CN1350587A - 植物的获得性抗性基因 - Google Patents

Abstract

本发明披露了植物的新的获得性抗性基因。还提供了用所述基因生产抗病的转基因植物的方法。

Description

植物的获得性抗性基因 相关申请资料

本申请要求申请日为1999年5月13日的美国临时申请60/133965的优先权。

                      发明领域

本发明涉及植物的获得性抗性基因及其使用方法。具体地讲，本发明披露了编码获得性抗性基因的新型核酸序列，含有所述获得性抗性基因的转化的宿主细胞和转基因植物，以及用所述基因赋予植物对病原体的抗性的方法。还披露了制备转化的宿主细胞和转基因植物的方法。

                      发明背景

植物要接触其环境中的多种定居者，包括细菌、病毒、真菌和线虫。尽管所述生物与植物之间的相互作用，特别是通过植物根进行的相互作用是有益的，但许多相互作用对植物是有害的。由植物病原体，特别是真菌病原体导致的病害所引起的农业作物、观赏植物和其他植物的毁灭，是对经济有重大影响的世界范围内的问题。

对植物的损害是由多种属的病原体引起的。这些属包括链格孢属、壳二孢属、曲霉属、葡萄孢属、尾孢属、次盘孢属、色二孢属、欧文氏菌属、白粉菌属、镰孢属、顶囊壳属、长蠕孢属、壳球孢属、Magnaporthe、球腔菌属、丛赤壳属、霜霉属、茎点霉属、瘤梗孢属、疫霉属、单轴霉属、叉丝单囊壳属、假单胞属、柄锈菌属、Puthium、核腔菌属、Pyricularia、腐霉属、丝壳菌属、Scerotium，核盘菌属、壳针孢属、根串珠霉属、钩丝壳属、黑星菌属、轮枝孢属和黄单胞菌。属。

业已开发了多种化合物来对付以上各种病原体。化学抗真菌剂的例子包括多氧霉素、nikkomycines、羧基酰胺、芳族碳水化合物、萎锈灵、吗啉、甾醇生物合成的抑制剂，和有机磷化合物(Worthington和Walker，1983；US5421839)。所述化合物的活性通常局限于若干物种。由于病原体真菌的庞大数量和多样性，所述化合物不能提供限制植物感染的有效方法。

控制植物病原体感染的另一种方法包括利用植物的天然防御机制产生抗性。很多植物都产生了对某些病原体的天然抗性。不过，抗性有可能局限于特定属的病原体，或者农艺上感兴趣的作物可能不具有足够的抗性。因此，天然植物防御通常不能提供足够的对病原体的保护。通过扩大对病原体防御的范围或加强防御反应，有可能增强现有的抗性机制，并改善其他易感植物的病原体防御。

如果存在植物的天然防御机制并且有活性的话，该机制在预防病原体定居和发病方面是高度有效的。抗性是多级的，具有被动的和主动的，组成型的和诱导型的因子(Baker等，1997；Keen，1990；Ryals等，1996)。诱导型防御可以通过植物识别病原体决定子或诱导子来引发定居细胞死亡或在病原体侵袭部位引起过敏反应(HR)的作用而激活(Dixon等，1994)。这种定居的编程细胞死亡通常是由能识别病原体中的特定的关联“无毒”产物的抗性基因(R-基因)介导的(Greenberg，1997)。病原体侵袭的局部知觉通过涉及水杨酸(SA)的可传递的信号传送给远处的组织，进一步激活基因表达，并调节被称为系统获得性抗性的状态(SAR；Ryals等，1996；Sticher等，1997)。后来，业已惊奇的发现，抗性可以在靠近病原体侵袭部位以局部获得性抗性的形式表达，或者进行系统性诱导，这要取决于触发信号和植物种类。因此，系统和局部反应被统称为获得性抗性(AR)。AR的建立是植物的有效的防御阵线，因为它能提供对有可能引起疾病的病毒、细菌、和真菌攻击的广泛的抗性(Cameron等，1994；Gorlach等，1996；Ryals等，1996)。所述AR反应能引起一套编码病原体相关(PR)蛋白的基因的转录活化。其中包括水解酶、细胞壁强化蛋白、与氧化作用相关的蛋白，相信其组合能促进加强了的抗性(Sticher等，1997)。

生物化学和遗传学分析业已鉴定了与获得性抗性相关的基因和分子信号。Npr1/NIM1基因在拟南芥对多种真菌和细菌病原体的AR防御中起着关键的调控作用(Cao等，1994；Cao等，1997；Delaney等，1995；Ryals等，1997；WO98/06748；WO94/16077；WO98/26082)。突变型Npr1植物在受到减毒病原体刺激之后能诱导正常的HR，并积累SA，但不能积累PR蛋白或激活AR反应，这表明这种蛋白是在水杨酸下游的途径中起作用(Cao等，1994；Cao等，1997；Delaney等，1995)。Npr1蛋白的特征表明它具有转录调控子的作用，并且包括诸如锚蛋白重复的基序，暗示了蛋白-蛋白相互作用；核定位信号；推测的磷酸化位点；和与IFκB-哺乳动物系统中的一种转录调节子的同源性(Cao等，1994；Ryals等，1997)。业已证实了活化Npr1的核转运，增强了它在转录调控方面的可能作用(WO98/06748)。克隆基因的转基因超量表达进一步证实了Npr1在双子叶植物中的中心重要性。它能增强拟南芥对真菌和细菌病原体的抗病性(Cao等，1998；WO98/06748)。

尽管大量的AR研究业已确定了双子叶植物中的上述途径，但诸如小麦、水稻和大麦的单子叶植物具有预防病原体侵袭的诱导型途径(Hwang和Heitefuss，1982；Kmecl等，1995；Schweizer等，1989；Smith和Metraux，1991)。可以通过不同的外部刺激调节获得性抗性，包括减毒病原体刺激(Manandhar等，1998；Schaffrath等，1997)，病原体诱导物处理(Jin等，1997；Schaffrath等，1995；Waspi等，1998)，和化学处理，包括使用SA和SA类似物，如2，6-二氯异烟酸(INA)或苯并(1，2，3)thiodiazole-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)(Gorlach等，1996；Kessman等，1994；Kozel等，1994；Manandhar等，1998；Schaffrath等，1997；Watanabe等，1979)。由于同一种类型的激活化合物在单子叶和双子叶植物中对AR途径都具有诱导性，信号途径有可能存在部分保守性，因为PR基因的亚类似乎能诱导这两种类型(Mormis等，1998)。不过，还对单子叶植物的显著不同之处进行了研究，用AR诱导物发现了与新型PR基因相关的新的途径(Gorlach等，1996；Schaffrath等，1997)。在单子叶植物中，诱导的获得性抗性是广谱性的，从真菌到细菌病害，而与病原体的小种无关，被激活的抗性可能持续数周到数月，因此，在单子叶植物中操作AR途径可能会改善对没有抗性遗传资源的病原体的抗性。

因此，有必要在诸如小麦和水稻的单子叶植物中鉴定可能在疾病防御方面起关键作用的基因。预计所述基因在转基因植物中的超量表达会提高针对特定微生物病原体的抗病水平。因此，业已发现从水稻中分离的被称为Nph1的基因和从小麦中分离的Nph2的基因是由已知能刺激AR的化学诱导物诱导的。因此，预计AR的活化和Nph1和Nph2的诱导表达能保护小麦和水稻不受活体营养病原体的侵害。Nph1和Nph2的转基因超量表达应该能够调节针对病原体攻击的较强的AR，从而促进更有效的防病作用。

                       发明概述

本发明涉及植物获得性抗性(AR)途径上的关键调控基因的发现和使用。业已从水稻和小麦中分离并鉴定了分别被称为Nph1和Nph2的基因。在本发明的具体实施方案中，与Nph1和Nph2具有相同性的基因是植物获得性抗性途径的关键调控子。超量表达产生的转基因植物具有对多种病原体的增强了的抗病性，包括，但不限于真菌、细菌和病毒病原体。

在一方面，本发明提供了能增强水稻中的获得性抗性的新型核酸序列(SEQ ID NO：1)和在小麦中增强获得性抗性的新型核酸序列(SEQID NO：5和6)。

在另一方面，本发明提供了一种分离的DNA分子，它是选自下列一组的核苷酸序列或与之互补的序列：a)SEQ ID NO：1、5或6的核苷酸序列，它们分别编码SEQ ID NO：4、10或11的蛋白序列；b)通过遗传密码的简并性编码分别由SEQ ID NO：1、5或6的核苷酸序列所编码的SEQ ID NO：4、10或11的蛋白序列的核苷酸序列；和能与在a)和b)中所提到的任一种核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种编码获得性抗性基因多肽的DNA序列，所述多肽包括SEQ ID NO：4、10或11的至少15个氨基酸的连续的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了能够增强水稻的获得性抗性的新型蛋白序列(SEQ ID NO：4)和能增强小麦的获得性抗性的新型蛋白序列(SEQID NO：10和11)。

在另一方面，本发明披露了一种通过给植物提供足够量的SEQ IDNO：1、5和6的核苷酸序列以便增强植物的获得性抗性而控制植物病原体的方法。

在本发明的另一种实施方案中，提供了含有能增强对多种病原体的获得性抗性的核酸序列的植物细胞或转基因植物，以及由所述植物产生的含有所述核酸序列的种子或后代。

                      附图简述

图1表示来自拟南芥属和粘质烟草的Npr1双予叶同系物的推测氨基酸序列(Ausubel等，1998)与玉米克隆700214872序列(SEQ ID NO：17)的排比。

图2表示质粒pMON38201。

图3表示通过用INA进行化学处理在水稻(cv.M202)中诱导AR，并且预防稻瘟真菌(Magnaporthe grisea)。图3a是未处理过的对照叶片的示图，而图3b是用0.5mM INA处理过的叶片的示图。在处理3天之后用Magnaporthe grisea刺激这两种叶片，并在7天之后打分(照相)。

图4表示在INA处理之后并且用稻瘟真菌(Magnaporthe grisea)刺激之后通过Northern印迹分析得到的水稻Nph1的诱导型。

图5表示在INA处理之后并且预防白粉真菌(Erysiphe graminis fsphordei)之后在小麦(cv.TAM107)中诱导AR。5a)表示低放大倍数的模拟喷雾对照；5b)表示较小的特定部位的较高的放大倍数，5c)表示用200ppm INA喷雾的一部分叶片的低的放大示图，5d)表示相同叶片的较小部位的较高放大倍数。

图6表示在用INA处理之后小麦Nph2基因在小麦中表达的诱导形式的Northern印迹分析。用玉米EST700214872Npr1同系物检测Northern印迹。在每一个泳道上加0.5微克的小麦mRNA。泳道1，“0”时间植物；泳道2，在24小时时用INA处理过的植物；泳道3，48小时时用INA处理过的植物；泳道4，在72小时时用INA处理过的植物；泳道5，在96小时时用INA处理过的植物。

图7表示小麦Nph2在栽培种TAM107中的发育表达形式的Northern印迹分析。用0.7kb的小麦Nph2 PCR片段检测Northern印迹。在每一个泳道上加15微克的小麦(cv.Bobwhite)mRNA。泳道1，根组织；泳道2，子叶鞘；泳道3，叶基；泳道4，叶节1；泳道5，叶节2；泳道6，叶节3；泳道7，叶节4；泳道8，叶节5(叶尖)。

图8表示用于水稻转化的pMON30643二元质粒，它含有水稻Nph1cDNA，和内源水稻5’前导序列。二元粘粒载体的T-DNA结构包括：LB＝左臂；RB＝右臂；P-e35S＝花椰菜花叶病毒的强化35S启动子；Kan＝Tn5新霉素磷酸转移酶II的编码区；Nos3’＝胭脂氨酸合成酶基因的终止序列。

图9表示用于水稻转化的pMON30640二元质粒，它含有相当于推测的编码区的水稻Nph1 cDNA，并缺乏水稻5’前导序列。

图10表示用于水稻转化的pMON30637二元质粒，它含有相当于所使用的预测的编码区的小麦Nph2-1 cDNA。

图11表示用于通过粒子轰击转化水稻的pMON30645质粒，它含有包括内源水稻5’前导序列的水稻Nph1 cDNA。

图12表示用于通过粒子轰击转化水稻的pMON30644质粒，它含有相当于推测的编码区的小麦Nph2-1 cDNA。

图13表示用于小麦转化的pMON30635质粒，它含有小麦Nph2-1编码序列。

                 序列表中序列的简要说明

SEQ ID NO：1推测的编码区的水稻Nph1 cDNA序列

SEQ ID NO：2包括5’和3’UTRs的水稻Nph1 cDNA全长序列

SEQ ID NO：3从PCR扩增中回收的水稻Nph1片段

SEQ ID NO：4水稻Nph1推测的蛋白序列

SEQ ID NO：5预测的编码区的小麦Nph2-1 cDNA

SEQ ID NO：6预测的编码区的小麦Nph2-2 cDNA

SEQ ID NO：7包括5’和3’UTRs的小麦Nph2-1 cDNA全长序列

SEQ ID NO：8包括5’和3’UTRs的小麦Nph2-2 cDNA全长序列

SEQ ID NO：9从PCR扩增中回收的小麦Nph2片段

SEQ ID NO：10小麦Nph2-1推测的蛋白序列

SEQ ID NO：11小麦Nph2-2推测的蛋白序列

SEQ ID NO：12结构域1：相当于拟南芥属的Npr1蛋白(aa270-277)

SEQ ID NO：13结构域2：相当于拟南芥属的Npr1蛋白(aa501-507)

SEQ ID NO：14用于单子叶植物热扩增的OB09引物

SEQ ID NO：15用于单子叶植物热扩增的OB011引物

SEQ ID NO：16玉米克隆700214872核苷酸序列

SEQ ID NO：17玉米克隆700214872推测的氨基酸序列

SEQ ID NO：18玉米克隆700102819核苷酸序列

SEQ ID NO：19玉米克隆700102819推测的氨基酸序列

SEQ ID NO：20玉米重叠群CPR951.FLR核苷酸序列

SEQ ID NO：21玉米重叠群CPR951.FLR推测的氨基酸序列

SEQ ID NO：22 OB-01引物

SEQ ID NO：23 OB-02引物

SEQ ID NO：24 OB-18引物

SEQ ID NO：25 OB-19引物

SEQ ID NO：26 OB-28引物

SEQ ID NO：27 OB-29引物

SEQ ID NO：28 OB-38引物

SEQ ID NO：29 OB-39引物

SEQ ID NO：30 OB-61引物

SEQ ID NO：31 OB-62引物

SEQ ID NO：32 OB-63引物

SEQ ID NO：33 OB-64引物

SEQ ID NO：34水稻Nco1引物

SEQ ID NO：35 NS-10引物

SEQ ID NO：36用于抗体生产的番茄Npr1同系物蛋白序列

                      发明详述定义

为了明确一致地理解本说明书和权利要求书，包括所述术语的特定范围，提供了以下定义。

来自水稻的获得性抗性基因(Npr1同系物1)以下被称为Nph1(SEQID NO：2)。Nph1还等同于Npo1(Npr1同系物水稻1)。

来自小麦的获得性抗性基因(Npr1同系物2)以下被称为Nph2-1(SEQ ID NO：7)和Nph2-2(SEQ ID NO：8)。Nph2-1和Nph2-2又分别等同于Npw1和Npw2(Npr1同系物小麦1和2)。

来自玉米的获得性抗性基因的部分序列(SEQ ID NO：20)等同于Npc1(Npr1同系物玉米1)。

“获得性抗性”是指用某种化合物(激活剂)处理过的或者用不相容的病原体刺激过的植物中的诱导型激活的防御机制。用这种方法获得的抗性，能预防植物随后不受多种不同病原体的感染。

“抗原表位”是指能引起免疫反应的分子、蛋白或核酸的任何分立的片段，其中，所述免疫反应能导致与所述抗原表位发生反应的抗体的产生。

“编码序列”和“开放读框”是指编码一种蛋白、多肽或肽序列的连续核酸三联体的片段。

“抗病性”是指与不具有抗病性的易感植物相比，植物在接触植物病原体之后产生较少的发病症状的能力。抗病性包括对特定疾病的完全抗性并且还包括表现为减轻了的症状，较长时间的存活或其他疾病参数，如较高产量的不同程度的抗性。

“同系物”是指序列相同性为70％或更高。与探针序列非常接近的序列的显著同源性是指所述序列能在68℃下与探针杂交过夜(至少16小时)，并在严格条件下洗涤(68℃，最后一次用0.1×SSC/0.1％SDS)。最终在50℃下在2×SSC中洗涤可以鉴定与探针有大约75％的同源性的序列。不过，严格性和序列同源性之间的确切关系取决于碱基组成、探针长度、和同源片段的长度(Hames和Higgins，1985)。所述杂交条件优选表示在TM值为35-45℃的杂交。最优选的是，显著的同源性是指能在严格条件下与参考序列杂交的DNA序列。

“杂交”是指一股核酸通过碱基配对与一个互补链结合的能力。杂交是在两个核酸链之间的互补序列彼此结合时发生的。

“过敏反应”(HR)是植物对病原体的一种防御。它包括在靠近感染部位发生的快速细胞坏死，这种坏死与活性氧的产生相关，产生抗微生物化合物，和宿主细胞壁的加强。能在特定宿主上引起HR的病原体对该宿主是无毒的，该宿主是抗性的，并且植物-病原体相互作用是不相容的。

“相同的”核酸或蛋白序列是使用购自GCG的诸如GAP或BestFit程序(遗传学计算机组公司，Madison，WI)，用预设参数确定的。

“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

“植物”在这里使用其广义，并且指分化过的植物和未分化过的植物材料，如原生质体、植物细胞、种子、小植株等，所述材料在合适条件下能发育成成熟植物，其后代，及其部分，如所述植物的切穗和果实。

“表型”是指由生物所表现出来的由于基因型和环境的相互作用所产生的性状。

“聚腺苷酸化信号”或“polyA信号”是指位于编码片段的3’末端的核酸序列，它能促进在有编码区转录的mRNA的3’末端添加腺苷酸核苷酸。

“启动子”或“启动子区”是指通常出现在编码序列的上游(5’)的核酸序列，它通过提供RNA聚合酶或在正确位点开始转录所必需的其他因子的识别位点，控制mRNA的产生来控制所述编码序列的表达。

“重组核酸载体”是指能够整合到基因组中或自主复制的来自任何来源的任何制剂，如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、或线性或环化单链或双链DNA或RNA核苷酸片段，它包括其中有一个或多个核酸序列是以功能性操作方式连接的核酸分子。所述重组核酸结构或载体能够将5’调控序列或启动子片段和编码特定基因产物的DNA序列以如下方式导入细胞：所述DNA序列被转录成有功能的mRNA，随后再将mRNA翻译成多肽或蛋白。可以构建重组核酸结构或重组载体，以便能够表达反义RNA，从而抑制感兴趣的特定RNA的翻译。

“再生”是指由植物细胞(例如植物原生质体或外殖体)生长出植株的过程。

“抗性基因”是编码一种蛋白的核酸分离物，所述蛋白与信号传导途径的诱导直接或间接相关，在所述植物接触特定病原体或昆虫时，所述途径最终会导致针对所有病原体或昆虫的植物防御反应。抗性基因产物是根据被称为诱导物的病原体信号分子而激活的。

“选择标记”是指一种核酸序列，它的表达能产生有利于识别含有该核酸序列的细胞的表型。选择标记包括能产生对有毒化合物的抗性(例如，氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、草甘膦抗性)，弥补营养缺陷型(尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸)或产生肉眼可分辨的特征(例如，颜色改变或荧光)的标记。

“结构基因”表示能表达产生一种多肽的基因。

“结构编码序列”是指编码肽、多肽或蛋白的DNA序列，所述蛋白是由细胞将所述结构编码序列转录成mRNA，再由mRNA翻译成所需要的肽、多肽、或蛋白产物而产生的。

“转录”是指由DNA模板产生RNA拷贝的过程。

“转化”是指将外源核酸序列(例如，载体、重组核酸分子)导入细胞或原生质体的过程，其中，所述外源核酸被整合到染色体上，或者能够自主复制。

“转基因”是指在它里面整合了外源核酸序列的生物。

“载体”是指能将外源DNA载入宿主生物中的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。

本发明涉及植物的获得性抗性基因，及其使用方法。具体地讲，本发明披露了编码能激活植物中的获得性抗性基因的新型核酸序列，含有获得性抗性基因的转化过的宿主细胞和转基因植物，以及用于在植物中产生对病原体的抗性的方法。还披露了用于制备转化的宿主细胞和转基因植物的方法。核酸序列

本发明还涉及一种核酸序列，它包括与SEQ ID NO：1的相同性至少为大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％的核酸序列，并且最优选是SEQ ID NO：1。

另外，所述核酸序列与SEQ ID NO：5的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：5。

另外，所述核酸序列与SEQ ID NO：6的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：6。

所述结构核酸基因可以从各种植物、动物、细菌、和真菌中获得(即克隆或分离)，并用于本发明中。所述结构核酸序列优选来自植物、真菌或细菌来源，或者是化学合成的。核酸杂交

可以根据其与互补序列杂交的能力进一步鉴定所述核酸序列。核酸杂交是DNA操作领域技术人员所熟知的技术。特定核酸对的杂交特性是其相似性或相同性的指标。

可以用低严格条件筛选与靶序列有较低序列相同性的序列。人们可能希望采用诸如大约0.15M-大约0.9M氯化钠，大约20-大约55℃的温度的条件。可以用高严格条件筛选与所披露的序列有较高程度相同性的核酸序列(Sambrook等，1989)。

高严格条件通常包括在大约2×-大约10×SSC(用蒸馏水稀释含有3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠pH7.0的20×SSC母液稀释而成)，大约2.5倍-大约5倍Denhardt’s溶液(用蒸馏水由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50倍母液稀释而成)，大约10-100毫克/毫升鱼精DNA，和大约0.02％(w/v)-大约0.1％(w/v)SDS中进行核酸杂交，在大约50-大约70℃下培养数小时至过夜。高严格条件优选由6倍SSC、5倍Denhardt’s溶液、100毫克/毫升鱼精DNA，和0.1％(w/v)SDS提供，在55℃下培养数小时。

杂交之后通常进行若干个洗涤步骤。洗涤组合物通常包括0.5-大约10倍SSC，和0.01-0.5％(w/v)SDS，在大约20-70℃下培养15分钟。优选在用0.1倍SSC在65℃下洗涤至少1次之后，所述核酸片段保持杂交。

所述核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补体杂交。另外，所述核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：5或其互补体杂交。所述核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：6或其互补体杂交。蛋白序列

本发明还涉及一种蛋白序列，它与SEQ ID NO：4的相同性优选为至少为大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白序列，并且最优选是SEQ ID NO：4。

另外，所述蛋白序列与SEQ ID NO：10的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：10。

另外，所述蛋白序列与SEQ ID NO：11的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：11。

为了进一步协助SEQ ID NO：4、10或11的蛋白的研究和应用，可以制备抗体。所述抗体可以是针对能提供抗原表位的所述蛋白的任何部分。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。所述抗体优选与SEQ IDNO：4、10或11有免疫反应性。

与SEQ ID NO：4、10或11的相同性至少为70％-100％的蛋白优选与所述抗体反应。

可以通过ELISA、放射免疫测定、免疫吸印、Western印迹、免疫荧光、免疫沉淀或任何其他相当的方法用所述抗体检测SEQ ID NO：4、10或11的存在。另外，可以设计采用了上述技术中的一种或多种的试剂盒，该试剂盒利用上述抗体检测序列4、10或11。密码子使用

由于遗传密码的简并性，可以用不同的核苷酸密码子来编码特定的氨基酸。宿主细胞通常表现出一种优选的密码子使用形式(Campbell等，1990)。优选构建核酸序列，以便利用特定宿主细胞的密码子使用形式。这通常能增强所述核酸序列在转化过的宿主细胞中的表达。本发明所披露的核酸序列优选使用细菌、真菌或植物宿主细胞的最佳密码子使用。修饰编码获得性抗性蛋白的核酸序列

改变编码获得性抗性蛋白的核酸序列会得到突变型获得性抗性蛋白序列。与本文所披露的序列相比，它具有相同的或更好的获得性抗性特征。突变可以包括亚基序列的缺失、插入、截短、取代、融合和改组等。

核酸序列的突变可以专一性或随机形式引入，这两种方法都是分子生物学领域的技术人员所熟知的。存在多种定向诱变技术，通常使用寡核苷酸将突变引入核酸序列上的特定位点。其例子包括单链拯救(Kunkel，1985)，单一位点消除(Deng和Nickloff，1992)，缺口保护(Vandeyar等，1988)和PCR(Costa等，1996)。可以通过诸如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，1998；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)的化学制剂或通过诸如用突变菌株传代的生物学方法(Greener等，1997)产生随机的或非专一性的突变(一般性综述参见Singer和Kusmierek，1982)。

所述修饰能导致氨基酸序列的保守性或非保守性变化。由于在核酸序列上添加、缺失、取代等所产生的保守性改变不会改变该蛋白的最终的氨基酸序列。非保守性改变包括能产生改变了的氨基酸序列的添加、缺失和取代。

产生上述改变的其他方法披露于以下文献中：Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)；和Walder等(1986)。

可以对本发明的蛋白序列和编码该蛋白的核酸片段进行修饰和改变，而仍然能获得编码具有所需抗性特征的蛋白的功能性分子。以下讨论基于改变一种蛋白的氨基酸序列，以便产生一种等同的或者可能是改善了的二代分子。氨基酸的改变可以通过按照本领域已知的标准密码子表改变核酸序列的密码子而实现。

某些氨基酸可以取代蛋白序列上的其他氨基酸，而不会使酶促活性明显丧失。因此，可以对所披露的蛋白序列的肽序列或其相应的核酸序列进行各种改变而不会使其生物学活性明显丧失。

在进行上述改变时，可能需要考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在蛋白上产生相互作用的生物学功能方面的重要性为本领域所普遍理解(Kyte和Doolittle，1982)。得到认可的是氨基酸的相对亲水性特征决定了所得到蛋白的二级结构，其二级结构又决定了该蛋白与诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、和抗原之类的其他分子的相互作用。

根据其疏水性和电荷特征确定了每一种氨基酸的亲水性指数。其中包括异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；苯氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷胺酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域众所周知的是，某些氨基酸可以被具有相似的亲水指数或等级的其他氨基酸所取代，并且仍然能得到一种具有相似的生物学活性的蛋白，就是说仍然能获得有生物学功能的蛋白。在产生所述改变时，氨基酸的取代优选亲水性指数在±2之内的氨基酸，更优选在±1之内的氨基酸，最优选在±0.5之内的氨基酸。

本领域还了解的是，诸如氨基酸的取代可以根据亲水性有效进行。US4554101(Hopp，T.P.，于1985年11月19日授权)指出，由其相邻氨基酸的疏水性控制的一种蛋白的最大局部平均疏水性与该蛋白的生物学特性相关。业已确定了氨基酸的以下亲水性值：精氨酸-赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷胺酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-0.1)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。

可以理解的是，一种氨基酸可以被具有相似亲水性等级的其他氨基酸所取代，并且仍然能得到具有相似生物学活性的蛋白，即仍然能获得有生物学功能的蛋白。在产生这种改变时，氨基酸取代优选亲水性指数在±2之内的氨基酸，更优选在±1之内的氨基酸，最优选在±0.5之内的氨基酸。

因此，如上文所述，氨基酸取代是基于氨基酸侧链取代的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、和大小等。综合考虑了上述各种特征的典型的取代为本领域技术人员所熟知，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。也可以采用预计不会产生好处的改变，如果这会得到有功能的获得性抗性蛋白的话。重组载体

上面提到的任一种结构核酸序列都可用于制备重组载体。重组载体通常沿5’到3’方向包括：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子，和3’聚腺苷酸化信号。重组载体还可以包括非翻译序列，转运和定向序列，选择标记，增强子，或操纵子。

制备重组载体的方法为本领域所熟知。制备特别适用于植物转化的重组载体的方法披露于US4971908，4940835，4769061和4757011中。业已对载体的类型作过综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。

可用于在高等植物中表达核酸的典型的载体为本领域所熟知，并且包括源于根癌农杆菌的Ti质粒的载体(Rogers等1987)。还披露了包括pCaMVCN转移控制载体在内的用于植物转化的其他重组载体(Fromm等，1985)。启动子

合适启动子的选择取决于将要用在它里面的宿主细胞的类型。能在细菌、酵母和植物中起作用的启动子在现有技术中有详细的介绍。

还可以根据所提供的转录调控选择启动子。所述调控可以包括转录活性、可诱导性、组织专一性、和发育阶段专一性的增强。在植物中，业已披露了来源于病毒或合成的诱导型启动子、组成型启动子、时序调控启动子和空间调控启动子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。

常用的组成型启动子包括CaMV35S启动子(Odell，1985)，强化CaMV35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，1987)，强化FMV启动子，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，和章鱼氨酸(ocs)启动子。

有用的诱导型启动子包括可以通过水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1，Williams等，1992)，或通过诸如2，6-二氯异烟酸(INA)或苯并(1，2，3)硫二唑-7-羧酸S-甲酯(BTH)的SA类似物诱导的启动子(Gorlach等，1996；Kessman等，1994)，通过使用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂，Hershey和Stoner，1991)诱导的启动子，热激启动子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，源于菠菜亚硝酸还原酶序列的硝酸诱导型启动子(Back等，1991)，激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，WCI-3启动子，和与RuBP羧化酶和LHCP家族相关的光诱导型启动子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，1991；Lam和Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。

有用的组织专一性、发育调控的启动子的例子包括β-conglycinin7S启动子(Doyle等，1986；Slighton和Beachy，1987)和种子专一性启动子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam和Chua，1991；Stayton等，1991)。可用于在种子质体中进行优势表达的在植物中起作用的启动子包括来自植物储存蛋白和来自与含有种子中脂肪酸生物合成相关的蛋白的启动子。所述启动子的例子包括来自诸如napin(Kridl等，1991)、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP脱饱和酶和油质蛋白的5’调控区的启动子。种子专一性调控披露于EP0255378中。

合适的启动子还可以在植物针对病原体感染的防御反应期间诱导。通常，病原体感染会引发受感染植物诱导大量的致病相关(PR)蛋白(Bowles，1990；Bol等，1990；Gorlach等，1996；Linthorst，1991)。所述PR序列可以编码参与苯基丙酸代谢的酶(例如，苯丙氨酸氨裂解酶，查尔酮合成酶)，能修饰植物细胞壁的蛋白(例如，富含羟基脯氨酸的糖蛋白，富含甘氨酸的蛋白，过氧化物酶)，能降解真菌细胞壁的酶(例如，壳多糖酶，葡聚糖酶)，奇甜蛋白样蛋白，脂肪氧合酶，半胱氨酸蛋白酶或具有未知功能的蛋白。来自基因Pir7b(Waspi等，1998)，Rirla(Mauch等，1998)，Rirlb(Mauch等，1998)和WIR1a(Bull等，1992)的启动子可用于本发明。

可以获得上述PR序列的启动子并用于本发明中。业已报导了从番茄植物中分离的PR启动子(Fritzemeier等，1987；Cuypers等，1988；Lozemann等，1989；Matton等，1989；Schroder等，1992)，从烟草植物中分离的PR启动子(Martini等，1993)，和从芦笋植物中分离的PR启动子(Warner等，1994)。

还可以构建启动子杂合体，以便增强转录活性(Comai，L.和Moran，P.M.，US5106739，1992年4月21日授权)，或组合需要的转录活性和组织专一性。

在本发明中具有特殊用途的启动子包括携带在根癌农杆菌的Ti质粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)、甘露氨酸合成酶(mas)和章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；强化CaMV35S启动子；玄参花叶病毒(FMV)35S启动子，强化FMV35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel等，1995)；4ASI启动子；RB7启动子；来自拟南芥属的AtEF1启动子；hsp90启动子；玉米蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；玉米醇脱氢酶1(Vozel等，1989)；玉米集光复合体(Simpson，1986)；玉米热激蛋白(Odell等，1985)；来自拟南芥属的壳多糖启动子(Samac等，1991)；来自花茎甘蓝LTP(脂转移蛋白)启动子(Pyee等，1995)；矮牵牛查尔酮异构酶(Van Dunen等，1988)；菜豆富含甘氨酸的蛋白1(Keller等，1989)；马铃薯patatin(Wenzler等，1989)；来自玉米的遍在蛋白启动子(Christensen等，1992)；hsp90启动子(Marrs等，1993；Yabe等，1994)；甘蔗badnavirus启动子；水稻RC2启动子；和来自水稻的肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。以上所有启动子都被用于制备各种类型的业已在植物中表达过的DNA结构。例如，有关这方面的内容可以参见US5034322。结构核酸序列

所述结构核酸序列优选编码与SEQ ID NO：4的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：4的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：4。

另外，所述结构核酸序列优选编码与SEQ ID NO：10的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：10的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：10。

另外，所述结构核酸序列优选编码与SEQ ID NO：11的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：11的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：11。

另外，所述核酸序列与SEQ ID NO：1的相同性优选为至少大约70％，更优选为至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：1。

另外，所述核酸序列与SEQ ID NO：5的相同性优选为至少大约70％，更优选为至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：5。

另外，所述核酸序列与SEQ ID NO：6的相同性优选为至少大约70％，更优选为至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：6。

还可以通过其与互补序列杂交的能力进一步鉴定所述结构核酸序列。在现有技术中对核酸杂交的各种条件有详细说明(Sambrook等，1989；Ausubel等，1995)。所述核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补体杂交。另外，所述结构核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：5或其互补体杂交。另外，所述结构核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：6或其互补体杂交。

所述重组载体还可以包括编码转运肽的核酸序列。这种肽可用于将一种蛋白引导到胞外空间或引导到细胞内部或外部的某些其他区室中。

所述结构核酸序列可以从各种植物、动物、细菌和真菌中获得，并用于本发明中。所述结构核酸序列优选源于植物、真菌、或细菌来源，或者是化学合成的。重组载体的其他因子

3’非翻译区通常能提供一个转录终止信号，而能在植物中起作用的聚腺苷酸化信号能导致腺苷酸核苷酸添加到mRNA的3’末端。以上部分可以从胭脂氨酸合成酶(nos)编码区、大豆7S储存蛋白编码序列、和豌豆ssRUBISCO E9编码序列的3’片段获得，或者从农杆菌属Ti质粒获得(Fischhoff等，US5500365)。

所述重组载体还可以包括一个选择标记。用作选择标记的核酸序列在细胞中起作用产生一种表型，该表型有利于该细胞不含有所述标记的细胞的区别。有用的选择标记包括GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素磷酸转移酶II(nptII)、荧光素酶(LUX)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、抗生素抗性序列、和除草剂(例如，草甘膦)抗性序列。所述选择标记优选为卡那霉素、潮霉素、或除草剂抗性标记。

通常，核酸序列位于起着终止转录作用的聚腺苷酸化位点下游数百个碱基对的部位。以上片段是进行转录的mRNA的有效聚腺苷酸化所必需的。

翻译增强子还可以作为重组载体的一部分整合。因此，所述重组载体优选包括一个或多个5’非翻译前导序列，该序列起着增强所述核酸序列表达的作用。所述增强序列是增强或改变所得到的mRNA的翻译效率所需要的。探针和引物

可以生产具有与互补的核酸序列进行专一性杂交的能力的短的核酸序列，并用于本发明中。所述短的核酸分子可以被用作探针，以便鉴定互补序列在特定样品中的存在。因此，通过构建与特定核酸序列的一小部分互补的核酸探针，可以证实该序列的存在。使用所述探针，可极大地方便含有特定核酸序列(例如，编码获得性抗性基因的核酸序列)的转基因植物的鉴定。所述探针还可被用于筛选编码获得性抗性基因的其他序列的cDNA或基因组文库。

另外，还可以用所述短的核酸序列作为寡核苷酸引物。通过PCR技术扩增或诱变一种互补的核酸序列。所述引物也可方便相关互补序列(例如，来自其他物种的相关的核酸序列)的扩增。

所述引物或探针通常互补于要被鉴定、扩增或诱变的核酸序列的一部分。所述引物或探针应当具有足够的长度，以便与其互补体形成稳定的、序列专一性双链分子。所述引物或探针的长度优选为大约10-大约200个核苷酸，更优选为大约10-大约100个核苷酸，更优选为大约10-大约50个核苷酸，最优选为大约14-大约30个核苷酸。

所述引物或探针可以通过直接化学合成，通过PCR(US6683195和4683202)制备，或者通过剪切来自较大核酸分子的核酸特定片段而制备。转基因植物和转化过的宿主细胞

本发明还涉及转基因植物和转化过的宿主细胞，它沿5’-3’方向包括：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子，和3’聚腺苷酸化信号。

所述启动子可以是种子选择性的、组织选择性的、组成型的、或诱导型的。所述启动子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)、章鱼氨酸合成酶(OCS)、甘露氨酸合成酶(mas)、花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S和CaMV35S)、强化CaMV(eCaMV)、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)、玄参花叶病毒(FMV)、强化FMV、CaMV衍生的AS4、烟草RB7、烟草EIF-4、凝集素蛋白(Le1)、4ASI、RB7、拟南芥属AtEF1、hsp90、水稻RC2启动子和甘蔗badnavirus启动子。

所述结构核酸序列编码与SEQ ID NO：4的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：4的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：4。

另外，所述结构核酸序列编码与SEQ ID NO：10的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：10的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：10。

另外，所述结构核酸序列编码与SEQ ID NO：11的相同性至少为大约70％的蛋白，更优选编码与SEQ ID NO：11的相同性至少为大约75％、80％、85％、90％或95％的蛋白，并且最优选编码SEQ ID NO：11。

另外，所述结构核酸序列与SEQ ID NO：1的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：1。

另外，所述结构核酸序列与SEQ ID NO：5的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：5。

另外，所述结构核酸序列与SEQ ID NO：6的相同性优选为至少大约70％，更优选至少大约75％、80％、85％、90％或95％，并且最优选是SEQ ID NO：6。

还可以通过其与互补序列杂交的能力进一步鉴定所述结构核酸序列。在现有技术中对核酸杂交的各种条件有详细说明(Sambrook等，1989；Ausubel等，1995)。所述核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补体杂交。另外，所述结构核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：5或其互补体杂交。另外，所述结构核酸序列优选能在低的或高的严格条件下与SEQ ID NO：6或其互补体杂交。

转化的宿主细胞通常可以是与本发明相容的任何细胞。转化过的宿主细胞优选是原核细胞，如细菌细胞，更优选是农杆菌属、节杆菌属、固氮螺菌属、棍状杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、或根瘤杆菌属细胞。转化过的宿主细胞优选是真核细胞、更优选是植物、酵母或真菌细胞。如果选择酵母细胞进行转化的话，它优选是酿酒酵母、粟酒裂殖酵母或巴斯德毕赤酵母。如果选择植物细胞进行转化的话，它可以是能够被转化的任何类型的植物，优选具有农艺、园艺、观赏、经济或商业价值的植物，更优选金合欢属、苜蓿、小茴香、苹果、杏、朝鲜冀、arugula、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、欧洲越橘、花茎甘蓝、抱子甘蓝、甘蓝、canola、硬皮甜瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻籽、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、cilantro、柑橘、宽皮橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、Douglas冷杉、茄子、苦苣、escarole、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、葡萄果实、密瓜、球根牵牛、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、橡树、油棕榈、油籽油菜、秋葵、橄榄、洋葱、橙子，观赏植物，棕榈、番木瓜、欧芹、欧洲防风、豌豆、桃、花生、梨、辣椒、柿子、松树、凤梨、车前草、李、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、XK辐射松、radicchio、红萝卜、油菜、悬钩子、水稻、黑麦、高粱、Southern松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香木、蜜柑、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、萝卜、葡萄树、西瓜、小麦、山药和小西葫芦细胞。

然后可以用本领域技术人员熟悉的技术由所述转化的细胞再生转基因植物。所得到的转基因植物相对同一物种的非转基因植物来说优选对病原体感染有更高的抗性。

制备含有获得性抗性基因的转化过的宿主细胞的方法。

本发明还涉及一种制备转化过的宿主细胞的方法，该细胞沿5’-3’方向包括：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子，和3’聚腺苷酸化信号。

所述方法通常包括以下步骤：选择合适的宿主细胞，用重组载体转化所述宿主细胞，并获得转化过的宿主细胞(Newell等，1991)。存在多种将核酸导入宿主细胞的方法。合适的方法包括细菌感染(例如，农杆菌属)，二元细菌人工染色体载体，DNA的直接输送(例如，通常PEG-介导的转化，干燥/抑制介导的DNA吸收，电穿孔、用碳化硅纤维进行搅拌，和对用DNA包衣的颗粒进行加速等)(综述参见Potrykus等，1991)。

用于将DNA导入细胞的技术为本领域技术人员所熟知。这些方法通常可以划分成四类：(1)化学方法(Graham和Van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法，如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；US5384253)，和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；和(4)受体介导的机制(Curiel等，1992；Wagnel等，1992)。

另外，可以通过直接注射植物的生殖器官将核酸导入花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Lul等，1988；Pena等，1987)。所述核酸序列还可以被注射到未成熟的胚胎中(Neuhaus等，1987)。

用于转化所述宿主细胞的重组载体通常沿5’-3’方向包括：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子和3’聚腺苷酸化信号。所述重组载体还可以包括非翻译序列，转运和定向序列，筛选标记，增强子，或操纵子。制备含有获得性抗性基因的转基因植物的方法

本发明还涉及一种制备与同一物种的非转基因植物相比具有更高的抗病原体感染能力的转基因植物的方法，该方法包括选择合适的植物细胞，用重组载体转化所述植物细胞，和获得转化过的宿主细胞。

所述重组载体通常沿3’-5’方向包括：指导结构核酸序列转录的启动子，结构核酸序列，3’转录终止子和3’聚腺苷酸化信号。所述重组载体还可以包括非翻译序列，转运和定向序列，筛选标记，增强子，或操纵子。

由转化的植物原生质体或外殖体开始进行的植物再生、发育、和培养在本领域中有详细的介绍(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)。在该方法中，通常在能筛选成功转化过的细胞并诱导植物幼芽再生的培养基存在的条件下培养转化体(Fraley等，1983)。所述幼芽通常是在2-4个月内获得的。

然后将所述幼芽转移到含有筛选试剂和用于防止细菌生长的抗生素的合适的根诱导培养基中。很多幼芽会长出根。然后将其移植到土壤或其他培养基中，以便让根继续发育。如上文所述的方法通常根据所使用的特定植物品系而改变。

再生的转基因植物优选是自花授粉的，以便提供纯合的转基因植物。另外，可以让从再生的转基因植物上获得的花粉与非转基因植物杂交，优选与在农业上有重要价值的品种的自交系杂交。相反，可以用来自非转基因植物的花粉对所述再生的转基因植物进行授粉。

所述转基因植物能将编码获得性抗性蛋白的核酸序列传给其后代。所述转基因植物在编码获得性抗性蛋白的核酸方面优选是纯合，并通过有性繁殖将该序列传给它的所有后代。后代可以由转基因植物产生的种子长成。然后让所述其他植物自花授粉，以便产生植物的真实的繁殖系。

对来自所述植物的后代的基因表达和抗病性等进行评估(例如，获得性抗性的诱导)。基因表达可以用若干种常用方法检测，如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀和ELISA。抗病性通常是在多种环境条件下在大田中、温室中、或生长箱中进行测定。

实施例

下面的实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例不能被理解成是对权利要求书的范围和含义的限定。例1：从水稻和小麦中鉴定获得性抗性基因

用拟南芥属Npr1基因序列检索玉米EST(Incyte)数据库(Cao等，1997)，以便鉴定单子叶同系物。该检索是用购自GCG(遗传学计算机组，Madison，WI)的软件进行的。该检索得到了与Npr1有弱的DNA同源性的19个EST(在氨基酸水平上与推测的Npr1蛋白的相同性为25-46％)。聚类分析表明，两个玉米克隆代表两类EST：克隆700214872相当于4EST；克隆700102819相当于3EST。对玉米克隆700214872进行的全长测序表明，它含有1385bp的cDNA插入片段(SEQ ID NO：16)，它有可能编码381个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：17)。由克隆700214872推测的蛋白与拟南芥属Npr1蛋白的220号氨基酸至C-末端吻合，这一部分跨越该蛋白的锚蛋白重复结构域和该蛋白的C-末端的一半。该克隆来自文库SATMON016(申请日为1998年5月15日的美国申请60/085533)，所述文库是用玉米叶鞘组织制备的。

玉米克隆700102819含有一个较小的640bp的cDNA插入片段(SEQ ID NO：18)，它有可能编码一种有126个氨基酸的多肽(SEQID NO：19)，它与拟南芥属Npr1的C-末端吻合，并证实了玉米克隆700214872推测的蛋白序列。组装所有玉米cDNA的2235bp的重叠群CPR951FL(SEQ ID NO：20)，它有可能编码具有409个氨基酸的序列蛋白(SEQ ID NO：21)，证实了关键的单子叶专一性结构域。

玉米克隆700214872与不同双子叶Npr1同系物，即拟南芥属和粘质烟草(Ausubel等，1998)(图1)的排比，证实了两个高度保守的区域：具有氨基酸HRALDSDD的结构域1，相当于拟南芥属Npr1的270-277号氨基酸(SEQ ID NO：12)，和具有氨基酸ELGRRYF的结构域2，相当于Npr1的501-507号氨基酸(SEQ ID NO：13)。用以上片段设计简并引物OB09：5’-CAYARIGCIYTIGAYWSIGAYGA-3’(SEQID NO：14)和OB11：5’-RAARWAICKIYKICCIARYTC-3’(SEQ IDNO：15)(Y＝C，T；R＝A，G；I＝肌苷；W＝A，T；S＝G，C；K＝G，T)。

为了扩增源于单子叶植物的获得性抗性序列，用引物OB09和OB11进行聚合酶链式反应(PCR)。对氯化镁浓度和引物退火温度的条件进行优化。2.5-3.0mM的氯化镁浓度和44℃的退火温度能够产生强的、可再现的PCR扩增产物(35轮PCR：94℃5分钟/94℃1分钟/44℃45秒/72℃1分钟/72℃10分钟)。在上述条件下，水稻(cv.M202)、小麦(cv.Bobwhite)、大麦(cv.Perry)、和玉米(cv.B-73)基因组DNA的扩增产生了大约为1.5kb和0.7kb的两种片段。将OB09-OB11引物用于从不同组织来源中获得的水稻(cv.M202)、小麦(cv.Bobwhite)、大麦(cv.Perry)RNA的RT-PCR中，产生了大小为大约0.7kb的带。按照生产商的说明用TRIZOL试剂(GibcoBRL，生命技术，Rockville，MD)纯化总RNA。用PolyATract mRNA分离系统IV(Promega，Madison，WI)从不同来源中回收纯化的PolyA+mRNA。为了进行逆转录反应，用4微升PolyA+mRNA作模板，用DT锚定引物在生产商推荐的条件下制备cDNA(CloneTech，PaloAlto，CA)。用OB09-OB11引物对所得到的cDNA产物进行PCR(35轮PCR：94℃5分钟/94℃1分钟/44℃45秒/72℃1分钟/72℃10分钟)。通过琼脂糖凝胶电泳分离来自上述实验的PCR产物。按照生产商的说明(Qiagen，Valencia，CA)从凝胶(Qiaex II凝胶提取试剂盒)中洗脱扩增的片段，将其克隆到接受直接克隆的PCR产物的pMON38201(图2)上，并对插入片段进行序列分析(ABIPRISMDye终止子循环测序Perkin-Elmer，Foster市，CA)。

通过采用这种方法，我们能够克隆据信能在水稻或小麦的获得性抗性途径上起作用的基因片段。上述同系物被称为Nph，水稻基因被命名为Nph1，而小麦基因被命名为Nph2。

通过公开的RT-PCR方法从黄化水稻组织和幼小的绿色叶片组织中分离水稻Nph1片段。按照生产商的说明用TRIZOL试剂(GibcoBRL，生命技术，Rockyille，MD)纯化总RNA。用PolyATractmRNA分离系统IV(Promega，Madison，WI)按照厂商说明回收PolyA+RNA。为了进行逆转录，将0.5微克纯化的PolyA+RNA作模板，用DT锚定引物制备的cDNA，在生产商推荐的条件下进行(CloneTech，Palo Alto，CA)。然后用OB09-OB11引物对4微升所得到的cDNA产物进行PCR扩增。分别处理来自这两种组织的0.7kb的产物。通过琼脂糖凝胶电泳分离最终的PCR产物，从琼脂糖凝胶中纯化(Qiagen，Valencia，CA)，直接到克隆pMON38201上，并转入大肠杆菌细菌细胞中(DH5α；ZibcoBRL，生命科学技术，Rockville，MD)。对插入片段进行的全长测序(ABIPRISMDye终止子循环测序Perkin-Elmer，Foster市，CA)证实了与玉米克隆700214872的强的同源性。对6个插入片段进行了分析，并发现其具有705bp的相同片段(SEQ ID NO：3)。

还通过RT-PCR回收了小麦Nph2片段。按照生产商的说明从小麦(cv.Bobwhite)的2周龄绿色叶片组织中分离总RNA。用PolyA TractmRNA系统分离PolyA+RNA(Promega，Madison，WI)。为了进行逆转录，将0.5微克纯化的PolyA+RNA作模板，用DT锚定引物制备的cDNA，在生产商推荐的条件下进行(CloneTech，Palo Alto，CA)。然后用OB09-OB11引物对所得到的cDNA产物(4微升)进行PCR扩增。对最终的0.7kb扩增产物进行琼脂糖纯化(Qiagen，Valencia，CA)，克隆到pMON38201上，并转入大肠杆菌细菌细胞中(DH5α；ZibcoBRL，生命科学技术，Rockville，MD)。通过将细菌DNA转移到带正电荷的尼龙膜(HYBOND N+；Amersham生命科学公司，Arlington Heights，IL)上，并用玉米克隆700214872开发的采用随机引物法以³²P标记过的探针进行检测来筛选细菌克隆。对阳性杂交克隆进行序列分析(ABIPRISMDye终止子循环测序Perkin-Elmer，Foster市，CA)。对三种插入片段进行的全长测序发现了与玉米克隆700214872(SEQ ID NO：16)有的强的同源性的706bp的相同片段(SEQ ID NO：9)。

例2：克隆来自水稻的Nph1基因

来自水稻的全长Nph1基因的克隆是通过用克隆的0.7kb水稻PCR片段(SEQ ID NO：3)作探针实现的。具体地讲，用来自所述PCR产物的内部471bp的PstI片段筛选用黄化水稻幼苗制备的λgp115’STRETCH-cDNA文库(水稻indica变种IR36；CloneTech，Palo Alto，CA)。用Y1090R-细菌宿主细胞(CloneTech)将噬菌体铺平板在NZY培养基上。通过将噬菌体DNA转移到带正电荷的尼龙膜(HYBONDN+；Amersham生命科学公司，Arlington Heights，IL)上筛选大约2×10⁶个独立的噬菌斑，通过³²P随机引物法制备来自水稻PCR产物的内部PstI片段作为探针，并用于通过在62℃下在Rapid Hyb缓冲液(Amersham生命科学公司)中杂交过夜筛选所述文库。用2×SSC/0.1％SDS洗涤滤膜1次(10分钟/室温)，并用1×SSC/0.1％SDS洗涤1次(40分钟/65℃)。在放射性自显影之后，鉴定了77个阳性杂交噬菌斑。从15个噬菌斑中分离噬菌体DNA，并用λzgp11正向和λgp11反向引物通过PCR扩增插入的DNA(35轮PCR：94℃5分钟/94℃1分钟/55℃1分钟/72℃1.5分钟/72℃10分钟)。扩增的两个最大的插入片段的大小为2.3kb。对来自这两种最大插入片段的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中纯化，克隆到载体pGEM-T(Promega)，并转入XL1-Blue大肠杆菌细菌细胞(Stratagene，La Jolla，CA)中。序列分析证实这两个克隆在核苷酸水平上是相同的(SEQ ID NO：1)。

水稻Nph1的全长cDNA含有2368个核苷酸的插入片段，该片段包括位于推测的第一个ATG上游的618个核苷酸的5’非翻译区，和位于推测的终止密码子以外的322个核苷酸的3’非翻译区(SEQ ID NO：2)。所述推测的Nph1编码区的长度为1428个核苷酸(SEQ ID NO：1)，它有可能编码长度为475个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4)。水稻Nph1cDNA(SEQ ID NO：1)与部分玉米克隆700214872(SEQ ID NO：16)具有99.3％的核苷酸相同性，但与拟南芥属Npr1cDNA仅有52.9％的相同性(Cao等，1997)。在推测的氨基酸水平上，水稻Nph1(SEQID NO：4)与部分玉米克隆700214872(SEQ ID NO：17)的相同性为82.4％，但与拟南芥属Npr1的氨基酸相同性仅为41％(Cao等，1997)。在对水稻Nph1和拟南芥属Npr1蛋白序列进行排比时，必须引入4个缺口。水稻Nph1蛋白序列在5’末端比拟南芥属Npr1蛋白序列短113个氨基酸。表1分别归纳了水稻Nph1、小麦Nph2-1、玉米克隆700214872、和拟南芥属Npr1核苷酸和推测的蛋白序列的百分相同性。

                           表1

水稻Nph1、小麦Nph2-1、玉米克隆700214972、和拟南芥属Npr1

         核苷酸和推测的蛋白序列的百分相同性

	水稻Nph1	小麦Nph2-1	玉米克隆700214972	拟南芥属Npr1
					水稻Nph1	100％	DNA：82％蛋白：82.6％	DNA：79.3％蛋白：82.4％	DNA：52.9％蛋白：41％
小麦Nph2-1	DNA：82％蛋白：82.6％	100％	DNA：78.8％蛋白：79.5％	DNA：49％蛋白：39.1％

例3：小麦Nph2-1和Nph2-2基因的分离

为了分离小麦Nph2基因，对来自生长在环境光照条件下的13日龄的出芽后的小麦(品种TAM107)的商业化小麦5’-STRETCH cDNA文库进行筛选(CloneTech，Palo Alto，CA)。筛选探针是通过用引物OB01(SEQ ID NO：22)和OB02(SEQ ID NO：23)对小麦Nph2 PCR片段(SEQ ID NO：9)进行PCR扩增而制备的，并通过PCR扩增玉米克隆70021487的1.38kb的插入片段(SEQ ID NO：16)是用基因专一性引物OB18(SEQ ID NO：24)和OB19(SEQ ID NO：25)扩增的。扩增的小麦和玉米PCR片段进行琼脂糖凝胶纯化，并通过³²P随机引物法进行标记。在文库筛选时使用小麦探针：玉米探针的1∶2的浓度比例。

含有所述文库的噬菌体铺平板在NZY培养基上。通过将噬菌体DNA转移到带正电荷的尼龙膜(HYBOND N+；Amersham生命科学公司，Arlington Heights，IL)上筛选大约2×10⁶个独立的噬菌斑，通过³²P随机引物法制备来自水稻PCR产物的内部PstI片段作为探针，并用于通过在62℃下在Rapid Hyb缓冲液(Amersham生命科学公司)中杂交过夜筛选所述文库，将所述滤膜与混合的探针在60℃下在20毫升含有100微克/毫升鱼精DNA的Rapid Hyb缓冲液(Amersham生命科学公司)中培养过夜。用2×SSC洗涤滤膜1次(10分钟/室温)，在60℃下洗涤2次(2×SSC/0.1％SDS)，并在60℃下洗涤1次(2×SSC/0.1％SDS)，并进行放射性自显影。在45个鉴定的阳性噬菌体中，发现有2个含有大约为2.4kb的插入片段。分离来自所述克隆的噬菌体DNA，并将插入片段分别亚克隆到pBluescript SK+质粒(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRI位点上。全长序列分析证实，这两种克隆编码小麦Nph2同源序列。小麦克隆1含有2420bp的插入片段(SEQ ID NO：7)，它具有1824bp的潜在编码区(SEQ ID NO：5)，该编码区编码607个氨基酸的推测的蛋白，该蛋白被命名为Nph2-1(SEQ ID NO：10)。小麦克隆2含有2420bp的插入片段(SEQ ID NO：8)，该片段具有1830bp的开放读框(SEQ ID NO：6)，预计它编码有609个氨基酸的蛋白，该蛋白被命名为Nph2-2(SEQ ID NO：11)。

对Nph2-1和Nph2-2所作的成对的比较发现了在推测的蛋白序列之间有98％的相同性。小麦Nph2-1和Nph2-2与玉米克隆700214872最为相似，核苷酸和推测的蛋白序列具有大约79％的相同性。小麦Nph2-1/Nph2-2序列与水稻Nph1有大约82％的核苷酸相同性，和大约83％的推测的蛋白序列相同性。比较小麦Nph2-1和拟南芥属Npr1发现它们具有较低水平的核苷酸和推测的蛋白相同性，分别为49％和39％。在用预设GAP参数(遗传学计算机组公司，Madison，WI)对小麦Nph2-1和拟南芥属Npr1蛋白序列进行排比时必须引入14个缺口。在对小麦Nph2-1同系物的推测的氨基酸序列和拟南芥属Npr1、玉米克隆700214872和水稻Nph1进行多重排比时，发现Nph2-1在该蛋白的锚蛋白重复区和C-末端部分具有明显的序列同源性，但含有独特的N-末端序列。小麦Nph2-1/Nph2-2序列的推测的起始密码子相对拟南芥属Npr1而言，在其N-末端增加了25个额外的氨基酸，而相对水稻Nph1而言在其N-末端增加了额外的137个氨基酸。

例4：单子叶植物的Nph1和Nph2的Southern印迹分析

在Southern印迹分析中用单子叶专一性探针检查单子叶物种的Nph同系物的基因拷贝数。用KS和SK引物(Stratagene，La Jolla，CA)扩增克隆在pBluescript SK+质粒上的小麦Nph2-1cDNA(SEQ IDNO：7)(Stratagene，30轮PCR，94℃5分钟/94℃1分钟/55℃1分钟/72℃1.5分钟/72℃10分钟)。用EcoRI或HindIII限制酶消化从小麦(cv.Bobwhite)、大麦(cv.Perry)、和玉米(cv.B-73)、和水稻(cv.M202)中分离的基因组DNA，在琼脂糖凝胶上分离片段，转移到HYBOND N+尼龙滤膜(Amersham生命科学公司，Arlington Heights，IL)上，并与通过³²P随机引物法制备的小麦Nph2-1探针一起培养。Southern杂交在65℃下进行一夜，使用含有100微克/毫升鱼精DNA的Rapid Hyb缓冲液(Amersham生命科学公司，Arlington Heights，IL)洗涤。用2×SSC/0.1％SDS洗涤滤膜2次(65℃，20分钟)，用0.5×SSC/0.1％SDS洗涤2次(65℃，20分钟)。通过放射性自显影检测杂交带。

发现了一种简单的杂交形式，在上述每一种单子叶植物中仅检测到一条或二条带。在水稻、玉米、大麦和小麦中，杂交形式与存在单一的相关基因一致，这表明与Nph2相关的基因似乎不是一个大的基因家族的一部分。与水稻相比，小麦和大麦的杂交信号似乎更强一些，这可能是由于小麦探针与小麦和大麦基因有强的同源性。另外，对小麦来说，较强的杂交信号也有可能部分归因于在六倍体小麦基因组中相同基因的多个拷贝。

例5：小麦Nph2同系物在小麦基因组上的排列

用中国春小麦缺对染色体-四体品系确定小麦Nph2基因在小麦基因组中3号染色体上的位置(Sears，1966)。将整倍染色体对整倍体亲本系和在3套染色体中的每一个上为缺对染色体的品系进行比较。从所有非整倍染色体中分离总的基因组DNA，并通过Southern印迹分析Nph2杂交带的改变。从小麦缺对染色体-四体品系中提取基因组DNA，用EcoRI消化，在琼脂糖凝胶上分离，并将片段转移到尼龙膜(HYBONDN+Amersham生命科学)。通过³²P随机引物法制备Nph2基因的0.7kb小麦PCR产物(与例3中一样，使用OB01/OB02引物)，并用作探针。杂交是在65℃下进行一夜，在含有100微克/毫升鱼精DNA的20毫升Rapid Hyb缓冲液(Amersham生命科学公司)中进行。在65℃下用2×SSC/0.1％SDS洗涤滤膜2次，每次20分钟，用1×SSC/0.1％SDS洗涤2次，每次20分钟，并用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤2次，每次20分钟。对杂交的膜进行的放射性自显影证实了Nph2杂交片段在小麦染色体的同源组3上的存在，和相应的带在缺对染色体3A(N3DT3A)、3B(N3BT3A)、或3D(N3AT3B)非整倍体品系中的缺乏。

很多农业上有价值的形状都定位在单子叶植物的3组同源染色体上。抗性基因Lr24、Lr27、Lr32、Sr35位于小麦染色体3组的遗传图谱上。植株高度(DENSO)、抽穗日期、种子产量的数量形状基因座(QTLs)位于大麦3H染色体上。比较单子叶物种之间的染色体作图，发现了相关的植物种类同源染色体组之间所述标记的线性排列是吻合的。因此，我们推测从小麦3组染色体上Nph2基因可能与位于大麦3H染色体上的在农业上有价值的性状相关。

例6：抗Npr1同系物的抗体的生产和使用

为了跟踪双子叶Npr1和单子叶Nph-1和Nph-2同源蛋白的积累，我们制备了具有多种交叉反应性的多克隆抗体。按以下方法制备抗番茄Npr1部分序列的融合蛋白的多克隆抗体(与Duke大学的X.Dong博士合作)。将番茄Npr1同系物的HindIII C-末端片段(180aa；Glu398-Stop577[SEQ ID NO：36])克隆到pRSETB载体(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的HindIII位点上，以便产生具有226个氨基酸的多组氨酸融合蛋白，其推测分子量为25.6kDa。通过向生长培养基中添加1mMIPTG诱导蛋白在大肠杆菌中的超量表达(菌株BL21；Invitrogen公司，Carlsbad，CA)，并让细胞在37℃下再生长2小时。通过离心收集细胞，并通过添加8M尿素、0.1M磷酸钠、0.010M Tris/HCl pH8.0在室温下培养1小时裂解沉淀。将提取物结合在由Ni-NTA树脂组成的平衡的亲和柱(Qiagen，Valencia，CA)。用所述结合缓冲液洗涤该柱，并用洗脱液(8M尿素，10M Tris/HCl pH6.8，100mMEDTA)处理。洗脱的聚组氨酸融合蛋白用PBS缓冲液透析过夜(4℃)，并用作免疫原在兔子体内产生多克隆抗体(200微克初次免疫/100微克第一次强化/50微克后续免疫)。

从免疫的兔子体内回收的抗血清(Pocono养兔场和实验室公司，Canadesis，PA)以1∶5000的稀释比例使用，并通过Western印迹分析评估全植株提取物和从表达所述目标融合蛋白的大肠杆菌中回收的蛋白。用于Western分析和ELISA测定的植物提取物是按以下方法回收的。在干冰上用microfuge研棒将大约100毫克新鲜组织研磨成细粉，并在4℃下用缓冲液[0.05M Tris/HCl pH7.2，0.05M氟化钠，0.150M氯化钠，0.5％NP-40、1mM PMSF、1mM蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO)]提取30-60分钟。使提取物沉淀(10000g/g10分钟/4℃)，回收上清液，并测定蛋白浓度(Ausubel等，1995)。为了进行Western分析，对多种总的提取蛋白进行测试(20-100微克/泳道)；对于ELISA来说，通常测定50-100微克/孔。

按照Ausubel(1995)所披露的标准方法用ECLWestern印迹分析系统(Amersham生命科学)进行Western分析，并对X光胶片进行曝光，以便观察杂交蛋白。将总蛋白提取物溶解在SDS-PAGE样品缓冲液中，并在8％-16％的SDS-PAGE梯度凝胶上分离。在0.025MTris/HCl、0.192M甘氨酸、pH8.3、含有10％(v/v)甲醇的溶液中在100伏电压下将分离的蛋白电转移到硝酸纤维素膜(Protran BA85，0.45微米；Midwest Scientific，Valley Park，MO)。在含有0.05％ Tween-20的PBS缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)(PBST)中洗涤Western印迹5分钟，在室温下用含有5％(w/v)香石竹脱脂奶粉(雀巢食品公司，Glendale，CA)的PBST中封闭1小时，或者在4℃下封闭过夜。用PBST洗涤印迹(3×10分钟/室温)，并在室温下用初级抗体溶液(在PBST中稀释1∶5000的抗血清)刺激1小时。在初级抗体培养之后，洗涤印迹(3×5分钟/PBST)，并在室温下与二级抗体(存在于PBST中的抗兔IgG缀合的辣根过氧化物酶)培养1小时。洗涤印迹(3×5分钟PBST/1×5PBS)，用ECL试剂盒按照生产商的说明(Amersham生命科学)观察识别的带。用纯合的融合蛋白进行的滴定实验证实，该抗血清在Western印迹分析中在10-20纳克/泳道的水平上能寻找所述融合蛋白。测定了来自多种单子叶和双子叶植物的提取物。在每一种情况下，都能识别一种大约65-66kDa的内源植物蛋白，它相当于拟南芥属Npr1的大致的分子量。该抗血清能识别来自水稻、小麦、大豆、马铃薯、烟草和番茄的蛋白提取物中的一条带。所述蛋白是从未诱导的植物中分离的，表明所述蛋白是组成性地存在于所有检查过的物种中。

上述多克隆抗体能够监测Nph1和Nph2蛋白在不同条件下的表达和积累。可以根据抗体和蛋白目标修改ELISA方案，以便取得最佳的分辨效果。为了对双子叶和单子叶样品进行ELISA，我们用在包被缓冲液(10mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠、pH9.3)1∶1000稀释的抗血清在4℃下将微量滴定测定板包被过夜，洗涤孔(3×3分钟/PBST)，用含有卵清蛋白的PBST(0.2w/v，PBSTO)将提取的样品稀释到合适浓度，并在4℃下结合过夜。洗涤孔(3×3分钟/PBST)，并向每一个孔中添加200微升的碱性磷酸酶缀合物(用PBSTO稀释1∶2000倍)，并培养(4小时/37℃)。用PBST洗涤孔，并添加新制备的磷酸酶底物(97毫升二乙醇胺/800毫升水)，并在405nm下监测光学密度。用纯化的融合蛋白作为浓度标准物。

在对获得性抗性进行化学或病原体诱导之后，优化了双子叶和单子叶植物的ELISA测定，并且由此证实了与相应基因的强化转录相关的蛋白的积累。我们希望所述抗体将有助于测定在非诱导条件下和能诱导获得性抗性的条件下Nph1和Nph2-1/2-2蛋白在转基因植物中的超量表达。

例7：在水稻中诱导的获得性抗性能增强Nph1的表达并产生对Magnaporthe grisea真菌的抗性

为了检验Nph1的表达是否是与水稻中AR激活协同调控的，我们鉴定了一种AR的化学诱导物，并测定用该诱导物处理水稻植物是否能提高Nph1的转录水平。测试一种研究比较充分的AR激活剂INA(Ryals等，1996)在水稻中诱导Nph1转录和调节AR的效力。在温室条件下生长14日龄的水稻植物(cv.M202)，并喷洒用含有0.05％Tween20(v/v)的20％丙酮/80％水(v/v)制备的0.5mM INA以便处理植物。模拟处理的植物仅喷洒丙酮/水/Tween20溶液。处理3天之后，用稻瘟病致病剂活体营养病原体Magnaporthe grisea接种植物。用Devilbiss手持式喷雾器将悬浮在水和Tween20(0.025％v/v)中的Magnaporthe grisea孢子(3-5×10⁴孢子/毫升)均匀喷洒在处理植物的叶片上。在24℃下，在黑暗中，在100％湿度的条件下培养植物24小时。然后将植物转移到12小时光照/黑暗周期的生长箱中，并在为期7天的实验中监测疾病症状。

在第5天，在对照植物上出现了强的稻瘟病症状，出现稻瘟病所特有的大的扩散性病斑。不过，用INA预处理过的植物表现出对病原体强的抗性，在接种过的叶片上仅出现小的坏死斑或细胞死亡(图3)。在INA处理过的植物上未发现发病症状或真菌孢子形成。这一结果证实(1)在水稻上化学诱导的AR能增强病原体抗性，和(2)水稻栽培种M202中诱导的AR能预防稻瘟真菌。

通过对INA处理过的和未处理过的水稻叶片(cv.M202)进行Northern印迹分析评估INA处理对Nph1基因激活的影响。在AR发作之前(处理后0小时)以及在处理后的时间间隔上用TRIZOL试剂(GibcoBRL，生命技术)从INA处理过的叶片组织中分离总RNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA(20微克/泳道)，并转移到HYBONDN+膜上(Amersham生命科学)。用PCR Nph1基因的内部0.47kb PstIDNA片段(SEQ ID NO：3)制备水稻Nph1探针，用琼脂糖凝胶进行纯化，并用³²P随机引物法制备。在62℃下在20毫升Rapid Hyb(Amersham生命科学)中，用放射性标记过的水稻Nph1 DNA探针杂交滤膜过夜。在杂交之后，在室温下洗涤滤膜(2×SSC/0.1％SDS，10分钟)，在65℃洗涤2次(1×SSC/0.1％SDS，20分钟)，并进行放射性自显影。

我们发现，喷洒INA能诱导Nph1转录物的积累增加2-3倍，表达高峰出现在INA处理之后3天(图4)。到第5天，即该实验的最后时间点，Nph1转录仍然很高。对水稻Nph1的最大诱导水平大约比非诱导的对照高3倍，这一结果与报导的拟南芥属Npr1的诱导的转录水平相当(Cao等，1998)。还用相同的Northern印迹实验研究了用上述接种条件用Magnaporthe grisea病原体刺激过的Nph1在水稻(cv.M202)中的时序表达。按上述方法收获组织，制备总RNA，并进行Northern印迹分析。病原体刺激只能暂时上调Nph1的表达。在感染1天之后，病原体诱导Nph1转录被提高到由INA处理诱导的水平，但到第3天，在病原体刺激过的植物中Nph1的表达就回落到非诱导的对照水平。相反，INA-诱导的植物表现出持续的高的Nph1表达，至少能持续到处理后5天，这表明Nph1的持续高的水平可能有助于加强获得性抗性，并预防稻瘟病感染。

Nph1蛋白积累与Nph1基因转录的增强相关。通过ELISA(如例6所述)比较了来自模拟处理或INA处理(12小时和5天)的水稻(cv.M202)的蛋白提取物。在INA处理之后12小时未检测到提高了的Nph1蛋白。不过，到INA处理之后第5天，我们发现了Nph1蛋白的积累可再现地增加了1.7倍。积累的蛋白的增加与在相同时间内Nph1的较高的转录水平十分吻合。

通过在较长时间内用Magnaporthe grisea真菌刺激INA处理过的水稻(cv.M202)测定诱导的AR的持续时间。用0.5mM INA[20％丙酮/80％水(v/v)+0.05％Tween20(v/v)]喷洒一群水稻植物，按上述方法在不同时间点上用稻瘟真菌感染处理过的和未处理过的对照的植物亚类。我们发现，化学调节的AR在一次INA处理之后能持续30天以上。在每一个时间点上，INA处理过的植物都一致地表现出对稻瘟病感染的高的抗性，而同时进行的对照植物都一致地发病。

我们推测，Nph1在转基因水稻中的超量表达能促进Nph1蛋白积累的增强，并对病原体的侵袭产生较强的反应，随后，在转基因植物中促进更有效的、时间更长的“免疫”期。通过转基因表达Nph1，我们希望在病原体刺激之后获得强的、均匀的AR。我们预计，通过Nph1的超量表达可以抗多种水稻病害，包括由真菌、细菌和病毒病原体引起的病害。通过用诸如pFMV、pe35S、或甘蔗badnavirus启动子的组成型启动子启动转基因在整个植株中的表达，或者通过组织专一性启动子启动Nph1在植物的特定部分的表达，如在根或叶中表达，或者在诸如表皮，维管、或叶肉细胞的特殊类型的细胞中表达进一步优化转基因Nph1的表达。

例8：小麦Nph2表达是诱导型的并且可以通过发育调控

为了确定小麦Nph2表达和AR之间的关系，我们用INA处理小麦植物，并监测白粉病和Nph2转录。业已证实，用INA处理能激活小麦的AR途径，表现在有限数量的标记基因的转录激活，和增强了的抗病性(Gorlach等，1996)。用含有0.05％Tween20(v/v)用20％丙酮/80％水(v/v)制备的1mM INA或仅用喷洒溶液(模拟处理对照)喷洒生长在室温中的14日龄的小麦植物(cv.TAM107)。处理5天之后，用小麦白粉病病原体(Erysiphe graminis fsp hordei)接种处理过的植物和模拟处理过的对照。将来自预先感染过的植物上的condia释放在测试植物的叶片上，然后将其保留在接种植物的生长箱中。生长箱的条件保持在20℃，给以12小时/12小时白天/黑夜的光照周期，光照强度300μE，相对湿度80％；每天对植物进行2次地下灌溉，在7天之后对INA处理过的植物和未处理过的对照的发病症状进行打分。

用INA喷洒过的小麦植物出现较少的真菌生长菌落，并表现出增强了的抗性，在重复实验中对小麦白粉病的控制达到60％(图5)。相反，对照植物有重要的病害，并出现许多强的真菌生长菌落。以上数据表明，用INA处理小麦栽培种TAM107能增强能有效抗白粉病的获得性抗性。为了对INA的吸收和下游基因的激活进行分子测定，用小麦栽培种Bobwhite在不同诱导条件下评估被确定为INA-诱导型(WCI-2；Gorlach等，1996)或病原体诱导型(WIR-2；Kmecl等，1995)的两个小麦基因的转录进行评估。按上述方法用含有0.05％Tween20(v/v)溶解在20％丙酮/80％水(v/v)中的1mM INA喷洒14日龄小麦植物，用喷洒溶液(INA)进行模拟处理，或用Erysiphe graminis fsphordei(白粉病真菌)刺激。在第3天收获叶片组织，并用TRIZOL试剂(GibcoBRL)按照生产商的说明分离总RNA。对10微克总RNA进行琼脂糖凝胶分离，并转移到HYBOND N+尼龙(Amersham生命科学)膜上，用基因专一性引物OB28(SEQ ID NO：26)和OB27(SEQ IDNO：27)通过PCR扩增制备WCI-2基因的DNA探针。用M13正向和反向引物(Stratagene)通过对含有WCI-2 cDNA的质粒进行PCR扩增制备WIR-2的DNA探针。在这两种情况下，PCR是在以下条件下进行的：35轮：94℃5分钟/94℃1分钟/45℃45秒/72℃1分钟/72℃10分钟(第25轮)。对PCR产生的探针进行琼脂糖凝胶纯化，用³²P随机引物法进行标记，添加到含有100微克/毫升鱼精DNA的20毫升Rapid-Hyb(Amersham)中(在65℃用2×SSC/0.1％SDS)洗涤滤膜2次(每次20分钟)，用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤2次(每次20分钟)，并进行放射性自显影。

在小麦栽培种Bobwhite上，在重复实验中，WCI-2基因受到INA的专一性诱导，未检测到病原体刺激的诱导。在小麦栽培种上，病原体专一性基因IR-2受INA的轻微诱导，但受小麦白粉病(Erysiphe graminisfsp hordei)的有效诱导。以上结果表明激活了Bobwhite小麦上的INA-诱导型获得性抗性途径，这一结果是通过获得性抗性的识别标记监测到的。

测试了在INA和病原体诱导条件下对小麦Nph2基因的诱导(图6)。按上述方法用1mM INA(cv.Bobwhite)喷洒小麦植物，或进行模拟处理。按上述方法在AR发作之前(处理后0小时)以及在AR局部发作之后(24和72小时)从INA处理过的叶片中回收总RNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA(10微克)，转移到HYBOND N+膜(Amersham生命科学)上，并与Nph2探针杂交。小麦Nph2探针是用KS和SK引物通过对原始Nph2-1 cDNA(SEQ ID NO：7)进行PCR制备的(Stratagene，30轮PCR，94℃5分钟/94℃1分钟/55℃1分钟/72℃1.5分钟/72℃10分钟，第30轮)。对PCR片段进行琼脂糖凝胶纯化，并通过³²P随机引物法制备用作探针。Northern印迹分析的条件如上文所述。

我们证实，到第3天，INA处理会导致Nph2表达上调1.5-2倍。小麦Nph2的表达时序和诱导类似于在水稻上用Nph1证实的结果。以上结果证实，似乎在Bobwhite栽培种上激活了获得性抗性途径。不过，Bobwhite的AR反应不能有效预防植物感染白粉病，而小麦栽培种TAM107具有高效的INA诱导型获得性抗性反应，它能有效防御白粉病。我们扩大该分析，评估了INA诱导的白粉病抗性和下游标记基因的激活，以便鉴定具有强的转录激活和抗病性的小麦栽培种。该研究最初包括小麦栽培种Kanzler、Slejpner、Ritmo、Tremie、Rialto、Soisson、Brigadier。

我们期望所述诱导型AR途径在同一物种的不同栽培种之间具有不同的强度和效果。这可能是由于AR途径中的诸如Nph2的关键调节蛋白的作用。小麦栽培种TAM107是Nph2-1和Nph2-2基因的来源，并且可能是优良的Nph2等位基因的来源。我们期望TAM107 Nph2等位基因在诸如Bobwhite的较弱的栽培种中的超量表达能够以转基因方式增强AR反应。TAM107 Nph2等位基因在栽培种中具有强的AR的超量表达会导致抗病性的增强，并可以想象出会导致较强的反应或拓宽病原体的防御范围。

除了Nph2之外，我们假设与胁迫适应相关的基因在AR反应期间能够上调。例如，业已证实了热激蛋白基因hsp90与细胞胁迫适应相关(Ali等，1998；Marrs等，1993)。为了检验该假说，我们进行了与上文所述的相同的Northern印迹分析，以便测定INA和病原体刺激对hsp90基因表达的时序和影响。通过RT-PCR制备大麦hsp90的探针(参见例1)。用寡聚dT引物(Stratagene)由从大麦(cv.Morex)中提取的polyA RNA(2.5微克)合成第一股cDNA链。用大约125纳克第一股cDNA链作模板，用OB38(SEQ ID NO：28)和OB39(SEQ ID NO：29)PCR扩增病原体诱导型大麦hsp90的452bp的片段(GeneBank保藏号x67960)(35轮PCR：94℃5分钟/94℃1分钟/44℃45秒/72℃1分钟/72℃10分钟)。将PCR片段克隆pMON38201上(图2)，并测序，证实它是部分hsp90 cDNA(ABIPRISMDye终止子循环测序Perkin-Elmer)。对PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化，通过随机引物法用³²P进行标记，并被用作探针。用Nph2和WCI-2的相同的Northern印迹检测hsp90基因的表达。我们发现在用INA处理之后，小麦中的hsp90受到有效诱导，与Nph2具有相同的时序和形式，这表明hsp90可以作为获得性抗性激活的另一种标记基因。

我们评估了小麦Nph2转录的发育形式，以便确定在非诱导条件下的表达水平。7天之后，收获生长在生长箱条件下(12小时/小时/白天/黑夜周期)的小麦植物(cv.Bobwhite)。从盆栽土壤中取出植物，用自来水洗涤根，并将植物分成以下样品：根、叶鞘、叶基，并将从叶片基部以上(叶鞘以上＝叶节1)到叶端(叶节5)的叶片分成5个相等的片段。按上述方法分离总RNA(10微克/泳道)，并进行Northern印迹分析，使用0.7kb Nph2 PCR片段作探针。在65℃下将滤膜杂交过夜，在室温下洗涤1次(2×SSC/0.1％SDS，5分钟)，在65℃下洗涤2次(1×SSC/0.1％SDS，20分钟)，在65℃下洗涤1次(0.5×SSC/0.1％SDS)，并进行放射性自显影。

Northern印迹分析证实了Nph2基因在小麦叶片中部的增强了的表达(图7)。这一部分相当于细胞分裂和伸长的部位。相反，在叶片其他部分和根中Nph2的表达比较低。通过在所有类型的组织中全面地转基因超量表达Nph2，或者通过在特定类型细胞或组织中定向表达，我们希望能够有效控制特定类型的病原体。

例9：鉴定单子叶Nph基因

为了鉴定高度INA响应型的表达Nph2小麦同系物的植物，我们比较了INA处理过的和未处理过的以下保藏物的植物中Nph2和下游响应基因的表达水平：T.aestivum-8保藏物；T.dicoccum-7保藏物；T.monococcum-7保藏物；T.durum-8保藏物；T.tauschii-33保藏物。在温室中生长植物，用INA处理(或模拟处理)，分离总RNA，并用Nph2 PCR片段，shp90或WCI-2探针进行Northern印迹分析(详见例8)。在65℃下将滤膜杂交过夜，在室温下洗涤1次(2×SSC/0.1％SDS，5分钟)，在65℃下洗涤1次(1×SSC/0.1％SDS，20分钟)，并通过放射性自显影观察杂交带。

Northern印迹分析发现，在所有研究过的保藏物中，在INA处理过之后Nph2的诱导上调了1-2.5倍。观察到了下游效应基因的基因可诱导性的更大的波动。在保藏物PI538722(cv.T.monococcum)、TA5023(cv.T.durum)、和TA1599(cv.T.tauschii)观察到了分别编码热激90蛋白、hsp90(Marrs等，1993)和脂氧合酶(WCI-2；Gorlach等，1996)的两个下游效应基因的最高水平。

例10：用Nph1和Nph2转化单子叶植物

通过组建适用于转基因植物表达的分子结构可以促进水稻Nph1和小麦Nph2基因向单子叶植物物种的转化。采用了若干种方法，包括组建适用于农杆菌属介导的转化和适用于粒子轰击转化的结构。

水稻农杆菌属转化

制备用于水稻转化的水稻Nph1和小麦Nph2结构。制备用于农杆菌属介导的转化的三种原始结构，用于粒子轰击的两种结构。具有Nph1基因的、含有5’非翻译区的二元质粒的组装包括以下步骤。用限制酶NcoI和EcoRV消化具有Nph1的质粒(例2)，凝胶纯化1.9kb的片段，并克隆到pMON19648穿梭载体的NcoI/EcoRI(平端)位点上。由此产生了强化35S启动子-hsp90内含子-Nph1 cDNA-Nos3’的框结构，NotI限制位点。以NotI3.7kb片段形式回收该框，并克隆到二元pMON18634相应的NotI位点上。携带Nph1的、含有5’UTR的最终的二元质粒是pMON30643(图8)。

用水稻NcoI引物(SEQ ID NO：34)和NS-10引物(SEQ ID NO：35)通过PCR扩增pGEMT质粒上的Nph1 cDNA(例2)，构建缺乏5’UTR的第二种版本的Nph1，以便产生一个386bp的片段，用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化该片段。用NcoII/Nar1限制酶消化PCR产物，以便产生83bp的片段，用它取代Nph1形成cDNA上的内源NcoI/Nar1片段，使用所述质粒多接头上的NcoI位点缺失完整的5’UTR。PCR将新的NcoI位点重新定位在推测的Nph1编码序列中紧挨着第一个甲硫氨酸密码子下游。用NcoI/EcoRV对具有修饰过的Nph2基因的质粒进行限制性消化，对1.5kb的片段进行琼脂糖凝胶纯化，并按上述方法亚克隆到pMON19648上，以便形成pMON30639穿梭载体。以NotI片段形式释放具有e35S启动子-hsp70内含子-Nph1(缺乏5’UTR)-Nos3’终止子序列的框，并亚克隆到pMON18364上，以便产生pMON30640二元质粒(图9)。

同样将小麦Nph2-1 cDNA组装在二元质粒中，用于水稻转化。需要若干个步骤将来自原始Bluescript SK+载体(Stratagene；例3)的Nph2-1基因亚克隆到适用于农杆菌属介导的单子叶植物转化的最终二元载体上。对Nph2-1 cDNA的3’和5’末端进行修饰，以便提供适用于亚克隆到穿梭载体上的限制位点。5’末端的修饰是这样实现：用OB-63(SEQ ID NO：32)和OB-64(SEQ ID NO：33)对Nph2-1 cDNA进行PCR扩增，以便产生175bp的片段，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化该片段。用ClaI/Nar1限制酶消化PCR产物，以便产生83bp的片段。将该片段用于取代Nph2-1上的内源ClaI/Nar1片段。所述PCR修饰将一个新的NcoI位点引入到推测的Nph2-1编码序列上紧挨着第一个甲硫氨酸密码子的上游。对Nph2-1 3’末端的修饰是这样实现的：用OB-61(SEQ ID NO：30)和OB-62引物(SEQ ID NO：31)对Nph2-1 cDNA进行PCR扩增。按上述方法纯化扩增的280bp片段，用限制酶XbaI/BsmI消化，以便产生170bp的片段，用该片段取代Nph2-1上的内源XbaI/BsmI片段。该取代将一个单一的EcoRI限制位点引入了Nph2-1的3’末端，位于推测的终止密码子的下游。证实从5’-3’修饰部分的序列(ABIPRISMDye终止子循环测序Perkin-Elmer)。用NcoI/EcoRI对具有修饰过的小麦Nph2-1 cDNA的质粒进行限制性消化，以便释放出1.8kb的片段，将该片段亚克隆到pMON19846的NcoI/EcoRI位点上，以便产生pMON30636穿梭载体。通过NotI消化从该穿梭载体上释放强化35S启动子-hsp70内含子-Nph2-1-Nos3’框，并克隆到pMON18364的NotI位点上。具有Nph2-1的最终的二元载体是pMON30637(图10)。

转化方法

母株和外殖体组织

在开花后7-11天，收获日本水稻品种M202的未成熟的胚胎。将花序收集在装有反渗透(RO)水的容器中。在含有一滴温和洗涤剂(Tween20)的RO水中搅拌花序。在RO水中漂洗3次。在70％的乙醇中搅拌花序大约60秒。用RO水漂洗。去掉种皮。将去皮的种子放入RO水中。放入一个无菌溶液中，并用70％的乙醇漂洗大约30秒。用无菌移液管除去乙醇。添加50％的漂白剂和1滴Tween20，加盖，并放在摇床上在室温下以150rpm的速度摇至少30分钟。用无菌RO水漂洗6次。取出胚胎。

农杆菌属培养物和接种

在所有实验中都使用具有二元载体的解除武装(diaarmed)的农杆菌属菌株C58(ABI)。最初的农杆菌属培养物来自甘油母液或来自新划线的平板，并在26-28℃下在含有200mM乙酰丁香酮(AS)、50毫克/升卡那霉素、50毫克/升链霉素和壮观霉素和25毫克/升氯霉素的液体LB培养基，pH7.0(MILLER，1972)中摇动(大约150rpm)生长过夜，达到对数中期(大约OD660＝1-1.5)。在4℃下以5000rpm的速度离心所述细胞15分钟。用含有2.2克/升MS盐、1毫升/升MS维生素(1000倍母液)、115毫克/升脯氨酸、10克/升葡萄糖、20克/升蔗糖的MSVI培养基漂洗/悬浮所述沉淀。在4℃下以5000rpm的速度离心所述细胞15分钟。将农杆菌属细胞重新悬浮在接种培养基(MSPL)中，并将粒度调整到OD660＝1。将含有1微升/5毫升MSPL的乙酰丁香酮的MSPL(MS盐，2.2克/升；MS维生素，1毫升1000倍母液；脯氨酸，115毫克/升；葡萄糖，26克/升；蔗糖，68.5克/升)添加到农杆菌属沉淀中，将其调整到需要的OD。在无菌培养皿内侧放置75-100微升的农杆菌属液滴。在每一个液滴上放5个胚胎。在室温下培养15分钟。除去农杆菌属液滴。将胚胎放在共培养培养基上(MS盐，2.2克/升；MS维生素，1毫升1000倍母液；盐酸硫胺素，0.5毫克/升；脯氨酸，115毫克/升；葡萄糖，10克/升；蔗糖，20克/升；2，4-D，2毫克/升；pichloram，2.2毫克/升；低EEC琼脂糖，5.5克/升，乙酰丁香酮，200μM；硝酸银，20μM)，并在23℃下培养1-3天。1天之后，将胚胎转移到含有4.4毫克/升MS盐，1毫克/升MS维生素(1000倍母液)，1毫克/升盐酸硫胺素，20毫克/升蔗糖，500毫克/升谷氨酰胺，750毫克/升氯化镁，100毫克/升酪蛋白水解物，2毫克/升2，4-D，pH5.8，2克/升pichroram的Delay培养基上。在高压灭菌之后，添加2.2毫克/升pichroram，500毫克/升羧苄青霉素，20μM硝酸银(1.7毫升/升2毫克/毫升母液)。

选择和再生

在24℃下在黑暗中在Delay培养基上培养7天之后，将未成熟胚胎转移到补充了40毫克/升G418和250毫克/升羧苄青霉素NPT1上(表2)。将小片转移到补充了25毫克/升G418和100毫克/升羧苄青霉素NPT3上，将所有绿色部分转移到装在phytatrays中的补充了25毫克/升G418和100毫克/升羧苄青霉素的NPT4上。再过2-4周之后，非转化植物会矮化，并且不能生长到phytatrays的顶部。保留已经生长到phytatrays顶部并且在根上有根毛的植株丛。轻轻地分离植株，并将单植株放入补充了25毫克/升G418和100毫克/升羧苄青霉素的NPT4phytatrays中。此时可将植株送入温室(此时植株已经达到phytatrays顶部，并且具有良好的根系和根毛)。

表2.基础培养基中的补充成分¹

成分	NPT1	NPT2	NPT3	NPT4
					2，4-D(mg/L)	2.0	0.2	--	--
Pichloram(mg/L)2	2.2	--	--	--
					谷氨酰胺(g/L)	0.5	--	--	--
蔗糖(g/L)	20.0	20.0	120.0	60.0
					MgCl2(g/L)	0.75	--	--	--
酪蛋白水解物(g/L)	0.1	--	--	--
					脱落酸(mg/L)2	--	.052	--	--
NAA(mg/L)2	--	--	1.0	--
					细胞分裂素(mg/L)2	--	--	1.0	--
BAp(mg/L)2	--	--	2.0	--
					PH	5.8	5.8*	5.8	5.8

2.5N HCL2	--	280μl	--	--
					Phytagel(g/L)	2.0	2.5	2.5	2.5

¹所有培养基都含有Murashige和Skoog(1962)的基础盐(MS基础盐)和维生素(MS维生素)。

²过滤灭菌，并在高压灭菌之后添加。

^*NPT2的最终pH为4.0。

水稻粒子轰击转化

组装两种结构用于水稻的粒子轰击转化。以NotI片段形式将来自pMON30639穿梭载体的含有e35S启动子-sp70内含子-Nph1 cDNA(缺乏5’UTR)-Nos3’的框亚克隆到pMON19572的NotI位点上。用KpnI对最终的质粒pMON30645(图11)进行限制性消化，并将纯化的6754bp的片段用于水稻胚胎的粒子轰击。以NotI片段形式将来自pMON30636的含有e35S启动子-sp70内含子-小麦Nph2-1 cDNA-Nos3’终止子的框亚克隆到pMON19572的NotI位点上。用PvuII对最终的质粒pMON30644(图12)进行限制性消化，并将纯化的7412bp的片段用于水稻胚胎的轰击。

利用Christou等(1991)的方法通过粒子轰击转化水稻，省略了珠制备步骤中的PEG。用Abedinia等(1997)的方法进行选择，所不同的是使用1mM草甘膦6周时间。将推测的转基因愈伤组织片转移到补充了0.1毫克/升IAA、0.1毫克/升玉米醇溶蛋白和0.02mM草甘膦的MS培养基，并在23℃下在光照条件下培养3周。将小的绿色幼芽转移到含有1/2MS盐，MS维生素，100毫克Myo-肌醇，60毫克/升蔗糖，0.5毫克/升IBA和在高压灭菌后添加的0.02mM草甘膦的培养基上。在23℃下在光照条件下培养幼苗2周。

小麦的转化

为了转化小麦植物，用NcoI/EcoRI消化上述pBluscript上的修饰过的Nph2-1 cDNA，并将1.8kb的片段亚克隆到穿梭载体(pMNO32635)的相应的NcoI/EcoRI位点上。由此产生了含有e35S启动子-CAB前导序列-水稻激动蛋白内含子-Nph2-1-小麦hsp17 3’终止子的框。以NcoI限制片段形式切除完整的框，并克隆到二元载体pMON45119的相应的NcoI位点上。用于农杆菌属介导的单子叶植物转化的具有Nph2-1的最终的二元载体是pMON30635(图13)。

1.外殖体制备

在授粉13-15天之后从未成熟的颖果(小麦小穗)上分离小麦(Triticum aestivum L)cv Bobwhite的未成熟胚胎，并在CM4C上培养(表3)3-4天。选择没有胚胎发生愈伤组织的胚胎进行农杆菌属接种。

表3.基础培养基中的补充成分¹

成分	NPT1	NPT2	NPT3	NPT4
					2，4-D(mg/L)	0.5	0.5	0.2	--
Pichloram(mg/L)2	2.2	2.2
					麦芽糖(g/L)	40.0	40.0	40.0	40.0
谷氨酰胺(g/L)	0.5	0.5
					MgCl2(g/L)	0.75	0.7
酪蛋白水解物(g/L)		0.1	0.1
					MES(g/L)		1.95	1.95	1.95
脱落酸(mg/L)2		100.0	100.0	100.0
					胶凝剂(g/L)3	2(P)	2(P)	2(G)	2(G)

¹所有培养基都含有Murashige和Skoog(1962)的基础盐(MS基础盐)和维生素(MS维生素)。将每一种培养基的pH调整到5.8。

²过滤灭菌，并在高压灭菌之后添加。

³PHYTAGEL(P)(PHYTAGEL是Sigma化学公司的注册商标，St.Louis，MO)或GELRITE(G)(GELRITE由Schweizerhell公司提供，South Plainfield NJ)(GELRITE是孟山都公司的注册商标，St.Louis，MO)。

2.农杆菌属培养物和接种

在所有实验中都使用具有二元载体的解除武装的农杆菌属菌株C58(ABI)。最初的农杆菌属培养物来自甘油母液或来自新划线的平板，并在26-28℃下在含有200mM乙酰丁香酮(AS)、50毫克/升卡那霉素、50毫克/升链霉素和壮观霉素和25毫克/升氯霉素的液体LB培养基，pH7.0(MILLER，1972)中摇动(大约150rpm)生长过夜，达到对数中期(大约OD660＝1-1.5)。将农杆菌属细胞重新悬浮在接种培养基中，并将密度调整到OD600为1。将在CM4C培养基中培养的未成熟的胚胎转移到无菌培养平板(16×20毫米)或6孔细胞培养平板(Costar公司，剑桥，MA)的孔中，每个培养平板装有10毫升接种培养基或者每个细胞培养簇板含有5毫升。加入等量的农杆菌属细胞悬浮液，使农杆菌属细胞的最终浓度为OD600＝0.5或在某些实验中为0.25。在大多数实验中，以0.01％的最终浓度向接种混合物中添加pluronicF68。农杆菌和未成熟胚胎(IEs)的比例为大约10毫升：20-200IEs。接种条件为温度为23-26℃，持续时间25-30分钟。

3.共培养

在接种阶段之后，用家用真空装置除去外殖体中的农杆菌属细胞。将一张消过毒的1号Whatman滤纸(与培养平板的大小吻合)放入每一个60×15或60×20毫米的培养皿中。在滤纸中央放175-190微升无菌水。2-3分钟之后，将接种过的未成熟胚胎放在所述平板上。通常，将20-50个外殖体堆成一迭(体积为大约1厘米，并且60-80毫克/迭)，在每一个平板上有4-5迭。马上用石蜡膜密封培养皿，然后在24-26℃下在黑暗中共培养2-3天。

4.选择和再生

在延迟培养基上培养2-3天之后，将未成熟胚胎转移到补充了25毫克/升G418和500毫克/升羧苄青霉素的CM4C上。2-3周之后，将胚胎破碎成较小的碎片(大约2毫米)，并在含有25毫克/升G418和250毫克/升羧苄青霉素的第一种再生培养基MMS.2C(表2)上继代培养。在转移到再生培养基上时，将每一片愈伤组织进一步分成若干小的碎片(大约2毫米)，在转移之后2周，将幼芽和有生活力的愈伤组织转移到含有相同浓度的G418和羧苄青霉素的第二种再生培养基MMS0C(表2)上。按上述方法将较大的组织碎片分裂成较小的碎片。在以后被证实为真实转化体的小植株能在该培养基上旺盛生长，并形成强壮的根系。将长有强壮根毛、长有10个以上短的强壮的根或二级根的植株转移到装有第二再生培养基的Sundae杯(Sweetheart Cup公司，Chicago，IL)种，以便进一步生长和选择。在Sundae杯中生长期间，大部分非转化体死去或表现出易感G418的迹象。在其生长到Sundae杯顶部之前，将高度抗G418，能旺盛生长的、长有强壮根系的植株转移到土壤中。来自同一个胚胎的植株都被视为同一事件的姊妹株。

5.转基因植物的检测和分析

让植物生长在环境受到控制的生长箱中，由高强度放电(HID)Svlvania光(GTE制品公司，Manchester，NH)提供800molm^-2s^-1的16小时的光周期。昼/夜温度为18-16℃。从接种对将大部分植物转移到土壤中需要大约2.5-3个月，并且没有观察到可见的异常。按下述方法检测每一个植株的获得性抗性基因。

例11：分析具有Nph2-1转基因的转基因小麦

通过农杆菌属介导的转化将Nph2-1(pMON30635)转入小麦栽培种“Bobwhite”中，产生了51个独立的转基因品系。对R0植株进行的RNA凝胶印迹分析发现了多种转基因表达，有36个品系以低水平表达Nph2-1(比对照植株低或相似)，有6个植株含有高出2-5倍的相对转录水平，并且有9个品系含有至少高出非转化对照5倍的水平。为了通过遗传学方法测定T-DNA基因座的数量，将随机挑选的代表多种表达水平的R0植株生长到成熟，以便分离R1种子。让每一个R0植株的大约0个R1种子发芽，并生长到三叶期。用paramomycin喷洒上述R1幼苗，以便实现NPTII基因的表达。在分析过的所有14个例子中，在R1家族中观察到paramomycin抗性的3∶1(抗性：敏感)分离，表明T-DNA是作为一个基因座整合的。

用白粉真菌(Erysiphe Graminis pv.tritici)在上述R1家族的9个上面进行接种实验。每一个家族包括24个paramomycin抗性R1植株，这些植株生长到3周阶段。用Erysiphe Graminis pv.tritici感染转基因植物和未转化过的对照，并在11天之后评估发病症状。在该实验中，没有一个转基因品系表现出高于对照植物的抗性水平。实际上，9个品系中的7个表现出略高一些的易感病性(p＜0.05)。平均而言，转基因品系的发病症状的相对严重程度比对照高大约10％。与Npr1在拟南芥属中的表现不一样，Nph2-1的超量表达似乎不能改善小麦的抗病性。

为了测定在SAR化学激活之后有可能在转基因品系中诱导的抗性水平，将4个R1群体各自分成包括12个植株的两组；一组用INA处理，另一组进行模拟处理。3天之后，按上述方法用Erysiphe Graminispv.tritici对每一个小组进行染病实验。在用INA处理对照之后，非转基因的Bobwhite植物的发病症状比模拟处理的植物降低了25％。在我们实验条件下，由INA喷洒处理过引起的发病水平的降低在不同实验是一致的。不过，在INA诱导之后，在4个转基因群体中都没有观察到明显的减轻症状。在所有情况下，处理过的和模拟处理过的对照亚群体都没有表现出增强了的病原体抗性，病害严重度与未处理的Bobwhite相当。以上结果表明，含有Nph2-1的小麦转基因植株的系统性获得性抗性反应受到了损害。

例12：分析转基因水稻的增强了的抗性

如例10中所述，业已将不同的二元结构导入水稻(cv.M202)，并对所得到的转基因植物进行分子分析，并进行发病测试(表4)。

表4.转基因结构和发病分析概述

pMON	元件	R0品系(Agro/Gun)	抗病品系
				30640	e35S-Nph1-nos 3′	Agro：58品系	12536
30643	e35S-5′UTR-Nph1-nos 3′	Agro：22品系	13943，13948，13949，13950，13954
				30644	e35S-Nph1-nos 3′	Agro：48品系	15008，15011，15038，15050，15110，15122，15146，15383，15470
30645	e35S-Npw2-1-nos 3′	Agro：44品系	15191，15233，15263，15308

筛选每一个转基因群体的NPTII的表达和Nph1蛋白表达(ELISA和/或Western印迹分析)。还通过RNA印迹分析评估选择的R0品系，分析改变了的Nph1转录物水平。对于低、中、和高表达品系的亚类来说，让R0植株自交，并用所得到的R1群体分析抗病性、Nph1转录物水平、和Nph1蛋白积累。

对于pMON30640来说，通过农杆菌属转化制备58个独立的R0品系。通过ELISA筛选植物，得到9个高的、8个中等的、和41个低的表达品系(高＝比对照高2.5倍或更高；中＝比对照高1.5-2.5倍；低＝对照的1.0-1.5倍)。其中，让19个品系(6个高表达品系，5个中等表达品系，和7个低表达品系)自交，并筛选R1群体对稻瘟病致病剂Magnaporthe grisea的抗病性。在测试的19个群体中，仅有一个品系(12536)在其R1分离体中表现出增强了的抗性(6抗性：14易感)。在病原体刺激之后，品系12536抗性反应以细胞死亡的针尖斑形式出现，类似于INA诱导的抗性水稻的表现型。没有观察到扩散性坏死，并且植物保持健壮。对12536R1分离体进行的Western印迹分析发现了Nph1蛋白水平的分离，交叉杂交带强度与来自对照植物的识别蛋白相当或明显更强。对于pMON30643来说，制备了22个独立的品系，所有品系都产生了具有低水平Nph1蛋白积累的R0植株。与pMON30640结构相反，这些品系在蛋白表达方面仅表现出中等的增强。15/22与对照植物相同，其余的7/22比对照高1.1-1.4倍。让16个R0植株自交产生R1群体，以便进行发病筛选。在16个R1群体中，有5个品系含有稻瘟病抗性分离体。

另外，用上述两种不同结构中的一种通过DNA粒子枪轰击制备92个R0水稻转基因品系。有48个品系是用水稻结构pMON30644制备的，有44个品系是用小麦Nph2-1结构pMON30645制备的。对于pMON30644结构(它相当于pMON30640)来说，我们在44个R0品系中的10个上观察到了增强了的抗性。在携带小麦Nph2-1基因(pMON30645)的44个品系中我们鉴定了4个独立的抗性品系。如上文所述，这些转基因植物上的抗性在表现型上类似于由化合物INA诱导的抗性，在真菌感染部位出现有限的针尖状的斑。与在易感相互作用中观察到的扩散性病斑不同，这些坏死斑的体积决不会增加，并且真菌孢子的产生受到明显的限制。以上结果表明，小麦和水稻Npr同系物在水稻中表达都能增强SAR途径。

Nph1和Nph2-1的转基因超量表达能促进针对M.grisea的强的抗性，类似于用INA诱导的结果，并且还能改善水稻对诸如热、干旱、和寒冷的非生物胁迫的耐受性，并且通过Nph1或Nph2转基因表达可以增强植物的生命力。

本说明书中所提到的所有文献和专利申请代表了本发明所属技术领域的技术人员的水平。所有文献和专利申请以相同的程度收作本文参考，就如同每一份文献或专利申请被专门独立地指明收作本文参考一样。

参考文献Abedinia等，澳大利亚植物生理学杂志，24：133-141，1997。Ainley等，植物分子生物学，14：9494，1990。Ali等，分子细胞生物学，18：4949-4960，1998。Ausubel等，PCT公开文件WO98/06748Ausubel等，当代分子生物学方法，John Wiley和Sons，Inc.，1995。Back等，植物分子生物学，17：9，1991。Baker等，科学276：726-733，1997。Bauer等，基因37：73，1985。Bol等，植物病理学年度综述28：13-138，1990。Bowles，生物化学年度综述，59：873-907，1990。Bull等，分子植物-微生物相互作用，5(6)：516-519，1992。Bustos等，EMBO杂志10：1469-1479，1991。Cameron等，植物杂志5：715-725，1994。Campbell等，植物生物学，92：1-11，1990。Cao等，植物细胞6：1583-1592，1994。Cao等，细胞88：57-63，1997。Cao等，美国国家科学院院刊95：6531-6536，1998。Capecchi，细胞，22(2)：479-488，1980。Castresana等，EMBO杂志7：1929-1936，1988。Cerda-Olmedo等，分子生物学杂志33：705-719，1968。Chau等，科学，244：174-181，1989。Christensen等，植物分子生物学，18：675，689，1992。Christou等，生物学技术，9：957-962，1991。Clapp，Clin.Perinatol，20(1)：155-168，1993。Costa等，分子生物学方法57：31-44，1996。Craik，生物技术，3：12-19，1985。Curiel等，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154，1992。Cuypers等，分子植物微生物相互作用1：157-160，1988。Delaney等，美国国家科学院院刊92：6602-6606，1995。Deng和Nickloff，分析生物化学200：81，1992。Dixon等，植物病理学年度综述32：479-501，1994。

Doyle等，生物化学杂志261：9228-9238，1986。

Eglitis和Anderson，生物技术，6(7)：608-614，1988。

Feinbaum等，分子基因遗传学226：449-456，1991。

Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803，1983。

Frits Eckstein等，核酸研究，10：6487-6497，1982。

Fritzemeier等，植物生物学，85：34-41，1987。

Fromm等，美国国家科学院院刊，82(17)：5824-5828，1985。

Fynan等，美国国家科学院院刊，90(24)：11478-11482，1993。

Glick等，植物分子生物学和生物技术方法，CRC出版社，BocaRaton，Fla.，1993。

Gorlach等，植物细胞，8：629-643，1996。

Graham和Van der Eb，病毒学，54(2)：536-539，1973。

Greenberg，植物生理学年度综述。植物分子生物学8：525-545，1997。

Greener等，分子生物技术7：189-195，1997。

Guerola等，自然新生物230：122-125，1971。

Hames和Higgins，核酸杂交：实践方法，IRL出版有限公司，牛津，Washington DC，1985。

Hershey和Stoner，植物分子生物学7：679-690，1991。

Hess，国际细胞学综述107：367，1987。

Horsch等，科学227：1229-1231，1985。

Hwang和Heitefuss，植物病理学103：41-47，1982。

Jin等，生理分子植物病理学51：243-257，1997。

Johnston和Tang，细胞生物学方法，43(A)：353-365，1994。

Kares等，植物分子生物学15：905，1990。

Keen，遗传学年度综述24：447-463，1990。

Keller等，EMBO杂志8：1309-1314，1989。

Kessmann等，植物病理学年度综述32：439-459，1994。

Kmecl等，生理学分子植物病理学47：185-199，1995。

Knutzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：2624-2628，1992。

Kogel等，植物生理学，106：1269-1277，1994。

Kridl等，种子科学研究，1：209，1991。

Kuhlemeier等，植物细胞1：471，1989。

Kunkel等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：488-492，1985。

Kyte和Doolittle，分子生物学杂志，157：105-132，1982。

Lam和Chua，生物化学杂志266：17131-17135，1990。

Lam和Chua，科学248：471，1991。

Linthorst，植物科学评述，10：123-150，1991。

Logemann等，植物细胞，1：151-158，1989。

Lu等，实验医学，178(6)：2089-2096，1993。

Luo等，植物分子生物学报告，6：165，1988。

Manandhar等，植物病理学88：735-739，1998。

Mandel等，植物分子生物学，29：995-1004，1995。

Marrs等，发育遗传学14：27-41，1993。

Martini等，分子记忆雌川学，263：179，1993。

Matton等，分子植物-微生物相互作用，2：325-331，1989。

Mauch等，植物分子生物学38(4)：577-586，1998。

McElroy等，植物细胞，2：163-171，1990。

Morris等，分子植物-微生物相互作用11：643-658，1998。

Mursahige和Skoog，植物生理学，15：473-497，1962。

Newell等，植物细胞制备，10(1)：30-34，1991。

Neuhaus等，遗传学应用理论，75：30，1987。

Odell等，自然，313：810，1985。

Osuna等，微生物学评述20：107-116，1994。

Ou-Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：6815，1986。

Pena等，自然，325：274，1987。Poszkowski等，EMBO杂志3：2719，1989。

Potrykus等，植物生物学年度综述，植物分子生物学，42：205，1991。

Pyee等，植物杂志，7：49-59，1995。

Richins等核酸研究20：8451，1987。

Rodriguez等，载体：分子克隆载体及其应用研究，Butterworths，Boston，1988。

Rogan和Bessman，细菌学杂志，103：622-633，1970。

Rogers等，酶学研究，153，253-277，1987。

Ryals等，植物细胞，8：1809-1819，1996。

Ryals等，植物细胞9：5425-439，1997。

Samac等，植物细胞，3：1063-1072，1991。

Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，纽约，1989。

Schaffrath等，生理学分子植物病理学46：293-307，1995。

Schaffrath等，分子植物-微生物相互作用，6：779-783，1997。

Schroder等，植物杂志，2：161-172，1992。

Schulze-Lefert等，EMBO杂志8：651，1989。

Schweizer等，植物分子生物学，12：451-461，1989。

Sears，染色体操作和植物遗传学，Oliver和Boyd，伦敦，1966。

Simpson，科学，233：34，1986。

Singer和Kusmierek，生物化学年度综述，52：655-693，1982。

Slighton和Beachy，植物学172：356，1987。

Smith和Metraux，生理学分子植物病理学，39：451-461，1991。

Smith等，遗传学工程：原理和方法，Setlow等，Eds.，Plenum出版社，纽约，1-32，1981。

Stayton等，澳大利亚植物生理学杂志18：507，1991。

Sticher等，生理学年度综述35：235-270，1997。

Vandeyar等，基因65：129-133，1988。

Van Tunen等，EMBO杂志7：1257，1988。

Vodkin等，细胞34：1023，1983。

Vogel等，细胞生物化学杂志(增补)13D：312，1989。

Wagner等，美国国家科学院院刊，89(13)：6099-6013，1992。

Walder等，基因，42：133，1986。

Warner等，植物杂志6：31-34，1994。

Waspi等，分子植物微生物相互作用11：727-733，1998。

Watanabe等，昆虫科学杂志，4：53-59，1979。

Weissbach和Weissbach，分支分子生物学方法(著)，学术出版社，Inc.，San Deigo，CA，1988。

Weisshaar等，EMBO杂志10：1777-1786，1991。

Wenzler等，植物分子生物学12：41-50，1989。

Williams等，生物技术10：540-543，1992。

Wong和Neumann，生物化学生物物理学研究综述通讯，107(2)：584-587，1982。

Worthington和Walker，杀虫剂手册，第7卷，英国作物保护协会，1983。

Yabe等，植物细胞生理学35：1207-1219，1994。

Yamaguchi-Shinozake等，植物分子生物学15：905，1990。

Zatloukal等，纽约学术科学年报，660：136-153，1992。

Zhou等，酶学方法，101：433，1983。

尽管业已出于说明目的而对本发明进行了说明，但应当理解的是，所述细节仅仅是出于说明目的，并且，在不脱离本发明构思和范围的前提下，本领域技术人员可以加以改变，本发明的范围是由权利要求书所限定的。

                            序列表<110>O.V.布格里(Bougri，Oleg)

 C.M.T.罗门斯(Rommens，Caius)

 N.斯里瓦斯塔瓦(Srivastava，Neelam)

 K.M.索兹(Swords，Kathleen M)<120>植物的获得性抗性基因<130>38-21(15415)MOBS：013-CN<140>US/60/133,965<141>1999-05-13<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1428<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>1atggaggagc tcgtgccggg aggccgcgtg gggcgcgacg ccttcctgtc gctgctgggt 60tacctgtaca cgggcaagct ccggccggcg ccggatgacg tggtgtcctg cgccgacccc 120atgtgcccgc acgactcgtg cccgccggcg atcaggttca acgtcgagca aatgtacgcg 180gcgtgggcgt tcaagatcac cgagctcatc tcgctgttcc agcgacggct tcttaacttc 240gtcgataaga ctctagtaga agatgttctt ccaattctgc aagttgcttt tcattcagag 300ctgactccag tgcttgaaaa atgtattcgg agaattgcaa gatcaaatct tgataatgta 360tcgttggata aggaacttcc tccagaagtt gctgttcaga taaaagagat tcgccaaaaa 420tctcagccaa atgagggtga cactgtcatt tcagaccctg tacatgagaa aagggtcaga 480agaatccaca gggcactgga ttctgatgat gttgagcttg tgaagttgct tcttaacgag 540tctgagatca ccttggatga tgccaatgca ttgcactatg ctgctgctta ctgtgattcg 600aaagttgttt cggagttgtt agacttgaga cttgccaact tgaatttgaa gaattcgcgt 660ggatacacgg cactccatct ggctgctatg aggagagagc cagctattat catgtgtctc 720ctaaacaaag gagcagctgt atcacaattg actgctgatg gccagagtgc aatgagtatc 780tgccggaggt taacaaggtt gaaagactac aatacaaaga tggagcaagg ccaagagtca 840aacaaagaca ggttatgtat tgatatatta gatagggaga tgataaggaa acctatggca 900gtggaagatt ctgtcacctc gcctttgttg gctgacgatc ttcacatgaa gcttctctac 960cttgaaaaca gagttgcatt tgcaagatta ttttttcctg cagaagcaaa ggttgcaatg 1020caaattgcac aagcagacac cacaccagaa tttggcattg ttcctgcagc tagcacttct 1080ggaaaattga aggaagtcga tctgaacgag acaccagtaa cacaaaacaa aaggctccgt 1140tcaagggtgg atgcactcat gaaaacagtt gagctgggac gtcgctactt ccctaactgc 1200tcgcaggtgc tcgacaaatt tctggaggat gatttgcccg atagtcctga tgcactcgac 1260ctccaaaatg gcacttctga tgagcaaaat gttaaaagga tgcggttctg tgagttaaag 1320gaggatgtgc gcaaggcatt cagcaaagcc agagctgata atagcatgtt ttctatcttg 1380tcatcttcat cgtcctcttc gccacctccc aaggttgcaa agaaatga              1428<210>2<211>2368<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2ttaaaataaa aacgagcgtc ttatcctttt ggtataacat gtagccgcca tgctgtttac 60acgacccaaa ttacagccat ttacctccgg attgacctca agaaaacaaa ccttccgcag 120cagagacgga actgttatcc agaacctcca tggtgctcaa ctctcaccga agaaatttat 180aatgatacat ctggcaatta gtccaaacaa ggttggcacc ccagacttca aagctgcaac 240agcttaatcc agcataccgg aaagtcggtc caacaataac catgaaaatt gatgagcacc 300aacaattacc aacattagac aagtcattcc ggaagcacca tgtaatgagc acagtgatca 360cagcaaaaca tcatcttctt gcttcagatg tcaagatccc agacggccac ctcaaccaag 420tttgattcgc aagaatactc ctttcttcgg gtgacttcag gttgaacttg tcttcaggtc 480accttaaaac gacgagagaa tgctacaatt tcttggttgt tgcgctgtag ctccacgttt 540agattcacgc gcgatcgttg aacgatgtag tcgcagtggg atctgagaga gaggactggg 600gggaggccgc ggtacaagat ggaggagctc gtgccgggag gccgcgtggg gcgcgacgcc 660ttcctgtcgc tgctgggtta cctgtacacg ggcaagctcc ggccggcgcc ggatgacgtg 720gtgtcctgcg ccgaccccat gtgcccgcac gactcgtgcc cgccggcgat caggttcaac 780gtcgagcaaa tgtacgcggc gtgggcgttc aagatcaccg agctcatctc gctgttccag 840cgacggcttc ttaacttcgt cgataagact ctagtagaag atgttcttcc aattctgcaa 900gttgcttttc attcagagct gactccagtg cttgaaaaat gtattcggag aattgcaaga 960tcaaatcttg ataatgtatc gttggataag gaacttcctc cagaagttgc tgttcagata 1020aaagagattc gccaaaaatc tcagccaaat gagggtgaca ctgtcatttc agaccctgta 1080catgagaaaa gggtcagaag aatccacagg gcactggatt ctgatgatgt tgagcttgtg 1140aagttgcttc ttaacgagtc tgagatcacc ttggatgatg ccaatgcatt gcactatgct 1200gctgcttact gtgattcgaa agttgtttcg gagttgttag acttgagact tgccaacttg 1260aatttgaaga attcgcgtgg atacacggca ctccatctgg ctgctatgag gagagagcca 1320gctattatca tgtgtctcct aaacaaagga gcagctgtat cacaattgac tgctgatggc 1380cagagtgcaa tgagtatctg ccggaggtta acaaggttga aagactacaa tacaaagatg 1440gagcaaggcc aagagtcaaa caaagacagg ttatgtattg atatattaga tagggagatg 1500ataaggaaac ctatggcagt ggaagattct gtcacctcgc ctttgttggc tgacgatctt 1560cacatgaagc ttctctacct tgaaaacaga gttgcatttg caagattatt ttttcctgca 1620gaagcaaagg ttgcaatgca aattgcacaa gcagacacca caccagaatt tggcattgtt 1680cctgcagcta gcacttctgg aaaattgaag gaagtcgatc tgaacgagac accagtaaca 1740caaaacaaaa ggctccgttc aagggtggat gcactcatga aaacagttga gctgggacgt 1800cgctacttcc ctaactgctc gcaggtgctc gacaaatttc tggaggatga tttgcccgat 1860agtcctgatg cactcgacct ccaaaatggc acttctgatg agcaaaatgt taaaaggatg 1920cggttctgtg agttaaagga ggatgtgcgc aaggcattca gcaaagccag agctgataat 1980agcatgtttt ctatcttgtc atcttcatcg tcctcttcgc cacctcccaa ggttgcaaag 2040aaatgacaga agttttgtaa caaatttccg ctcgtgatgt tactgggaca agagatatcg 2100atcaatagac ctgtatagtc ttacagtggt ataacaatta gatatcgaag cttcttcgaa 2160tattagaaag tgctgttctg ggctgcactc agctggttta tgggacccat gcggtgaaac 2220tggcaaaaga aaaccagctg attagaggct ccaaagtagt gtctctcgtg aatatgtttg 2280tagcattctg ttttgttcag gatggctgta atgataaaat cttttcaata gatatatagc 2340taattgtctc gtaaaaaaaa aaaaaaaa                                    2368<210>3<211>705<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>3cacagggcgt tggataggga tgatgttgag cttgtgaagt tgcttcttaa cgaatctgag 60atcaccttgg atgatgccaa tgcattgcac tatgctgctg cttactgtga ttcgaaagtt 120gtttcggagt tgttagactt gagacttgcc aacttgaatt tgaagaattc gcgtggatac 180acggcactcc atctggctgc tatgaggaga gagccagcta ttatcatgtg tctcctaaac 240aaaggagcag ctgtatcaca attgactgct gatggccaga gtgcaatgag tatctgccgg 300aggttaacaa ggatgaaaga ctacaataca aagatggagc aaggccaaga gtcaaacaaa 360gacagattat gtattgatat attagatagg gagatgataa ggaaacctat ggcagtggaa 420gattctgtca cctcgccttt gttggctgac gatcttcaca tgaagcttct ctaccttgaa 480aacagagttg catttgcaag attatttttt cctgcagaag caaaggttgc aatgcaaatt 540gcacaagcag acaccacacc agaatttggc attgttcctg cagctagcac ttctggaaaa 600ttgaaggaag tcgatctgaa cgagacacca gtaacacaaa acaaaaggct ccgttcaagg 660gtggatgcac tcatgaaaac agtcgaactc ggcccaccgc ttctt                 705<210>4<211>475<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>4Met Glu Glu Leu Val Pro Gly Gly Arg Val Gly Arg Asp Ala Phe Leu1               5                  10                  15Ser Leu Leu Gly Tyr Leu Tyr Thr Gly Lys Leu Arg Pro Ala Pro Asp

         20                  25                  30Asp Val Val Ser Cys Ala Asp Pro Met Cys Pro His Asp Ser Cys Pro

     35                  40                  45Pro Ala Ile Arg Phe Asn Val Glu Gln Met Tyr Ala Ala Trp Ala Phe

 50                  55                  60Lys Ile Thr Glu Leu Ile Ser Leu Phe Gln Arg Arg Leu Leu Asn Phe65                  70                  75                  80Val Asp Lys Thr Leu Val Glu Asp Val Leu Pro Ile Leu Gln Val Ala

             85                  90                  95Phe His Ser Glu Leu Thr Pro Val Leu Glu Lys Cys Ile Arg Arg Ile

        100                 105                 110Ala Arg Ser Asn Leu Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Glu Leu Pro Pro

    115                 120                 125Glu Val Ala Val Gln Ile Lys Glu Ile Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asn

130                 135                 140Glu Gly Asp Thr Val Ile Ser Asp Pro Val His Glu Lys Arg Val Arg145                 150                 155                 160Arg Ile His Arg Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu

            165                 170                 175Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His

        180                 185                 190Tyr Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Ser Lys Val Val Ser Glu Leu Leu Asp

    195                 200                 205Leu Arg Leu Ala Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala

210                 215                 220Leu His Leu Ala Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu225                 230                 235                 240Leu Asn Lys Gly Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Gln Ser

            245                 250                 255Ala Met Ser Ile Cys Arg Arg Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Thr

        260                 265                 270Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Leu Cys Ile Asp

    275                 280                 285Ile Leu Asp Arg Glu Met Ile Arg Lys Pro Met Ala Val Glu Asp Ser

290                 295                 300Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Leu Tyr305                 310                 315                 320Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala

            325                 330                 335Lys Val Ala Met Gln Ile Ala Gln Ala Asp Thr Thr Pro Glu Phe Gly

        340                 345                 350Ile Val Pro Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Lys Glu Val Asp Leu

    355                 360                 365Asn Glu Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg Val Asp

370                 375                 380Ala Leu Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro Asn Cys385                 390                 395                 400Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu Pro Asp Ser Pro

            405                 410                 415Asp Ala Leu Asp Leu Gln Asn Gly Thr Ser Asp Glu Gln Asn Val Lys

        420                 425                 430Arg Met Arg Phe Cys Glu Leu Lys Glu Asp Val Arg Lys Ala Phe Ser

    435                 440                 445Lys Ala Arg Ala Asp Asn Ser Met Phe Ser Ile Leu Ser Ser Ser Ser

450                 455                 460Ser Ser Ser Pro Pro Pro Lys Val Ala Lys Lys465                 470                 475<210>5<211>1824<212>DNA<213>Triticum aestivum<400>5atggagccgt cgtcgtccat cacggtcgcc tcctcgtcgt cctacctgtc caacggctct 60agcccctgct ccggcgctct ggcgccgctg cccgcggcgg acgggtgggg cggggctggg 120ggagggggag ggagcagcag cagcgtcgag gctgtgagtc tgagtcgcct cagcagcaac 180ctcgagcgcc tcctcctcga ttctgaactc gactgcagcg acgccgacgt cgacgtggcg 240gacggcgggc cgcccatccc catccaccgc tgcatcctcg ccgcgcgcag ccccttcttc 300cacgacctct tccgcgcccg cgggagccgc agtgatgggg cagtcaccgc ctccgcctcc 360gccaccagtg gcggagcggg aggggatgtt accgggaggc cgcagtacaa gatggaggac 420ctcgtcccag gtggccgtgt gggtcgcgag gccttcctgg cgttcatggg gtacctctac 480acgggcaggc tccggccagc gccgctggac gtggtgtcat gtgctgatct tgtgtgcccg 540cacgactcgt gcccgccggc catcaggttc gccgtcgagc tcatgtacgc ggcgtggacc 600ttcaggatcc ccgagctcat gtcgctgttc cagcgacggc ttatgaactt tgttgacaag 660actctggctg aagacgtcct acctattttg caagttgctt tccactcgga gcttactcaa 720gtgcgtgaaa aatgtgttca aaggattgca agatcggatc ttgatattat gtctttggat 780aaggaactcc ttcccgaaat cgctgatgag ataaaaagaa tccgacagaa atctccccca 840attgatggtg acaccatcat ttcggaccct atacacgaga aaagagtaag aagaatccac 900agggcactgg attctgatga tgttgagctt gtgaagttgc ttcttaatga gtctgaaatc 960accctagacg acgccaacgc attgcattat gctgcagctt actgcgattc taaagttctt 1020acagagttgt taggcctgga acttgccaac ttgaatttga agaacagtcg tgggtacaca 1080gcactccacc tagctgctat gaggagagaa ccagctatta ttatgtgtct cttaagcaaa 1140ggagcagtgg cgtcgcaatt gacagatgat ggccgccttg caagtaatat ttgtcgaaga 1200ttaacaagac taaaagatta caatgcaaag atggagcagg gccaagagtc aaataaagat 1260aggatgtgca ttgacatcct agagagggag atgatgagga atcctatgac agcggaagat 1320tcagtcacct cacctttatt ggctgatgat cttcacatga aactaagcta cctggaaaat 1380agagtcgcgt ttgcaagatt attcttccct gctgaagcga aggttgcgat gcaaattgcg 1440caagcagaca tcacaccaga agttggtggt ttttctgcag caagtacttc tggtaaactg 1500agggaagtcg atctgaatga gacgccagta acaaaaaaca aaaggctacg ttcgagggtg 1560gatgcactag tgaaaacagt ggaactgggc cgtcggtact tcccaaactg ctcgcaggtg 1620ctcgacaaat tcttggaaga tggcctgcct gatggccttg atgcattcca gcagcaaagc 1680ggcacccctg atgagcaaca ggtgaagaag atgcgcttct gcgaggtgaa ggaggacgtg 1740cgcaaagcat acagcaaaga cacggccgat aacagcatgt tttcagccct gtcgtcaaac 1800tcctcatcct cggcgatgaa gtga                                        1824<210>6<211>1830<212>DNA<213>Triticum aestivum<400>6atggagccgt cgtcgtccat cacgttcgcc tcctcgtcgt cctacctgtc caacggctct 60agcccctgct ccggcgctct ggcaccgctg cccgcggcgg acgggtgggg cgggggcggt 120ggagggggag ggggagggag cagcagcagc gtcgaggccg tgagcttgaa tcgcctcagc 180agcaacctcg agcgcctcct cctcgattct gaactcgact gcagcgacgc tgacgtcgac 240gtcgcggacg gcggtccgcc catccccgtc caccgttgca tcctcgccgt gcgcagctcc 300ttcttccacg acctcttccg cgcccgcggg agccgcagtg atggggccgt cactgcctct 360gcctccgcca ccggaggcgg agcgggaggg gatgtgaacg ggaggccgca gtacaagatg 420gaggacctcg tcccaggtgg ccgtgtgggc cgcgaggcct tcctagcgtt catggggtac 480ctctacacgg gcaggctccg gccggcgccg ctggacgtgg tgtcatgtgc tgatcttgtg 540tgcccgcacg actcgtgccc gccggctatc aggttcgccg tcgagctcat gtacgcggct 600tggaccttca ggatccccga gctcatgtcg ctgttccagc gacggcttat gaactttgtt 660gacaagactc tggcggaaga cgtcctacct attttgcaag ttgctttcca ctcggagctt 720actcaagtgc gtgaaaaatg tgttcaaagg attgcaagat cggatcttga tattatgtct 780ttggataagg aactccctcc agaaattgct gacgagataa aaaagatccg tcagaaatct 840ccgccaattg atggtgacac catcatttcg gaccctgtac acgagaaaag agtaagaaga 900atccacaggg cactggattc tgatgatgtt gaacttgtca agttgcttct taatgagtct 960gaaatcaccc ttgacgacgc aaacgcattg cattatgctg cagcttactg cgattccaaa 1020gttcttacag agttgttagg cctggaactt gccaacttga atttgaagaa cagtcgtggg 1080tacacagcac tccacctagc tgctatgagg agagaaccag ctattattat gtgtctctta 1140agcaaaggag cagtggcgtc gcaattgaca gatgacggcc gccttgcaag taatatttgt 1200cgaaggttaa caagactaaa agattacaat gcgaagatgg agcagggcca agagtcaaat 1260aaagatagga tgtgcattga catcctagag agggagatga tgaggaatcc tatgacagcg 1320gaagattctg tcacctcacc tttattggct gatgatcttc acatgaaact aagctacctg 1380gaaaacagag tcgcgttcgc aagactgttc ttccctgctg aagccaaggt tgccatgcaa 1440attgcacaag cagacgtcac accagaagtt ggtggttttt ctgcagcaag tacttctggt 1500aaactgaggg aagtcgatct gaatgagacg ccagtaacaa aaaacaaaag gctgcgttca 1560agggtggatg cactagcgaa aacagtggaa ctgggccgtc ggtacttccc aaactgctcg 1620caggtgctcg acaaattctt ggaagatggc ctgcctgatg gccttgatgc gttccagcag 1680caaagcggca cccctgatga gcaacaggtg aagaagatgc gcttctgcga ggtgaaggag 1740gacgtgcgca aagcatacag caaagacacg gccgataaca gcatgttttc ggccctgtcg 1800tcaaactcct cgtcctcggc gatgaagtga                                  1830<210>7<211>2420<212>DNA<213>Triticum aestivum<400>7gccgtccctt ctccgctgag tttaggcggg gggtgacgtg ggggagtttc cgtgccgacg 60cggatctgcg tggtgccaaa caaagcctgc ccgaattgcg cagttcggcc gggagcgacc 120aaaaggcagc ctcccccctt tgccttccca cacatggtgg tccggctcta gggccctttc 180gcctcgtgct tggcggcggt gatggagccg tcgtcgtcca tcacggtcgc ctcctcgtcg 240tcctacctgt ccaacggctc tagcccctgc tccggcgctc tggcgccgct gcccgcggcg 300gacgggtggg gcggggctgg gggaggggga gggagcagca gcagcgtcga ggctgtgagt 360ctgagtcgcc tcagcagcaa cctcgagcgc ctcctcctcg attctgaact cgactgcagc 420gacgccgacg tcgacgtggc ggacggcggg ccgcccatcc ccatccaccg ctgcatcctc 480gccgcgcgca gccccttctt ccacgacctc ttccgcgccc gcgggagccg cagtgatggg 540gcagtcaccg cctccgcctc cgccaccagt ggcggagcgg gaggggatgt taccgggagg 600ccgcagtaca agatggagga cctcgtccca ggtggccgtg tgggtcgcga ggccttcctg 660gcgttcatgg ggtacctcta cacgggcagg ctccggccag cgccgctgga cgtggtgtca 720tgtgctgatc ttgtgtgccc gcacgactcg tgcccgccgg ccatcaggtt cgccgtcgag 780ctcatgtacg cggcgtggac cttcaggatc cccgagctca tgtcgctgtt ccagcgacgg 840cttatgaact ttgttgacaa gactctggct gaagacgtcc tacctatttt gcaagttgct 900ttccactcgg agcttactca agtgcgtgaa aaatgtgttc aaaggattgc aagatcggat 960cttgatatta tgtctttgga taaggaactc cttcccgaaa tcgctgatga gataaaaaga 1020atccgacaga aatctccccc aattgatggt gacaccatca tttcggaccc tatacacgag 1080aaaagagtaa gaagaatcca cagggcactg gattctgatg atgttgagct tgtgaagttg 1140cttcttaatg agtctgaaat caccctagac gacgccaacg cattgcatta tgctgcagct 1200tactgcgatt ctaaagttct tacagagttg ttaggcctgg aacttgccaa cttgaatttg 1260aagaacagtc gtgggtacac agcactccac ctagctgcta tgaggagaga accagctatt 1320attatgtgtc tcttaagcaa aggagcagtg gcgtcgcaat tgacagatga tggccgcctt 1380gcaagtaata tttgtcgaag attaacaaga ctaaaagatt acaatgcaaa gatggagcag 1440ggccaagagt caaataaaga taggatgtgc attgacatcc tagagaggga gatgatgagg 1500aatcctatga cagcggaaga ttcagtcacc tcacctttat tggctgatga tcttcacatg 1560aaactaagct acctggaaaa tagagtcgcg tttgcaagat tattcttccc tgctgaagcg 1620aaggttgcga tgcaaattgc gcaagcagac atcacaccag aagttggtgg tttttctgca 1680gcaagtactt ctggtaaact gagggaagtc gatctgaatg agacgccagt aacaaaaaac 1740aaaaggctac gttcgagggt ggatgcacta gtgaaaacag tggaactggg ccgtcggtac 1800ttcccaaact gctcgcaggt gctcgacaaa ttcttggaag atggcctgcc tgatggcctt 1860gatgcattcc agcagcaaag cggcacccct gatgagcaac aggtgaagaa gatgcgcttc 1920tgcgaggtga aggaggacgt gcgcaaagca tacagcaaag acacggccga taacagcatg 1980ttttcagccc tgtcgtcaaa ctcctcatcc tcggcgatga agtgaaggta ctgtaacagg 2040ctgttttctg gagatgtcag gactaaagag ggatcgctgg tcatgcgcat gtatagtgct 2100caccatcgtg taaaactgaa tatgaacatg aaagaaggcc ccaaaatagt agaagatgat 2160atatactttg ctggacttgg agtttgttgg agaaggctgt gccatcccat tccagattcc 2220caatatcaat tttcccatgc tggttgtgaa gacagagccg cggatcatcc agctccgacg 2280ctatgcatgc gtgcagcctg ctgtatttgt ttcgcatagc tgcaatactt atatgtttaa 2340taatagtact agggagtagt aggttattga ggctgtagcg gaagttggaa cctaccttaa 2400tgtaagtgaa agggggcccg                                             2420<210>8<211>2120<212>DNA<213>Triticum aestivum<400>8gggtttccgt gccgacgcgg atctgtgtgg tgccaaacaa agcctgcccg aattgcgcag 60ttcggccggg agcgaccaaa aggcagcctc ccccctttgc cttcacacat ggtggtccgg 120ctctagggcc ctttcgcctc gtgcttggcg gcggtgatgg agccgtcgtc gtccatcacg 180ttcgcctcct cgtcgtccta cctgtccaac ggctctagcc cctgctccgg cgctctggca 240ccgctgcccg cggcggacgg gtggggcggg ggcggtggag ggggaggggg agggagcagc 300agcagcgtcg aggccgtgag cttgaatcgc ctcagcagca acctcgagcg cctcctcctc 360gattctgaac tcgactgcag cgacgctgac gtcgacgtcg cggacggcgg tccgcccatc 420cccgtccacc gttgcatcct cgccgtgcgc agctccttct tccacgacct cttccgcgcc 480cgcgggagcc gcagtgatgg ggccgtcact gcctctgcct ccgccaccgg aggcggagcg 540ggaggggatg tgaacgggag gccgcagtac aagatggagg acctcgtccc aggtggccgt 600gtgggccgcg aggccttcct agcgttcatg gggtacctct acacgggcag gctccggccg 660gcgccgctgg acgtggtgtc atgtgctgat cttgtgtgcc cgcacgactc gtgcccgccg 720gctatcaggt tcgccgtcga gctcatgtac gcggcttgga ccttcaggat ccccgagctc 780atgtcgctgt tccagcgacg gcttatgaac tttgttgaca agactctggc ggaagacgtc 840ctacctattt tgcaagttgc tttccactcg gagcttactc aagtgcgtga aaaatgtgtt 900caaaggattg caagatcgga tcttgatatt atgtctttgg ataaggaact ccctccagaa 960attgctgacg agataaaaaa gatccgtcag aaatctccgc caattgatgg tgacaccatc 1020atttcggacc ctgtacacga gaaaagagta agaagaatcc acagggcact ggattctgat 1080gatgttgaac ttgtcaagtt gcttcttaat gagtctgaaa tcacccttga cgacgcaaac 1140gcattgcatt atgctgcagc ttactgcgat tccaaagttc ttacagagtt gttaggcctg 1200gaacttgcca acttgaattt gaagaacagt cgtgggtaca cagcactcca cctagctgct 1260atgaggagag aaccagctat tattatgtgt ctcttaagca aaggagcagt ggcgtcgcaa 1320ttgacagatg acggccgcct tgcaagtaat atttgtcgaa ggttaacaag actaaaagat 1380tacaatgcga agatggagca gggccaagag tcaaataaag ataggatgtg cattgacatc 1440ctagagaggg agatgatgag gaatcctatg acagcggaag attctgtcac ctcaccttta 1500ttggctgatg atcttcacat gaaactaagc tacctggaaa acagagtcgc gttcgcaaga 1560ctgttcttcc ctgctgaagc caaggttgcc atgcaaattg cacaagcaga cgtcacacca 1620gaagttggtg gtttttctgc agcaagtact tctggtaaac tgagggaagt cgatctgaat 1680gagacgccag taacaaaaaa caaaaggctg cgttcaaggg tggatgcact agcgaaaaca 1740gtggaactgg gccgtcggta cttcccaaac tgctcgcagg tgctcgacaa attcttggaa 1800gatggcctgc ctgatggcct tgatgcgttc cagcagcaaa gcggcacccc tgatgagcaa 1860caggtgaaga agatgcgctt ctgcgaggtg aaggaggacg tgcgcaaagc atacagcaaa 1920gacacggccg ataacagcat gttttcggcc ctgtcgtcaa actcctcgtc ctcggcgatg 1980aagtgaaggt actgtaacag gctgttttct cgagatgtca gggctaaaga gggatcgctg 2040gtcatgcgca tgtatagtgc ccaccatcgt gtaaaaccga atatgaacat gaaaggaggc 2100cccaaaatag tagaagaccg                                             2120<210>9<211>706<212>DNA<213>Triticum aestivum<400>9tcacagggcg ttggactggg atgatgttga acttgtgaag ttgcttctta atgagtctga 60aatcacccta gacgacgcca acgcattgca ttatgctgca gcttactgcg attccaaagt 120tcttaccgag ttgttaggcc tggaacttgc caacttgaat ttgaagaaca gtcgtgggta 180cacagcactc cacctagctg ctatgaggag agaaccagct attattatgt gtctcttaag 240caaaggagca gtggcgtcgc aattgacaga tgatggccgc cttgcaagta atatttgtcg 300aagattaaca agactaaaag attataatgc aaagatggag cagggccaag agtcaaataa 360agataggatg tgcattgaca tcctagagag ggagatgatg aggaatccta tgacagcgga 420agattcagtc acctcacctt tattggctga tgatcttcac atgaaactaa gctacctgga 480aaatagagtc gcgtttgcaa gattattctt ccctgctgaa gcgaaggttg cgatgcaaat 540tgcgcaagca gacgtcacac cagaagttgg tgttttttct gcagcaagta cttctggtaa 600actgagggaa gtcgatctga atgagacgcc agtaacaaaa aacaaaaggc tacgttcgag 660ggtggatgca ctcgcaaaaa cagtggaact cggccgccgc tacttc                706<210>10<211>607<212>PRT<213>Triticum aestivum<400>10Met Glu Pro Ser Ser Ser Ile Thr Val Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu1               5                  10                  15Ser Asn Gly Ser Ser Pro Cys Ser Gly Ala Leu Ala Pro Leu Pro Ala

         20                  25                  30Ala Asp Gly Trp Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser

     35                  40                  45Val Glu Ala Val Ser Leu Ser Arg Leu Ser Ser Asn Leu Glu Arg Leu

 50                  55                  60Leu Leu Asp Ser Glu Leu Asp Cys Ser Asp Ala Asp Val Asp Val Ala65                  70                  75                  80Asp Gly Gly Pro Pro Ile Pro Ile His Arg Cys Ile Leu Ala Ala Arg

             85                  90                  95Ser Pro Phe Phe His Asp Leu Phe Arg Ala Arg Gly Ser Arg Ser Asp

        100                 105                 110Gly Ala Val Thr Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ser Gly Gly Ala Gly Gly

    115                 120                 125Asp Val Thr Gly Arg Pro Gln Tyr Lys Met Glu Asp Leu Val Pro Gly

130                 135                 140Gly Arg Val Gly Arg Glu Ala Phe Leu Ala Phe Met Gly Tyr Leu Tyr145                 150                 155                 160Thr Gly Arg Leu Arg Pro Ala Pro Leu Asp Val Val Ser Cys Ala Asp

            165                 170                 175Leu Val Cys Pro His Asp Ser Cys Pro Pro Ala Ile Arg Phe Ala Val

        180                 185                 190Glu Leu Met Tyr Ala Ala Trp Thr Phe Arg Ile Pro Glu Leu Met Ser

    195                 200                 205Leu Phe Gln Arg Arg Leu Met Asn Phe Val Asp Lys Thr Leu Ala Glu

210                 215                 220Asp Val Leu Pro Ile Leu Gln Val Ala Phe His Ser Glu Leu Thr Gln225                 230                 235                 240Val Arg Glu Lys Cys Val Gln Arg Ile Ala Arg Ser Asp Leu Asp Ile

            245                 250                 255Met Ser Leu Asp Lys Glu Leu Leu Pro Glu Ile Ala Asp Glu Ile Lys

        260                 265                 270Arg Ile Arg Gln Lys Ser Pro Pro Ile Asp Gly Asp Thr Ile Ile Ser

    275                 280                 285Asp Pro Ile His Glu Lys Arg Val Arg Arg Ile His Arg Ala Leu Asp

290                 295                 300Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ile305                 310                 315                 320Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala Tyr Cys Asp

            325                 330                 335Ser Lys Val Leu Thr Glu Leu Leu Gly Leu Glu Leu Ala Asn Leu Asn

        340                 345                 350Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Met Arg

    355                 360                 365Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Ser Lys Gly Ala Val Ala

370                 375                 380Ser Gln Leu Thr Asp Asp Gly Arg Leu Ala Ser Asn Ile Cys Arg Arg385                 390                 395                 400Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Ala Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu

            405                 410                 415Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys Ile Asp Ile Leu Glu Arg Glu Met Met

        420                 425                 430Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala

    435                 440                 445Asp Asp Leu His Met Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe

450                 455                 460Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met Gln Ile Ala465                 470                 475                 480Gln Ala Asp Ile Thr Pro Glu Val Gly Gly Phe Ser Ala Ala Ser Thr

            485                 490                 495Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Lys

        500                 505                 510Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg Val Asp Ala Leu Val Lys Thr Val Glu

    515                 520                 525Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro Ash Cys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe

530                 535                 540Leu Glu Asp Gly Leu Pro Asp Gly Leu Asp Ala Phe Gln Gln Gln Ser545                 550                 555                 560Gly Thr Pro Asp Glu Gln Gln Val Lys Lys Met Arg Phe Cys Glu Val

            565                 570                 575Lys Glu Asp Val Arg Lys Ala Tyr Ser Lys Asp Thr Ala Asp Asn Ser

        580                 585                 590Met Phe Ser Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ala Met Lys

    595                 600                 605<210>11<211>609<212>PRT<213>Triticum aestivum<400>11Met Glu Pro Ser Ser Ser Ile Thr Phe Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu1               5                  10                  15Ser Asn Gly Ser Ser Pro Cys Ser Gly Ala Leu Ala Pro Leu Pro Ala

         20                  25                  30Ala Asp Gly Trp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser

     35                  40                  45Ser Ser Val Glu Ala Val Ser Leu Asn Arg Leu Ser Ser Asn Leu Glu

 50                  55                  60Arg Leu Leu Leu Asp Ser Glu Leu Asp Cys Ser Asp Ala Asp Val Asp65                  70                  75                  80Val Ala Asp Gly Gly Pro Pro Ile Pro Val His Arg Cys Ile Leu Ala

             85                  90                  95Val Arg Ser Ser Phe Phe His Asp Leu Phe Arg Ala Arg Gly Ser Arg

        100                 105                 110Ser Asp Gly Ala Val Thr Ala Ser Ala Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala

    115                 120                 125Gly Gly Asp Val Asn Gly Arg Pro Gln Tyr Lys Met Glu Asp Leu Val

130                 135                 140Pro Gly Gly Arg Val Gly Arg Glu Ala Phe Leu Ala Phe Met Gly Tyr145                 150                 155                 160Leu Tyr Thr Gly Arg Leu Arg Pro Ala Pro Leu Asp Val Val Ser Cys

            165                 170                 175Ala Asp Leu Val Cys Pro His Asp Ser Cys Pro Pro Ala Ile Arg Phe

        180                 185                 190Ala Val Glu Leu Met Tyr Ala Ala Trp Thr Phe Arg Ile Pro Glu Leu

    195                 200                 205Met Ser Leu Phe Gln Arg Arg Leu Met Asn Phe Val Asp Lys Thr Leu

210                 215                 220Ala Glu Asp Val Leu Pro Ile Leu Gln Val Ala Phe His Ser Glu Leu225                 230                 235                 240Thr Gln Val Arg Glu Lys Cys Val Gln Arg Ile Ala Arg Ser Asp Leu

            245                 250                 255Asp Ile Met Ser Leu Asp Lys Glu Leu Pro Pro Glu Ile Ala Asp Glu

        260                 265                 270Ile Lys Lys Ile Arg Gln Lys Ser Pro Pro Ile Asp Gly Asp Thr Ile

    275                 280                 285Ile Ser Asp Pro Val His Glu Lys Arg Val Arg Arg Ile His Arg Ala

290                 295                 300Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu Ser305                 310                 315                 320Glu Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala Tyr

            325                 330                 335Cys Asp Ser Lys Val Leu Thr Glu Leu Leu Gly Leu Glu Leu Ala Asn

        340                 345                 350Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala Ala

    355                 360                 365Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Ser Lys Gly Ala

370                 375             380Val Ala Ser Gln Leu Thr Asp Asp Gly Arg Leu Ala Ser Asn Ile Cys385                 390                 395                 400Arg Arg Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Ala Lys Met Glu Gln Gly

            405                 410                 415Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys Ile Asp Ile Leu Glu Arg Glu

        420                 425                 430Met Met Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu

    435                 440                 445Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Asn Arg Val

450                 455                 460Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met Gln465                 470                 475                 480Ile Ala Gln Ala Asp Val Thr Pro Glu Val Gly Gly Phe Ser Ala Ala

            485                 490                 495Ser Thr Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val

        500                 505                 510Thr Lys Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg Val Asp Ala Leu Ala Lys Thr

    515                 520                 525Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp

530                 535                 540Lys Phe Leu Glu Asp Gly Leu Pro Asp Gly Leu Asp Ala Phe Gln Gln545                 550                 555                 560Gln Ser Gly Thr Pro Asp Glu Gln Gln Val Lys Lys Met Arg Phe Cys

            565                 570                 575Glu Val Lys Glu Asp Val Arg Lys Ala Tyr Ser Lys Asp Thr Ala Asp

        580                 585                 590Asn Ser Met Phe Ser Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ala Met

    595                 600                 605Lys<210>12<211>8<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>12His Arg Ala Leu Asp Trp Asp Asp1               5<210>13<211>7<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>13Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe1               5<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：n＝I<220><221>primer_bind<222>(1)..(23)<400>14cayarngcny tngaywsnga yga                                 23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：n＝I<220><221>primer_bind<222>()..(21)<400>15raarwanckn yknccnaryt c                                   21<210>16<211>1385<212>DNA<213>Zea mays<400>16gaattcccgg gtcgacccac gcgtccgccc acgcgtccgc aaaggattgc tagatcagat 60ctcgacgata tatctttgga taaggagctc cctccagaag cagttgatga gataaaaaat 120ttgcgcaaga attcacaaac tgctgatggt gatacgttca tttcggaccc tgtgcatgag 180aaaagagtca gaagaatcca cagggcactt gactctgatg atgttgagct tgtgaagttg 240cttcttaatg agtccgacat cacattagat gatgccaacg cattacacta tgctgcttct 300tactgtgatc ctaaagttgt ctcagagctg ttagatttgg caatggctaa cttaaatttg 360aagaattccc gtgggtacac agcactccac ttggctgcta tgaggagaga accagctata 420atcatgtgtc tccttaacaa aggggcaaat gtgtcacaac tgacagctga tggcaggagc 480gcaattggta tttgtcggag gttaacaaga gcaaaagact acaatacaaa gatggagcag 540ggtcaagaat caaataaaga taggctgtgt atagatattc tagagaggga gatgatgcgg 600aatcctatgg cggtggaaga tgccgtcacc tcgcctttgt tggcagatga tcttcacatg 660aagcttctct acctggaaaa cagagttgca tttgctagat tgttctttcc tgctgaagcc 720aaggtcgcca tgcaaatcgc acaagcagac accacgaagg aattcggcgg tatagttgca 780gttgcagcaa gcacttctgg taaactgagg gaggtggacc ttaatgagac gccagtgaca 840caaaacaaaa ggctccgttc aagggtagat gcactgatga aaacagtgga gctgggccgt 900cggtacttcc cgaactgctc gcaggtgctg gacaagttcc tggaggacga tctgccggaa 960ggtctggacc agttctacct ccagaggggc acagccgatg agcagaaggt gaagaggatg 1020cgcttctgcg agctgaaaga ggacgtgctg aaggcgttta gcaaggacaa ggcggagggc 1080agcgtgttct cgggcctgtc ctcgtcgtcg tcgtgctcgc cgccccagaa gtatgcccag 1140aggtgatcaa ggcaccagtt tttgccgtat agtttgttat catggtcttc gagacttgga 1200cccggacagc atatagggac atgtacacct gtgtatgtat agtgcttaca attggcgtaa 1260gtagaactat atgtatggaa cataaggaaa catggcagga acaccgtgca aaaagatgaa 1320aagatggccg aagtgctcta tgcgagtgcc cacctgaaaa aaaaaaaaaa aaaaagggcg 1380gccgc                                                             1385<210>17<211>381<212>PRT<213>Zea mays<400>17Glu Phe Pro Gly Arg Pro Thr Arg Pro Pro Thr Arg Pro Gln Arg Ile1               5                  10                  15Ala Arg Ser Asp Leu Asp Asp Ile Ser Leu Asp Lys Glu Leu Pro Pro

         20                  25                  30Glu Ala Val Asp Glu Ile Lys Asn Leu Arg Lys Asn Ser Gln Thr Ala

     35                  40                  45Asp Gly Asp Thr Phe Ile Ser Asp Pro Val His Glu Lys Arg Val Arg

 50                  55                  60Arg Ile His Arg Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu65                  70                  75                  80Leu Leu Asn Glu Ser Asp Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His

             85                  90                  95Tyr Ala Ala Ser Tyr Cys Asp Pro Lys Val Val Ser Glu Leu Leu Asp

        100                 105                 110Leu Ala Met Ala Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala

    115                 120                 125Leu His Leu Ala Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu

130                 135                 140Leu Asn Lys Gly Ala Asn Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Arg Ser145                 150                 155                 160Ala Ile Gly Ile Cys Arg Arg Leu Thr Arg Ala Lys Asp Tyr Asn Thr

            165                 170                 175Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Leu Cys Ile Asp

        180                 185                 190Ile Leu Glu Arg Glu Met Met Arg Asn Pro Met Ala Val Glu Asp Ala

    195                 200                 205Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Leu Tyr

210                 215                 220Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala225                 230                 235                 240Lys Val Ala Met Gln Ile Ala Gln Ala Asp Thr Thr Lys Glu Phe Gly

            245                 250                 255Gly Ile Val Ala Val Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val

        260                 265                 270Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg

    275                 280                 285Val Asp Ala Leu Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro

290                 295                 300Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu Pro Glu305                 310                 315                 320Gly Leu Asp Gln Phe Tyr Leu Gln Arg Gly Thr Ala Asp Glu Gln Lys

            325                 330                 335Val Lys Arg Met Arg Phe Cys Glu Leu Lys Glu Asp Val Leu Lys Ala

        340                 345                 350Phe Ser Lys Asp Lys Ala Glu Gly Ser Val Phe Ser Gly Leu Ser Ser

    355                 360                 365Ser Ser Ser Cys Ser Pro Pro Gln Lys Tyr Ala Gln Arg

370                 375                 380<210>18<211>640<212>DNA<213>Zea mays<400>18gaattcccgg gtcgacccac gcgtccgccc acgcgtccgc tgagggaggt ggaccttaat 60gagacgccag tgacacaaaa caaaaggctc cgttcaaggg tagatgcact gatgaaaaca 120gtggagctgg gccgtcggta cttcccgaac tgctcgcagg tgctggacaa gttcctggag 180gacgatctgc cggaaggtct ggaccagttc tacctccaga ggggcacagc cgatgagcag 240aaggtgaaga ggatgcgctt ctgcgagctg aaagaggacg tgctgaaggc gtttagcaag 300gacaaggcgg agggcagcgt gttctcgggc ctgtcctcgt cgtcgtcgtg ctcgccgccc 360cagaagtatg cccagaggtg atcaaggcac cagtttttgc cgtatagttt gttatcatgg 420tcttcgagac ttggacccgg acagcatata gggacatgta cacctgtgta tgtatagtgc 480ttacaattgg cgtaagtaga actatatgta tggaacataa ggaaacatgg caggaacacc 540gtgcaaaaag atgaaaagat ggccgaagtg ctctatgcga gtgcccacct gattcgatgg 600ccctattcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                       640<210>19<211>126<212>PRT<213>Zea mays<400>19Glu Phe Pro Gly Arg Pro Thr Arg Pro Pro Thr Arg Pro Leu Arg Glu1               5                  10                  15Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg Ser

         20                  25                  30Arg Val Asp Ala Leu Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe

     35                  40                  45Pro Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu Pro

 50                  55                  60Glu Gly Leu Asp Gln Phe Tyr Leu Gln Arg Gly Thr Ala Asp Glu Gln65                  70                  75                  80Lys Val Lys Arg Met Arg Phe Cys Glu Leu Lys Glu Asp Val Leu Lys

             85                  90                  95Ala Phe Ser Lys Asp Lys Ala Glu Gly Ser Val Phe Ser Gly Leu Ser

        100                 105                 110Ser Ser Ser Ser Cys Ser Pro Pro Gln Lys Tyr Ala Gln Arg

    115                 120                 125<210>20<211>2235<212>DNA<213>Zea mays<400>20gaattcggct cgagcacgat tcgtgcccgc cggccatcag gtccgcggtc gagctcatgt 60acgcggcgtg taccttcaag atccccgagc tcacctcgct cttccaggcg aacctggtgg 120cttgaagtct atgaattgaa atggaatcat tattcattag gctgctcaac atttgaatat 180tacatttatg gctgtatagt ttatcaatca gtttaacatc aattgagctt tgctttgtct 240ttacggaagg caaatggtta acatggtctt cttctacagc ggcggcttct taattttgta 300gacaagactc tagtggagga tgtcattcct attctggaag ttgcttccca ctcagggctg 360actcaagtga tcgacaaatg tattcaaagg attgctagat cagatcttga tgatatatct 420ttggataagg agctccctcc agaagcagtt gatgagataa aaaatttgcg caagaagtca 480caaactgctg atggtgatac gttcatttcg gaccctgtgc atgagaaaag agtcagaaga 540atccacaggg cacttgactc tgatgatgtt gagcttgtga agttgcttct taatgagtcc 600gacatcacat tagatgatgc caacgcatta cactatgctg cttcttactg tgatcctaaa 660gttgtctcag agctgttaga tttggcaatg gctaacttaa atttgaagaa tagccgtggg 720tacacagcac tccacttggc tgctatgagg agagaaccag ctataatcat gtgtctcctt 780aacaaagggg caaatgtgtc acaactgaca gctgatggca ggagcgcaat tggtatttgt 840cggaggttaa caagagcaaa agactacaat acaaagatgg agcagggtca agaatcaaat 900aaagataggc tgtgtataga tattctagag agggagatga tgcggaatcc tatggcggtg 960gaagatgccg tcacctcgcc tttgttggca gatgatcttc acatgaagct tctctacctg 1020gaaaacagag ttgcatttgc tagattgttc tttcctgctg aagccaaggt cgccatgcaa 1080atcgcacaag cagacaccac agaagaattc ggcggtatag ttgcagttgc agcaagcact 1140tccggtaaac tgagggaggt ggaccttaat gagacgccag tgacacaaaa caaaaggctc 1200cgttcaaggg tagatgcact gatgaaaaca gtggagctgg gccgtcggta cttcccgaac 1260tgctcgcagg tgctggacaa gttcctggag gacgatctgc cggaagtctg gaccagttct 1320tacctccaga ggggcacagc cgatgagcag aagttgaaga ggatgcgctt ctgcgagctg 1380aaagaggacg tgctgaaggc gtttagcaag gacaaggcgg agggcagcgt gttctcgggc 1440ctgtcctcgt cgtcgtcgtg ctcgccgccc cagaagtatg cccagaggtg atcaaggcac 1500cagtttttgc cgtatagttt gttatcatgg tcttcgagac ttggacccgg acagcatata 1560gggacatgta cacctgtgta tgtatagtgc ttacaattgg cgtaagtaga actatatata 1620tggaacataa ggaaacatgg caggaacacc gcgcaaaaag atgaaaagat ggccgaagtg 1680ctctatgcga gtgcgcacct gattcgatgg ccctattcaa cggcgccctg tcagcatgct 1740gcatgcccac tgagaccttc ggttgcatag ggataggagg agatttctgt tcaattttgg 1800ctagcaagtg atataggggt gtttaggact gtttcacttt atgaaaatca acttagctca 1860taaacacttt taacttcaat aacttaggtc ctgtttggag tggctgtatt tttctagtcc 1920caagaaaata atgtggtatc tgagaatacc atggtctaga aaccaaaatg tgtttggcag 1980actcttttaa accatggtat ttaaaatctt ggttttgaca agaccacatt atttctgggt 2040atagaatact gtcagccgag ttcggctcgg ctcggtgcgg ctcgttgact gaacgagctc 2100gactcggctc gtccattcca cgagctggtg aaagaggctc ggctcggctc gaccttagct 2160cgcgagccat attcttgtaa aaaaaasaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220aaaaagggcg gccgc                                                  2235<210>21<211>409<212>PRT<213>Zea mays<400>21His Gly Leu Leu Leu Gln Arg Arg Leu Leu Asn Phe Val Asp Lys Thr1               5                  10                  15Leu Val Glu Asp Val Ile Pro Ile Leu Glu Val Ala Ser His Ser Gly

         20                  25                  30Leu Thr Gln Val Ile Asp Lys Cys Ile Gln Arg Ile Ala Arg Ser Asp

     35                  40                  45Leu Asp Asp Ile Ser Leu Asp Lys Glu Leu Pro Pro Glu Ala Val Asp

 50                  55                  60Glu lle Lys Asn Leu Arg Lys Lys Ser Gln Thr Ala Asp Gly Asp Thr65                  70                  75                  80Phe Ile Ser Asp Pro Val His Glu Lys Arg Val Arg Arg Ile His Arg

             85                  90                  95Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu

        100                 105                 110Ser Asp Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ser

    115                 120                 125Tyr Cys Asp Pro Lys Val Val Ser glu Leu Leu Asp Leu Ala Met Ala

130                 135                 140Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala145                 150                 155                 160Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly

            165                 170                 175Ala Asn Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Arg Ser Ala Ile gly Ile

        180                 185                 190Cys Arg Arg Leu Thr Arg Ala Lys Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu Gln

    195                 200                 205Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Leu Cys Ile Asp Ile Leu Glu Arg

210                 215                 220Glu Met Met Arg Asn Pro Met Ala Val Glu Asp Ala Val Thr Ser Pro225                 230                 235                 240Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg

            245                 250                 255Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met

            260             265                 270Gln Ile Ala Gln Ala Asp Thr Thr Glu Glu Phe Gly Gly Ile Val Ala

    275                 280                 285Val Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val Asp Leu Asn Glu

290                 295                 300Thr Pro Val Thr Gln Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg Val Asp Ala Leu305                 310                 315                 320Met Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro Asn Cys Ser Gln

            325                 330                 335Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Asp Leu Pro Glu Val Trp Thr Ser

        340                 345                 350Ser Tyr Leu Gln Arg Gly Thr Ala Asp Glu Gln Lys Leu Lys Arg Met

    355                 360                 365Arg Phe Cys Glu Leu Lys Glu Asp Val Leu Lys Ala Phe Ser Lys Asp

370                 375                 380Lys Ala Glu Gly Ser Val Phe Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Cys385                 390                 395                 400Ser Pro Pro Gln Lys Tyr Ala Gln Arg

            405<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>22ggattgctag atcagatctc g                                   21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>23cggtgttcct gccatgtttc c                                   21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>24acagggcgtt ggactgggat g                                   21<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>25agtgcatcca ccctcgaacg ta                                  22<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>26agctcgcgtg gcgaacggac                                     20<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>27gatggtcatg gtgtccggta g                                   21<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>28gacaagaagt tccagaacgt gtccaagg                            28<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>29gaccggtaga tgctcgacgc aaagtc                              26<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>30ggatgcacta gtgaaaacag tgg                                 23<210>31<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>31gctctagagg aattctcact tcatcgccga ggatgagg                 38<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>32ccatcgatcc atggagccgt cgtcgtccat cac                      33<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>33gactcagact cacagcctcg acg                                 23<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>34ttatctgaac agcaacttct                                     20<210>35<211>180<212>PRT<213>Lycopersicon esculentum<400>35Glu Ala Ser Leu Ser Leu Ala Met Ala Gly Asp Asp Leu Arg Met Lys1               5                  10                  15Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Leu Leu Phe Pro

         20                  25                  30Met Glu Ala Lys Val Ala Met Asp Ile Ala Gln Val Asp Gly Thr Ser

     35                  40                  45Glu Leu Pro Leu Ala Ser Met Arg Lys Lys Ile Ala Asp Ala Gln Arg

 50                  55                  60Thr Thr Val Asp Leu Asn Glu Ala Pro Phe Lys Met Lys Glu Glu His65                  70                  75                  80Leu Asn Arg Leu Arg Ala Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg

             85                  90                  95Phe Phe Pro Arg Cys Ser Glu Val Leu Asn Lys Ile Met Asp Ala Asp

        100                 105                 110Asp Leu Ser Glu Ile Ala Tyr Met Gly Asn Asp Thr Val Glu Glu Arg

    115                 120                 125Gln Leu Lys Lys Gln Arg Tyr Met Glu Leu Gln Glu Ile Leu Ser Lys

130                 135                 140Ala Phe Thr Glu Asp Lys Glu Glu Phe Ala Lys Thr Asn Met Ser Ser145                 150                 155                 160Ser Cys Ser Ser Thr Ser Lys Gly Val Asp Lys Pro Asn Asn Leu Pro

            165                 170                 175Phe Arg Lys Glx

        180<210>36<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：热扩增引物<400>36catgccatgg aggagctcgt gccggga                             27

Claims (34)

1.一种核酸序列，它编码包括选自下列一组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。

2.如权利要求1的核酸序列，它包括SEQ ID NO：1的核酸序列或其互补体或能在高严格条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列。

3.如权利要求1的核酸序列，它包括SEQ ID NO：5的核酸序列或其互补体或能在高严格条件下与SEQ ID NO：5杂交的序列。

4.如权利要求1的核酸序列，它包括SEQ ID NO：6的核酸序列或其互补体或能在高严格条件下与SEQ ID NO：6杂交的序列。

5.如权利要求1的核酸序列，它被进一步限定为RNA序列。

6.一种分离的DNA分子，它是选自下列一组的核苷酸序列或互补于以下序列：

a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，它编码一种包括SEQ ID NO：4的蛋白；

b)通过遗传密码的简并性而编码由a)的核苷酸序列所编码的蛋白的核苷酸序列；和

c)能在高严格条件下与a)或b)中的任一种杂交的核苷酸序列。

7.一种分离的DNA分子，它是选自下列一组的核苷酸序列或互补于以下序列：

a)SEQ ID NO：5的核苷酸序列，它编码一种包括SEQ ID NO：10的蛋白；

b)通过遗传密码的简并性而编码由a)的核苷酸序列所编码的蛋白的核苷酸序列；和

c)能在高严格条件下与a)或b)中的任一种杂交的核苷酸序列。

8.一种分离的DNA分子，它是选自下列一组的核苷酸序列或互补于以下序列：

a)SEQ ID NO：6的核苷酸序列，它编码一种包括SEQ ID NO：11的蛋白；

b)通过遗传密码的简并性而编码由a)的核苷酸序列所编码的蛋白的核苷酸序列；和

c)能在高严格条件下与a)或b)中的任一种杂交的核苷酸序列。

9.一种DNA序列，它编码包括选自下列一组的至少15个氨基酸的连续氨基酸序列的获得性抗性多肽：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。

10.如权利要求9的DNA序列，它被进一步限定为重组载体。

11.如权利要求10的DNA序列，其中，所述DNA可操作地与一种启动子连接，所述启动子能表达该DNA序列。

12.如权利要求11的DNA序列，其中，所述启动子选自下列一组：FMV 35S启动子、强化FMV启动子、CaMV 35S启动子、ssRUBISCO启动子、EIF-4A启动子、LTP启动子、肌动蛋白启动子、甘蔗badnavirus启动子、hsp90启动子、β葡聚糖酶启动子、脂氧合酶启动子和遍在蛋白启动子。

13.一种含有权利要求9的DNA序列的重组宿主细胞。

14.如权利要求13的重组宿主细胞，它被进一步限定为植物细胞。

15.如权利要求14的植物细胞，它被进一步限定为选自下列一组：苹果、大麦、花茎甘蓝、甘蓝、canola、胡萝卜、柑橘、玉米、棉花、大蒜、燕麦、洋葱、豌豆、花生、辣椒、马铃薯、水稻、黑麦、高粱、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、烟草和小麦。

16.如权利要求13的重组宿主细胞，它被进一步限定为小麦或水稻植物细胞。

17.一种分离的核酸序列，它是选自下列一组的核苷酸序列或者互补于选自下列一组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：5-8中任一个的核苷酸序列；

b)由于遗传密码的简并性而编码由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10-11中任一个里所包含的单一的连续ORF所编码的蛋白的核苷酸序列；和

c)能在高严格条件下与SEQ ID NO：2-3或SEQ ID NO：5-8中任一个杂交的核苷酸序列。

18.一种由权利要求6的DNA序列所编码的分离的获得性抗性多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。

19.一种由权利要求7的DNA序列所编码的分离的获得性抗性多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。

20.一种由权利要求8的DNA序列所编码的分离的获得性抗性多肽，其中，所述多肽包括SEQ ID NO：11所示氨基酸序列。

21.如权利要求18的多肽，其中，所述多肽是从小麦或水稻中分离的。

22.如权利要求19的多肽，其中，所述多肽是从小麦或水稻中分离的。

23.如权利要求20的多肽，其中，所述多肽是从小麦或水稻中分离的。

24.一种转基因植物，在其基因组中整合了编码SEQ ID NO：4所示获得性抗性多肽的转基因。

25.一种转基因植物，在其基因组中整合了编码SEQ ID NO：10所示获得性抗性多肽的转基因。

26.一种转基因植物，在其基因组中整合了编码SEQ ID NO：11所示获得性抗性多肽的转基因。

27.如权利要求24的转基因植物，其中，所述多肽是由SEQ ID NO：1的DNA编码序列所编码的。

28.如权利要求25的转基因植物，其中，所述多肽是由SEQ ID NO：5的DNA编码序列所编码的。

29.如权利要求26的转基因植物，其中，所述多肽是由SEQ ID NO：6的DNA编码序列所编码的。

30.如权利要求24的植物的后代或组织，它含有所述转基因。

31.如权利要求25的植物的后代或组织，它含有所述转基因。

32.如权利要求26的植物的后代或组织，它含有所述转基因。

33.一种控制植物病原体的方法，包括给植物提供一种编码选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中，所述氨基酸序列以足够的数量产生，以便增强该植物的获得性抗性。

34.一种控制植物病原体的方法，包括给植物提供选自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列的获得性抗性多肽，其中，所述多肽以足够的数量产生，以便增强该植物的获得性抗性。

Images