CN1630664A

CN1630664A - 胱冬酶－8结合蛋白及其制备和使用

Info

Publication number: CN1630664A
Application number: CNA02821966XA
Authority: CN
Inventors: D·沃勒克; T·冈察洛夫; G·克鲁马姆; A·拉杰普特
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2005-06-22
Also published as: US20050048639A1; KR20040049845A; EP1423422A2; WO2003020759A3; WO2003020759A9; WO2003020759A2; EA200400392A1; BR0212287A; EA009956B1; MXPA04002103A; CA2459136A1; US20080254028A1; JP2005501545A; US7354736B2

Abstract

本发明涉及一种胱冬酶－8相互作用多肽(Cari)的制备和使用方法。

Description

胱冬酶-8结合蛋白及其制备和使用

发明领域

本发明涉及一种胱冬酶-8相互作用多肽(Cari)，其制备方法和使用。

发明背景

肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)是主要由单核白细胞形成的多功能促炎细胞因子，对于细胞有许多功能(Wall，D.(1986)，《干扰素7》( Interferon 7)(Ion Gresser编)，83-122页，Academic Press，London；Beutler和Cerami(1987)。TNF-α和TNF-β都通过结合特异细胞表面受体来开始作用。一些效果似乎对生物体有利：它们可破坏例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞且增强粒细胞的抗菌活性。这样，TNF有助于生物体抗肿瘤和感染剂的防御且有助于从损伤中恢复。因此，TNF可用作抗肿瘤剂，在此应用中TNF结合其肿瘤细胞表面受体并从而起始导致肿瘤细胞死亡的事件。TNF也可用作抗感染剂。

然而，TNF-α具有害作用。证据表明TNF-α的过度生成在一些疾病中可能起主要的致病作用。例如，主要在脉管系统的TNF-α作用已知是引起感染性休克症状的主要原因(Tracey等，1994)。在一些疾病中，TNF可通过抑制脂肪细胞活性和导致厌食来引起重量过多减少(恶病质)，因此TNF-α被称为恶液质素。它也被描述为风湿性疾病中组织损坏的调节物(Beutler和Cerami，1987)和移植物抗宿主中所观察损伤的主要调节物(Grau GE等，1989)。此外，已知TNF参与炎性疾病和许多疾病过程。

两种不同、单独表达的受体p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF受体都特异结合TNF-α和TNF-β，起始和/或调节上述TNF的生物作用。这两种受体具有结构不同的胞内结构域，表明它们信号不同(参见Hohmann等，1989；Engelmann等，1990；Brockhaus等，1990；Loetscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990)。然而，细胞机制例如参与CD120a和CD120b胞内信号产生的多种蛋白质和可能的其它因子还有待阐明。胞内信号通常在配体结合受体后发生，配体即TNF(α或β)，受体使级联反应开始，最终产生所观察到的细胞对TNF的反应。

关于上述TNF在迄今所研究大部分细胞中的细胞坏死作用，此作用主要由CD120a引起。抗CD120a胞外结构域(配体结合结构域)的抗体本身可引发细胞坏死作用(参见EP 412486)，与被抗体交联受体的效果相关，这被认为是产生胞内信号过程中的第一个步骤。此外，突变研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)显示CD120a的生物功能取决于胞内结构域的完整性，因此表明起始导致TNF细胞坏死作用的胞内信号是作为两个或更多CD120a胞内结构域相联的结果。而且，TNF(α或β)作为同源三聚体产生，显示经CD120a诱导胞内信号，这是通过它与受体分子结合和交联的能力，即引起受体聚合(Engelmann H.等，1990)。

TNF/NGF受体超家族的另一个成员是FAS/AP01受体(CD95)。CD95调节细胞调亡形式的细胞死亡(Itoh等，1991)，似乎作为自身反应T细胞的负选择子，即在T细胞成熟中，CD95调节识别自身抗原的T细胞的细胞调亡死亡。同样发现CD95基因(lpr)突变导致小鼠中的淋巴增生疾病，类似人自身免疫性疾病系统性红斑性狼疮(SLE)(Watanabe-Fukunaga等，1992)。CD95的配体是杀伤T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞-CTLs)携带的细胞表面相关分子，因此当这些CTLs接触携带CD95的细胞时，它们能诱导携带CD95细胞的细胞调亡死亡，包括转化编码人CD95 cDNA的小鼠细胞(如Itoh等，1991)。

TNF受体和包括不同受体的Fas信号机制，它们的调节和鉴定的下游信号分子由Wallach等，(1999)详细综述。

发现一些恶性细胞和HIV感染细胞在它们的表面携带CD95，抗CD95抗体或CD95配体可用于在这些细胞中引起CD95调节的细胞毒性作用，从而提供抗这些恶性细胞和HIV感染细胞的方法(参见Itoh等，1991)。因此发现另外提高CD95细胞毒性活性的方法也具有治疗潜力。

一直需要一种调节细胞对TNF(α或β)和CD95配体反应的方法。例如，在上述病理情况下，当TNF或CD95配体过量表达时需要抑制TNF或CD95配体诱导的细胞毒性作用，而在其它情况下，如伤口愈合应用需要增强TNF作用，或在CD95的情况下，肿瘤细胞或HIV感染细胞中需要增强CD95调节作用。

专利申请人采用了一些方法(参见例如欧洲专利说明书号EP186,833、EP 308,378、EP 398,327和EP 412,486)以调节TNF的有害效果，这是通过用抗TNF抗体抑制TNF结合其受体或使用可溶性TNF受体(本质上是受体可溶性胞外结构域)竞争TNF与细胞表面结合TNF受体(TNF-Rs)的结合。此外，在TNF诱导的细胞效果需要TNF结合其受体的基础上，专利申请人采用方法(参见例如EP 568,925)通过调节TNF-Rs活性来调节TNF作用。

EP 568,925涉及调节信号转导和/或TNF-Rs中裂解的方法，其中肽或其它分子可与受体本身或效应蛋白相互作用，效应蛋白与受体相互作用，从而调节TNF-Rs的正常功能。在EP 568,925中描述了多种CD120a突变形式的构建物和特征，在其胞外、跨膜和胞内结构域中有突变。这样，鉴定上面CD120a结构域中的区域对于受体功能是必需的，即结合配体(TNF)和随后的信号转导和最终对细胞产生所观察TNF作用的胞内信号。此外，也描述了一些分离和鉴定能结合上面CD120a结构域中多个区域的蛋白质、肽或其它因子的方法，蛋白质、肽或其它因子可参与控制或调节TNF-Rs活性。同样在EP0 368,925中列出了一些方法，用于分离和克隆编码这种蛋白质和肽的DNA序列；用于构建生成这些蛋白质和肽的表达载体；用于制备抗体或其与CD120a或上面蛋白质和肽相互作用的片段，蛋白质和肽结合CD120a的多个区域。然而，EP 568,925没有详细说明结合TNF-Rs胞内结构域的确切蛋白质和肽。类似的，在EP 568,925中没有揭示能结合CD95胞内结构域的具体蛋白质和肽。

因此，当需要抑制TNF或CD95配体的作用时需减少细胞表面TNF-Rs或CD95的量或活性，而当追求增强TNF或CD95配体的作用时需增加TNF-Rs或CD95的量或活性。为了此目的，CD120a和CD120b的启动子都被测序、分析且发现一些对不同转录调节因子特异的关键序列基序，这些TNF-Rs的表达可在它们的启动子水平控制，即抑制启动子转录以减少受体数量和增加启动子转录以增加受体数量(EP606，869和WO 9531206)。

已知肿瘤坏死因子(TNF)受体和结构相关受体CD95通过白细胞-生成配体的刺激在细胞中引起导致自身死亡的破坏作用，对此触发机制仍理解很少。突变研究表明在CD95和CD120a中，细胞毒性信号包括它们胞内结构域中的不同区域(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。这些区域(“死亡结构域”)具有序列相似性。CD95和CD120a的“死亡结构域”往往自身相联。它们的自身相联显然促进受体聚合，这对于信号起始是必需的(参见Bigda等，1994；Boldin等，1995)，高水平的受体表达可引起不取决于配体的信号(Boldin等，1995)。

一些淋巴细胞的细胞毒性作用通过靶细胞中淋巴细胞-生成配体与CD95的相互作用来调节(也参见Nagata和Goldstein，1995)。单核吞噬细胞的细胞杀死包括TNF和其受体CD120a(也参见Vandenabeele等，1995)。类似其它受体诱导的效果，TNF受体和CD95诱导的细胞死亡通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用产生，导致从配体-受体结合到最终酶效应功能的活化，显示包括起始细胞死亡信号的非酶蛋白质-蛋白质相互作用：三聚TNF或CD95配体分子结合受体、所得它们胞内结构域的相互作用(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)，通过死亡结构域基序自身相联倾向来增强(Boldin等，1995a)、以及诱导两种细胞质蛋白质(也可相互结合)结合受体胞内结构域-MORT-1(或FADD)结合CD95(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)及TRADD结合CD120a(Hsu等，1996)。除了结合CD95和CD120a，MORT-1和TRADD也能相互结合以及结合含蛋白质如RIP(Stanger等，1995)的其它死亡结构域，在CD95和CD120a间提供功能性的“串话”。这些结构域通过一个保守的序列基序发生，此基序是受体和它们相关蛋白共有的“死亡结构域组件”。此外，尽管在酵母双杂交试验中MORT-1显示自发结合CD95，在哺乳动物细胞中此结合仅在刺激受体后发生，表明MORT-1参与起始CD95信号的事件。MORT-1不包含任何具有酶活性特征的序列基序，因此它引起细胞死亡的能力似乎不涉及MORT-1本身的内在活性，而是活化一些结合MORT-1和在信号级联更下游作用的其它蛋白质。细胞表达缺乏分子N-末端部分的MORT-1突变体显示阻碍CD95或CD120a诱导的细胞毒性(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，表明此N-末端区域通过蛋白质-蛋白质相互作用传送两种受体的细胞毒性效果。

最近的研究指示一组细胞质硫醇蛋白酶，在多种生理细胞死亡过程开始时与秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)蛋白酶CED3和哺乳动物白介素-1β-转化酶(ICE)结构相关(Kumar，1995和Henkart，1996综述)。也有证据表明此蛋白酶家族参与CD95和TNF-Rs诱导的细胞毒性。发现蛋白酶特异肽抑制物和两种阻碍它们功能的病毒-编码蛋白质牛痘蛋白质crmA和杆状病毒p35蛋白保护细胞抗此细胞毒性(Enari等，1995；Tewari等，1995；Xue等，1995；Beidler等，1995)。CD95或TNF-Rs刺激后不久可在细胞中证实一些特异细胞蛋白质的迅速裂解，此裂解显然由CED3/ICE(胱冬酶)蛋白酶家族调节。

一个称为MACH(现在叫胱冬酶-8)的这类蛋白酶和其多种同工型(包括抑制型)被分离、克隆和确定特征并描述它可能的用途，MACH是一种MORT-1结合蛋白，这些被详细列出且全部纳入本文在共有的PCT/US96/10521和本发明者(Boldin等，1996)的出版物中供参考。另一个名为Mch4(也称为胱冬酶-10)的这类蛋白酶和其多种同工型(包括抑制型)也由本发明者(未发表)和其他人(Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)分离和确定特征。胱冬酶-10也是一种MORT-1结合蛋白。因此涉及胱冬酶-10所有方面、特征、性质和用途的细节列于上述出版物，它们全部纳入本文供参考。

也应注意具有类似前结构域的胱冬酶、胱冬酶-8和胱冬酶-10(参见Boldin等，1996；Muzio等，1996；Fernandes-Alnemri等，1996；Vincent和Dixit，1997)通过它们的前结构域与MORT-1相互作用，此相互作用经“死亡效应结构域”DED，DED存在于MORT-1N-末端部分且在胱冬酶-8和胱冬酶-10中成双存在(参见Boldin等，1995b；Chinnalyan等，1995)。

胱冬酶(半胱氨酸天冬氨酸-特异蛋白酶)是一个发展的半胱氨酸蛋白酶家族，共享一些普遍特征。发现大部分胱冬酶参与程序性细胞死亡或细胞调亡的起始和完成，而其它似乎参与促炎细胞因子的生成(Nicholson DW等，1997，Salvesen GS等，1997，Cohen GM 1997)。它们作为催化几乎失活的前体合成且一般由特异内部天冬氨酸残基后的裂解来活化，残基存在于结构域间接头中。胱冬酶切割位点定义为四肽序列(X-X-X-D)且裂解常出现在天冬氨酸下游。结果一些成熟的活化胱冬酶可加工和活化它们本身以及其它失活前体(Fernandes-Alnemri T等1996，Srinivasula SM等，1996)。

程序性细胞死亡过程的活化一般是特异的且包括名为“起始子”的上游胱冬酶连续加工名为“执行者”的下游胱冬酶。两类胱冬酶的功能特征也通过它们的结构反映。事实上与“执行”胱冬酶相比，“起始胱冬酶(initiator caspase)”包含更长的前结构区域(Salvesen GS等，1997，Cohen GM 1997)。长前结构域使起始子或“顶点”胱冬酶可通过引发TNF受体家族死亡受体来活化。在配体诱导的死亡受体三聚化上，起始胱冬酶通过它们的长N-末端前结构域与特异衔接分子相互作用来募集以形成死亡诱导信号复合物(Cohen GM 1997，Kischkel FC等，1995)。例如，包含两个DED的胱冬酶-8/MACH和可能的胱冬酶-10通过衔接分子FADD/MORT-1募集到受体复合物，而胱冬酶-2假设通过衔接分子CRADD/RAIDD和RIP来募集(Nagata S等，1997，MacFarlane M等，1997，Ahmad M等，1997，DuanH等，1997)。由于活化受体复合物的三聚性质，认为至少两种胱冬酶分子相互很接近，从而通过自动催化加工进行活化(Yang等，1998，Muzio等，1998)。

胱冬酶作为酶原合成，由三个主要亚基即N-末端前结构域和两个亚基组成，两个亚基有时由接头肽分开。两个亚基命名为“长”或亚基1(Sub-1)和“短”或亚基2(Sub-2)，Sub-1含活化酶位点的主要部分。为充分活化酶，它被加工以形成前结构域和两个亚基结构域。两个亚基形成异二聚物。在推测的胱冬酶-3三维结构基础上，似乎长结构域C-末端以及短亚结构域N-末端被释放且短亚基C-末端与长亚基N-末端很接近以产生正确折叠和活化的酶(Rotonda等，1996，Mittl等，1997，Srinivasula等，1998)。

尽管通常认为导致细胞调亡或坏死的途径完全不同，最近的发现表明代表细胞调亡主要调节物的胱冬酶也以负和正方式包含在坏死中。确实，胱冬酶抑制物CrmA在L929细胞中的过量表达使这些细胞对TNF坏死作用的敏感性提高1000倍(Vercammen等，1998)，表明胱冬酶对TNF诱导的坏死作用的抑制效果。此外，TNFR1-和Fas-相关死亡结构域通过这些配体在细胞调亡诱导中发挥关键作用(Wallach等综述，1999)，近来也提出这些结构域在坏死诱导中发挥重要作用(Boone等，2000)。有趣的是FasL-诱导的肝坏死显示被胱冬酶抑制物阻断(Kunstle等，1997)。

由于胱冬酶调节的蛋白水解是细胞调亡过程中关键和重要的成分[NicholsonD.W.和Thornberry，N.A.(1997)，Villa等，(1997)及Salvesen，G.S.，和Dixit，V.M.(1997)]，鉴定这些蛋白酶的关键下游分子靶对于理解细胞调亡信号转导是必需的。多种结构和信号蛋白显示在细胞调亡死亡中通过胱冬酶切割[Nicholson D.W.和Thornberry，N.A.(1997)，Villa，P.等，(1997)]，包括胱冬酶活化的DNA酶抑制物ICAD，ICAD对于核小体间DNA降解是必需的但对完成细胞调亡不是必需的(Enari，M.等，(1998)和Sakahira等，(1998)。凝溶胶蛋白是一种调节细胞质肌动蛋白凝溶胶(gelsol)转化的肌动蛋白-调节蛋白质(Yin，H.L.和Stossel，T.P.(1979)，参与细胞调亡，其基础是(i)体内细胞调亡中它的裂解[Kothakota，S.等，(1997)](ii)通过它的过量表达预防细胞调亡[Ohtsu，M.等，(1997)]和(iii)通过一种裂解产物诱导细胞调亡[Kothakota，S.等，(1997)]。凝溶胶蛋白具有Ca+2活化的多种活性，切断肌动蛋白丝且盖在丝快速生长的末端上，也使肌动蛋白聚合成核[Yin，H.L.和Stossel，T.P.，(1980).Kurth，M.，和Bryan，J.(1984)，Janmey，P.A.，和Stossel，T.P.(1987)]。

专利申请WO 0039160揭示了胱冬酶-8相互作用蛋白质，能与胱冬酶-8的Sub-1和/或Sub-2相互作用。胱冬酶-8相互作用蛋白质用胱冬酶-8单链构建物通过双杂交发现。

专利申请WO 9830582(Jacobs等)揭示了分泌或膜蛋白DF518_3的核苷和预测氨基酸序列，DF518_3分离自人成熟脑cDNA文库。蛋白质用对编码分泌蛋白的cDNA具选择性的方法来鉴定(US 5,536,637)，也在计算机分析编码蛋白质氨基酸序列的基础上被鉴定为编码分泌或膜蛋白。根据本发明的蛋白质的位置(胞内对膜/分泌)和其氨基酸序列(残基230E相对G中有一个非保守氨基酸变化)与DF5182_3不同。在WO申请中，许多没有任何数据支持的非相关活性归于DF518_3。

发明概述

本发明涉及能与胱冬酶原或突变蛋白或其片段相互作用的胞内多肽(Cari)，多肽包括SEQ ID NO：3、或同工型、DF5182_3以外的突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的多肽在体外和体内可被胱冬酶切割，优选胱冬酶-8。

此外，本发明提供对内源Cari多肽活性有显性失活作用的Cari多肽突变蛋白和能抑制或增加胱冬酶细胞毒性作用的突变蛋白，胱冬酶-8更优选。

在一个实施方案中，本发明提供不能裂解的Cari突变(Cari D600E)多肽，其中Cari多肽中残基D600的氨基酸残基被谷氨酸残基取代。此多肽能增加胱冬酶-8的细胞毒性作用。在另一个实施方案中，本发明提供获自Cari的肽，能结合胱冬酶-8，例如包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

此外，本发明提供的DNA序列编码Cari多肽或同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白(例如Cari D600E)、融合蛋白或其衍生物，提供的DNA序列能在适度严格条件下与编码Cari多肽或同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白或其衍生物的DNA序列杂合，或与对应于SEQ ID NO：2的DNA序列杂合。

更具体的是本发明提供编码SEQ ID NO：3多肽的DNA序列。本发明也提供不能裂解的Cari突变(Cari D600E)DNA和编码肽的DNA(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4)。此外，本发明同样提供核酶和反义寡核苷酸，反义寡核苷酸包括至少9个对应于上面DNA序列的核苷，优选SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的反义寡核苷酸。

本发明也提供包括DNA序列的载体，DNA序列编码Cari多肽或其同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白或其衍生物，提供生成Cari多肽或其同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白或其衍生物的方法，这是通过在原核或真核宿主细胞中导入所述载体且使细胞生长并分离生成的蛋白质，优选哺乳动物、昆虫或酵母细胞，更优选的细胞选自海拉细胞、293THEK和CHO细胞。

此外，本发明提供编码Cari多肽或其同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白、核酶、反义寡核苷酸或其衍生物的病毒载体和它将Cari多肽、同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白导入哺乳动物细胞的用途。

另外，本发明提供的载体适于靶向调节序列，此序列在细胞中用于活化内源Cari或抑制Cari表达。

另一方面，本发明提供多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、完全人源化的抗体、抗-抗Id抗体或者它针对Cari多肽或其同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白或其衍生物的抗原表位的片段以及提供它的用途用于诊断目的或发展检测生物流体中Cari多肽或其同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白、融合蛋白或其衍生物的免疫测定。

此外，本发明提供的宿主选自原核或真核细胞，优选海拉细胞、293THEK和CHO细胞，包括编码Cari的载体以及生成Cari或其同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的方法。另外，本发明提供生成Cari或其同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的方法，包括产生转基因动物和分离生成自动物体液的蛋白质。

一方面，本发明提供用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病(oligodendrogliopathy)的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎(uveoretinitis)、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病的基因治疗方法，包括诱导表达Cari或突变蛋白(例如Cari D600E)、片段(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4)、优选SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7的反义以及在有此需要的人类患者所需位置上Cari的核酶。

此外，本发明提供的治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病的方法包括调节内源Cari或Cari抑制物，通过靶向有DNA调节序列的载体，调节序列在细胞中功能是在有此需要的人类患者所需位置上使内源基因活化Cari或内源Cari抑制物。

另外，本发明提供使用Cari多肽、突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)、融合蛋白或其衍生物、反义(例如SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7)；编码Cari和其片段的载体以及抗Cari抗体用于负调节胱冬酶，这是在细胞调亡引起过度细胞死亡的情况下，例如通过诱导TNF受体信号途径。

本发明进一步提供使用用Cari多肽、突变蛋白(例如Cari D600E)、同工型、等位基因变体、或片段、融合蛋白或其衍生物、编码Cari和其片段的载体、编码Cari和其片段和突变蛋白的载体、包括编码Cari的DNA或片段或突变蛋白的载体、用于内源Cari活化的载体，以及在需要过度细胞死亡的情况下抗个体基因型Cari抗体用于上调胱冬酶活性和增加细胞调亡。

另一方面，本发明提供的药物组合物含有治疗有效量的Cari多肽、或突变蛋白(例如Cari D600E)、同工型、等位基因变体、片段(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4)、融合蛋白或其衍生物、编码Cari或突变蛋白或片段的DNA或载体、用于内源活化Caride或其抑制物的载体、反义、核酶或Cari特异抗体，用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病。

另外，本发明提供的药物组合物含有治疗有效量的Cari多肽、或突变蛋白(例如Cari D600E)、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物、编码Cari或突变蛋白或片段的DNA或载体、用于内源活化Cari的载体、或Cari特异抗个体基因型抗体，用于治疗癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供的药物组合物含有治疗有效量的Cari抑制物，用于治疗或预防Cari活性参与的疾病。

本发明进一步提供方法用于分离、鉴定和克隆同种类Cari的另一个多肽，包括使用编码Cari或突变蛋白或其片段的DNA以筛选DNA文库，或者使用适于共免疫沉淀胱冬酶和结合多肽的胱冬酶特异抗体或用Cari特异抗体从样品中亲和纯化这些多肽，样品选自体液、细胞提取物和DNA表达文库，或者使用Cari多肽或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物作为酵母双杂交过程的捕获物或饵。

本发明也涉及方法用于从样品中分离参与胞内信号过程的多肽或因子，样品选自细胞提取物、人液体和表达文库，包括用识别Cari的抗体共免疫沉淀Cari和参与胞内信号过程的多肽或因子。

此外，本发明提供方法用于筛选拮抗Cari的肽或小分子，包括高通量筛选和选择这些分子，分子能抑制Cari与胱冬酶原-8或突变蛋白(例如Cari D600E)、同工型、等位基因变体、片段(例如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5)、融合蛋白或其衍生物相互作用，或者选择能抑制细胞调亡的分子，细胞调亡由Cari或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物增强。

另外，本发明治疗和/或预防疾病的方法，疾病选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎和癌症，方法包括施用治疗有效量的Cari多肽或突变蛋白(例如Cari D600E)、同工型、等位基因变体、片段(例如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)、融合蛋白或其衍生物、或者编码Cari或突变蛋白或其片段的DNA或载体、或者用于内源基因活化Cari或Cari抑制物的载体、或Cari特异抗体给需要的病人。

附图概述

图1显示胱冬酶原-8的氨基酸序列。用于制备Mabs的胱冬酶-8的肽序列以粗体和下划线表示。

肽179-对应于胱冬酶-8大亚基C-末端的肽CQGDNYQKGIPVETD(Sub-1)。

肽182-对应于胱冬酶-8小亚基N-末端的肽LSSPQTRYIPDEAD(Sub-2，残基赖氨酸385-甘氨酸399)。

肽183-对应于Sub-1 N-末端的肽SESQTLDKVYQMKSKPR(残基丝氨酸217-甘氨酸234)。

图2显示用抗抗原表位179的单克隆抗体在BJAB细胞裂解物中发现的微量胱冬酶-8的有效免疫沉淀。从左到右显示用不同抗体通过免疫沉淀从BJAB细胞裂解物(制备前-，后+，Fas受体刺激)中取出胱冬酶-8。

泳道3和4是Mab179：制备的单克隆抗体，抗对应于Sub-1 C-末端的肽(胱冬酶-8大亚基，残基半胱氨酸360-天冬氨酸374)。

泳道5和6是Mab183.1且泳道7和8是Mab183.2，它们是制备的两种单克隆抗体，抗对应于Sub-1 N-末端的肽(残基丝氨酸217-甘氨酸234)。

泳道9和10是Mab182，它是制备的单克隆抗体，抗对应于Sub-2 N-末端的肽(胱冬酶-8小亚基)(残基赖氨酸385-甘氨酸399)。

泳道11是NMS-正常小鼠血清。

图显示用所示抗体免疫沉淀后细胞裂解物中剩余胱冬酶-8量和总细胞裂解物中量的蛋白质印迹评估(泳道1和2)。

图3a显示如图2中免疫沉淀的胱冬酶-8的洗脱，这是通过与肽竞争，多种抗体抗此肽产生。来自所示抗体产生的免疫沉淀的洗脱液中的胱冬酶-8用蛋白质印迹分析检测(如图2)。

图3b显示如图2中免疫沉淀的胱冬酶-8的洗脱，这是通过与肽竞争，多种抗体抗此肽产生。来自所示抗体产生的免疫沉淀的洗脱液中的胱冬酶-8用银染显示。

图4显示用多克隆抗体血清在BJAB细胞裂解物中发现的微量胱冬酶-8的有效免疫沉淀，血清通过用对应于Sub-1 C-末端的肽(胱冬酶-8大亚基，残基半胱氨酸360-天冬氨酸374)来免疫制备。从左到右显示用不同抗体通过免疫沉淀从BJAB细胞裂解物(制备前-，后+，Fas受体刺激)中取出胱冬酶-8。用下列抗体免疫沉淀后裂解物中剩余胱冬酶-8用蛋白质印迹分析检测：

泳道3和4是NMS-正常小鼠血清。

泳道5和6是抗179多克隆抗体、制备抗Sub-1 C-末端(胱冬酶-8大亚基，残基半胱氨酸360-天冬氨酸374)的兔多克隆抗体。

泳道7和8是Mab182。

TL-总细胞裂解物。

图5显示用多种抗体从非刺激BJAB细胞裂解物中免疫沉淀和洗脱的胱冬酶-8。从左到右显示用下列抗体免疫沉淀洗脱后通过蛋白质印迹分析检测的胱冬酶-8水平：

泳道1是抗Sub-1 N-末端(残基丝氨酸217-甘氨酸234)的抗183血清。

泳道2是Mab183.2，抗对应于Sub-1 N-末端(残基丝氨酸217-甘氨酸234)的单克隆抗体。

泳道3是Mab179，抗Sub-1 C-末端(胱冬酶-8大亚基，残基半胱氨酸360-天冬氨酸374)的单克隆抗体。

通过Mab179新加工模式生成的胱冬酶-8小片段(5.6kDa)以箭头表示。

图6显示在用Fas-配体刺激1小时和肽179洗脱之前或之后从Bjab细胞裂解物中通过Mab179免疫沉淀的胱冬酶-8和胱冬酶-8结合多肽(p72/Cari)。洗脱用Mab179免疫沉淀的胱冬酶-8和结合多肽(如图3b)，SDS-PAGE分离并银染。泳道1和2显示对照，其中细胞裂解物用MIgG1小鼠免疫球蛋白IgG1免疫沉淀。

图7显示p72(CARI)多肽基序的示意图。一个卷曲螺旋基序(C)和两个随机位置的“SURP基序”(S)处于多肽N末端附近，一个“G-膜片”基序位于多肽C末端(G基序)。同样显示G基序内存在的天冬氨酸残基D600。D600-突变体中多肽的残基D600被谷氨酸残基取代。

图8显示用于全长制备p72(Cari)cDNA的方法的示意图。缺乏前21个核苷序列(编码前7个氨基酸)的EST克隆IMAGE 2964545购买自Incyte Genomics，用作第一个聚合酶链式反应(PCR)的模板，与一对引物一起使用：正向引物P2含5’EST克隆的重叠核酸和另外21个缺失核苷中的15个核苷，反向引物P3含3’EST的重叠序列。所得PCR产物用作第一个PCR的模板，与一对引物一起使用：正向引物P1含全部21个缺失核苷和EST的5个核苷，反向引物P3含3’EST的重叠序列。

图9显示零时和Fas-配体刺激20分钟后从Bjab细胞裂解物中通过Mab179共免疫沉淀胱冬酶-8和p72(Cari)。Mab179免疫沉淀后洗脱的多肽在SDS-PAGE中分离并用银染检测。Fas-配体刺激前一条对应于p72(Cari)的带与胱冬酶原-8共沉淀，此带显然具有约72.5kDa的分子量(泳道3)。刺激20分钟后72.5kDa带的水平降低且检测到一条对应于明显更低分子量多肽的新带，约68kDa(泳道4)。

泳道1和2显示的负对照包括用MIgG1小鼠免疫球蛋白IgG1免疫沉淀细胞裂解物。

图10显示活化胱冬酶-8裂解Cari。在³⁵S甲硫氨酸存在时用TnT T7偶联网织红细胞裂解物系统在网织红细胞裂解物中体外表达p72(Cari)cDNA编码的多肽，并在有或没有重组活化胱冬酶-8情况下37℃孵育1小时后试验。此外，Cari裂解用2个不同p72 cDNA突变体编码的TnT产物研究：一个编码Cari，其中猜测是胱冬酶-8靶残基的残基D600突变成E[p72(D600E)]，另一个中缺失基因且所得截短多肽缺少下游残基[D600 p72(1-600)]。所得多肽在SDS-PAGE分离且结果用磷成像(phosphoimaging)显现。

图11显示Fas-配体刺激前(0)或5、10、20、40和60分钟后从Bjab细胞裂解物中通过Mab179共免疫沉淀胱冬酶-8和p72(Cari)。洗脱的肽在SDS-PAGE胶中分离并用银染检测。刺激前(0)检测到明显具72.5kDa分子量的肽。刺激5和10分钟后出现了一个具明显更低分子量的多肽，约68kDa。刺激40分钟后72.5kDa完全消失且仅检测到约68kDa。60分钟时没有上述多肽与胱冬酶-8共沉淀。

图12a显示p72(Cari)对TNF受体-信号途径诱导的细胞调亡死亡的作用。p72(Cari)cDNA(p72)或反义p72(a/s)插入pcDNA3.1表达载体并用插入pcDNA3.1表达载体的p55 TNF受体和表达自pEGFPC1载体的绿色荧光蛋白(GFP)共转染，插入组成型表达T抗原的HEK293细胞[用作没有p72 cDNA插入载体的负对照(pc)]。24小时后，在荧光显微镜下检测转染细胞且通过确定总荧光细胞群中表现细胞调亡形态的细胞数来评估细胞死亡。

图12b显示p72(Cari)过量表达结合Fas-配体刺激诱导的细胞死亡。Cari过量表达对Fas配体调节细胞死亡的作用在组成型表达T抗原的HEK293细胞中监控。实验中细胞共转染载体pcDNA3.1(对照组)或编码Cari或其反义的pcDNA3.1(分别是pc、p72或p72a/s)和编码分泌碱性磷酸酶(SEAP)的载体pSBC-2。24小时后转染细胞用Fas-配体诱导16小时且生长培养基用新鲜生长培养基替换。细胞死亡通过确定下一个24小时中分泌到生长培养基中的SEAP量来测量。

图13显示THC报导中获得的多肽序列间的排列(THC510568 SEQ ID NO：1)，包含所有ESTs的共有序列和所产生全长cDNA预测的多肽(SEQ ID NO：3)。

图14显示Cari不能裂解突变体D600E p72调节的细胞死亡动力学。在对照细胞(B1)、组成型表达转染p72的细胞(B2)和组成型表达转染D600E p72的细胞(B3)中应用Fas配体后监控Bjab细胞的存活。

图15显示Cari中用于结合胱冬酶-8的多肽的最小氨基酸序列。通过详细的缺失研究和与胱冬酶原-8共沉淀来鉴定Cari中用于结合胱冬酶原-8的最小多肽。

图16显示Cari反义分子pSuper-Cari表达诱导的细胞调亡抑制。细胞调亡通过胱冬酶-8(Mach a1)过量表达或融合跨膜的p55 TNF R1胞外部分与Fas受体胞内部分(Cl*)的嵌合体来诱导，这是通过用编码这些多肽的载体进行一些单独转染，Cari反义抑制通过pSuper-Cari(水平填充条)或pSuper-载体(对照，垂直填充条)共转染来评估。

发明详述

本发明涉及结合多肽p72(或Cari)或同工型、突变蛋白、等位基因变体或其片段的胞内胱冬酶。

一方面，Cari结合胱冬酶原-8且增加胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8，另一方面，活性胱冬酶-8裂解Cari，因此Cari活性由活化胱冬酶-8负调节。

除了胱冬酶原-8，Cari可结合不同的胱冬酶、或突变蛋白或其片段并也影响这些胱冬酶的活性。

例如，产生一种不能裂解的Cari突变体(Cari D600E)多肽，其中天冬氨酸600被谷氨酸取代。此多肽诱导的细胞毒性高于野生型。同样，产生获自Cari的小肽(分别是SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的24和16个氨基酸残基)，包含Cari中用于结合胱冬酶-8的结构域。这些肽可抑制Cari结合胱冬酶原-8并因此抑制胱冬酶-8的细胞毒性作用。

为鉴定胱冬酶结合多肽(如Cari)，细胞可在配体刺激(如Fas配体)之前或后裂解且通过适当胱冬酶特异抗体进行免疫沉淀。

产生用于免疫沉淀的适当单克隆抗体，抗来自胱冬酶-8 Sub-1 C-末端结构域的肽。此抗体能与胱冬酶-8结合蛋白(如Cari)一起免疫沉淀且胱冬酶-8和胱冬酶-结合蛋白都能从免疫复合物中有效洗脱并通过与获自胱冬酶的肽竞争在上清中回收，肽最初用于产生抗体。

因此胱冬酶结合多肽可根据本发明共免疫沉淀，这些胱冬酶特异的适当抗体来自样品、表达cDNA文库和基因组或组合肽文库，样品选自静止细胞或刺激细胞的细胞裂解物。

刺激细胞可受淋巴因子影响，例如Fas-配体，TNF受环境因素影响如饥饿、热激等。

可发展抗体抗根据本发明发现的胱冬酶结合蛋白(如Cari)。Cari特异抗体包括其片段，也可用于定量或定性检测样品中的Cari或检测表达Cari的细胞存在。这可通过免疫荧光技术完成，使用光学显微镜偶联的荧光标记抗体(见下)、流式细胞仪或荧光检测。

抗多肽的多克隆抗体产生描述于《免疫学当前进展》(Current Protocols inImmunology，Wiley and Sons有限公司)第2章。产生抗肽的抗体需要对操作进行一些改变，因为与多肽相比肽一般抗原性较低。抗肽的多克隆抗体产生描述于上述《免疫学当前进展》第9章。

制备抗Cari的抗体可用于改变细胞内蛋白质的活性，如通过选择性靶向细胞上的Cari，包括用胞内表达的抗体或抗Cari的胞内抗体转导细胞。胞内抗体的制备示于WO9914353。

单克隆抗体可制备自B细胞，B细胞取自免疫动物的脾或淋巴结，具体是大鼠或小鼠，通过在有利杂交细胞生长的条件下与无限增殖B细胞融合。为融合鼠B细胞，优选细胞系Ag-8。

产生单克隆抗体的技术描述于许多文章和课本，如《免疫学当前进展》(Wileyand Sons有限公司)第2章。其第9章描述了用肽或动物免疫。这些动物的脾或淋巴结细胞可用与多肽免疫动物的脾或淋巴结细胞相同方式使用，用于产生第2章所述单克隆抗体。

产生单克隆抗体的技术进一步由Kohler和Milstein，(1975)以及USP 4,376,110描述。

从人抗体基因库制备抗体描述于USP 5,840,479，其高变区被几乎随机的序列取代。如果用特定肽或多肽免疫动物困难，优选这些抗体。一些结构免疫原型较差且可保持这样，尽管在融合构建物中加入佐剂并连接其它多肽。如果需要使用与人抗体结构类似的抗体，例如当需要抗体在人中具低免疫原性时，更优选USP 5,840,479中所述抗体。

一旦鉴定了适当抗体，需要改变其性质。例如，嵌合抗体可获得更高产量。当需要抗体在人中具低免疫原性时，更需恒定区被人抗体恒定区取代的嵌合抗体。嵌合抗体的生成描述于一些出版物中，如Cabilly等，1984，Morrison等，1984，Boulianne等，1984，EP 125023，EP 171496，EP 173494，EP 184187，WO 86/01533，WO 87/02671，Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，Cold Spring harbor Laboratory，1988。

“完全人源化抗体”是含人免疫球蛋白可变和恒定区的分子。完全人源化抗体可用于治疗用途，其中反复治疗需要用于慢性和复发疾病如自身免疫性疾病。一种制备完全人源化抗体的方法由“人源化”小鼠体液免疫系统组成，即生成能产生人Ig的小鼠品系(异种小鼠(Xenomice))，通过将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入小鼠，其中内源Ig基因失活。Ig基因座在它们的物理结构和基因重排和最终产生广泛免疫应答所需的表达过程方面非常复杂。抗体多样性主要由Ig基因座中存在的不同V、D和J基因间组合重排来产生。这些基因座也包含散布的调节元件，元件控制抗体表达、等位基因排斥、类别转换和亲和成熟。将未重排的人Ig转基因导入小鼠证明小鼠重组机制与人基因相容。此外，分泌多种同种型的抗原特异人mAbs的杂交瘤可通过抗原免疫异种小鼠来获得。

完全人源化抗体和它们的生成方法在本领域已知(Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)；Buggemann等，Eur.J.Immunol.21：1323-1326(1991)；Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727(2000)专利WO 98/24893。

另一类抗体是抗个体基因型抗体。抗个体基因型(抗Id)抗体是识别独特决定簇的抗体，决定簇一般与抗体的抗原结合位点相联。制备Id抗体可通过免疫相同种类和基因型(如小鼠品系)的动物作为制备抗Id的Mab来源。免疫动物识别并对免疫抗体的个体基因型决定簇应答，应答是通过产生这些个体基因型决定簇的抗体(抗Id抗体)。参见例如全部纳入本文供参考的美国专利号4,699,880。

抗Id抗体也可用作“免疫原”以在另一种动物中诱导免疫应答，生成所谓的抗抗Id抗体。抗抗Id抗体也许具有与原始mAb相同的抗原表位，诱导抗Id。因此通过对mAb个体基因型决定簇使用抗体，可能鉴定其它表达相同特异性抗体的克隆。

术语“抗体”也包括完整分子以及其片段，例如能结合抗原的Fab和Fab(ab’)2。Fab和Fab(ab’)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，更迅速的从循环中清除，也许非特异性组织结合少于完整抗体(Wahl等，1983)。

要理解的是Fab和Fab(ab’)2和其它本发明中有用的抗体片段可根据本文所示完整抗体分子的方法用于检测和定量Cari。这些片段一般通过蛋白裂解产生，使用酶如木瓜蛋白酶(以生成Fab片段)或胃蛋白酶(以生成Fab(ab’)2片段)。

如果抗体能与分子特异反应从而使分子结合抗体，抗体被称为“能结合”分子。术语“抗原表位”指任何分子能被抗体结合的部分，此部分也可被此抗体识别。抗原表位或“抗原决定簇”通常由化学活性表面分子组组成如氨基酸或糖侧链，且具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。

本发明中有用的抗体(或其片段)可组织使用，如在免疫荧光或免疫电子显微镜中用于原位检测Cari。完成原位检测可通过从病人中取出组织样本，提供本发明标记抗体给此样本。抗体(或片段)优选通过应用或覆盖标记抗体(或片段)于生物样品来提供。通过使用此过程，不仅能确定Cari多肽的存在，也能确定它在检测组织上的分布。普通技术人员使用本发明认识到可修改多种组织方法(如染色过程)以获得这种原位检测。

这种用于本发明Cari多肽的试验一般包括孵育生物样品例如生物流体、组织提取物、新鲜收集的细胞如淋巴细胞或白细胞或存在可检测标记抗体时组织培养物中孵育的细胞，抗体能鉴定Cari多肽，用任何一种本领域熟知的方法检测抗体。

“生物流体”或生物样品指任何获自或包含细胞、细胞成分或细胞产物的流体。生物流体包括但不限于细胞培养物上清、细胞裂解物、清除的细胞裂解物、细胞提取物、组织提取物、血液、血浆、血清、乳和其组分。

处理生物样品可用固相支持物或载体如硝化纤维或者其它能固定细胞、细胞颗粒或可溶多肽的固体支持物或载体。随后支持物或载体可用适当缓冲液洗，接着如上所示用可检测的标记抗体根据本发明处理。然后固相支持物或载体可用缓冲液洗第二次以去除未结合抗体。随后所述固体支持物或载体上结合标记的量可用常规方法检测。

“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”或“载体”指任何能结合抗原或抗体的支持物或载体。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。载体性质可以是一定程度的可溶或不溶，用于本发明目的。只要偶联分子能结合抗原或抗体，支持物材料可具有几乎任何可能的结构构象。因此，支持物或载体构象可以是球如在珠中、圆柱如在试管内表面或杆外表面。另外，表面可以是平面如薄片、试验片等。优选的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员知道其它用于结合抗体或抗原的适当载体，或能用常规实验确定相同载体。

如上所示，发明的特定抗体的结合活性可根据熟知方法确定。本领域技术人员能用常规实验确定各自的操作和最佳试验条件。

其它这些步骤如洗、搅拌、振荡、过滤等可加入试验，这对于具体情况是惯用或必须的。

方法之一是连接抗体和酶并用于酶免疫测定(EIA)，其中根据本发明的抗体能被可检测的标记。当稍后暴露于合适底物时，此酶依次与底物反应以产生化学部分，该部分可通过分光光度、荧光或视觉方法检测。能用于可检测标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、山葵过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测可通过比色方法完成，使用酶的显色底物。检测也可通过视觉比较底物酶反应程度和类似准备的标准来完成。

检测可用多种其它免疫测定完成。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，能用放射性免疫测定(RIA)检测R-PTP酶。RIA较好地描述于《分子生物实验室技术和生化》(Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology)，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)，具体参考名为“放射性免疫测定和相关技术入门”(An Introduction to Radioimmune Assay andRelated Techniques)的章节，Chard，T.，纳入本文供参考。检测放射性同位素可通过方法如使用计数器或闪烁计数器或放射自显影。

同样能根据本发明用荧光化合物标记抗体。当荧光标记抗体暴露于适当波长的光时，随后由于荧光可检测其存在。最普遍使用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、玫瑰精、藻红蛋白、藻蓝蛋白(pycocyanin)、别藻蓝蛋白、o-邻苯二醛和荧光胺。

抗体也可用荧光发射金属可检测标记，如¹⁵²E或其它稀土属元素。这些金属可用金属螯合基团如二乙基三胺五乙酸(ETPA)附着于抗体。

抗体也可通过偶联到化学发光化合物来可检测标记。随后通过检测化学反应进程中出现的发光来确定化学发光-标记抗体的存在。具体有用的化学发光标记化合物例子是发光氨、异发光氨、theromatic acridinium酯、咪唑、acridinium盐和草酸酯。

同样，生物发光化合物可用于标记本发明抗体。生物发光是生物系统中发现的一类化学发光，其中催化蛋白质增加化学发光反应的效率。生物发光蛋白质的存在通过检测发光存在来确定。用于标记目的的重要生物发光化合物是萤光素、荧光素酶和发光蛋白质。

本发明的抗体分子可适应用于免疫测量分析(immunometric)，也称为“两位点”或“三明治”分析。在典型的免疫测量分析中，一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合固体支持物或载体且加入一定量可检测标记的可溶抗体以检测和/或定量固相抗体、抗原和标记抗体间形成的三元复合物。

通常，优选的免疫测量分析包括“正向”分析，其中结合固相的抗体首先与试验样品接触以通过形成二元固相抗体-抗原复合物从样品中提取抗原。在适当孵育阶段后，冲洗固体支持物或载体以去除存在的流体样品残余，包括未反应抗原，随后接触含未知量标记抗体(作为“报告分子”)的溶液。第二个孵育阶段使标记抗体穿过未标记抗体与结合固体支持物或载体的抗原形成复合物，孵育阶段后固体支持物或载体洗第二遍以去除未反应的标记抗原。

在另一种“三明治”分析中，也可用本法明抗原，使用所谓的“同时”和“反向”分析。同时分析包括单个步骤，结合固体支持物或载体的抗体和标记抗体都同时加入试验样品。孵育完成后，冲洗固体支持物或载体以去除流体样品残余和未形成复合物的标记抗体。随后如常规“正向”三明治分析，确定与固体支持物或载体相连的标记抗体存在。

在“反向”分析中，首先逐步加入标记抗体的溶液到流体样品，接着在适当孵育阶段后加入未标记抗体结合固体支持物或载体。第二个孵育阶段后，以常规方式洗固相用于去除试验样品残余和未反应标记抗原的溶液。随后如“同时”和“正向”分析，确定与固体支持物或载体相连的标记抗体。

免疫测定如RIA或ELISA的产生描述于许多文章、课本和其它出版物中。参考WO 97/03998，48页第4行到52页第27行。发明的免疫测定可有两种一般类型：首先，免疫测定使用固定的Cari多肽或相等肽，可用于定量Cari。第二，免疫测定使用针对Cari多肽抗原标位的固定抗体，可用于定量Cari多肽。

这些测定可用于诊断，如需要Cari和其它参与细胞调亡途径的多肽以评估一些疾病或症状，其中这些途径可能参与。

术语蛋白质和多肽在本发明中可交换。

发明的多肽是72kDa的多肽，发现它特异结合胱冬酶原-8。随后多肽进一步用部分测序和质谱来分析。然后所得序列输入数据库搜索程序并通过计算机搜索确定重叠序列和ESTs。所用程序对所有本领域技术人员是熟知的且包括如GCG(遗传计算机组)包。优选的是，使用搜索功能如来自EMBL服务器(如http：//dove.embl-heidelberg.de/Blast2/)的基本局部排列搜索工具(BLAST)。Blastn命令可用于搜索与鉴定克隆重叠或类似的核苷序列。

另外或除了上述搜索数据库方法，可筛选文库如基因组文库或cDNA文库以鉴定完整克隆。这些筛选方法描述于上述Sambrook等，和Ausubel等。另外或除此之外，可使用以PCR为基础的克隆技术，如迅速扩增cDNA末端(5’和3’RACE，Graham等，1991，和本文参考文献)。

在本实施方案中，在TIGR人基因索引中搜索发现的EST序列并获得THC报告。获得所有ESTs的共有序列THC510568，它吻合这些序列(SEQ ID NO：1)。从表现出与人EST高度类似的小鼠EST判断(约90％同一性)，共有序列缺乏编码第一个甲硫氨酸和随后6个Cari氨基酸的核苷。第一个甲硫氨酸和随后小鼠对应蛋白质的6个氨基酸在小鼠ESTs中不缺失，它们与人类基因组工作草案序列相比以完善人序列。成功获得对应于智人染色体19序列的克隆LINLR-232E12。此克隆证实缺失p72的7个氨基酸。p72蛋白质的全长cDNA通过PCR获得，图示于图8。编码p72的完整DNA被回收、测序(SEQ ID NO：2)并推断氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

发现p72多肽包含三个保守基序(图7)：一个卷曲螺旋基序C基序、两个随机位置的“SURP基序”(也称为“SWAP”基序，图7表示为S)(Denhez F和Lafyatis R1994)，处于多肽N末端附近、一个位于C末端的“G-膜片”(图7表示为G)(AravindL和Koonin EV 1999)。认为SURP和G-膜片基序有助于RNA结合，表明p72的靶可以是RNA分子。因此p72重新命名为Cari(此名字代表具RNA结合基序的胱冬酶-8相关多肽)。因此，本说明书中术语Cari和p72可交换。

对应于全Cari多肽的带在刺激细胞后消失，改为出现一个具更低分子量的新多肽。Cari也许被活化胱冬酶-8裂解的可能性通过体外分析检查，包括孵育重组产生的胱冬酶-8和Cari标记的多肽。Cari可通过将其编码序列导入表达载体并转染入哺乳动物细胞来产生，载体包含强启动子。另外，Cari可用体外翻译系统在体外生成。体外翻译技术对本领域技术人员是熟知的，因此具有试剂和详细操作，如来自Stratagene，La Jolla，USA。

在本实施方案中，Cari用放射性同位素标记。有利的是，当使用同位素标记时，待试验多肽在体外表达且在体外翻译反应中一起加入同位素标记的氨基酸和未标记氨基酸，同位素优选S³⁵。更优选的是，标记氨基酸是S³⁵-甲硫氨酸且标记和未标记氨基酸间的比例从1∶1-约1∶1000。

放射性同位素标记的Cari多肽和重组产生的胱冬酶-8活化酶随后在适当缓冲液中结合且结合足够时间段以发生裂解。优选缓冲液和其它测定优选参数描述于出版物，Boldin等，1996。优选时间段一般在10分钟和几小时间，优选在30分钟和1小时间。

裂解发生后，反应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。干胶且同位素通过照相胶片或磷成像来检测。待试验多肽可以被标记，也可用标记-特异的抗体在蛋白质印迹中检测。

与没有胱冬酶-8的对照反应相比，加入胱冬酶-8的反应中出现其它低分子量的带，表明胱冬酶-8裂解Cari。裂解后检测到的较低分子量带的计算大小提示裂解位点的大致位置。

进行突变分析以发现Cari中精确的残基靶。由于残基600从D突变为E的突变Cari不被胱冬酶-8裂解(p72/Cari D600E突变体)，发现残基D-600是裂解靶。

本发明也涉及编码Cari的DNA序列。此外，本发明进一步涉及的DNA序列编码Cari的生物活性同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段或融合蛋白。通过标准过程制备这些突变蛋白和衍生物(参见例如Sambrook等，1989)，其中编码Cari的DNA序列中可缺失、加入或取代一个或多个密码子，用于产生与天然多肽相比具有至少一个氨基酸残基变化的突变蛋白，除了如WO9830582的多肽DF5182_3，在氨基酸残基230上甘氨酸取代谷氨酸的突变蛋白。

发明的DNA序列编码Cari、同工型、等位基因变体、片段、突变蛋白或衍生物，DNA序列能与获自天然Cari多肽编码区域的cDNA序列杂合，其中这种杂合在适度严格条件下进行且可杂合的DNA序列编码生物活性Cari。因此这些可杂合的DNA序列包括与天然Cari cDNA序列相对高度类似的DNA序列且这样代表Cari-类似序列可以是如编码多种Cari同工型的天然获得序列或编码多肽的天然产生序列，此天然产生序列属于编码具Cari活性多肽的Cari-类似序列。此外，这些序列也可例如包括非天然产生的合成序列，与天然Cari cDNA序列类似但包括一些所需修饰。因此这种合成序列包括所有编码Cari突变蛋白、片段和衍生物的可能序列，它们都具有Cari活性。

如本文所用，严格条件是杂合实验所用温度、非共价阳离子摩尔浓度和杂合溶液中甲酰胺百分比的函数。为确定参与任何特定条件的严格程度，首先使用Meinkoth等，(1984)的公式确定杂合物的稳定性，100％同一性表示为DNA-DNA杂合的溶解温度T_m：

T_m＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是非共价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中G和C核苷的百分比，％form是杂合溶液中的甲酰胺百分比，L是以碱基对表示的杂合物长度。对于每1℃，T_m比100％同一性杂合计算的减小，允许错配的量增加约1％。因此，如果根据Meinkoth公式在具体盐和甲酰胺浓度的特定杂合实验中所用T_m比100％杂合计算的T_m低10℃，即使有上至约10％的错配，仍发生杂合。

“适度严格条件”提供的T_m不比与靶序列发生完美双螺旋的T_m低超过20℃，T_m由上面公式计算或实际测量。没有限制，适度严格(低于计算或测量的杂合T_m15-20℃)条件在低于杂合计算T_m的合适温度使用2XSSC(标准柠檬酸盐)和0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)的洗液。最终的严格条件主要由于洗涤条件，具体是如果所用杂合条件使更不稳定的杂合与稳定杂合一起形成。随后更严格的冲洗条件去除更不稳定的杂合。可与上述适度严格冲洗条件一起使用的普遍杂合条件是在低于T_m约20-25℃的温度在溶液中杂合，溶液含6XSSC(或6XSSPE)(标准磷酸盐-EDTA)、5XDenhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性剂、鲑精DNA片段。如果使用混合探针，优选使用氯化四甲基铵(TMAC)取代SSC(Ausubel，1987，1999)。

为获得多种上述天然产生的Cari-类似序列，可使用标准过程从不同组织中筛选和分离天然获得的DNA或RNA样品，用天然Cari cDNA或其蛋白质作为探针(参见例如Sambrook等，1989列出的标准过程)。

发明的胱冬酶结合多肽可通过用上面的Mab179免疫沉淀来鉴定，Mab179对胱冬酶-8的Sub-1 C-末端结构域特异。然而在上面的免疫沉淀测定中，对Sub-1 C-末端结构域特异的抗体来自除了胱冬酶-8的不同胱冬酶，可用于交换。发明也涉及充分对应于Cari的多肽或蛋白质。术语“充分对应”不仅包括Cari多肽，也包括其突变蛋白的多肽或蛋白质。它们也可包括对应的“融合蛋白”，即多肽包括Cari或其突变蛋白与另一种蛋白质融合且在体液中具有更长的半衰期。因此CARI可与另一种蛋白质融合，例如免疫球蛋白、高分子量的聚合物如聚乙二醇等。

在充分对应于Cari多肽的突变蛋白中，与蛋白质氨基酸序列相互作用的一个或多个胱冬酶-8的氨基酸被另一个氨基酸取代、缺失和/或插入，除了在氨基酸残基230甘氨酸取代谷氨酸的突变蛋白且只要所得多肽表现出与其对应的Cari完全相同或更高的生物活性。

为充分对应于Cari，Cari序列的变化如同工型一般相对较小。尽管变化数量可超过10，优选不超过10个变化，更优选不超过5个，最优选不超过3个这种变化。任何技术可用于发现充分对应于多肽Cari的潜在生物活性多肽，一个这种技术是在编码多肽的DNA上使用常规突变技术，导致一些变化。随后可筛选这些克隆表达的多肽结合胱冬酶-8和/或在控制/调节上述胞内途径中调控胱冬酶-8活性的能力。

“保守”变化不预期改变多肽活性，通常首先被筛选因为不预期它们会完全改变多肽的大小、电荷或构象并因此不预计改变其生物性质。

Cari多肽的保守取代包括一个突变蛋白，其中多肽中至少一个氨基酸残基被不同氨基酸保守取代。这些取代优选根据下面表IA所示列表进行，取代可通过常规实验确定以提供修饰结构和功能性质的合成多肽分子而维持Cari多肽的生物特征。

表IA

原始残基示范取代

丙氨酸甘氨酸；丝氨酸

精氨酸赖氨酸

天冬酰胺谷氨酰胺；组氨酸

天冬氨酸谷氨酸

半胱氨酸丝氨酸

谷氨酰胺天冬酰胺

谷氨酸天冬氨酸

甘氨酸丙氨酸；脯氨酸

组氨酸天冬氨酸；谷氨酰胺

异亮氨酸亮氨酸；缬氨酸

亮氨酸异亮氨酸；缬氨酸

赖氨酸精氨酸；谷氨酰胺；谷氨酸

甲硫氨酸亮氨酸；酪氨酸；异亮氨酸

苯丙氨酸甲硫氨酸；亮氨酸；酪氨酸

丝氨酸苏氨酸

苏氨酸丝氨酸

色氨酸酪氨酸

酪氨酸色氨酸；苯丙氨酸

缬氨酸异亮氨酸；亮氨酸

另外，另一组Cari取代中多肽的至少一个氨基酸残基被去除且一个不同残基根据下表IB插入此位置。可在多肽中进行的取代类型是以不同种类同源多肽间氨基酸变化频率分析为基础，如表1-2，Schulz等，G.E.，《蛋白质结构Springer-Verlag原理》(Principles of Protein Structure Springer-Verlag)，New York，NY，1798以及图3-9，Creighton，T.E.，《蛋白质：结构和分子性质》(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983所示。在这种分析基础上，本文定义了另外的保守取代与下列5组之一交换：

表IB

1.小的脂肪族、非极性或稍有极性的残基：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸(脯氨酸、甘氨酸)；

2.极性负电荷残基和它们的酰胺物：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺；

3.极性、正电荷残基：组氨酸、精氨酸、赖氨酸；

4.大的脂肪族非极性残基：甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸(半胱氨酸)；

5.大的芳族残基：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。

上面括号中的三个氨基酸残基在蛋白质体系中具有特殊作用。甘氨酸是唯一缺乏任何侧链的残基并因此赋予链灵活性。然而这往往促进除了α-螺旋外的二级结构形成。脯氨酸由于其不寻常的几何性质，紧紧限制链且一般趋向促进β-转角-类似结构，这对于蛋白质折叠式重要的。注意到Schulz等，同上合并上面的组1和2。同样注意到酪氨酸由于其氢键潜能，与丝氨酸和苏氨酸等具有重要的亲缘关系。

根据本发明的保守氨基酸取代如上面所示，在本领域已知且预期在氨基酸取代后能维持多肽的生物和结构性质。根据本发明的大部分缺失和取代不产生蛋白质或多肽分子特征的根本变化。“特征”以非包含方式定义以确定二级结构中的变化如α-螺旋或β-片层，以及生物活性的变化如结合胱冬酶-8和/或调节胱冬酶-8对细胞死亡的作用。

蛋白质中氨基酸取代产生的例子可用于获得本发明使用的胱冬酶-8相互作用多肽Cari的突变蛋白，包括任何已知方法步骤如Mark等的美国专利RE 33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等的5,116,943；Namen等的4,965,195；Chong等的4,879,111；Lee等的5,017,691所示，以及美国专利号4,904,584(Shaw等)中所示赖氨酸取代的蛋白质。

除了上面所讨论不显著改变多肽Cari活性的保守取代，导致Cari多肽的突变蛋白生物活性增加的保守取代或更少保守且更随机的变化在发明范围内。

当要确定取代或缺失的实际效果时，本领域技术人员理解取代或缺失等的效果可通过常规的结合和细胞死亡分析来评估。用标准试验的筛选不包括过度的实验。

可接受的Cari突变蛋白保持至少与胱冬酶原-8相互作用的能力，因此调节胱冬酶-8在胞内途径中的活性。在一个实施方案中，发现Cari增加Fas调节的细胞死亡，这可能是通过增加胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8的速度。一旦胱冬酶-8形成，它裂解可能引起其失活的Cari。生成Cari的不能裂解突变蛋白(Cari D600E突变体)且发现它在细胞死亡诱导中比野生型多肽更有效。不能裂解的突变蛋白和优选的p72 D600E突变体可用于一些需要增加胱冬酶-8活性的情况。可生成具有所谓显性失活作用的突变蛋白多肽，即多肽在结合胱冬酶-8或这种结合后的信号或其它活性中有缺陷。突变蛋白可用于例如抑制胱冬酶-8的细胞毒性作用或增加作用，这取决于是否需要增加细胞死亡或细胞存活且取决于这些活性中哪个是通过Cari与胱冬酶-8相互作用来主要调节(见上)，这些突变蛋白与天然Cari多肽竞争用于结合或与胱冬酶-8相互作用。

在遗传水平上，突变蛋白一般通过定点突变编码Cari多肽的DNA来制备，从而产生编码突变蛋白的DNA，之后合成DNA并在重组细胞培养物中表达多肽。突变蛋白一般表现出与天然产生多肽相同或提高的定性生物活性，Ausubel等，《分子生物学当前进展》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublications and Wiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。

因此制备相应Cari或由于已知遗传密码简并性所允许的变化编码相同多肽但不同于天然序列的另外核苷序列可通过定点突变DNA来完成，DNA编码Cari多肽较早制备的突变蛋白或天然Cari多肽。定点突变可产生突变蛋白，通过使用编码所需突变DNA序列的特异寡核苷酸序列以及足够量的相邻核苷以提供具足够大小和序列复杂性的引物序列用于在横贯的缺失连接两侧形成稳定双螺旋。通常，优选约20-25个核苷长度的引物，改变序列每侧有约5到10个互补核苷。一般，定点突变技术在本领域熟知，范例示于出版物如Adelman等，(1983)，全部纳入本文供参考。

要理解的是定点突变技术一般使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点突变的典型载体包括例如M13噬菌体，如描述于Messing等，《关于大分子和重组DNA的第三届克利夫兰会议》(Third Cleveland Symposium on Macromoleculesand Recombinant DNA)，A.Walton，Elsevier编，Amsterdam(1981)，所揭示的全部纳入本文供参考。这些噬菌体可商业购买且它们的使用对本领域技术人员是熟知的。另外，可使用含单链噬菌体复制起点的噬菌体载体(Veira等，Meth.Enzymol. 153：3，1987)以获得单链DNA。

一般，相应定点突变首先通过获得单链载体来进行，载体的序列中含编码相关多肽的DNA序列。携带所需突变序列的寡核苷酸引物通过自动DNA/寡核苷酸合成来合成制备。随后此引物与单链蛋白质序列-包含载体一起退火，接受DNA聚合酶作用如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段，用于完成携带突变链的合成。因此，突变序列和第二条链携带所需突变。此异源双链载体随后用于转化适当细胞如大肠杆菌JM101细胞，选择含重组载体的克隆，重组载体携带突变序列排列。

选择这种克隆后，可取出突变的Cari序列并置于合适载体中，一般是可用于转染适当宿主的转移或表达载体类型。

因此，编码Cari的基因或核酸也可在体外、原位和/或体内检测、获得和/或修饰，通过使用已知的DNA或RNA扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)和化学寡核苷酸合成。PCR可通过重复DNA聚合酶反应来扩增(数量增加)特异DNA序列。此反应可用于取代克隆；所需的是知道核酸序列。为进行PCR，设计与感兴趣序列互补的引物。随后引物通过自动DNA合成来产生。由于可设计引物与基因任何部分杂合，可确立条件使互补碱基对中的错配能被忍受。这些错配区域的扩增可导致突变产物的合成，产生具新性质的肽(即定点突变)。同样参见例如Ausubel等，同上，第16章。

此外，可设计PCR引物以包含新的限制性酶切位点或其它特征如待扩增基因片段末端的终止密码子。扩增基因片段5’和3’末端的限制性酶切位点位置使编码Cari多肽或其片段的基因片段被习惯设计用于连接载体中其它序列和/或克隆位点。

PCR和其它DNA或RNA扩增方法在本领域熟知且在本文所示教授和指南基础上，可根据本发明使用而不需过度实验。DNA或RNA扩增的已知方法包括但不限于聚合酶链式反应和相关扩增过程(参见例如Mullis等的美国专利4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；Tabor等的4,795,699和4,921,794；Innis的5,142,033；Wilson等的5,122,464；Innis的5,091,310；Gyllensten等的5,066,584；Gelfand等的4,889,818；Silver等的4,994,370；Biswas的4,766,067；Ringold的4,656,134；Innis等编，《PCR操作：方法和应用指南》，(PCR Protocols：A Guide to Method and Applications))和RNA调节的扩增，RNA调节扩增将反义RNA用于靶序列作为双链DNA合成的模板(美国专利号5,130,238，Malek等，商标为NASBA)；以及结合DNA扩增使用和抗体标记的免疫-PCR(Ruzicka等，(1993)；Sano等，(1992)；Sano等，(1991)，专利和参考文献的所有内容全部纳入本文供参考。

以类似方式，Cari的生物活性片段(如Cari多肽或其同工型的生物活性片段)可如上面关于Cari突变蛋白所述来制备。适当的Cari片段保持胱冬酶原-8结合蛋白能力且可调节Cari或其它与胱冬酶-8直接或间接相关蛋白质的生物活性。因此，可如上面关于突变蛋白所述来制备Cari片段，此片段具有显性失活或显性阳性作用。要注意的是这些片段代表一类特殊的发明突变蛋白，即它们定义为获自全Cari序列的cari部分(如来自任何一种Cari蛋白质或其同工型)，各个这种部分或片段具有上述所需活性。这类片段可以是例如肽。

类似的，制备衍生物可通过标准修饰Cari多肽、其突变蛋白或片段的一个或多个氨基酸残基，或通过使Cari多肽、其突变蛋白或片段偶联另一个分子如本领域熟知的抗体、酶、受体等。因此如本文所用，“衍生物”涵盖可通过本领域已知方法从功能基团制备的衍生物，功能基团作为残基侧链或N-或C-末端基团出现，它们包括在本发明内。衍生物可具有化学部分如碳水化合物或磷酸残基，只要这个部分具有与Cari多肽相同或更高的生物活性。

例如，衍生物可包括羧基的脂族酯、通过氨与伯胺或仲胺反应产生的羧基酰胺物、用酰基部分形成的氨基酸残基的N-酰基衍生物或游离氨基(如alkanoyl或碳环芳酰基)或用酰基部分形成的游离羟基的O-酰基衍生物(例如丝氨酰或苏氨酰残基)。

术语“衍生物”仅包括不从一个氨基酸变成另一个氨基酸的衍生物，氨基酸属于20种普遍产生的天然氨基酸。

如上所述，裂解试验可用于确定Cari多肽和突变蛋白是否被胱冬酶-8裂解。

在本发明的一个实施方案中，进一步确定裂解位点(D600)是通过制备Cari缺失突变体或点突变并试验各缺失和点突变受上述胱冬酶-8裂解的影响。构建缺失突变体可通过PCR克隆待试验多肽的所需片段，使用编码所述待试验多肽的克隆DNA序列作为模板。随后PCR扩增片段可插入表达载体，其中必须提供ATG起始密码子且优选Kozak序列。表达多肽的更多细节可发现于上述Qiagen的信息，涉及his-标记蛋白质但也涉及一般的蛋白质表达。另一个蛋白质表达的参考文献是上述《当前进展》，具体是第16章。

因此确定待试验多肽的裂解位点可通过制备多种缺失突变体并确定被胱冬酶-8裂解的最小缺失突变体。

另一种确定裂解位点的方法使用肽，肽根据待试验克隆预测的多肽序列来产生。肽可化学合成，如详细描述于Bodanszky和Bodanszky，《肽合成实践》(Thepractice of peptide synthesis)，Springer，New York，ISBN 0-387-13471-9，Bodanszky，《肽合成原理》(The principles of peptide synthesis)，Springer，New York，ISBN 0-387-12359-4。常规的肽合成进一步可从一些商业公司获得，如SynPep公司，Dublin，CA USA和California Peptide Research有限公司，Napa，CA，USA。肽也可与其它蛋白质融合或未融合来生成，这是通过表达编码的重组DNA，如详细描述于上面《当前进展》的第16章。

为将肽用于做待试验多肽裂解位点的图谱，所述多肽的预测氨基酸序列分成区并合成对应于各区的肽。此外，合成的肽包括一个区约一半的氨基酸且进一步包括直接相邻区约一半的氨基酸，以重叠两个区之间的边界。这些区包括5到100个间的氨基酸，优选9到40个氨基酸之间，最优选20到30个氨基酸之间。因此裂解反应后，分析它们可直接通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和UV检测或染色观察，如用考马斯蓝。另外，可标记肽以更容易检测，如通过同位素末端标记(参见例如Shevchenko A.等，1997)。

完成上述肽筛选后，已知包括胱冬酶-8裂解位点的肽可通过重复相同技术来进一步研究，但选择来自被鉴定肽序列的更小区域。

肽的实际裂解位点应符合胱冬酶切割序列XXXD(参见Boldin等，Cell 1996和Nicholson等，1997)。评估肽中各氨基酸的作用，通过制备突变一个氨基酸的肽并试验这些突变肽对胱冬酶-8裂解的敏感性。待突变的氨基酸优选被来自带电非极性氨基酸组的氨基酸取代(参见Lehninger，Biochemistry，Worth，NY，1979，第4章)，最优选来自甘氨酸或丙氨酸。

通过突变关键氨基酸能产生结合胱冬酶原-8但不受其裂解的肽。测试结合可在非变性条件下用丙烯酰胺凝胶电泳通过大小分离肽-胱冬酶-8复合物或用胱冬酶-8特异抗体共沉淀。

待试验的多肽、其肽片段可进一步确定特征，通过将所述多肽或肽导入哺乳动物细胞并测量细胞调亡诱导试剂对所述细胞的作用。

可在哺乳动物细胞中表达Cari多肽或肽，通过将编码Cari的DNA插入含启动子的载体，任选内含子序列和剪接供体/受体信号，更任选含终止序列。这些技术一般描述于上面《当前进展》的第16章。

上面的启动子、内含子和终止序列在哺乳动物细胞中可操作。启动子优选强启动子如上述RSV、CMV或MPSV启动子。启动子也可以是SV40早期启动子(Everett等，1983和其参考文献)或细胞启动子如β-肌动蛋白启动子或ELF-1启动子(Tokushige等，1997)。同样，可使用杂合启动子，如Akagi等，(1997)所述lac操纵子和人ELF-1α启动子间的杂合或者tet操纵子序列和CMV启动子间的杂合(Furth等，1994和其参考文献)。

内含子序列可插入作为完整序列即包括剪接供体和受体位点，可插入需要表达的多肽编码序列。如果这些内含子序列可提高RNA稳定性并因此增加所需多肽生成则插入。原则上，适当内含子序列可选自任何含内含子的基因，优选的内含子序列是β-肌动蛋白启动子、SV40内含子和p55 TNF受体内含子。

内含子序列可包含增强子元件，可提高上述启动子的转录。

通常，内含子序列也包含赋予组织特异表达的转录或翻译控制序列。因此，当需要以组织特异方式表达发明的多肽时，这些内含子序列可有利使用。一个含组织特异性增强子元件的内含子是位于人5-氨基乙酰丙酸合酶2基因内含子8中的红细胞特异性增强子(Surinya等，1998)，用内含子序列增加蛋白质生成的原理讨论以及内含子序列例子由Huang等，1990提供。

转录终止序列和多腺苷酸信号可在DNA 3’末端加入，DNA编码需要表达的多肽。这些序列可在许多或甚至大部分基因中发现。有利的是，可使用SV40多腺苷酸信号(Schek等，1992和其参考文献)。

可使用于在哺乳动物细胞中表达Cari的载体，例如pcDNA3.1载体(Invitrogen)，含CMV启动子以推动编码所需多肽的基因表达，以及有MPSV启动子的pMPSVEH载体。

重组多肽可在细菌或真核(如CHO)的培养宿主细胞或在转基因动物中生成，宿主细胞用编码这些多肽的载体转染。当使用转基因动物时，在它们的乳中产生异源多肽尤其有利。因此乳畜如牛、绵羊和山羊是优选的宿主。参见例如专利说明书WO 88/00239、WO 90/05188、WO 91/02318和WO 92/11757；美国专利号4,873,191；4,873,316和5,304,489，全部纳入本文供参考。

使用待试验多肽的重组表达，目前可评估多肽对细胞调亡信号的作用，细胞调亡信号由胱冬酶调节例如胱冬酶-8。为了此目的，诱导细胞调亡可通过过量表达诱导细胞调亡的蛋白质如p55 TNF、Mort-1蛋白、胱冬酶-8或其相当物；或通过引发p55 TNF、CD120a、CD95、TRAMP/DR3或其等价受体来活化细胞调亡信号。在一个实施方案中，细胞调亡通过p55 TNF过量表达来诱导。

完成受体活化也可通过使受体接触特异配体或通过受体与抗体交联，优选多克隆抗体(参见Engelmann等，1990)。在一个实施方案中，Cari过量表达后用Fas-配体刺激。

一般，用Fas-配体引发受体像CD95需要加入蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺以获得细胞调亡的强信号，过量表达参与细胞调亡信号转导蛋白质的受体胞内结构域则不需要(参见Boldin等，1996)。相反，当Fas-配体刺激给予过量表达Cari的细胞时，不需环己酰亚胺以获得细胞调亡的强信号。细胞调亡的检测、孵育时间和其它细节及此试验参数由上面Boldin等描述。

过量表达Cari的细胞中相对对照细胞的细胞死亡可用一些方法评估，如以DNA断裂或检测细胞调亡特异抗原和抗原表位为基础的方法。检测细胞调亡的试剂和操作可以试剂盒形式从上述Boehringer Mannheim和其它公司获得。

细胞死亡也可通过评估细胞形态来确定。细胞调亡死亡的特征在没有细胞裂解时是波纹细胞膜和细胞收缩。

有利的是，报告基因在哺乳动物中表达以提供成功转染的标记。转染过程本身导致一些细胞死亡，包括没有转染的细胞死亡，优势是仅评估转染的细胞。用于此目的的优选报告基因是绿色荧光蛋白GFP，GFP可用于直接检测而不需颜色反应，此报告基因需要使用荧光显微镜。然而，可使用任何其它已知报告基因，优选基因的产物容易用简单的颜色反应检测，例如lacZ基因容易通过转染细胞与Xgal或类似指示活性β-半乳糖苷酶的试剂孵育来检测，结果能用显微镜评估。

因此，通过仅考虑转染即表达报告基因的细胞和计数表现细胞调亡形态的细胞百分比，能评估具体转染的克隆和表达多肽对细胞调亡的作用。

用于转染和试验细胞调亡的哺乳动物细胞选自海拉细胞、具成淋巴细胞形态的白种人慢性髓细胞(K562)、具成淋巴细胞形态的人T细胞淋巴瘤(Hut78)、具成淋巴细胞形态的黑人Burkitt淋巴瘤(Raji)、具成淋巴细胞形态的Namalwa-人Burkitt淋巴瘤(Nalm)、具前髓细胞形态的白种人前髓细胞白血病(HL-60)、具成淋巴细胞形态的急性成淋巴细胞白血病(CEM)和具成淋巴细胞形态的人T细胞(H9)以及优选过量表达T抗原细胞的人胚肾(HEK)293细胞。转染优选用上面《当前进展》中所述磷酸钙方法进行。细胞形态如果在转染后1-150小时评估，优选转染后4-35小时且最优选转染后24小时。

根据发明也考虑使用载体以诱导和/或提高Cari内源生成或通常沉默的Cari抑制物。载体可包括在细胞中发挥作用的调节序列，细胞需要表达Cari或Cari抑制物。这种调节序列可以是例如启动子或增强子。随后调节序列可通过同源重组导入基因组的正确基因座，从而可操作连接调节序列和需诱导或增加表达的基因。此技术通常称为“内源基因活化”(EGA)并描述于如WO 91/09955。

本领域技术人员要理解的是也能用相同技术关闭Cari表达，即通过导入负调节元件如沉默元件到Cari基因座，从而负调节或预防Cari表达。本领域技术人员理解这种Cari表达的负调节或沉默与使用Cari抑制物预防和/或治疗疾病有相同效果。

通过发明方法筛选胱冬酶结合多肽中获得的克隆可以是部分克隆。如果需要，完整克隆的产生进一步描述于上。完整克隆和最初在发明筛选中发现的部分克隆的DNA序列可有多种用途。

例如，为操作Cari表达，需要在细胞中生成反义RNA。为此目的，编码Cari多肽的完整或部分cDNA，优选9个核苷，如上所示插入含启动子的表达载体。因此cDNA 3’末端插入启动子3’末端邻近，所述cDNA使cDNA 5’末端与启动子3’末端分开。在细胞中表达cDNA时，因而产生的反义RNA不能编码多肽。细胞中反义RNA的存在降低Cari细胞(基因组)拷贝的表达。

为生成反义RNA，可使用完整cDNA。另外，可使用其片段，优选在约9和2，000个核苷长度间，更优选在15和500个核苷间，最优选在20和150个核苷间。

合成寡核苷酸可用作反义寡核苷酸。寡核苷酸优选是DNA寡核苷酸。反义寡核苷酸长度优选在9和150个核苷间，更优选在12和60个间，最优选在20和50个间，例如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中的序列。

反义RNA作用机制和反义工具使用技术的当前状况由Kumar等，Microbiol MolBiol Rev.62，1415-1434页，1998综述。使用反义寡核苷酸抑制BMP受体合成由Yeh等，1998描述。使用反义寡核苷酸抑制取决于电压的钾通道基因Kvl.4合成由Meiri等，1998描述。使用反义寡核苷酸抑制Bcl-x合成由Kondo等，1998描述。

反义药物的治疗用途讨论于Stix 1998、Flanagan，1998、Guinot和Temsamani，1998和其参考文献。

当设计反义寡核苷酸时，一般使用增强所需性质的寡核苷酸修饰。例如，使用硫代磷酸键代替DNA中天然产生的磷酸酯键，主要由于这种硫代磷酸寡核苷酸更不倾向于被细胞酶降解。Peng等教授了当使用混合磷酸酯-硫代磷酸主链时，可减少不需要的硫代磷酸寡核苷酸体内副作用。优选的是，在60％寡核苷酸中使用2’-甲氧基核糖核苷酸修饰。这种修饰的寡核苷酸能引起的反义效果可与用硫代磷酸寡核苷酸观察到的效果相比。Peng等进一步教授不能支持核糖核酸酶的寡核苷酸突变蛋白是失活的。

因此，发明的优选反义寡核苷酸具有混合磷酸酯-硫代磷酸主链。更优选在约30到80％的寡核苷酸中使用2’-甲氧基核糖核苷酸修饰，最优选约60％。

更多的修饰可引入反义寡核苷酸。例如，寡核苷酸分子可连接基团，基团含任选部分未饱和脂肪族烃链和一个或多个极性或带电基团如羧酸基团、酯基和醇基(aclohol)。另外，寡核苷酸可连接肽结构，优选膜向(membranotropic)肽。这种修饰寡核苷酸更容易渗透膜，这对于它们的功能是关键的并因此显著提高它们的活性。膜渗透性尤其需用于要到达脑的反义药物。棕榈酰-连接的寡核苷酸由Gerster等，1998描述。香叶醇-连接的寡核苷酸由Shoji等，1998描述。连接肽如膜向肽的寡核苷酸和它们的制备由Soukchareun等，1998描述。反义药物或其它药物的修饰由Wang，J 1998描述，修饰使分子靶向确定细胞且提高所述细胞对寡核苷酸的吸收。

已知基因的mRNA序列则可设计核酶，核酶是特异结合和裂解所述mRNA序列的RNA分子(参见例如Chen等，1992，Zhao和Pick，1993，Shore等，1993，Joseph和Burke，1993，Shimayama等，1993，Cantor等，1993)。

因此，可设计编码核酶的RNA序列以裂解发明Cari多肽的mRNA。裂解点优选位于编码区或5’非翻译区，更优选位于AUG翻译起始密码子附近编码区的5’部分。

根据发明编码核酶的DNA可导入细胞，这是通过DNA吸收、修饰DNA的吸收(参见如本文下面所述导致膜渗透性提高的寡核苷酸和蛋白质修饰)、或如本文下面详述的病毒载体调节的基因转移。

因此，本发明提供Cari、由此获得的肽、突变蛋白、特异抗体、编码蛋白质的DNA、核酶、反义DNA分子和寡核苷酸。这些工具的治疗或研究相关用途使它们必须导入活生物体的细胞。为此目的，需要改进肽、多肽和寡核苷酸的膜渗透性。

亲脂结构的衍生可用于产生膜渗透性提高的肽和多肽。例如，如上所示已知的膜向肽序列可加入肽或多肽序列。此外，肽或多肽可通过部分亲脂结构来衍生，如上述用至少一个极性或带电基团取代的烃链。例如，肽的月桂酰衍生物由Muranishi等，1991描述。如Zacharia等，1991所述，进一步的肽和多肽修饰包括甲硫氨酸残基氧化从而产生亚砜基。Zacharia和同时也描述了肽或衍生物，其中相对疏水的肽键被其酮亚甲基酮异酯(ketomethylene isoester)(COCH2)取代。这些和其它多肽和肽化学领域技术人员已知的修饰提高膜渗透性。

另一种提高膜渗透性的方法是在细胞表面使用受体如病毒受体，用于诱导细胞吸收肽或多肽。此机制常为病毒使用，病毒特异结合一些细胞表面分子。结合后细胞将病毒吸收到其内部。细胞表面分子称为病毒受体。例如，整合蛋白分子CAR和AdV被描述为腺病毒的病毒受体，参见Hemmi等，1998和其参考文献。CD4、GPR1、GPR15和STRL33分子被鉴定为HIV的受体/辅受体，参见Edinger等，1998和其参考文献。

因此，肽、多肽或寡核苷酸与已知结合细胞表面受体的分子缀合会增加所述肽、多肽或寡核苷酸的膜渗透性。形成缀合物的适当基团例子是糖、维生素、激素、细胞因子、脱唾液酸糖蛋白等分子。Low等，USP 5,108,921描述了这些分子用于增加肽、多肽和寡核苷酸膜渗透性的用途以及所述缀合物的制备。

Low和同事进一步教授了分子如叶酸或生物素可用于使缀合物靶向生物体中多种细胞，这是由于这些分子的受体丰富和非特异表达。

上面细胞表面蛋白提高发明肽、多肽或寡核苷酸膜渗透性的用途也可用于使所述发明的肽、多肽或寡核苷酸靶向确定细胞类型或组织。例如，如果需要靶向癌细胞，优选使用那些细胞表面表达更丰富的细胞表面蛋白。例子是叶酸受体、粘液素抗原MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B和MUC7、糖蛋白抗原KSA，、癌胚抗原、前列腺-特异膜抗原(PSMA)、HER-2/neu和人慢性促性腺激素-β。上面Wang等，1998教授了使用叶酸靶向癌细胞，Zhang等，1998教授了上述多种类型癌和正常细胞中各其它抗原的相对丰度。

因此发明的肽、多肽或寡核苷酸可使用上述缀合技术如所需地靶向确定细胞类型。例如，如果需要增加淋巴细胞谱系细胞中的细胞调亡，发明的Cari肽、其片段、突变体和衍生物可靶向这些细胞，例如通过使用这些细胞上表达的MHC II型分子。这可通过使抗体或其抗原结合位点偶联发明的多肽或肽来获得，抗原结合位点定向抗所述MHC II型分子的恒定区。此外，描述了用于多种细胞因子和其它细胞通讯分子的许多细胞表面受体，许多这些分子或多或少以组织-或细胞-类型限制的方式表达。因此，当需要靶向T细胞亚群时，CD4 T细胞表面分子可用于产生发明的缀合物。CD4-结合分子由HIV病毒提供，HIV病毒表面抗原gp42能特异结合CD4分子。发明的Cari、突变体或肽增加细胞调亡，可有利的靶向T细胞治疗忍受自身免疫反应的病人如红斑狼疮病人，自身免疫反应以T细胞为基础。

发明的多肽、肽和反义序列可通过病毒载体导入细胞。为了此目的使用的牛痘载体详细描述于上面的《分子生物当前进展》的第16章。腺病毒的使用描述于例如Teoh等，1998，Narumi等，1998，Pederson等，1998，Guang-Lin等，1998，和其参考文献，Nishida等，1998，Schwarzenberger等，1998和Cao等，1998。逆转录病毒转移反义序列由Daniel等，1998描述。

为治疗和/或预防Cari参与的疾病，如果需要抑制细胞调亡，基因治疗载体包括抑制Cari的序列，或如果需要增加细胞调亡，载体另外包括Cari序列，载体分别用于抑制或诱导Cari生成和/或肌动蛋白，例如可直接注入患病关节从而预防全身施用基因治疗载体涉及的问题，像载体稀释、到达和靶向靶细胞或组织和副作用。

当使用病毒作为载体时，病毒表面蛋白一般用于靶向病毒。许多病毒如上述腺病毒在细胞定向中相当非特异，需要用细胞-类型或组织-特异启动子赋予更多的特异性。Griscelli等，1998教授了使用心室-特异的心肌浆球蛋白轻链2启动子以心脏-特异靶向基因，基因转移由腺病毒调节。

另外，可改造病毒载体以在其表面表达另外的蛋白质，或可改变病毒载体的表面蛋白以包括所需肽序列。因此可改造病毒载体以表达一个或多个另外的抗原表位，抗原表位能用于靶向所述病毒载体。例如，细胞因子抗原表位、MHC II型结合肽或来自寻靶分子的抗原表位可根据发明的教授用于靶向病毒载体。

因此通过在人类患者所需位置降低或增加内源Cari量，Cari可用于基因治疗。

Cari与胱冬酶-8的相互作用有一些可能的结果：

首先，调节细胞调亡。这在本文体内试验中证明，其中过量表达Cari加强细胞调亡。细胞调亡由p55TNFR过量表达、p72过量表达或Fas-配体刺激来诱导。在一个实施方案中，不能裂解的突变体p72 D600E显示在Fas-配体细胞死亡增强中比野生型Cari更有效。对此结果一个可能的解释是Cari参与胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8。因此，不能裂解的Cari连续诱导胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8并增加细胞调亡，不像野生型Cari，野生型Cari可被逐步裂解并由活性胱冬酶-8使其失活。Cari具有RNA结合基序，因此其作用机制也许包括不同mRNA转录本翻译速度和/或周转的变化，从而影响参与调节细胞死亡的关键蛋白质。

第二，可调节Cari活性。这在本文中通过胱冬酶-8裂解Cari的能力来证明。可能Cari通过裂解失活。然而也可能Cari活性改变，诱导新活性，或Cari多肽通过裂解活化，如胱冬酶本身。

因而，Cari、突变体优选Cari/p72 D600E突变体、肽，例如Cari中胱冬酶-8结合结构域，包括氨基酸残基414-437(SEQ ID NO：4)和残基422-437(SEQ ID NO：5)、寡核苷酸如反义cari和Cari特异抗体可用于调节胱冬酶-8和细胞调亡。

在细胞调亡引起过多细胞死亡的情况下需要负调节胱冬酶-8。例如，炎性疾病如带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、不论病因的急性肝功能衰竭、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎，表明身体组织的破坏由细胞调亡信号引起。因此，在被细胞调亡死亡破坏的细胞中下调胱冬酶-8活性对于患这些疾病的病人是有益的。

类似的，发明的肽或多肽如Cari 414-437和Cari 422-437可靶向其它细胞类型，这些细胞参与上列其它疾病和另外疾病，在另外疾病中过度细胞调亡死亡显示调节身体组织中观察到的损伤。

上调胱冬酶-8活性和通过Cari增加细胞调亡可用于需要过度细胞死亡的情况。

例如在上面少突神经胶质病中，需要抑制少突细胞中的胱冬酶-8活性。细胞表面G-蛋白-偶联磷脂溶血磷脂酸受体在少突细胞和多种其它脑细胞中表达，但不在其它身体组织中表达。由于一个实施方案证明TNF受体信号途径或取决于胱冬酶-8的细胞调亡需要CARI活性，Cari小肽例如24个氨基酸的Cari多肽(Cari 414-437)结合胱冬酶-8，可靶向少突细胞以抑制胱冬酶-8调节的细胞调亡。这可通过所述肽或多肽偶联磷脂溶血磷脂酸或通过将特异识别所述磷脂溶血磷脂酸受体的抗体序列导入病毒载体，从而所述病毒载体特异结合所述磷脂溶血磷脂酸受体。

同样，发明的反义RNA、反义寡核苷酸，具有的序列来自人Cari cDNA如AAGAGGATAAGGTAGAGCTCC(1169-1190)(SEQ ID NO：6)和/或来自3’-非翻译区AATGACCAACCGTCCCTGGAC(3’26-47bp)(SEQ ID NO：7)、核酶可类似的靶向上面少突细胞或其它疾病中的对应细胞。在此情况下，Cari多肽表达被抑制，而不是胱冬酶-8自身表达。抑制Cari表达可减少胱冬酶-8的细胞调亡作用。然而，Cari多肽表达确实能增加胱冬酶-8作用，一些内源Cari多肽能作为胱冬酶-8活性的负调节物。因此在考虑这些试剂用于治疗前首先必须测试使用反义寡核苷酸和反义RNA以及核酶的效果，如上述测定。

另一方面，有一些情况需要增加胱冬酶-8活性。这可能是上述相同疾病中的情况，如全身红斑狼疮。然而待靶向的细胞类型不同。例如，在狼疮中，T细胞群可包含在胸腺中不被破坏的自身反应细胞。因此，发明的胱冬酶-8上调剂应靶向T细胞。优选使胱冬酶-8上调剂靶向自身反应细胞。在一些疾病中如多发性硬化，认为一些T细胞克隆在疾病发展中发挥关键作用。因而，根据发明的胱冬酶-8上调剂可靶向这些细胞，通过使用一个或多个抗体以靶向发明的胱冬酶-8上调剂，抗体特异针对自身反应T细胞克隆的T细胞受体可变区，胱冬酶-8上调剂可以是根据发明的Cari多肽、突变体或肽。

通过Cari增加胱冬酶-8活性和细胞调亡也可用于治疗癌症。

本发明包括的药物组合物所含活性物质选自一个或多个根据发明的Cari多肽、突变体优选p72 D600E、肽例如包括414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)和422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)、编码这种Cari的载体、其突变蛋白和片段、cari特异抗体、核酶、反义RNA或反义寡核苷酸。

活性蛋白质的治疗有效量是许多变量的函数，如施用途径、病人的临床情况。

“治疗有效量”是施用时Cari或其拮抗物表现出生物活性。施用给个体的剂量，如单或多剂量，取决于多种因素而变化，包括药物动力学性质、施用途径、病人情况和特征(性别、年龄、体重、健康、尺寸)、症状程度、同时的治疗、治疗频率和所需效果。调节和操作确立的剂量范围很好地在本领域技术人员能力范围内，确定对个体效果的体外和体内方法也如此。

发明进一步包括的药物组合物含能感染哺乳动物细胞的病毒载体，其中所述载体包括可操作连接的启动子和发明的DNA序列，此序列编码根据发明的Cari、突变体(如p72 D600E)、肽(如Cari 414-437或Cari 422-437)、核酶、反义RNA、反义寡核苷酸或Cari抗体。病毒载体可任选包括可操作连接启动子的编码序列，编码位于病毒表面上的肽或蛋白质且能结合哺乳动物细胞的表面蛋白。表面蛋白优选能吸收病毒载体且优选以组织-或细胞-类型特异方式表达的蛋白质，从而能靶向病毒载体。

也可使用根据发明的Cari、其突变蛋白、片段或衍生物、p72 D600E突变体、肽Cari 414-437或Cari 422-437、核酶、反义RNA、反义寡核苷酸或Cari抗体以分离、鉴定和克隆其它相同种类的多肽即结合胱冬酶-8的多肽，或用于分离参与胞内信号过程的功能相关蛋白酶或蛋白质。

为此目的，可使用上面的免疫沉淀系统或使用一个发展的系统，此系统用非严格的Southern杂交，接着用PCR克隆(Wilks等，1989)。在Wilks等的出版物中描述了鉴定和克隆两个假定的蛋白质-酪氨酸激酶，通过应用非严格的Southern杂交，接着用以已知激酶基序序列为基础的PCR克隆，此序列认为是激酶序列。可根据本发明使用该方法，Cari多肽序列用于鉴定和克隆Cari多肽相关序列。

另一种利用发明的Cari多肽、突变蛋白、片段或其衍生物或Cari抗体的方法是在亲和层析方法中使用它们以分离和鉴定它们能结合的其它多肽或因子，如其它参与胞内信号过程的多肽或因子。Cari、其突变蛋白、片段或其衍生物、Cari抗体可以单独附于亲和层析基质并随后接触细胞提取物、人液体或怀疑参与胞内信号过程的分离多肽或因子。亲和层析过程后，结合发明Cari多肽、或其突变蛋白、片段或其衍生物的其它多肽或因子可被洗脱、分离和确定特征。

本发明也涉及使用Cari和其肽如Cari中的胱冬酶-8结合结构域(残基414-437或残基422-437)或Cari抗体用于制备具潜在治疗价值的Cari拮抗分子。这些方法包括使用Cari和其片段用于分离天然拮抗物、小肽拮抗物和非肽的化学拮抗物。高通量筛选使用自动机器测试数千种化合物(肽或化学化合物，如通过组合化学产生)抗Cari靶的结合活性。测试化合物不仅可通过组合化学获得，也可来自其它高通量合成方法。自动化技术能迅速合成分子库、大量收集能被筛选的不同化合物。也可筛选化合物对Cari或Cari(414-437)和胱冬酶-8相互作用的抑制。检测拮抗分子也可通过它们抑制Cari结合胱冬酶原-8或抑制细胞死亡的能力，细胞死亡由Cari、胱冬酶-8或TNF受体家族配体调节。生成更大和更多样的化合物库增加在库内发现有用药物的可能性。

如上所述，Cari、其突变蛋白、片段或其衍生物也能用作免疫原(抗原)以产生它的特异抗体。这些抗体也可用于从细胞提取物或从转化细胞系培养基中纯化Cari多肽，细胞系生成Cari多肽、或其突变蛋白或片段。此外，这些抗体可用于诊断目的以鉴定与胱冬酶-8调节FAS或TNF系统异常功能相关的疾病。因此，这些疾病应与胞内信号系统错误相关，系统包括胱冬酶-8或Cari多肽，这些抗体作为重要的诊断工具。这些用Cari产生的抗体也可具治疗价值，具体是完全人源化抗体(如胞内抗体，见上)。

要注意的是根据发明或一种相同种类的多肽的分离、鉴定和确定特征可用任何熟知的标准筛选过程进行。例如，这些筛选过程之一，酵母双杂交过程(参见Stanger等，1995)。同样如上和下面所示，可使用其它过程如本领域熟知的亲和层析、DNA杂交过程等以分离、鉴定和确定发明多肽的特征或分离、鉴定和确定另外多肽、因子、受体等的特征，它们能结合发明的多肽。

描述发明后，参考下列例子更容易理解发明，例子通过阐述提供且不想要限制本发明。

实施例

实施例1：

免疫小鼠用于产生胱冬酶-8特异的单克隆抗体

活化后，胱冬酶-8被裂解并装配在两个亚基中(Sub-1和Sub-2)。

为产生胱冬酶-8活化后可能形成的新抗原表位的特异抗体，获自Sub-1 C-末端和Sub-1与Sub-2 N-末端的合成肽可用于免疫小鼠。

下列肽用于免疫小鼠以产生单克隆抗体：

肽179-对应于胱冬酶-8大亚基C-末端的肽CQGDNYQKGIPVETD(Sub-1)(对应于残基半胱氨酸360-天冬氨酸374的抗原表位，图1)，合成纯化通过反相HPLC和经其天然半胱氨酸偶联到载体KLH，以使肽暴露于载体表面。

肽182-对应于胱冬酶-8小亚基N-末端的肽LSSPQTRYIPDEAD(Sub-2，残基赖氨酸385-甘氨酸399)，合成纯化通过反相HPLC和经半胱氨酸偶联到载体KLH，半胱氨酸不获自Sub-2序列。

肽183-对应于Sub-1N-末端的肽SESQTLDKVYQMKSKPR(残基丝氨酸217-甘氨酸234)，合成纯化通过反相HPLC和经半胱氨酸偶联到载体KLH，半胱氨酸不获自Sub-1序列。

四次免疫和两次用相同量抗原(肽-KLH)加强如下施用给小鼠：

第一次免疫将50μg肽-KLH溶于50μl PBS并用50μl完全弗氏佐剂匀化，注入5只7周大Balb/C雌性小鼠的爪垫。

第二次免疫在第一次免疫后2周进行，小鼠用50％(v/v)不完全弗氏佐剂溶液中的相同量肽肌肉内加强。

第三次免疫在第二次免疫后2周进行，小鼠用50μl PBS中的50μg肽-KLH腹膜内注射。

第二和第三次次免疫后10天测试注射小鼠的血清。

第四次免疫(仅用肽182和183进行)以与第三次免疫类似方式在一个月后进行。

第四次免疫后一个月(或第三次免疫小鼠后用肽179攻击)在两天间隔内进行两次加强(以与第三和第四次免疫类似的方式)。

四天后取出两只表现最高特异免疫反应的小鼠的脾和腹股沟淋巴结，用于与骨髓瘤细胞融合(Eshhar Z，1985)。

实施例2：

免疫兔用于产生胱冬酶-8特异的多克隆抗体

兔用179-KLH和183-KLH免疫以产生特异多克隆抗体。

第一次免疫用100μg肽-KLH进行，肽-KLH溶于50μl PBS并用50μl完全弗氏佐剂匀化且皮下注射。第二次免疫在2周后用相同量肽-KLH进行且在2周后用不完全弗氏佐剂肌肉内注射。这两次免疫后进行两次相同量肽-KLH的加强，肽-KLH溶于50μl PBS并以两周间隔皮下施用。

实施例3：

杂交瘤制备、选择抗体产生克隆并从腹水中纯化抗体

融合过程和杂交瘤细胞选择根据Eshhar Z，1985的操作进行。简要地，来自两只反应小鼠的110×10⁶个脾和淋巴结细胞混合物通过用PEG短暂孵育与32×10⁶个NSO/1骨髓瘤变体骨髓瘤细胞融合。PEG首先用DMEM缓慢稀释，随后通过离心完全去除。细胞重悬浮于DMEM-HAT培养基，以约2.5×10⁴个细胞/孔的浓度分布在96孔板中并在8％CO₂培养箱中37℃培养。所有杂交瘤细胞中的培养基换成添加10％马血清(HS)的DMEM。融合后通过ELISA筛选杂交瘤培养物上清样品中特异Mabs的存在(描述于下面的实施例12)。来自孔的细胞转移到24孔板，在培养物上清中检测到特异抗体存在。阳性细胞被亚克隆两次；在此阶段发现所有亚克隆是阳性的。克隆在24孔中扩增并随后到25cm²T烧瓶中。监控扩增培养物的特异Mabs分泌。来自阳性培养物的细胞安瓿被冷冻并保存于液氮中。

筛选约700个克隆用于检测肽179的特异抗体，仅发现1个阳性克隆(Mab 179)，筛选700个克隆用于检测肽182的特异抗体，仅发现1个阳性克隆(Mab 182)，筛选1100个克隆用于检测肽183的特异抗体，仅发现2个阳性克隆(Mab 183.1和Mab183.2)。阳性克隆通过在96孔板中极限稀释来亚克隆。通过ELISA几次测试生长克隆上清的特异抗体(描述于实施例12)。

阳性杂交瘤克隆在DMEM中生长于组织培养烧瓶，DMEM含15％马血清，来自部分培养物的安瓿被冷冻。不同杂交瘤克隆的细胞平行注射给2-4只小鼠以获得腹水。抗体用亲和胶珠(亲和胶15 Biorad)通过亲和纯化从腹水中纯化，珠与BSA交联(Pierce Cat 77116)，BSA偶联合成肽用于小鼠免疫(肽179、182或183)。

对于抗体纯化，通过50％硫酸铵沉淀的腹水在0℃抗PBS透析16小时。透析后，等分样品用1ml亲和胶-BSA-肽珠0℃孵育16小时且预孵育的珠用于填充1ml柱。最初柱用10ml PBS洗，接着用含1M NaCl的10mM Tris pH7.5洗并用PBS洗。抗体用溶液从柱中洗脱，溶液含100mM甘氨酸HCl pH2.7和0.5M NaCl。1ml部分收集在含40μl Tris碱的管中用于中和洗脱液。从25ml腹水中获得约5-13.6mg的纯化抗体。

实施例4：

单克隆抗体同种型

单克隆抗体同种型用商业同种型试剂盒(Southern Biotechnology Associates有限公司，cat 5300-05)根据厂商试验过程来确定。Mabs183和179鉴定为IgG1，而Mab182发现是IgM类。

实施例5：

用Mabs179、182和183免疫沉淀胱冬酶-8

不同单克隆的抗胱冬酶-8抗体描述于上面的实施例3，测试它们从静止和活化Bjab细胞中免疫沉淀胱冬酶-8的能力(见下面的实施例13)。Bjab系是获自非洲Burkitt淋巴瘤的连续淋巴瘤细胞系(Clements GB等，1975)。

Bjab细胞用Fas-配体刺激1小时。在刺激前和后从Bjab细胞中制备细胞裂解物。用Mabs179、182和183(如实施例13所述)免疫沉淀“耗尽裂解物(depleted)”且用相应肽洗脱的胱冬酶-8通过SDS-PAGE和银染来分析或通过蛋白质印迹分析，蛋白质印迹分析使用Sub-1抗体作为初次抗体(Cell Signaling Technology胱冬酶-8 ICI2 Cat 9746)。

图2显示总细胞提取物和“耗尽裂解物”的蛋白质印迹分析(如下面实施例11所述进行)，它们是用Mabs179、183.1、183.2和182免疫沉淀后获得。

在非刺激细胞中(泳道2、4、6、8和10)，对应于胱冬酶原-8同种型α1和α2(胱冬酶原-8 53/55kDa)的双重带在总细胞提取物(泳道2)和用抗183和抗182抗体获得的耗尽裂解物(泳道6、8和10)中检测到，相反在用Mab179获得耗尽裂解物(泳道4)中没有检测到胱冬酶原-8。这些结果表明Mab179免疫沉淀胱冬酶原-8。

在刺激细胞中，总细胞提取物中的胱冬酶原-8水平较低(泳道1)。活化时出现另外对应于活化胱冬酶-8片段的较小带，即对应于同种型α1和α2的部分加工胱冬酶-8双重带(部分加工胱冬酶-8 p41/43，缺乏Sub-2)和对应于Sub-1的较小带(p20)。通过Mabs耗尽微量胱冬酶原-8和活化胱冬酶-8片段在Fas-配体刺激细胞中测试(图2，泳道3、5、7、9和11)。

要注意的是Sub-1通过Mab182的耗尽对Sub-2特异，也被测试因为活化胱冬酶-8包括结合Sub-2的Sub-1，因此通过Mab182免疫沉淀取出Sub-2应导致Sub-1耗尽。

从刺激细胞裂解物中免疫沉淀胱冬酶-8显示Mab182、183.1和183.2与正常小鼠血清对照(图2泳道11)类似，不去除少量的剩余胱冬酶原-8或活性胱冬酶-8片段(分别为泳道9、7、5和11)。与这些结果相反，用Mab179处理细胞裂解物(泳道3)有效取出所有胱冬酶原-8以及活性胱冬酶-8片段。

图3a(蛋白质印迹分析)和3b(用银染检测蛋白质)显示通过Mabs179、182、183.1和183.2抗体免疫沉淀的胱冬酶原-8和活性胱冬酶-8片段可在上清中通过与各肽竞争来有效回收，多种抗体抗这些肽产生(实施例13)。

从非刺激细胞中(图3a泳道2、4、6、8和10以及图3b泳道2、3、6、8和10)，胱冬酶原-8通过Mab179免疫沉淀和与肽179竞争来有效回收(图3a和3b泳道8)。从刺激细胞中，尽管活化后剩余少量胱冬酶原-8，通过Mab179免疫沉淀有效回收蛋白质(图3a和3b泳道9)。在非活化细胞中通过Mab183.2(图3a泳道6)和在活化细胞中通过Mab183.1(图3a泳道5)可观察到一些胱冬酶原-8的回收。，其中胱冬酶-8活性片段可在活化细胞裂解物中用Mab182(图3a泳道3)、Mab183.1(图3a泳道5)和Mab183.2(图3a泳道7，仅p20)回收。

所得结果表明Mab179抗对应于Sub-1 C-末端的肽(179抗原表位)发展，甚至痕量存在时对免疫沉淀和纯化胱冬酶原-8以及活性胱冬酶-8很有效。

生成对相同179抗原表位特异的多克隆抗体(如上面实施例1所述制备)以研究179抗原表位是否具有引起抗体的独特能力，这一般可用于有效免疫沉淀和纯化胱冬酶原-8以及活性胱冬酶-8。比较通过对抗原表位179特异的多克隆抗体免疫沉淀(泳道5和6分别用于活化和非活化细胞)或通过对抗原表位182特异的单克隆抗体(泳道7和8分别用于活化和非活化细胞)获得的“耗尽裂解物”。图4结果清楚显示来自刺激细胞裂解物的胱冬酶原-8和胱冬酶-8片段也能用多克隆抗179抗体从细胞裂解物中取出，甚至比用单克隆抗182抗体更有效。

从静止细胞裂解物中用Mab183和对抗原表位183特异的多克隆抗体进行平行免疫沉淀和回收胱冬酶原-8(如实施例1所述)，与用Mab179获得结果相比。图5显示用Mab183和poly183免疫沉淀胱冬酶原-8无效，而用Mab179免疫沉淀胱冬酶原-8则非常高。

另外约5.6kDa的胱冬酶-8获得片段仅在用Mab179进行的免疫沉淀中观察到(泳道3)。抗体抗对应于大胱冬酶Sub-1 C-末端的胱冬酶-8区域发展，具有赋予胱冬酶新加工模式的独特能力。

上面观察的结果表明胱冬酶-8的抗原表位179不像其它抗原表位，具有引起特异抗体的特殊能力，特异抗体对于免疫沉淀胱冬酶原-8和活性胱冬酶-8很有效且能诱导胱冬酶-8自动加工。

实施例6：

分离和鉴定胱冬酶-8结合多肽(Cari)

由于Mab179有效免疫沉淀胱冬酶-8的能力，它被用于共免疫沉淀胱冬酶-8和胱冬酶-8结合蛋白。

Bjab细胞(Steinitz M，Klein G.1975)用Fas-配体刺激1小时，在刺激前和后从Bjab细胞中制备细胞裂解物。如实施例13所述，免疫沉淀和洗脱后，回收蛋白质用SDS-PAGE分离并通过银染检测。用小鼠IgG1免疫沉淀作为负对照。图6结果显示明显约72.5kDa(本文称为p72)分子量的多肽在来自静止细胞的裂解物中与胱冬酶原-8(p53/55)共沉淀(泳道3)，但在来自刺激细胞的裂解物中不与活性胱冬酶-8反应(泳道4)。

此外，也发现p72多肽在来自非刺激海拉、Raji、H9、K562、HL-60、CEM和Hut78细胞(ATCC)的裂解物中与胱冬酶原-8共沉淀。

这些结果表明多肽p72一般结合胱冬酶原-8但不结合活性胱冬酶-8。

切下SDS-PAGE中对应p72的带，胰蛋白酶消化并进行限制序列分析和质谱分析。胰蛋白酶消化获得的7个肽用于搜索蛋白质数据库，数据库从核苷序列推出(或ESTs)。人EST克隆预测蛋白质序列的蛋白质序列配对部分(SEQ ID NO：1)发现于基因库(登录号gi/2988397/gbAAC08052.1/(AC004475)，其功能未知。

实施例8：

产生编码p72的全长cDNA

编码p72的全长cDNA产生如下：

EST形式(实施例7)用于筛选TIGR人基因索引和THC报告(THC510568 SEQ ID NO：1)，报告含所有ESTs的共有序列，获得符合此序列的序列。

编码部分预测多肽的DNA克隆购买自Incyte Genomics(IMAGE #2964545)。克隆缺乏编码第一个甲硫氨酸和随后6个氨基酸的核苷序列(即21个核苷)。发现小鼠和人的这些蛋白质序列高度相似(约90％同一性)，因此核苷序列编码第一个甲硫氨酸和随后6个在小鼠ESTs中不缺失的小鼠蛋白质的氨基酸，此序列与人类基因组工作草案序列相比以完善缺失的人序列。成功获得对应于智人染色体19序列的克隆LINLR-232E12。此克隆证实核苷序列编码p72的7个缺失氨基酸。p72的全长cDNA通过两轮PCR获得(使用Takara ExTaq，Takara，cat#R001A)，图示于图8。

在第一个PCR中，获自Incyte Genomics的克隆用作模板，正向引物：CTCAAGATGGACAACCGGGATGTTGCAGGAAAGG，合成以包含21个缺失核苷中的15个(下划线)以及p72的现存序列(图8引物2)，反向引物：CCACTCGAGTCAGTAGTAAGGCCGTCTGGGATT，包含以终止密码子为结束的3’区域(图8引物3)。

第二次PCR包括第一轮PCR的PCR产物作为模板，正向引物：AATGGATCC ATGAGTCTCAAGATGGACAACCGGGA，含全部21个缺失核苷和5个现存核苷(图8引物1)以及相同的反向引物(图8引物3)。编码p72的完整cDNA被回收和测序(SEQ ID NO：2)且氨基酸序列从核苷序列中预测((SEQ ID NO：3)。

比较THC报告(THC510568 SEQ ID NO：1)中获得的序列，报告含所有ESTs的共有序列和图13中通过产生全长cDNA预测的多肽，比较显示在ESTs中缺失前7个氨基酸，在ESTs中缺失25个氨基酸，以及氨基酸397的错误(脯氨酸取代亮氨酸)。

发现p72多肽包含三个保守基序(图7)：一个卷曲螺旋基序C基序、两个随机位置的“SURP基序”(也称为“SWAP”基序，图7表示为S)(Denhez F和Lafyatis R1994)，处于多肽N末端附近、一个位于C末端的“G-膜片”(图7表示为G)(AravindL和Koonin EV 1999)。认为SURP和G-膜片基序有助于RNA结合，表明p72的靶可以是RNA分子。因此p72重新命名为Cari(具RNA结合基序的胱冬酶-8相关多肽)。

实施例9：

Cari被胱冬酶-8裂解

如实施例8所示，刺激1小时后测试，Cari仅结合胱冬酶原-8且不结合活性胱冬酶-8。一些胱冬酶原-8在刺激20分钟后仍检测到。为确定在较短刺激时间Cari是否能与胱冬酶原-8共沉淀，仅活化20分钟的Bjab细胞被裂解并用M179免疫沉淀。免疫沉淀和洗脱后，胱冬酶-8和结合多肽用SDS-PAGE分离且多肽通过银染检测。刺激前一条大概对应于Cari的72.5kDa带(图9泳道3)在细胞裂解物中免疫沉淀，而刺激20分钟后，除了Cari，检测到一条具明显更低分子量的多肽，约68kDa(图9泳道4)。72.5kDa和68kDa的两条多肽从Bjab细胞中免疫沉淀，接受质谱分析。胰蛋白酶化后，多肽都表现出类似肽分布，除了一个明显的不同，72.5kDa(Cari)中存在另外肽序列FRPNPLNNPR(残基632-641)但在68kDa多肽中没有。

此结果表明细胞刺激时，可能由于活化胱冬酶-8使约4.5kDa的片段从Cari C-末端去除，产生具明显68kDa分子量的较小多肽，它仍结合剩余的胱冬酶原-8。

认为位于Cari C-末端的残基D600(图7)可作为裂解的候选残基，因为来自这种裂解的假定片段表现出与刺激20分钟后体内检测的Cari片段类似的分子量。

为测试Cari是否如所示为胱冬酶-8底物且D600是否是裂解的靶残基，体外转录-翻译和放射性同位素标记(S³⁵)Cari(TnT系统)接受重组活性胱冬酶-8作用。在³⁵S甲硫氨酸存在时用TnT T7偶联网织红细胞裂解物系统在网织红细胞裂解物中体外表达Cari cDNA，被重组活性胱冬酶-8裂解(在大肠杆菌中分别制备的各亚基1和2在体外一起混合和重折叠)。简要地，在有或没有细菌产生的活化胱冬酶-8情况下，体外合成的³⁵S标记Cari在蛋白酶缓冲液(25mM Hepes pH 7.5，0.1％CHAPS，5mM EDTA和2mM DTT)中37℃孵育30分钟。蛋白质和它们的片段在SDS-PAGE分离且结果用磷成像显现。结果(图10)显示没有胱冬酶-8时仅检测到对应全长Cari的72.5kDa带(泳道1)。加入活化胱冬酶-81小时后此带消失且出现一条新的对应68kDa的较小片段(泳道4)。此结果表明Cari cDNA编码的蛋白质用作底物，被胱冬酶-8有效裂解。

此外，TnT转录翻译系统也用于体外产生2种不同的Cari突变体：1-Cari中残基D600突变成E(D600E)，D600在体外实验中怀疑是胱冬酶-8靶残基，2-缺失的Cari，缺少D600下游残基(即表达蛋白质表现出1-600个残基)。

在重组活性胱冬酶-8存在(分别是图10泳道5和6)或没有(分别是泳道2和3)测试上面两种Cari突变体的裂解。如图10所示(分别是是泳道3和6)，有或没有胱冬酶-8时观察到Cari D600E突变体的相同蛋白质分布，表明胱冬酶-8不裂解Cari D600E突变体。Cari 1-600突变体与裂解野生型Cari后产生的68kDa片段共迁移且不被胱冬酶-8加入进一步裂解(泳道2和5)。这些结果显示活化时胱冬酶-8在D600残基裂解Cari。

体外进行的研究表明通过胱冬酶-8裂解Cari在细胞中迅速发生，在Fas配体刺激后5-20分钟内发生(图11)，裂解的Cari(或它更大的片段)可保持与胱冬酶原-8相联。

实施例10：

Cari的功能特征

为分析Cari对TNF受体信号途径诱导的细胞调亡死亡的作用，使用Cari cDNA或反义Cari(a/s)或没有p72 cDNA插入的载体作为负对照(pc)。CDNA插入pcDNA3.1表达载体(来自Invitrogen)并用插入pcDNA3载体(Invitrogen)的p55 TNFR受体DNA和插入pEGFPC1表达载体(Clontech)的绿色荧光蛋白(GFP)共转染，转入组成型表达T抗原的HEK293细胞。

24小时后，转染细胞在荧光显微镜下检测且细胞死亡且通过确定总荧光细胞群中表现细胞调亡形态的细胞数来评估细胞死亡。发现过量表达Cari加强p55 TNFR受体过量表达诱导的细胞死亡(图12a，p72)。相反，当反义cDNA构建物用于共转染时(图12a，p72/a/s)，细胞被保护不受p55 TNFR过量表达诱导的细胞死亡影响。

此结果表明Cari调节TNF受体信号途径诱导的细胞调亡死亡。

一般，通过FasL引发受体像CD120a需要加入蛋白质合成抑制剂像环己酰亚胺以获得细胞调亡的强信号。为分析Cari对Fas信号途径诱导的细胞死亡的作用，Cari过量表达对Fas-配体调节的细胞死亡的作用在没有加入环己酰亚胺时在HEK293细胞中监控，HEK293细胞中组成型表达T抗原(HEK-293T)。在实验中，HEK-293T细胞共转染载体pcDNA3.1或者编码Cari或Cari反义的pcDNA3.1(分别是pc、p72和p72a/s)和编码报道基因SEAP(分泌碱性磷酸酶)的载体pSBC-2(Dirks等，1983)。24小时后转染细胞用Fas-配体诱导16小时且生长培养基用新鲜生长培养基替换。细胞死亡通过确定24小时中分泌到生长培养基中的SEAP量来测量(如Boldin等所述通过酶反应检测)。图12b结果表明Cari而不是Cari反义过量表达，结合Fas-配体刺激引起死亡。结果也显示没有Fas-配体刺激时Cari过量表达对细胞死亡没有任何作用(未显示)。

pSuper-Cari是稳定表达短干扰Cari RNAs的系统，假定会阻碍Cari，测试其过量表达对海拉细胞中诱导的细胞调亡的作用，细胞调亡通过Mach a1(胱冬酶-8)过量表达或通过含p55 TNFR1胞外部分的嵌合物融合FAS受体跨膜和胞内部分(CI*)来诱导。

接种海拉细胞(2×10⁵个细胞)并共转染，共转染用2μg Mach a1或CI*DNA包含质粒(主链质粒pcDNA3，来自Invitrogen)和3μg pSuper载体(Brummelkamp等，2002 science 296-550)或pSuper-Cari(pSuper-Cari是pSuper质粒的1∶1混合物，质粒所含序列获自人Cari cDNA AAGAGGATAAGGTAGAGCTCC(1169-1190 SEQ ID NO：6)或来自3’-非翻译区AATGACCAACCGTCCCTGGAC(3’26-47bp SEQ ID NO：7)和0.5μg含质粒的报告GFP基因(主链质粒pRGFP，Clontech)。转染后27小时，转染细胞在荧光显微镜下检测且细胞死亡且通过含GFP的细胞形态来估计。

结果概括于图16。细胞死亡通过Mach a1或CI*过量表达来诱导(Mach a1过量表达细胞中的细胞调亡高于CI*过量表达细胞)，用Mach a1或CI*与pSuper-Cari一起转染的细胞显示细胞调亡显著减少或没有。这些结果证明通过TNF信号途径或胱冬酶-8诱导的细胞调亡需要Cari活性。

实施例11

用于检测胱冬酶-8免疫反应血清的蛋白质印迹

重组纯化Sub-1和Sub-2的混合物用于蛋白质印迹分析，抗体用合成肽发展。简要地，12％SDS聚丙烯酰胺胶在还原条件下(400mM DTT)上样100ng/泳道的Sub-1和Sub-2混合物。一个泳道上样低分子量标记(LMW)。在胶上分离的蛋白质通过电洗脱转移到PVDF高P-键(Amersham)膜。膜在含5％低脂牛奶、0.05％Tween 20的PBS中孵育16小时。膜切成条且各条用小鼠抗血清(稀释1/2000)室温孵育1小时。膜条用含0.05％Tween 20的PBS洗(3×15分钟)并用二次抗体-偶联山葵过氧化物酶的山羊抗小鼠(稀释1∶10,000，Jackson)室温孵育1小时。

条用含0.1％Tween 20的PBS洗(3×15分钟)。阳性带通过增强化学发光(ECL，Amersham)来检测。

对于实施例5中进行的蛋白质印迹，使用对Sub-1特异的抗体(Cell SignalingTechnology胱冬酶-8 ICI2 Cat 9746)。

实施例12

用于杂交瘤克隆筛选的ELISA

直接ELISA用于筛选产生特异抗体的杂交瘤，进行如下：96孔板用结合溶液(0.1M Na₂HPO₄，pH 9)中2.5μg/ml浓度的BSA-肽50μl/孔覆盖，37℃ 1小时或4℃ 16小时。随后板用PBS-T(含0.05％Tween 20的PBS)洗3次并加样200μl/孔的封闭溶液(PBS中1％血红蛋白)，37℃ 1小时，PBS洗3次。各孔加样50μl杂交瘤培养物上清或稀释标准物(用PBS-T)，37℃孵育1小时或22℃4小时。此孵育阶段后，孔用PBS-T洗6次。二次抗体偶联HRP的抗小鼠抗体(Jackson 115-025-100)在PBS-T稀释1∶5000，37℃孵育1小时并用PBS-T洗6次。新鲜制备HRP底物(2.2ml的0.2M Na₂HPO₄，pH 9.2，1.4ml的0.2M柠檬酸，pH 4.35，6.4ml H₂O，10mgABTS和1μl H₂O₂)并加样50μl/孔，22℃孵育直到颜色显示(约5-80分钟)。颜色反应通过加入50μl/孔的0.2M柠檬酸来终止。板在405nm读数。

作为阳性对照抗体，使用稀释1∶1000的阳性小鼠抗血清且作为负对照培养基。

实施例13

胱冬酶-8的免疫沉淀

对于各免疫沉淀，使用108个细胞。收集细胞并裂解，裂解是通过在1％NP-40裂解缓冲液和完全蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合物片剂来自RocheMolecular Biochemicals)钟0℃孵育40分钟。细胞裂解物等分于Eppendorf管，14000rpm 4℃离心10分钟且上清收集于新管中。细胞裂解物进行预清除步骤，旨在去除非特异结合G蛋白-琼脂糖的蛋白质。对于预清除，细胞裂解物用G蛋白-琼脂糖(Pharmacia)预洗的PBS和小鼠IgG 4℃预孵育2-3小时。此孵育后，裂解物在Eppendorf管中14000rpm离心30秒，弃去G蛋白-琼脂糖并收集预清除的上清。混合纯化的单克隆抗体(或小鼠IgG 1κ用于负对照)和G蛋白-琼脂糖预洗的PBS且用预清除的上清4℃孵育4-16小时。此孵育阶段后，表示为“耗尽裂解物”的未结合物质通过离心收集(14000rpm 30秒)且洗脱结合物质，洗脱通过用裂解缓冲液洗琼脂糖珠6次和用“洗脱溶液”(300μl洗脱溶液/100μl琼脂糖)22℃孵育2小时，“洗脱溶液”含0.2％NP-40裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂和400μg/ml用于免疫的肽。管在5,000rpm旋转5分钟且表示为“胱冬酶-8洗脱物”的上清转移到新管。

实施例14

不能裂解的突变体p72 D600E在Fas调节细胞调亡中的作用评估

发现Cari被活性胱冬酶-8裂解且通过产生不能裂解的突变体(p72 D600E)证明了特异裂解位点(实施例9)。暂时过量表达Cari显示加强Fas配体处理细胞的细胞调亡活性(实施例9)。为评估不能裂解的突变体p72 D600E相对野生型多肽在Fas调节细胞调亡中的作用，Bjab细胞一般改造成组成型产生突变体或野生型cari且监控Fas配体在改造细胞中的作用。为产生组成型生成，编码两种Cari蛋白质的cDNAs插入pcDNA 3.1表达载体。转染的Bjab细胞在1500μg/ml新霉素中选择，收集分离物且通过蛋白质印迹分析细胞裂解物来测试Cari生成。进一步选择产生类似水平Cari野生型和突变体的分离物。在Fas配体应用于对照细胞(B1)、组成型表达转染p72的细胞(B2)和组成型表达转染D600E p72的细胞(B3)后监控Bjab细胞的存活。图14结果显示表达不能裂解的Cari突变体的细胞比表达野生型Cari的细胞被Fas配体处理更有效杀死。此结果一个可能的解释是Cari也许参与胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8。因此，不能裂解的Cari连续诱导胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8，导致细胞调亡增加，不像野生型Cari，野生型Cari可被逐步裂解并由活性胱冬酶-8使其失活。

为测试Cari在胱冬酶-8活化中可能的参与，在Fas配体处理表达野生型Cari或不能裂解Cari突变体的Bjab细胞后，监控胱冬酶原-8转化成活性胱冬酶-8的速度，监控通过用抗胱冬酶-8特异抗体进行蛋白质印迹以检测胱冬酶原-8和活化胱冬酶-8。所得结果表明胱冬酶-8活化速度在产生突变Cari的Bjab细胞中更高(未显示)。

这些结果说明p72参与胱冬酶-8活化且表达突变体p72 D600E的细胞中Fas配体调节抗细胞调亡活性相对表达野生型的细胞增加，这是由于尽管存在活性胱冬酶-8，前一种蛋白质仍保持活性(没有被裂解)。

实施例14

确定Cari结合胱冬酶-8的结构域

用Cari进行缺失研究以确定Cari结合胱冬酶-8的最小氨基酸序列。逐步缺失Cari且所得片段连接GFP报告基因并导入pcDNA3.1/HisC载体(In Vitrogen)。Cari构建物(10μg)与含胱冬酶原-8的载体(10μg)[Mach a1(C360S)]导入pcDNA 3载体(In-Vitrogen)]一起共转染到海拉细胞中。

转染后24小时，细胞在1％NP-40裂解缓冲液中裂解。胱冬酶-8用抗体179和G蛋白免疫沉淀2小时。沉淀复合物用冲洗缓冲液(0.2％NP-40缓冲液)洗5次且在含抗体179的冲洗缓冲液中洗脱。免疫沉淀蛋白质通过SDS-PAGE分离并用抗胱冬酶-8抗体1C12(1：2000，Cell s Signaling Technology)和多克隆抗体进行蛋白质印迹分析，多克隆抗体抗大肠杆菌产生的His-Cari(1：2000)。

图8显示Cari的示意图，包括卷曲螺旋基序、SURP-或SWAP基序、G-膜片基序NLS基序、胱冬酶-8裂解位点D600和横跨上面基序的对应氨基酸。表II概括了Cari完整和缺失构建物与胱冬酶-8的结合。

Cari中胱冬酶-8裂解位点D600对于其结合可能不需要，因为D600E Cari突变体不结合胱冬酶-8。缺失构建物393-645缺少蛋白质N-末端，包括一些上面的Cari基序(卷曲螺旋基序、SURP-或SWAP基序、G-膜片基序NLS基序)，但包含蛋白质完整C-末端，构建物仍结合胱冬酶-8，表明不像C-末端，结合胱冬酶-8不需这些基序。也可能不需要G-膜片基序，这是通过缺失构建物393-437缺乏G-膜片基序但仍结合胱冬酶来证明。蛋白质可进一步从其N-末端缺失以获得24个氨基酸的肽VQDLKGLGYEKGKPVGLVGVTEL(构建物414-437 SEQ ID NO：4)，它仍结合胱冬酶-8。另外从此肽N-末端缺失16个氨基酸产生9个氨基酸的肽(构建物429-437)，它不能结合胱冬酶-8。因此，从构建物414-437 N-末端缺失仅7个氨基酸产生16个氨基酸的肽(构建物4122-437)，测试此肽且发现它结合胱冬酶-8。因此，发现能结合胱冬酶-8的最小氨基酸是16个氨基酸的肽，序列为GYEKGKPVGLVGVTEL(构建物422-437 SEQ ID NO：5图15)。

表II

Cari构建物	结合胱冬酶-8	注释
Cari构建物	结合胱冬酶-8	注释	全长Cari(1-645)	+
突变体D600E(1-645)	+	在残基600不能裂解	全长Cari(1-645)	+
突变体D600E(1-645)	+	在残基600不能裂解	1-260	-	仅包括第一个SURP组件的N-末端
1-330	-	包括两个SURP组件的N-末端	1-260	-	仅包括第一个SURP组件的N-末端
1-330	-	包括两个SURP组件的N-末端	1-352	-	包括两个SURP组件和第一个NLS的N-末端
1-427	-	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端	1-352	-	包括两个SURP组件和第一个NLS的N-末端
1-427	-	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端	1-490	+	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端
1-531	+	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端	1-490	+	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端
1-531	+	包括两个SURP组件和所有三个NLS的N-末端	179-645	+	包括两个SURP组件和C-末端
260-645	+	包括仅第二个SURP组件和C-末端	179-645	+	包括两个SURP组件和C-末端
260-645	+	包括仅第二个SURP组件和C-末端	370-645	+	包括仅二个NLS和C-末端
突变NLS的370-645	+	类似370-645突变体但NLS序列被突变	370-645	+	包括仅二个NLS和C-末端
突变NLS的370-645	+	类似370-645突变体但NLS序列被突变	393-645	+	包括C-末端而没有任何NLS
370-484	+	包含NLS和排除G-膜片基序的部分C-末端	393-645	+	包括C-末端而没有任何NLS
370-484	+	包含NLS和排除G-膜片基序的部分C-末端	突变NLS的370-484	+	类似370-484突变体但NLS序列被突变
438-484	-	GFP-融合C-末端	突变NLS的370-484	+	类似370-484突变体但NLS序列被突变
438-484	-	GFP-融合C-末端	393-437	+	GFP-融合C-末端
398-437	+	GFP-融合C-末端	393-437	+	GFP-融合C-末端
398-437	+	GFP-融合C-末端	406-437	+	GFP-融合C-末端
414-437	+	GFP-融合C-末端	406-437	+	GFP-融合C-末端
414-437	+	GFP-融合C-末端	429-437	-	GFP-融合C-末端
422-437	+	GFP-融合C-末端	429-437	-	GFP-融合C-末端

参考文献

Adelman Jp等，1983 DNA 2：183.

Ahmad M等，Cancer Res 1997；57(4)：615-9.

Akagi Y等，1997 Kidney Int.51，p.1265-9.

Aravind L和Koonin EV 1999 TIBS 24：342-344.

Artelt P等，1988 Gene 68，213-9.

Barnikol-Watanabe S等，Biol Chom Hoppe Seyler 1994；375(8)：497-512.

Beidler Dr等，1995.J Biol Chem 1995 Jul 14；270(28)：16526-8.

Beutler和Cerami 1987 N Engl J Med 1987 Feb 12；316(7)：379-85.

Bigda J等，1994 J Exp Med Aug 1；180(2)：445-60

Boldin MP等，1995 J Biol Chem Apr 7；270(14)：7795-8

Boldin MP等，1995a Biol Chem 1995 Jan 6；270(1)：387-91.

Boldin MP等，1995b FEBS Lett 1995 Jun 19；367(1)：39-44.

Boldin MP等，1996 Cell 1996 Jun 14；85(6)：803-15.

Boone，E等，J.Biol Chem.275，37596-603.

Boulianne GL等，1984 Nature 1984 Dec 13-19；312(5995)：643-6.

Brakebusch C等，1992.EMBO J 1992 Mar；11(3)：943-50.

Brockhaus M等，1990 Proc Natl Acad Sci U S A 1990 Apr；87(8)：3127-31.

Cabilly S等，1984 PNAS 81，3273.

Cantor等，1993 PNAS 90 109-32.

Cao X等，1998 J Immunol 161，6238-44.

Chen CJ等，1992 Ann.NY Acad.Sci.660，271-3.

Chinnaiyan AM等，1995 Cell May 19；81(4)：505-12.

Chinnaiyan AM等，1996 J Biol Chem Mar 1；271(9)：4961-5.

Clements GB等，1975 Int J Cancer 16：125-33.

Cohen OM 1997 Biochem J；326(Pt 1).1-16.

Daniel R等，1998 J Biomed Sci.5，383-94.

Denhez F和Lafyatis R 1994 J Biol Chem 269：16170-16179.

Dirks，Wirth和Hauser 1983 Gene 128，247-249.

Duan H和Dixit VM.Nature 1997；385(6611)：86-9.

Durfee T等，Genes Dev 1993；7(4).SSS-69.

Edamatsu H，Kaziro Y，Itoh H.1997，Gene 187，289-94.

Edinger AL等，1998 Virology.249，p.367-78.

Enari M等，1995.Nature May 4；375(6526)：78-81

Enari M等，1998 Nature(London)391，43-50.

Engelmann H等，1990.J.Biol Chem Jan 25；265(3)：1531-6.

Engelmann H等，1990 J.Biol.Chem.265，p.14497-504.

Eshhar Z，1985，《生物科学和医学中的杂交瘤技术》(Hybridoma technology in thebioscience and medicine)，Timothy A.编，Springer(Plenum Publishing Corporation，1985；第1章).

Everett RD等，1983 Nucleic Acids Res.11 2447-64.

Fernandes-Alnemri T等，1996 ProcNatiAcadSciUSA；93(15)：7464-9

Fields S等，1989；Nature 340(6230)：245-6.

Flanagan，1998 Cancer Metastasis Rev 17，169-76.

Furth PA等，1994 ProcNatiAcadSciUSA 91，9302-6.

Gerster M等，1998 Anal Biochem.262，177-84.

Graham A等，1991，Biochem Biophys Res Commun 177，8-16.

Grau GE 1989 Schweiz Med Wochenschr Dec 9；119(49)：1756-61.

Griscelli F等，1998，Hum Gene Ther.9，1919-28.

Guang-Lin M等，1998 Transplant Proc 30，2923-4.

Guinot和Temsamani，1998 Pathol Biol(Paris)46，p.347-54.

Haendler B等，E.EMBO J 1987；6(4)：947-50.

Hemmi S等，1998 Hum Gene Ther 9，p.2363-73.

序列表

<110> 耶达研究发展有限公司(Yeda Research and Development Co.Ltd)

D.沃勒克(David，Wallach)

T.冈察洛夫(Tanya，Goncahrov)

G.克鲁马姆(Ganesh，Kolumam)

R.阿克希尔(Akhil，Rajput)

<120> 胱冬酶-8结合蛋白及其制备和使用

<130> 497

<150> 145278

<151> 2001-04-09

<150> 146251

<151> 2001-04-09

<150> 147487

<151> 2001-04-09

<160> 7

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Ala Arg Gly Arg Asp Val Ala Gly Lys Ala Asn Arg Trp Phe Gly Val

1 5 10 15

Ala Pro Pro Lys Ser Gly Lys Met Asn Met Asn Ile Leu His Gln Glu

20 25 30

Glu Leu Ile Ala Gln Lys Lys Arg Glu Ile Glu Ala Lys Met Glu Gin

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Asn Gln Val Ala Ser Pro Gln Pro Pro His Pro Gly

50 55 60

Glu Ile Thr Asn Ala His Asn Ser Ser Cys Ile Ser Asn Lys Phe Ala

65 70 75 80

Asn Asp Gly Ser Phe Leu Gln Gln Phe Leu Asn Ala Gly Lys Arg Ser

85 90 95

Leu Leu Ile Ser Arg Arg Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Leu Pro Gly

100 105 110

Pro Val Lys Ser Tyr Ser His Ala Lys Gln Leu Pro Val Ala His Arg

115 120 125

Pro Ser Val Phe Gln Ser Pro Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Glu

130 135 140

Gln Trp Leu Glu Ile Lys Val Ser Pro Pro Glu Gly Ala Glu Thr Arg

145 150 155 160

Lys Val Ile Glu Lys Leu Ala Arg Phe Val Ala Glu Gly Gly Pro Glu

165 170 175

Leu Glu Lys Val Ala Met Glu Asp Tyr Lys Asp Asn Pro Ala Phe Ala

180 185 190

Phe Leu His Asp Lys Asn Ser Arg Glu Phe Leu Tyr Tyr Arg Lys Lys

195 200 205

Val Ala Glu Ile Arg Lys Glu Ala Gln Lys Ser Gln Ala Ala Ser Gln

210 215 220

Lys Val Ser Pro Pro Glu Asp Glu Glu Val Lys Asn Leu Ala Glu Lys

225 230 235 240

Leu Ala Arg Phe Ile Ala Asp Gly Gly Pro Glu Val Glu Thr Ile Ala

245 250 255

Leu Gln Asn Asn Arg Glu Asn Gln Ala Phe Ser Phe Leu Tyr Glu Pro

260 265 270

Asn Ser Gln Gly Tyr Lys Tyr Tyr Arg Gln Lys Leu Glu Glu Phe Arg

275 280 285

Lys Ala Lys Ala Ser Ser Thr Gly Ser Phe Thr Ala Pro Asp Pro Gly

290 295 300

Leu Lys Arg Lys Ser Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gly Ser Leu Pro Pro

305 310 315 320

Ala Thr Thr Cys Pro Ala Ser Ser Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ile Pro

325 330 335

Ala Pro Ala Ala Pro Gly Lys Pro Ala Ser Ala Ala Thr Val Lys Arg

340 345 350

Lys Arg Lys Ser Arg Trp Gly Pro Glu Glu Asp Lys Val Glu Leu Pro

355 360 365

Pro Ala Glu Leu Val Gln Arg Asp Val Asp Ala Ser Pro Ser Pro Leu

370 375 380

Ser Val Gln Asp Leu Lys Gly Leu Gly Tyr Glu Lys Gly Lys Pro Val

385 390 395 400

Gly Leu Val Gly Val Thr Glu Leu Ser Asp Ala Gln Lys Lys Gln Leu

405 410 415

Lys Glu Gln Gln Glu Met Gln Gln Met Tyr Asp Met Ile Met Gln His

420 425 430

Lys Arg Ala Met Gln Asp Met Gln Leu Leu Trp Glu Lys Ala Val Gln

435 440 445

Gln His Gln His Gly Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Val Asp Ser Glu Leu

450 455 460

Gly Thr Trp Glu His Gln Leu Arg Arg Met Glu Met Asp Lys Thr Arg

465 470 475 480

Glu Trp Ala Glu Gln Leu Thr Lys Met Gly Arg Gly Lys His Phe Ile

485 490 495

Gly Asp Phe Leu Pro Pro Asp Glu Leu Glu Lys Phe Met Glu Thr Phe

500 505 510

Lys Ala Leu Lys Glu Gly Arg Glu Pro Asp Tyr Ser Glu Tyr Lys Glu

515 520 525

Phe Lys Leu Thr Val Glu Asn Ile Gly Tyr Gln Met Leu Met Lys Met

530 535 540

Gly Trp Lys Glu Gly Glu Gly Leu Gly Ser Glu Gly Gln Gly Ile Lys

545 550 555 560

Asn Pro Val Asn Lys Gly Thr Thr Thr Val Asp Gly Ala Gly Phe Gly

565 570 575

Ile Asp Arg Pro Ala Glu Leu Ser Lys Glu Asp Asp Glu Tyr Glu Ala

580 585 590

Phe Arg Lys Arg Met Met Leu Ala Tyr Arg Phe Arg Pro Asn Pro Leu

595 600 605

Asn Asn Pro Arg Arg Pro Tyr Tyr

610 615

<210> 2

<211> 1938

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgagtctca agatggacaa ccgggatgtt gcaggaaagg ctaaccggtg gtttggggtt 60

gctcccccta aatctggaaa aatgaacatg aacatccttc accaggaaga gctcatcgct 120

cagaagaaac gggaaattga agccaaaatg gaacagaaag ccaagcagaa tcaggtggcc 180

agccctcagc ccccacatcc tggcgaaatc acaaatgcac acaactcttc ctgcatttcc 240

aacaagtttg ccaacgatgg tagcttcttg cagcagtttc tgaagttgca gaaggcacag 300

accagcacag acgccccgac cagtgcgccc agcgcccctc ccagcacacc cacccccagc 360

gctgggaaga ggtccctgct catcagcagg cggacaggcc tggggctggc cagcctgccg 420

ggccctgtga agagctactc ccacgccaag cagctgcccg tggcgcaccg cccgagtgtc 480

ttccagtccc ctgacgagga cgaggaggag gactatgagc agtggctgga gatcaaagtt 540

tcacccccag agggagccga gactcggaaa gtgatagaga aattggcccg ctttgtggca 600

gaaggaggcc ccgagttaga aaaagtagct atggaggact acaaggataa cccagcattt 660

gcatttttgc acgataagaa tagcagggaa ttcctctact acaggaagaa ggtggctgag 720

ataagaaagg aagcacagaa gtcgcaggca gcctctcaga aagtttcacc cccagaggac 780

gaagaggtca agaaccttgc agaaaagttg gccaggttca tagcggacgg gggtcccgag 840

gtggaaacca ttgccctcca gaacaaccgt gagaaccagg cattcagctt tctgtatgag 900

cccaatagcc aagggtacaa gtactaccga cagaagctgg aggagttccg gaaagccaag 960

gccagctcca caggcagctt cacagcacct gatcccggcc tgaagcgcaa gtcccctcct 1020

gaggccctgt cagggtcctt acccccagcc accacctgcc ccgcctcgtc cacgcctgcg 1080

cccactatca tccctgctcc agctgccccc gggaagccag cctccgcagc caccgtgaag 1140

aggaagcgga agagccggtg ggggcctgaa gaggataagg tagagctcct acctgctgaa 1200

ctggtgcaga gggacgtgga tgcctctccc tcgcctctgt cagttcagga cctcaagggg 1260

ctcggctatg agaaggggaa gcctgtgggt ctagtgggcg tcacagagct ttcagacgcc 1320

cagaagaagc agctgaagga gcagcaggag atgcagcaga tgtacgacat gatcatgcag 1380

cacaagcggg ccatgcagga catgcagctg ctgtgggaga aggcagtcca acagcaccag 1440

cacggctatg acagtgatga ggaggtggac agcgagctgg gcacctggga gcaccagctg 1500

cggcgcatgg agatggataa gaccagggaa tgggccgagc agctgacaaa gatgggccgg 1560

ggcaagcact tcatcggaga cttcctgcct ccagacgagc tggaaaagtt tatggagacc 1620

ttcaaggccc tgaaggaggg ccgtgagcct gactactcag agtacaagga gttcaagctg 1680

actgtggaga acatcggcta ccagatgctg atgaagatgg gctggaagga gggcgagggg 1740

ctgggctcag agggccaggg catcaagaac ccagtgaaca agggcaccac cacagtggac 1800

ggcgctggct tcggcattga ccggccggcg gagctctcca aggaggacga cgagtatgag 1860

gcgttccgca agaggatgat gctggcctac cgcttccggc ccaaccccct gaacaatccc 1920

agacggcctt actactga 1938

<210> 3

<211> 645

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ser Leu Lys Met Asp Asn Arg Asp Val Ala Gly Lys Ala Asn Arg

1 5 10 15

Trp Phe Gly Val Ala Pro Pro Lys Ser Gly Lys Met Asn Met Asn Ile

20 25 30

Leu His Gln Glu Glu Leu Ile Ala Gln Lys Lys Arg Glu Ile Glu Ala

35 40 45

Lys Met Glu Gln Lys Ala Lys Gln Asn Gln Val Ala Ser Pro Gln Pro

50 55 60

Pro His Pro Gly Glu Ile Thr Asn Ala His Asn Ser Ser Cys Ile Ser

65 70 75 80

Asn Lys Phe Ala Asn Asp Gly Ser Phe Leu Gln Gln Phe Leu Lys Leu

85 90 95

Gln Lys Ala Gln Thr Ser Thr Asp Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ala

100 105 110

Pro Pro Ser Thr Pro Thr Pro Ser Ala Gly Lys Arg Ser Leu Leu Ile

115 120 125

Ser Arg Arg Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Leu Pro Gly Pro Val Lys

130 135 140

Ser Tyr Ser His Ala Lys Gln Leu Pro Val Ala His Arg Pro Ser Val

145 150 155 160

Phe Gln Ser Pro Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Glu Gln Trp Leu

165 170 175

Glu Ile Lys Val Ser Pro Pro Glu Gly Ala Glu Thr Arg Lys Val Ile

180 185 190

Glu Lys Leu Ala Arg Phe Val Ala Glu Gly Gly Pro Glu Leu Glu Lys

195 200 205

Val Ala Met Glu Asp Tyr Lys Asp Asn Pro Ala Phe Ala Phe Leu His

210 215 220

Asp Lys Asn Ser Arg Glu Phe Leu Tyr Tyr Arg Lys Lys Val Ala Glu

225 230 235 240

Ile Arg Lys Glu Ala Gln Lys Ser Gln Ala Ala Ser Gln Lys Val Ser

245 250 255

Pro Pro Glu Asp Glu Glu Val Lys Asn Leu Ala Glu Lys Leu Ala Arg

260 265 270

Phe Ile Ala Asp Gly Gly Pro Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Gln Asn

275 280 285

Asn Arg Glu Asn Gln Ala Phe Ser Phe Leu Tyr Glu Pro Asn Ser Gln

290 295 300

Gly Tyr Lys Tyr Tyr Arg Gln Lys Leu Glu Glu Phe Arg Lys Ala Lys

305 310 315 320

Ala Ser Ser Thr Gly Ser Phe Thr Ala Pro Asp Pro Gly Leu Lys Arg

325 330 335

Lys Ser Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gly Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr

340 345 350

Cys Pro Ala Ser Ser Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ile Pro Ala Pro Ala

355 360 365

Ala Pro Gly Lys Pro Ala Ser Ala Ala Thr Val Lys Arg Lys Arg Lys

370 375 380

Ser Arg Trp Gly Pro Glu Glu Asp Lys Val Glu Leu Leu Pro Ala Glu

385 390 395 400

Leu Val Gln Arg Asp Val Asp Ala Ser Pro Ser Pro Leu Ser Val Gln

405 410 415

Asp Leu Lys Gly Leu Gly Tyr Glu Lys Gly Lys Pro Val Gly Leu Val

420 425 430

Gly Val Thr Glu Leu Ser Asp Ala Gln Lys Lys Gln Leu Lys Glu Gln

435 440 445

Gln Glu Met Gln Gln Met Tyr Asp Met Ile Met Gln His Lys Arg Ala

450 455 460

Met Gln Asp Met Gln Leu Leu Trp Glu Lys Ala Val Gln Gln His Gln

465 470 475 480

His Gly Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Val Asp Ser Glu Leu Gly Thr Trp

485 490 495

Glu His Gln Leu Arg Arg Met Glu Met Asp Lys Thr Arg Glu Trp Ala

500 505 510

Glu Gln Leu Thr Lys Met Gly Arg Gly Lys His Phe Ile Gly Asp Phe

515 520 525

Leu Pro Pro Asp Glu Leu Glu Lys Phe Met Glu Thr Phe Lys Ala Leu

530 535 540

Lys Glu Gly Arg Glu Pro Asp Tyr Ser Glu Tyr Lys Glu Phe Lys Leu

545 550 555 560

Thr Val Glu Asn Ile Gly Tyr Gln Met Leu Met Lys Met Gly Trp Lys

565 570 575

Glu Gly Glu Gly Leu Gly Ser Glu Gly Gln Gly Ile Lys Asn Pro Val

580 585 590

Asn Lys Gly Thr Thr Thr Val Asp Gly Ala Gly Phe Gly Ile Asp Arg

595 600 605

Pro Ala Glu Leu Ser Lys Glu Asp Asp Glu Tyr Glu Ala Phe Arg Lys

610 615 620

Arg Met Met Leu Ala Tyr Arg Phe Arg Pro Asn Pro Leu Asn Asn Pro

625 630 635 640

Arg Arg Pro Tyr Tyr

645

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Cari的肽

<400> 4

Ser Val Gln Asp Leu Lys Gly Leu Gly Tyr Glu Lys Gly Lys Pro Val

1 5 10 15

Gly Leu Val Gly Val Thr Glu Leu

20

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Cari的肽

<400> 5

Gly Tyr Glu Lys Gly Lys Pro Val Gly Leu Val Gly Val Thr Glu Leu

1 5 10 15

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cari序列的反义寡核苷酸

<400> 6

aagaggataa ggtagagctc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cari序列的反义寡核苷酸

<400> 7

aatgaccaac cgtccctgga c 21

Claims

1.一种能与胱冬酶原或突变蛋白或其片段相互作用的胞内多肽(Cari)，其特征在于，所述多肽包括SEQ ID NO：3、或同工型、DF5182_3以外的突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQ ID NO：2或其剪接变体编码。

3.如权利要求1和2中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽在体外被胱冬酶切割。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽在体内被胱冬酶切割。

5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，其特征在于，所述胱冬酶是胱冬酶-8。

6.如权利要求1所述的片段，其特征在于，所述片段对内源Cari多肽的活性有显性失活作用。

7.如权利要求6所述的片段或突变蛋白、融合蛋白或其衍生物，其特征在于，它们能抑制胱冬酶的细胞调亡作用。

8.如权利要求1所述的片段或突变蛋白、融合蛋白或其衍生物，其特征在于，它们能抑制Cari与胱冬酶相互作用。

9.如权利要求8所述的片段，其特征在于，所述片段包括SEQ ID NO：4中的氨基酸序列。

10.如权利要求8所述的片段，其特征在于，所述片段包括SEQ ID NO：5中的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的多肽或同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物，其特征在于，它们能增加胱冬酶的细胞调亡作用。

12.如权利要求11所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

13.如权利要求6-12中任一项所述的多肽、或突变蛋白或其片段，其特征在于，胱冬酶是胱冬酶-8。

14.一种DNA序列，其特征在于，所述序列编码权利要求1-13中任一项所述的多肽或同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段和融合蛋白。

15.一种DNA序列，其特征在于，所述序列能在适度严格条件下与权利要求14所述的DNA序列或对应SEQ ID NO：2的DNA序列杂合。

16.如权利要求14所述的DNA序列，其特征在于，所述序列编码SEQ ID NO：3的多肽。

17.如权利要求14所述的DNA序列，其特征在于，所述序列包括SEQ ID NO：3的DNA。

18.如权利要求14所述的DNA序列，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

19.如权利要求14所述的DNA序列，其特征在于，所述序列包括编码SEQ ID NO：4的序列。

20.如权利要求14所述的DNA序列，其特征在于，所述序列包括编码SEQ ID NO：5的序列。

21.一种核酶，其特征在于，所述核酶对权利要求14-20中任一项所述的DNA序列特异。

22.一种编码如权利要求14-20中任一项所述DNA反义序列的DNA序列，其特征在于，所述序列包括至少9个核苷。

23.如权利要求22所述的DNA，其特征在于，所述DNA包括SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7的序列。

24.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求14-23中任一项所述的DNA序列。

25.如权利要求24所述的载体，其特征在于，所述载体是表达载体。

26.如权利要求24所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。

27.一种载体，其特征在于，所述载体具有在细胞中发挥作用的调节序列，用于内源基因活化Cari或内源Cari抑制物。

28.一种多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、完全人源化的抗体、抗-抗Id抗体或其片段，其特征在于，它们用权利要求1-13中任一项所述的多肽片段或突变蛋白制备。

29.如权利要求28所述的抗体在发展用于检测生物流体中的Cari的免疫测定中的应用。

30.如权利要求29所述的抗体用于诊断目的。

31.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求25或26所述的载体。

32.一种制造Cari或同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求31所述的宿主细胞生长并分离产生的蛋白质。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述细胞是真核细胞。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是哺乳动物、昆虫或酵母细胞。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述细胞选自海拉细胞、293THEK和CHO细胞。

36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述细胞是原核细胞。

37.一种制造Cari或同工型、突变蛋白、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括产生转基因动物并分离动物体液中生成的蛋白质。

38.一种治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病的基因治疗方法，其特征在于，所述方法包括诱导Cari或突变蛋白、片段、反义和其核酶在有此需要的人类患者所需位置表达。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，片段包括Cari 422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

42.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7的序列。

43.一种治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括调节内源Cari或Cari抑制物，通过使权利要求27所述的载体靶向有此需要的人类患者的所需位置。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述方法用于内源基因活化Cari。

45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述方法用于内源基因活化Cari抑制物。

46.如权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽、突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物用于在细胞调亡引起过多细胞死亡的情况下负调节胱冬酶。

47.如权利要求46所述的应用，其特征在于，所述片段包括Cari 414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

48.如权利要求46所述的应用，其特征在于，所述片段包括Cari 422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

49.如权利要求14-23中任一项所述的DNA用于在细胞调亡引起过多细胞死亡的情况下负调节胱冬酶。

50.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述DNA包括SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7。

51.如权利要求24-27中任一项所述的载体用于在细胞调亡引起过多细胞死亡的情况下负调节胱冬酶。

52.如权利要求28所述的抗体用于在细胞调亡引起过多细胞死亡的情况下负调节胱冬酶。

53.使用如权利要求46-52中任一项所述的应用，其特征在于，所述胱冬酶是胱冬酶-8。

54.使用如权利要求46-55中任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞调亡由TNF受体信号途径诱导。

55.如权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物用于在需要过多细胞死亡的情况下正调节胱冬酶活性和增加细胞调亡。

56.如权利要求53所述的应用，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

57.如权利要求14-23中任一项所述的DNA用于在需要过多细胞死亡的情况下正调节胱冬酶活性和增加细胞调亡。

58.如权利要求24-27中任一项所述的载体用于在需要过多细胞死亡的情况下正调节胱冬酶活性和增加细胞调亡。

59.如权利要求28所述的抗体用于在需要过多细胞死亡的情况下正调节胱冬酶活性和增加细胞调亡。

60.如权利要求54-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述胱冬酶是胱冬酶-8。

61.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽、或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物。

62.如权利要求61所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病。

63.如权利要求61或62所述的药物组合物，其特征在于，所述突变蛋白是CariD600E。

64.如权利要求61或62所述的药物组合物，其特征在于，所述片段包括Cari414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

65.如权利要求61或61所述的药物组合物，其特征在于，所述片段包括Cari422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

66.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求14-23中任一项所述的DNA。

67.如权利要求66所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病。

68.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求24-27中任一项所述的载体。

69.如权利要求68所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病。

70.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求28所述的抗体。

71.如权利要求70所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性疾病。

72.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物，所述药物组合物用于治疗癌症。

73.如权利要求72所述的药物组合物，其特征在于，所述突变蛋白是CariD600E。

74.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求14或18中任一项所述的DNA，所述细合物用于治疗癌症。

75.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的权利要求24或26中任一项所述的载体，所述组合物用于治疗癌症。

76.一种药物组合物，其特征在于，所示组合物含有治疗有效量的权利要求28所述的抗体，所述组合物用于治疗癌症。

77.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有治疗有效量的Cari抑制物，所述组合物用于治疗或预防涉及Cari活性的疾病。

78.一种分离、鉴定和克隆另一个相同种类Cari多肽的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求14-23中任一项所述的DNA以筛选DNA文库。

79.一种从样品中分离、鉴定和克隆另一个相同种类Cari多肽的方法，所述样品选自体液、细胞提取物和DNA表达文库，其特征在于，所述方法包括用胱冬酶特异抗体共免疫沉淀胱冬酶和多肽。

80.一种分离、鉴定和克隆另一个相同种类Cari多肽的方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求28所述的抗体在样品中亲和纯化这种多肽。

81.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述样品选自体液、细胞提取物和DNA表达文库。

82.一种分离参与胞内信号过程的多肽或因子的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物作为酵母双杂交过程中的捕获物或饵。

83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

84.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

85.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

86.一种从样品中分离参与胞内信号过程的多肽或因子的方法，所述样品选自细胞提取物、人液体和表达文库，其特征在于，所述方法包括用权利要求28所述的抗体共免疫沉淀Cari和参与胞内信号产生的多肽或因子。

87.一种筛选拮抗Cari的肽或小分子的方法，其特征在于，所述方法包括高通量筛选和选择分子，所述分子能抑制权利要求1-13中任一项所述的Cari或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物与胱冬酶原-8相互作用。

88.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

89.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

90.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

91.一种筛选拮抗Cari的肽或小分子的方法，其特征在于，所述方法包括高通量筛选和选择分子，所述分子能抑制权利要求1-13中任一项所述的Cari或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物诱导的细胞调亡。

92.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

93.一种治疗和/或预防选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和癌症的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予有此需要的患者治疗有效量的权利要求1-13中任一项所述的Cari多肽或突变蛋白、同工型、等位基因变体、片段、融合蛋白或其衍生物。

94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述突变蛋白是Cari D600E。

95.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 414-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：4)。

96.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述片段包括Cari 422-437的氨基酸残基(SEQ ID NO：5)。

97.一种治疗和/或预防选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和癌症的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予有此需要的患者治疗有效量的权利要求14-23中任一项所述的DNA。

98.一种治疗和/或预防选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和癌症的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予有此需要的患者治疗有效量的权利要求24-27中任一项所述的载体。

99.一种治疗和/或预防选自带有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫性色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫性心肌炎I、HCV调节的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和癌症的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予有此需要的患者治疗有效量的权利要求28所述的抗体。