PL199214B1 - Sekwencja DNA, białko wiążące RAP-2, jego izoforma, fragment lub analog, sposób izolowania i identyfikowania białek o właściwościach wiązania RAP-2 oraz zastosowanie jednego lub więcej białek wiążących RAP-2 - Google Patents

Abstract

Rozwi azania wed lug wynalazku nale za do dziedziny receptorów przynale znych do nadrodziny receptorów TNF/NGF oraz kontrolowania ich funkcji biologicznych. W szczególno sci przedmiotem wynalazku jest bia lko wi azace RAP-2 (skrót od bia lko towarzysz ace RIP-2, ang. RIP-associated prote- in-2), jego izoforma, fragment lub analog, sekwencja DNA je koduj aca, sposób izolowania i identyfi- kowania bia lek o w la sciwo sciach wi azania RAP-2 oraz zastosowanie jednego lub wi ecej bia lek wiaz a- cych RAP-2. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA, białko wiążące RAP-2, jego izoforma, fragment lub analog, sposób izolowania i identyfikowania białek o właściwościach wiązania RAP-2 oraz zastosowanie jednego lub więcej białek wiążących RAP-2.

Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny receptorów należących do nadrodziny receptorów TNF/NGF oraz kontrolowania ich funkcji biologicznych. Nadrodzina receptorów TNF/NGF obejmuje receptory, takie jak receptory czynnika martwicy nowotworu p55 i p75 (TNF-R, zwane dalej p55-R i p75-R) oraz receptor liganda FAS (zwany również FAS/APO1 albo FAS-R, zwany dalej FAS-R) i inne. Konkretnie, wynalazek dotyczy nowych białek, które wiążą się z innymi białkami, które same wiążą się pośrednio albo bezpośrednio z członkami rodziny receptorów TNF/NGF i innymi białkami modulacji wewnątrzkomórkowej.

Bardziej szczegółowo, wynalazek odnosi się do jednego z tych białek, dalej określanego jako RAP-2 (skrót od białko towarzyszące RIP-2, ang. RIP-associated protein-2), a w szczególności dotyczy białek wiążących RAP-2.

RAP-2 wiąże się z RIP (białko oddziałujące z receptorem, ang. receptor interacting protein) i jest zdolne do modulowania albo pośredniczenia w działaniu RIP, a w ten sposób również zdolne do modulowania albo pośredniczenia, bezpośrednio albo pośrednio, w działaniu innych białek, które wiążą się z RIP bezpośrednio albo pośrednio. Białka wiążące RAP-2 są modulatorami/mediatorami funkcji RAP-2.

Czynnik martwicy nowotworu (TNF-α) oraz limfotoksyna (TNF-β) (dalej, TNF dotyczy zarówno TNF-α, jak i TNF-β) są wielofunkcyjnymi cytokinami prozapalnymi, wytwarzanymi głównie przez fagocyty jednojądrzaste, które wywierają wiele działań wobec komórek (Wallach (1986) w: Interferon 7 (red. Ion Gresser), str. 83-122, Academic Press, Londyn; oraz Beutler i Cerami (1987)). Zarówno TNF-α, jak i TNF-β zapoczątkowują swe działanie przez związanie się ze swoistymi receptorami komórkowymi na powierzchni komórek. Niektóre z tych efektów są korzystne dla organizmu: mogą one, np. zniszczyć komórki nowotworowe albo zakażone wirusem oraz wspomagać działanie przeciwbakteryjne granulocytów. Tym sposobem, TNF przyczynia się do obrony organizmu przed nowotworami i czynnikami zakaźnymi oraz umożliwia powrót do zdrowia po urazie. Tak więc, TNF można zastosować jako czynnik przeciwnowotworowy, w którym to zastosowaniu, wiąże się on ze swoim receptorem na powierzchni komórek nowotworowych i zapoczątkowuje zjawiska prowadzące do śmierci komórek nowotworowych. TNF można również zastosować jako czynnik przeciwzakaźny.

Jednakże, zarówno TNF-α, jak i TNF-β wykazują szkodliwe działanie. Istnieją dowody, że nadprodukcja TNF-α może odgrywać istotną patogenną rolę w niektórych chorobach. Przykładowo, działanie TNF-α, głównie wobec naczyniówki, wywołuje jak wiadomo główne objawy wstrząsu septycznego (Tracey i in., 1986). W niektórych chorobach, TNF może powodować nadmierną utratę ciężaru ciała (kacheksja) przez zahamowanie aktywności adipocytów i powodowanie anoreksji, stąd TNF-α zwany jest kachektyną. Opisano również, że jest on mediatorem uszkodzenia tkanek w chorobie reumatycznej (Beutler i Cerami, 1987) oraz głównym mediatorem uszkodzenia obserwowanego w reakcjach „przeszczep przeciwko gospodarzowi” (Piquet i in., 1987). Oprócz tego wiadomo, że TNF związany jest z procesami zapalnymi i wieloma innych chorobami.

Dwa różne, wyrażane niezależnie receptory, TNF-R p55 i p75, które swoiście wiążą TNF-α i TNF-β, zapoczątkowują i/lub pośredniczą w powyższych aktywnościach biologicznych TNF. Te dwa receptory posiadają strukturalnie różne domeny wewnątrzkomórkowe, co sugeruje różne mechanizmy przekazywania sygnału (patrz, Hohmann i in., 1989; Engelmann i in., 1990; Brockhaus i in., 1990; Leotscher i in., 1990; Schall i in., 1990; Nophar i in., 1990; Smith i in., 1990; Heller i in., 1990). Jednakże, mechanizmy komórkowe, przykładowo, różne białka i ewentualnie inne czynniki, które są związane z sygnalizacją wewnątrzkomórkową TNF-R p55 i p75 nie zostały do tej pory określone. To właśnie ta sygnalizacja wewnątrzkomórkowa, która zachodzi zwykle po związaniu liganda, tj. TNF (α albo β) z receptorem, jest odpowiedzialna za aktywację kaskady reakcji, które prowadzą w końcu do obserwowanej reakcji komórki na TNF.

W odniesieniu do wyżej opisanego działania cytotoksycznego TNF, w większości zbadanych do tej pory komórkach, efekt ten jest wywoływany głównie przez TNF-R p55. Przeciwciała przeciwko domenie zewnątrzkomórkowej (domena wiążąca ligand) TNF-R p55 same mogą wyzwolić działanie cytotoksyczne (patrz, EP 412486), co koreluje ze skutecznością sieciowania receptora przez przeciwciała, co, jak się uważa, stanowi pierwszy etap wyzwalania procesu sygnalizowania wewnątrzkomórkowego. Dalej, badania mutacyjne (Brakebusch i in., 1992; Tartaglia i in., 1993) wykazały, że działanie

PL 199 214 B1 biologiczne TNF-R p55 zależy od integralności domeny wewnątrzkomórkowej. Tak więc, sugeruje się, że zapoczątkowanie sygnalizacji wewnątrzkomórkowej prowadzące do efektu komórkobójczego TNF zachodzi jako konsekwencja połączenia dwóch lub więcej domen wewnątrzkomórkowych TNF-R p55. Ponadto, TNF (α oraz β) występuje jako homotrimer, i sugeruje się, że jako taki indukuje wewnątrzkomórkową sygnalizację przez TNF-R p55 przez zdolność do wiązania i sieciowania cząsteczek receptora, tj. powodując agregację receptora.

Innym przedstawicielem nadrodziny receptorów TNF/NGF jest receptor FAS (FAS-R), zwany również antygenem FAS, białko powierzchniowe wyrażane w różnych tkankach i wykazujące homologię z innymi członkami receptorów powierzchniowych, w tym TNF-R i NGF-R. FAS-R pośredniczy w wywoływaniu ś mierci komórkowej przez apoptozę (Itoh i in., 1991) i jak się wydaje służy jako negatywny czynnik selekcji autoreaktywnych limfocytów T, tj. podczas dojrzewania limfocytów T, FAS-R pośredniczy w apoptozie limfocytów T rozpoznających antygeny własne. Stwierdzono, że mutacje w genie FAS-R (Ipr) powodują u myszy zaburzenia limfoproliferacyjne, które przypominają ludzką chorobę autoagresyjną, układowy toczeń rumieniowaty (SLE, ang. systemic lupus erythematosus) (Watanabe-Fukunaga i in., 1992). Ligand FAS-R zdaje się być cząsteczką powierzchniową niesioną przez, m.in. niszczące limfocyty T (albo cytotoksyczne limfocyty T - CTL), a więc, po wejściu w kontakt CTL z komórkami niosącymi FAS-R, mogą one wywołać apoptotyczną śmierć komórkową komórek niosących FAS-R. Dalej, wytworzono przeciwciała monoklonalne, które są swoiste wobec FAS-R, przy czym są one zdolne do wywoływania śmierci apoptotycznej komórek niosących FAS-R, w tym komórek myszy transformowanych cDNA kodującym ludzki FAS-R (Itoh i in., 1991).

Zgłaszający dokonali wielu podejść (patrz, przykładowo, europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 186833, EP 308378, EP 398329 i EP 412486) w celu regulowania szkodliwych skutków TNF przez zahamowanie wiązania TNF z jego receptorami, przy użyciu przeciwciał przeciwko TNF albo przez zastosowanie rozpuszczalnych receptorów TNF, które współzawodniczą o wiązanie z TNF z receptorami powierzchniowymi TNF-R. Dalej, ponieważ wiązanie TNF z jego receptorem jest konieczne do wywołania działań komórkowych wywołanych przez TNF, podejście zastosowane przez Zgłaszających (patrz, przykładowo EP 568925) umożliwiło modulowanie działań TNF przez modulowanie aktywności TNF-R.

Pokrótce, EP 568925 dotyczy sposobu modulowania przekazywania sygnału i/lub cięcia TNF-R, przy czym peptydy albo inne cząsteczki mogą oddziaływać z samym receptorem, albo z białkami efektorowymi oddziałującymi z receptorem, modulując w ten sposób normalne działanie TNF-R. W EP 568925 opisano konstruowanie i charakteryzację różnych zmutowanych TNF-R p55, posiadających mutacje w domenie zewnątrzkomórkowej, śródbłonowej i wewnątrzkomórkowej TNF-R p55. W ten sposób, zidentyfikowano regiony w powyższych domenach TNF-R p55, które są kluczowe dla funkcjonowania receptora, tj. wiązania z ligandem (TNF), a następnie przekazywania sygnału i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, która w końcu prowadzi do obserwowanego działania TNF na komórki. Dalej, opisano również wiele podejść izolowania i identyfikacji białek, peptydów albo innych czynników, które są zdolne do wiązania z różnymi regionami w powyższych domenach TNF-R, które to białka, peptydy i inne czynniki mogą być związane z regulowaniem albo modulowaniem aktywności TNF-R. Liczne podejścia dotyczące izolowania i klonowania sekwencji DNA kodujących takie białka i peptydy, w celu konstruowania wektorów ekspresji do wytwarzania tych białek i peptydów; oraz dotyczące wytwarzania przeciwciał albo ich fragmentów, które oddziałują z TNF-R albo z powyższymi białkami i peptydami, które wiążą się z różnymi regionami TNF-R, przedstawiono również w EP 568925. Jednakże, EP 568925 nie wymienia konkretnych białek i peptydów, które wiążą się z domenami wewnątrzkomórkowymi TNF-R (np. TNF-R p55), ani nie opisuje podejścia opartego na drożdżach w układzie dwuhybrydowym, w celu wyizolowania i identyfikacji takich białek albo peptydów, które wiążą się z domenami wewnątrzkomórkowymi TNF-R. Podobnie, EP 568925 nie ujawnia białek albo peptydów zdolnych do wiązania się z wewnątrzkomórkową domeną FAS-R.

O ile wiadomo, ż e receptory czynnika martwicy nowotworu (TNF) oraz pokrewny strukturalnie receptor FAS-R wyzwalają w komórkach, po aktywacji ligandami wytwarzanymi przez leukocyty, destrukcyjną aktywność, która prowadzi do samozniszczenia, mechanizm tego wyzwalania jest wciąż słabo poznany. Badania mutacyjne wskazują, że w FAS-R i receptorze TNF p55 (p55-R) sygnalizacja cytotoksyczności obejmuje osobne rejony w domenach wewnątrzkomórkowych (Brakenbusch i in., 1992; Tartaglia i in., 1993; Itoh i Nagata, 1993). Regiony te („domeny śmierci”) wykazują podobieństwo sekwencji. „Domeny śmierci” zarówno FAS-R i p55-R mają tendencję do samoasocjacji (łączenia się ze sobą). Ich samoasocjacja ułatwia agregację receptora, co jest konieczne do zapoczątkowania

PL 199 214 B1 sygnalizacji (patrz, Song i in., 1994; Wallach i in., 1994; Boldin i in., 1995) i przy wysokich poziomach ekspresji receptora może spowodować wyzwalanie sygnalizacji niezależnej od liganda (Boldin i in., 1995).

Podobnie jak inne działania wywołane przez receptor, indukcja śmierci komórkowej przez receptory TNF i FAS-R zachodzi przez szereg oddziaływań typu białko-białko, prowadząc od związania się liganda z receptorem do końcowej aktywacji enzymatycznych funkcji efektorowych, które w badaniach wykazały nie-enzymatyczne oddziaływanie białko-białko zapoczątkowujące sygnalizację śmierci komórkowej: wiązanie trimeru TNF albo liganda FAS-R z receptorem, spowodowane tym oddziaływanie ich domen wewnątrzkomórkowych (Brakebush i in., 1992; Tartaglia i in., 1993; Itoh i Nagata, 1993) wspomagane skłonnością motywów domen śmierci do wiązania się ze sobą (Boldin i in., 1995a) i indukowaniem wią zania dwóch biał ek cytoplazmatycznych (które również wiążą się ze sobą ) z domenami wewnątrzkomórkowymi receptora - MORT-1 (albo FADD) z FAS-R (Boldin i in., 1995b; Chinnayan i in., 1995; Kischkel i in., 1995) i TRADD z p55-R (Hsu i in., 1995; Hsu i in., 1996). Dzięki procedurze przesiewowej na drożdżach w układzie dwu-hybrydowym zidentyfikowano trzy białka, które wiążą się z domeną wewnątrzkomórkową FAS-R i p55-R w regionie „domeny śmierci” związanym z wywoływaniem ś mierci komórkowej przez receptory dzięki połączeniu heterologicznemu regionów homologicznych i które są zdolne niezależnie do wyzwalania śmierci. Jednym z nich jest białko MORT-1 (Boldin i in., 1995b), znane również jako FADD (Chinnaiyan i in., 1995), które wiąże się swoiście z FAS-R. Drugie, TRADD (Hsu i in., 1995, 1996) wiąże się z p55-R, zaś trzecie RIP (Stanger i in., 1995) wiąże się zarówno z FAS-R i p55-R. Oprócz wiązania się z FAS-R i p55-R, białka te są zdolne do wiązania się ze sobą, co zapewnia funkcjonalne oddziaływanie krzyżowe pomiędzy FAS-R i p55-R. Wiązanie to zachodzi przez konserwatywne motywy sekwencji, „moduł domeny śmierci”, wspólne dla receptorów i związanych z nimi białek. Ponadto, mimo iż test dwu-hybrydowy w drożdżach wykazał, że MORT-1 wiąże się spontanicznie z FAS-R w komórkach ssaczych, wiązanie to zachodzi jedynie po stymulacji receptora, co sugeruje, że MORT-1 uczestniczy w początkowych zjawiskach sygnalizacji FAS-R. MORT-1 nie zawiera żadnych motywów sekwencji charakterystycznych dla aktywności enzymatycznej, a stąd jego zdolność do wyzwalania śmierci komórkowej nie wydaje się obejmować wewnętrznej aktywności samego MORT-1, ale raczej aktywację niektórych innych białek, które wiążą się z MORT-1 i dział ają poniż ej w kaskadzie sygnalizacji. Wykazano, ż e ekspresja komórkowa mutantów MORT-1 pozbawionych części końca N cząsteczki blokuje indukcję cytotoksyczności przez FAS/APO1 (FAS-R) albo p55-R (Hsu i in., 1996; Chinnaiyan i in., 1996), co wskazuje, że region końca N przenosi sygnalizację efektu komórkobójczego obu receptorów przez oddziaływanie białko-białko.

Tak więc, motyw „domeny śmierci” receptorów p55-R i FAS-R, jak również trzech związanych z nimi biał ek MORT-1, RIP i TRADD wydaje się być miejscem oddział ywania biał ko-białko. Trzy biał ka, MORT-1, RIP i TRADD oddziałują z domenami wewnątrzkomórkowymi p55-R i FAS-R przez wiązanie ich domen śmierci z tymi receptorami, a w przypadku zarówno RIP i TRADD domeny śmierci ulegają samoasocjacji (MORT-1 różni się od nich w tym względzie, że jego domeny śmierci nie łączą się ze sobą). Dalej, MORT-1 i TRADD różnie wiążą się z FAS-R i p55-R, jak również wiążą się ze sobą. Ponadto, zarówno MORT-1, jak i TRADD wiążą się w sposób efektywny z RIP. Tak więc, wydaje się, że oddziaływanie pomiędzy trzema białkami, MORT-1, RIP i TRADD stanowi istotny składnik całkowitej modulacji wewnątrzkomórkowej sygnalizacji za pośrednictwem tych białek. Interferencja oddziaływania pomiędzy tymi trzema białkami wewnątrzkomórkowymi powinna spowodować modulację działań wywołanych przez te oddziaływania. Przykładowo, zahamowanie wiązania TRADD z MORT-1 może modulować oddziaływanie FAS-R -p55 TNF-R. Podobnie, zahamowanie RIP oprócz powyższego zahamowania wiązania TRADD z MORT-1 może dalej modulować oddziaływanie FAS-R p55 TNF-R.

Przeciwciała monoklonalne wywołane przeciwko „domenie śmierci” p55-R, konkretnie przeciwko miejscom wiązania TRADD i RIP można również zastosować do hamowania albo zapobiegania wiązaniu tych białek, a w ten sposób modulować oddziaływanie pomiędzy FAS-R i p55-R.

Ostatnio stwierdzono, że oprócz wyżej wspomnianych aktywności cytotoksycznych i ich modulowania za pośrednictwem różnych receptorów i ich białek wiążących, w tym FAS-R, p55-R, MORT-1,

TRADD, RIP, MACH, Mch4 i G1, wiele tych receptorów i białek wiążących związanych jest również z modulowaniem aktywności jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-κΒ, który jest kluczowym mediatorem przeżycia i żywotności komórki, będąc odpowiedzialnym za kontrolowanie ekspresji wielu genów reakcji odpornościowej i zapalnej. Przykładowo stwierdzono, że TNF-α pobudza aktywację NF-kB, a w ten sposób TNF-α może indukować dwa rodzaje sygnałów w komórce, jeden wywołujący śmierć komórki i drugi, który chroni komórki przed indukowaniem śmierci przez indukowanie ekspresji genów

PL 199 214 B1 przez NF-κΒ (patrz Beg i Baltimore, 1996; Wang i in., 1996; Van Antwerp i in., 1996). Podobny podwójny efekt został opisany dla FAS-R (patrz, odnośniki w Van Antwerp i in., 1996). Stąd wydaje się, że istnieje delikatna równowaga pomiędzy śmiercią i przeżyciem komórki po stymulacji różnych rodzajów komórek przez TNF-α i/lub ligand FAS-R, zaś końcowy efekt stymulacji zależy od tego, który szlak wewnątrzkomórkowy jest stymulowany w większym stopniu, ten prowadzący do śmierci (zwykle przez apoptozę), czy ten prowadzący do przeżycia komórki przez aktywowanie NF-kB.

Oprócz tego twórcy ostatnio wyjaśnili dalej możliwy szlak, przez który przedstawiciele rodziny receptorów TNF/NGF aktywują NF-kB (patrz, Malinin i in., 1997 i inne odnośniki tam wskazane; stanowiące współwłasność, równocześnie rozpatrywane izraelskie zgłoszenia patentowe nr IL 117800 i IL 119133). Pokrótce, okazało się, że kilku przedstawicieli rodziny receptorów TNF/NGF jest zdolnych do aktywacji NF-kB przez wspólne białko adaptorowe TRAF2. Ostatnio opisana kinaza białkowa NIK (patrz powyżej Malinin i in., 1997; IL 117800, IL 119133) jest zdolna do wiązania się z TRAF2 i pobudzania aktywności NF-kB. W rzeczywistości wykazano (patrz, wymienione powyżej Malinin i in. oraz izraelskie zgłoszenia), że ekspresja w komórkach mutantów NIK pozbawionych aktywności kinazy powoduje powstanie komórek niezdolnych do stymulowania NF-kB w prawidłowy endogenny sposób, jak również komórek wykazujących blokadę indukcji aktywności NF-kB przez TNF, przez którykolwiek z FAS-R, oraz blokadę indukcji NF-kB przez TRADD, RIP i MORT-1 (będącymi białkami adaptorowymi, które wiążą receptory p55-R i/lub FAS-R). Wszystkie te receptory, p55-R, p75-R, FAS-R, oraz ich białka adaptorowe, MORT-1, RIP i TRADD, wiążą się bezpośrednio albo pośrednio z TRAF2, którego zdolność wiązania z NIK wydaje się modulować indukcję NF-kB.

Spośród powyższych białek modulatorowych, związanych z delikatną równowagą pomiędzy śmiercią komórkową i przeżywaniem po pobudzeniu FAS-R i/lub p55-R, białko RIP wydaje się odgrywać istotną rolę. RIP (patrz Stanger i in., 1995; Malinin i in., 1997) posiada „domeny śmierci” w regionie na końcu C, co umożliwia indukowanie cytotoksyczności komórkowej w sposób niezależny, jak również przez asocjację z domenami śmierci MORT-1, p55-R, FAS-R i TRADD. RIP posiada również domenę kinazy białkowej w regionie końca N i pośrednią domenę, uważaną za umożliwiającą krzyżowanie (wiązanie) z TRAF2, a w ten sposób udział w indukcji NF-kB. Tak więc, szczegóły dotyczące charakterystyki i sekwencji (DNA i aminokwasów) RIP podane są w wymienionych wyżej publikacjach (w szczególności, Stanger i in., 1995), które włączone są tu w całości jako odnośnik.

TNF jest również jedną z cytokin związanych z zapoczątkowywaniem i modulacją obrony przeciwwirusowej. Podobnie, wirusy ewoluowały wyrażając geny, których produkty białkowe regulują aktywność cytokin, zaś wirusowe białka cytokinowo-regulacyjne umożliwiają, jak się uważa, przetrwanie wirusa w organizmie zwierzęcym. Jednym z najlepiej przebadanych przykładów takich białek jest E3-14.7K z grupy C ludzkich adenowirusów (Ad) typu 2 i 5, który działa jako silny antagonista cytolizy za pośrednictwem TNF.

Mając na celu wyizolowanie składników cząsteczkowych kaskady TNF, które stają się celem dla E3-14.7K po zakażeniu wirusowym, wyizolowano ostatnio ludzkie białko wiążące E3-14.7K przy użyciu przesiewania w układzie dwu-hybrydowym (FIP-2, białko oddziałujące z 14K, ang. Fourteen-K Interacting Protein, Li i in., 1998). Stwierdzono, że FIP-2 jest nietoksyczne samo, oraz że odwraca efekt ochronny E3-14.7K względem cytotoksyczności wywołany nadekspresją TNFR-I albo RIP, bez wiązania się z wymienionymi białkami. Stwierdzono, że FIP-2 wykazuje pewną homologię z RAP-2. Stopień całkowitej homologii pomiędzy RAP-2 i FIP-2 jest jednak dość niski, co można zaobserwować na podstawie ogólnego przyrównania obu sekwencji aminokwasowych (Fig. 3). Jednakże, homologia staje się bardziej znacząca w specyficznych regionach w kierunku końca C białek, stając się niemal identyczna w obrębie 30 aminokwasów końca C. Warte jest zaznaczenia, że domniemany motyw „suwaka leucynowego” FIP-2 jest w dużym stopniu zachowany w RAP-2 (z wyjątkiem podstawienia Ile do Ala).

Podobna sekwencja nazwana HYPL - kodująca białko związane z chorobą Huntingtona, które wydaje się być odległym homologiem RAP-2, zostało ostatnio dostarczone do GenBank jako „białko oddziałujące z huntingtyną, HYPL” (nr dostępu AF049614). Jednakże, nie został do tej pory opublikowany artykuł opisujący funkcje białka.

Niedawna publikacja S. Yamaoka i in., (1998) donosi o identyfikacji mysiego homologa RAP-2. Mysi homolog, NEMO (niezbędny modulator NF-kB, ang. NF-kB Essential Modulator) zidentyfikowano podczas poszukiwania kluczowych cząsteczek regulujących aktywację sygnalizacji NF-kB. Scharakteryzowano płaskokomórkowy wariant szczurzych fibroblastów transformowanych Tax HTLV-I, oznaczony 5R, który nie reagował na wszystkie zbadane bodźce aktywujące NF-kB (LPS, PMA, IL-1, TNF) i przeprowadzono komplementację genetyczną. W wyniku tej procedury, uzyskano cDNA kodujący

PL 199 214 B1 białko NEMO wielkości 48 kDa. W oparciu o te dane wykazano, że białko to nie występujące w komórkach 5R, jest częścią kompleksu kinazy IkB o dużym ciężarze cząsteczkowym i konieczne jest do jego tworzenia. In vitro, NEMO może tworzyć homodimery i bezpośrednio oddziałuje z IKKe.

Izraelski opis patentowy nr 120485 ujawnia białko związane z RIP, jako określane RAP, które swoiście wiąże się z RIP i hamuje indukcję NF-kB.

Izraelski opis patentowy nr 123758 oraz niniejsze zgłoszenie są związane z innym białkiem związanym z RIP, zwanym RAP-2, które wykazuje takie same albo podobne aktywności.

RAP-2 jest również określane jako 303 albo RAP-303 albo RAT-303. Dla porządku, określane tu będzie jako RAP-2.

Niniejszym opisane zostało białko RAP-2, w tym jego izoformy, analogi, fragmenty albo pochodne, zdolne do wiązania białka RIP (określanego dalej jako RIP). Ponieważ RIP jest zdolne do oddziaływania bezpośrednio albo pośrednio z wewnątrzkomórkowymi mediatorami stanu zapalnego, cytotoksyczności/śmierci komórkowej, takimi jak p55-R i FAS-R i związanymi z nimi białkami adaptorowymi albo modulatorowymi, jak np. MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1 i inne, białka zdolne do związania RIP są zdolne do wpływania na proces sygnalizacji wewnątrzkomórkowej zapoczątkowanej przez związanie ligandu FAS ze swoim receptorem i TNF ze swoim receptorem (p55-R), i jako takie, RAP-2 są modulatorami działania na komórkę za pośrednictwem p55-R i FAS-R. RIP może również oddziaływać z TRAF2, a w ten sposób jest zdolne do oddziaływania bezpośrednio albo pośrednio z NIK, zaś jako takie RIP działa jako modulator szlaków stanu zapalnego i przeżywania komórki, związanych z indukcją NF-kB. Tak więc RAP-2 są modulatorami stanu zapalnego i przeżywania komórki związanych z RIP. Podobnie, przez FAS-R, p55-R i ich białka modulujące: MORT-1 i TRADD, które są zdolne do indukowania NF-kB i przeżywania komórki bezpośrednio albo pośrednio przez związanie RIP albo przez wiązanie z TRAF2, z którym wiąże się RIP, białka RAP-2 mogą być również mediatorami procesów przeżywania przez komórki dzięki działaniu przez wspólny albo pokrewny szlak sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, w którym działa wiele białek indukując przeżywanie komórki. Podobnie, ponieważ p75-R wiąże się z TRAF2, z którym wiąże się RIP, białka RAP-2 mogą być również modulatorami pośrednictwa związanego z RIP w aktywności za pośrednictwem p75-R.

Niniejszym opisano również antagonistów (np. przeciwciała, peptydy, związki organiczne albo nawet pewne izoformy) powyższych białek RAP-2, które można zastosować do hamowania procesów sygnalizacji albo, bardziej szczegółowo, procesów zapalnej-cytotoksyczności komórkowej albo przeżywania komórek, jeżeli to pożądane.

Powyższe białka RAP-2, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne, można stosować do izolowania i charakteryzowania dodatkowych białek albo czynników, które mogą być związane z regulowaniem aktywności receptora, np. innych białek, które mogą się wiązać z białkami RAP-2 i wpływać na ich aktywność i/lub do wyizolowania i identyfikacji innych receptorów znajdujących się powyżej albo poniżej w szlaku sygnalizacji, z którymi wiążą się RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne, z którymi związane jest w ten sposób ich działanie.

Wynalazek dotyczy zatem białek wiążących RAP-2, które są zdolne do modulowania/pośredniczenia w funkcjach RAP-2.

Niniejszym opisane zostały również inhibitory, które można wprowadzać do komórki w celu związania albo oddziaływania z RAP-2 i ewentualnymi izoformami RAP-2, które to inhibitory mogą działać hamująco na aktywność związaną z RIP w procesach cytotoksyczności komórkowej, a w ten sposób, jeżeli to pożądane, zwiększając przeżywanie komórek, albo może działać hamująco na aktywność związaną z RIP w procesach przeżywania komórek i w ten sposób zwiększając cytotoksyczność komórek.

Opisane tu białko RAP-2, jego izoformy i analogi, fragmenty oraz pochodne można stosować jako antygeny do wytwarzania przeciwko nim przeciwciał poliklonalnych i/lub monoklonalnych. Z kolei przeciwciała można zastosować, przykładowo, do oczyszczania nowych białek z różnych źródeł, takich jak ekstrakty komórkowe albo linie komórek transformowanych.

Ponadto, przeciwciała te można zastosować do celów diagnostycznych, np. do identyfikacji chorób związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem działań komórkowych za pośrednictwem p55-R, FAS-R i innych pokrewnych receptorów.

Niniejszym opisane zostały też kompozycje farmaceutyczne obejmujące białka RAP-2, izoformy albo analogi, fragmenty albo pochodne, jak również kompozycje farmaceutyczne obejmujące powyższe przeciwciała albo innych antagonistów.

PL 199 214 B1

Białko RAP-2 zostało wyizolowane. RAP-2 może wiązać się albo oddziaływać z RIP, a w ten sposób jest modulatorem albo mediatorem aktywności wewnątrzkomórkowej RIP. RIP jest związane z modulowaniem albo poś redniczeniem w szlakach sygnalizacji wewną trzkomórkowej, np. cytotoksyczności komórkowej albo śmierci komórkowej, w której RIP samo wywiera efekt cytotoksyczny albo w połączeniu, bezpoś rednio albo poś rednio, z wieloma innymi biał kami zwią zanymi ze ś miercią komórkową, takimi jak np. MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1, p55-R i FAS-R, z którymi RIP może asocjować albo wiązać się w sposób bezpośredni albo pośredni przez motyw/moduł „domeny śmierci” występujący w RIP i wszystkich wspomnianych wyżej białkach; innymi szlakami stanu zapalnego, przeżywania komórek albo żywotności, w których RIP może odgrywać aktywującą rolę, bezpośrednio albo pośrednio dzięki obecności występującego w RIP motywu albo domeny kinazy, i zdolności RIP do wiązania się z TRAF2, które może wiązać NIK, co z kolei jest bezpośrednio związane z aktywacją

NF-κΒ, który odgrywa kluczową rolę w stanie zapalnym albo przeżywaniu komórki. Dalej, p55-R jest również zdolny do oddziaływania z TRADD i TRAF2 (przez TRADD), jak również związany jest z aktywacją NF-kB i w ten sposób ze szlakiem przeżywania komórek, a stąd RIP przez to że jest zdolne do wiązania albo oddziaływania z FAS-R, TRADD i p55-R (przez TRADD), jak również z TRAF2 może być również związane w modulowanie stanu zapalnego, aktywacji przeżywania komórek dzięki tym białkom. Tak więc, RIP jest modulatorem albo mediatorem tych szlaków, a stąd, RAP-2 przez wiązanie się z RIP jest modulatorem albo mediatorem tych szlaków wewnątrzkomórkowych.

RAP-2 wyizolowano i klonowano stosując drożdżowy układ dwu-hybrydowy, sekwencjonowano i scharakteryzowano, i jak to opisano niżej, wydaje się, że RAP-2 jest silnie swoistym białkiem wiążącym RIP, a stąd swoistym modulatorem/mediatorem RIP. RAP-2 nie wiąże się z TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R i MACH. Dalej, wydaje się, że RAP-2 nie ma charakterystycznego modułu czy motywu domeny śmierci, co jest zgodne z ujawnieniem, że RAP-2 nie indukuje samo cytotoksyczności komórkowej.

Jak się to tu stosuje, za aktywność RIP uważa się aktywność w modulowaniu/pośredniczeniu w szlakach stanu zapalnego i szlakach śmierci/przeżywania komórek. Aktywności te są wskazane powyżej i poniżej, jak również we wszystkich wspomnianych publikacjach i zgłoszeniach patentowych, których pełna zawartość włączona jest tu jako odnośnik. Podobnie, w znaczeniu tu zastosowanym, aktywność RAP-2 obejmuje jego wszelkie modulowanie/pośredniczenie, a aktywności RIP dzięki swoistemu wiązaniu się z RIP, przy czym to modulowanie/pośredniczenie przez RAP-2 obejmuje modulowanie/pośredniczenie w szlakach stanu zapalnego, śmierci i przeżywania komórek, w których RIP bierze udział bezpośrednio albo pośrednio, oraz ponieważ RAP-2 może być uważany za pośredni mediator/modulator wszystkich wspomnianych wyżej białek i prawdopodobnie wielu innych, które są związane ze stanem zapalnym, śmiercią albo przeżywaniem komórek, i z którymi wiąże się RIP, albo z którymi RIP oddziałuje w sposób bezpośredni albo pośredni.

Dwa nowe białka wiążące RAP-2, zidentyfikowane podczas procedury przeszukiwania dwu-hybrydowego, z użyciem sekwencji białka RAP-2 pełnej długości jako „przynęty”.

Stosując białko RAP-2 pełnej długości jako przynętę podczas poszukiwania w układzie dwu-hybrydowym ujawniono nowe białko oddziałujące z RAP-2, określone powyżej albo poniżej jako klon #10 (albo białko kodowane przez klon #10 albo białko wiążące RAT #10 albo RBP-10). Otrzymaną sekwencję cDNA dalej wydłużono w kierunku końca 5', stosując ogólnie znane w stanie techniki metody sekwencjonowania, w celu odtworzenia częściowej ramki odczytu białka, która jednak pozbawiona była kodonu początkowego.

Test dwu-hybrydowy wiązania repertuaru klonu #10 wykazał, że białko to nie tylko wiąże się z RAP-2, ale wykazuje również raczej silne powinowactwo do TRAF2. Jednakże klon #10 nie wiązał się z RIP, TRADD, MORT-1, MACH, TNFR-I, TIP60 i NIK, jak również z kilkoma białkami kontrolnymi (przykładowo laminą i cykliną D). Nie można jednak wykluczyć, że wiązanie klonu #10 z NIK może mieć miejsce w komórkach ssaków, zważywszy na szczególne zachowanie NIK w komórkach drożdży. Wykazano, że klon #10 wiąże się z RAP-2 w obrębie 200 aminokwasów końca C tego drugiego białka, tj. w regionie niekoniecznie związanym z wiązaniem się z RIP, TIP60, NIK i IKKe. Sekwencja ta, choć niedokładna, umożliwiła przeprowadzenie kilku rund przeszukiwania GenBank, mających na celu znalezienie homologów klonu #10. Jedyne białko, które wykazywało istotny stopień podobieństwa z białkiem kodowanym przez klon #10 było F40F12.5 - hipotetyczna cząsteczka z C. elegans, której nie przypisano fizjologicznej roli.

Co ciekawe, stwierdzono że F40F12.5 wykazuje pewne podobieństwo do kilku przedstawicieli szeroko zakonserwowanej rodziny proteaz kierowanych na ubikwitynę. Enzymy te przeciwdziałają destrukcyjnemu działaniu ubikwitynacji, co jak wiadomo kieruje większością zjawisk degradacji białka

PL 199 214 B1 w komórce. O ile ligazy ubikwitynowe są odpowiedzialne za przyłączanie łańcucha poli-ubikwityny do białka przeznaczonego do degradacji, proteazy ubikwitynowe zapobiegają rozgałęzianiu się rosnącego łańcucha. Takie przewidywania dotyczące roli F40F12.5 oparte były na podobieństwie wspomnianych proteaz kierowanych na ubikwitynę, jednakże wątpliwe jest, ponieważ nie zbadano jeszcze, czy to konkretne białko posiada jakąkolwiek aktywność enzymatyczną wobec polimerów ubikwityny. Ponadto, kilka faktów czyni taką zbieżność dość nieprawdopodobną:

a) reszty uważane za stanowiące region katalityczny w obu podklasach proteaz ubikwitynowych nie są zakonserwowane w F40F12.5 ani w klonie #10;

b) z wyjątkiem miejsc katalitycznych, enzymy rodziny proteaz kierowanych na ubikwitynę pochodzące z różnych gatunków (od bakterii do człowieka) nie wykazują praktycznie podobieństwa sekwencji, podczas gdy F40F12.5 i klon #10 wykazują pewien stopień homologii.

Tak więc wydaje się, że RAP-2 jest swoistym białkiem wiążącym RIP, a stąd modulatorem/mediatorem aktywności wewnątrzkomórkowej RIP. Białka wiążące RAP-2, dzięki ich zdolności do wiązania RAP-2, mają pośredni wpływ na RIP i są również modulatorami/mediatorami aktywności wewnątrzkomórkowej RIP.

Tak więc, ponieważ RAP-2 odgrywa rolę w modulowaniu/pośredniczeniu w aktywności stanu zapalnego, przeżywaniu komórek i/lub śmierci komórkowej, z którymi bezpośrednio albo pośrednio związane jest RIP, zwłaszcza związane z cytotoksycznością i stanem zapalnym spowodowanym albo indukowanym przez różne bodźce, w tym przenoszone przez receptory rodziny receptorów TNF/NGF i prawdopodobnie inne (schemat związku RIP z tymi zjawiskami wewnątrzkomórkowymi, jak również związek RAP-2, patrz Fig. 1 w Malinin i in., 1997).

RAP-2 może również służyć jako inhibitor cytotoksyczności komórkowej i stanu zapalnego dzięki występowaniu jako część kompleksu innych białek, np. RIP i białek związanych z RIP, oraz jako taki może wpływać na efekty cytotoksyczne albo zapalne tych białek (np. p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, G1 i MORT-1), prowadząc w końcu do zahamowania ich aktywności cytotoksycznej albo ich aktywności w stanie zapalnym.

RAP-2 może również służyć jako wzmacniacz lub czynnik zwiększający cytotoksyczność komórkową i stan zapalny przez wspomaganie aktywności innych białek, np. RIP i innych białek związanych z RIP, jak zaznaczono powyżej ułatwiając rekrutację tych białek przez RIP, co służy wzmocnieniu aktywności cytotoksycznej różnych białek albo wzmacnia ich efekt zapalny.

Podobnie, w analogiczny sposób RAP-2 może również służyć jako inhibitor lub wzmacniacz szlaku przeżywania komórek, jak zaznaczono wyżej, dzięki związkowi RIP z tym szlakiem.

Niniejszym przedstawiono sekwencję DNA kodującą białko związane z RIP (RAP-2), jej izoformy, analogi albo fragmenty, zdolne do wiązania się z RIP oraz modulowania albo pośredniczenia w aktywności wewnątrzkomórkowej RIP, przy czym aktywność wewnątrzkomórkowa jest modulacją/pośredniczeniem w stanie zapalnym i/lub śmierci komórkowej, i/lub przeżywaniu komórek.

W szczególności, opisana została sekwencja DNA wybrana z grupy obejmującej:

(a) sekwencję cDNA pochodzącą z regionu kodującego natywne białko RAP-2;

(b) sekwencje DNA zdolne do hybrydyzacji z sekwencją (a) w umiarkowanie ostrych warunkach, które kodują biologicznie czynne białko RAP-2; i (c) sekwencje DNA, które są zdegenerowane w wyniku kodu genetycznego sekwencji DNA określonych w (a) i (b), które kodują biologicznie czynne białko RAP-2.

Powyższe sekwencje DNA obejmują sekwencję DNA obejmującą przynajmniej część sekwencji kodującej przynajmniej jedną izoformę białka RAP-2. Sekwencja DNA kodująca białko RAP-2 jest przedstawiona na Fig. 1. Inną sekwencję DNA pokazano na Fig. 2.

Niniejszym opisano też białka RAP-2 i ich analogi, fragmenty albo pochodne, kodowane przez dowolną z powyższych sekwencji DNA, przy czym białka, analogi, fragmenty i pochodne są zdolne do wiązania z RIP i modulowania/pośredniczenia aktywności biologicznych w wewnątrzkomórkowych szlakach śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek.

Sekwencja białka RAP-2 wywnioskowana z sekwencji DNA przedstawionej na Fig. 1 i 2 jest pokazana na Fig. 3.

Niniejszym opisano również zdolne do replikacji nośniki ekspresji, obejmujące powyższy DNA, przy czym nośniki te mogą być wyrażane w odpowiednich komórkach eukariotycznych albo prokariotycznych; transformowane komórki eukariotyczne albo prokariotyczne, zawierające takie zdolne do replikacji nośniki ekspresji; oraz sposób wytwarzania białka RAP-2 albo analogów, fragmentów albo pochodnych przez hodowanie takich transformowanych komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do

PL 199 214 B1 ekspresji białka, analogów, fragmentów albo pochodnych, przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych takiego białka jeżeli to konieczne do otrzymania białka oraz ekstrahowanie wyrażanego białka, analogów, fragmentów albo pochodnych z pożywki hodowlanej transformowanych komórek albo z ekstraktów komórkowych transformowanych komórek. Powyższe definicje mają obejmować wszystkie izoformy białka RAP-2.

Opisane zostały też przeciwciała albo ich aktywne pochodne albo fragmenty, swoiste wobec białka RAP-2.

Poniżej wymieniono różne zastosowania powyższych sekwencji DNA albo białek, przez nie kodowanych:

(i) Sposób modulowania wewnątrzkomórkowego szlaku zapalnego, śmierci komórkowej i/lub przeżycia komórek modulowanego albo zachodzącego za pośrednictwem białka RIP, obejmujący traktowanie takich komórek jednym albo wieloma białkami RAP-2, izoformami, analogami, fragmentami albo pochodnymi, zdolnymi do wiązania z RIP, przy czym traktowanie komórek obejmuje wprowadzanie do komórek jednego albo wielu białek, izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych w postaci odpowiedniej do wprowadzania ich wewnątrzkomórkowo albo wprowadzania do komórek sekwencji DNA kodującej jedno albo wiele białek, izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych w postaci odpowiedniego wektora niosącego taką sekwencję, przy czym wektor jest zdolny do przeprowadzenia insercji sekwencji do komórki w taki sposób, że sekwencja ulega ekspresji w komórce.

(ii) Sposób modulowania szlaków zapalnych, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, zachodzących za pośrednictwem ligandów rodziny TNF, przez działanie na komórki za pośrednictwem działania białka RIP, zgodnie z punktem (i), przy czym traktowanie komórek obejmuje wprowadzanie do komórek białka RAP-2, albo izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych, w postaci odpowiedniej do wprowadzania wewnątrzkomórkowego, albo wprowadzania do komórek sekwencji DNA kodującej białko G1 lub pochodne w postaci odpowiedniego wektora niosącego taką sekwencje, przy czym wektor jest zdolny do przeprowadzenia insercji sekwencji do komórki w taki sposób, że sekwencja ulega ekspresji w komórce.

(iii) Sposób jak w (ii), przy czym traktowanie komórek przeprowadza się przez transfekowanie komórek rekombinowanym wektorem wirusa zwierzęcego, obejmujące etapy:

(a) konstruowania rekombinowanego wektora wirusa zwierzęcego niosącego sekwencję kodującą białko powierzchniowe wirusa (ligand), który jest zdolny do związania ze swoistym receptorem powierzchniowym komórki na powierzchni komórek niosących FAS-R albo p55-R i drugą sekwencję kodującą białko wybrane spośród białka RAP-2 i jego izoform, analogów, fragmentów i pochodnych, które po ekspresji w komórkach są zdolne do modulowania/pośredniczenia w wewnątrzkomórkowych szlakach zapalnych i/lub śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek; i (b) zakażania komórek wektorem z (a).

(iv) Sposób modulowania szlaków zapalnych, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, zachodzących za pośrednictwem ligandów rodziny TNF na komórki przez działanie białka RIP, obejmujący traktowanie komórek przeciwciałami albo ich aktywnymi fragmentami albo pochodnymi, przy czym traktowanie przeprowadza się przez zastosowanie wobec komórek odpowiedniej kompozycji zawierającej przeciwciała, ich aktywne fragmenty albo pochodne, przy czym przynajmniej część białka RAP-2 jest eksponowana na powierzchni zewnątrzkomórkowej, przy czym kompozycja jest formułowana do zastosowania zewnątrzkomórkowego, zaś gdy białka RAP-2 są całkowicie wewnątrzkomórkowe, kompozycję formułuje się do zastosowania wewnątrzkomórkowego.

(v) Sposób modulowania szlaków zapalnych, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, zachodzących za pośrednictwem ligandów rodziny TNF, przez działanie na komórki przez działanie białka RIP, obejmujący traktowanie komórek sekwencją oligonukleotydową, kodującą sekwencję antysensowną przynajmniej części sekwencji białka RAP-2, przy czym sekwencja oligonukleotydowa jest zdolna do blokowania ekspresji białka RAP-2.

(vi) Sposób zgodny z punktem (ii) do traktowania komórek nowotworowych albo zakażonych HIV albo innych chorych komórek, obejmujący:

(a) konstruowanie rekombinowanego wektora wirusa zwierzęcego niosącego sekwencję kodującą białko powierzchniowe wirusa, które jest zdolne do związania ze swoistym receptorem powierzchniowym komórki nowotworowej albo receptorem powierzchniowym komórki zakażonej HIV albo receptorem niesionym przez inną chorą komórkę i sekwencję kodującą białko wybrane spośród białka RAP-2, jego izoform, analogów, fragmentów i pochodnych, które po ekspresji w komórce nowotworowej, zakażonej HIV albo innej chorej komórce są zdolne do niszczenia komórek dzięki działaniu białka RIP; i

PL 199 214 B1 (b) zakażania komórki nowotworowej, zakażonej HIV albo innej chorej komórki wektorem z (a).

(vii) Sposób modulowania szlaków zapalnych, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, zachodzących za pośrednictwem ligandów rodziny TNF, przez działanie na komórki za pośrednictwem działania białka RIP, obejmujący zastosowanie procedury rybozymu, w której wektor kodujący sekwencję rybozymu zdolną do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA kodującego białko RAP-2, wprowadza się do komórek w postaci umożliwiającej ekspresję sekwencji rybozymu w komórkach, zaś sekwencja rybozymu po ekspresji w komórkach oddziałuje z sekwencją komórkowego mRNA i tnie sekwencję mRNA powodując zahamowanie ekspresji białka RAP-2 w komórkach.

(viii) Sposób wybrany spośród powyższych sposobów, przy czym sekwencja białko RAP-2 obejmuje przynajmniej jedną z izoform RAP-2, analogów, fragmentów i pochodnych, które są zdolne do wiązania się z RIP.

(ix) Sposób izolowania i identyfikacji białek zdolnych do wiązania białka RIP, obejmujący zastosowanie procedury dwu-hybrydowej, w której sekwencja koduje białko RIP jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencja z biblioteki cDNA albo genomowego DNA jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, zaś wektory stosuje się do transformowania komórek drożdży i izoluje się komórki transformowane pozytywnie, a następnie ekstrahuje drugi wektor hybrydowy w celu uzyskania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z białkiem RIP.

(x) Sposób zgodny z dowolnym z punktów (i)-(x), w którym białko RAP-2 jest dowolną izoformą RAP-2, jego analogiem, fragmentem i pochodną.

(xi) Sposób zgodny z dowolnym z punktów (i)-(x), w którym białko RAP-2 albo jego dowolne izoformy, analogi, fragmenty albo pochodne związane są z modulowaniem komórkowych efektów zachodzących za pośrednictwem albo modulowanych przez dowolny inny mediator albo induktor, z którym wiąże się białko RAP-2, jego izoforma, analog, fragment albo pochodna w sposób bezpośredni albo pośredni.

Niniejszym przedstawiono również kompozycje farmaceutyczne do modulowania szlaków stanu zapalnego, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, w których pośredniczy rodzina TNF, przez działanie białka RIP albo przez inny mediator albo induktor w komórkach jak wskazano powyżej, obejmującej jako składnik czynny jeden z poniższych:

(i) białko RAP-2 i biologicznie czynne fragmenty, analogi, pochodne i mieszaniny;

(ii) rekombinowany wektor wirusa zwierzęcego kodujący białko zdolne do wiązania się z receptorem powierzchniowym komórki i kodujący białko RAP-2 albo jego biologicznie czynne fragmenty albo analogi;

(iii) sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną sekwencji białka RAP-2, przy czym oligonukleotyd może być drugą sekwencją rekombinowanego wektora wirusa zwierzęcego według (ii).

Niniejszym przedstawiono też:

I. Sposób modulowania szlaków stanu zapalnego, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, modulowanych/zachodzących za pośrednictwem białka RIP, albo modulowania wpływu dowolnego innego mediatora albo induktora, albo dowolnego z induktorów albo inhibitorów NF-kB, na komórki, który obejmuje traktowanie komórek sposobem określonym w punktach (i)-(x), białkiem RAP-2, jego izoformami, analogami, fragmentami albo pochodnymi albo sekwencjami kodującymi białko RAP-2, jego izoformy, analogi albo fragmenty, przy czym traktowanie powoduje wzmocnienie albo zahamowanie działania za pośrednictwem RIP, a w ten sposób również działania za pośrednictwem FAS-R albo p55-R albo innego mediatora albo induktora, albo innego induktora albo inhibitora NF-kB.

II. Sposób jak wyżej, przy czym białko RAP-2, jego analog, fragment albo pochodna stanowi część białka RAP-2, które jest swoiście włączone w wiązanie RIP, albo innego mediatora albo induktora, albo innego induktora albo inhibitora NF-kB, albo sekwencję białka RAP-2 kodującą część białka RAP-2, która jest swoiście włączona w wiązanie RIP albo innego mediatora albo induktora albo innego induktora albo inhibitora NF-kB.

III. Sposób jak wyżej, w którym białko RAP-2 jest dowolnym spośród izoform RAP-2, przy czym izoformy są zdolne do wzmacniania działania związanego z RIP.

IV. Sposób jak wyżej, w którym białko RAP-2 jest dowolnym spośród izoform RAP-2, przy czym izoformy są zdolne do hamowania działania związanego z RIP albo innego mediatora albo induktora związanego z działaniem na komórki, a w ten sposób zahamowania działania na komórki związanego z FAS-R albo p55-R, albo innym mediatorem albo induktorem efektu cytotoksycznego wobec komórek.

PL 199 214 B1

V. Sposób jak wyżej, w którym białko RAP-2, izoforma, analog, fragment albo pochodna jest zdolna do wzmacniania albo zahamowania działań związanych z RIP albo innych działań wobec szlaku stanu zapalnego i przeżywania komórek przez bezpośrednie albo pośrednie zahamowanie NF-kB albo pośrednią albo bezpośrednią aktywację kinazy JNK albo p38.

Izolowanie białek RAP-2, ich identyfikacja i charakteryzacja może być przeprowadzona dowolną z technik badań przesiewowych stosowanych do izolowania i identyfikacji białek, przykładowo, metodą dwu-hybrydową na drożdżach, chromatografią powinowactwa i dowolną spośród innych dobrze znanych procedur stosowanych w tym celu.

Białko RAP-2, jego izoforma, fragment albo pochodna, są stosowane jako przynęta w procedurze przeszukiwania dwu-hybrydowego w kierunku wiążących się z nimi białek.

Białka, które wiążą się z RAP-2, izoformami, fragmentami albo pochodnymi stanowią część niniejszego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca białko wiążące RAP-2, jego izoformę, fragment albo analog, obejmująca sekwencję przedstawioną na Fig. 10A i 10B, przy czym izoforma, fragment albo analog białka wiążącego RAP-2 mają właściwości wiązania RAP-2. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku koduje białko o właściwości modulowania/pośredniczenia w funkcjach RAP-2.

Wynalazek dotyczy też białka wiążącego RAP-2, jego izoformy, fragmentu albo analogu, które są kodowane przez sekwencję DNA według wynalazku i mają właściwość modulowania/pośredniczenia w funkcjach RAP-2.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób izolowania i identyfikowania białek o właściwościach wiązania RAP-2 obejmujący zastosowanie dwu-hybrydowej procedury, w której sekwencja kodująca białko RAP-2, jego izoformę, analog lub fragment, jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, zaś sekwencja DNA z biblioteki cDNA albo genomowego DNA jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, wektory stosuje się następnie do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izoluje się pozytywnie transformowane komórki, po czym ekstrahuje się drugi wektor hybrydowy w celu otrzymania sekwencji DNA kodującej białko, które wiąże się z RAP-2; przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) sekwencji DNA kodującej białko RAP-2 o sekwencji przedstawionej na Fig. 3 A/1 i A/2;

(b) sekwencji DNA przedstawionej w SEK. NR ID.: 1 lub 2;

(c) sekwencji DNA, która jest zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach z sekwencją z (a) lub (b) i koduje biologicznie czynne białko RAP-2;

(d) sekwencji DNA, która jest zdegenerowana w wyniku kodu genetycznego względem sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) i koduje biologicznie czynne białko RAP-2;

(e) sekwencji DNA określonej w punkcie (b) kodującej białko RAP-2, jego izoformę, analog albo fragment, który ma przynajmniej część sekwencji przedstawionej na Fig. 3 A/1 i A/2.

Wynalazek dotyczy również zastosowania jednego lub więcej białek wiążących RAP-2 według wynalazku, lub ich izoform, fragmentów lub analogów, korzystnie białka wiążącego RAP-2 kodowanego przez klon 10, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania szlaku zapalnego, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek.

Inne aspekty i wykonania niniejszego wynalazku są również dostarczone jako wynikające ze szczegółowego opisu wynalazku.

Należy zaznaczyć, że w znaczeniu tu zastosowanym poniższe określenia: modulowanie/pośredniczenie w działaniu RIP albo liganda FAS albo TNF na komórkę; oraz dowolne inne określenia jak „modulowanie/pośredniczenie” oznaczają pojęcia obejmujące traktowanie in vitro, jak również in vivo oraz zahamowanie albo wzmocnienie/wspomaganie.

Krótki opis figur

Figura 1 (A, B) (SEK. NR ID.: 1) przedstawia sekwencję nukleotydową RAP-2, w której kodony start i stop są podkreślone. Strzałki pokazują początek klonu 1,5 kb otrzymanego przez dwu-hybrydową procedurę przesiewową.

Figura 2 (A, B) (SEK. NR ID.: 2) przedstawia sekwencję nukleotydową klonu #41072 (patrz Przykład 1), kodony start i stop są podkreślone.

Figura 3 A (/1, /2) przedstawia domniemaną sekwencję aminokwasową ludzkiego (20.4 full (pełna) i Human shrt (krótka) i mysiego (NEMO full (pełna) i Mouse part (częściowa)) wariantu składania RAP-2, zaś B (/1, /2) przedstawia opublikowaną sekwencję FIP-2 przyrównaną przy użyciu pakietu oprogramowania dostępnego z BCM Search Launcher (Baylor College of Medicine, Houston, TX).

PL 199 214 B1

Aminokwasy homologiczne wzięto w ramki, aminokwasy identyczne zacieniowano na szaro. Gwiazdki w (B) oznaczają domniemany motyw suwaka leucynowego (LZ) w FIP-2.

Figura 4 przedstawia charakterystykę molekularną RAP-2.

A. Badanie metodą Northern blot przy użyciu Human MTN Blot I (Clontech) z fragmentem DNA RAP-2.

B. Wiązanie RAP-2 z RIP analizowano w sposób opisany w Przykładzie 3.

C. Oddziaływanie NIK-RAP-2 wykrywano jak w (B), z takim wyjątkiem, że do badania Western blot zastosowano przeciwciała anty-FLAG, a następnie immunoprecypitację przy użyciu anty-His6. Strzałki oznaczają położenie immunoprecypitowanych białek.

Figura 5 stanowi graficzną prezentację silnej ujemnej regulacji aktywacji NF-kB i c-Jun przez różne bodźce, przez ektopową ekspresję RAP-2, jak opisano w Przykładzie 4. Komórki HEK-293T nietrwale transfekowano plazmidem reporterowym (HIVLTR-Luc albo CMV-Luc do testów aktywacji NF-kB (A) i GAL4-Luc dla c-Jun (B)), oraz wektorem ekspresyjnym dla wskazanego induktora i ewentualnie pustym wektorem (pcDNA3 - oznaczony jako „sam” na figurze) albo plazmidem kodującym RAP-2 pełnej długości (pcRAP-2 oznaczony jako „plus” na figurze). Aktywacja genu reporterowego, lucyferazy, wyrażona jest we względnych jednostkach lucyferazy (RLU).

Figura 6 pokazuje, że RAP-2 wykazuje podobnie represyjne zachowanie wobec NF-kB i c-Jun w szerokim zakresie stężeń. TRAF2 poddano nietrwałej ekspresji w komórkach HEK-293T wraz z różnymi wskazanymi ilościami konstruktów pcRAP-2 (sensowny) albo pcRAP-2-a/s (antysensowny). W celu oceny aktywacji NF-kB (A) i c-Jun (B) włączono plazmidy reporterowe, odpowiednio, pHIVLTR-Luc i pGAL4-Luc. Test lucyferazy przeprowadzono w sposób opisany dla Fig. 5 w Przykładzie 4.

Figura 7 pokazuje, że RAP-2 nasila znacząco wywołaną sygnałem fosforylację c-Jun bez wywierania wpływu na poziom aktywacji JNK1/2.

(A) całkowite lizaty komórkowe komórek HEK-293T transfekowanych wskazanymi konstruktami ekspresyjnymi wraz z nośnikiem pcDNA3 zaznaczonym na figurze znakiem (-) albo pcRAP-2 zaznaczonym na figurze znakiem (+), zidentyfikowano przez analizę Western blot z przeciwciałami przeciwko fosfo-Jun jak opisano w Przykładzie 5. Błony kontrolne pokazane na dolnym panelu ponownie sondowano przeciwciałami przeciwko całkowitemu c-Jun (NEB).

(B) Aktywowaną JNK1/2 z komórek HEK-293T transfekowanych pcDNA3 albo pcRAP-2 traktowanych hrTNFa w zwiększanych okresach czasu wykrywano badaniem Western blot całkowitych lizatów przy użyciu przeciwciał przeciwko fosfo-JNK, jak opisano w Przykładzie 5.

(C) komórki HEK-293T transfekowane pustym wektorem pcRAP-2 i pcRIP w różnych kombinacjach wraz z plazmidem wyrażającym HA-JNK1. JNK1 immunoprecypitowano przez N-końcowy znacznik HA, zaś jego zdolność do fosforylowania GST-Jun wytworzonej w bakteriach i oczyszczonej zbadano w teście kinazowym in vitro. Produkty reakcji analizowano przez SDS-PAGE. GST-Jun zaznaczono strzałkami.

Figura 8 pokazuje, że RAP-2 nie współzawodniczy z NF-kB i AP-1 o wiązanie z DNA. HEK-293T transfekowano wskazanymi białkami samymi (-) albo razem z pcRAP-2 (+). Wytworzone z komórek ekstrakty jądrowe inkubowano z oligonukleotydami znakowanymi ³²P, obejmującymi klasyczne sekwencje rozpoznawcze dla AP-1 (A) albo NF-kB (B). Produkty reakcji analizowano przez niedenaturującą analizę PAGE.

Figura 9 wskazuje, że RAP-2 wpływa na podstawowy poziom NF-kB w komórkach HEK-293T i HeLa nietrwale transfekowanych różnymi ilościami RAP-2 (sens) albo RAP-2 antysens (a/s). Wszystkie manipulacje przeprowadzono w sposób opisany dla Fig. 6 w Przykładzie 4.

Figura 10 (A, B) (SEK. NR ID.: 3) pokazuje częściową sekwencję nukleotydową klonu #10.

Figura 11 przedstawia właściwości funkcjonalne kolejnych delecji RAP-2. W A, pokazano schematycznie kolejne delecje z końca C RAP-2. Wszystkie skrócenia pozostawiają nietknięty koniec N RAP-2, podczas gdy końce C zaznaczono strzałkami. Podkreślono region wiążący RIP, NIK, IKKe i TIP60. Trzy kreskowane ramki odpowiadają domniemanym motywom suwaka leucynowego. B przedstawia wpływ nadekspresji konstruktów delecyjnych opisanych w A na aktywację NF-kB w komórkach HEK-293T przez RelA, TRAF2, TNF i NIK, przy użyciu plazmidu reporterowego lucyferazy HIV-LTR dla NF-kB. Aktywacja genu reporterowego, lucyferazy, wyrażona jest we względnych jednostkach lucyferazy (RLU).

Figura 12 przedstawia mapowanie regionów funkcjonalnych i wiążących RAP-2.

(A) Różne delecje RAP-2 testowano pod względem ich zdolności do wiązania wskazanych białek w transfekowanych komórkach drożdży (kolumny nieparzyste) i ssaków HEK-293T (kolumny parzyste).

PL 199 214 B1

Dwie skrajnie prawe kolumny pokazują zdolność tych samych delecji transfekowanych w dużych ilościach, jak to opisano szczegółowo w Przykładzie 9, do komórek HEK-293T, w celu zahamowania aktywacji NF-kB i nasilania hiperfosforylacji c-Jun (c-Jun) w odpowiedzi na traktowanie TNF-α. Grubość krzyżyków jest proporcjonalna do natężenia danego efektu. Gwiazdki wskazują, że obserwowane efekty znakowanych konstruktów wobec pobudzenia Rel-A są różne (Fig. 11B).

(B) Podsumowanie wykresu przedstawiającego lokalizację regionów wiążących (górna część) i funkcjonalnych (dolna część) RAP-2 określonych na podstawie analizy delecyjnej pokazanej w (A), przyrównanych wzdłuż szkieletu białkowego. Kreskowane części oznaczają ewentualną lokalizację granic odpowiednich regionów minimalnych.

Figura 13 pokazuje, że Ser-148 w RAP-2 jest istotna dla jego zdolności do indukowania hiperfosforylacji c-Jun w pozycji Ser-63.

Pokazano analizę Western blot, w której wt oznacza typ dziki, S148A oznacza, że serynę w pozycji 148 zastąpiono alaniną, zaś wektor jest wektorem pustym.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszym opisano nowe białka RAP-2, które są zdolne do wiązania się z białkiem RIP, a w ten sposób do pośredniczenia albo modulowania wewnątrzkomórkowej aktywności RIP, w szczególności, gdy RIP bierze udział w modulowaniu lub pośredniczeniu w szlakach zapalnych, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek, jak to opisano wyżej. Tak więc, RAP-2 może zahamować aktywność RIP w szlaku śmierci komórkowej/stanu zapalnego i przeżywania, RAP-2 może nasilić aktywność RIP w szlaku stanu zapalnego lub śmierci komórkowej/przeżywania, albo może nasilić aktywność RIP w jednym z tych szlaków, przy zahamowaniu innych.

RAP-2 sekwencjonowano i charakteryzowano i stwierdzono, że RAP-2 jest białkiem wiążącym RIP o wysokiej swoistości względem RIP, ale nie wykazującym wiązania z wieloma białkami, o których wiadomo, że są związane z wewnątrzkomórkowymi szlakami sygnalizacji, które prowadzą do zapalenia, śmierci komórkowej albo przeżywania komórek. RAP-2 nie zawiera również żadnej z domen wspólnych dla białek, które wykazują aktywność w jednym z tych szlaków, tj. RAP-2 nie zawiera motywu albo modułu „domeny śmierci”, nie zawiera motywu albo domeny kinazy oraz nie posiada domeny albo motywu proteazy. Sekwencję RAP-2 określono również jako sekwencję unikalną, jak okazało się z porównania z sekwencjami w wielu bazach danych, w tym GenBank, Human Genome level 1 i „dbest”. Jak opisano wyżej (również w odniesieniu do wszystkich publikacji i zgłoszeń patentowych) RIP związane jest z wewnątrzkomórkowymi szlakami zapalnymi, śmierci komórkowej i przeżywania komórkowego. Stąd, regulowanie albo kontrola aktywności RIP może regulować jedną albo wszystkie z tych szlaków po ich zainicjowaniu przez, przykładowo, związanie TNF albo liganda Fas z ich receptorami (dla TNF w szczególności p55-R). RIP może odgrywać kluczową rolę w określaniu, który szlak jest aktywowany w większym stopniu, a to dzięki zdolności do wiązania wielu białek cytotoksycznych posiadających domeny śmierci, jak również wielu białek o aktywności kinazowej. Tak więc, białka, takie jak RAP-2, które mogą się wiązać swoiście z RIP mogą odgrywać istotną rolę w modulowaniu aktywności RIP, a w ten sposób modulując zakres indukcji jednego ze szlaków w porównaniu z innymi. Tak więc, białko RAP-2 stanowi istotny modulator albo mediator sygnałów wewnątrzkomórkowych.

Oprócz białka RAP-2 pełnej długości sklonowano krótszy cDNA, który jak stwierdzono składa się z „bloków” sekwencji pochodzących z kilku odległych regionów „pełnego” (ang. full) cDNA, prawdopodobnie powstały z alternatywnego składania tego samego genu. Mysi odpowiednik ludzkiego RAP-2 zidentyfikowano w podobnym poszukiwaniu w mysiej kolekcji EST. Stwierdzono, że częściowy mysi cDNA jest praktycznie identyczny z ludzkim odpowiednikiem w obrębie regionu kodującego.

Istotność fizjologiczna oddziaływania RIP-RAP-2 została dalej potwierdzona w transfekowanych komórkach HEK-293T i HeLa. Jednakże, tworzenie takiego kompleksu nie powoduje aktywności enzymatycznej RIP, co potwierdzono przez nadekspresję RIP, która nie wywoływała fosforylacji RAP-2.

Doświadczenia transfekcyjne w komórkach HEK-293T również prowadziły do stabilnego tworzenie kompleksu RAP-2-NIK.

Wydaje się, że RAP-2 jest kluczowym elementem szlaku przekazywania sygnału NF-kB i c-Jun, ponieważ wiąże się z NIK, IK^ i TIP60 (acetylotransferaza histonowa) i moduluje transkrypcję zależną od NF-kB i c-Jun. W rzeczywistości, zwiększona ektopowa ekspresja RAP-2 prowadzi do zahamowania reakcji NF-kB, podczas gdy jego usunięcie z komórki, przy użyciu konstruktu antysensownego powoduje zwiększoną transaktywację NF-kB i c-Jun.

Ujawniono również, że RAP-2 wzmaga hiperfosforylację c-Jun, która nie przebiega za pośrednictwem aktywności JNK. RAP-2 nie hamowało wiązania c-Jun i RelA do DNA. Domeny wiążące

PL 199 214 B1 i funkcjonalne RAP-2 zidentyfikowano przez analizę delecyjną sekwencji. Badania te wskazały, że region wiążący dla RIP, NIK i TIP60 zachodzi na siebie i znajduje się pomiędzy aminokwasami 95-264 RAP-2. Jednakże ujawniono, że kolejne działania funkcjonalne zachodzące za pośrednictwem RAP-2 znajdują odzwierciedlenie w domenie N-końcowej białka, zawierającej aminokwasy 1-264.

W związku z powyższym RAP-2 wydaje się być istotnym elementem obwodu osłabiającego sygnał w układzie w odpowiedzi na stres: ektopowa ekspresja sensownych konstruktów kodujących hamuje odpowiedź, podczas gdy ekspresja antysensownych konstruktów kodujących wzmacnia odpowiedź. W rzeczywistości, RAP-2 jest także znany w laboratorium twórcy jako RAT (ang. RIP's Attenuator), tj. „tłumik” RIP i może być niniejszym oznakowany jako RAT i/lub RAT-303 i/lub klon 303.

Istnienie wielu wariantów składania wskazuje, że przynajmniej w części ostateczne działanie RAP-2 w danych warunkach prawdopodobnie zależy od obecności pewnych bloków sekwencji, które są konieczne do wiązania/naprowadzania/translokacji/modyfikacji białka, w dominującej izoformie. Na przykład, jeżeli faktycznie wiązanie RAP-2 z TIP60 umożliwia jądrową lokalizację tego pierwszego białka, należy przypuszczać, że warianty RAP-2 z wyciętymi podczas składania sygnałami lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal) mogą stać się wadliwe, lub, odwrotnie, mogą nakładać się z aktywnymi w tłumieniu NF-kB/AP-1. Analiza sekwencji pokazuje, że RAP-2 niesie kilka klasterów dodatnio naładowanych aminokwasów (E, K i R), które są charakterystyczne dla większości znanych NLS.

Wiązanie RAP-2 do RIP mapowano na region białka RAP-2, który zaczyna się pomiędzy aminokwasami 177-218, a kończy się przy aminokwasie 264. Domena wiążąca RIP w białku RAP-2 nie nakładała się z miejscami wiążącymi dla IKKe ani NIK.

Wiązanie z TIP60, przedstawicielem rodziny białek jądrowych nazywanymi acetylotransferazami histonowymi, najwyraźniej jest mapowane w regionie zawierającym się pomiędzy aminokwasami 95-264. Ujawniono, że region biorący udział w homodimeryzacj i znajduje się pomiędzy aminokwasami 217-264.

Zebrane dane sugerują, że wszystkie funkcjonalne efekty RAP-2 (a mianowicie hamowanie NF-kB i indukcja hiperfosforylacji c-Jun) znajdują odwzorowanie w tym samym regionie.

Białko kodowane przez klon #10 najwyraźniej wiąże się z regionem rozpoczynającym się pomiędzy aminokwasami 218-309 i kończącym się na aminokwasie 416, a stąd miejsce wiązania może obejmować nakładające się regiony z miejscami wiążącymi dla RIP, NIK, IKKe i TIP60.

Ponadto, możliwe jest, że region wystarczający do skutecznego modulowania sygnalizacji przez wszystkie induktory lokalizuje się w N-końcowym segmencie białka.

Region obejmujący aminokwasy 95-416 wykazuje działanie jakkolwiek jest ono znacząco słabsze w porównianiu z białkiem pełnej długości, co może być spowodowane nasiloną agregacją endogennego RAP-2.

Ponadto, z wyłączeniem RelA, wszystkie działania wywołane w niniejszych doświadczeniach mogą zachodzić za pośrednictwem około 100 aminokwasów końca N RAP-2. W rzeczywistości, nawet fragment obejmujący aminokwasy 1-102 pośredniczy w różnych działaniach, mimo że w sposób bardziej umiarkowany.

Z drugiej strony, tłumienie działań za pośrednictwem RelA wymaga znacznie dłuższej części RAP-2. Do tej pory możliwe było zidentyfikowanie granic tego regionu pomiędzy aminokwasami 1-264, które ewidentnie obejmują region pomiędzy aminokwasami 157 i 264 o pewnych swoistych wiążących właściwościach związanych z RelA.

W świetle tych obserwacji, wydaje się że:

a. Z wyłączeniem RelA, wiązanie RAP-2 z RIP, klon #10, i prawdopodobnie NIK i TIP60 nie są konieczne do działania białka jako inhibitora NF-kB indukowanego nadekspresją.

b. W działaniu RAP-2 w aktywacji wywołanej nadekspresją RelA pośredniczą przynajmniej częściowo różne efekty wiązania. Zasadniczo, wszystkie wymienione białka mogą przyczyniać się do danej aktywności, co wywnioskowano z doświadczeń przeprowadzonych do tej pory.

Ze względu na unikalną właściwość receptorów FAS-R i TNF do wywoływania śmierci komórkowej, jak również zdolności receptorów TNF do wyzwalania różnych aktywności niszczących tkankę, zaburzenia funkcji tych receptorów mogą być szczególnie szkodliwe dla organizmu. Faktycznie, wykazano, że zarówno nadmierne jak i niepełne funkcjonowanie tych receptorów przyczynia się do patologicznych manifestacji różnych chorób. Identyfikacja cząsteczek biorących udział w aktywności sygnalizacyjnej tych receptorów oraz ujawnienie sposobów modulowania funkcji tych cząsteczek stanowi potencjalny klucz do nowych terapeutycznych rozwiązań wobec tych chorób. W świetle tej przypuszczalnie istotnej roli RIP w toksyczności FAS-R i p55-R, a zatem przypuszczalnie istotnej roli regulatorowej RAP-2 w FAS-R i TNF przez modulowanie RIP, opracowanie leków blokujących cytotoksyczną funkcję

PL 199 214 B1

RIP, ewentualnie przez blokowanie wiązania RAP-2 do RIP lub w przeciwnym wypadku hamowanie oddziaływania pomiędzy RAP-2 i RIP w warunkach, kiedy RAP-2 działa, aby wzmocnić cytotoksyczność zachodzącą za pośrednictwem RIP (jak wskazano powyżej RIP jest cytotoksyczne samodzielnie oraz w połączeniu z innymi białkami, które mają regiony domeny śmierci) wydaje się szczególnie istotne.

Podobnie wiadomo (patrz powyżej), że FAS-R i p55-R biorą udział w aktywacji NF-kB, a tym samym są odpowiedzialne za przeżywalność komórki. Wobec tego kiedy pożądane jest uśmiercanie komórek, na przykład komórek rakowych, komórek zainfekowanych HIV i tym podobnych, byłoby właściwym wzmaganie cytotoksycznych efektów FAS-R i p55-R (oraz białek z nimi powiązanych, na przykład MORT-1, MACH, Mch4, G1, TRADD), z jednoczesnym hamowaniem ich zdolności do indukowania NF-kB. Dlatego też, kiedy oddziaływanie lub wiązanie RAP-2 z RIP prowadzi do zwiększenia możliwej roli RIP we wzmaganiu indukcji NF-kB (ewentualnie przez TRAF2 i ewentualnie przez domenę kinazową i/lub domenę pośrednią RIP), pożądane byłoby wtedy blokowanie tego oddziaływania pomiędzy RAP-2 i RIP w celu hamowania, lub przynajmniej zapobiegania wzmagania, aktywacji NF-kB, a tym samym przenoszenie równowagi efektów indukowanych przez ligandy TNF lub FAS na stronę cytotoksyczności komórkowej, aby ostatecznie powodować zwiększoną śmierć komórkową.

Podobnie w sytuacji odwrotnej (do tej wskazanej powyżej), kiedy wiązanie RAP-2 do RIP właściwie powoduje hamowanie efektów zapalnych lub cytotoksycznych FAS-R i p55-R i jest pożądane blokowanie tych działań cytotoksycznych, np. w procesach zapalnych, różnorodnych chorobach autoimmunizacyjnych i tym podobnych, w których wskazane jest zwiększanie przeżywalności komórek, ważne jest opracowywanie leków, które wzmacniały by oddziaływanie pomiędzy RAP-2 i RIP, w celu wzmocnienia całkowitego hamowania śmierci komórkowej i przesunięcia równowagi w kierunku przeżywalności komórek. Z powyższego wynika również to, że w przypadku gdy oddziaływanie RAP-2 z RIP powoduje hamowanie w funkcjonowaniu RIP we wzmacnianiu aktywacji NF-kB, wtedy gdy przeżywalność komórek jest pożądana, konieczne jest blokowanie tego oddziaływania pomiędzy RAP-2 i RIP, a tym samym wzmaganie aktywności RIP we wzmacnianiu aktywacji NF-kB.

Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe wskazania, wydaje się, że RIP odgrywa kluczową rolę w równowadze pomiędzy indukowaniem lub pośredniczeniem w szlakach zapalnych, śmierci komórkowej lub przeżywalności komórkowej, a zatem będąc modulatorem RIP RAP-2 odgrywa równie istotną rolę. Wywieranie wpływu na oddziaływanie/wiązanie RAP-2-RIP potencjalnie pozwoli przez stosowanie różnych leków lub sposobów leczenia, jak wskazano powyżej i poniżej, na przesunięcia w ścieżkach sygnalizacji wewnątrzkomórkowej ze śmierci komórkowej na komórkową przeżywalność i vice versa, o ile będzie to konieczne.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji DNA kodującej białko RAP-2 oraz białek RAP-2 kodowanych przez te sekwencje DNA.

Niniejszym ujawniono również sekwencje DNA kodujące biologicznie aktywne analogi, fragmenty oraz pochodne białka RAP-2, oraz kodowane przez nie analogi, fragmenty i pochodne. Przygotowanie takich analogów, fragmentów i pochodnych przeprowadza się standardowymi procedurami (zobacz na przykład, Sambrook i in., 1989), w których w sekwencji DNA kodującej białko RAP-2 jeden lub więcej kodonów może być usunięty, dodany, podstawiony przez inny, z wytworzeniem analogów wykazujących co najmniej zmianę jednej reszty aminokwasowej w porównaniu z białkiem natywnym.

Do powyższych sekwencji DNA, które kodują białko, izoformę, analog, fragment lub pochodną białka RAP-2 dodane są również sekwencje DNA zdolne do hybrydyzowania z sekwencją cDNA otrzymaną z regionu kodującego natywnego białka RAP-2, przy czym hybrydyzacja taka jest prowadzona w warunkach umiarkowanie ostrych, a zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA kodują biologicznie aktywne białko RAP-2. Zatem te zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA obejmują sekwencje DNA, które mają stosunkowo wysoką homologię do natywnej sekwencji cDNA RAP-2 i jako takie reprezentują sekwencje podobne do RAP-2, które mogą być, na przykład, naturalnie otrzymanymi sekwencjami kodującymi różne izoformy RAP-2 lub naturalnie występującymi sekwencjami kodującymi białka należące do grupy sekwencji podobnych do RAP-2, kodujących białko o aktywności RAP-2. Ponadto sekwencje te mogą również, na przykład, obejmować niewystępujące naturalnie, syntetycznie wytworzone sekwencje, które są podobne do natywnej sekwencji cDNA RAP-2, ale do których została wkomponowana liczba pożądanych modyfikacji. Takie syntetyczne sekwencje obejmują zatem wszystkie możliwe sekwencje kodujące analogi, fragmenty i pochodne RAP-2, z których wszystkie wykazują aktywność RAP-2.

Aby otrzymać wskazane powyżej różnorodne naturalnie występujące sekwencje typu RAP-2, standardowe procedury przesiewania i izolacji naturalnie otrzymanych próbek DNA lub RNA z różnych

PL 199 214 B1 tkanek mogą być zastosowane przy użyciu jako próbnika naturalnego cDNA RAP-2 lub jego części (patrz na przykład standardowe procedury przedstawione w Sambrook i in., 1989).

Podobnie, aby przygotować wskazane powyżej różnorodne syntetyczne sekwencje typu RAP-2 kodujące analogi, fragmenty lub pochodne RAP-2, liczba pewnych standardowych procedur może być zastosowana, jak szczegółowo opisano poniżej w odniesieniu do wytwarzania takich analogów, fragmentów i pochodnych.

Polipeptyd lub białko „zasadniczo odpowiadające” białku RAP-2 obejmuje nie tylko białko RAP-2, ale również polipeptydy lub białka będące analogami RAP-2.

Analogi, które zasadniczo odpowiadają białku RAP-2 są polipeptydami, w których jeden lub więcej aminokwasów sekwencji aminokwasowej białka RAP-2 zostało zastąpione innymi aminokwasami, usunięte i/lub wstawione, przy czym otrzymane w ten sposób białko wykazuje zasadniczo podobną lub wyższą aktywność biologiczną, niż białko RAP-2, któremu odpowiada.

Aby białko, takie jak izoformy, mogło zasadniczo odpowiadać RAP-2, zmiany w sekwencji białka RAP-2 powinny być zasadniczo małe. Jakkolwiek liczba zmian może przekraczać dziesięć, korzystnie nie występują więcej niż dziesięć, korzystniej pięć, zaś najkorzystniej nie więcej niż trzy takie zmiany. O ile można zastosować dowolną technikę w celu określenia potencjalnych aktywnych biologicznie białek, które zasadniczo odpowiadają białkom RAP-2, jedna z tych technik wykorzystuje konwencjonalne techniki mutagenezy na DNA kodującym białko, dając niewiele modyfikacji. Białka wyrażane przez takie klony można badać przesiewowo pod kątem ich zdolności do wiązania z RIP, jak również modulacji aktywności RIP i modulacji/pośredniczenia w wewnątrzkomórkowych szlakach opisanych wyżej.

Określeniem „zmiany konserwatywne” określa się takie zmiany, które nie zmieniają aktywności białek i są zwykle pierwszymi, które są badane ponieważ nie oczekuje się by zmieniały wielkość, ładunek i konfigurację białka, a więc nie oczekuje się by zmieniały ich właściwości biologiczne.

Konserwatywne zastąpienia białek RAP-2 obejmują analogi, w których przynajmniej jeden aminokwas został zastąpiony konserwatywnie przez inny aminokwas. Takie zastąpienia korzystnie przeprowadza się zgodnie z następującą listą przedstawioną w Tabeli IA, które to zastąpienia można określić przez rutynowe doświadczenia w celu określenia zmodyfikowanych właściwości strukturalnych i funkcjonalnych syntetyzowanej cząsteczki polipeptydowej, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności biologicznej charakterystycznej dla białka RAP-2.

T a b e l a IA

Reszta oryginalna	Przykładowe zastąpienie
1	2
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile

PL 199 214 B1 ciąg dalszy tabeli IA

1	2
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Alternatywnie, innymi grupami zastąpień białka RAP-2 są takie, w których przynajmniej jedna reszta aminokwasowa została zastąpiona przez inną resztę w jej miejscu zgodnie z poniższą Tabelą IB. Ten rodzaj zastąpień, który można przeprowadzić w polipeptydzie, opiera się analizie częstości zmian aminokwasowych pomiędzy białkami homologicznymi różnych gatunków, jak przedstawione na Tabeli 1-2 w Schultz i in., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; i Fig. 3-9, w Creighton; Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman & Co., San Francisco, CA, 1983. W oparciu o tę analizę, określa się alternatywne zastąpienia, które są określone jako zamiany w jednej z poniższych grup:

Tabeli IB

1. Reszty małe, alifatyczne, niepolarne albo słabo polarne: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Reszty polarne, ujemnie naładowane i ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. Reszty polarne, dodatnio naładowane: His, Arg, Lys;

4. Reszty duże, alifatyczne, niepolarne: Met, Leu, Ile, Val (Cys); i

5. Reszty duże, aromatyczne: Phe, Tyr, Trp.

Trzy reszty aminokwasowe w nawiasach odgrywają specjalną rolę w strukturze białka. Gly jest jedyną resztą pozbawioną łańcuchów bocznych, a więc nadaje giętkości łańcuchowi. Jednakże sprzyja to tworzeniu innych struktur drugorzędowych niż helisy α. Pro, z powodu niezwykłej geometrii, ściśle ogranicza łańcuch i zasadniczo promuje struktury typu skrętów β, jakkolwiek w niektórych przypadkach Cys może brać udział w tworzeniu mostków disiarczkowych, które są istotne dla fałdowania białka. Należy zaznaczyć, że Schultz i in. powyżej, łączą grupę 1 i 2. Należy również zaznaczyć, że Tyr, z powodu zdolności do tworzenia wiązania wodorowego wykazuje istotne podobieństwo do Ser i Thr, itd.

Konserwatywne substytucje aminokwasowe, np. jak wskazano powyżej, są znane w dziedzinie i należałoby oczekiwać zachowania właściwości biologicznych i strukturalnych polipeptydów poddanych substytucji aminokwasów. Większość delecji i substytucji stanowią takie, które nie powodują radykalnych zmian w charakterystyce cząsteczki białka lub polipeptydu. „Charakterystyka” jest zdefiniowana w sposób nie obejmujący, w celu określenia zmiany w strukturze drugorzędowej np. helisa α lub harmonijka β, jak również zmiany w aktywności biologicznej, np. wiązania z RIP i/lub pośredniczenia w działaniu RIP-2 na śmierć komórkową.

Przykłady wytwarzania substytucji aminokwasowych w białkach, które można wykorzystać w celu otrzymania analogów białek RAP-2 obejmują dowolny znany sposób taki, jak przedstawione w patencie USA nr RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462, przyznane Mark i in., 5,116,943, przyznane Koths i in., 4,965,195 przyznany Namen i in., 4,879,111 przyznany Chong i in., oraz 5,017,691 przyznany Lee i in., oraz białka podstawione lizyną jak przedstawiono w patencie 4,904,584 (Shaw i in.).

Oprócz konserwatywnych substytucji omówionych powyżej, które w sposób znaczący nie zmieniłyby aktywności białka RAP-2, konserwatywne lub mniej konserwatywne i bardziej przypadkowe zmiany, prowadzące do zwiększenia aktywności biologicznej analogów białek RAP-2, są również niniejszym opisane.

Kiedy dokładny efekt substytucji lub delecji ma być potwierdzony, osoba biegła w dziedzinie doceni, że efekt substytucji, delecji itd. będzie oceniany rutynowymi testami wiązania i śmierci komórkowej. Badania przesiewowe wykorzystujące standardowy test nie obejmują nadmiernej ilości pracy eksperymentalnej.

Dopuszczalnymi analogami RAP-2 są takie, które zatrzymują co najmniej zdolność wiązania RIP, przez co, jak wskazano powyżej, pośredniczą w aktywności RIP w wewnątrz komórkowych szlakach opisanych powyżej. W taki sposób mogą być wytwarzane analogi, które wykazują tak zwane działanie

PL 199 214 B1 dominujące-negatywne, to znaczy analog, który jest wadliwy albo pod kątem wiązania z RIP albo w sygnalizacji lub innej aktywności występującej kolejno po takim związaniu. Takie analogi mogą być stosowane, na przykład, do hamowania działania RIP lub hamowania działania RIP indukującego NF-kB (bezpośrednio lub pośrednio), w zależności od tego, która z tych aktywności jest główną modulowaną przez oddziaływanie RAP-2 i RIP (patrz powyżej) i to przez takie analogi współzawodniczące z naturalnymi RAP-2 o wiązanie z RIP.

Na poziomie genetycznym, analogi te są w ogólności wytwarzane przez kierowaną miejscowo mutagenezę nukleotydów w DNA kodującym RAP-2, tym samym wytwarzając DNA kodujące analog, a następnie syntetyzując DNA i wyrażając polipeptyd w rekombinowanej hodowli komórkowej. Typowo analogi wykazują taką samą lub jakościowo zwiększoną aktywność biologiczną, co naturalnie występujące białka, Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Wytwarzanie białka RAP-2 zgodnie z niniejszymi ujawnieniami lub alternatywnej sekwencji nukleotydowej kodującej taki sam polipeptyd, ale różniący się od sekwencji naturalnej ze względu na zmiany dopuszczone przez znaną degenerację kodu genetycznego, mogą być osiągnięte przez miejscowo swoistą mutagenezę DNA, który koduje wcześniej wytworzony analog lub natywną wersję białka RAP-2. Miejscowo specyficzna mutageneza pozwala na wytwarzanie analogów przez zastosowanie specyficznych sekwencji oligonukleotydowych kodujących sekwencję DNA pożądanej mutacji, jak również wystarczającą liczbę przylegających nukleotydów, aby dostarczyć sekwencję startera wystarczającej wielkości i stopniu skomplikowania sekwencji w celu otrzymania stabilnego dupleksu, zabezpieczając po obu stronach połączenia w miejscu delecji. Zazwyczaj korzystny jest starter o około 20 lub 25 nukleotydach długości, o około 5 do 10 zmienionych nukleotydach komplementarnych po każdej stronie sekwencji. Ogólnie technika miejscowo specyficznej mutagenezy jest dobrze znana w dziedzinie i zilustrowana publikacjami takimi jak Adelman i in., DNA 2:183 (1983), którego ujawnienia są niniejszym włączone na drodze odniesienia.

Jak będzie to docenione, technika miejscowo specyficznej mutagenezy wykorzystuje wektor fagowy, który istnieje zarówno w postaci jednoniciowej jak i dwuniciowej. Typowe wektory użyteczne w miejscowo specyficznej mutagenezie obejmują wektory, takie jak fag M13, na przykład te ujawnione przez Messing i in., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, redaktor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), którego ujawnienia są włączone niniejszym na drodze odniesienia. Te fagi są dostępne na rynku w sposób bezpośredni, a ich zastosowanie jest ogólnie dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Alternatywnie wektory plazmidowe zawierające jednoniciowe fagowe źródła replikacji (Veira i in., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987) mogą być zastosowane do otrzymania jednoniciowego DNA.

W ogólności ukierunkowana miejscowo mutageneza zgodnie z niniejszym ujawnieniem jest wykonywana najpierw przez otrzymanie jednoniciowego wektora, który obejmuje wewnątrz swojej sekwencji sekwencję DNA kodującą istotny polipeptyd. Starter oligonukleotydowy niosący pożądaną zmutowaną sekwencję jest przygotowany syntetycznie przez zautomatyzowaną syntezę DNA/oligonukleotydową. Starter jest następnie splatany z jednoniciowym wektorem kodującym sekwencję białka i podany działaniu enzymów polimeryzujących DNA, takich jak fragment Klenow polimerazy I E. coli, w celu ukończenia syntezy nici zawierającej mutacje. Zatem zmutowana sekwencja i druga nić niosą pożądaną mutację. Ten wektor w postaci heterodupleksu jest następnie stosowany do transformowania odpowiednich komórek, takich jak E. coli JM101 i klony są wybrane tak, aby zawierały rekombinowane wektory niosące układ zmutowanych sekwencji.

Po selekcji takich klonów, zmutowana sekwencja białka RAP-2 może być usunięta i umiejscowiona w odpowiednim wektorze, w ogólności wektorze transferującym lub ekspresyjnym typu, który może być stosowany do transfekcji odpowiedniego gospodarza.

Odpowiednio, gen lub kwas nukleinowy kodujący białko RAP-2 może być również wykryty, otrzymany i/lub modyfikowany in vitro, in situ i/lub in vivo, przez zastosowanie znanych technik amplifikacji DNA lub RNA, takich jak PCR oraz chemiczna synteza oligonukleotydów. PCR pozwala na amplifikację (wzrost w liczbie) specyficznych sekwencji DNA przez powtarzanie reakcji polimerazy DNA. Reakcja ta może być użyta jako zastępstwo wobec klonowania; wszystko co jest konieczne to znajomość sekwencji kwasu nukleinowego. Aby przeprowadzić PCR, startery są opracowane, które są komplementarne wobec interesującej nas sekwencji. Startery te są wytworzone przez zautomatyzowaną syntezę DNA. Ponieważ startery mogą być opracowane do hybrydyzacji z którąkolwiek częścią genu,

PL 199 214 B1 warunki mogą być stworzone tak, aby niezgodność komplementarnych par zasad była tolerowana. Amplifikacja tych niedopasowanych regionów może prowadzić do syntezy zmutagenizowanego produktu, czego wynikiem jest powstanie peptydu o nowych właściwościach (tj. miejscowo ukierunkowanej mutagenezy). Zobacz również na przykład Ausubel, supra, rozdz. 16. Również przez syntezę sprzęgającą komplementarne DNA (cDNA) z zastosowaniem w PCR odwrotnej transkryptazy, RNA może być stosowany jako materiał wyjściowy do syntezy zewnątrzkomórkowej domeny receptora prolaktyny bez klonowania.

Ponadto starter PCR może być zaprojektowany tak, aby zawierał nowe miejsca restrykcyjne lub inne cechy, takie jak kodony stop na końcach segmentu genu, który ma być amplifikowany. Umieszczenie miejsc restrykcyjnych na końcach 5' i 3' amplifikowanej sekwencji genu pozwala na indywidualne zaprojektowanie segmentów genu kodującego białko RAP-2 lub jego fragment dla celów ligacji z innymi sekwencjami i/lub miejscami klonowania w wektorach.

PCR i inne metody amplifikacji RNA i/lub DNA są dobrze znane w dziedzinie i mogą być stosowane w oparciu o ujawnienia i instrukcje niniejszym ujawnione, bez nadmiernego wkładu pracy eksperymentalnej. Znane sposoby amplifikacji obejmują, ale nie ograniczają się do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz pokrewnych procesów amplifikacji (patrz, np. opisy patentowe USA o numerach 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, na rzecz Mullis i in.; 4,795,699 i 4,921,794 na rzecz Tabor i in.; 5,142,033 na rzecz Innis; 5,122,464 na rzecz Wilson i in.; 5,091,310 na rzecz Innis; 5,066,584 na rzecz Gyllensten i in.; 4,889,818 na rzecz Gelfand i in.; 4,994,370 na rzecz Silver i in.; 4,766,067 na rzecz Biswas; 4,656,134 na rzecz Ringold; oraz Innis i in., red., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) oraz amplifikacji za pośrednictwem RNA wykorzystującej antysensowne RNA do naprowadzania sekwencji jako matrycy do syntezy dwuniciowego DNA (opis patentowy USA nr 5,130,238 wydany na rzecz Malek i in., pod nazwą handlową NASBA); oraz immunologiczny PCR, który łączy zastosowanie amplifikacji DNA ze znakowaniem przeciwciał (Ruzicka i in., Science 260:487 (1993); Sano i in., Science 258-120 (1992); Sano i in., Biotechniques 9: 1378 (1991)), przy czym całkowita zawartość opisów patentowych i odnośników jest całkowicie włączona niniejszym na drodze odniesienia.

W sposób analogiczny, biologicznie czynne fragmenty białek RAP-2 (np. te spośród dowolnych RAP-2 lub jego izoform) mogą być przygotowane jak wskazano powyżej w odniesieniu do analogów białek RAP-2. Odpowiednimi fragmentami białek RAP-2 są takie, które zachowują zdolność RAP-2 i które modulują lub pośredniczą w biologicznej aktywności RIP lub innych białek powiązanych z RIP bezpośrednio lub pośrednio. Tak więc, mogą być przygotowane fragmenty białka RAP-2, które wykazują dominujący-negatywny lub dominujący-pozytywny efekt, jak wskazano powyżej w odniesieniu do analogów. Należy zauważyć, że takie fragmenty reprezentują szczególną klasę analogów, w szczególności, są nimi części białek RAP-2 otrzymane z białka RAP-2 pełnej sekwencji (np., dowolne spośród RAP-2 lub jego izoform), a każda z takich części lub fragmentów wykazuje dowolną ze wskazanych powyżej pożądanych aktywności. Takie fragmenty mogą być na przykład peptydami.

Podobnie pochodne mogą być wytworzone przez standardowe modyfikacje grup bocznych jednego lub więcej reszt aminokwasowych białka RAP-2, jego analogów lub fragmentów, albo przez skoniugowanie białka RAP-2, jego analogów lub fragmentów, z inną cząsteczką, na przykład, przeciwciałem, enzymem, receptorem, itd., jak jest to dobrze znane w dziedzinie. Zatem „pochodne” jak stosuje się niniejszym obejmuje pochodne, które mogą być wytworzone z grup funkcyjnych występujących jako łańcuchy boczne reszt aminokwasowych lub grupy N- lub C-końca, sposobami znanymi w dziedzinie. Pochodne mogę mieć reszty węglowodanowe lub fosforanowe, przy czym frakcja taka wykazuje taką samą lub wyższą biologiczną aktywność niż białka RAP-2.

Na przykład pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych otrzymane przez reakcję z amoniakiem lub jego pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzone przez połączenie z ugrupowaniami acylowymi (np., grupami alkanoilowymi lub karbocyklicznymi grupami aroilowymi) lub pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (na przykład takich jak reszty serylowa lub treonylowa) wytworzone z ugrupowaniami acylowymi.

Określenie „pochodne” w zamierzeniu ma obejmować tylko takie pochodne, które nie zamieniają jednego aminokwasu na inny z dwudziestu powszechnie występujących naturalnych aminokwasów.

RAP-2 jest białkiem lub polipeptydem, tj. sekwencją reszt aminokwasowych. Polipeptyd składający się z większej sekwencji, która obejmuje całą sekwencję białka RAP-2, zgodnie z niniejszymi definicjami, mieści się w założeniu w zakresie takiego polipeptydu tak długo, jak addycje nie wpływają

PL 199 214 B1 na podstawowe i nowe cechy charakterystyczne, tj. jeżeli albo zachowują lub zwiększają aktywność biologiczną białka RAP-2 lub mogą być cięte z wytworzeniem białka lub polipeptydu o aktywności biologicznej białka RAP-2. Zatem opisane zostały niniejszym, na przykład, białka fuzyjne RAP-2 z innym aminokwasami lub peptydami.

Nowe białko RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne znajdują liczne możliwe zastosowania, przykładowo:

(i) Białko RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne można zastosować do modulowania funkcji RIP w szlakach zapalnych, śmierci komórkowej albo przeżywania komórek, jak zaznaczono wyżej. Na przykład, jeżeli RAP-2 może modulować wpływ RIP na aktywację NF-kB, JNK (kinazy Jun) lub kinazy p38, oba takie działania RAP-2 prowadzące do wzmocnienia działania RAP-2-RIP mogą być pożądane w zastosowaniach anty- lub pro-zapalnych, anty-HIV itd. W tym przypadku białko RAP-2, jego analogi, fragmenty lub pochodne, które mogą modulować zapalenie, wzmacniać efekty cytotoksyczne lub blokować przeżywanie komórek, mogą być wprowadzane do komórek standardowymi procedurami znanymi per se. Na przykład, kiedy białko RAP-2 jest całkowicie wewnątrzkomórkowe (jak się przypuszcza) i powinno być wprowadzane do komórek, w których działanie za pośrednictwem RIP liganda FAS-R lub TNF lub innego cytotoksycznego białka jest pożądane, system specyficznego wprowadzenia tego białka do komórek jest konieczny. Jednym sposobem dokonanie tego jest otrzymanie rekombinowanego zwierzęcego wirusa, np. takiego otrzymanego z wirusa krowianki, do DNA którego zostaną wprowadzone następujące geny: gen kodujący ligand, który wiąże się swoiście do białek powierzchniowych wyrażanych przez komórki, np. takie jak białko gp120 wirusa AIDS (HIV), które wiąże się swoiście z niektórymi komórkami (limfocytami CD4 i pokrewnymi leukocytami), lub dowolny inny ligand, który swoiście wiąże się z komórkami niosącymi FAS-R lub p55-R, takimi jak rekombinowany wektor wirusowy zdolny do wiązania takich komórek niosących FAS-R lub p55-R; oraz gen kodujący białko RAP-2. Zatem ekspresja białek wiążących się z powierzchnią komórki na powierzchni wirusa nakierowuje wirusa specyficznie do komórki nowotworowej lub innej komórki niosącej FAS-R lub p55-R, po czym sekwencja kodująca białko RAP-2 zostaje wprowadzona do komórki przez wirus, i gdy zostanie wyrażona w komórce, nastąpi wzmocnienie pośredniczenia RIP w działaniu liganda FAS-R lub TNF lub niezależnego RIP. Do konstrukcji takiego zwierzęcego wirusa stosuje się standardowe techniki (patrz na przykład, Sambrook i in., 1989). Inną możliwością jest wprowadzenie sekwencji białka RAP-2 (np., dowolnego z RAP-2 lub jego izoform) w postaci oligonukleotydu, który może być absorbowany przez komórki i być w nich wyrażany.

(ii) Można je zastosować do hamowania działań liganda FAS-R albo TNF albo pokrewnego białka, za pośrednictwem RIP albo niezależnie od RIP, np. w przypadkach jak uszkodzenie tkanki we wstrząsie septycznym, odrzuceniu przeszczepu przeciwko gospodarzowi, ostrym zapaleniu wątroby, kiedy to pożądane jest blokowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji przez FAS-R albo p55-R wywołanej ligandem FAS-R albo TNF, albo działanie niezależnego od RIP, albo innej sygnalizacji za pośrednictwem białka w tym samym czasie w celu zwiększenia przeżywania komórek. W takiej sytuacji możliwe jest, na przykład, wprowadzenie do komórek, standardowymi procedurami, oligonukleotydów o antysensownej sekwencji kodującej wobec białka RAP-2, co w sposób skuteczny zablokowałoby translację mRNA kodującego białko RAP-2, tym samym blokując ekspresję i prowadząc do hamowania efektu wywołanego ligandem FAS-R lub TNF lub RIP lub innym białkiem. Takie oligonukleotydy mogą być wprowadzane do komórek z zastosowaniem powyższych technik rekombinowanego wirusa, gdzie drugą sekwencją niesioną przez wirus będzie sekwencja oligonuklotydowa.

Podobnie, jak zaznaczono wyżej, zależnie od natury oddziaływania RAP-2-RIP, możliwe jest dzięki (i) albo (ii) nasilenie albo zahamowanie szlaków zapalnych albo przeżywania, o ile jest to pożądane.

Inną możliwością jest zastosowanie przeciwciał swoistych wobec białka RAP-2, w celu zahamowania aktywności sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

Jeszcze innym sposobem zahamowania działań za pośrednictwem RIP albo działania niezależnego od RIP jest ostatnio opracowane podejście oparte na rybozymach. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA, które swoiście tną RNA. Rybozymy mogą być opracowane do cięcia docelowo wybranego RNA, np. mRNA kodującego białko RAP-2. Takie rybozymy miałyby swoistą sekwencję wobec mRNA białka RAP-2 i byłyby zdolne do oddziaływania z nim (wiązanie komplementarne), a następnie cięcia mRNA, wynikiem czego byłoby obniżenie (lub całkowite zaprzestanie) ekspresji białka RAP-2, przy czym poziom obniżenia ekspresji będzie zależał, od poziomu wyrażania rybozymu w komórce docelowej. Aby wprowadzić rybozymy do wybranych komórek (np., takich niosących FAS-R lub p55-R), dowolny odpowiedni wektor może być stosowany, np., plazmid, wektory wirusa zwierzęcego

PL 199 214 B1 (retrowirusowe), które zazwyczaj są stosowane do tego celu (patrz także punkt (i) powyżej, przy czym wirus posiada jako drugą sekwencję, cDNA kodujący sekwencję wybranego rybozymu). (Przeglądówki, sposoby, itd., dotyczące rybozymów opisano w Chen i in., 1992; Zhao i Pick, 1993; Shore i in., 1993; Joseph i Burke, 1993; Shimayama i in., 1993; Cantor i in., 1993; Barinaga, 1993; Crisell i in., 1993 oraz Koizumi i in., 1993). Podejście to jest odpowiednie gdy oddziaływanie RAP-2-RIP wzmacnia cytotoksyczność komórkową w sytuacjach kiedy pożądane jest blokowanie takiej cytotoksyczności, lub kiedy oddziaływanie RAP-2-RIP hamuje aktywację NF-kI w takiej samej sytuacji, kiedy pożądane jest blokowanie takiego hamowania w celu zwiększenia takiej aktywacji NF-kB, tj. w obydwu przypadkach pożądane jest zwiększenie przeżycia komórek jak w punkcie (ii) powyżej.

(iii) Białko RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne można również zastosować do izolowania, identyfikacji i klonowania innych białek tej samej klasy, tj. wiążących RIP albo funkcjonalnie pokrewnych receptorów albo białek, związanych z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. W niniejszym zgłoszeniu wskazany powyżej dwu-hybrydowy drożdżowy system może być stosowany, lub może być stosowany niedawno opracowany system stosujący hybrydyzację typu Southern w warunkach nieostrych, a następnie klonowanie PCR (Wilks i in., 1989). W publikacji Wilks i in., opisano identyfikację i klonowanie dwóch domniemanych tyrozynowych kinaz białkowych przez zastosowanie hybrydyzacji typy Southern w nieostrych warunkach, a następnie klonowanie PCR w oparciu o znaną sekwencję motywu kinazy, z otrzymaniem sekwencji kinazy. Takie podejście może być stosowne z zastosowaniem sekwencji białka RAP-2 w celu zidentyfikowania i sklonowania związanych białek wiążących RIP.

(iv) Jeszcze innym podejściem wykorzystującym białko RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne jest zastosowanie ich w sposobach polegających na chromatografii powinowactwa w celu izolowania i identyfikacji innych białek albo czynników, z którymi mogą się wiązać, np. innych białek albo czynników związanych z wewnątrzkomórkowym procesem sygnalizacji. W tym zgłoszeniu, białko RAP-2 jego analogi, fragmenty lub pochodne, mogą być indywidualnie przyłączone do matryc stosowanych w chromatografii powinowactwa, a następnie doprowadzone do kontaktu z ekstraktami komórkowymi lub wyizolowanymi białkami lub czynnikami potencjalnie biorącymi udział w wewnątrzkomórkowych procesach sygnalizacji. Po procedurze chromatografii powinowactwa inne białka lub czynniki, które wiążą się z białkiem RAP-2, lub jego analogami, fragmentami lub pochodnymi, mogą być eluowane, izolowane i scharakteryzowane.

(v) Jak zaznaczono wyżej, białko RAP-2, jego analogi, fragmenty i pochodne można również zastosować jako immunogeny (antygeny) w celu wytworzenia przeciwko nim swoistych przeciwciał. Przeciwciała te można również zastosować w celu oczyszczania białka RAP-2 (np. RAP-2 albo dowolnej izoformy) z ekstraktów komórkowych albo transformowanych linii komórkowych z wytworzeniem białek RAP-2, lub jego analogów lub fragmentów. Ponadto przeciwciała te mogą być stosowane do celów diagnostycznych do identyfikowania zaburzeń związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem systemu ligand FAS-R lub TNF, zachodzącego za pośrednictwem RIP lub niezależnych aktywności RIP, np., nadmierne lub niewystarczające działania komórkowe indukowane ligandem FAS-R lub TNF zachodzące za pośrednictwem RIP albo swoiste działania komórkowe samego RIP. Zatem takie choroby mogą być powiązane z nieprawidłowym funkcjonowaniem wewnątrzkomórkowego systemu sygnalizacji, w którym bierze udział białko RIP lub różnorodne inne, wskazane powyżej białka wiążące RIP lub samo białko RAP-2, tak że przeciwciała stanowiłyby ważne narzędzie diagnostyczne.

Należy zaznaczyć, że izolowanie, identyfikację i charakteryzację białka RAP-2 można przeprowadzić stosując dowolną znaną standardową procedurę przesiewową. Na przykład, jedna z procedur przesiewowych, dwu-hybrydowa drożdżowa procedura opisana niniejszym, była stosowana do identyfikacji białka RIP (zobacz Stanger i in., 1995), a następnie różnorodnych białek RAP-2 (oprócz różnych innych nowych białek wskazanych powyżej i poniżej wskazanych w zgłoszeniach patentowych Zgłaszającego, rozpatrywanych w tym samym czasie). Podobnie jak wskazano powyżej i poniżej inne procedury mogą znaleźć zastosowanie, takie jak chromatografia powinowactwa, procedury hybrydyzacji DNA itd., jak dobrze wiadomo w dziedzinie, aby wyizolować, zidentyfikować oraz scharakteryzować białko RAP-2 albo zidentyfikować i scharakteryzować dodatkowe białka, czynniki, receptory, itd., które są zdolne do wiązania białek RAP-2.

Jak podano wyżej, białko RAP-2 można zastosować do wytworzenia przeciwciał swoistych wobec białek RAP-2, np. RAP-2 i izoform. Przeciwciała te albo ich fragmenty podano szczegółowo poniżej, przy czym rozumieć należy, że w niniejszym zgłoszeniu przeciwciała i ich fragmenty są swoiste wobec białek RAP-2.

PL 199 214 B1

W oparciu o ujawnienia, że RAP-2 wiąże się swoiście z RIP i jako takie jest mediatorem/modulatorem RIP i może przez to pośredniczyć w/modulować aktywność RIP w szlakach zapalnych, śmierci komórkowej i przeżywalności komórkowej w sposobach takich, że RIP funkcjonuje niezależnie lub w połączeniu z innymi białkami (np. FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1 i TRADD w szlakach śmierci komórkowej, lub z TRAF2 w szlakach przeżywalności komórkowej), istotne jest opracowanie leków, które mogą, jak opisano, wzmagać lub hamować oddziaływanie RAP-2-RIP i w zależności od tego, który z tych szlaków jest wzmacniany/hamowany przez oddziaływanie RAP-2-RIP. Istnieje wiele chorób, w których leki takie stanowiły by wielką pomoc. Między innymi, ostre zapalenie wątroby, w którym ostre uszkodzenia wątroby wydają się odzwierciedlać śmierć komórek wątroby przebiegającą za pośrednictwem liganda FAS-R; autoimmunizacyjnie indukowana śmierć komórkowa, taka jak śmierć komórek B Langerhansa w trzustce, wynikiem czego jest powstanie cukrzycy; śmierć komórek przy odrzuceniu przeszczepu (np. nerki, serca i wątroby); śmierć oligodendrocytów w mózgu w stwardnieniu rozsianym; oraz hamowane przez AIDS samounicestwienie limfocytów T powodujące proliferację wirusów AIDS, a tym samym chorobę AIDS.

Możliwe jest, że RAP-2 albo jedna albo wiele izoform może służyć jako „naturalny” inhibitor RIP w jednym albo wielu szlakach i można je zastosować jako wspomniane swoiste inhibitory RIP. Podobnie, inne substancje takie jak peptydy, związki organiczne, przeciwciała, itp., mogą również służyć w procedurach przesiewowych w celu otrzymania swoistych leków, które są zdolne do hamowania oddziaływania RAP-2-RIP.

Nie ograniczający przykład tego, w jaki sposób inhibitory peptydowe oddziaływania RAP-2-RIP mogłyby być opracowywane i określone w badaniach przesiewowych jest oparty na poprzednich badaniach nad peptydowymi inhibitorami proteaz ICE lub proteaz podobnych do ICE, swoistością substratową ICE oraz strategiach analizy epitopu z zastosowalniem syntezy peptydów. Ujawniono, że minimalny wymóg skutecznego cięcia peptydu przez ICE jest oparty na czterech aminokwasach po lewej stronie miejsca cięcia, z mocnym uprzywilejowaniem kwasu asparaginowego w pozycji PI oraz z metyloaminą będącą wystarczająco po prawej stronie pozycji PI (Sleath i in., 1990; Howard i in., 1991; Thornberry i in., 1992). Ponadto, fluorogenny peptyd podłoża (tetrapeptyd), acetylo-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-methylo-kumarylo-7-amid) oznaczany w skrócie Ac-DEVD-AMC, odpowiada sekwencji w poli(ADP-rybozo)polimerazie (PARP), która ulega cięciu w komórkach wkrótce po stymulacji FAS-R, jak również w innych apoptopowych procesach (Kaufmann, 1989; Kaufmann i in., 1993; Lazebnik i in., 1994), i jest cięta skutecznie przez CPP32 (członka rodziny proteaz CED3/ICE) oraz proteazy MACH (podobnie, także przez proteazy GI - zobacz na przykład obecnie rozpatrywane nasze zgłoszenie patentowe IL 120367).

Ponieważ Asp w pozycji PI substratu wydaje się być istotna, tetrapeptydy posiadające Asp jako czwartą resztę aminokwasową w różnorodnych kombinacjach aminokwasów w pierwszych trzech pozycjach reszt mogą być szybko przesiewane pod kątem wiązania miejsca czynnego proteaz, z zastosowaniem na przykład, sposobu opracowanego przez Geysen'a (Geysen, 1985; Geysen i in., 1987), w którym duża liczba peptydów na podłożu stałym była przesiewana pod kątem oddziaływań z przeciwciałami. Wiązania proteaz MACH do swoistych peptydów można wykrywać różnymi, dobrze znanymi sposobami detekcji, znajdującymi się w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie, takimi jak znakowanie promieniotwórcze proteaz, i itd. Sposób Geysen'a wykazał zdolność testowania co najmniej 4000 peptydów, każdego dnia.

W podobny sposób dokładny region wiązania lub region homologiczny, który określa oddziaływania pomiędzy RAP-2 i RIP może być wyodrębniony, a następnie peptydy mogą być poddane badaniu przesiewowemu pod kątem blokowania takiego oddziaływania, np. peptydy syntetyzowane o sekwencji podobnej do sekwencji regionu wiążącego lub komplementarne do niej, które mogą współzawodniczyć z RAP-2 o wiązanie z RIP.

Leki lub inhibitory peptydowe, które są zdolne do hamowania aktywności zapalnej RAP-2 lub aktywności RAP-2 związanej ze śmiercią komórkową przez hamowanie oddziaływania RAP-2-RIP mogą zostać skoniugowane lub przekształcone w kompleksy z cząsteczkami ułatwiającymi wprowadzenie do komórki.

Amerykański opis patentowy 5,149,782 ujawnia koniugowanie cząsteczki, która ma być przetransportowana przez błonę komórkową z czynnikiem wprowadzającym do błony, takim jak polipeptyd fuzogenny, polipeptydy tworzące kanały jonowe, inne polipeptydy błonowe, oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. kwas mirystynowy, palmitynowy. Te wprowadzające do błony czynniki wprowadzają

PL 199 214 B1 koniugaty do dwuwarstwy lipidowej błon komórkowych, a tym samy ułatwiają ich wprowadzenie do cytoplazmy.

Low i in., amerykański opis patentowy 5,108,921, poddaje analizie dostępne metody dostarczania transbłonowego cząsteczek takich jak, ale nie ograniczając się do białek i kwasów nukleinowych przez zachodzącą z udziałem receptorów endocytozę. Takie układy receptorów obejmują te, które rozpoznają galaktozę, mannozę, fosforan 6 mannozy, transferrynę, asialoglikoproteinę, transkobalaminę (witaminę B12), α-2 makroglobuliny, insulinę i inne peptydowe czynniki wzrostu, takie jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Low i in. ujawniają, że receptory składników odżywczych, takie jak receptory biotyny i folanu mogą być z korzyścią stosowane w celu wzmagania transportu przez błonę komórkową, ze względu na umiejscowienie i mnogość receptorów biotyny i folanu na powierzchni błony większości komórek oraz na procesy transportu transbłonowego zachodzące z udziałem powiązanych receptorów. Zatem kompleks powstały pomiędzy związkiem, który ma być dostarczony do cytoplazmy, a ligandem, takim jak biotyna lub folan, jest doprowadzony do kontaktu z błoną komórkową niosącą receptory biotyny lub folanu w celu zapoczątkowania mechanizmu transportu transbłonowego zachodzącego z udziałem receptora i w ten sposób możliwe jest wejście pożądanego związku do komórki.

Ponadto z stanie techniki znane są fuzje pożądanych sekwencji peptydowych z liderowymi/sygnałowymi sekwencjami peptydowymi w celu wytworzenia peptydów chimerowych, które mogą być transportowane przez błonę komórkową do cytoplazmy.

Jak będzie to docenione przez specjalistów w dziedzinie, inhibitory peptydowe oddziaływania RAP-2-RIP mają na celu obejmowanie leków lub inhibitorów peptydomimetycznych, które mogą być w sposób szybki wyodrębnione w badaniu przesiewowym ze względu na wiązanie do proteazy RAP-2/RIP w celu opracowania bardziej trwałych inhibitorów.

Będzie również docenione, że te same sposoby ułatwiające lub wzmagające transport inhibitorów peptydowych przez błony komórkowe, jak opisano powyżej, będą również mogły znaleźć zastosowanie w odniesieniu do RAP-2 oraz jego izoform, jak również innych peptydów i białek, które wykazują wewnątrzkomórkowe działanie.

W odniesieniu do przeciwciał, jak wskazano niniejszym określenie „przeciwciało” ma w zamiarze obejmować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAb), przeciwciała chimerowe, przeciwciała antyidiotypowe (anty-Id) wobec przeciwciał, które mogą być znakowane w postaci rozpuszczalnej lub związanej, jak również ich fragmenty, które mogą być dostarczone dowolną znaną techniką, taką jak, ale nie ograniczając się do enzymatycznego cięcia, syntezy peptydów lub technik rekombinacji.

Przeciwciała poliklonalne stanowią heterogenną populację cząsteczek przeciwciał otrzymanych z surowicy zwierząt szczepionych antygenem. Przeciwciało monoklonalne zawiera zasadniczo jednorodną populację przeciwciał swoistych wobec antygenów, które to populacje zawierają zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopu. MAb mogą być otrzymywane sposobami znanymi specjaliście w dziedzinie. Zobacz na przykład Kohler i Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); amerykański opis patentowy 4,376,110; Ausubel i in., red., Harlow i Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); oraz Colligan i in., red., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), zawartość których jest włączona niniejszym w całości na drodze odniesienia. Takie przeciwciała mogą być dowolnej klasy immunoglobulinami łącznie z IgG, IgM, IgE, IgA, GILD oraz ich dowolnymi podklasami. Hybrydoma wytwarzająca mAb mogą być hodowane in vitro, in situ lub in vivo. Wytwarzanie wysokich mian mAb in vivo lub in situ jest obecnie korzystnym sposobem wytwarzania.

Chimerowe przeciwciała są cząsteczkami, których różne części pochodzą z różnych gatunków zwierzęcych, takie jak te które posiadają region zmienny otrzymany z mysich mAB oraz stały region ludzkiej immunoglobuliny. Chimerowe przeciwciała są głownie stosowane w celu obniżenia immunogenności podczas stosowania oraz w celu zwiększenia wydajności procesów wytwarzania, na przykład mysie mAb wykazują wyższe wydajności, gdy są wytwarzane przez hybrydoma, ale również wyższą immunogenność u ludzi, niż gdy chimerowe mAb człowiek/mysz są stosowane. Chimerowe przeciwciała oraz sposoby ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Cabilly i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne i in., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly i in., Europejskie zgłoszenie patentowe 125023 (opublikowane 14 listopada 1984); Neuberger i in., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi i in., Europejskie zgłoszenie patentowe 171496 (opublikowane 19 lutego 1985); Morrison i in., Europejskie zgłoszenie patentowe 173494

PL 199 214 B1 (opublikowane 5 marca 1986); Neuberger i in., zgłoszenie PCT WO 8601533, (opublikowane 13 marca 1986); Kudo i in., Europejskie zgłoszenie patentowe 184187 (opublikowane 11 czerwca 1986); Sahagan i in., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson i in., Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO8702671 (opublikowane 7 maja 1987); Liu i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better i in., Science 240: 1041-1043 (1988); oraz Harlow i Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, powyżej). Odnośniki te, są w swojej całości włączone niniejszym na drodze odniesienia.

Anty-idiotypowe przeciwciała (anty-Id) są przeciwciałami rozpoznającymi unikalne determinanty, które zazwyczaj są powiązane z miejscem wiążącym przeciwciała. Przeciwciała Id mogą być wytwarzane przez zaszczepienie zwierzęcia tego same gatunku i typu genetycznego (np. ten sam typ myszy), co źródłowy mAb, wobec którego anty-Id jest wytwarzane. Szczepione zwierzę rozpozna i odpowie na determinanty idiotypowe przeciwciał zastosowanych do szczepienia przez wytwarzanie przeciwciała skierowanego wobec tym idiotypowym determinantom (przeciwciało anty-Id). Zobacz, na przykład, amerykański opis patentowy 4,699,880, który jest niniejszym włączony w całości na drodze odniesienia.

Przeciwciało anty-Id może być również stosowane jako „immunogen” w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej u jeszcze innego zwierzęcia z wytworzeniem tak zwanego przeciwciała anty-anty-Id. Przeciwciało anty-anty-Id może być pod względem epitopu identyczne z oryginalnym mAB, które indukowało powstanie przeciwciała anty-Id. Zatem, przez stosowanie mAb wobec determinant idiotypowych, możliwe jest zidentyfikowanie klonów wyrażających przeciwciała o identycznej swoistości.

Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku RAP-2, jego analogom, fragmentom i pochodnym można zastosować do indukowania przeciwciał antyidiotypowych u odpowiednich zwierząt, np. myszy Balb/c. Komórki śledziony z takich szczepionych myszy są stosowane do wytwarzania hybrydoma anty-Id wytwarzających mAb anty-ID. Ponadto, mAb anty-Id mogą być sprzęgane z nośnikami takimi jak hemocyjanina KLH (KLH, ang. keyhole lipet hemocyanin) i stosowana do szczepienia dodatkowych myszy BALB/c. Surowice tych myszy będą zawierały przeciwciała anty-anty-Id, które wykazują właściwości wiążące oryginalnych mAb swoistych wobec epitopu powyższego białka RAP-2, lub jego analogów, fragmentów czy też pochodnych.

Anty-Id mAb mają zatem swoje własne idiotypowe epitopy, lub „idiotopy” strukturalnie podobne to epitopów będących przedmiotem rozważań, takich jak białko GRB.

Określenie „przeciwciała” obejmuje również zarówno całe cząsteczki, jak i ich fragmenty, takie jak, np. Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania antygenu. Fab i F(ab')2, które nie posiadają fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, szybciej ulegają usuwaniu z układu krążenia, i mogą wykazywać mniejsze niespecyficzne wiązanie do tkanek niż całe przeciwciało (Wahl i in., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Będzie to docenione, że Fab i F(ab')2 i inne fragmenty przeciwciał mogą być stosowane do wykrywania oraz ilościowego określania białka RAP-2 zgodnie z ujawnionymi niniejszym sposobami dla całych cząsteczek przeciwciał. Takie fragmenty są typowo wytwarzane przez cięcie proteolityczne, z zastosowaniem enzymów, takich jak papaina (do wytwarzania fragmentów Fab) albo pepsyna (do wytwarzania fragmentów F(ab')2).

Przeciwciałem „zdolnym do wiązania” cząsteczki jest przeciwciało, które jest zdolne do swoistego reagowania z cząsteczką, aby związać cząsteczkę z przeciwciałem. Określenie „epitop” oznacza część dowolnej cząsteczki zdolną do wiązania przez przeciwciało, które może być również rozpoznawane przez przeciwciało. Epitopy i „determinanty antygenowe” zwykle obejmują aktywne chemicznie ugrupowania powierzchniowe cząsteczek, takie jak łańcuchy boczne aminokwasów albo cukrów i wykazujące swoistą budowę trójwymiarową, jak również specyficzną charakterystykę ładunku.

„Antygen” jest cząsteczką lub częścią cząsteczki, która może być wiązana przez przeciwciało i która dodatkowo jest zdolna do indukowania w zwierzęciu wytwarzania przeciwciał zdolnych do wiązania epitopu tego antygenu. Antygen może mieć jeden lub więcej niż jeden epitop. Swoista reakcja wspomniana powyżej oznacza, że antygen będzie reagował w wysoce wybiórczy sposób z odpowiadającym przeciwciałem, a nie z wieloma innym przeciwciałami, które mogą być wywołane przez inne antygeny.

Przeciwciała, łącznie z fragmentami przeciwciał mogą być stosowane do ilościowej lub jakościowej detekcji obecności białka RAP-2 w próbce lub obecności komórek wyrażających białko RAP-2. Może to być dokonane technikami immunofluorescencji wykorzystującymi fluorescencyjnie znakowane

PL 199 214 B1 przeciwciało (patrz poniżej) w kombinacji z detekcją przy zastosowaniu mikroskopu świetlnego, cytometrii przepływowej lub detekcji fluorymetrycznej.

Przeciwciała (lub ich fragmenty) mogą być stosowane histologicznie, np. w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub immunoelektronowej do detekcji in situ białka RAP-2. Detekcja in situ może być osiągnięta przez usunięcie histologicznej próbki od pacjenta i dostarczenie wyznakowanego przeciwciała do takiej próbki. Przeciwciało (lub jego fragment) jest korzystnie dostarczone przez dodanie lub naniesienie znakowanego przeciwciała (lub fragmentu) na biologiczną próbkę. Przez zastosowanie takich procedur, możliwe jest określenie nie tylko obecności białka RAP-2, ale również jego rozkład w badanej tkance. Stosując takie rozwiązania, specjalista w dziedzinie od razu rozpozna, że dowolny sposób z szerokiego spektrum metod histologicznych (takich jak procedury wybarwienia) może być zmodyfikowany w celu osiągnięcia takiej detekcji in situ.

Takie testy na obecność białka RAP-2 zazwyczaj obejmują inkubowanie próbki biologicznej, takiej jak płyn ustrojowy, ekstrakt tkankowy, świeżo zebrane komórki, takie jak limfocyty lub leukocyty, albo komórki, które były inkubowane w hodowli tkankowej w obecności przeciwciała wyznakowanego w sposób umożliwiający jego detekcję, które jest zdolne do identyfikowania białka RAP-2, oraz wykrywania przeciwciał przez dowolną z licznych technik znanych w dziedzinie.

Próbka biologiczna może być traktowana podłożem stałym lub nośnikiem takim jak nitroceluloza lub innym podłożem lub nośnikiem stałym, który jest zdolny do unieruchomienia komórek, cząstek komórek lub rozpuszczalnych białek. Stałe podłoże lub nośnik może być następnie przemyte odpowiednimi buforami po czym następuje traktowanie przeciwciałem wyznakowanym w sposób umożliwiający jego detekcję jak opisano powyżej. Stałe podłoże lub nośnik może być następnie przemyty buforem po raz drugi w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Ilość związanego znacznika na podłożu stałym lub nośniku może być wówczas określona konwencjonalnymi sposobami.

Określenia „podłoże w fazie stałej”, „nośnik w fazie stałej”, „podłoże stałe”, „stały nośnik”, „podłoże”, lub „nośnik” są przeznaczone dla dowolnego podłoża lub nośnika, będącego w stanie związać antygen lub przeciwciała. Dobrze znane podłoża lub nośniki obejmują szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, amylazy nylonowe, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakryloamidy, gabro i magnetyt. Nośnik może być do pewnego stopnia rozpuszczalny lub nierozpuszczalny. Materiał podłoża może być zasadniczo o dowolnej możliwej przestrzennej konfiguracji, tak długo jak sprzężona cząsteczka jest zdolna do wiązania antygenu lub przeciwciała. Zatem konfiguracja podłoża lub nośnika może być sferyczna, tak jak w przypadku koralika, cylindryczna, tak ja w przypadku powierzchni wewnętrznej probówki albo zewnętrznej powierzchni drążka. Alternatywnie powierzchnia może być płaska, taka jak arkusz lub skrawek testowy, itd. Korzystne podłoża lub nośniki obejmują koraliki polistyrenowe. Specjaliści w dziedzinie będą znali inne odpowiednie nośniki do wiązania przeciwciał lub antygenów, lub będą mogli ustalić takie z zastosowaniem rutynowych eksperymentów.

Aktywność wiążąca danej partii przeciwciał, jak wskazano powyżej, może być określona dowolnymi dobrze znanymi sposobami. Specjalista w dziedzinie będzie zdolny do oceny obowiązujących i optymalnych warunków testowych dla każdorazowego określenia przez wykorzystanie rutynowych eksperymentów.

Inne etapy takie jak przemywanie, mieszanie, wstrząsanie, przesączanie i tym podobne mogą być dodane do procedury testów, jak będzie to odpowiednie i konieczne w szczególnej sytuacji.

Jeden ze sposobów, w których przeciwciało może być wyznakowane w sposób umożliwiający jego detekcję, jest przez połączenie go z enzymem i stosowanie w teście immunoenzymatycznym (EIA). W następstwie enzym ten, kiedy jest później wystawiony na działanie odpowiedniego substratu przereaguje z tym reagentem w taki sposób, że powstanie ugrupowanie cząsteczkowe, które może być wykryte, na przykład sposobami spektrofotometrycznymi, fluorometrycznymi lub wizualnymi. Enzymy, które mogą być stosowane do znakowania przeciwciał w sposób umożliwiający ich detekcję obejmują nieograniczająco dehydrogenazę jabłczanową, nukleazę stafilokokową, delta-5-izomerazy steroidowe, drożdżową dehydrogenazę alkoholową, dehydrogenazę alpha-glicerofosforanową, izomerazę triozofosforanową, peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, asparaginazę, oksydazę glukozową, beta-galaktozydazę, rybonukleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glukozo-6-foforanową, glukoamylazę i esterazę acetylocholinową. Detekcja może być prowadzana sposobami kolorymetryczymi, wykorzystującymi wytwarzający barwy substrat dla enzymu. Detekcje można również prowadzić przez wizualne porównanie zakresu enzymatycznej reakcji substratu w porównaniu z podobnie przygotowanymi standardami.

PL 199 214 B1

Detekcję można prowadzić dowolnym spośród innych testów immunologicznych. Na przykład, przez promieniotwórcze znakowanie przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, możliwe jest wykrywanie R-PTPazy z zastosowaniem testu radioimmunologicznego (RIA). Odpowiedni opis RIA można znaleźć w publikacji Work, T. S. i in., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY (1978), ze szczególnym uwzględnieniem rozdziału „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” autorstwa Chard, T., włączonej niniejszym na drodze odniesienia. Promieniotwórczy izotop może być wykrywany takimi metodami jak zastosowanie licznika g lub licznika scyntylacyjnego albo autoradiografia.

Możliwe jest również znakowanie przeciwciała związkiem fluorescencyjnym. Kiedy wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciało jest wystawione na działanie światła o odpowiedniej długości fali, jego obecność może być wtedy wykryta z powodu fluorescencji. Pośród najpowszechniej stosowanych związków fluorescencyjnych do znakowania należą izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina, o-ftaladehyd i fluorescamina.

Przeciwciało może również być znakowane w sposób umożliwiający jego detekcję z zastosowaniem metali emitujących fluorescencję, takich jak 152E, lub innych z serii lantanowców. Metale te mogą być dołączone do przeciwciała z zastosowaniem grup chelatujących metale takich jak kwas dietylenotriaminopentaoctowy (ETPA).

Przeciwciało może być również znakowane w sposób umożliwiający jego detekcję przez sprzęganie ze związkiem chemiluminiscencyjnym. Obecność przeciwciała znakowanego chemiluminiscencyjnie jest następnie określona przez wykrywanie luminescencji, która pojawia się podczas reakcji chemicznej. Przykładami szczególnie użytecznych związków chemiluminescenyjnych do znakowania są luminol, izoluminol, aromatyczny ester akrydyny, imidazol, sól akrydyny i ester oksolanowy.

Podobnie, związek bioluminescencyjny może być stosowany w celu znakowania przeciwciała. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji występującej w układach biologicznych, przy czym białko katalityczne zwiększa wydajność reakcji chemiluminescencyjnej. Obecność białka bioluminescencyjnego jest ustalana przez wykrywanie obecności luminescencji. Istotnymi związkami bioluminescencyjnymi dla celów znakowania są lucyferyna, lucyferaza i ekworyna.

Cząsteczka przeciwciała może być przystosowana do wykorzystywania w testach immunometrycznych, znanych również jako testy „dwu stronne” lub „kanapkowe”. W typowym teście immunometrycznym, ilość niewyznakowanych przeciwciał (lub fragmentów przeciwciał) jest związana ze stałym podłożem lub nośnikiem i ilość rozpuszczalnego przeciwciała, znakowanego w sposób umożliwiający jego detekcję, jest dodawana w celu umożliwienia wykrywania i/lub oceny ilościowej trzeciorzędowych kompleksów utworzonych pomiędzy przeciwciałem w fazie stałej, antygenem oraz znakowanym przeciwciałem.

Zazwyczaj i korzystnie testy immunometryczne obejmują testy „w przód”, w których przeciwciało związane z fazą stałą jest najpierw doprowadzone do kontaktu z testowaną próbką, w celu wyodrębnienia antygenu z próbki przez utworzenie kompleksów drugorzędowych pomiędzy przeciwciałem w fazie stałej a antygenem. Po odpowiednim okresie inkubacji, stałe podłoże lub nośnik jest przemywane w celu usunięcia reszt płynnej próbki, łącznie z nieprzereagowanym antygenem, jeżeli takowy się tam znajduje, a następnie doprowadzone do kontaktu z roztworem zawierającym nieznaną ilość znakowanego przeciwciała (działającego tutaj na zasadzie „cząsteczki reporterowej”). Po okresie drugiej inkubacji umożliwiającym wyznakowanym przeciwciałom na skompleksowanie antygenu związanego przez nieoznaczone przeciwciało ze stałym podłożem lub nośnikiem, stałe podłoże lub nośnik jest przemywane po raz drugi w celu usunięcia nieprzereagowanego znakowanego przeciwciała.

Innymi rodzajami testu „kanapkowego”, który również może być użyteczny z antygenami, są tak zwane testy „symultaniczne” i „odwrotne”. W teście symultanicznym jeden pojedynczy etap inkubowania ma miejsce, w którym przeciwciało związane ze stałym nośnikiem lub podłożem oraz znakowane przeciwciało są obydwa dodane do testowanej próbki równocześnie. Po zakończeniu inkubacji stały nośnik lub podłoże jest przemywane w celu usunięcia resztek próbki płynu oraz nieskompleksowanych znakowanych przeciwciał. Obecność znakowanego przeciwciała związanego ze stałym podłożem lub nośnikiem, jest następnie wykrywana jak w konwencjonalnym teście kanapkowym „w przód”.

W teście „odwrotnym”, dodawanie krok po kroku pierwszego roztworu znakowanego przeciwciała do próbki płynu poprzedza stosowane po okresie inkubacji dodawanie nieznakowanego przeciwciała związanego ze stałym podłożem lub nośnikiem. Po okresie drugiej inkubacji, podłoże stałe jest przemywane w sposób konwencjonalny w celu uwolnienia go od pozostałości testowanej próbki oraz roztworu nieprzereagowanego znakowanego przeciwciała. Detekcja znakowanego przeciwciała związanego

PL 199 214 B1 z podłożem lub nośnikiem stałym jest następnie prowadzona tak jak w przypadku testów „w przód” i „symultanicznych”.

Białka RAP-2 można wytworzyć dowolną standardową metodą rekombinacji DNA (patrz, Sambrook i in., 1989; Ausubel i in., 1987-1995) w których przydatne, dobrze znane w dziedzinie, komórki eukariotyczne albo prokariotyczne można transformować odpowiednimi wektorami zawierającymi sekwencje kodujące białko. Zatem niniejszym opisane zostały takie wektory ekspresyjne i transformowane komórki gospodarzy do wytwarzania białek. Jak wskazano powyżej, białka te obejmują również ich biologicznie aktywne analogi, fragmenty i pochodne, zatem wektory je kodujące również obejmują wektory kodujące analogi i fragmenty tych białek, oraz transformowani gospodarze obejmują także gospodarzy wytwarzających analogi i fragmenty. Pochodne tych białek wytwarzane przez transformowanych gospodarzy są pochodnymi wytworzonymi przez standardowe modyfikacje białek lub ich analogów lub fragmentów.

W zgłoszeniu przedstawiono również kompozycje farmaceutyczne obejmujące wektor będący rekombinowanym wirusem zwierzęcym, kodującym białko RAP-2, który to wektor koduje również białko powierzchniowe wirusa zdolne do wiązania się z komórką docelową (np. komórką nowotworową) w celu ukierunkowania wprowadzania sekwencji białka RAP-2 do komórki. Dalej, kompozycje farmaceutyczne obejmują składnik czynny (a) sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną sekwencji białka RAP-2, albo (b) lek, który blokuje oddziaływanie RAP-2-RIP.

Kompozycje farmaceutyczne obejmują odpowiednią ilość składnika czynnego w celu osiągnięcia zamierzonego celu. Oprócz tego, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, obejmujący zaróbkę i substancje pomocnicze, które są dobrze znane specjaliście w dziedzinie, a które ułatwiają obróbkę składnika czynnego w preparaty, które mogą być stosowane farmaceutycznie oraz które mogą stabilizować takie preparaty dla celów podawania ich osobnikowi temu potrzebującemu.

Podejrzewa się, że białko RAP-2 i jego izoformy lub izotypy są wyrażane w różnych tkankach na znacząco różnych poziomach i oczywiście z różnymi wzorami izotypów w sposób analogiczny do ekspresji różnych białek powiązanych ze szlakami sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, jak wskazano w wyżej wymienionych zgłoszeniach patentowych należących do Zgłaszającego. Te różnice mogą prawdopodobnie mieć wkład do cech swoistych tkankowo w odpowiedzi na ligand Fas/APO1 i TNF. Jak miało to miejsce w przypadku innych CED3/ICE homologów (Wang i in., 1994; Alnemri i in., 1995), twórcy wykazali wcześniej (w wyżej wskazanych zgłoszeniach patentowych), że izoformy MACH zawierające niekompletne regiony CED3/ICE (np., MACHa3) mają wpływ hamujący na aktywność równocześnie wyrażanych cząsteczek MACHa1 lub MACHa2; ujawniono również, że blokują one indukcje śmierci przez Fas/APO1 i p55-R. Wyrażanie takich hamujących izoform w komórce może stanowić mechanizm samoobronny wobec cytotoksyczności zachodzącej przez Fas/APO1 i TNF. Podejrzewa się również podobne działanie hamujące dla izoform G1 (G1 jest niedawno wyizolowanym nowym białkiem wiążącym Mch4 i możliwie MACH, a także białkiem wiążącym MORT-1, które wykazuje moduł MORT i domenę proteazy, zobacz będący własnością Zgłaszającego IL 120367). Duża heterogeniczność izoform MACH, i podobnie podejrzewanej analogicznej heterogeniczności izoform G1, która w dużym stopniu przekracza te obserwowane dla dowolnej z proteaz z rodziny CED3/ICE, powinna pozwolić na szczególnie dostrajanie aktywnych izoform MACH, oraz analogicznie aktywnych izoform G1. Zatem jak wskazano powyżej, białka RAP-2 lub możliwe izoformy wykazują różne działania w różnych tkankach w odniesieniu do ich oddziaływania z RIP i przez to mają wpływ na równowagę pomiędzy szlakami aktywacji śmierci komórkowej lub przeżywalności komórkowej jak opisano powyżej.

Niewykluczone jest również to, że możliwe izoformy RAP-2 mają inne funkcje. Na przykład, RAP-2 lub niektóre izoformy RAP-2 mogą również działać jako miejsca dokujące dla cząsteczek, które biorą udział w innych nie cytotoksycznych działaniach receptorów Fas/APO1 i TNF przez oddziaływanie RIP lub nawet niezależnie od RIP.

Z powodu unikalnej zdolności receptorów Fas/APO1 i TNF do wywoływania zapalenia, śmierci komórkowej, jak również unikalnej zdolności receptorów TNF do wywoływania innych wywołujących uszkodzenia tkanki czynności, anormalność w funkcjonowaniu tych receptorów mogłoby być szczególnie szkodliwe dla organizmu. Właściwie, wykazano, że zarówno nadmierne jak i niedoborowe działanie tych receptorów przyczynia się do patologicznych objawów różnych chorób (Vassalli, 1992; Nagata i Golstein, 1995). Identyfikacja cząsteczek biorących udział w aktywności sygnalizacyjnej receptorów oraz znajdowanie sposobów modulowania aktywności takich cząsteczek, może kierować nowymi podejściami leczenia. Inne aspekty wynalazku staną się jasne w odniesieniu do następujących przykładów.

PL 199 214 B1

Wynalazek zostanie opisany szczegółowo w poniższych nie ograniczających przykładach oraz dołączonych rysunkach.

Należy również zaznaczyć, że:

i) dwu-hybrydowy test przesiewowy i dwu-hybrydowy test ekspresji β-galaktozydazy; (ii) indukowana ekspresja, znakowanie metaboliczne i immunoprecypitacja białka; (iii) wiązanie in vitro; (iv) ocena cytotoksyczności; i (v) analizy Northern i sekwencji (patrz, Boldin i in., 1995b) 2, 3 (patrz, Boldin i in., 1996) i 4, niżej, w odniesieniu do MORT-1 i białka wiążącego MORT-1 (np. MACH), jak również niedawno wyizolowane białko G1 (IL 120367) są również możliwe do zastosowania (z niewielkimi modyfikacjami) do odpowiednio izolowania, klonowania i charakteryzacji RAP-2 i ewentualnych izoform. Procedury te stanowią więc w pełni ujawnienie tych samych procedur zastosowanych do izolowania, klonowania i charakteryzacji RAP-2, jak to szczegółowo opisano np. w tych samych albo współposiadanych, równolegle rozpatrywanych izraelskich zgłoszeniach patentowych 114,615, 114,986, 115,319, 116,588, 117,932 i 120,367, jak również odpowiadającemu im zgłoszeniu PCT/US96/10521. Dalej, w odniesieniu do białka NIK i jego roli w aktywacji NF-kB, przeżywanie komórki oraz rola odgrywana przez TRAF2 w szlaku przeżywania komórki, przykładowo oddziaływanie pomiędzy TRAF2 i RIP i innymi białkami, zostały szczegółowo opisane w równolegle rozpatrywanym, współposiadanym zgłoszeniu dokonanym przez niniejszych twórców, IL 117800, IL 119133 i Malinin i in., 1997.

P r z y k ł a d 1.

Klonowanie i izolacja białka RAP-2, które wiąże się do białka RIP, badanie przesiewowe w układzie dwu-hybrydowym, sekwencjonowanie i analiza wstępna

Stosując badanie przesiewowe w układzie dwu-hybrydowym z RIP jako przynętę (patrz np. Fields i Song, 1989, WO/96/18641) w bibliotece komórek B, wyizolowano klon o długości około 1,5 kpz. Ten klon 1,5 kpz (patrz strzałka na Fig. 1 i 2) zastosowano do badania przesiewowego fagowej biblioteki cDNA, uzyskując klon ok. 2 kpz, którego sekwencję przedstawiono na Fig. 1.

Wykorzystując dobór porównawczy EST do sekwencji klonu 1,5 kpz, uzyskano fragment EST zawierający 3' koniec klonu #41072 konsorcjum I.M.A.G.E. (Research Genetics Institute). Z tego klonu, pochodzącego z biblioteki mózgu płodu, opublikowano jedynie dwa małe fragmenty sekwencji na jej końcach 3' i 5'. Po uzyskaniu klonu, został on poddany sekwencjonowaniu i okazało się, że nawet te opublikowane fragmenty sekwencji zawierały błędy. Sekwencjonowany klon (Fig. 2) okazał się być identyczny z klonem z Fig. 1 w swoim regionie kodującym, wykazując jednak różnice w niekodującym regionie 5'. Przypuszczalnie zatem, obydwa cDNA są postaciami tego samego genu ulegającego alternatywnemu składaniu (splicingowi).

Analiza sekwencji wykazała, że podobnie do białka RAP, białko RAP-2 przypuszczalnie nie posiada „domeny śmierci”, nie posiada Modułu MORT (ang. MORT MODULE), nie posiada domeny proteazy podobnej do rodziny ICE, nie posiada domeny kinazy, nie posiada domen TRAF (patrz wymienione, jednoczesne zgłoszenia patentowe tych samych zgłaszających i różne odsyłacze, szczególnie Malinin i in., 1997 w odniesieniu do wszystkich rozlicznych domen obecnych w ścieżkach przekazywania sygnału wewnątrzkomórkowego). Żaden z rozważanych motywów nie jest obecny w przedmitowej sekwencji, poza trzema suwakami leucynowymi (LZ, ang. leucine zipper) - bloki „podobne” rozmieszczone są równomiernie wzdłuż regionu kodującego białko. Napisano „podobne”, ponieważ dwa z nich zawierają substytucje Leu na Val, Met lub Ile. Pomimo, że uznaje się je za konserwatywne, nie jest jasne czy takie zmiany w domenie suwaka leucynowego pozwalają białku zachować jego aktywność funkcjonalną tj. wiązanie do innych LZ. Badania wiązania dowodzą, że RAP-2 zasadniczo wiąże się do RIP, RAP-2 nie będąc zdolnym do wiązania się do TRADD, MORT-1, p55-R i MACH (w dotychczasowych badaniach). Wyniki potwierdzają fakt, że RAP-2 jest przypuszczalnie pozbawiony „domen śmierci” i modułów MORT.

Dlatego, wydaje się, że RAP-2 jest białkiem specyficznie wiążącym się z RIP, które oddziaływuje/wiąże się z RIP w bardzo specyficzny sposób. Zatem RAP-2 wydaje się być specyficznym modulatorem/mediatorem wewnątrzkomórkowej aktywności RIP spełniającym ważną rolę w modulowaniu/przenoszeniu przez RIP sygnału w ścieżkach zapalenia i śmierci komórkowej/przetrwania komórki.

W skrócie, klon RAP-2 uzyskano w dwu-hybrydowym badaniu przesiewowym biblioteki cDNA ludzkich komórek B stosując pełnej długości białko RIP jako „przynętę”. Sekwencja RIP była znana z wcześniejszych publikacji (np. Stanger i in. 1995) i ujawnionej w bazie danych GenBank pod numerem dostępu Nr U 25994 będącej ludzką sekwencją RIP (ujawniona została także mysia sekwencja RIP pod numerem dostępu Nr U 25995). Stosując te dane sekwencyjne zaprojektowano za pomocą oprogramowania OLIGO4™ odpowiednie primery do PCR i uzyskano region kodujący RIP stosując

PL 199 214 B1 w PCR jako matrycę cDNA pochodzące z zupełnej biblioteki RNA ludzkich komórek fibroblastów (stosując standardowe procedury). Ten region kodujący RIP wklonowano następnie do wektora pGBT-9 (Clontech) i zastosowano jako przynętę, jak opisano powyżej, w dwu-hybrydowej procedurze przesiewowej. W tym dwu-hybrydowym badaniu przesiewowym uzyskano klon kodujący białko wiążące RIP, które oddziaływuje z RIP.

Klon ten, jak wspomniano powyżej, zastosowano do przeszukania fagowej biblioteki cDNA i bazy danych EST. Można zauważyć na Fig. 1 i 2, że sekwencje kodujące dwóch klonów są identyczne, natomiast niekodujące regiony 5' różne. Zatem przypuszczalnie mamy tu do czynienia z postaciami alternatywnego splicingu. Klony mają około 2,0 kpz zawierając ORF (otwartą ramkę odczytu) o długości około 1,5 kpz, co odpowiada szacunkowej masie cząsteczkowej białka około 50 kD. Odczytana sekwencja aminokwasowa RAP-2 została przedstawiona na Figurze 3.

Analiza powyższych sekwencji klonu RAP-2 i sekwencji typu „dbest” z baz danych, Human Genome Database poziom 1 i GenBank dowodzą, że sekwencja RAP-2 jest sekwencją nową (unikalną), gdyż żadna ze znanych sekwencji nie wykazuje znaczącej homologii do tej sekwencji RAP-2. Po złożeniu zgłoszenia IL 123758, z którego pierwszeństwa korzysta niniejsze zgłoszenie, Yamaoka S. i in. (1998) opisują mysie cDNA kodujące 48 kD białko, które oznaczono NEMO (dla NF-kB Istotnego Modulatora).

Dodatkowe przeszukiwania baz danych (in silico) pozwoliły zidentyfikować FIP-2 - białko o nieznanej funkcji sklonowane przez Li Y. i in. (1998, patrz wyżej).

Z globalnego porównania sekwencji RAP-2 i FIP-2 (Figura 3B) można wywnioskować, że stopień całkowitego podobieństwa jest dosyć niski (nie jest zatem zaskoczeniem, że sekwencja nie została zidentyfikowana za pomocą przeszukiwań opartych na globalnych algorytmach). Homologia pomiędzy RAP-2 i FIP-2 wzrasta na C-końcu białek, osiągając punkt kulminacyjny na 30 aminokwasach przewidywanego C-końca. Warto zauważyć, że przypuszczalny motyw LZ w FIP-2 jest w znacznym stopniu powtórzony w RAP-2 (za wyjątkiem substytucji Ile/Ala).

Ponadto, zidentyfikowano także krótszy cDNA RAP-2 o długości około 0,5 kpz (ID: 1469996) nazwany później jako Human shrt. Wariant ten posiada „bloki sekwencji kodującej pochodzące z kilku odległych regionów „pełnego (full) 1,5 kpz cDNA, prawdopodobnie wywodzący się z alternatywnego splicingu tego samego genu.

Analiza hybrydyzacyjna Northern korzystająca z wielokrotnych tkankowych blotów Northern (Clontech) z fragmentem Bglll o dł. 0,9 kpz pochodzącym z RAP-2 cDNA, zaprezentowała kompleksową mozaikę RAP-2 mRNA. Przynajmniej 5 różnych mRNA, od długości <1 kpz do >7 kpz, zostało wykryte z mniejszą lub większą powszechnością w 2,5 kpz i 6 kpz wariantach (Figura 4A).

P r z y k ł a d 2.

Identyfikacja mysiego RAP-2

Podobne badania mysiej kolekcji EST posiadanej przez TIGR ujawniły częściowy cDNA o długości 1,6 kpz (Mouse part. ID: 761011. Figura 3) prawdopodobnie odpowiadający mysiemu RAP-2, ponieważ przewiduje się jego 95% identyczność z ludzkim odpowiednikiem w obrębie regionu kodującego (patrz Figura 3).

Niemniej jednak różnice pomiędzy ludzkimi i mysimi sekwencjami RAP-2 i NEMO przekraczają oczekiwane, powszechnie występujące różnice międzygatunkowe. Przykładami godnymi uwagi jest brakujący blok 7 aminokwasów (pozycja 249 w 20.4) w mysim RAP-2 i sekwencji NEMO i insercja 3 aminokwasów (KLE w pozycji 111) w otwartej ramce odczytu NEMO w porównaniu z pełnej długości ludzkim wariantem i częściową ludzką sekwencją (Figura 3). Mogą one jednak wywoływać zmiany w aktywności białka. Właściwości funkcjonalne opisane dla NEMO, zdają się być przeciwne stwierdzonym dla RAP-2, jednak analiza frakcyjna uzyskana dla NEMO potwierdza, że jest ono zlokalizowane w sygnałosomach.

P r z y k ł a d 3.

Wiązanie RIP do RAP-2 w komórkach ssaczych

Dalsze dowody fizjologicznych efektów oddziaływań RAP-2-RIP uzyskano w transfekowanych komórkach HEK-393T i HeLa. Te dwa białka mogą łatwo koprecypitować z lizatów komórkowych z komórek HEK-293 (ATCC Nr CRL 1573) transfekowanych jak opisano powyżej każdego prążka na figurze 4B i ulegać immunoprecypitacji z przeciwciałami monoklonalnymi anty-FLAG mAb (Kodak). Immunokompleksy analizowano następnie pod względem obecności HIS-RAP-2 za pomocą tradycyjnej procedury Western blot z anty-His6 mAb (Sigma) (Figura 4B i dane nie pokazane). Jednakże, tworzenie się takich kompleksów nie wynika z aktywności enzymatycznej RIP: co można potwierdzić

PL 199 214 B1 w teście kinazowym in vitro z immunokompleksami, nadekspresjonowane RIP nie fosforyluje RAP-2 (nie pokazano).

Test wiązania prowadzono w celu stwierdzenia czy RAP-2 wiąże się do jakiegoś innego znanego wewnątrzkomórkowego białka sygnałowego. W teście tym przebadano białka TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH pod względem zdolności do wiązania się z RAP-2. Stwierdzono jednak, że RAP-2 nie jest zdolny do wiązania się z żadnym z tych białek. RAP-2 także nie jest zdolny do wiązania się żadnym z białek kontrolnych np. lamina, cyklina D.

Wszystkie z powyższych wyników wskazują, że nowe białko RAP-2 prawdopodobnie oddziaływuje z RIP w bardzo specyficzny sposób i jako takie stanowi specyficzny modulator/przenośnik RIP.

P r z y k ł a d 4.

RAP-2 oddziaływuje z NIK i moduluje transkrypcję zależną od NF-kB i c-Jun.

Pomimo, że nie wykryto oddziaływań RAP-2-NIK w teście dwu-hybrydowym w drożdżach (patrz wyżej) eksperymenty transfekcyjne z komórkami ssaczymi HEK-293T wskazują na tworzenie takich stabilnych kompleksów. Oddziaływania NIK-RAP-2 wykryto jak opisano w przykładzie 3 za wyjątkiem tego, że zamiast przeciwciał anty-His6 zastosowano do immunoprecypitacji w teście Western przeciwciała anty-FLAG (Figura 4C). Takie różnice pomiędzy wiązaniem się w komórkach drożdżowych i ssaczych nie są zaskoczeniem, ponieważ pełnej długości NIK zwykle traci swoje wiążące właściwości podczas ekspresji w drożdżach.

W związku z tym, że in vivo zarówno RIP jak i NIK są uznane jako niezbędne mediatory w aktywacji NF-kB indukowanej przez TNF, przebadaliśmy czy nadekspresja RAP-2 w hodowlach komórkowych jest zdolna do wpływania na tą ścieżkę sygnałową. Początkowe eksperymenty zostały przeprowadzone w komórkach HEK-293T transfekowanych plazmidami reporterowymi zawierającymi gen lucyferazy pod kontrolą minimalnego promotora HIV-LTR. W podobny sposób, RAP-2 był uznany początkowo za ulegający wyciszaniu, najczęściej do poziomu podstawowego, aktywacja genu reporterowego była wywoływana zarówno przez nadekspresję różnych znanych induktorów NF-kB zaangażowanych w ścieżkę sygnałową TNF (NIK, TRAF2, RIP itp.) jak i traktowanie komórek przez zewnętrzne stymulatory (TNF i PMA, Figura 5A). Komórki HEK-293T były przejściowo transfekowane plazmidem reporterowym (HIVLTR-Luc lub CMV-Luc dla NF-kB (5A) i GAL4-Luc dla c-Jun (5B) testów aktywacyjnych), i oraz wektorem ekspresyjnym dla wskazanego induktora oraz albo pustym nośnikiem (pcDNA3) lub plazmidem kodującym pełnej długości RAP-2 (pcRAP-2). Warto zauważyć, że fakt iż RAP-2 jest zdolny do wywierania swojego wpływu oraz wyciszania ścieżki sygnałowej i RelA, sugeruje, że część działania tego białka może być wspólna dla różnych, i często rozbieżnych ścieżek sygnałowych (patrz powyżej).

Jednocześnie, nie dochodziło do transkrypcji lucyferazy niezależnej od kB (wywoływanej przez wczesny promotor CMV) (Figura 5A), z czego wnioskujemy, że można wykluczyć prawdopodobne ogólne zaburzanie podstawowej maszynerii transkrypcyjnej/translacyjnej przez RAP-2. Wyniki te zostały następnie w pełni potwierdzone w komórkach HeLa (nie pokazano).

Jednakże, dalsze testy miareczkowania dowodzą, że zjawisko to jest dużo bardziej złożone. Mianowicie, podczas przejściowej ekspresji TRAF2 w komórkach HEK-293T wraz z różnymi ilościami pcRAP-2 wskazanymi na Figurze 6, RAP-2 drastycznie zmieniał swoje zachowanie w niskich stężeniach (około 20 ng/10⁶ komórek), wzmacniając indukowaną TRAF2 NF-kB transkrypcję (patrz Figura 6A). Ponadto, zastępując oryginalny insert insertem o odwrotnej orientacji, przygotowując nośnik efektywnie wyrażający RAP-2 antysens i przejściowo ekspresjonując TRAF2 w komórkach HEK-293T wraz z różnymi ilościami konstruktów pcRAP-2-a/s (antysensownych), analizowano efekt postępującego wyciszania RAP-2, uzyskując diagram zależności od stężenia. Ogólny trend wykresu wskazuje, że odpowiedź komórkowa jest odwrotnie skorelowana z ilością transfekowanego RAP-2 DNA, z wyjątkiem charakterystycznego regionu wokół punktu „zero” odpowiadającego nominalnemu, endogennemu poziomowi białka (Figura 6). Należy zauważyć, że wyciszanie ekspresji danego genu przez wprowadzanie antysensu jest przypuszczalnie bardziej wyrafinowanym testem, niż nadekspresja sekwencji kodującej. Antysens nie jest zaangażowany w sztuczną produkcję żadnego obcego białka w komórce, i dlatego, jasno określa wiarygodność właściwości ihibitorowej RAP-2. Niemniej jednak, należy zauważyć, że powyżej wspomniany skok przy niskim stężeniu jest odbiciem, nie odwróceniem, antysensownej połowy wykresu (Figura 6).

Aby oszacować różnorodność systemów transkrypcyjnych w których może być angażowane RAP-2, przeszliśmy do badań c-Jun, jądrowego czynnika którego rola w ustalaniu i zachowywaniu odpowiadającej stresowi odpowiedzi została uznana jako kluczowa podobnie jak w przypadku NF-kB.

PL 199 214 B1

Stosując składniki komercyjnie oferowanego przez Stratagene zestawu „Path Detect” potwierdziliśmy podobne dwu-fazowe zachowanie RAP-2 wobec kilku znanych aktywatorów AP-1 w komórkach HEK-293T i HeLa (patrz Figury 5B i 6B).

P r z y k ł a d 5.

RAP-2 wzmacnia hiper-fosforylację c-Jun, bez zmieniania aktywności JNK

Aby zbadać mechanizm zgodny z tak głębokim wpływem na transkrypcję, istotne było określenie dokładnego poziomu na którym normalnie następuje powstawanie sygnału. Potwierdzono, że transaktywacyjny potencjał c-Jun jest regulowany przez indukowaną przez sygnał zewnątrzkomórkowy fosforylację dwóch reszt seryny (⁶³Ser i ⁷³Ser) z jego N-końcowej domeny aktywacyjnej. Kinazy białkowe JNK/SAPK, które odpowiadają za powyżej wspomnianą fosforylację stanowią podzbiór szeroko rozpowszechnionej rodziny kinaz MAP i są wzajemnie aktywowane przez fosforylację na ¹⁸³Thr i ¹⁸⁵Tyr przenoszoną dodatkowo przez poprzedzające jej kinazy o podwójnej specyficzności. Dlatego też, stan fosforylacji odpowiednich miejsc w obrębie c-Jun i JNK może być stosowany jako marker odzwierciedlający stan aktywacji białka. Analiza Western blot lizatów przejściowo transfekowanych komórek HEK-293T dowiodła, że pomimo osłabienia przenoszonej przez c-Jun transkrypcji, RAP-2 znaczącą wzmacnia fosforylację endogennego c-Jun na ⁶³Ser indukowaną przez liczne stymulatory (patrz Figura 7A). Całkowite lizaty komórkowe komórek HEK-293T transfekowanych wskazanymi konstruktami ekspresyjnymi wraz z nośnikiem pcDNA3 oznaczonym na figurze 7 jako minus (-) lub pcRAP-2 oznaczonych na tej samej figurze znakiem plus (+), były rozwijane na SDS-PAGE, przenoszone na membranę ECL i poddawane sondowaniu przeciwciałami anty-fosfo-⁶³Ser-c-Jun Abs (NEB). Membrana pokazana na dolnej części figury 7A była poddawana ponownemu sondowaniu przeciwciałami anty-total-c-Jun Abs jako kontrola (NEB).

Jednakże, całkowita ilość c-Jun, pozostawała niezmieniona wykluczając wpływ poziomów c-Jun jako możliwe źródło modyfikacji. Przeciwciała specyficzne wobec fosforylowanych postaci JNK1/2 nie wykrywały znaczącego wzrostu ilości tych aktywowanych kinaz w odpowiedzi na RAP-2, co sugeruje, że dodatkowa fosforylacja c-Jun nie wpływa na zależny od RAP-2 wzrost aktywności JNK (Figura 7B). Aktywowane JNK1/2 z komórek HEK-293T transfekowanych albo pcDNA3 albo pcRAP-2, traktowanych hrTNFa w celu przedłużenia czasu trwania były wykrywane techniką Western blotting w całkowitych lizatach z użyciem przeciwciał fosfo-(¹⁸³Thr/¹⁸⁵Tyr)-JNK Abs (NEB) co pokazano na Figurze 7.

Na poparcie drugiej części tezy, test kinazowy in vitro z immunoprecypitowanym JNK1 i oczyszczonym GST-c-Jun jako substratami dał zasadniczo taki sam wynik (Figura 7C). Komórki HEK293T, transfekowano równocześnie pustym wektorem pcRAP-2 i pcRIP w różnych kombinacjach z plazmidem wyrażającym HA-JNK1. JNK1 był następnie immunoprecypitowany przez N-końcowy znacznik HA i jego zdolność do fosforylacji wytworzonego przez bakterie, oczyszczonego GST-Jun określono przez wbudowanie ³²P w teście kinazowym in vitro. Produkty reakcji analizowano przy pomocy SDS-PAGE jak przedstawiono na Fig. 7.

RAP-2 jest fosforylowany, gdy kompleks Rap-2-IKKI, ulegający immunoprecypitacji z transfekowanych komórek HEK293, jest inkubowany w warunkach fosforylacji in vitro. Poszukiwania funkcji fosforylacji RAP-2 pozwoliły stwierdzić, że mutacja jednej seryny w tym białku (w pozycji 148) w pełni znosi aktywację przez to białko fosforylacji Jun. Jak to przedstawiono na Fig. 13, nadekspresja RAP2 (S148A) nie wpływa na fosforylację Jun. Jednak wpływ RAP-2 na NF-kB nie był zmieniany przez tą mutację. Odkrycie to sugeruje, że fosforylacja seryny 148 w RAP-2 jest specyficznie zaangażowana w jego wpływ na fosforylację Jun.

P r z y k ł a d 6.

RAP-2 nie hamuje wiązania się c-Jun i RelA do DNA

W świetle wyników eksperymentów opisanych w przykładzie 5, które nie pozwoliły poznać cytozolowego celu modulacji nadekspresji RAP-2 w kaskadach sygnałowych NF-kB i AP-I, zbadaliśmy całość procesów jądrowych wymaganych do transkrypcji. Testy przesunięć ruchliwości w polu elektrycznym (EMSA) prowadzony z ekstraktem jądrowym transfekowanych komórek HEK-293T zdecydowanie pokazały, że RAP-2 nie wpływa na wiązanie się c-Jun i RelA do oligonukleotydów odpowiadających sekwencjom tradycyjnie przez nie rozpoznawanym (Figura 8). Zaobserwowano kilkukrotne wzmocnienie wydajności tworzenia się kompleksu DNA/AP-1 w komórkach transfekowanych RAP-2. Ponadto, nie zaobserwowano oddziaływań pomiędzy RAP-2 i c-Jun/RelA, co może powodować przeszkodę steryczną w późniejszej aktywacji domen. Przypuszczalnie wchodzenie RAP-2 do jądra wpływa na pewien punkt następujący po nastąpieniu wzmocnienia wiązania.

PL 199 214 B1

P r z y k ł a d 7.

RAP-2 oddziaływuje in vivo z histonową acetylotransferazą TIP60.

TIP60 (GenBank U 74667) należy do ostatnio opisanej rodziny białek jądrowych zwanych histonowymi acetylotransferazami (HAT). Aktywność enzymatyczna tych białek jest związana ze stanem struktury chromatyny w kompleksach jądrowych. Białka HAT są często kojarzone z pewnymi elementami aparatury transkrypcyjnej i są zdolne do modulowania stopnia transkrypcji. HAT wywołują rozluźnienie upakowania chromatyny w sąsiedztwie miejsca inicjacji poprzez przenoszenie grup acylowych na specyficzne reszty lizyny w histonach, promując przez to dostęp różnych czynników do DNA. Prawdopodobnie jedno z tych pomocniczych białek jądrowych, pozwala komunikować się czynnikom wiążącym się z enhancerami i RNA polimerazą II. Dlatego też zbadaliśmy czy TIP60 może tworzyć kompleksy z RAP-2. Immunoprecypitacja z komórek HeLa poprzedzająca testy dwu-hybrydowe wykazała, że RAP-2 silnie oddziaływuje z TIP60 w obydwu układach. Pomimo tego, nie stwierdziliśmy dostrzegalnej zmiany przenoszonego przez RAP-2 wpływu na NF-kB i c-Jun poprzez wspólną ekspresję TIP60 w komórkach HEK-293T (nie pokazano). Taki sam brak zmian był obserwowany w eksperymencie kontrolnym, tj. stymulacji ± TIP60 (z/bez RAP-2), prowadząc do wniosku, że krótki czas odczytu (20-30 godzin po transfekcji), prawdopodobnie wyklucza szansę chromatynizacji reporterowego DNA, nie pozostawiając dostatecznego czasu na działanie enzymów typu HAT.

P r z y k ł a d 8.

Klon #10 - nowe białka oddziaływujące z RAP-2

Stosując pełnej długości białko RAP-2 jako przynętę w dwu-hybrydowym badaniu przesiewowym biblioteki cDNA komórek B, wyizolowaliśmy nowe białko oddziaływujące z RAP-2 nazywane uprzednio jako klon #10, lub białko kodowane przez klon #10 lub białko #10 wiążące RAT lub RBP-10 (Figura 10). Pierwotny klon (około 2,2 kpz) koduje domniemany polipeptyd o szacunkowej masie cząsteczkowej 60 kDa. Jednakże, domniemany pierwszy kodon ATG jest prawdopodobnie brakującym w tej sekwencji. Pomimo tej przypuszczalnej długości, otrzymane cDNA powinno rozciągać się dalej w kierunku 5' dając pełną otwartą ramkę odczytu.

Test dwu-hybrydowy repertuaru wiążącego klonu #10 określił, że białko to, obok RAP-2, posiada raczej silne powinowactwo do TRAF2. Klon #10 nie wiąże się jednak do RIP, TRADD, MORT1, MACH, TNFR-I, TIP60 i NIK oraz kilku innych kontrolnych białek (przykładowo laminy i cykliny). Nie można jednak wykluczyć, że wiązanie klonu #10 do NIK może być stwierdzone dla komórek ssaczych, pamiętając osobliwe zachowanie NIK w drożdżach. Klon #10 wiąże się z RAP-2 z 200 aminokwasami na C-końcu, tj. regionem nie koniecznie kojarzonym z wiązaniem się z RIP, TIP, NIK i IK^.

Koekspresja klonu #10 z TRAF-2 w ssaczych komórkach 293T zapobiega przenoszonej przez TRAF2 aktywacji NF-kB, natomiast koekspresja klonu #10 z NIK wyraźnie podnosi późniejszą aktywację NF-kB. Ujawnienie to może wskazywać na ważną funkcję regulatorową klonu #10. Wyraźny obserwowany efekt modulatorowy może prawdopodobnie sugerować istnienie innych, nie nakładających się miejsc działania białka w komórce.

Wielokrotne przeszukiwania bazy GenBank pozwoliły zidentyfikować bliskie homologii RBP-10 prowadząc do identyfikacji F40F12.5 (numer dostępu S42834) - domniemanego białka z C. elegans, którego funkcja fizjologiczna nie została poznana. Co ciekawe, F40F15.5 wykazuje pewne podobieństwo do kilku członków szeroko konserwowanej rodziny proteaz specyficznych wobec ubikwityny. Enzymy te równoważą efekt destrukcyjny ubikwitynacji maszynerii komórkowej, która odpowiada za większość przypadków rozkładu białka w komórce. Ponieważ ligazy ubikwityny są odpowiedzialne za przyłączanie poli-ubikwityny do białka wyzwalając degradację, proteazy ubikwityny zapobiegają dalszemu rozgałęzianiu dołączanego polimeru. Takie przypuszczenia odnośnie funkcji F40F12.5 oparte na podobieństwie powyżej wspomnianych proteaz ubikwityny zdają się być jednak kwestionowane jako, że nie zbadano jeszcze czy to szczególne białko posiada jakąś aktywność enzymatyczną wobec polimerów ubikwityny. Ponadto kilka punktów zdaje się czynić takie przypuszczenia mało prawdopodobnymi:

a) reszty które prawdopodobnie tworzą zrąb regionu katalitycznego w podklasie proteaz ubikwityny nie są konserwowane ani w F40F12.5 ani w RBP-10.

b) Za wyjątkiem ich miejsc katalitycznych, enzymy z rodziny proteaz specyficznych wobec ubikwityny pozyskiwane z różnych gatunków (od bakterii do człowieka) nie wykazują podobieństwa sekwencji podczas gdy F40F12.5 i klon #10 wykazują pewien stopień homologii.

PL 199 214 B1

P r z y k ł a d 9.

Klon #84: białko oddziałujące z RAP-2

Zidentyfikowano dodatkowe białko RAP-2 wykorzystując pełnej długości białko RAP-2 jako przynętę w dwu-hybrydowym badaniu przesiewowym biblioteki cDNA komórek B, które zostało oznaczone jako klon #84.

Klon #84 wiąże się specyficznie z pełnej długości RAP-2 nie wykazując oddziaływania z żadnym innym analizowanym białkiem spośród TRAF2, MORT1, TRADD, RIP, NIK, TIP60 i lamin. Częściowa sekwencja 5' klonu #84 została uznana za identyczną z sekwencją poprzednio sklonowanego cDNA kodującego białko regulujące wzrost komórki CGR19, zidentyfikowane jako transkrypt wzmacniany specyficznie w komórkach dających funkcjonalne białko p53 (Madden S. i in. 1996, numer dostępu # U66469). Analiza sekwencji CGR19 pozwoliła zidentyfikować motyw palca C3HC4-cynk (zwany także palca RING) w jej C-końcowej domenie. Ekspresja CGR19 hamowała wzrost kilku linii komórkowych. Zaangażowanie białka CGR19 w regulację NF-kB poprzez wiązanie się z RAP-2 może prawdopodobnie sugerować modulację cyklu komórkowego przez członków rodziny TNF-R.

P r z y k ł a d 10.

Pokrewieństwo strukturalno-funkcjonalne RAP-2

A. regiony wiążące

Stosując analizę delecyjną, regiony wiążące w obrębie RAP-2 zostały zmapowane i zidentyfikowano RIP, NIK, TIP60 - wiążące domeny oraz domeny wzajemnie oddziaływujące (Figura 11).

Miejsce wiązania się do RIP zostało zmapowane w regionie białka RAP-2, który rozpoczyna się pomiędzy aminokwasami 177-218 i kończy na aminokwasie 264.

Dotychczas nie stwierdzono nakładania się miejsca wiążącego RIP w RAP-2 ani z miejscami wiążącymi IKKe albo NIK (aminokwasy 95-264 i aminokwasy 1-264, odpowiednio) (Figura 11).

Miejsce wiążące się z TIP60 prawdopodobnie mapuje się w regionie aminokwasów 95-264. Brak oddziaływań z fragmentem delecyjnym obejmującym aminokwasy 95-309, może prawdopodobnie być wynikiem specyficznych utrudniających konformacji odnoszących się do tej szczególnej delecji.

Podobne rozbieżności wiązania się fragmentów delecyjnych może być stwierdzone dla wiązania się klonu #10 i wewnętrznych oddziaływań RAP-2. W przeciwieństwie do TIP60, wiązanie pełnej długości RAP-2 do fragmentu delecyjnego zawierającego aminokwasy 1-264 sugeruje, że region ten jest zaangażowany w homo-dimeryzację zlokalizowaną pomiędzy aminokwasami 217-264.

Białko kodowane przez klon #10, poza powyżej opisanym wyjątkiem, przypuszczalnie wiąże się do regionu rozpoczynającego się pomiędzy aminokwasami 218-309 i kończącego się aminokwasem 416, a zatem jego miejsce wiążące może obejmować regiony nakładające się z miejscem wiążącym RIP, NIK, IKKe i TIP60 (Figura 11).

B. Regiony funkcjonalne

W zakresie naszej obecnej wiedzy, wszystkie funkcjonalne efekty wywoływane przez RAP-2 (mianowicie inhibicja NF-kB i indukowanie hiperfosforylacji c-Jun) mapują w tym samym regionie (Figura 11).

Ponadto, jest możliwe, że region odpowiadający za efektywną modulację sygnału przez wszystkie induktory stosowane w tych eksperymentach jest zlokalizowany w N-końcowym segmencie białka.

Region obejmowany przez aminokwasy 95-416 posiada aktywność, jednak znacząco słabszą niż efekt wywoływany przez pełnej długości białko, co może być wynikiem przymusowej agregacji endogennego RAP-2.

Ponadto, za wyjątkiem RelA, wpływy wszystkich induktorów stosowanych w naszych eksperymentach mogą być przenoszone przez kilka, jak i 100 N-końcowych aminokwasów z RAP-2. W rzeczywistości nawet fragment obejmujący aminokwasy 1-102 przenosi pewną aktywność, jednakże znacznie ograniczoną (Figura 12B).

Z drugiej strony, udana indukcja RelA wymaga dużo większej części białka RAP-2. Dotychczas możemy zdefiniować obszar tego regionu jako rozciągający się od aminokwasu 1 do 264, ze wskazaniem na region pomiędzy 157 i 264 posiadającym pewne specyficzne, związane z RelA właściwości wiążące.

C. Pokrewieństwo funkcji wiążących

Z wyników pokazanych na Figurze 11 i 12, prawdopodobne jest, że:

a) za wyjątkiem RelA, wiązanie się RAP-2 do RIP, klonu #10, i najprawdopodobniej do NIK i TIP60 nie jest wymagane dla funkcjonowania białka, jako inhibitora nadekspresji indukowanej przez NF-kB.

PL 199 214 B1

b) Wpływ RAP-2 na aktywację RelA indukowaną nadekspresją jest przenoszone, przynajmniej częściowo, przez inne czynniki wiążące. Właściwie, wszystkie powyżej wspomniane białka mogą brać udział w danej aktywnoś ci, co wynika z dotychczasowych eksperymentów.

Dokładne miejsce oddziaływań pomiędzy RAP-2 i RIP nie zostało jeszcze określone, jednak wydaje się, że miejsce to jest specyficzne wobec RIP i RAP-2 i nie wykazuje oddziaływania z innymi znanymi białkami oddziaływującymi z RIP, np. MORT-1, TRADD, FAS-R i prawdopodobnie także TRAF2 (patrz Malinin i in. 1997). Przypuszcza się również, że (na podstawie analizy i porównania z sekwencjami z różnych baz danych opisanych powyżej), że RAP-2 nie posiada „domeny martwej”, modułu MORT, domeny proteazowej (np. ICE/CED3 motywu), domeny/motywu kinazowego ani domen TRAF. W związku z tym, analiza aktywności biologicznej także pozwoliła stwierdzić, że RAP-2 najwyraźniej posiada następujące cechy:

(i) podczas nadekspresji RAP-2 silnie hamuje aktywację NF-kB przez TNF lub przez nadekspresję TRAD, RIP, TRAF-2, NIK lub p65 NF-kB podjednostkę, (ii) RAP-2 wspomaga hiperfosforylację c-Jun, bez zmieniania aktywności JNK;

(iii) RAP-2, co stwierdzono w trakcie analizy delecyjnej, nie wymaga martwej domeny RIP, ani aktywności kinazowej RIP do wiązania się z RIP;

(iv) w oparciu o analizę delecyjną, region wiążący RAP-2 do RIP został wskazany jako region około 200 aminokwasowy leżący na N-końcu;

(v) RAP-2 wiąże się z NIK w transferowanych komórkach ssaczym, lecz nie w komórkach drożdżowych.

W związku z powyższym RAP-2 wydaje się być wysoce specyficznym białkiem wiążącym RIP, a zatem modulatorem/przenośnikiem RIP, który wydaje się być zaangażowany w przenoszone przez RIP ścieżki przenoszenia sygnału wewnątrzkomórkowego.

W świetle powyższego wydaje się, że RAP-2 jest zaangażowany w modulowanie/przenoszenie aktywności RIP. Wewnątrzkomórkowe, są to zaangażowanie RIP w ścieżki przeżycia komórki (aktywacja NF-kB, możliwie poprzez oddziaływanie z TRAF2) i jego udział w ścieżkach zapalenia i śmierci komórkowej (niezależnie poprzez jego „domenę śmierci” lub poprzez oddziaływanie z innymi białkami takimi jak MORT-1, TRADD, p55-R, FAS-R i odpowiednie proteazy takie jak MACH, Mch4, G1 i tym podobne). Możliwe drogi jakimi RAP-2 może modulować/przenosić aktywność RIP są wyszczególnione powyżej. Przykładowo oddziaływania RAP-2-RIP mogą prowadzić do inhibicji bądź to śmierci komórki albo ścieżek przetrwania komórki, a to wzmacnianie lub osłabianie prawdopodobnie zależy od względnych aktywności innych członków tych dwóch przeciwstawnych ścieżek. RAP-2 może także działać jako białko dokujące prowadząc do agregacji licznych cząsteczek RIP i innych białek wiążących RIP lub RAP-2, które to agregaty mogą następnie działać w kierunku śmierci komórki albo przetrwania komórki (lub nawet obydwu) w zależności od względnej aktywności/ilości innych członków tych ścieżek w komórce.

P r z y k ł a d 11.

Przygotowywanie poliklonalnych przeciwciał specyficznych wobec RAP-2

Króliki zaszczepiano początkowo podskórnie 5 μg czystego preparatu RAP-2 emulgowanego w pełnym adjuwancie Freunda. Trzy tygodnie później, były one ponownie zaszczepiane podskórnie 5 μg czystego preparatu RAP-2 emulgowanego w niezupełnym adjuwancie Freunda. Dwa dodatkowe szczepienia RAP-2 w roztworze PBS podawano w 10 dniowych odstępach. Króliki wykrwawiano 10 dni po ostatniej immunizacji. Poziom przeciwciał oceniano metodami radioimmunologicznymi. Znakowany ¹²⁵I RAP-2 mieszano z różnymi rozcieńczeniami (1:50, 1:500, 1:5,000 i 1:50,000) surowicy króliczej. Zawiesinę białka G w bloczkach agarozowych (20 pl, Pharmacia) dodawano do całkowitej objętości 200 pl. Mieszaninę pozostawiano na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, bloczki przemywano trzykrotnie i mierzono poziom związanej radioaktywności. Królicza antysurowica specyficzna wobec ludzkiej leptyny była stosowana jako kontrola negatywna. Miano surowicy RAP-2 mierzono i porównywano do kontroli negatywnej.

P r z y k ł a d 12.

Przygotowywanie przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec RAP-2

Samice mysz Balb/C (trzymiesięczne) zaszczepiano najpierw 2 pg oczyszczonego RAP-2 w emulsji pełnego adjuwanta Freunda, następnie po trzech tygodniach, podskórnie w niepełnym adjuwancie Freunda. Trzy dodatkowe szczepienia w postaci roztworu w PBS podawano podskórnie w 10 dniowych odstępach. Ostateczne wzmocnienie podawano dootrzewnowo 4 i 3 dni przed fuzją, myszom wykazującym najwyższe miano wiążące, co określano techniką IRIA (patrz poniżej). Fuzję

PL 199 214 B1 prowadzono stosując NSO/1 linię komórek szpiczaka i limfocyty otrzymywane ze śledziony i węzłów chłonnych zwierząt stosowanych jako partnerzy fuzyjni. Komórki po fuzji rozdzielano na płytki do mikrohodowli i selekcjonowana hybrydoma w pożywce DMEN uzupełnionej HAT i 15% surowicą końską. Hybrydoma wykazujące produkcję przeciwciał specyficznych wobec RAP-2 subklonowano techniką kolejnych rozcieńczeń i wstrzykiwano myszom Balb/C, u których inicjowano za pomocą pristanu produkcję opuchliny brzusznej. Izotyp przeciwciał określano za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów ELISA (Amersham, UK).

Badanie przesiewowe hybrydoma wytwarzających monoklonalne przeciwciała specyficzne wobec RAP-2 prowadzono następująco: Zawiesiny hybrydoma testowano pod względem obecności przeciwciał anty-RAP-2 techniką radioimmunologicznego testu w odwróconej fazie stałej (IRIA). Płytki ELISA (Dynantech Laboratories, Alexandria, VA) pokrywano Talon-oczyszczane IL-18Bpa-His6 (10 μg/ml, 100 μ l/studzienkę). Po całonocnej inkubacji w 4°C, płytki przemywano dwukrotnie PBS zawierającym BSA (0,5%) i Tween 20 (0,05%) i blokowano roztorem do przemywania przez przynajmniej 2 godziny w 37°C. Przesącze z hodowli hybrydoma (100 μl/studzienkę) dodawano i inkubowano płytki przez 4 godziny w 37°C. Płytki przemywano 3 razy i dodawano koniugat kozich przeciwciał anty-mysich z peroksydazą chrzanową (HRP, Jackson Labs, 1:10,000, 100 μl/studzienkę) na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano czterokrotnie i zabarwiano stosując ABTS (kwas 2,2'-azino-bis-(3-etylobenzotiazolino-6-siarkowy, SIGMA) wraz z H2O2 jako substrat. Płytki odczytywano automatycznie w czytniku płytek do ELISA. Próbki dające OD będące przynajmniej 5-krotnie wyższe niż OD dla kontroli negatywnej uznawano za pozytywne.

Przeciwciała specyficzne wobec RAP-2 mogą być stosowane do oczyszczania RAP-2 chromatografią powinowactwa.

P r z y k ł a d 13.

Test ELISA

Płytki do mikromiareczkowania (Dynatech lub Maxisorb, według Nunc) pokrywano anty-RAP-2 monoklonalnym przeciwciałem (supernatant surowicy nie zawierającej hybrydoma lub immunoglobuliny płynu z opuchliny brzusznej) i pozostawiano na noc w 4°C. Płytki przemywano PBS zawierającym BSA (0,5%) oraz Tween 20 (0,05%) i przetrzymywano w tym roztworze przez przynajmniej 2 godz. w 37°C. Badane próbki rozcieńczano w roztworze blokującym i dodawano do studzienek (100 pl/studzienkę) na 4 godz. w 37°C. Płytki następnie trzykrotnie przemywano PBS zawierającym Tween 20 (0,05%), a następnie dodawano surowicę króliczą anty-RAP-2 (1:1000, 100 pl/studzienkę) i inkubowano przez noc w 4°C. Płytki przemywano trzykrotnie i koniugat owczo-anty-króliczej peroksydazy chrzanowej (HRP, Jackson Labs, 1:10.000, 100 pl/studzienkę) dodano na 2 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano czterokrotnie i rozwijano kolor przez dodanie ABTS (kwas 2,2'-azyno-bis-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy, Sigma) z H2O2 jako substratu. Płytki odczytywano za pomocą automatycznego czytnika ELISA.

Mając obecnie opisany w pełni wynalazek, specjaliści w tej dziedzinie będą mogli docenić, że może on być wykonany w szerokim zakresie równoważnych parametrów, stężeń i warunków, bez oddalania się od istoty i kształtu wynalazku i bez nadmiernych eksperymentów.

O ile wynalazek ten opisany jest w kontekście jego specyficznej postaci wykonania, uznaje się, że możliwe są dalsze jego modyfikacje. Zastosowanie to dotyczy wszelkich wariantów, sposobów stosowania lub przystosowań niniejszego wynalazku, ogólnie, zasad zawartych w niniejszym wynalazku i obejmuje takie odstępstwa od niniejszego ujawnienia, jakie wynikają z wiedzy lub przeciętnej praktyki znanej ze stanu techniki, której dotyczy wynalazek i takich, które mogą być zastosowane do istotnych cech wskazanych powyżej oraz w poniższych zastrzeżeniach.

Wszystkie cytowane tu odnośniki literaturowe, włączając artykuły z czasopism lub skróty, opublikowane lub odpowiadające amerykańskim lub zagranicznym zgłoszeniom patentowym, udzielone patenty amerykański lub zagraniczne, lub jakichkolwiek inne odnośniki, są całkowicie włączone niniejszym przez odniesienie, łącznie z wszystkimi danymi, tabelami, figurami i tekstem zaprezentowanym w cytowanych odnośnikach. Dodatkowo, całkowita zawartość odnośników cytowanych w odnośnikach literaturowych tu zawartych również jest włączona w całości do niniejszego opisu patentowego na drodze odniesienia.

Odniesienia do znanych etapów metod, konwencjonalnych etapów metod, znanych metod lub konwencjonalnych metod nie powinny w jakikolwiek sposób prowadzić do wniosku, że dowolny aspekt, opis lub realizacja niniejszego wynalazku zostały ujawnione, nauczane lub zasugerowane w powiązanym stanie techniki.

PL 199 214 B1

Powyższy opis specyficznych realizacji oddaje w pełni ogólny charakter wynalazku na tyle, aby inni mogli, stosując swoją wiedzę ze stanu techniki (obejmującą zawartość cytowanych niniejszym odnośników literaturowych), bezpośrednio modyfikować lub przystosować do różnych zastosowań te specyficzne realizacje, bez nadmiernego eksperymentowania i bez odchodzenia od ogólnej idei prezentowanego wynalazku. Dlatego takie przystosowania i modyfikacje mieszczą się w pojęciu ekwiwalentów ujawnionych realizacji, w oparciu o wskazówki tu zaprezentowane. Uznaje się, że frazeologia lub terminologia stosowana w niniejszym opisie służy jedynie opisowi, a nie ograniczeniu, w związku z czym terminologia lub frazeologia z niniejszego opisu powinna być interpretowana przez fachowców w świetle wskazówek tu zaprezentowanych, w połączeniu z ich ogólną wiedzą ze stanu techniki.

Literatura

Alnemri, E. S. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: 4312-4317.

Barinaga, M. (1993) Science 262: 1512-1514.

Beg, A. A. i Baltimore, D. Science 274: 782-784.

Beidler, J. i in., (1995) J. Biol. Chem. 270: 16526-16528.

Berger, J. i in., (1988) Gene 66: 1-10.

Beutler, B. i Cerami, C. (1987) NEJM: 316: 379-385.

Bigda, J. i in. (1994) J. Exp. Med. 180: 445-460.

Boldin, M. P. i in. (1995a) J. Biol. Chem. 270: 337-341.

Boldin, M. P. i in. (1995b) J. Biol. Chem. 270: 7795-7798.

Boldin, M. P. i in. (1996) Cell 85: 803-815.

Brakebusch, C. i in. (1992) EMBO J., 11: 943-950.

Brockhaus, M. i in. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3127-3131.

Cantor, G. H. i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10932-6.

Cerreti, D. P. i in. (1992) Science 256: 97-100.

Chen, C. J. i in. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 271-3.

Chinnaiyan i in. (1995) Cell 81: 505-512.

Chinnaiyan i in. (1996) J. Biol. Chem. 271: 4961-4965.

Cifone, M. G. i in. (1995) EMBO J. 14: 5859-5868.

Clement, M. V. i in. (1994) J. Exp. Med. 180: 557-567.

Crisell, P. i in., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 21 (22): 5251-5.

Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Albright, L. M., Coen, D. M. i Varki, A., red.), (1994) str. 8.1.1-8.1.6 i 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons, Inc., New York.

Dirks, W., i in., (1993) Gene 128: 247-249.

Durfee, T. i in. (1993) Genes Dev. 7: 555-569.

Eischen, C. M. i in. (1994) J. Immunol. 153: 1947-1954.

Ellis, H. M. i in. (1986) Cell 44: 817-829.

Enari, M. i in. (1995) Nature 375: 78-81.

Engelmann, H. i in. (1990) J. Biol. Chem., 265: 1531-1536.

Faucheu, C. i in. (1995) EMBO J. 14: 1914-1922.

Fernandes-Alnemri, T. Fernandes-Alnemri, T. Fernandes-Alnemri, T.

in. (1994) J. Biol. Chem. 269: 30761-30764. in. (1995) Cancer Res. 55: 2737-2742. in. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7464-7469. Field, J. i in. (1988) Mol. Cell Biol. 8: 2159-2165.

Fields, S. i Song, O. (1989) Nature, 340: 245-246.

Frangioni, J. V. i Neel, B. G. (1993) Anal. Biochem. 210: 179-187.

Geysen, H. M. (1985) Immunol. Today 6: 364-369.

Geysen, H. M. i in. (1987) J. Immunol. Meth. 102: 259-274.

Gossen, M. i Boujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551. Grell, M. i in. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2563-2566.

Heller, R. A. i in. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6151-6155.

Henkart, P. A. (1996) Immunity 4: 195-201.

Hohmann, H.-P. i in. (1989) J. Biol. Chem., 264: 14927-14934.

Howard, A. D. i in. (1991) J. Immunol. 147: 2964-2969.

Hsu, H. i in. (1995) Cell 81: 495-504.

Hsu, H. i in. (1996) Cell 84: 299-308.

PL 199 214 B1

Itoh, N. i in. (1991) Cell 66: 233.

Itoh, N. i Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268: 10932-7.

Joseph, S. i Burke, J. M. (1993) J. Biol. Chem. 268: 24515-8.

Kamens, J. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: 15250-15256.

Kaufmann, S. H. (1989) Cancer Res. 49: 5870-5878.

Kaufmann, S. H. (1993) Cancer Res. 53: 3976-3985.

Kischkel, F. C. i in. (1995) EMBO J. 14: 5579-5588.

Koizumi, M. i in. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9): 879-83.

Kumar, S. i in. (1994) Genes Dev. 8: 1613-1626.

Kumar, S. (1995) Trends Biochem Sci. 20: 198-202.

Lazebnik, Y. A. i in. (1994) Nature 371: 346-347.

Leithauser, F. i in. (1993) Lab Invest. 69: 415-429.

Li, Y. i in. (1998) Mol Cell Biol 18: 1601-1610.

Loetscher, H. i in. (1990) Cell, 61: 351-359.

Los, M. i in. (1995) Nature 375: 81-83.

Madden, S. L. i in. (1996) Cancer Res 56: 5384-5390.

Malinin, N. L. i in. (1997) Nature 385: 540-544.

Martin, S. J. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6425-6428.

Mashima, T. i in. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 907-915.

Miller, B. E. i in. (1995) J. Immunol. 154: 1331-1338.

Milligan, C. E. i in. (1995) Neuron 15: 385-393.

Miura, M. i in. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8318-8322.

Munday, N. A. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: 15870-15876.

Muranishi, S. i in. (1991) Pharm. Research 8: 649.

Musti AM, i in. (1997) Science 1997 275: 400-402.

Nagata, S. i Golstein, P. (1995) Science 267:1449-1456.

Natoli, G. i in. (1997) J. Biol. Chem. 272: 26079-26082.

Nicholson, D. W. i in. (1995) Nature 376: 37-43.

Nophar, Y. i in. (1990) EMBO J., 9: 3269-3278.

Piquet, P. F. i in. (1987) J. Exp. Med., 166: 1280-89.

Ray i in. (1992) Cell 69: 597-604.

Ruggiero, V. i in. (1987) Cell Immunol. 107: 317-325.

Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schall, T. J. i in. (1990) Cell, 61: 361-370.

Schlegel, i in. (1996) J. Biol. Chem. 271: 1841-1844.

Schulze-Osthoff, K. i in. (1994) EMBO J. 13: 4587-4596.

Shimayama, T. i in., (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29: 177-8.

Shore, S. K. i in. (1993) Oncogene 8: 3183-8.

Sleath, P. R. i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14526-14528.

Smith, C. A. i in. (1990) Science, 248: 1019-1023.

Song, H. Y. i in. (1994) J. Biol. Chem. 269: 22492-22495.

Srinivasula, S. M. i in. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14486-14491.

Stanger, B. Z. i in. (1995) Cell 81: 513-523.

Tartaglia, L. A. i in. (1993) Cell, 74: 845-853.

Tewari, M. i in. (1995) J. Biol. Chem. 270: 3255-3260.

Tewari, M. i in. (1995a) J. Biol. Chem. 270: 18738-18741.

Tewari, M. i in. (1995b) Cell 81: 1-20.

Thornberry, N. A. i in. (1992) Nature 356: 768-774.

Thornberry, N. A. i in. (1994) Biochemistry 33: 3934-3940.

Tracey, J. T. i in. (1987) Nature, 330: 662-664.

Van Antwerp, D. J. i in. (1996) Science 274: 787-789.

Vandenabeele, P. i in. (1995) Trends Cell Biol. 5: 392-400.

Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452.

Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132: 2464-9.

Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London.

PL 199 214 B1

Wallach, D. i in. (1994) Cytokine 6: 556.

Wang, L. i in. (1994) Cell 78: 739-750.

Wang, C.-Y i in., (1996) Science 274: 784-787.

Watanabe-Fukunaga, R. i in. (1992) Nature, 356: 314-317. Watanabe, F. R. i in. (1992) J. Immunol. 148: 1274-1279.

Weitzen, M. i in. (1980) J. Immunol. 125: 719-724.

Wilks, A. F. i in. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1603-1607. Wong i in. (1994) J. Immunol. 152: 1751-1755.

Xue, D. i in. (1995) Nature 377: 248-251.

Yamaoka S, i in. (1998) Cell 93: 1231-1240.

Yonehara, S. i in. (1989) J. Exp. Med. 169: 1747-1756.

Yuan, J. i in. (1993) Cell 75: 641-652.

Zaccharia, S. i in. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203: 353-357.

Zhao, J. J. i Pick, L. (1993) Nature (England) 365: 448-51.

Claims (6)

1. Sekwencja DNA kodująca białko wiążące RAP-2, jego izoformę, fragment albo analog, obejmująca sekwencję przedstawioną na Fig. 10A i 10B, przy czym izoforma, fragment albo analog białka wiążącego RAP-2 mają właściwości wiązania RAP-2.

2. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko o właściwości modulowania/pośredniczenia w funkcjach RAP-2.

3. Białko wiążące RAP-2, jego izoforma, fragment albo analog, które są kodowane przez sekwencję DNA określoną w zastrz. 1 albo 2 i mają właściwość modulowania/pośredniczenia w funkcjach RAP-2.

4. Sposób izolowania i identyfikowania białek o właściwościach wiązania RAP-2, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie dwu-hybrydowej procedury, w której sekwencja kodująca białko RAP-2, jego izoformę, analog lub fragment, jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, zaś sekwencja DNA z biblioteki cDNA albo genomowego DNA jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, wektory stosuje się następnie do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izoluje się pozytywnie transformowane komórki, po czym ekstrahuje się drugi wektor hybrydowy w celu otrzymania sekwencji DNA kodującej białko, które wiąże się z RAP-2; przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) sekwencji DNA kodującej białko RAP-2 o sekwencji przedstawionej na Fig. 3 A/1 i A/2;

(b) sekwencji DNA przedstawionej w SEK. NR ID.: 1 lub 2;

(c) sekwencji DNA, która jest zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach z sekwencją z (a) lub (b) i koduje biologicznie czynne białko RAP-2;

(d) sekwencji DNA, która jest zdegenerowana w wyniku kodu genetycznego względem sekwencji DNA określonych w (a) lub (b) i koduje biologicznie czynne białko RAP-2;

(e) sekwencji DNA określonej w punkcie (b) kodującej białko RAP-2, jego izoformę, analog albo fragment, który ma przynajmniej część sekwencji przedstawionej na Fig. 3 A/1 i A/2.

5. Zastosowanie jednego lub więcej białek wiążących RAP-2 określonych w zastrz. 3, lub ich izoform, fragmentów lub analogów do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania szlaku zapalnego, śmierci komórkowej i/lub przeżywania komórek.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że białko wiążące RAP-2 jest kodowane przez klon nr 10.