ES2203619T3 - Celulas de hongos modificadas y metodo para producir productos recombinantes. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A CELULAS FUNGALES PERFECCIONADOS Y METODOS PARA OBTENER PRODUCTOS RECOMBINANTES DE CALIDAD PERFECCIONADA Y GRANDES RENDIMIENTOS. MAS ESPECIFICAMENTE, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS FUNGALES QUE TIENEN MODIFICACIONES ESPECIFICAS DENTRO DE SUS SECUENCIAS DEL DNA, Y QUE ORIGINAN LA EXHIBICION EN ELLAS DE, AL MENOS, UNA CAPACIDAD REDUCIDA PARA PROTEINAS HOMOLOGAS Y/O HETEROLOGAS, Y EL USO DE ESTAS CELULAS COMO CELULAS HUESPEDES PARA OBTENER GRANDES RENDIMIENTOS DE PRODUCTOS RECOMBINANTES.

Description

Células de hongos modificadas y método para producir productos recombinantes.

Esta invención se refiere a células de hongos mejoradas y métodos para producir productos recombinantes de calidad mejorada y de altos rendimientos. Más específicamente, la presente invención se refiere a células de hongos que portan modificaciones específicas dentro de sus secuencias de ADN que les causan que exhiban al menos una reducida capacidad para O-glicosilar proteínas homólogas y/o heterólogas, y el uso de estas células como células huéspedes para producir altos rendimientos de productos recombinantes.

El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante ha hecho posible la preparación de productos externos en células huéspedes en las que se han introducido secuencias de ADN exógeno que codifican esos productos. La ventaja de esta tecnología es que pueden prepararse productos con altos rendimientos, en forma muy purificada, sin ningún riesgo de contaminación como la contaminación vírica (SIDA, hepatitis B, etc.). Estas técnicas recombinantes se han usado ampliamente para la preparación de proteínas recombinantes en células huéspedes procarióticas así como eucarióticas. Las células huéspedes procarióticas incluyen E. coli [Nagata et al., Nature 284 (1980), 316; EP 001 929], Bacillus subtilis [Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 2917], Streptomyces, y Corynebacterium (EP 433 117). Las células huéspedes eucarióticas incluyen células vegetales, células animales y células de hongos.

Sin embargo, la preparación a gran escala de productos recombinantes por estas técnicas es todavía limitada, debido a problemas de eficacia de la expresión de estas secuencias de ADN exógeno, debido también a la inestabilidad del vector y a degradación intracelular de los productos recombinantes por la célula huésped en la que se hacen. Considerando la eficacia de la expresión, se han hecho esfuerzos para aislar fuertes promotores, que llevan a niveles de expresión incrementados de secuencias de ADN exógeno y, por tanto, niveles incrementados de preparación de los productos recombinantes. Se han desarrollado varios sistemas para incrementar la estabilidad de los vectores dentro de las células huéspedes, los más frecuentemente usados de los cuales consisten en la inserción en el vector de un gen con resistencia a los antibióticos que permite células huéspedes recombinantes para sobrevivir y crecer en un medio selectivo. Con respecto a la degradación intracelular, se han descrito varias células mutantes que pierden o que tienen una actividad proteasa reducida, limitando de ese modo la capacidad de dichas células para degradar productos recombinantes.

Sin embargo, problemas adicionales limitan todavía la producción a gran escala y el uso farmacéutico de productos recombinantes. Uno de éstos resulta del hecho de que los productos producidos de forma recombinante son a menudo diferentes de sus duplicados naturales. Por ejemplo, las células huéspedes bacterianas no poseen todos los mecanismos postraslacionales requeridos para maduración de polipéptidos de mamíferos. En consecuencia, dichos polipéptidos de mamíferos producidos en bacterias son a menudo inmaduros o no correctamente replegados. Además, las células huéspedes bacterianas introducen, generalmente, una metionina adicional en el extremo N de los productos.

Los productos recombinantes producidos en huéspedes eucarióticos heterólogos se diferencian, también, normalmente, de sus duplicados que aparecen de forma natural en su contenido de glicosilación. Esto puede afectar a la presencia frente a la ausencia de cualquier estructura hidrocarbonada, a la localización de dicha estructura hidrocarbonada en el producto, así como a la naturaleza del hidrocarburo. Más específicamente, se ha demostrado que los productos recombinantes derivados de la levadura, a menudo portan O-glicanos adicionales no naturales comparados con su duplicado natural. Por ejemplo, se ha demostrado que, mientras el factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-I, en inglés)en suero humano no está glicosilado, su forma recombinante producida en S. cerevisiae es O-glicosilada y, más exactamente, O-manosilada [Hard et al., FEBS Letters 248 (1989), 111]. De la misma forma, se ha demostrado que el factor de crecimiento derivado de trombocitos (PDGF, en inglés) humanos y GM-CSF humano presentan estructuras O-manosilo no naturales cuando se producen en S. cerevisiae [Biomedic. Environ. Mass Spectrometry 19 (1990), 665; BIO/TECHNOLOGY 5 (1987), 831]. Esta O-glicosilación anormal es el resultado de importantes diferencias entre los mecanismos de glicosilación de células de mamíferos (humanos) y aquellas de otras células eucarióticas, tales como levaduras. A este respecto, se ha observado que la O-glicosilación en células de hongos (incluidas levaduras y hongos filamentosos) continúa de una manera similar e inusual hasta ahora no observada en ningún otro organismo.

La aparición de esta indeseable O-glicosilación en productos recombinantes derivados de hongos constituye un importante inconveniente para esta tecnología para la preparación de productos farmacéuticos.

La primera razón es que glicanos específicos de hongos pueden introducir nuevos determinantes inmunológicos en una proteína, y una glicoproteína con tales hidrocarburos no naturales puede, por tanto, ser antigénica cuando se administra a seres humanos. A este respecto, se sabe, por ejemplo, que la mayor parte de los seres humanos tienen anticuerpos dirigidos contra cadenas de manosanos de levadura enlazados en N [Feizi y Childs, Biochem. J. 245 (1987), 1].

Otra razón es que las proteínas sin las estructuras hidrocarbonadas apropiadas pueden haber alterado, también, las propiedades farmacocinéticas. Se ha demostrado que las estructuras hidrocarbonadas de las glicoproteínas influyen y participan en definir su velocidad de eliminación in vivo, que es esencial en determinar la eficacia de un producto farmacéutico. Más exactamente, se ha identificado un receptor de manosa en la superficie de células endoteliales de hígado y de macrófagos residentes que aparentemente representa un medio para eliminar glicoproteínas que presentan oligosacáridos de tipo manosa [Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990), 317]. Por tanto, la presencia de estructuras de manosa no naturales adicionales y en una proteína puede incrementar su velocidad de eliminación y disminuir, así, su vida media en el plasma.

Todavía otra razón es que se ha demostrado, también, que la actividad biológica de una glicoproteína varía con el contenido, la posición y la naturaleza de su hidrocarburo. Por ejemplo, se ha demostrado que la glicosilación afecta las propiedades biológicas de la EPO humana recombinante [Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86 (1989), 7819] y de la tPA humana recombinante [Parekh et al., Biochemistry 28 (1989), 7644].

Por las razones mencionadas anteriormente, está claro que la O-glicosilación no natural de productos recombinantes derivados de hongos puede afectar gravemente sus propiedades inmunológicas, biológicas y farmacocinéticas y, por tanto, puede impedir su desarrollo para uso terapéutico en el ser humano.

La presente invención resuelve el problema de O-glicosilación anormal referida anteriormente proporcionando células de hongos modificadas que portan modificación o modificaciones genéticas dentro de sus secuencias de ADN que causan que éstas tengan al menos una capacidad reducida de O-glicosilación de proteínas nativas o externas.

El solicitante ha encontrado que es posible obtener células de hongos modificadas genéticamente con reducida capacidad de O-glicosilación que son todavía viables y muestran buenas características de crecimiento en condiciones de fermentación industriales. Inesperadamente, el solicitante ha demostrado, también, que dichas modificaciones genéticas no afectan a la estabilidad de estas células de hongos cuando se transforman con ADN exógeno. Las células de hongos modificadas de la presente invención pueden ser utilizadas ventajosamente como células huéspedes para la preparación de productos recombinantes de alta calidad, con O-glicanos reducidos o no indeseables.

Un objeto de la presente invención es una célula de hongos que porta modificación o modificaciones genéticas que están situadas en la región codificante o en regiones responsables de o involucradas en la expresión y/o en la regulación transcripcional del gen que codifica una proteína con actividad Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) manosil- transferasa (PMT1) seleccionada del grupo constituido de

(a) moléculas de ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 4A o fragmentos de la misma;

(b) moléculas de ADN que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4B o fragmentos de la misma; o

(c) moléculas de ADN que comprenden la secuencia del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis representado en la Figura 7 o fragmentos del mismo;

que causa o causan que dicha célula tenga al menos una reducida capacidad de O- glicosilación comparada con una célula de hongos que porta la correspondiente molécula de ADN no modificada como se define en (a) a (c).

Objetos adicionales de la presente invención son

la molécula de ADN que comprende un gen que codifica la Dol-P-Man:Proteina (Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de Saccharomyces, teniendo dicho gen la secuencia dada en la Figura 4A;

una molécula de ADN que comprende un gen que codifica la Dol-P-Man:Proteina (Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de Kluyveromyces, conteniendo dicho gen la secuencia del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis dado en la Figura 7; y

una molécula de ADN que comprende un gen que codifica una proteína que exhibe propiedades de la Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa:

(a) que hibrida con la secuencia de ADN como se ha mencionado anteriormente, y/o

(b) representa fragmentos o derivados de la secuencia de ADN como se ha mencionado anteriormente.

La célula de hongos de la presente invención puede escogerse de hongos filamentosos y levaduras por lo que Kluyveromyces y Saccharomyces son géneros de levaduras preferidos. Cepas ejemplares de Kluyveromyces que constituyen realizaciones preferidas de esta invención incluyen K. lactis, K. fragilis, K. waltii, K. drosophilarum y similares. La cepa preferida de Saccharomyces es S. cerevisiae.

En el significado de la presente invención, modificación genética significa, preferiblemente, cualquier supresión, sustitución, deleción o adición de una o más bases o de un fragmento de las secuencias de ADN de células de hongos. Tales modificaciones genéticas pueden ser obtenidas in vitro (directamente sobre ADN aislado) o in situ, por ejemplo por técnicas de ingeniería genética o exponiendo las células de hongos a agentes mutagénicos. Agentes mutagénicos incluyen, por ejemplo, agentes físicos tales como rayos energéticos (rayos X, rayos \mu, UV, etc.) o agentes químicos capaces de reaccionar con diferentes grupos funcionales de ADN, como agentes alquilantes (EMS, NQO, etc.),
agentes bis-alquilantes, agentes de intercalación, etc. También pueden obtenerse modificaciones genéticas por disrupción genética, por ejemplo según el método descrito por Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 194 (1991), 281-301].

Según este método, parte o todo el gen es reemplazado, por recombinación homóloga, por una versión modificada in vitro.

También pueden obtenerse modificaciones genéticas mediante cualquier inserción mutacional en secuencias de ADN, como elementos que pueden experimentar transposición (transposons, en inglés), fagos, etc.

Además, se sabe que ciertas modificaciones tales como las mutaciones puntuales pueden ser invertidas o atenuadas por mecanismos celulares. Tales modificaciones pueden no proporcionar las formas de células de hongos modificadas más útiles de esta invención ya que sus propiedades fenotípicas pueden no ser muy estables. La presente invención proporciona también un procedimiento para preparar células de hongos modificadas en las que las modificaciones (y, por tanto, las propiedades fenotípicas) son estables durante la segregación y/o no inversión y/o no permeación. Tales células de hongos modificadas son particularmente ventajosas como huéspedes para la producción de productos recombinantes.

En consecuencia, una realización preferida de la invención es una célula de hongos que porta una modificación o modificaciones genéticas que son estables durante la segregación y/o no inversión y/o no permeación. Estas modificaciones se obtienen generalmente por deleción o deleciones o disrupción o disrupciones.

La reducida capacidad de las células de hongos de la invención para O-glicosilar proteínas puede resultar, por tanto, de la producción de enzimas inactivas debido a cambios estructurales y/o conformacionales, de la producción de enzimas con propiedades biológicas alteradas, de la ausencia de producción de dichas enzimas, o de la producción de dichas enzimas a bajos niveles.

El camino de la O-glicosilación de células de hongos implica la unión de un primer resto manosilo al grupo hidroxilo de aminoácidos serilo y/o treonilo de proteínas o péptidos y, después, la extensión a di- y oligo-sacáridos O-enlazados por adición posterior de restos manosilo. El primer resto manosilo se transfiere desde dolicol-monofosfasto-manosa (Dol-P-Man) a la proteína en el retículo endoplásmico, y los restos manosilo adicionales se transfieren desde GPD-Man en el Golgi. Por el contrario, las células eucarióticas (no fúngicas) superiores O-glicosilan siguiendo un mecanismo diferente, porque la etapa inicial es la unión covalente de N-acetil-galactosamina a aminoácidos serilo o treonilo, sin que ningún donante oligosacárido acoplado a lípidos esté implicado en esta primera reacción, la etapa inicial se produce en el Golgi, las estructuras de hidrocarburos son diferentes, etc.

En la presente invención, las células de hongos modificadas portan modificación o modificaciones genéticas en un gen cuyo producto de expresión está involucrado en la unión de un resto manosilo al grupo hidroxilo de los aminoácidos serilo o treonilo.

Más específicamente, las células de hongos modificadas portan modificación o modificaciones genéticas en un gen cuyo producto de expresión está involucrado en la transferencia de un resto manosilo desde el precursor Dol-P-Man al grupo hidroxilo de los aminoácidos serilo o treonilo. Por ello, este gen es el gen que codifica la Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa [DPM2 - también designada PMT1] cuya secuencia está representada en la Figura 4A, o que codifica una proteína representada en la Figura 4B o cuya secuencia o fragmentos de la misma está representada o están representados en la Figura 7.

Además de la modificación o de las modificaciones en el gen involucrado en la unión de restos manosilo al grupo hidroxilo de aminoácidos serilo o treonilo como se ha mencionado anteriormente, las células de hongos de la invención pueden portar, también, modificación o modificaciones en los genes involucrados en adiciones posteriores de restos manosilo que llevan a di- u oligosacáridos, o en la síntesis de donantes de restos manosilo (Dol-P-Man).

Ejemplos específicos de tales células de hongos se describen en los ejemplos.

Otro objeto de la invención reside en una célula de hongo como se ha descrito anteriormente en la que se ha introducido una secuencia de ADN exógeno.

En el significado de la presente invención, la expresión secuencia de ADN exógeno incluye cualquier secuencia de ADN que comprende uno o más genes que codifican una proteína deseada para ser expresada y/o secretada en dicha célula. Una secuencia de ADN de este tipo puede ser una secuencia de ADN complementario (cADN), una secuencia artificial de ADN, una secuencia de ADN genómico, una secuencia de ADN híbrido o una secuencia de ADN sintética o semisintética, incluida en una expresión cassete que permite la síntesis en las células de hongos de dichas proteínas. La expresión cassete comprende, preferiblemente, una región de iniciación de transcripción y traducción unida al extremo 5' de la secuencia que codifica dicha proteína o proteínas deseadas para dirigir, y opcionalmente regular, la transcripción y traducción de dicha secuencia. La elección de estas regiones puede variar según la célula de hongo utilizada. Generalmente, estas secuencias se escogen de promotores y o finalizadores derivados de genes de células de hongos, y, cuando se busca la expresión en huéspedes de levadura, de genes de levadura. De especial interés son ciertas regiones de promotores y/o finalizadores derivados de genes glicolíticos de células de hongos tal como, para las levaduras, los genes que codifican la fosfoglicerato-quinasa (PGK, en inglés), gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GDP, en inglés), enolasas (ENO, en inglés) o alcohol-deshidrogenasas (ADH, en inglés), y para los hongos filamentosos, los genes que codifican la triosa-fosfato-isomerasa (tpi, en inglés). Las regiones promotoras y/o finalizadoras pueden derivar, también, de otros genes fuertemente expresados tales como, para las levaduras, el gen lactasa (LCA4, en inglés), el gen ácido-fosfatasa (PH05, en inglés), el gen alcohol-oxidasa (AOX, en inglés) o el gen metanol-oxidasa (MOX, en inglés), y, para hongos filamentosos, el gen celobiohidrolasa (CBHI, en inglés), el gen alcohol-deshidrogenasa (alcA, alcC, en inglés), el gen glucoamilasa (GAM, en inglés), o el gen acetamidasa (amds), y similares. Estas regiones de iniciación de la transcripción y de la traducción pueden ser, además, modificadas, por ejemplo, mediante mutagénesis in vitro, por introducción de elementos de control o secuencias sintéticas adicionales, o mediante deleciones. Por ejemplo, los elementos que regulan la transcripción, tales como los denominados UAS, que se originan de otros promotores pueden ser usados para construir promotores híbridos que permiten la fase de crecimiento del cultivo de células de hongos que han de separarse de la fase de expresión de la proteína o proteínas deseadas que codifican la secuencia o secuencias. También puede ser colocada en el extremo 3' de la secuencia codificante una región de finalización de la transcripción o de la traducción, funcional en la célula de hongos proyectada. Además, en el extremo N de la secuencia de la proteína, puede introducirse un péptido señal (pre-secuencia) para dirigir la proteína naciente al camino secretor de la célula de hongo usada. Esta pre-secuencia puede corresponder a la pre-secuencia natural de la proteína si esta proteína es secretada de forma natural, o puede ser de otro origen, por ejemplo obtenida de otro gen, o incluso artificial.

Preferiblemente, la secuencia del ADN exógeno es parte de un vector, que puede replicarse de forma autónoma en la célula de hongos usada o integrarse en sus propias secuencias de ADN (cromosoma). Los vectores que se replican de forma autónoma pueden contener secuencias que se replican de forma autónoma derivadas del ADN cromosómico de la célula de hongos (ARS) o de plásmidos de célula de hongos que aparecen en la naturaleza tal como pGK1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982), 737], pKD1 (documento EP 241 435), plásmido de 2 \mum (Broach, Cell 28 (1982), 203-204) y similares. Los vectores integradores contienen, normalmente, secuencias homólogas a regiones del cromosoma de la célula de hongos que, después de ser introducidas en dicha célula, permiten la integración por recombinación in vivo. En una realización específica de la invención, dichas secuencias homólogas corresponden a la región del cromosoma que va a ser modificado en la célula de hongos, que permite un mecanismo de modificación-integración en una etapa. La integración puede darse también por recombinación no homóloga.

La secuencia de ADN exógeno puede ser introducida en la célula de hongos por cualquier técnica conocida en la técnica y, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante, cruzamientos genéticos, fusiones de protoplastos, etc. Con relación a las técnicas de ADN recombinante, pueden usarse transformación, electroporación o cualquier otra técnica descrita en la literatura. Más específicamente, cuando la célula de hongos es una célula de levadura, la transformación puede ser realizada según los métodos de Ito et al., [J. Bacteriol. 153 (1983), 163], Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990), 7] o siguiendo el método descrito en el documento EP 361 991. La electroporación puede realizarse según Karube et al. [FEBS Letters 82 (1985), 90].

Las células de hongos de la presente invención pueden utilizarse ventajosamente como células huéspedes para la preparación de productos recombinantes tal como proteínas heterólogas con interés farmacéutico y/o agroalimentario. Las células de hongos de esta invención son particularmente ventajosas ya que permiten la preparación y/o secreción de productos de alta calidad, y ya que sus modificaciones genéticas no afectan a la estabilidad mitótica o genética de dichos vectores de expresión de los productos. Las células de esta invención son más particularmente adecuadas para la producción de proteínas con usos terapéuticos humanos y que son susceptibles de O-glicosilación por la célula huésped.

En consecuencia, un objeto adicional de esta invención radica en un procedimiento para la preparación de productos recombinantes en el que una célula de hongos como la definida anteriormente se cultiva en condiciones en las que se expresa la secuencia de ADN exógeno y el producto se recupera. En una realización preferida, dicho producto es secretado en el medio de cultivo. En otra realización preferida, dicho producto es susceptible de O-glicosilación por la célula huésped.

Las siguientes proteínas se citan como ejemplos de proteínas heterólogas que pueden ser preparadas con las células de hongos de la presente invención: enzimas (tales como superóxido-dismutasa, catalasa, amilasas, lipasas, amidasas, quimosina, etc., o cualquier fragmento o derivado de las mismas), hemoderivados (tal como seroalbúmina humana, alfa- o betaglobina, factor VIII, factor IX, factor de van Willebrand, fibronectina, alfa-1 antitripsina, etc., o cualquier fragmento o derivado de los mismos], insulina y sus variantes, linfoquinas [tales como interleuquinas, interferones, factores de estimulación de colonias (G-CSF, GM-CSF, M-CSF...), TNF, TRF, etc., o cualquier fragmento o derivado de los mismos], factores del crecimiento (tales como hormona del crecimiento, eritropoyetina, FGF, EGF, PDGF, TGF, etc., o cualquier fragmento o derivado de los mismos), apolipoproteínas, polipéptidos antigénicos para la preparación de vacunas (hepatitis, citomegalovirus, Eppstein-Barr, herpes, etc.), o cualquier polipéptido de fusión tal como, por ejemplo, fusiones que comprenden un resto activo ligado a un resto estabilizante.

Otro objeto de la invención radica en un fragmento de ADN que codifica una enzima involucrada en la unión de restos de manosilo al grupo hidroxilo de aminoácidos serilo o treonilo de proteínas. El solicitante ha proporcionado fragmentos de ADN que codifican por primera vez tales enzimas. Más específicamente, dicho fragmento de ADN comprende el gen Dol-P-Man:Proteína (Ser/Htr) manosil-transferasa cuya secuencia se representa en la Figura 4A, que codifica una proteína representada en la Figura 4B o cuya secuencia se representa en la Figura 7, o fragmentos de la misma.

En el significado de la presente invención, gen homólogo significa cualquier otro gen de cualquier célula de hongos que codifica una enzima con la actividad requerida. Dichos otros genes pueden obtenerse, por ejemplo, por complementación de una célula de hongos mutante, deficitaria en dicha actividad, con ADN preparado a partir de una célula de hongos capaz de dicha actividad, selección de los transformantes con la actividad recuperada, y aislar su secuencia de ADN insertada. Estos otros genes pueden, también, ser aislados de librerías de ADN por hibridación con sonda o sondas (incluidos cebadores con PCR) que comprenden toda o parte de la secuencia presentada en la Figura 4. A este respecto, es también un objeto de esta invención usar los fragmentos de ADN proporcionados, o cualquier parte de los mismos, como sonda o sondas de hibridación o para la complementación de fenotipos mutantes, para la obtención de genes homólogos de células de hongos.

El término derivado significa cualquier otro fragmento de ADN preparado por cualquier modificación o modificaciones genéticas y/o químicas de los genes mencionados anteriormente. Dicha modificación o modificaciones genéticas y/o químicas pueden ser cualquier supresión, sustitución, deleción o adición de una o más bases o de una región de dichos genes, que conducen o a una incrementada actividad de la enzima o al mismo nivel de actividad o a una actividad de la enzima disminuida o nula después de transformación en una célula huésped de hongos.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Mapa de restricción de plásmidos pDM3, pMT4 y pMT1.

Figura 2: Subclonación del plásmido pDM3.

Figura 3: Estrategia de secuenciación del gen PMT1.

Figura 4a: Secuencia de nucleótidos del gen PMT1 (ID. SEC. nº 1).

Figura 4b: Secuencia de aminoácidos del gen PMT1 (ID. SEC. nº 2)

Figura 5: Estructura y mapa de restricción de pMT1.1/URA3.

Figura 6: Actividad de O-glicosilación de S. cervisiae WT (panel A) y MT (panel B).

Figura 7: Secuencia parcial de nucleótidos del gen PMT1 de K. lactis (ID. SEC. nº 3).

Figura 8: Comparación de secuencias de nucleótidos (Panel A) y de aminoácidos previstos (Panel B) entre el gen PMT1 de S. cerevisiae (secuencias superiores) y el homólogo de K. lactis (secuencias inferiores) aislados por multiplicación con PCR del ADN genómico de K. lactis. Los puntos representan identidad de secuencia, los signos de interrogación indican ambigüedad de secuencia. La secuencia de nucleótidos complementaria al cebador Sq3910 está subrayada.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de manosiltransferasa muy purificada a partir de S. cerevisiae y generación de péptidos

La actividad manosiltransferasa se solubilizó de membranas totales de levadura y se purificó en hidroxilapatito según Strahl-Bolsinger y Tanner (Eur. J. Biochem. 196 (1991), 185). La proteína tenía que ser entonces enriquecida, además, por precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} antes de que se realizara la purificación adicional mediante cromatografía de afinidad. El material eluido se separó luego en SDS/PAGE. La banda de 92 kDa resultante se cortó del gel. La digestión con tripsina (en el gel) produjo varios péptidos no solapantes, permitiendo el diseño de sondas.

E.1.1. Precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4}

100 ml de fracciones de la columna de hidroxilapatito conteniendo actividad manosiltransferasa se mezclaron con (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una concentración final del 30% (peso/volumen) y se agitaron suavemente durante 1 h en un baño de hielo/sal. La mezcla se centrifugó durante 30 minutos (a 8.000 x g). El gránulo resultante se resuspendió en 8 ml de tampón-AB (Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, glicerol al 15% (% en vol), lubrol al 0,1% (% en vol), NaCl 150 mM) y se dializó durante 1 h contra el mismo tampón. Almacenamiento: -20ºC.

E.1.2. Cromatografía de afinidad E.1.2.1. Preparación de la columna de cromatografía de afinidad

0,5 g de polvo liofilizado de Proteína A-Sefarosa Cl 4B se hincharon en 10 ml de NaPi 100 mM, pH 7,0, durante 15 minutos y se lavaron en un filtro de vidrio sinterizado (G3) con 200 ml del mismo tampón. La proteína A-Sefarosa Cl 4B se equilibró en NaPi 100 mM, pH 7,0. Aproximadamente 3 a 6 ml de suero anti-manosiltransferasa se dializaron durante 2 h frente a 1 l de NaPi (100 mM), pH 7,0. El suero dializado se incubó con el material de la columna durante 16 h a 4ºC. El suero se retiró usando un filtro de vidrio sinterizado (G3). El material de la columna se lavó dos veces con 10 ml de NaPi 100 mM, pH 8,5, y se resuspendió en 50 ml del mismo tampón.

Para acoplamiento covalente, se añadieron 0,75 mg/ml de dimetilsuberimidato. El pH se ajustó a pH 8,5 añadiendo 5-6 gotas de NaOH 1 M. El material se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Por una segunda vez, se añadió dimetilsuberimidato y el pH se ajustó a pH 8,5 con NaOH 1M. El material de la columna se lavó consecutivamente sobre un filtro de vidrio sinterizado (G3) con:

a) 50 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0

b) 25 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0, rodanina amónica 3 M

c) 100 ml de NaPi 100 mM, pH 8,0

El material se lavó y se equilibró en tampón-AB.

E.1.2.2. Purificación de la proteína de 92 kDa

8 ml de la proteína precipitada con (NH_{4})_{2}SO_{4} y dializada (E.1.1) se incubaron con el material de la columna de afinidad (E.1.2.1.) durante 16 h a 4ºC con suave agitación. Una columna (2 cm x 0,5 cm) se rellenó y se lavó con 15 ml de tampón- AB. La columna se eluyó con glicina/HCl 100 mM, pH 3,0, lubrol al 0,05% (% en vol.), glicerol al 15% (% en vol.). Se recogieron fracciones de 0,9 ml y se neutralizaron inmediatamente con Tris 1M (15 \mul/ fracción de 0,9 ml).

Para detectar la proteína de 92 kDa, 40 \mul de cada fracción eluida se analizaron por SDS/PAGE y análisis por transferencia Western como se ha descrito (Strahl-Bolsinger y Tanner, 1991). Las fracciones que contienen proteína de 92 kDa (fracciones 2-6) se reunieron y se concentraron hasta 100 \mul mediante microconcentradores (Centricon/Amicon) por centrifugación a 5.000 x g. Se añadieron 0,9 ml de EtOH al 98% y la proteína se precipitó durante 16 h a -20ºC. La proteína precipitada se granuló por centrifugación durante 30 minutos a 10.000 x g.

E.1.3. SDS-PAGE

La proteína precipitada (E.1.2.2.) se resuspendió en 150 \mul de tampón SDS-muestra (Na_{2}CO_{3} 0,07 M, \beta-EtSH al 0,07%, SDS al 2%, sacarosa al 12%, azul de bromofenol al 0,07%). La electroforesis en SDS-gel según Lämli y Favre [J. Mol. Biol. 80 (1973), 575] se llevó a cabo a 50-70 V usando la celda BIORAD-Mini-Protean. Proteínas estándares: Estándares de alto peso molecular (HMW, en inglés)/Gibco BRL.

La proteína se detectó por coloreado con Coomassie R250 al 0,05% (peso/volumen), isopropanol al 25% (% en volumen), ácido acético al 10% (% en volumen), y decolorando en ácido acético al 7,5% (% en volumen).

E.1.4. Digestión con tripsina y diseño de oligonucleótidos

Después de la SDS-PAGE (E.1.3.), se recortó la banda de la proteína de 92 kDa (aproximadamente 10 \mug de proteína). El fragmento de gel se cortó en pequeñas piezas y se agitó tres veces durante 30 minutos en 5 ml de metanol al 50%/ácido acético al 10% y una vez durante 30 minutos en 5 ml de metanol al 50%. El gel se liofilizó durante 3 h. La digestión con tripsina se llevó a cabo en 0,3 ml de carbonato de amonio e hidrógeno 0,2 M/2 \mug de tripsina durante 16 h a 37ºC. El sobrenadante se separó. La elución de los péptidos se hizo tres veces durante 1 h a 37ºC en 0,2 ml de carbonato de amonio e hidrógeno 0,2 M y una vez durante 1 h a 37ºC en 0,2 ml de carbonato de amonio e hidrógeno 0,2 M/acetonitrilo al 30%. El material eluido se reunió, se liofilizó y se resolvió en 0,2 ml de hidrocloruro de guanidino 1 M/Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Los péptidos se separaron usando una columna RP18 de fase inversa equilibrada en TFA al 0,13%. Los péptidos se eluyeron mediante acetonitrilo (0-70%). Pudieron detectarse hasta 40 picos de péptidos diferentes. Cinco de los picos principales se secuenciaron via análisis secuencial automatizado según Edman (G. Allen en: Sequencing of proteins and peptides, Laboratory Techniques en Biochem. and Mol. Biol. 9, redactores: Burdon, R.H. y Knippenberg, P.H.; Elsevier (1989)). Entre las secuencias obtenidas de ese modo, tres fueron adecuadas para el diseño de oligonucleótidos, que se presentan en la Tabla 1, siguiente.

TABLA 1

Pico	Secuencia peptídica
15	I S Y K P A S F I S K
23	E V S P Y G Y S G F D G D A
34	N L V E P H V Y E S

Sobre la base de estas secuencias, se sintetizaron químicamente los oligonucleótidos A-C, usando el empleo del codón de S. cerevisiae (Guthrie y Abelson en: The molecular biology of the yeast Saccharomyces; redactores: J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (1982)). Los oligonucleótidos A-C tienen las siguientes características:

Oligonucleótido A

Pico: 23

Secuencia de aminoácidos: G F D G D A

Oligodesoxinucleótido: 5'-G^{T}/_{C}GTCACCGTCGAANCC-3'

Degenerado 8 veces, trenza codificante, 17 nucleótidos

Oligonucleótido B

Pico: 34

Secuencia de aminoácidos: E P H V Y E

Secuencia de ADN: 5'- ^{C}/_{T}TCGTAGAC^{G}/_{A}TG^{A}/_{T}GG^{T}/_{C}TC-3'

Degenerado 16 veces, trenza codificante, 18 nucleótidos

Oligonucleótido C

Pico: 15

Secuencia de aminoácidos: I S Y K P A S F I S K

Secuencia de aminoácidos: 5'- ATTTC^{T}/_{A}TA^{T}/_{C}AA^{A}/_{G}CC^{A}/_{T} GCTTC^{T}/_{A}

TT^{T}/_{A}AAA-3'

Degenerado 128 veces, trenza codificante, 33 nucleótidos

Ejemplo 2 Examen de una librería de plásmidos de ADN genómico de levadura

Los oligodesoxinucleótidos A-C (E.1.4.) sintetizados químicamente se usaron para examinar la librería de plásmidos del pCS19 del ADN genómico de levadura (Sengstag y Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 233). Esta librería se preparó mediante digestión parcial de ADN genómico de levadura con Sau3A, y la clonación en el punto de restricción Bc1I del pCS19 vector.

E.2.1. Marcado de Oligodesoxinucleótidos

Los oligonucleótidos A-C se marcaron por reacción quinasa, llevada a cabo según Maniatis et al. (T. Maniatis, J. Sambrook, E.F. Fritsch (1989), Molecular cloning: A Laboratory manual, C.S.H. Press). 40 pmol de Oligodesoxinucleótidos se marcaron usando 50 \muCi [\gamma-^{32}P]-ATP. Nucleótidos exentos de radioactividad se retiraron usando "columnas NUC de empuje con trampa" (Stratagene) según el manual de instrucción del fabricante.

E.2.2. Examen de la librería

La librería de ADN (4.992 diferentes colonias sencillas) se transfirió de microplacas de titulación a nitrocelulosa. La hibridación de la colonia se realizó según Grunstein y Hogness (PNAS 72 (1975), 3961) en las siguientes condiciones:

- Prehibridación: Los filtros se incubaron a 44ºC en 200 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, durante al menos 4 h (5 x Denhardt: ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, BSA al 0,1%; 6 x NET: NaCl 0,9 M, Tris-HCl 90 mM, pH 8,3, AEDT 6 mM, pH 8,0).

- Hibridación: Los filtros se incubaron a 44ºC en 100 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, oligodesoxinucleótidos A y C marcados (40 pmol cada uno). La hibridación se realizó durante 16 h.

- Condiciones de lavado: Los filtros se lavaron tres veces en 50 ml 6 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen) a 0ºC durante 15 minutos.

Para detectar colonias positivas, los filtros se expusieron a películas de rayos X durante 16 h, -70ºC. En estas condiciones, se pudieron identificar 12 clones que reaccionan positivamente.

Ejemplo 3 Análisis Southern de los 12 clones positivos

Los 12 clones positivos se analizaron por transferencia Southern usando tres diferentes oligodesoxinucleótidos. Este análisis condujo a la identificación de un clon positivo que reacciona con todos los tres oligonucleótidos. Este clon se denominó pDM3.

Los 12 clones positivos se desarrollaron en 5 ml de medio LB suplementado con ampicilina y su ADN se aisló según el método de Birnbaum y Doly (Nucl. Acid. Res. 7 (1979), 1513).

1/10 de cada ADN plásmido aislado (plásmidos: pDM1-pDM12) se digirieron con enzimas de restricción EcoRI-XhoI (cada una 5 U), 1 x tampón "uno para todos" (Pharmacia) en un volumen total de 20 \mul durante 1 h a 37ºC. Los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a nitrocelulosa según Maniatis et al. (citado anteriormente). El análisis Southern se realizó usando oligos A y B usando las mismas condiciones descritas por el examen de la librería. La temperatura de hibridación para oligo A fue de 48ºC, para oligo B de 42ºC. Los clones 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 11 reaccionaron positivamente con ambos oligodesoxinucleótidos. Estos siete clones se analizaron además por análisis por transferencia Southern. Tres manchas idénticas se prepararon por consiguiente, en las que el ADN de los clones 1, 2, 3, 5, 6, 7 y 11 se digirió con EcoRI-XhoI y se transfirió a nitrocelulosa como se ha descrito. Las manchas 1, 2 y 3 se prehibridaron en 20 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón a 50ºC durante 4 h. Cada mancha se hibridó luego en 10 ml de 5 x Denhardt, 6 x NET, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 40 pmol de oligonucleótidos marcados durante 16 h. La temperatura de hibridación se indica en la Tabla 2, a continuación. El lavado se realizó durante 10 minutos a cada temperatura en 50 ml 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen).

TABLA 2

Mancha	Hibridación con oligo	Temperatura de hibridación	Condiciones de lavado	Clones con
				reacción positiva
Mancha 1	A	25	2x10 min/25ºC	1, 2, 3, 5, 6, 7, 11
			1x10 min/35ºC
Mancha 2	B	25	2x10 min/25ºC	3, 5
			1x10 min/35ºC
Mancha 3	C	45	2x10 min/45ºC	3
			1x10 min/55ºC

El clon 3 era el único clon que reacciona con oligo A, B y C. El clon se denominó pDM3 y se analizó posteriormente.

Ejemplo 4 Análisis del pDM3 E.4.1. Métodos E.4.1.1. Digestión con endonucleasas de restricción

La digestión analítica con endonucleasas se realizó en 1 x tampón "uno para todos" ("one for all", en inglés) (Pharmacia), 0,2-0,5 \mug de ADN, 1-5 U de enzima de restricción en un volumen total de 20 \mul durante 1 h a 37ºC.

La digestión preparativa se realizó en un volumen total de 40-80 \mul con 1-10 \mug de ADN, 5-20 \mul de enzima de restricción, 1 x tampón "uno para todos" durante 2 h a 37ºC.

E.4.1.2. Electroforesis de ADN en gel

La separación de fragmentos de ADN se realizó según Maniatis et al. (citado anteriormente).

E.4.1.3. Aislamiento de fragmentos de ADN

Después de la separación, los fragmentos de ADN se aislaron usando el "Estuche Geneclean" (Stratagene) según el manual de instrucción del fabricante.

E.4.1.4. Tratamiento con fosfatasa alcalina

Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con fosfatasa alcalina según Maniatis et al. (citado anteriormente).

E.4.1.5. Ligadura

Los fragmentos de ADN se ligaron en 1 x T4-tampón de ligadura (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, ATP 1 mM) con 1 U de T4-ADN ligasa (volumen total 10-15 \mul). La relación molar de ADN del vector: el inserto era 1:4 o 1:8. La cantidad absoluta de ADN era 20-50 ng. Tiempo de incubación: 16 h a 14ºC o 5 h a 25ºC.

E.4.1.6. Transformación de E. coli

Se prepararon células competentes DH5\alpha\ de E. coli según Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557). La transformación se realizó como se describe por Maniatis et al. (citado anteriormente).

E.4.1.7. Preparación de ADN

El ADN plásmido se preparó según Birnbaum y Doly (citado anteriormente).

E.4.1.8. Análisis por transferencia Southern

El análisis por transferencia Southern se realizó usando las mismas condiciones descritas en E.3.

E.4.1.9. Análisis de la secuencia de ADN

La secuenciación del ADN se hizo según el método de Sanger et al. ( PNAS 74 (1977), 5463). Sólo se secuenció ADN plásmido. Se usó el estuche de secuenciación de T4-ADN Polimerasa (Pharmacia); el nucleótido radiactivo era [\alpha-^{35}S]-dATP (actividad específica de 600 Ci/mmol).

E.4.2. Identificación del ORF

Este ejemplo describe un análisis de restricción de pDM3, la identificación de diferentes fragmentos de ADN reconocidos por oligonucleótidos A, B o C y su subclonación. La secuenciación de estos subclones permitió la identificación de un ORF.

E.4.2.1. Subclonación de fragmentos de ADN pDM3 que hibridan con oligos A, B o C.

El ADN pDM3 se digirió con EcoRI, XhoI y EcoRI-XhoI. El análisis por transferencia Southern se realizó usando oligos A, B o C como diana.

El oligo A reconoce un fragmento EcoRI de 3,0 kb, los oligos B y C reconocen un fragmento EcoRI-XhoI de 1,1 kb. El fragmento EcoRI de 3,0 kb se subclonó en pUC19 (se linealizó con EcoRI y se desfosforiló). El fragmento EcoRI-XhoI de 1,1 kb se subclonó en pUC18 (se linealizó con EcoRI-Sa1I, y se desfosforiló). Subclones correctos se identificaron mediante análisis de restricción y análisis por transferencia Southern usando oligos A o B/C, respectivamente.

El subclon EcoRI de 3,0 kb se denominó pMT4, el subclon EcoRI-XhoI de 1,1 kb se denominó pMT1. El adicional análisis por restricción de pMT4 y pMT1 se realizó usando diversas endonucleasas de restricción diferentes (por ejemplo: PstI, HindIII y Bg1II). El análisis por transferencia Southern que usa oligos A o B/C se llevó a cabo para definir la región exacta de un posible ORF.

Mapas de restricción de pDM3, pMT4 y pMT1 se muestran en la Figura 1.

E.4.2.2. Análisis de secuencias

Desde ambos extremos, los insertos ADN de plásmidos pMT4 y pMT1 se secuenciaron usando cebadores universal e inverso, cebando cerca del polienlazador de pUC19/pUC18. También, como cebadores de secuenciación se usaron los oligos A, B y C. Los datos de secuenciación dieron como resultado un ORF de aproximadamente 400 pb en ambos lados del inserto de pMT1. También, pMT4 mostró un ORF de aproximadamente 200 pb cuando se secuenciaron con el cebador inverso. Usando estos datos de secuenciación, puede deducirse una secuencia de aminoácidos. Esta secuencia de AA mostró secuencias de péptidos conocidos del análisis de péptidos de la proteína de 92 kDa (se encontraron péptidos correspondientes a los picos 15, 23 y 34). Según estos datos, podía predecirse la orientación 5'/3' del gen.

Otros varios subclones se estructuraron y secuenciaron usando los cebadores universal e inverso de pUC18/19 (Figura 2).

Para la secuenciación se usaron también los siguientes oligodesoxinucleótidos:

Oligo	Secuencia (5'-3')	vector secuenciado
Oligo 6	CCAACCAGACAACCACTGGG	pMT1
	2713
Oligo 7	GACAGGCCACTAACAGCTTC	pMT4
	697
Oligo 8	GATGTTGTATGCTGGTGTG	pMT4
	840
Oligo 9	CATTGAGCGAGTTGGCAGGG	pMT4
	1178
Oligo 4	GAACCTCATGTTTATGAA	pMT1
	2189

Estos oligodesoxinucleótidos representan partes de fragmentos de ADN nuevamente secuenciados.

Para secuenciar la región 5' del gen, se hicieron deleciones con exoIII/judía mung del pMT4 vector. El pMT4 se linealizó usando SphI (solapamiento 3'). El plásmido se cortó después usando BamHI (solapamiento 5').

La deleción con exonucleasa III se realizó según Roberts y Lauer (Meth. Enzymol. 68 (1979), 473), Henikoff (Meth. Enzymol. 155 (1987), 156).

Los extremos superpuestos se retiraron mediante nucleasa de judía mung. Los plásmidos resultantes se analizaron por análisis de restricción usando HindIII y EcoRI.

El análisis de la secuencia de los clones se llevó a cabo usando el cebador inverso de pUC19. La estrategia de la secuencia se muestra en la Figura 3. Los datos de la secuencia se dan en la Figura 4.

Ejemplo 5 Análisis por transferencia Northern. Identificación del mARN que codifica la manosiltransferasa E.5.1. Métodos E.5.1.1. Aislamiento de ARN

El ARN total se aisló de la cepa SEY2101 de levadura (Mat. a, ade2-1, leu2-3, 112, ura3-52 (Emr et al. PNAS 80 (1983), 7080) según Domdey et al. (Cell 39 (1984), 611).

E.5.1.2. Transferencia Northern

El ARN total se separó usando un gel de agarosa formaldehído y se transfirió a nitrocelulosa como se describe por Maniatis et al. (citado anteriormente).

E.5.1.3. El ADN diana

El inserto de 1,1 kb de pMT1 se aisló por digestión con EcoRI-PstI. El fragmento se purificó usando el "Estuche Gene-clean" (Stratagene).

200 ng del fragmento de ADN se marcaron con [\alpha-^{32}P]-dCTP (50 \muCi) usando el juego de marcado "megaprime" (Amersham) según el manual de instrucciones del fabricante.

E.5.2. Resultados

El filtro de nitrocelulosa se prehibridó durante 2 h a 42ºC en 20 ml de 5 x Denhardt, 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen), formamida al 50% (vol/vol), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16 h en 10 ml de 1 x Denhardt, 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen), formamida al 50% (vol/vol), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 200 \mug de fragmento EcoRI-PstI de 1,1 kb de pMT1 marcado con [\alpha\-^{32}P]-dCTP. El lavado se hizo dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 50ºC en 50 ml de 0,1 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen). La hibridación de la diana se detectó por exposición a película de rayos X (- 70ºC, 16 h). Se detectó un único mARN (ARN mensajero) con el tamaño de 3 kb.

Este procedimiento puede repetirse fácilmente por la persona experta en la técnica con otras sondas derivadas de la secuencia de la Figura 4 y con el ARN de otras fuentes (otras células de hongos).

Ejemplo 6 Preparación de una célula de S. cerevisiae deficiente en actividad de O-glicosilación

Una célula de S. cerevisiae deficiente en actividad de O-glicosilación se preparó por disrupción del gen, por inserción del gen URA3 en el lugar de restricción HindIII del ORF identificado, en 1595 pb de la secuencia de codificación.

E.6.1.Estructura del plásmido usado para la disrupción del gen

El inserto de pMT1 de 1,1 kb se aisló como fragmento EcoRI-PstI y se subclonó en un vector pUC18 (se linealizó con EcoRI/PstI y se desfosforiló, sin sitio de restricción HindIII en el polienlazador). El vector resultante se denominó pMT1.1.

El pMT1.1. se linealizó con HindIII y se desfosforiló. El fragmento HindIII de 1.1 kb de YEp24 (Julius et al., Cell 37 (1984), 1075) que contiene el gen URA3 de S. cerevisiae se aisló y se subclonó en el pMT1.1. vector linealizado con HindIII y desfosforilado. Los clones se identificaron por análisis de restricción y se denominaron pMT1.1/URA3 (Figura 5).

El pMT1.1/URA3 tiene una secuencia codificante de PMT1 de 0,24 kb flanqueando un lado del gen URA3 y una secuencia codificante de PMT1 de 0,86 kb flanqueando el otro. El CsCl-ADN de pMT1.1/URA3 se preparó según Maniatis et al. (citado anteriormente).

E.6.2. Transformación de la levadura

40 \mug de CsCl-ADN pMT1.1/URA3 se digirieron con SphI/EcoRI. Para comprobar que la digestión era completa, parte del ADN digerido se analizó sobre un gel de agarosa ADN. El digesto se trató, después, con fenol y el ADN se precipitó con EtOH al 98% (Maniatis et al., citado anteriormente). El ADN se resolvió en 10 \mul de TE, pH 8,0.

Las cepas SEY2101/2102 de S. cerevisiae (Mat a/\alpha\, ura3-52, leu2-3, 112 (Emr et al., citado anteriormente) y SEY2101 (Mat a, ura3-52, leu2-3, 112, ade2-1) se transformaron con 5 \mul de pMT1.1/URA3 vector se digirió con EcoRI/SphI según el método de Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983), 163).

Los transformantes SEY2101/2102 se seleccionaron en medio mínimo + Leu; los transformantes SEY2101 se seleccionaron en medio mínimo + Leu + Ade.

Después de 3-4 días a 30ºC, los transformantes pueden ser recogidos y puestos en placas en el mismo medio por una segunda vez.

E.6.3. Transferencia Southern genómica de los transformantes

El ADN genómico de tres transformantes haploides y células de tipo salvaje se aisló como se describe por Hoffmann y Winston (Gene, 57 (1987), 267). 1\mug del ADN genómico se digirió con XhoI/EcoRI, se separó en un gel de agarosa y se transfirió a nitrocelulosa como se describe por Maniatis et al. (citado anteriormente).

El transferido se prehibridó en 20 ml de 5 x Denhardt's, 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, formamida al 50% (peso/volumen) durante 4 h a 42ºC.

La hibridación se permitió en 10 ml de la misma solución añadiendo 200 ng de fragmento EcoRI/PstI de pMT1.1 de 1.1 kb marcado con [\alpha\-^{32}P]-dCTP (véase E.5.1.3) durante 16 h a 42ºC. El lavado se hizo dos veces a temperatura ambiente en 50 ml de 2 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen) y dos veces a 68ºC en 50 ml de 1 x SSC, SDS al 0,1% (peso/volumen). La detección de la señal por películas de rayos X. Las células de tipo salvaje mostraron una única señal a 1.1 kb, reflejando el fragmento EcoRI/XhoI sin inserción de URA3. En las cepas fragmentadas no aparecía esta señal. En lugar de ésta, se reconoció un nuevo fragmento de 2.2 kb por la diana de 1.1 kb, que representa el fragmento EcoRI/XhoI de 1.1 kb que transporta la inserción de URA3 de 1.1 kb.

Ejemplo 7 Caracterización del mutante E.7.1. Crecimiento

Las células de tipo salvaje SEY2101 se desarrollaron o sobre YPD (extracto de levadura 10 g/l; peptona10 g/l; dextrosa 20 g/l) o en medio mínimo + Ade, + Leu, + Ura. Las células mutantes PMT1::URA3 SEY2101 se desarrollaron o en YPD o en medio mínimo + Ade, + Leu. Las células se desarrollaron a 30ºC en un agitador al baño María. La OD578 se midió cada 30 minutos después de someter las células a ultrasonidos. Las células de tipo salvaje y las mutantes muestran casi idéntico crecimiento en ambos medios aunque, en algunos casos, las células mutantes pueden pegarse. Sin embargo, tales células pueden separarse fácilmente por tratamiento con ultrasonidos (someter durante 30 segundos a ultrasonidos en baño de agua). Las características de crecimiento de estas células se listan a continuación:

Tiempo de generación:

- WT (de tipo salvaje): 99 min

- MT (de tipo mutante): 93 min

Número de células:

- WT: 1 OD = 1,9 x 10^{7}

- MT: 1 OD = 1,9 x 10^{7}

Velocidad de duplicación:

- WT: 0,61/h

- MT: 0,65/h

En un cultivo de crecimiento en forma logarítmica, el 54,7% de las células de tipo salvaje y el 56% de las células mutantes muestran brotes. Después de crecer durante 24 h en YPD, las células de tipo salvaje alcanzaron una OD578 de 11,4 y las células mutantes de 12,3.

E.7.2. Actividad de la manosiltransferasa in vitro y transferencia Western E.7.2.1. Preparación de membranas en bruto

La SEY2101 se desarrolló en 100 ml de medio mínimo + Ade + Leu + Ura para OD578 = 0,5. La PMT1::URA3 SEY2101 se desarrolló en 100 ml de medio mínimo + Ade, Leu para OD578 = 0,5.

Se llevaron a cabo dos preparados de cada cepa. El trabajo se realizó en hielo; todos los tampones estaban a 4ºC. 40 OD de células se granularon y lavaron en 25 ml de TMA (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 7,5 mM). Las células se resuspendieron en 100 \mul de TMA y se transfirieron a un tubo violax, se añadieron 0,3 g de perlas de vidrio y las células se rompieron en un vórtex atro veces durante 30 minutos (enfriando con hielo entre intervalos de ruptura). El extracto se separó de las perlas de vidrio usando una pipeta Pasteur. Las perlas de vidrio se lavaron tres veces con 250 \mul de TMA. Todas las soluciones de lavado se reunieron en una copa Eppendorf. La solución se centrifugó urante 15 segundos (10.000 x g). El sobrenadante se retiró y el gránulo se resuspendió en 40 \mul de TMA (1 OD = 1 \mul)

E.7.2.2. Ensayo de la manosiltransferasa (in vitro)

Se ensayó la actividad de la enzima para 1 y 5 \mul de las membranas en bruto (E.7.2.1.) como se describe por Strahl-Bolsinger y Tanner (citado anteriormente). Se midieron dos muestras paralelas de células de tipo salvaje y mutantes. Se muestran los valores medios de estas dos medidas independientes.

	\mul de membranas	cpm/incubación^{1)}
WT	1	2786
WT	5	10289
MT	1	563
MT	5	1135
^{1)} Los valores de control (sin péptido) fueron 506 y 1031, respectivamente.

En contraste con las células de tipo salvaje, las células mutantes no muestran actividad manosiltransferasa in vitro.

E.7.2.3. Análisis por transferencia Western

Las membranas (1 \mul de E.7.2.1) se incubaron en 20 \mul de tampón SDS-muestra durante 1 h a temperatura ambiente. Después, la SDS/PAGE y la transferencia Western se realizaron como se describe por Strahl-Bolsinger y Tanner (citados anteriormente). Para la detección de anticuerpos, se usó el estuche ECL peroxidasa (Amersham) según el manual de instrucciones del fabricante. Los anticuerpos frente a la proteína de 92 kDa reaccionan específicamente con una proteína de 92 kDa de membranas de tipo salvaje. En las membranas mutantes, esta señal de 92 kDa no aparece.

E.7.3. O-glicosilación in vivo

Para investigar glicosilación in vivo, se dejaron crecer células de tipo salvaje y mutantes en presencia de [^{3}H]-manosa. Después de que una pared celular en bruto mas membrana se aislaron y se O-glicosilaron, el material se liberó por \beta-eliminación.

E.7.3.1. Tratamiento con [^{3}H]-manosa

Células de tipo salvaje y mutantes se dejaron crecer durante la noche en medio mínimo que contenía sacarosa como única fuente de C. Un OD 7,5 del cultivo (OD578 = 1-2) se granuló y se lavó con 5 ml de H_{2}O (precalentada a 30ºC). Las células se dejaron crecer en 5 ml de YP/sacarosa al 0,5%/250 \muCi de [^{3}H]-manosa en un agitador al baño María durante 2 h a 30ºC.

E.7.3.2. Aislamiento de la pared celular en bruto y de la fracción membrana

Un OD 5 de las células tratadas con [^{3}H]-manosa se centrifugaron y se lavaron tres veces con 1 ml de TMA. Las células se resuspendieron en 200 \mul de TMA y se rompieron con perlas de vidrio como se describe en E.7.2.1. (10 \mul de muestra se usaron para el recuento de la radioactividad correspondiente a la incorporación total). El extracto se centrifugó luego durante 15 minutos (10.000 x g) y el sobrenadante se retiró (100 \mul de muestra se usaron para el recuento de la radioactividad correspondiente al material soluble).

E.7.3.3.\beta-eliminación

El gránulo se resuspendió en 1 ml de NaOH 0,1 N (una muestra de 10 \mul se usó para el recuento de la radioactividad correspondiente al material antes de la \beta-eliminación). La incubación se mantuvo durante 24 h a 30ºC.

E.7.3.4. Análisis de material \beta-eliminado

El material \beta-eliminado se desalinizó mediante una columna Dowex 50WS8/H^{+} (0,5 cm x 6 cm). La columna se saturó con manosa 0,5 M y se equilibró en agua. La muestra con \beta-eliminación se cargó en la columna y se lavó interiormente con 1,5 \mul de H_{2}O. El flujo a su través se recogió (se usó una muestra de 100 \mul para el recuento de la radioactividad correspondiente al material \beta-eliminado) y se concentró hasta 10 \mul en el speed-vac. Se realizó cromatografía de capa fina sobre Silicagel 60 (Merck) en acetona:butanol:agua 75:15:15. Patrones: manosa, sacarosa, estaquiosa y rafinosa. La prueba cromatográfica se repitió una vez. Los azúcares se detectaron con 0,5 g de KMnO_{4} en 100 ml de NaOH 1 N. La radioactividad se detectó mediante un escáner de capa fina (Berthold) (véase la Figura 6).

Célula/cpm	Incorporación total	Material soluble	Material antes de la	Radioactividad del material
			\beta-eliminación	\beta-eliminado
WT	1,46 x 10^{7}	2,23 x 10^{6}	1,2 x 10^{7}	1,2 x 10^{6}
MT	1,46 x 10^{7}	1,84 x 10^{6}	0,79 x 10^{7}	4,0 x 10^{5}

Las células mutantes muestran glicosilación reducida en comparación con las células de tipo salvaje. La
O-glicosilación en células mutantes es aproximadamente 40-50% menor que en las células de tipo salvaje.

Ejemplo 8 Clonación del homólogo PMT1 de Kluyveromyces lactis.

Se usó la S. cerevisiae de levadura que ha de ser el sistema de preferencia cuando se desea preparar una proteína heteróloga en una célula huésped de hongos. Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que la productividad de la levadura de panaderos es, a menudo, limitada, especialmente cuando se requiere la secreción del producto al medio de cultivo. El uso de sistemas de hongos distintos de S. cerevisiae es, por tanto, preferible en numerosos casos [véanse Romanos et al., Yeast 8 (1992), 423-488; Fleer, Curr. Opinion Biotechnol. 3 (1992), 486-496]. Uno de los huéspedes de levadura alternativos está representado por el género Kluyveromyces para el que se han encontrado superiores rendimientos de secreción con respecto a varias proteínas de interés comercial [por ejemplo, Van de Berg et al., Bio/Technology 8 (1990) 135-139]. El siguiente ejemplo demuestra que la presente invención no se limita a levadura de panaderos, ya que la secuencia del gen PMT1 aislado de S. cerevisiae puede usarse entajosamente para la identificación de genes que codifican actividades enzimáticas similares en otras especies de hongos. Además, la información de la secuencia revelada en la presente invención puede usarse también para la identificación de genes relacionados que codifican la manosiltransferasa en S. cerevisiae.

E.8.1. Diseño de cebadores con PCR degenerados para la multiplicación de genes relacionados con PMT1

La región de la secuencia de nucleótidos de PMT1 que corresponde a la región central hidrófila de la proteína manosiltransferasa se escoge para diseñar cebadores con PCR [Polymerase-catalized Chain Reaction, Saiki et al., Science 230 (1985), 1350-1354; Mullis y Faloona, Meth. Enzymol. 155 (1987), 335-350] para la multiplicación de genes homólogos. La multiplicación requiere hi bridación, también denominada reasociación, de estos ligonucleótidos sintéticos con su ADN diana. La especificidad con la que se multiplican las regiones individuales del ADN genómico depende de las condiciones de la reacción PCR y del grado de homología entre los cebadores y la secuencia de nucleótidos que ha de ser multiplicada. Después de la etapa de reasociación, los cebadores son extendidos usando una ADN-polimerasa termoestable. Una vez que la trenza complementaria ha sido polimerizada, las dos trenzas se separan mediante desnaturalización por calor y puede comenzar un nuevo ciclo de reasociación y de polimerización.

En la Tabla 2 siguiente, se presentan cuatro ejemplos de oligonucleótidos adecuados como cebadores para la multiplicación con PCR de homólogos PMT1.

TABLA 2

Designación del cebador	Secuencia de nucleótidos
Sq3908	5'-ATGGAYGCNAAYAAYGAYTGG-3'
Sq3909	5'-GAYGCNAAYGAYGAYTGGGT-3'
Sq3910	5'-TCYTGYTGYTCRAANCCCCA-3'
Sq3911	5'-CTRTTRTTYTCNCCCCARTA-3'

El diseño de estos oligonucleótidos "degenerados" tiene en cuenta que varios codones pueden contener la información para la incorporación del mismo aminoácido en una cadena polipeptídica naciente, lo más frecuentemente variando en la tercera posición ("rotación fuera del plano") de un triplete. Cada cebador representa, por tanto, una mezcla de oligonucleótidos en la que Y significa C o T, R significa A o G, y N significa A, C, G o T.

E.8.2. Multiplicación con PCR de ADN genómico de K. lactis

El ADN genómico de la cepa CBS2359 de K. lactis se preparó como se describe por Sherman et al. ["Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Presss (1986), pág. 127]. Se usaron 10 ng de ADN genómico en una reacción estándar con PCR [Sambrook et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] en presencia de 1 \mug de cada uno de los cebadores y formamida desionizada al 5%. La multiplicación se realizó usando un "DNA Termal Cycler" (Perkin Elmer Cetus) y "AmpliTag DNA Polymerase" (Perkin Elmer Cetus, 5 unidades por cada tubo de reacción). Las condiciones de la desnaturalización, de la reasociación y de la polimerización (30 ciclos) fueron 91ºC (1 min), 42ºC (2 min) y 72ºC (3 min), respectivamente, excepto para el primer ciclo en el que la desnaturalización era durante 5 min. Los resultados de las multiplicaciones con PCR usando los cebadores descritos anteriormente se presentan en la Tabla 3 siguiente.

TABLA 3

Combinaciones de iniciadores	Tamaño aproximado de fragmentos de ADN multiplicados (pb)
	esperado para el homólogo	observado
	PMT1
Sq3908+Sq3910	400	400
Sq3908+Sq3911	600	600
Sq3909+Sq3910	170	170
	300
Sq3909+Sq3911	400	400
	800

Estos resultados demuestran que no sólo es posible obtener fragmentos que exhiben el mismo tamaño que el esperado para el homólogo de K. lactis del gen PMT1 de S. cerevisiae sino que, además, los fragmentos de ADN pueden multiplicarse con gran especificidad que lo más probable corresponde a otro gen que codifica una actividad enzimática estrechamente relacionada.

E.8.3. Caracterización de la secuencia parcial del homólogo PMT1 de K. lactis

El fragmento de 400 pb, multiplicado con la combinación de cebador Sq3908+Sq3910, se subclonó en el pCRII vector (TA Cloning^{®}, Invitrogen Corp.) siguiendo las indicaciones del suministrador, y se secuenció parcialmente según el método descrito en E.4.1.9. usando el cebador universal. La secuencia obtenida se presenta en la Figura 7. La comparación de secuencias entre el gen PMT1 de S. cerevisiae y el fragmento aislado del ADN genómico de K. lactis mediante ultiplicación con PCR revela identidad del 75% y del 80,5% en el nivel de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente (Figura 8). El fragmento de ADN de 400 pb multiplicado puede usarse para convertir en diana un gen marcador seleccionable para el lugar cromosómico PMT1 de K. lactis en analogía con el experimento descrito en E.6. que conduce a un gen fragmentado. Esto producirá una cepa de K. lactis con actividad de manosiltransferasa específica Ser/Thr reducida. Además, el fragmento multiplicado puede usarse como sonda de hibridación homóloga para la clonación del gen PMT1 de K. lactis completo usando procedimientos normalizados.

Claims (23)

1. Célula de hongos que porta una modificación o modificaciones genéticas que están localizadas en la región codificante o en regiones responsables de o involucradas en la expresión y/o regulación transcripcional del gen que codifica una proteína con actividad Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa (PMT1) seleccionada del grupo consistente en

(a)

moléculas de ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 4A o fragmentos de la misma;

(b)

moléculas de ADN que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 4B o fragmentos de la misma; o

(c)

moléculas que comprenden la secuencia del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis representado en la Figura 7, o fragmentos del mismo;

que causa o causan que dicha célula tenga al menos una capacidad reducida de O-glicosilación comparada con una célula de hongos que lleva la correspondiente molécula de ADN no modificada como se define en (a) a (c).

2. Célula de hongos según la reivindicación 1, en la que dicha modificación o modificaciones comprenden cualquier supresión, sustitución, deleción, adición, disrupción y/o inserción mutacional.

3. Célula de hongos según la reivindicación 2, en la que dicha modificación o modificaciones son estables durante la segregación y/o no inversión y/o no permeación.

4. Célula de hongos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la reducida capacidad de O-glicosilación resulta de la producción de enzimas inactivas, de la producción de enzimas con propiedades biológicas alteradas, de la ausencia de producción de dichas enzimas o de la producción de dichas enzimas a bajos niveles.

5. Célula de hongos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, modificación o modificaciones en uno o más genes involucrados en adiciones posteriores de residuos manosilo, o en la síntesis de donantes de residuos manosilo (Dol-P-Man).

6. Célula de hongos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que se ha introducido una secuencia de ADN exógeno.

7. Célula de hongos según la reivindicación 6, en la que la secuencia de ADN exógeno comprende uno o más genes que codifican una proteína deseada que ha de ser expresada y/o secretada en dicha célula.

8. Célula de hongos según la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de ADN está incluida en una cassete de expresión que comprende una región de iniciación de la transcripción y de la traducción unida al extremo 5' de dicha secuencia de ADN que codifica la proteína o proteínas deseadas.

9. Célula de hongos según la reivindicación 8, en la que dicha región de iniciación de la transcripción y de la traducción se escoge de promotores derivados de genes de células de hongos.

10. Célula de hongos según las reivindicaciones 8 ó 9, en la que dicha cassete de expresión comprende, además, una región de terminación de la transcripción y de la traducción en el extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica la proteína o proteínas deseadas.

11. Célula de hongos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dicha cassete de expresión comprende, además, un péptido señal (pre-secuencia) en el extremo N de la secuencia de la proteína deseada para dirigir la proteína naciente al camino secretor de dicha célula de hongos.

12. Célula de hongos según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en la que la secuencia de ADN exógeno es parte de un vector que puede replicarse de forma autónoma en dicha célula de hongos o integrarse en sus propias secuencias de ADN (cromosoma).

13. Célula de hongos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que ésta se escoge de hongos filamentosos y levaduras.

14. Célula de hongos según la reivindicación 13, en la que la levadura se escoge del grupo constituido de Kluyveromyces y Saccharomyces.

15. Procedimiento para preparar productos recombinantes, en el que una célula de hongos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 se cultiva en condiciones en las que se expresa la secuencia de ADN exógeno y el producto se recupera.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho producto se secreta en el medio de cultivo.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho producto es susceptible de O-glicosilación por la célula de hongos.

18. Una molécula de ADN que comprende un gen que codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de Saccharomyces, teniendo dicho gen la secuencia dada en la Figura 4A.

19. Una molécula de ADN que comprende un gen que codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa de una especie de Kluyveromyces, conteniendo dicho gen la secuencia del fragmento de 126 pb del gen PMT1 de Kluyveromyces lactis dado en la Figura 7.

20. Una molécula de ADN que comprende un gen que codifica la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr) manosil-transferasa:

(a)

que hibrida con la secuencia ADN de la reivindicación 18 ó 19; y/o

(b)

que representa fragmentos o derivados de la secuencia de ADN de la reivindicación 18 ó 19.

21. El uso de una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o cualquier parte de la misma como sonda o sondas de hibridación o para complementar fenotipos mutantes para la obtención de genes homólogos de células de hongos.

22. Fragmento de ADN que es un fragmento o fragmento degenerado debido al código genético del gen según la reivindicación 18 y tiene la secuencia siguiente:

5'ATGGAYGCNAAYAAYGAYTGG-3',

5'-GAYGCNAAYGAYGAYTGGGT-3',

5'-TCYTGYTGYTCRAANCCCCA-3', o

5'-CTRTTRTTYTCNCCCCARTA-3'.

23. Uso del fragmento de ADN o del fragmento degenerado según la reivindicación 22 como un cebador con PCR.