forme binárneho komplexu tuhej fázy s protilátkou a antigénu. Po vhodnej dobe inkubácie sa tuhá podlož19 ka alebo nosič premyje na odstránenie zvyškov tekutej vzorky vrátane nezreagovaného antigénu, ak by bol prítomný, a potom sa privedie do styku s roztokom, obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá pôsobí ako „spravodajská molekula“, reportér molecule). Po niekoľkosekundovej dobe inkubácie, počas ktorej sa značená protilátka viaže do komplexu s antigénom viazaným na tuhej podložke alebo nosiči cez neznačenú protilátku sa tuhá podložka alebo nosič sa premyje po druhý raz, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inej úprave sa „sendvičový“ postup môže tiež použiť v súvislosti s antigénmi podľa tohto vynálezu ako takzvané „simultánne“ a „vratné“ („reverzné“) imunoanalýzy. Simultánna analýza vyžaduje jeden inkubačný krok, pretože sa obidva, protilátka na tuhej podložke alebo nosiči a značená protilátka súčasne pridajú do skúšanej vzorky. Po ukončení inkubácie sa tuhá podložka alebo nosič premyje na odstránenie zvyšku tekutej vzorky a značenej protilátky, ktorá sa neviazala do komplexu. Prítomnosť značenej protilátky, viazanej na tuhej podložke alebo nosiči sa potom stanoví ako pri už uvedenej „vpred“ analýze sendvičového spôsobu.

Vo „vratnom“ uskutočnení analýzy sa najprv postupne pridá roztok značenej protilátky k roztoku vzorky, potom, po vhodnej dobe inkubácie, nasleduje pridanie neznačenej protilátky, viazanej na tuhej podložke alebo nosiči. Po druhej inkubácii sa tuhá fáza bežným spôsobom premyje, aby sa zbavila zvyšku skúšanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Stanovenie značenej protilátky, viazanej na tuhej podložke alebo nosiči sa potom vykoná rovnako ako v prípadoch „simultánnej“ alebo „vpred“ analýzy.

Ako už bolo uvedené, vynález sa týka tiež farmaceutických kompozícií, obsahujúcich rekombinantne živočíšne vírusové vektory, kódujúce TRAF-väzbové proteíny, ktoré kódujú tiež vírusový povrchový proteín, schopný viazať špecifické povrchové proteíny terčových buniek (napríklad rakovinových) za usmernenia inzercie TRAF-väzbových proteínových sekvencií do buniek. Ďalšie farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu obsahujú ako aktívnu zložku (a) oligonukleotidovú sekvenciu, kódujúcu protismemú sekvenciu TRAF-väzbovej proteínovej sekvencie, alebo (b) liečivo, ktoré blokuje interakciu medzi TRAF-väzbovým proteínom a TRAF.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu obsahujú dostatočné množstvo aktívnej zložky na dosiahnutie zamýšľaného účinku. Farmaceutické kompozície ďalej môžu obsahovať vhodné, farmaceutický prípustné nosiče, obsahujúce farmaceutické pomocné látky a prísady, ktoré uľahčujú spracovanie aktívnej zlúčeniny na liečivé prípravky, ktoré sa môžu farmaceutický použiť, a ktoré môžu stabilizovať liečivé prípravky v liekových formách na podávanie subjektu, ktorý to potrebuje, čo všetko je dobre známe odborníkom v danej oblasti.

Usudzuje sa, že uvedený TRAF-väzbový proteín a jeho izoformy alebo izotypy sú exprimované v rôznych tkanivách a na významne rozdielnej úrovni a zrejme tiež v rôznom zastúpení izotypov obdobným spôsobom, ako prebieha expresia rôznych iných proteínov, zapojených do intracelulámych signálnych dráh, ako je uvedené v citovanej, spoločne vlastnenej, prihláške závislého patentu.

Uvedené rozdiely môžu prispievať k tkanivovo-špecifickým javom reakcie na FAS/APO1-ligand a TNF. Podobne, ako v prípade ďalších homológov od CED3/ICE (Wang et al., (1994); Alnemri et al., (1995)), autori tohto vynálezu už v minulosti ukázali (v uvedenej patentovej prihláške), že izoformy MACH, ktoré obsahujú neúplné oblasti CED3/ICE (napríklad MACHa3) majú inhibičný účinok na aktivitu ko-exprimovaných MACHal alebo MACHa2 molekúl; tiež sa zistilo, že blokujú FAS/APO1 a p55-R indukciu hynutia buniek. Expresia takých inhibičných izoforiem v bunkách môže vytvárať mechanizmus samoochrany bunky proti FAS/APO1- a TNF - sprostredkovanej cytotoxickosti. Rozsiahla heterogenita izoforiem MACH, ktorá značne presahuje doteraz pozorované heterogenity pri ktorýchkoľvek ďalších proteázach skupiny CED3/ICE by mohla umožňovať mimoriadne citlivo nastavovať funkcie aktívnych izoforiem MACH.

V zhode s týmto vynálezom sa izolovali tiež analógy/mutanty jedného z TRAF-väzbových proteínov, menovite TRAF2-väzbového proteínu NIK. Tieto analógy /mutanty NIK (pozri skôr a pozri príklad, uvedený ďalej) sú inhibičné k NIK-sprostredkovanej, ako aj inhibičné k indukcii aktivácie NF-κΒ, sprostredkovanej TNF receptormi, FAS/APO1 receptorom, jemu príbuznými proteínmi, IL-1 receptorom a ďalšími činidlami. Ako už bolo spomenuté, môžu preto mať TRAF-väzbové proteíny, alebo ich možné izoformy odlišné účinky v rôznych tkanivách, pokiaľ sa týka ich interakcie s TRAF proteínmi a ich vplyvu a tým na aktivitu TRAF proteínov, alebo na intracelulámu signalizáciu, sprostredkovanú proteínmi.

Tiež je možné, že niektoré z možných izoforiem TRAF-väzbového proteínu majú aj iné funkcie. NIK, alebo niektoré analógy NIK môžu napríklad pôsobiť tiež ako kotviace miesta na molekuly, ktoré sú zapojené do iných ako cytotoxických účinkov, napríklad do účinkov receptorov FAS/APO1 a TNF cez interakciu s TRAF2 alebo aj nezávisle od TRAF2.

V dôsledku jedinečnej schopnosti receptorov FAS/APO1 a TNF spôsobovať hynutie buniek, ako aj schopnosti receptorov TNF spúšťať ďalšie aktivity poškodzujúce tkanivá, odchýlky vo funkcii týchto receptorov môžu byť pre organizmus mimoriadne škodlivé. Skutočne sa ukázalo, že nadmerná alebo nedostatočná funkcia týchto receptorov prispieva k patologickým prejavom rôznych chorôb (Vassalli (1992); Nagata a Golstein (1995)). Identifikácia molekúl, ktoré sa zúčastňujú na signálnej aktivite uvedených receptorov a nájdenie cesty, ako modulovať aktivitu týchto molekúl môže určiť smer nových terapeutických prístupov. Z hľadiska možnej dôležitej úlohy TRAF proteínov, napríklad proteínov TRAF2, a preto interakcií TRAF-TRAF-väzbového proteínu, napríklad TRAF2-NIK proteínu v FAS/APO1 a TNF-sprostredkovanej aktivácii, zdá sa byť mimoriadne dôležité navrhnúť liečivá, ktoré môžu blokovať interakciu TRAF-TRAF väzbový protein, napríklad interakciu TRAF2-NIK, ak sa vyžaduje ničiť bunky (inhibíciou aktivácie NF-κΒ) a obrátene, ak sa vyžaduje zachovať bunky, túto interakciu treba podporiť (zosilniť aktiváciu NF-κΒ ).

Tento vynález sa tiež týka proteínov alebo iných ligandov, ktoré sa môžu viazať k TRAF-väzbovým proteínom podľa tohto vynálezu, čím modulujú/-sprostredkujú aktivitu TRAF-väzbových proteínov. Uvedené proteíny alebo ligandy sa môžu vytriediť skríningom, izolovať a produkovať ktorýmkoľvek z už uvedených spôsobov. Možno tak napríklad izolovať mnohé nové ligandy, obsahujúce proteíny, schopné väzby k proteínom NIK z tohto vynálezu (uvedené nové proteíny/ligandy s výnimkou známeho TRAF2 a možno I-kB, ak sa NIK skutočne viaže s I-kB).

Podrobnejšie už bolo uvedené, že nové TRAF-väzbové proteín-väzbové proteíny/ligandy, napríklad NIKväzbové proteíny môžu napríklad slúžiť ako inhibítory alebo enhancery (posilňujúce sekvencie, zosilňovače) NIK sprostredkovanej aktivity, alebo aktivity sprostredkovanej napríklad TRAF2 - NIK interakciou; potom majú dôležitú úlohu v rôznych patologických a iných situáciách, ako sa už uviedlo. Inou funkciou uvedených zoskupení TRAF-väzbový proteín-väzbové proteíny/ligandy by mohlo byť, že by slúžili ako špecifické činidlá na čistenie TRAF-väzbových proteínov, napríklad afinitnou chromatografiou; uvedené nové väzbové proteíny/ligandy zakotvené na vhodnej chromatografickej matrici vytvárajú tuhú alebo afinitnú podložku alebo matricu, cez ktorú sa prelieva roztok, extrakt alebo podobná forma, obsahujúca uvedené TRAF-väzbové proteíny, napríklad NIK a týmto spôsobom sa uľahčí jeho čistenie. Uvedené spôsoby afinitnej chromatografie sú už všeobecne známe a patria k bežným postupom v danom odbore.

Všetky z uvádzaných TRAF-väzbových proteínov, analógov, fragmentov, izoforiem a derivátov podľa tohto vynálezu sa podobne môžu použiť na čistenie afinitnou chromatografiou rôznych TRAF proteínov, ku ktorým sa viažu. Napríklad, TRAF2-väzbové proteíny, ako je NIK, a analógy, fragmenty a mutanty NIK (pozri ďalej uvedené príklady) sa môžu použiť pri čistení TRAF2 pomocou afinitnej chrotomatografie. Rovnakým spôsobom, ako protein NIK, sa preto izolovali analógy/mutanty z tohto vynálezu a produkovali (pozri ďalej uvedené príklady) s použitím uvedených a akýchkoľvek ďalších rovnocenných spôsobov, ktoré sú zrejmé odborníkom v danej oblasti (podrobnejšie rozvedené skôr). Uvedeným spôsobom možno identifikovať a produkovať akékoľvek iné TRAF2-väzbové proteíny. Uvedený spôsob identifikácie a produkcie týchto TRAF-väzbových proteínov, napríklad TRAF2-väzbových proteínov zahŕňa skríning, pri ktorom ktorom sa použije TRAF (napríklad TRAF2) protein, alebo pri najmenšom jeho špecifická časť (to znamená časť TRAF2 medzi aminokyselinami od 222 až po 501) ako substrát alebo „návnada“, aby sa získali proteíny alebo akýkoľvek iný ligand, schopné väzby k TRAF proteínu; nasledujú kroky identifikácia a charakterizácia tak získaných proteínov/ligandov a následne produkcia takých proteínov/ligandov, izolovaných v podstate v čistých formách. Všetky uvedené kroky prípravy sú v odbore dobre známe a sú podrobnejšie uvedené v predchádzajúcom a nasledujúcom texte.

Vynález sa teraz podrobnejšie opíše pomocou ďalej uvedených, rozsah vynálezu však neobmedzujúcich príkladov a nákresov.

Treba poznamenať, že postupy:

i) dvojhybridová skríningová a dvojhybridová β-galaktozidázová skúška expresie;

(ii) indukovaná expresia, metabolické značenie a imunoprecipitácia proteínov;

(iii) väzba in vitro ;

(iv) hodnotenie cytotoxickosti, a (v) northemový prenos a analýza sekvencii, ako aj ďalšie postupy, použité v ďalej uvedených príkladoch, boli už podrobnejšie opísané v doterajších publikáciách autormi tohto vynálezu z hľadiska iných signálnych proteínov a reakčných dráh (pozri napríklad Boldin et al., (1995a), (1995b) a Boldin et al., (1996)). Tieto postupy sa podrobne nachádzajú tiež v spoluvlastnených prihláškách závislých izraelských patentov 114 615, 114 986,115 319,116 588, 117 932 a 120 367, ako aj v zodpovedajúcej prihláške PCT číslo PCT/US96/10521). Plné zverejnenie všetkých uvedených publikácií a patentových prihlášok v ich celosti sa tu zahŕňa prinajmenšom v tom, čo sa týka podrobných experimentálnych postupov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 graficky znázorňuje štruktúru molekuly TRAF.

Obr. 2 a-b zjednodušene znázorňujú niektoré proteíny, ktoré sú v spojení s aktiváciou NF-κΒ vrátane nových TRAF-väzbových proteínov podľa tohto vynálezu (napríklad NIK), z ktorých obraz a je čiastková schéma a obraz b je úplnejšia schéma.

Obr. 3 a-b-c znázorňujú nukleotidovú sekvenciu 5'-konca klonu 9 (obr. 3a) a odvodenú kódovanú aminokyselinovú sekvenciu (obr. 3d).

Obr. 4 znázorňuje nukleotidovú sekvenciu klonu 10.

Obr. 5 a-b znázorňujú nukleotidovú sekvenciu klonu 15 (obr. 5a) a jeho odvodenú kódovanú aminokyselinovú sekvenciu (obr. 5b).

Obr. 6 znázorňuje nukleotidovú sekvenciu a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu NIK.

Obr. 7 znázorňuje zarovnanie sekvencie proteínu NIK so sekvenciou kinázy proteínu mMEKK myši (MAPK alebo ERK kináza myši) a niekoľkými ďalšími kinázami. Na obraze sú vyznačené oblasti, ktoré zodpovedajú konzervovaným motívom I až XI proteínových kináz.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiály a spôsoby

i) Knižnice cDNA

a) B-bunková cDNA knižnica

Použila sa oligo dT prímová knižnica, skonštruovaná z ľudských B buniek (Durfee et al., (1993)). Uvedené cDNA knižnice sa vložili do polohy Xhol do vektora pSEl 107, založenom na pACT fúziou s aktivačnou doménou GAL4.

b) cDNA knižnica ZgtlO z testis

Použila sa cDNA knižnica z ľudských semeníkov. Uvedená knižnica je hexanukleotidová prímová knižnica so strednou veľkosťou inzertov 200 až 400 bp.

ii) Kvasinkové kmene

Ako hostiteľské kmene sa na transformáciu a skríning použili dva kmene kvasiniek: kmeň HF7c, ktorý sa použil v dvojhybridovom skríningu a kmeň SFY526, ktorý sa použil pri β-galaktozidázovej analýze. Obidva kmene nesú auxotrofné značkovače trpí a leu2; významné je, že tieto kmene nemôžu rásť na minimálnom syntetickom médiu s nedostatkom tryptofánu a leucínu, iba ak sú transformované plazmidom, ktorý nesie divoký typ verzie týchto génov (TRPÍ, LEU2). Uvedené dva bunkové kmene nesú delečné mutácie v ich génoch GAL4 a GAL80 (mutácie gal4-542 a gal80-538).

Kmene SFY526 a HF7c v ich genotypoch nesú lacZ reportérové zoskupenie; v kmeni SFY526 fúzované k UAS a TATA časti promótora GALI; v kmeni HF7c tri kópie GAL4 17-mérovej súhlasnej sekvencie a časť TATA promótora CYC1 sú fúzované k lacZ. Obidva GALI UAS a GAL4 17-méry sú schopné reagovať na GAL4 transkripčný aktivátor. Kmeň HF7c navyše nesie reportérové zoskupenie HIS3, fúzované k UAS a časť TATA promótora GALI.

iii) Klonovanie ľudského TRAF2

Ľudský TRAF2 sa klonoval z HL60 knižnice cDNA (pre TRAF2 sekvenciu; ďalšie podrobnosti pozri Rothe et al., (1994); Rothe et al., (1995); Cheng et al., (1966), Hsu et al., (1966); a Wallach, (1996)). Použité priméry boli: a) 30-mérny priamy primér CAGGATCCTATGGCTGCAGCTAGCGTGAC, zodpovedajúci kódujúcej sekvencii hTRAF2, počínajúc od kodóna pre prvý metionín (podčiarknuté) a vrátane linkera s miestom BamHI; b) 32-mémy reverzný primér GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG, ktorý zahŕňa hTRAF2 génový stop kodón (podčiarknutý) a Sali reštrikčné miesto v jeho linkeri. Program PCR analýzy zahŕňal najprv denaturačný krok počas 2 minút pri 94 °C, nasledovaný 30 cyklami po 1 minúte pri 94 °C, 1 minútu pri 64 °C a 40 sekúnd pri 72 °C. Amplifikovaný ľudský TRAF2 sa potom vložil do BamHI - Sali miest vektora pGBT9 v spojení s GAL4 DNA väzbovej domény.

iv) Dvojhybridný skríning knižnice B-buniek

Dvojhybridný skríning je technika (podrobnosti pozri v uvedenej publikácii a prihláškach patentov), ktorá sa používa na identifikáciu faktorov, ktoré sú v spojení s konkrétnou molekulou, ktorá slúži ako „návnada“. V tomto vynáleze ako „návnada“ slúžil TRAF2, ktorý bol klonovaný do vektora pGBT9. TRAF2 bol koexprimovaný v kvasinkovom kmeni HF7c spolu s skríningovanou cDNA knižnicou B-buniek. Uvedený PCRklonovaný TRAF2 bol rekombinantne fúzovaný s CAL4 DNA-väzbovou doménou a skríningovaná cDNA knižnica sa fúzovala k GAL4 aktivačnej doméne vektora pSEl 107. Reportérovým génom v HF7c bol HIS3, fúzovaný k protismemej aktivačnej sekvencii (UAS) promótora GALI, ktorý reaguje na GAL4 transkripčný aktivátor. Na rast na platniach bez tryptofánu a leucínu sa selektovali transfomanty, ktoré obsahovali obidva plazmidy pGBT9 a pSE1107. V druhom kroku sa z platní zbavených tryptofánu, leucínu a histidínu a obsahujúcich 50 mmol.dm'³ 3-aminotriazolu (3AT) odobrali pozitívne klony, ktoré exprimovali dvojhybridné proteíny, ktoré vzájomne spolu reagujú, a preto aktivovali GAL1-HIS3.

v) β-galaktozidázová skúška

Odobrané pozitívne klony sa vystavili lacZ skúške vyfarbenia v SFY526 kvasinkových bunkách; postupovalo sa podľa návodov Clontech Laboratrories' Manual (podrobnosti sú v uvedenej publikácii a patentových prihláškach). V stručnosti, transformanty sa nechali rásť pri teplote 30 °C počas 2 až 4 dní, až sa dosiahol priemer asi 2 mm, potom sa preniesli na Whatmanove filtre. Filtre sa podrobili spracovaniu zmrazovaním a topením, aby sa dosiahla potrebná permeabilita buniek; potom sa ponorili do tlmivého roztoku (16,1 mg.ml’¹Na2HPO4.7H2O; 5,5 mg.ml'¹ NaH2PO₄.H₂O; 0,75 mg.mľ¹ KCI; 0,75 mg.ml’¹ MgSO₄.7H₂O, pH = 7), obsahujúcom 0,33 mg.mľ¹ X-gal a 0,35 mmol.dm’³ β-merkaptoetanolu. Kolónie sa monitorovali podľa vývoja modrého sfarbenia, ktoré indikuje indukciu β-galaktozidázy.

vi) Expresia klonovaných cDNA

Skonštruovali sa dva druhy expresných vektorov:

a) vektrory založené na pUHD10-3, obsahujúce otvorený čítací rámec (open reading frame, ORF) niektorého z klonov 9, 10 alebo 15, fúzovaného s hemoglutidínovým (HA) epitopom.

b) vektrory založené na pUHD10-3, do ktorých bola vložená oktapeptidová FLAG sekvencia práve pred klonovaný TRAF2, v tomto spise označované tiež ako FLAG/B6/TRAF2.

Konštrukty, obsahujúce ORF klonu 9, 10 alebo 15 sa transfektovali do HeLa-Bujardových buniek (o týchto bunkách bližšie pozri Gossen M., a Bujard, M. (1992)) buď samotné, alebo kotransfektované s GLAG/B6/TRAF2 s použitím spôsobu s fosforečnanom vápenatým (spôsob je opísaný napríklad v: Current Protocol in Molecular Biology, ed. Ausubel, F., M., et al.).

vii) Luciferázová skúška

Typicky sa odobralo 5.10⁵ transfektovaných buniek, trikrát premytých so studeným PBS, ktoré sa resuspendovali v 400 μΐ extrakčného tlmivého roztoku (0,1 mol.dm’³ roztok K2HPO4/KH2PO4 pH = 7,8; 1 mmol.dm’³ roztok DTT). Lýza buniek sa dosiahla trojnásobným zmrazením v tekutom dusíku a roztopením. Zvyšky buniek sa odstránili odstredením (5 minút pri 10 000 x g). Na luciferázovú skúšku sa k 50 μΐ lyzátu pridalo 200 μΐ luciferázového tlmivého roztoku (25 mmol.dm'³ glycylglycínu, 15 mmol.dm’³Κ2ΗΡΟ4/ΚΗ₂ΡΟ₄ pH = 7,8, 15 mmol.dm'³ MgSO₄, 4 mmol.dm’³ EGTA, 2 mmol.dm’³ ATP, 1 mmol.dm’³DTT). Do reakčnej zmesi sa potom pridalo 100 μΐ 0,2 mmol.dm’³ D-luciferínu, 25 mmol.dm'³ glycylglycínu a 1 mmol.dm’³ DTT. Luciferázová aktivita sa stanovovala odčítaním svetelnej emisie s použitím luminimetrického zariadenia 10 sekundovou integráciou (bližšie podrobnosti pozri v uvedených publikáciách a patentových prihláškach).

Príklad 1

Klonovanie nových klonov, klonu 9, klonu 10 a klonu 15

Knižnica cDNA, pripravená z B-buniek sa podrobila skríningu na proteíny, ktoré sa spájajú s TRAF2 s použitímdvojhybridovej techniky, ako sa opisuje v časti Materiály a spôsoby, odsek (iv). GAL4 DNA väzbová doména a transkripčná aktivačná doména boli nesené spolu iba v transformantoch, ktoré exprimovali TRAF2 a aj proteín, schopný interakcie s ním. Výsledkom bola aktivácia a expresia reportérového génu, v tomto prípade H1S3 fúzovaného k GAS a TATA časti GALI promótora.

Skríning poskytol približne 2 000 klonov, ktoré boli schopné rast na Trp-, Leu-, His- 3AT platniach. Na kotransfekciu buniek kmeňa SFY526 spolu s TRAF2, klonovaným do vektora GBT9, slúžili DNA, pripravené z 165 náhodne vybraných pozitívnych klonov. Na kolóniách transformovaných kvasinkových SFY526 kolónií sa vykonala skúška na β-galaktozidázovú aktivitu; postup skúšky pozri v časti Materiály a spôsoby (v). Vznikajúce modré zafarbenie poukazovalo na kvasinkové kolónie, ktoré obsahujú cDNA, kódujúce proteín alebo polypeptid, ktorý sa viaže k TRAF2.

Výsledky dvoch hybridových skríningov; schopnosť prenesených klonov rásť na 3AT platniach a schopnosť indukovať LacZ podľa merania modrého sfarbenia sú zhrnuté v tabuľke II. Zo zistených pozitívnych klonov dve cDNA kódovali pre známe proteíny: TRAF2 samotný, ktorý je schopný vlastnej asociácie a tvorby homodiméru, a lymfotoxínový β-receptor, ktorého intraceluláme domény sa ukázali ako schopné viazať TRAF2. Tri z klonovaných cDNA (klony 9, 10 a 15) boli nové.

Pozitívne klony sa ďalej skúšali skúškou na väzbovú špecifickosť, menovite sa skúšali na ich interakciu s irelevantnou návnadou. Ako sa uvádza v tabuľke III, klony 9 a 10 reagujú iba s TRAF2 a neviažu sa ani k jednému z veľkého počtu skúšaných irelevantných proteínov. Na druhej strane kloň 15 sa neviazal k MORT1, ani k intercelulámym doménam p55 a p75 TNF receptorov, ale vykazujú slabú väzbu k Lamínu a k Cyklínu D.

V snahe zúžiť oblasť TRAF2 molekuly, ktorá vstupuje do interakcie s klonmi 9, 10 a 15, sa pripravili dva ďalšie konštrukty. Jeden konštrukt obsahoval N-terminálnu časť molekuly TRAF2, aminokyseliny 1 až 221, ktoré zahŕňajú štruktúrne motívy „ring finger“ a „zink finger“. Druhý konštrukt zahŕňal iba C-koncovú časť molekuly, aminokyseliny 222 až 501, ktoré prekrývajú „doménu TRAF“ a ďalších 42 aminokyselín. Uvedené dva konštrukty slúžili ako „návnada“ v dvojhybridných skúškach. Výsledky zreteľne ukázali, že zatiaľ čo klony 9, 10 a 15 nevstupujú do interakcie s konštruktom obsahujúcim aminokyseliny 1 až 221 molekuly TRAF, všetky sa viažu k C-terminálovému konštruktu, obsahujúcemu uvedenú „doménu TRAF“ s rovnakou účinnosťou, ako sa viazali k TRAF2 molekule s úplnou dĺžkou reťazca.

Tabuľka II

Prehľad výsledkov dvojhybridného skríningu s použitím TRAF2 ako „návnady“ a klonov 9, 10 alebo 15

Rast na 50 mmol.dm'³3AT	Farebná skúška (minúty)	Identifikačný názov klonu, ako je určený jeho sekvenovaním	Počet nezávislých klonov
+++	10	TRAF2	150
++	20	nový kloň číslo 9	6
+++	15	nový kloň číslo 10	2
++++	10	Lymfotoxínový β-receptor	2
+	15	nový kloň číslo 15	5

Tabuľka III

Skúšky špecifickosti (interakcia s irelevantnou „návnadou“ v dvojhybridovej skúške)

„Návnada“	Kloň 9	Kloň 10	Kloň 15
LAMIN	-	-	+
cyklín D	-	-	+
p75-IC	-	-	-
p55-IC	-	-	-
MORT1	-	-	-
TRAF2	+++	+++	+++

Vykonaním niekoľkých PCR krokov na cDNA klonu 10 sa klonovala úplná dĺžka cDNA z knižnice cDNA, získanej z RNA z tkaniva človeka. Tento proteín sa označil NIK ako skratka pre „NF-κΒ indukujúcu kinázu“ pre skutočnosť, že obsahuje proteínovú kinázovú oblasť( pozri ďalej). Treba poznamenať, že keď bola (pred získaním NIK pomocou PCR) pôvodne analyzovaná sekvencia klonu 10 bolo zrejmé, že kóduje pre proteín, pôvodne označovaný NMP1 (pozri spoluvlastnenú závislú ÍL 117 800). Tento NMP1 alebo klonom 10 kódovaný proteín sa považoval za proteín, ktorý má sekvenciu, zodpovedajúcu I až XI z konzervatívnych motívov, ktoré sú charakteristické pre Ser/Thr proteínové kinázy.

Príklad 2

Sekvenovanie nových klonov

Tri z nových cDNA klonov (klony 9, 10 a 15) sa čistili, amplifikovali v E. coli a ich DNA boli predmetom sekvenčnej analýzy. Zistilo sa, že všetky tri klony sú čiastkové cDNA klony.

Celková dĺžka klonov 9, 10 a 15 bola okolo 2 000, 2 700 a 1 300 párov báz.

Obr. 3 a 5 znázorňujú sekvenovanú časť klonov 9 a 15; obr. 4 znázorňuje úplnú sekvenciu klonu 10.

Obr. 5a a 5b znázorňujú úplnú nukleotidovú sekvenciu klonu 15, sekvenovaného z obidvoch koncov (5'a 3') (obr. 5a) a z nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (obr. 5b). Zistilo sa, že kloň 15, ktorý je čiastkovým cDNA klonom, kóduje proteín dlhý 172 aminokyselín.

Klony 9 a 15 sú čiastkové klony, ktoré postrádajú väčšinu ich 5' zakončenia kódujúcich DNA sekvencií. Odvodené aminokyselinové sekvencie, znázornené na obr. 3b, 4b a 5b, všetky začínajú od prvého nukleotidu príslušného klonu.

Sekvencia klonu 10 (čiastkový cDNA kloň), ktorý bol naj dôkladnej šie analyzovaný, kóduje pre proteín označovaný NMP1, ako sa uvádza, obsahujúci Ser/Thr proteínové kinázové motívy. Celé dĺžky cDNA klonu, získané z PCR s použitím uvedeného klonu 10 umožnili odhaliť novú TRAF2-väzbovú kinázu NIK, ako sa už opísalo.

Úplná nukleotidová sekvencia a jej odvodená aminokyselinová sekvencia NIK sú uvedené na obr. 6, v ktorom iniciátor ATG je pri nukleotide číslo 232 podčiarknutá a v ktorom stop kodón pri nukleotide číslo

3073 je vyznačený hviezdičkou. Celkom sekvenovaný kloň NIK z obr. 6 má nukleotidovú dĺžku 4 596 nukleotidov, v ktorých je zahrnutá kódujúca sekvencia NIK, ktorá kóduje pre NIK proteín o 947 aminokyselinových zvyškoch.

Prieskum údajov v banke odhalil, že nová aminokyselinová sekvencia NIK vykazuje mimoriadne vysokú homológiu k skupine kináz, z ktorých niektoré sú známe, že slúžia ako MAP kináza kináza kináza.

Obr. 7 znázorňuje zarovnanie:

MEKK (Sl) myši,

Byr2 (S2),

Tpl-2 (S3),

Oncogén Ewingovho sarkómu (S4),

SS3 (S5), (STE11)(S6), (NPK1)(S7), (BCKl)(S8)a (NIK)(S9).

V niektorých z uvedených kináz bola identifikovaná onkogénna aktivita, ktorá sa prejavuje, ak sú kinázy v mutantnej forme.

Príklad 3

Expresia klonovaných cDNA a ich koimunoprecipitácia s TRAF2

HeLa-Bujardove bunky sa transfektovali s TRAF2 v spojení s FLAG, založenom na pUHD10-3 expresnom vektore a s konštruktom, obsahujúcim ORF niektorého z klonov 9, 10 alebo 15, fúzovaného k HA epitopu, ako sa opisuje v časti Materiály a spôsoby (iv). Bunka sa potom nechali rásť 24 hodín v Dulbecovom modifikovanom Eagleho prostredí (DMEM) s 10 % teľacieho séra s prídavkom ³⁵S-metionínu a ³⁵S-cysteínu. Na koniec inkubačnej doby sa bunky podrobili lýze v rádioimunitnom precipitačnom tlmivom roztoku (10 mmol Tris-HCl, pH 7,5, 150 mmol NaCl, 1 % nonidentu P-40, 1 % deoxycholátu, 0,1 % SDS, a 1 mmol EDTA; 1 ml na 5.10⁵ buniek). Lyzát sa vyčíril inkubáciou s irelevantným antisérom králika a perličkami Protein G-Sepharose (Pharmacia, Švédsko). Imunoprecipitácia sa vykonala 1 hodinovou inkubáciou pri 4 °C alikvotných podielov lyzátu s anti-FLAG (zakúpené od spoločnosti Eastman Kodak Co.) alebo anti-HA (kloň 12CASA5 (Field, J., et al., (1988))) monoklonovými protilátkami. Exprimované proteíny sa analyzovali na SDS-PAGE géli s následnou autorádiografiou.

Výsledky týchto experimentov ukazujú, že čiastkové cDNA klony 9, 10 a 15 kódovaných proteínov majú molekulové hmotnosti okolo 50 až 65, 45 a 26 kD.

Nezaznamenala sa nijaká interakcia klonu 15 s TRAF2, ale proteín kódovaný klonmi 9 a 10 (NIK), ako aj úplná dĺžka NIK boli imunoprecipitované s proteínom TRAF2. Vzorky buniek, ktoré boli kotransfektované s TRAF2 a tiež jedným z týchto dvoch klonov a imunoprecipitované, buď s anti-FLAG alebo s anti-HA protilátkami a následnou analýzou na SDS-PAGE, ako sa opisuje, vykázali tri pásy v každom pruhu; jeden pás zodpovedajúci buď klonu 9 alebo 10, kódovanému proteínom a ďalšie dva pásy tvoria dublet pre 42 a 44 kD, zodpovedajúci TRAF2 proteínu.

Príklad 4

Funkčné skúšky

Zistilo sa, že pri gólovej retardačnej analýze má NIK NF-κΒ indukciu. Typicky sa transfektovalo 10⁶293EBNA buniek buď s 10 pg klonu 10 v pcDNA3 (obr. 7, pruh 1), 3 pg pcDNA3 obsahujúcim cDNA pre p75 TNF receptor (obr. 7, pruh 3), alebo s obidvoma, klonom 10 (10 pg) a p75 TNF receptorom (3 pg), obr. 7 pruh 2. Pri každej tejto transfekcii bolo celkové množstvo trasnfektovanej DNA 15 pg s „prázdnym“ pcDNA3 vektorom. Ako porovnávacia kontrola slúžili 293 EBNA bunky, transfektované s 15 pg samotného vektora pcDNA3 (obr. 7, pruh 4). Bunky rástli 24 hodín v prostredí DMEM + 10 % teľacieho séra, potom sa oddelili a spracovali podľa Schreibera et al.,(Schreiber et al., (1989)). Vzorky boli ďalej spracované na 5 %-nom polyakrylamidovom géli. Monitoroval sa NF-κΒ s použitím súpravy ³²P-rádioznačených oligonukleotidov, zodpovedajúcich NF-κΒ väzbovému miestu ako sondy. (Sondy boli GATGCCATTGGGGATTTCCTCTTT a CAGTAAAGAGGAAATCCCCAATGG).

Ako je zrejmé z tabuľky IV, NIK indukoval NF-κΒ ešte účinnejšie ako TRAF2. Na druhej strane kloň 10 vo všeobecnosti nemal uvedený účinok.

Analýza s reportérovým génom sa vykonala nasledovne: bunky 293 EBNA sa kotransfektovali s vektorom pcDNA3, obsahujúcim HIV LTR, viazaný k luciferázovému reportérovému génu buď spolu s pcDNA3 plazmidom, obsahujúcom cDNA pre p75 TNF receptor, alebo s pcDNA3 plazmidom, obsahujúcim kloň 10 cDNA, alebo s pcDNA3 plazmidom, obsahujúcim cDNA aj pre p75 TNF receptora aj plazmid pcDNA3, uvedený v tabuľke IV a V.

Výsledky v tabuľke V ukazujú, že

a) transfekcia klonu 10 neaktivuje NF-κΒ indukciu, zatiaľ čo NIK áno;

b) kloň 10, ako aj NIK, v ktorom bolo aktívne miesto lyzínu nahradené alanínom (NIK ), silne inhiboval NF-κΒ indukciu s cDNA, uvedenými v prvom stĺpci tabuľky IV.

Delécia 3' UTR z NIK (ΝΙΚ-3'UTR) značne zvyšuje jeho expresiu a následne jeho schopnosť blokovať NF-κΒ indukciu, ak je exprimovaný v mutantnej forme.

Tabuľka IV

Aktivácia NF-κΒ účinkom NIK, gélová retardačná analýza. Čísla znamenajú počty rádioaktívnych rozpadov, ako boli stanovené fosfozobrazovacou platňou („phosphoimager plate“)

T ransfektovaná cDNA	počet rozpadov	plocha (mm )
prázdny vektor	327	70,7
TRAF2	3 411	70,7
NIK	6 532	70,7
kloň 10	343	70,7

Tabuľka V

Dominantne-negatívny účinok klonu 10, NIK K->A mutanta na indukciu NF-κΒ nadexpresiou TRAF2, TRADD, MORT1/FADD, TRNF-I, TNFR-II, chimérou TNFR-I/FAS, RIP a aktivácia NF-κΒ účinkom NIK. Luciferázová skúška.

Induktor NF- kB	prázdny vektor	NIK	NIK3'UTR	kloň 10	NIK*	NIK*3 UTR	TRAF2 225-501
TRAF2	300	1 000		25	30		ND
TRADD	300	800	1 000	100	100	5	ND
MORT1/FADD	300	1 000		25	80		90
TNFR-1	200	800	1 000	50	100	5	ND
TNFR-II	200	750	800	20	90	6	ND
chiméra FAS	300	1 200		25	50		30
RIP	300	800		75	50		ND
NIK	500			100		10	ND
TNF	200			80
RelA	1 000	ND	ND	1 000	ND	ND	ND

Pozn.: ND = nestanovené

Príklad 5

Ďalšie charakteristiky NIK

Ako doplnok k skúškam špecifickosti z príkladu 2, ďalšie dvojhybridné skúšanie väzbových vlastností NIK overilo (výsledky sa neuvádzajú), že prvotne izolovaný čiastkový kloň NIK (NIK 624-947)sa špecificky viaže k C-terminálnej oblasti TRAF2 (doména C-TRAF ), a na rozdiel od neho sa NIK s úplnou dĺžkou viazal s C-TRAF doménou a aj s jej protismemou oblasťou (doména N-TRAF). NIK sa neviazal tiež k TRAF3. Ďalej, chimérové molekuly, obsahujúce doménu C-TRAF z TRAF2 a N-terminálna časť z TRAF3 môžu viazať čiastkovú NIK molekulu (NIK 624-947), ale nie NIK s úplnou dĺžkou, čo poukazuje, že väzba úplnej dĺžky NIK k TRAF2 vyžaduje obidve domény TRAF2: doménu C-TRAF aj doménu N-TRAF.

Okrem toho NIK neasociuje sám so sebou ani viazaný k intracelulámym doménam receptorov TNF p55 a p75, receptora CD40 (člen receptorovej skupiny TNF / NGF) a receptora FAS/APO1 (CD 95 receptor). NIK sa neviaže tiež k intracelulámym proteínom, združeným s týmito receptormi, ako sú napríklad TRADD, MORT1 a RIP. Tieto výsledky sú v zhode s uvedenými výsledkami v tabuľke II čo sa týka špecifickosti väzbových vlastností proteínov, kódovaných klonmi 9, 10 a 15. Rôzne interakcie medzi rôznymi receptormi a proteínmi sú schematicky vyznačené na obr. 2a a 2B, pričom obr. 2b je úplnejší.

Analýza northemovým prenosom ukázala, že jestvuje iba jeden transkript NIKu, exprimovaný rôznymi tkanivami na rôznych úrovniach; uvedený transkript má veľkosť okolo 5 000 nukleotidov, ktoré sú v podstate rovnaké ako klonované NIK cDNA (ako sa poznamenáva, pozri obr. 6).

Ako už bolo uvedené v súvislosti s proteínom, kódovaným klonom 10 (pôvodne označovaného NMP1), proteín NIK s úplnou dĺžkou má tiež serínový/-treonínový proteínový kinázový motív, podobný niekoľkým MAP kináz kináz kinázam (MAPKKK), ako to tiež vyplýva zo zarovnania sekvencií, znázornených na obr. 7.

Skúšky in vitro NIK kinázovej aktivity ukázali, že NIK sa môže autofosforylovať, ale nie vtedy, ak aktívne lyzínové miesto a priľahlý lyzín sú nahradené alanínom (označenie analógu alebo mutantného NIK ako

NIK KK429-430AA, poukazuje na náhradu lyzínu v polohách 429 a 430 alanínom). Toto koreluje tiež s uvedenými výsledkami z príkladu 4, ktoré sa týkajú mutantného NIK* a sú uvedené v tab.IV.

Ako už bolo poznamenané, nadexpresia NIK(u) v 293 EBNA bunkách, indukovala NF-κΒ v ešte väčšom rozsahu ako nadexpresia TRAF2, ale nadexpresia čiastkového NIK (NIK 624 - 947) nespôsobila aktiváciu

NF-κΒ. Navyše, uvedený NIK analóg/mutant NIK KK429 - 430AA tiež nespôsobuje aktiváciu NF-κΒ, ak je v týchto bunkách nadbytočné exprimovaný (nadexprimovaný). Potom indukcia NF-κΒ účinkom NIK závisí od plnej kinázovej funkcie NIK. Obrátene RIP (pozri obr. 2a a 2b), ktorý má tiež kinázovú doménu môže stále indukovať aktiváciu NF-κΒ, aj keď je kinázová aktivita zrušená mutáciou.

Aktivácia NF-κΒ po nadexpresii NIK(u) bola nerozlíšiteľná od uvedenej aktivity, produkovanej spraco10 vaním buniek s TNF; a ako u TNF alebo TRAF2 nadexpresii boli základné zložky NIKom aktivovaného NFkB tiež p50 a p65. Nadexpresia NIK(u) spôsobila degradáciu ΙκΒα a blokovanie tejto degradácie s N-acetylLeu-Leu-norleucinolom (ALLN) malo za následok (ako s TNF) akumuláciu IkB molekúl, ktoré majú pomalšiu migráciu pri SDS-PAGE, poukazujúcu na fosforylovaný ΙκΒα.

Ďalšie skúšky ukázali, že NF-κΒ môže byť v bunkách 293-EBNA aktivovaný s TNF, ako aj nadexpresiou receptorov TNF p55 a p75, alebo nadexpresiou recpetora TNF p55, v ktorom intraceluláma doména p55 TNF receptora je nahradená doménou receptora FAS/APO1. NF-κΒ môže byť aktivovaný tiež nadexpresiou TRAF2, TRADD, RIP alebo MORT1, ale nie deletovaným mutantom MORT1, v ktorom chýba oblasť proti smeru „smrtiacej domény“ z MORT1. Ako už bolo poznamenané, NIK s plnou dĺžkou indukuje aktiváciu NF-κΒ, ale nie mutantný NIK KK429 - 430AA, ani čiastkový NIK (NIK 624 - 947), B. Expresia mutanta

NIK KK429 - 430AA, alebo NIK 624 - 947 v 293-EBNA bunkách spolu s ktorýmkoľvek iným, skôr uvedeným činidlom, to znamená s receptormi alebo so združenými proteínmi, má navyše za následok blokovanie indukcie aktivácie NF-κΒ všetkými z týchto činidiel, čo poukazuje na skutočnosť, že aktivita NIK je priamo zapojená do indukcie NF-κΒ. Podobne pozorovaná inhibícia inaktívnymi molekulami NIK koreluje s menším znížením IkB.

NF-κΒ je aktivovaný tiež s IL-1 (pozri schému na obr. 2b). Tento účinok sa zdá byť nezávislý od TRAF2 (IL-1 neviaže TRAF2 a účinok IL-1 nie je blokovaný expresiou TRAF2 dominantne negatívneho mutanta). Uvedený účinok IL-1 je však inhibovaný expresiou mutantov NIK. Pozorovaná NF-κΒ aktivita po nadexpresii homológa p65 Rel v 293-EBNA bunkách navyše nebola ovplyvnená koexpresiou kinázou deficitných mutantov NIK, čo poukazuje na to, že NIK priamo neovplyvňuje funkciu Rel proteínov, ale zúčastňuje sa na ich receptorovo-indukovanej aktivácii.

Cytotoxická aktivita TNF (zjavne sprostredkovaná s MORT1 združenou proteázou MACH, pozri obr. 2b) je predmetom negatívnej regulácie niektorými NF-κΒ indukovateľnými génmi. Antagonizujúce dôsledky génovej indukcie, sprostredkovanej NF-κΒ a aktivácie MACH môžu vysvetľovať, prečo TNF sám, ako aj IL-1 môžu vyvolať bunkovú rezistenciu proti cytotoxickosti TNF. V súlade s uvedeným a v zhode s týmto vy35 nálezom sa tiež zistilo, že expresia NIK dominantne negatívnych mutantov v 293-EBNA bunkách významne zvyšuje ich citlivosť na ničenie účinkom TNF, a že nadexpresia prírodného (s úplnou dĺžkou, divoký typ) NIK inhibuje ničenie uvedených buniek účinkom TNF, alebo účinkom nadexpresie p55 TNF receptora; (tento receptor má intracelulámu doménu, obsahujúcu oblasť „smrtiacej domény“, ktorá - ak je exprimovaná v bunkách - za neprítomnosti TNF môže vyvolať jej vlastnú bunkovú cytotoxickosť - pozri citované publikácie autorov tohto vynálezu a spoluvlastnené závislé prihlášky).

Príklad 6

Ďalšie funkčné skúšky biologickej aktivity NIK

V zhode s týmto vynálezom sa tiež zistilo, že expresia NIK- dominantne negatívnych mutantov mohla tiež blokovať indukciu aktivácie NF-κΒ v 293-EBNA bunkách ďalšími indukčnými činidlami, ktoré zahŕňajú napríklad (i) známy bakteriálny endotoxín, lipopolysacharid (LPS); (ii) známy acetát-myristát forbolu, ktorý je známy ako proteínový kinázový C aktivátor; (iii) HTLV-1 protein TAX.

Ďalej sa zistilo, že expresia dominantne -negatívnych mutantov NIK v 293-EBNA bunkách nemá v podstate vplyv na TNF indukovanú aktiváciu Jun kinázy, čo poukazuje na to, že NIK pôsobí špecifickým a prav50 depodobne priamym spôsobom na posilnení fosforylácie IkB bez ovplyvnenia kináz MAP, zapojených do fosforylácie Jun.

Z hľadiska všetkého, čo sa doteraz uviedlo vyplýva, že kinázová aktivita NIK je časťou signálnej kaskády, ktorá je zodpovedná za aktiváciu NF-κΒ a ktorá je spoločná dvom TNF receptorom, FAS/APO1 receptoru a IL-1 receptoru. Zdá sa, že NIK má v tejto kaskáde špecifickú úlohu. Väzba NIK k TRAF2 môže slúžiť k tomu, aby bol NIK ovplyvňovaný obidvoma uvedenými receptormi. Podľa podobnosti s MAP kinázovou kaskádou môže NIK potom, ako bol privedený s TRAF k stimulovaným receptorom, slúžiť ako substrát pre kinázu (MAPKKKK); a keď je NIK fosforylovaný, fosforyluje a aktivuje iné kinázy (alebo môže priamo vyvolať aktiváciu NF-κΒ priamou fosforyláciou IkB). Uvedená IL-l-vyvolaná NF-κΒ aktivácia je nezávislá od TRAF2, a preto aktivácia NIK receptorom IL-1 môže byť sprostredkovaná ďalším proteínom IRAK, sérino27 vou/treonínovou kinázou, ktorá je po stimulácii rekrutovaná k IL-1 receptoru (Cao et al., (1996b)). Ako už bolo poznamenané, vhodným terčom pre NIK, alebo pre ním aktivovanú kaskádu je IkB. NIK môže tiež fosforylovať TRAF proteíny alebo regulačné proteíny, ktoré sa k nemu viažu, napríklad TANK-I/TRAF (pozri Cheng a Baltimore, (1996)), vytvárajúc tak kotviace miesta pre ďalšie proteíny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid, ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ, ktorý obsahuje:

a) aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2;

b) aminokyselinovú sekvenciu fragmentu a), ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ;

c) aminokyselinovú sekvenciu analógu a) alebo b), ktorý nemá viac ako desať zmien v aminokyselinovej sekvencií a) alebo b), pričom každá takáto zmena je substitúciou, deléciou alebo inzerciou aminokyseliny, pričom tento analóg sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ.
2. Izolovaný polypeptid podľa nároku 1, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2.
3. Izolovaná DNA sekvencia kódujúca polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.
4. Izolovaná DNA sekvencia kódujúca polypeptid podľa nároku 1, ktorý sa viaže na TRAF2 a moduluje aktivitu NF-κΒ, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej:

(i) cDNA sekvenciu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1;

(ii) fragment sekvencie (i), ktorý kóduje polypeptid viažuci sa na TRAF2 a modulujúci aktivitu NF-κΒ.
5. Izolovaná DNA sekvencia podľa nároku 4, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 1.
6. Vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5.
7. Vektor podľa nároku 6, ktorý je schopný exprimovať sa v eukaryotickej hostiteľskej bunke.
8. Vektor podľa nároku 6, ktorý je schopný exprimovať sa v prokaryotickej hostiteľskej bunke.
9. Transformovaná eukaryotická alebo prokaryotická hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku

6.
10. Spôsob produkcie TRAF-väzobného proteínu, jeho izoformy, fragmentu alebo anlógu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa pestovanie transformovanej hostiteľskej bunky podľa nároku 9 v podmienkach vhodných na expresiu tohto proteínu, jeho izoformy, fragmentu alebo analógu, v prípade potreby post-translačnú modifikáciu, a izoláciu exprimovaného proteínu, jeho izoformy, fragmentu alebo analógu.
11. Protilátky alebo ich aktívne fragmenty špecifické pre polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.
12. Spôsob izolácie a identifikácie polypeptidu podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je schopný priamo sa viazať na TRAF2, vyznačujúci sa tým, že sa aplikuje kvasinkový dvojhybridný postup, pri ktorom je sekvencia kódujúca TRAF2 nesená jedným hybridným vektorom, a sekvencia z cDNA knižnice alebo z genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom tieto vektory sa potom použijú na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, následne sa extrahuje druhý hybridný vektor na získanie sekvencie kódujúcej proteín, ktorý sa viaže na TRAF2.
13. Farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku najmenej jeden polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.
14. Farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín, ktorý je schopný viazať sa na bunkový povrchový receptor, a kódujúci najmenej jeden polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.
15. Farmaceutický prostriedok na moduláciu TRAF2 modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú zložku obsahuje oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense sekvenciu mRNA kódujúcej polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.
16. Farmaceutický prostriedok na prevenciu alebo liečenie patologického stavu asociovaného s indukciou NF-κΒ, na ktorý sa viaže polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo proteínu podľa nároku 1 alebo 2, alebo DNA molekuly, ktorá ho kóduje tento proteín.
17. Spôsob skríningu ligandu schopného viazať sa na polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie afinitnej chromatografickej matrice, na ktorú je pripojený polypeptid, do kontaktu s bunkovým extraktom na naviazanie ligandu na túto matricu, a následné eluovanie, izoláciu a analýzu ligandu.
18. Spôsob identifikácie a izolácie DNA kódujúcej polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa aplikáciu kvasinkového dvojhybridného postupu, pri ktorom je sekvencia kódujúca polypeptid nesená jedným hypridným vektorom a sekvencie z cDNA alebo z genomickej DNA knižnice sú nesené druhým hybridným vektorom, transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek týmito vektormi, izoláciu pozitívne transformovaných buniek a extrakciu druhého hybridného vektora na získanie sekvencie kódujúcej uvedený ligand.
19. Anti-sense oligonukleotid pozostávajúci zo sekvencie komplementárnej s aspoň časťou mRNA kódujúcej TRAF2-väzobný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2, pričom tento antisense oligonukleotid je schopný účinne blokovať transláciu uvedenej mRNA.

20. Použitie polypeptidu podľa nároku 1 alebo 2 na výrobu farmaceutického prostriedku na podávanie pacientovi, ktorý trpí patologickým stavom asociovaným s indukcou NF-κΒ, na ktorý sa viaže polypeptid podľa nároku 1 alebo 2.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Yeda Research and Development Co. Ltd.

(B) Ulica: Weizmann Inštitúte of Science (C) Mesto: P.O. Box 95 (D) Štát: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 100 (G) Telefón: +972-8-9 344 093 (H) Fax: +972-8-9 470 739 (A) Meno: Dávid Wallach (B) Ulica: 24 Borochov Street (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 406 (A) Meno: Nikolaj Malinin (B) Ulica: Beit Clore, Weizmann Inštitúte of Science (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 100 (A) Meno: Mark Boldin (B) Ulica: Beit Clore, Weizmann Inštitúte of Science (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 100 (A) Meno: Andrej Kovalenko (B) Ulica: Beit Clore, Weizmann Inštitúte of Science (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 100 (A) Meno: Igor Mett (B) Ulica: 60 Levin Epstein Street (C) Mesto: Rehovot (E) Krajina: Izrael (F) Poštový kód (ZIP): 76 462 (ii) Názov vynálezu: Modulátory faktora združeného s receptormi TNF (TRAF), ich príprava a použitie (iii) Počet sekvencií: 11 (iv) Počítačom čitateľný tvar:

(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Programové vybavenie: Patentln Release No. 1, verzia 1.30 (EPO) (v) Údaje súčasnej prihlášky

Číslo prihlášky: PCT/IL97/00 117 (vi) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

5 (A) Číslo prihlášky: IL 117 800 (B) Dátum podania: 2. apríl 1996 (vi) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: IL 119 133 (B) Dátum podania: 26. august 1996 ¹⁰ (2) Údaje o sekvencii SEQ ID NO: 1 :

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 1 906 párov báz

15 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 1:

CATTGGGTCA CGCGGTGGCG GCGCTCTAGA ATAGTGGATC CCCCGGGCTG CAGGAATTCG 60 ATTCGAGGCC ACGAAGGCCG GCGGCGCGGC GCANGCACCG GCCCGGGGAN AGGCNCCATG 120 AGCGGATCNC NGAACNATGA CAAAAGACAA TTTCTGCTGG AGCGACTGCT GGATGCAGTG 180 AAACAGTGCC AGATCCGCTT TNGAGGGAGA AAGGAGATTG CCTCGGATTC CGACAGCAGG 240 GTCACCTGTC TGTGTGCCCA GTTTGAAGCC GTCCTGCAGC ATGGCTTGAA GAGGAGTCGA 300 GGATTGGCAC TCACAGCGGC AGCGATCAAG CAGGCAGCGG GCTTTGCCAG CAAAACCGAA 360 ACAGAGCCCG TGTTCTGGTA CTACGTGAAG GAGGTCCTCA ACAAGCACGA GCTGCAGCGC 420 TTCTACTCCC TGCGCCACAT CGCCTCAGAC GTGGGCCGGG GTCGCGCCTG GCTGCGCTGT 480 GCCCTCAACG AACACTCCCT GGAGCGCTAC CTGCACATGC TCCTGGCCGA CCGCTGCAGG 540 CTGAGCACTT TTTATGAAGA CTGGTCTTTT GTGATGGATG AAGAAAGGTC CAGTATGCTT 600 CCTACCATGG CAGCAGGTCT GAACTCCATA CTCTTTGCGA TTAACATCGA CAACAAGGAT 660 TTGAACGGGC AGAGTAAGTT TGCTCCCACC GTTTCAGACC TCTTAAAGGA GTCAACGCAG 720 AACGTGACCT CCTTGCTGAA GGAGTCCACG CAAGGAGTGA GCAGCCTGTT CAGGGAGATC 780 ACAGCCTCCT CTGCCGTCTC CATCCTCATC AAACCTGAAC AGGAGACCGA CCCTTGCCTG 840 TCGTGTCCAG GAATGTCAGT GCTGATGCCA AATGCAAAAA GGAGCGGAAG AAGAAAAAGA 900 AAGTGACCAA CATAATCTCA TTTGATGATG AGGAAGATGA GCAGAACTCT GGGGACGTGT 960 TTAAAAAGAC ACCTGGGGCA GGGGAGAGCT CAGAGGACAA CTCCGACCGC TCCTCTGTCA 1020 ATATCATGTC CGCCTTTGAA AGCCCCTTCG GGCCTAACTC CAATGGAATC AGAGCAGCAA 1080 CTCATGGAAA ATTGATTCCC TGTCTTTGAA CGGGGAGTTT GGGTACCAGA AGCTTGATGT 1140 GAAAAGCATC GATGATGAAG ATGTGGATGA AAACGAAGAT GACGTGTATG GAAACTCATC 1200 AGGAAGGAAG CACAGGGGCC ACTCGGAGTC GCCCGAGAAG CCACTGGAAG GGAACACCTG 1260 CCTCTCCCAG ATGCACAGCT GGGCTCCGCT GAAGGTGCTG CACAATGACT CCGACATCCT 1320