ES2094722T5

ES2094722T5 - Plantas resistentes a los insectos.

Info

Publication number: ES2094722T5
Application number: ES88870070T
Authority: ES
Inventors: David Allen Fischhoff; Roy Lee Fuchs; Sylvia Ann Mcpherson; Paul Bruno Lavrik; Frederick Joseph Perlak
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2008-04-26
Also published as: JPS63287488A; US6284949B1; TR27832A; EP0289479B1; US5763241A; CN1026497C; JP2001112490A; US20020152496A1; JPH10323138A; DE3855644T3; US5495071A; DK234088D0; NZ224418A; DE3855644D1; EP0289479A2; AU610157B2; AU1527388A; JP3122642B2; GR3022490T3; EP0731170A1

Abstract

METODO PARA PRODUCIR PLANTAS GENETICAMENTE TRANSFORMADAS QUE MUESTRAN TOXICIDAD FRENTE A INSECTOS COLEOPTEROS. EN OTRO ASPECTO LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A GENES VEGETALES QUIMERICOS, CELULAS TRANSFORMADAS GENETICAMENTE Y PLANTAS DIFERENCIADAS QUE MUESTRAN TOXICIDAD FRENTE A INSECTOS COLEOPTEROS. TAMBIEN INCLUYE LA PRESENTE INVENCION CELULAS BACTERIANAS Y VECTORES DE TRANSFORMACION DE PLANTAS QUE COMPRENDEN UN GEN VEGETAL QUMERICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA TOXICA PARA LOS COLEOPTEROS DE BACILLUS THURINGIENSIS.

Description

Plantas resistentes a los insectos.

La presente invención se refiere a los campos de la ingeniería genética, la bioquímica y la transformación de plantas.

El Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria del suelo formadora de esporas que es conocida por su capacidad de producir una proteína cristalina paraesporal que es tóxica hacia una amplia diversidad de insectos. La mayoría de las cepas son activas frente a insectos lepidópteros (polillas y mariposas) y unas pocas se ha descrito que tienen actividad frente a insectos dípteros (mosquitos y moscas, véase Aronson et al. 1986). Los genes de las toxinas de una diversidad de estas cepas han sido clonados y las toxinas han sido expresadas en hospedantes heterólogos (Schnepf et al., 1981; Klier et al., 1982). En los últimos años, se han identificado cepas (B.t. var. tenebrionis (B.t.t., Krieg et al., 1983; Krieg et al., 1984) y B.t. var. san diego (B.t.sd., Herrnstadt et al., 1986) que tienen actividad frente a insectos coleópteros. En el documento EP-A-0213818 (Mycogen) ha sido clonado el gen de la toxina de B.t.sd., pero la toxina producida en E. Coli se describió por Herrnstadt et al., 1986, que tenía un tamaño mayor que la toxina de los cristales de B.t.sd., y la actividad de esta toxina de B.t.sd. recombinante se suponía que era débil.

Los insectos susceptibles a la acción de la toxina proteica de las bacterias Bacillus thuringiensis de tipo coleóptero incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el escarabajo de la patata del Colorado (Leptinotarsa decemlineata), gorgojo de cápsulas (Anthonomus grandis), gusano amarillo de la harina (Tenebrio molitor), escarabajo de la hoja de olmo (Pyrrhalta luteola) y gusano de raíz de maíz del Sur (Diabrotica undecimpunctata howardi).

Por lo tanto, se previó la capacidad potencial de que las plantas tratadas por ingeniería genética exhibieran toxicidad o tolerancia hacia insectos coleópteros si tales plantas pudieran ser transformadas para expresar una toxina de tipo coleóptero a un nivel eficaz como insecticida. Cultivos agronómicamente importantes que están afectados por insectos coleópteros incluyen alfalfa, algodón, maíz, patata, colza (canola), maíz, tabaco, tomate, remolacha azucarera y girasol.

Aunque ciertos genes quiméricos han sido expresados en células transformadas de plantas transformadas y plantas, tal expresión no es en modo alguna sencilla. Específicamente, la expresión de proteínas de toxina de B.t. de tipo lepidóptero ha sido particularmente problemática. Se ha encontrado ahora que las explicaciones de la técnica con respecto a la expresión de una proteína de toxina de B.t. de tipo lepidóptero en plantas no se extiende a una proteína de toxina de B.t. de tipo coleóptero. Estos descubrimientos son directamente contrarios a las explicaciones anteriores, que sugerían que se emplearían las mismas manipulaciones genéticas para obtener una expresión útil de tales toxinas en plantas transformadas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un procedimiento para producir plantas genéticamente transformadas que exhiben toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(a): insertar en el genoma de una célula de una planta susceptible al ataque por insectos coleópteros, un gen quimérico que comprende:

i): un promotor que actúa en las células de la planta para provocar la producción de RNA;

ii): una secuencia de DNA que codifica una proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644), (58-644) o (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10; y

iii): una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de la planta para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de RNA;

(b): obtener células transformadas de la planta, y

(c): regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros, en el que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un gen quimérico de plantas que comprende, en secuencia:

(a): un promotor que actúa en las células de la planta para provocar la producción de RNA;

(b): una secuencia de DNA que codifica una proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644), (58-644) o (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(c): una región no traducida en 3' que actúa en las células de la planta para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.

Se han proporcionado también, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, células bacterianas, células transformadas de plantas y vectores de transformación de plantas que contienen, respectivamente, DNA comprendido por los elementos anteriormente mencionados (a), (b) y (c), en el que las células de la planta no son células de una planta monocotiledonea.

Todavía, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado una planta diferenciada que comprende células transformadas de planta, como se describe con anterioridad, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros y en el que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón. La presente invención contempla también semillas que producen las plantas transformadas descritas con anterioridad seleccionadas entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las sondas de DNA usadas para el aislamiento del gen de toxina de B.t.t.

La Figura 2 muestra las etapas empleadas en la preparación de plásmido pMON5432.

La Figura 3 muestra una orientación de la fracción HindIII de 3,0 kb que codifica el gen de la toxina en pMON5420 y pMON5421 con respecto al multienlazante de pUC119.

La Figura 4 muestra la estrategia utilizada para la secuenciación del gen de toxina de B.t.t. contenido en pMON5420 y pMON5421.

La Figura 5 muestra la secuencia de DNA y los sitios de colocación y restricción para el ORF de 1932 bp del gen de B.t.t. que codifica la proteína de toxina del aminoácido 644.

La Figura 6 muestra las bandas observadas para la toxina de B.t.t. siguiendo un análisis SDS-PAGE.

La Figura 7 muestra los N terminales de proteínas expresadas a partir del gen de toxina de B.t.t. o producidas por vía proteolítica in vivo en B.t.t.

La Figura 8 representa los genes de B.t.t. alterados usados para analizar el carácter crítico de la parte de los C terminales de la toxina.

La Figura 9 representa los genes de B.t.t. alterados usados para analizar el carácter crítico de la parte de los N terminales de la toxina.

La Figura 10 muestra las deleciones producidas en la evaluación de los mutantes de proteínas de toxinas de B.t.t.

La Figura 11 muestra las etapas empleadas en la preparación de los plásmidos pMON9758, pMON9754 y
pMON9753.

La Figura 12 muestra las etapas empleadas en la preparación de plásmido pMON9791.

La Figura 13 muestra las etapas empleadas en la preparación de plásmido pMON9792.

La Figura 14 muestra un mapa de plásmido para un vector cassette de transformación de la planta pMON893.

La Figura 15 muestra las etapas empleadas en la preparación de plásmido pMON9741.

La Figura 16 muestra las etapas empleadas en la preparación de plásmido pMON5436.

La Figura 17 ilustra los elementos que comprenden la región T-DNA de Agrobacterium ACO desarmado.

La Figura 18 muestra la secuencia de DNA para el promotor CaMV35S intensificado.

Fundamentos de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para transformar plantas de tomate, patata y algodón para exhibir toxicidad hacia insectos coleópteros susceptibles. Más particularmente, la presente invención proporciona plantas transgénicas que expresan la proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644) o (77-644) de dicha proteína en la que los residuos de aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10, a un nivel insecticida, en el que las plantas se seleccionan del grupo formado por tomate, patata y algodón.

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En un aspecto, la presente invención comprende genes quiméricos que actúan en plantas y producen plantas transgénicas que exhiben toxicidad hacia insectos coleópteros susceptibles. La expresión de un gen de planta que existe en forma de DNA de doble hebra incluye la transcripción de una hebra del DNA mediante RNA polimerasa para producir RNA mensajero (mRNA), y el tratamiento del mRNA primario transcrito dentro del núcleo. Este tratamiento incluye una región no traducida en 3' que añade poliadenilato nucleótidos al extremo 3' del mRNA.

La transcripción de DNA para producir mRNA está regulada por una región de DNA habitualmente denominada el "promotor". La región promotora contiene una secuencia de nucleótidos que señala RNA polimerasa para asociar con el DNA, e iniciar la producción de un mRNA transcrito usando la hebra de DNA situada detrás del promotor como un molde para preparar una hebra correspondiente de RNA.

En la bibliografía ha sido descrito un cierto número de promotores que son activos en células de plantas. Estos incluyen los promotores nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS) y manopina sintasa (MAS) que son portados en plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens, los promotores 19S y 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV), y el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de ribulosa bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante). Estos tipos de promotores han sido usados para crear diversos tipos de construcciones de DNA que han sido expresadas en plantas; véase, por ejemplo, la publicación del documento PCT WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).

Promotores que son conocidos o que se encuentra que provocan la producción de un mRNA transcrito en células de plantas pueden ser usados en la presente invención. Promotores adecuados pueden incluir tanto los que son derivados de un gen que es expresado de forma natural en plantas como secuencias de promotores sintéticos que pueden incluir secuencias intensificadoras redundantes o heterólogas. El promotor seleccionado debe ser capaz de provocar una suficiente expresión que de lugar a la producción de una cantidad eficaz de proteína de toxina que haga la planta tóxica hacia insectos coleópteros. Los expertos en la técnica reconocen que la cantidad de proteína de toxina necesaria para inducir la toxicidad deseada puede variar con los insectos coleópteros particulares frente a los que se quiere proteger. Consecuentemente, aunque se prefieren los promotores CaMV35S, ssRUBISCO y MAS, debe entenderse que estos promotores pueden no ser promotores óptimos para todas las realizaciones de la presente invención.

El mRNA producido por el gen quimérico contiene también una secuencia líder no traducida en 5'. Esta secuencia puede ser derivada del promotor particular seleccionado tal como los promotores CaMV35S, ssRUBISCO o MAS. La región no traducida en 5' puede ser obtenida también a partir de otros genes eucarióticos adecuados o de una secuencia de genes sintéticos. Los expertos en la técnica reconocen que la funcionalidad necesaria de la secuencia líder no traducida en 5' es la intensificación de la unión del mRNA transcrito a los ribosomas de la célula de la planta para intensificar la traducción del mRNA en la producción de la proteína codificada.

El gen quimérico contiene también una secuencia codificadora estructural que codifica los fragmentos que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644) o (77-644) de la proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis, B.t. Tenebrionis o B.t. san diego, en el que los residuos de aminoaácido de dicha proteína están numerados como se muestra en la figura 10.

La región no traducida en 3' contiene una señal de poliadenilación que actúa en las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' del RNA: Ejemplos de regiones de 3' adecuadas son (1) las regiones transcritas en 3', no traducidas, que contienen la señal de poliadenilato de los genes de los plásmidos inductores de tumores (T_{i}) de Agrobacterium, tal como el gen nopalina sintasa (NOS), y (2) genes de plantas como los genes de proteínas de almacenamiento de soja y el ssRUBISCO. Un ejemplo de las regiones 3' preferidas son la de los genes NOS, ssRUBISCO y de proteínas de almacenamiento, descritos más en detalle en los Ejemplos con posterioridad.

Los genes de proteínas de toxinas de tipo coleóptero anteriores se insertan en el genoma de la planta de tomate, patata o algodón mediante cualquier procedimiento adecuado. Vectores adecuados de transformación de plantas incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens tal como los descritos, por ejemplo, en la publicación del documento EPO 131.620 (Rogers et al.), Herrera-Estrella 1983, Bevan 1983, Klee 1985 y publicación del documento EPO 120.516 (Schilperoort et al.). Además de los vectores de transformación de plantas derivados de los plásmidos Ti o inductores de raíces (Ri) de Agrobacterium, se pueden usar procedimientos alternativos para insertar los genes de proteínas de toxinas de tipo coleóptero de esta invención en células de plantas. Tales procedimientos pueden incluir, por ejemplo, liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la absorción de DNA libre, y el uso de virus o polen como vectores. Si se desea, se puede insertar más de un gen en los cromosomas de una planta, mediante procedimientos tales como repetir el ciclo de transformación y selección más de una vez.

El material de plantas así modificado puede ser ensayado, por ejemplo, mediante transferencia Northern en cuanto a la presencia de mRNA de proteína de toxina de tipo coleóptero. Si no se detecta mRNA de proteína de toxina (o un título demasiado bajo), el promotor usado en la construcción de genes quiméricos es sustituido con otro promotor potencialmente más fuerte, y la construcción alterada se vuelve a ensayar. Alternativamente, se puede ensayar el nivel de proteína de toxina mediante un inmunoensayo tal como la transferencia Western. En muchos casos el ensayo más sensible para la proteína de toxina es un bioensayo de insectos.

Esta verificación se puede efectuar en plantas regeneradas completas. En cualquier caso, cuando se consigue una producción adecuada de mRNA de proteína de toxina, y las células transformadas (o protoplastos) han sido regeneradas en plantas completas, estas últimas son rastreadas en cuanto a la resistencia al ataque por insectos coleópteros. La elección de una metodología para la etapa de regeneración no es crítica, estando disponibles protocolos adecuados para hospedantes de Leguminosae (alfalfa, soja, trébol, etc.) Umbelliferae (zanahoria, apio, chirivía), Cruciferae (repollo, rábano, semilla de colza, etc.), Cucurbitaceae (melones y pepinos), Graminae (trigo, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (patata, tabaco, tomate, pimientos), Malvaceae (algodón, etc.), Chenopodiaceae (remolacha azucarera, etc.) y diversos cultivos de flores. Véase, por ejemplo, Ammirato et al. (1984).

Todas las estructuras de proteínas representadas en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones son mostradas en un formato convencional en el que el grupo amino en el N terminal aparece a la izquierda, y el grupo carboxilo en el C terminal a la derecha. Análogamente, la nomenclatura de aminoácidos para los aminoácidos que se producen de forma natural encontrados en la proteína es como sigue: alanina (ala;A), asparagina (Asn;N), ácido aspártico (Asp;D), Arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido glutámico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), Leucina (Leu;L), lisina (Lys;K), metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptófano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y) y valina (Val;V).

Aislamiento de gen de toxina de B.t.t.

El gen de B.t.t. que codifica la proteína de toxina de tipo coleóptero se aisló como se describe a continuación.

Aislamiento de cristales de proteínas

El B.t. tenebriones se cultivó en medio de caldo de soja de tripticasa (TSB) para el aislamiento de cristales de proteínas. Al intentar aislar cristales intactos de B.t.t. se apreció una diferencia significativa entre estos cristales y los del tipo lepidóptero. Aunque los cristales de tipo lepidóptero se aislaron rutinariamente en gradientes formados a partir de Renografin. Hipaque o NaBr, se encontró que los cristales de B.t.t. se disolvían en estos medios gradientes. Se encontró que los cristales de B.t.t. eran estables en gradientes de sacarosa, y se usaron gradientes de sacarosa para el aislamiento de cristales de B.t.t.

Aislamiento de toxina de B.t.t. a partir de cristales

Se analizaron cristales purificados en cuanto a su composición de proteínas mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. Los resultados de estos experimentos indicaron que los cristales de B.t.t. contenían al menos dos componentes proteicos con pesos moleculares de aproximadamente 68 a 70 kilodaltones (kDa) y aproximadamente 60 kDa, respectivamente. Las cantidades relativas de los componentes eran variables de una preparación a otra. Además, se sugirió que el componente de peso molecular más elevado podría consistir en más de una única proteína. Bernhard (1986) describió proteínas de aproximadamente 68 kDa y 50 kDa como componentes de cristales de B.t.t.. Hernstadt et al. (1986) describieron que los cristales de B.t.san diego estaban compuestos por una proteína de aproximadamente 64 kDa. Por el contrario, las cepas B.t. de tipo lepidóptero tal como B.t. kurstaki contienen típicamente una proteína de peso molecular más elevado de 130 kDa a 140 kDa. Este resultado indica una diferencia significativa en la estructura de las proteínas de toxinas de lepidópteros y coleópteros.

Se adoptaron diversas aproximaciones para purificar los componentes proteicos individuales del cristal. Un enfoque isoeléctrico no fue satisfactorio porque todas las proteínas precipitaron. Un cromatógrafo líquido a presión elevada de intercambio aniónico (HPLC) en una columna Mono Q no consiguió resolver los componentes. Una HPLC de intercambio catiónico en una columna Mono S en presencia de urea 4 M resolvió cinco picos. Un análisis de los picos mediante electroforesis de gel SDS indicó que el pico A contenía solamente la banda de peso molecular superior de los cristales completos. El pico B era rico en esta banda superior, con pequeñas cantidades de la banda inferior. El pico C era rico en la banda inferior, con cantidades significativas de la banda superior. Los picos D y E eran mezclas de las dos bandas. En la mayoría de las preparaciones, la banda de peso molecular superior, correspondiente a los picos A y B, era la proteína predominante en los cristales. Para el material separado por HPLC, los picos A y B representaron la mayoría de la proteína recuperada.

Se determinaron las secuencias de aminoácidos N-terminales correspondientes a los picos A, B y C. Los picos A y B se encontró que tenían la misma secuencia N-terminal, mientras que la secuencia del pico C era diferente. Las secuencias determinadas fueron:

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X representa un aminoácido sin determinar.

Toxicidad hacia insectos de proteínas de B.t.t.

Varias preparaciones de B.t.t. y proteínas de B.t.t. se ensayaron en cuanto a la toxicidad hacia diversos insectos, incluidos tanto lepidópteros como coleópteros. No se observó actividad hacia lepidópteros (gusano de la mazorca de maíz, oruga nocturna negra, larva de esfíngido del tabaco y oruga medidora de la col). Entre los coleópteros, se observó actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado (Leptinotarsa decemlineata) y el gorgojo del algodón (Anthonomus grandis). Se exhibió un nivel inferior de actividad frente al gusano de la raíz de maíz del Sur (Diabrotica undecimpunctata howardi). Se encontró una actividad insecticida en cultivos bacterianos en bruto, cristales purificados, cristales solubilizados y los picos aislados C, D, E (reunidos), A y B.

Se llevaron a cabo ensayos en cuanto a la toxicidad hacia el escarabajo de la patata del Colorado aplicando la preparación que iba a ser ensayada a hojas de tomate, y permitiendo que los insectos se alimentaran en las hojas tratadas durante cuatro días. Los ensayos con el gorgojo del algodón y el gusano de la raíz de maíz del Sur se realizaron incorporando el material de ensayo en una mezcla de dieta apropiada.

Identificación y clonación del gen de toxina de B.t.t. en E. Coli y pseudomonas

Usando esta información de la secuencia de proteínas N-terminales, se diseñaron sondas de DNA (Figura 1) que se usaron en el aislamiento de clones que contenían el gen de toxina de B.t.t.. Las sondas se marcaron terminalmente con [\gamma-P^{32}] ATP según Maniatis (1982). Se cultivó B.thuringiensis var. tenebriones durante 6 horas a 37ºC en medio Spizizen (Spizizen, 1958) complementado con extracto de levadura al 0,1% y glucosa al 0,1% (SPY) para el aislamiento de DNA total. El DNA total se aisló a partir de B.t.t. mediante el procedimiento de Kronstad (1983). Las células se cultivaron en placas de agar Luria para el aislamiento de cristales de B.t.t. usados en los estudios de toxicidad.

Se cultivaron rutinariamente cultivos de E. Coli y Pseudomonas en caldo Luria (LB) con ampicilina (Ap, 200 \mug/ml), kanamicina (Km, 50 \mug/ml), o gentamicina (Gm, 15 \mug/ml) añadidos para la selección y el mantenimiento de los plásmidos.

Aislamiento y manipulación de DNA

Se extrajo DNA de plásmidos de células de E. Coli y Pseudomonas mediante el procedimiento de Birnboim y Doly (1979) y se purificaron grandes cantidades usando resina NACS-52 (Bethesda Research Laboratories) según las instrucciones del fabricante. Se usaron endonucleasas de restricción, fosfatasa alcalina de ternera y ligasa de DNA T4 según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Los productos de digestión de restricción se analizaron en geles de agarosa al 0,8% tratados por electroforesis en tampón Tris-acetato. Los fragmentos de DNA para la clonación se purificaron en agarosa usando el procedimiento de congelación-descongelación. La construcción de moléculas de DNA recombinante fue según Maniatis et al. (1982). La transformación en E. Coli se realizó según Maniatis (1982).

Clonación del gen de toxina de B.t.t.

Se realizó un análisis Southern (Southern, 1975) usando el procedimiento del gel seco modificado (Conner et al., (1983). La hibridación del filtro de colonias, para la detección de clones de toxinas de B.t.t., usó el procedimiento de cloruro de tetrametilamonio (Wood et al., 1985).

Un análisis Southern de DNA total de B.t.t. digerido con BamHI y HindIII identificó un fragmento BamHI de 5,8 kb y uno HindIII de 3,0 kb que se hibridizaron a la sonda A1 sintética. Los fragmentos BamHI de DNA de B.t.t. (5,4-6,5 kb) fueron purificados en geles de agarosa y se ligaron al pUC119 digerido con BamHI tratado con fosfatasa alcalina. El pUC119 se prepara aislando el fragmento HgiAI/DraI de 476 bp de bacteriofago M13 y rematando los extremos del fragmento con polimerasa de DNA T4 (New England Biolabs). Este fragmento se inserta seguidamente en pUC19 que ha sido digerido con NdeI y se rellena con polimerasa de DNA Klenow (New England Biolabs). La B.t.t. ligada y el DNA de pUC119 se usaron seguidamente para transformar células JM101 de E. Coli. Después de varios intentos, solamente se obtuvieron 150 colonias resistentes a Ap. Los fragmentos HindIII de DNA de B.t.t. (2,8-3,5 kb) se clonaron también en el sitio HindIII de pUC119, y se obtuvieron 1100 colonias. Todas las colonias fueron rastreadas mediante hibridación de colonias a la sonda A1 (Figura 1). Once clones HindIII mostraron una hibridación fuerte, pero ninguna de las colonias BamHI mostraron hibridación alguna. Las colonias identificadas por hibridación a A1 fueron seguidamente rastreadas usando sonda sintética A2 (Figura 1) y dos colonias mostraron hibridación a la segunda sonda. Los modelos de digestión con restricción de las dos colonias sindicaron que el mismo fragmento HindIII de 3,0 kb estaba contenido en las dos orientaciones, aunque opuestas. Estos clones fueron denominados pMON5420 y pMON5421 (Figura 3). Para confirmar que los clones contenían el gen para la proteína de toxina de B.t.t., el DNA de una hebra de ambos clones fue secuenciado usando sondas degeneradas A1 y A2 como cebadores para una secuenciación di-desoxi (Sanger, 1977). Un análisis de las secuencias con sonda A1 como cebador reveló un marco de lectura abierto (ORF) cuya secuencia era idéntica a los aminoácidos 9 a 15 de la secuencia de aminoácidos determinada para los picos purificados A y B de la proteína de toxina de B.t.t. La sonda A2 produjo una secuencia de DNA que comenzaba más allá del extremo de la secuencia de aminoácidos determinada, pero esta secuencia de DNA era idéntica a la secuencia producida con A1. Estos resultados confirman que se clonó el gen de toxina de B.t.t. deseado.

Una hibridación Southern del DNA total de B.t.t., usando sondas degeneradas basadas en el N-terminal del pico C, no consiguió detectar bandas específicas que sugirieran que la secuencia de aminoácidos determinada para el pico C fuera incorrecta o, lo más probablemente, se obtuviera a partir de una mezcla de dos o más proteínas que comprendían el pico C.

Análisis de proteínas producidas en E. Coli

Las proteínas de cristales de B.t.t. y las proteínas de B.t.t. recombinantes se examinaron mediante SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Un ml de E. Coli fue centrifugado, los sedimentos se volvieron a poner en suspensión en 100 \mug de tampón SDS-muestra y muestras de 10 \mul fueron tratadas por electroforesis en geles de poliacrilamida al 7,5%. Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie o ensayados en cuanto a su reactividad cruzada respecto a anticuerpos surgidos frente a cristales purificados de toxina de B.t.t. Se realizaron transferencias Western usando el procedimiento de anticuerpos conjugados de peroxidasa de rábano picante (Towbin et al., 1974). Se adquirieron marcadores de peso molecular elevado de la empresa BioRad.

Se obtuvo una confirmación adicional de que los clones produjeron toxina de B.t.t. mediante un análisis de transferencia Western de las proteínas producidas en E. Coli. Células de E. Coli JM101 que contenían pUC119, pMON5420 o pMON5421 fueron cultivadas durante una noche en presencia de IPTG (0,1 mM) para inducir el promotor 1ac. Se analizaron muestras duplicadas mediante SDS-PAGE junto con proteínas de cristal de B.t.t. purificadas incluidas como testigos. Un análisis de transferencia Western de un gel reveló la producción de 2 proteínas de reacción cruzada mediante E. Coli que contenía pMON5420 o pMON5421. Estas proteínas eran idénticas en tamaño a las proteínas mayor y menor del cristal de B.t.t. Los pesos moleculares de las proteínas fueron determinados mediante una comparación con los patrones de pesos moleculares en el segundo gel teñido con azul de Coomassie. La proteína de la toxina principal se determinó que era de 74 kDa de tamaño, y la proteína de la toxina menor se determinó que era de 68 kDa de tamaño. El nivel de proteínas de toxinas de B.t.t. producido por pMON5420 se aumentó mediante la adición de IPTG, mientras que la producción de proteínas de toxinas mediante pMON5421 no fue afectada.

Producción de toxina(s) de B.t.t. en Pseudomonas fluorescens

Se construyó un vector para un amplio espectro de hospedantes, pMON5432, clonando pMON5420 digerido con BamHI en el sitio BamHI de pMON7111, como se muestra en la Figura 2. Este vector fue acoplado seguidamente en P. fluorescens 701E1 para un análisis de la producción de toxinas. Se hicieron acoplamientos Tri-parentales en Pseudomonas fluorescens, como se describió anteriormente (Ditta et al., 1980). Las muestras de los cultivos de una noche, cultivadas con y sin IPTG, fueron preparadas para un análisis por transferencia Western y para estudios de toxicidad hacia insectos. Las proteínas producidas por Pseudomonas eran idénticas en tamaño a las proteínas producidas por E. Coli, y la expresión de proteínas fue aumentada con la adición de IPTG.

Ensayo de toxicidad hacia insectos

Se ensayó la actividad de toxinas hacia coleópteros usando insectos de escarabajos de la patata del Colorado (Leptinotarsa decemlineata) en un ensayo de alimentación con hojas de tomate. Se cultivaron cultivos de E. Coli y Pseudomonas durante una noche en presencia de IPTG, se centrifugaron y se volvieron a poner en suspensión a diversas concentraciones en MgSO_{4} 10 mM. Las células fueron disueltas mediante sonicación (tres tratamientos pulsados de 15 segundos en hielo). Se añadió Tween-20 (0,1%) y la muestra se aplicó como revestimiento sobre una hoja de tomate colocada en una placa de petri de 9 cm alineada con papel de filtro húmedo. Se añadieron diez larvas de escarabajo de la patata del Colorado a cada hoja. Después de cuatro días, se calculó por ordenador el porcentaje de mortalidad corregida (porcentaje de insectos vivos en el testigo menos el porcentaje de insectos vivos en la muestra tratada dividido por el porcentaje vivo en el testigo) usando la fórmula de Abbott (Abbott, 1925). Los ensayos se realizaron poro duplicado y se combinaron los datos. Se usó una preparación de cristales/esporas de B.t.t. como testigos positivos.

Cultivos de E. Coli de pMON5420 y pMON5421 fueron evaluados en cuanto a la toxicidad hacia coleópteros usando diferentes concentraciones en cultivos cultivados con IPTG añadido. Una comparación de las actividades de toxina de B.t.t. de tipo recombinante y salvaje se muestra a continuación en la Tabla I. Los resultados muestran que la(s) proteína(s) de B.t.t. recombinante(s) son tóxicas hacia el escarabajo de la patata del Colorado. El cultivo de pMON5420 inducido por IPTG, concentrado a 2x, destruyó un 100% de insectos, como lo hizo el testigo de esporas/cristales de B.t.t. Estos resultados de toxicidad demuestran que el gen de B.t.t. clonado era el gen que codificaba la proteína de toxina de B.t.t.

El ensayo de alimentación de insectos demostró que las toxinas producidas por Pseudomonas eran tóxicas hacia el escarabajo de la patata del Colorado. La toxicidad relativa de los cultivos de Pseudomonas era congruente con la cantidad de proteína de toxina producida según se determinó mediante un análisis de transferencia Western cuando se comparó con cultivos de E. Coli.

TABLA I Toxicidad hacia coleópteros de toxina de B.t.t. recombinante

Muestra^{1}	Concentración^{2}	Mortalidad corregida
E. Coli JM101
pUC119	2x	0%
pMON5420	1x	83%
pMON5420	2x	100%
pMON5421	1X	44%
pMON5421	2X	61%
P. fluorescens 701E1
pMON5432	3x	60%
Prep. de B.t.t.		100%

^{1} Los cultivos se cultivaron durante una noche con IPTG añadido, se concentraron, se sonicaron y se ensayaron en cuanto a la toxicidad. ^{2} Concentración celular igual a 1x de cultivo durante una noche.

Secuencia de gen de toxina de B.t.t.

La colocación y la orientación del gen de B.t.t. dentro de fragmento clonado fueron determinadas basándose en la siguiente información: a) la secuencia de DNA se obtuvo a partir del molde de pMON5421 de hebra única, b) un sitio Ost identificado mediante análisis de secuencia de DNA, cerca del comienzo de la traducción, se colocó en el mapa en pMON5420 y pMON5421, c) se colocaron en el mapa otros diversos sitios de restricción, d) se construyó una deleción de un sitio BglII a un sitio BamHI que suprime 130 bp, y se produjeron las dos proteínas de longitud completa. Esta información se usó para construir mapas de pMON5420 y pMON5421. Haciendo referencia a la Figura 4, la región que codifica la toxina comienza 500 bp a partir del sitio HindIII en 5', y 150 bp aguas arriba del sitio PstI. La región codificadora termina aproximadamente a 450 bp del sitio HindIII en 3'. El sitio BglII está aproximadamente 350 bp aguas abajo del codón de terminación.

Plásmidos

Los plásmidos generados para secuenciar el gen de toxina insecticida de B.t.t. se listan en la Tabla II. Los plásmidos parentales, pMON5420 y pMON5421, son aislamientos independientes del fragmento HindIII clonado en pUC119 en orientación opuesta.

TABLA II Plásmidos de secuenciación

pMON5420	Inserto en HindIII de 3,0 de DNA de B.t.t. (plásmido parental)
pMON5421	Inserto en HindIII de 3,0 de DNA de B.t.t. (plásmido parental)
pMON5307	Deleción en EcoRI de pMON5420
pMON5308	Deleción en EcoRI de pMON5421
pMON5309	Deleción en PstI de pMON5420
pMON5310	Deleción den XbaI de pMON5421
pMON5311	Deleción en EcoRV-SmalI de pMON5421
pMON5312	Deleción en NdeI-BamHI de pMON5421*
pMON5313	Deleción en NdeI-BamHI de pMON5420*
pMON5314	Deleción en AsuII-BamHI de pMON5421*
pMON5315	Deleción en AsuII (parcial)-BamHI de pMON5421*
pMON5316	Deleción en AsuII-BamHI de pMON5421**
pMON5426	Deleción en BglII-BamHI de pMON5420
pMON5427	Deleción en EcoRV-SmaI de pMON5420
pMON5428	Deleción en HpaI-SmaI de pMON5420
pMON5429	Deleción en XbaI de pMON5420

* - Después de la digestión del DNA con ambas enzimas, los extremos fueron rellenados con polimerasa Klenow, ligada y usada para transformar JM101. \text{**} - La generación de la deleción en AsuII-BamHI de esta construcción dio lugar a un reagrupamiento de un fragmento AsuII a una orientación opuesta a su colocación original. Esto dio lugar a una secuencia de lectura 5316 hacia el extremo NH_{2}.

Preparación de molde de hebra única para la secuenciación

El siguiente protocolo proporciona buenos rendimientos con carácter reproducible de moldes de hebra única para la secuenciación. Una única colonia que contenía el pUC119 con el fragmento que va a ser secuenciado, fue linealmente extendido en L-agar (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar por litro) que contenía ampicilina (200 \mug por ml). Una colonia única de esta placa se inoculó en 3 ml de caldo de cultivo L (200 \mug por ml de ampicilina) y se incubó a 37ºC durante una noche con agitación. A partir de este cultivo, se inocularon 50 \mul en 10 ml de 2X YT (20 g de triptona y 10 g de extracto de levadura por litro) con 200 \mug de ampicilina por ml en un matraz con mango lateral de 150 ml y se incubaron a 37ºC con agitación. Después de 2-3 horas (lectura klett de 50), se añadieron 100 \mul de M13K07 (fago helper) cultivado en E. Coli JM101, para inducir el cultivo. El matraz se agitó durante una hora y seguidamente se añadieron 20 ml de 2X YT, ajustando la concentración final de Kanamicina a 70 \mug por litro y la ampicilina a 200 \mug por ml. Los cultivos fueron agitados durante 16-18 horas a 37ºC. Se encontró que un total de tres ml del cultivo inducido durante una noche era suficiente para aislar una cantidad adecuada de molde para cuatro experimentos secuenciales. Los tres ml fueron centrifugados en tubos Eppendorf de 1,5 ml durante 1 minuto. Se decantaron y se filtraron a través de un filtro Gelman Sciences Acrodisc® de 0,2 \mum. Esta etapa se encontró que era útil para la separación de debris celular y E. Coli intacto. Una precipitación con polietilenglicol (PEG al 20%, NaCl 2,5 M, 500 \mul por 2 ml de lisado) a temperatura ambiente durante 10 minutos, estuvo seguida por una centrifugación durante 10 minutos. El material sobrenadante se desechó y seguidamente se centrifugó brevemente (15 segundos) y se separó el PEG residual. Cualquier PEG restante será llevado hasta el aislamiento del molde y afectará adversamente a las reacciones de secuenciación de DNA. Los sedimentos se vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM, pH 8,0), se combinan y se mezclan bien con 200 \mul de fenol tamponado (tamponado mediante equilibrado con un volumen igual de Tris 1 M-HCl, Ph 8,0, y seguidamente Tris 0,1 M-HCl, pH 8,0, seguido de un volumen igual de TE). Después de incubar a 55ºC durante 10 minutos, se añadió un volumen igual (200 \mul) de fenol/cloroformo (1:1), se agitó vorticalemnte y se centrifugó durante 2 minutos. La capa superior se separó, se extrajo con 200 \mul de cloroformo, se centrifugó y la fase acuosa se separó. El molde de hebra única se precipitó con 25 \mul de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 600 \mul de etanol al 95%, se incubó sobre hielo seco durante 5 minutos y se centrifugó durante 10 minutos. el precipitado se volvió a poner en suspensión en 25 \mul de H_{2}O y 2 \mul fueron verificados sobre un gel de agarosa en cuanto al tamaño correcto, concentración relativa y DNA contaminante.

Reactivos y condiciones de secuenciación

Los protocolos para la secuenciación de DNA se describen en detalle en el manual disponible en la empresa Amersham Corporation. Los reactivos (nucleótidos, cebador, tampón, solución de seguimiento y polimerasa Klenow) fueron obtenidos a partir del estuche de ensayo para secuenciación Amersham M13 (catálogo nº N4502). Las mezclas de secuenciación proporcionadas en el estuche de ensayo de Amersham fueron ajustadas para la secuenciación eficaz del gen de B.t.t. rico en A-T. En lugar de la mezcla recomendada 1:1 de dNTP a ddNTP, se encontró que las siguientes relaciones eran más apropiadas; 40 \mul de dATP:10 \mul de ddATP, 35 \mul de ddTP: 15 \mul de ddTTP, 15 \mul de dGTP: 35 \mul de ddGTP y 10 Rl de dCTP: 40 \mul de ddCTP. Se usó azufre radioactivo ([\alpha-S^{35}]dATP) en las reacciones de secuenciación (catálogo de Amersham nº SJ.1304). Los geles de secuenciación (preparados como se describe en el manual de Amersham) se realizaron en el aparato Hoeffer "Poker Face" a 70 watios (1200-1400 voltios), que se encontró que proporcionaban una muy buena resolución. Unos voltajes superiores dieron lugar a bandas borrosas.

Secuenciación del gen de toxina de B.t.t.

Los plásmidos aislados, pMON5420 y pMON5421, contenían un fragmento HindIII de 3,0 en orientación opuesta (véase la Figura 3). La proteína principal del cristal de B.t.t., que se usó como la base para diseñar las sondas de oligonucleótidos, tiene un peso molecular estimado de 73-76 kdal que correspondía a aproximadamente 2,0 kb de DNA. La secuenciación inicial de los cebadores A1 y A2 (oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de aminoácidos del pico A; véase la Tabla III, a continuación) confirmó que la secuencia de DNA correspondía a la secuencia de aminoácidos anticipada.

TABLA III Oligonucleótidos sintéticos usados para secuenciar el gen de toxina insecticida de B.t.t.

Cebador	Molde	Secuencia	Posición 1
Bttstart	pMON5420	tgaacatggttagttgg	291-275
Bttext	pMON5421	taggtgatctctaggcg	422-439
Bttseq	pMON5421	ggaacaaccttctctaatat	1156-1175
BttA1*	pMON5421	atgaayccnaayaaycg	205-222
BttA2*	pMON58421	garcaygayacyathaa	227-242

* y = t o c. r = a o g. h = t, c o a. n = a, g, c o t. ^{1} La colocación de los cebadores se basa en el total de 2615 bases secuenciadas. La secuenciación a partir de pMON5420 prosiguió hacia el extremo de aminoácido y a partir de pMON5421, hacia el extremo carboxilo (véase la Figura 3).

Se colocó un sitio PstI en la secuencia inicial que se usó para identificar la colocación y orientación probable del gen de B.t.t. dentro de pMON5420 y pMON5421 (véanse las Figuras 3 y 4). La elaboración de los mapas de los sitios de restricción con un número de enzimas (HpaI, XbaI, NdeI, EcoRV y BglII) y los numerosos sitios únicos que quedaban en la parte pUC119 tanto de pMON5420 como de pMON5421 proporcionaron la oportunidad de obtener una secuencia usando el cebador secuenciador universal. Se generaron deleciones tanto en pMON5420 como en pMON5421 llevando la región homóloga del cebador universal en proximidad cercana a las regiones internas del gen. En las áreas no fácilmente secuenciadas por deleciones generantes, se usaron oligonucleótidos sintéticos correspondientes a las regiones secuenciadas en la secuencia codificadora (Tabla III) como cebadores para obtener extensiones de las regiones secuenciadas. Las regiones secuenciadas (coordenadas de secuencia; Tabla IV) y la dirección de secuenciación se describen en la Figura 4.

TABLA IV Fuente de datos de secuencia

Plásmido	Longitud (bp)	Colocación	Plásmido	Longitud (bp)	Colocación
pMON5307	414	797-1211	pMON5316	153	1861-2041
pMON5308	276	1895-2171	pMON5426	300	2220-2520
pMON5309	170	114-284	pMON5427	110	1701-1812
pMON5310	283	1595-1880	pMON5428	129	1548-1677
pMON5311	110	1812-1922	pMON5429	303	1292-1595
pMON5312	248	782-1030	Bttstart	264	l-264
pMON5314	291	2041-2305	Bttext	380	440-820
pMON5315	330	1157-1187	BttA2	267	250-517

Análisis por ordenador del gen de toxina insecticida de B.t.t.

Se obtuvo un total de 2615 pares de bases de secuencia a partir de pMON5420 y pMON5421. Un análisis por ordenador de la secuencia reveló un único marco de lectura abierto a partir del par de bases 205 a 2136. Haciendo referencia a la Figura 5, el gen de toxina insecticida de B.t.t. es de 1932 pares de bases, que codifican una proteína de 644 aminoácidos con un peso molecular de 73.091 daltones. La proteína tiene una carga neta de -17 y un contenido G-C de 34%.

Comparación entre genes de toxinas y proteína de tipo coleóptero y de tipo lepidóptero

Aunque las toxinas de tipo coleóptero y las toxinas de tipo lepidóptero son derivadas de Bacillus thuringiensis, hay diferencias significativas entre los genes de toxinas y las proteínas de toxinas de los dos tipos. En la medida en que se aislan a partir de Bacillus thuringiensis, ambos tipos de toxinas se encuentran en cristales parasporales; sin embargo, como se describió anteriormente, las propiedades de solubilidad de los cristales son distintivamente diferentes. Además, los tamaños de las proteínas de toxinas encontradas en los cristales solubilizados son completamente diferentes. Las proteínas de toxinas de tipo lepidóptero son típicamente del orden de 130 kDa, mientras que las proteínas de toxinas de tipo coleóptero son de aproximadamente 70 kDa.

El aislamiento y el análisis de la secuencia de DNA del gen de toxina de tipo coleóptero de B.t. tenebrionis predice la secuencia de aminoácidos de la proteína de toxina (véase la Figura 5). Tanto la secuencia de nucleótidos como la secuencia de aminoácidos derivados del gen de toxina de tipo coleóptero han sido comparados con la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una toxina típica de tipo lepidóptero. Esta comparación se realizó usando el programa de ordenador BESTFIT de Devereux et al. (1984) que emplea el algoritmo de Smith y Waterman (1981). BESTFIT obtiene una máxima alineación de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. BESTFIT calcula dos parámetros, calidad y relación, que pueden ser usados como medidores de alineaciones cuando se comparan alineaciones diferentes. La relación varía entre 0 y 1,0. Una relación mayor indica una mejor alineación (mayor similitud) entre dos secuencias.

La alineación BESTFIT muestra que los dos tipos de genes de toxinas están relacionados a un nivel tanto de secuencia de nucleótidos como de secuencia de aminoácidos. Sin embargo, la alineación muestra también que las dos secuencias son claramente distintas y poseen muchas regiones de desapareamiento a niveles de secuencias tanto de nucleótidos como de aminoácidos. Por ejemplo, la relación para la comparación de dos secuencias de aminoácidos es solamente 0,22. A nivel de la secuencia de nucleótidos, se obtiene una alineación máxima solamente mediante la introducción de muchos huecos en las dos secuencias, y la relación es solamente 0,072.

Hay muchos ejemplos secuenciaciones de genes de toxinas de tipo lepidóptero; una comparación similar entre estos genes ha mostrado que el gen de B.t. kurstaki HD-1 descrito por Schnepf et al. (1985) y el de B.t. kurstaki HD-73 descrito por Adang et al. (1985) representan los dos genes de toxinas de tipo lepidóptero más divergente. Por comparación con las relaciones calculadas anteriormente para la alineación del gen de tipo coleóptero y de tipo lepidóptero, la relación para la comparación de secuencia de aminoácidos de las dos proteínas de tipo lepidóptero más divergentes es 0,811, y la relación para estos dos genes de tipo lepidóptero al nivel de secuencia de nucleótidos es 0,755. Esto indica que aunque los genes de toxinas de tipo coleóptero y de tipo lepidóptero pueden estar relacionados por sus evolución, son bastante distintos en su secuencia tanto de nucleótidos como de aminoácidos.

Producción a nivel elevado de toxina de B.t.t. recombinante en E. Coli

Para facilitar la purificación de grandes cantidades de toxina de B.t.t. recombinante, fue necesario clonar el gen de B.t.t. en vectores de expresión elevada de E. Coli. Se usó mutagénesis dirigida al sitio para introducir un sitio de restricción NcoI en pMON5420 en el codón ATG al comienzo del marco de lectura abierto.

Mutagénesis dirigida al sitio

Se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para introducir nuevos sitios de restricción mediante el procedimiento de Kunkel (1985). Se introdujo el plásmido pMON5420 mediante transformación en E. Coli cepa BW313, que contiene las mutaciones dut^{-} y ung^{-} con el fin de incorporar desoxiuridina en el DNA. Se cultivó una única colonia transformada durante una noche en medio 2X YT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 0,25 \mug/ml de uridina. Se añadió una parte alícuota de 0,5 ml de este cultivo a 10 ml del mismo medio, y se incubó durante una hora a 37ºC con agitación vigorosa hasta una densidad de 0,23 (A600). Para introducir la formación de partículas de fagos que contienen una única hebra, se añadió fago helper M13K07 a una multiplicidad de aproximadamente 10, y se continuó la incubación durante una hora hasta una densidad de 0,4 (A600). El cultivo se diluyó mediante la adición de 30 ml del medio anterior, y se añadió kanamicina hasta una concentración final de 70 \mug/ml. La incubación se continuó durante 15 horas, en cuyo momento se separaron las células por centrifugación. Las partículas de fagos se precipitaron a partir de 25 ml de material sobrenadante mediante la adición de 5 ml de PEG al 20%/NaCl 2,5 M/50 \mug/ml de RNAasa A seguida de incubación en hielo durante 15 minutos. Los fagos se recuperaron mediante centrifugación y se disolvieron en 0,8 ml de tampón TE. Se aisló DNA a partir de las partículas mediante tres extracciones con 0,8 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) seguida de precipitación en etanol. El sedimento de DNA se disolvió en 100 \mul de agua hasta una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml (estimada mediante electroforesis en gel de agarosa).

Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la mutagénesis se pusieron en suspensión en agua a una concentración de aproximadamente 10 pmoles/\mul. Los oligonucleótidos fueron fosforilados utilizando polinucleótido quinasa T4 en una reacción que contenía 50 pmoles de oligonucleótido, ATP 1 mM, Tris-Cl 25 mM a pH 8, MgCl_{2} 10 mM, espermidina-HCl 0,2 mM, DTT 1 mM y 2 unidades de enzima. La reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos y seguidamente se calentó a 70ºC durante 5 minutos. El cebador fosforilado fue reasociado a la desoxiuridina que contenía DNA de fagos mezclando aproximadamente 1 pmol del DNA de fagos (2 \mug) con 10 pmoles de cebador en una reacción que contenía Tris-HCl 6,6 mM, MgCl_{2} 6,6 mM, NaCl 6,6 mM y DTT 5 mM. La mezcla se calentó a 70ºC durante siete minutos y seguidamente se enfrió lentamente a temperatura ambiente. El cebador/molde reasociado se usó como el sustrato para la síntesis de DNA circular cerrado, de doble hebra, mediante la adición de cada uno de dNTP a 0,5 mM, ATP a 0,5 mM, 5 unidades de DNA polimerasa del fragmento de Klenow y 400 unidades de T4 DNA ligasa (New England Biolabs). La reacción se llevó a cabo en las mismas sales tamponantes que para la reasociación a 15ºC, durante aproximadamente 15 horas. En este momento se añadieron 400 unidades adicionales de ligasa y se continuó la incubación durante dos horas.

Una mitad de la reacción se usó para transformar 0,15 ml de células JM101 tratadas con CaCl_{2}, y las células fueron extendidas en placas LB que contenían 100 \mug/\mul de ampicilina. Se recuperaron entre 30 y varios centenares de colonias para cada reacción de mutagénesis. Las colonias únicas fueron cultivadas durante una noche en ampicilina que contenía LB y se prepararon minipreparaciones de plásmidos mediante el procedimiento SDS alcalino. Los plásmidos fueron analizados en cuanto a la presencia del nuevo sitio de restricción y la presencia del sitio fue confirmada mediante análisis de secuencias, como se describió anteriormente.

Un plásmido que contenía un sitio NcoI (pMON9759) al comienzo del gen de toxina insecticida de B.t.t., fue generado mediante mutagénesis específica para el sitio. El cebador usado se muestra a continuación:

Sitio deseado	Cebador
NcoI	GATTGTTCGGATCCATGGTTCTTCCTCCCT

La generación del sitio NcoI en el N-terminal ha cambiado el segundo aminoácido de asparagina a ácido aspártico. Este cambio no afecta a la toxicidad hacia los insectos. Los sitios BamHI y StyI han sido generados también como una consecuencia de la introducción de este sitio NcoI. El plásmido que contiene el sitio NcoI ha sido denominado pMON9759. El fragmento NcoI-HindIII de 2,5 kb que contiene el pMON9759 del segmento que codifica la toxina fue seguidamente clonado en pMON5634 digerido con NcoI-HindIII para producir pMON5436. Haciendo referencia a la Figura 16, pMON5634 es un plásmido basado en pBR327 que contiene también el fago f1 origen de la replicación. El vector contiene un promotor recA sintético que es inducido por ácido nalidíxico. El gen 10 conductor del fago T7 (descrito en la solicitud de patente europea 87870039.2) está presente también para aumentar la expresión en E. Coli. Se añadió un conector sintético con múltiples sitios de clonación para la inserción de genes aguas abajo del promotor y la secuencia conductora del gen 10.

Para la inducción del promotor recA, cultivos de una noche fueron diluidos 1:50 en medios mínimos M9 (Miller, 1972) añadiéndose casaminoácidos al 0,2% y glucosa al 0,25%. En las unidades de Klett 150, se añadió ácido naladíxico a 50 \mug/ml, y las células fueron recolectadas 3 horas después de la inducción. El nivel de toxina de B.t.t. producida por pMON5436 inducido por ácido nalidíxico se comparó con el pMON5420 inducido por IPTG mediante análisis en SDS-PAGE. El gel teñido con azul de Coomassie no reveló B.t.t. detectable producido por pMON5420, mientras que el nivel de B.t.t. producido por pMON5436 fue aproximadamente un 5% de la proteína total. Esta construcción se usó para aislar grandes cantidades de proteínas de toxinas de B.t.t. recombinante para investigar los niveles de toxicidad, la especifidad para los insectos y el modo de acción.

Caracterización de toxina de B.t.t. Identificación del número y origen de las proteínas de B.t.t.

La B.t. var. tenebriones produce un cierto número de proteínas de toxinas de tipo coleóptero, presentes en cristales de proteínas, que son producidas de forma co-incidental con la esporulación (véase la Figura 6). Estos cristales de proteínas son liberados en los medios y células autolisadas durante o con posterioridad a la esporulación. Para determinar el número de proteínas de toxinas producidas por B.t. var. tenebriones, se cultivaron cultivos de 500 ml de este organismo en matraces de 2 litros en medio TSB al 15% en tampón de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES) 100 mM, pH 7,0, a 30ºC durante 7 días. En este momento, los cultivos han esporulado y las células están lisadas. Los cristales de proteínas y las esporas fueron cultivados mediante centrifugación a 20.000 x gravedad (g) durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos fueron lavados tres veces con agua en exceso, a lo que siguieron tres lavados con NaCl 2 M. El sedimento resultante se almacenó a 4ºC en agua más acida de sodio al 0,02%. La proteína de toxina de B.t.t. se solubilizó a partir de los cristales poniendo en suspensión el sedimento en tampón de carbonato de sodio 100 mM, pH 10, y agitando esta suspensión durante dos horas a temperatura ambiente. Después de una centrifugación a 20.000 x g durante 20 minutos para separar los materiales insolubilizados, el material sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum para separar cualesquiera esporas restantes. La proteína de toxina de B.t.t. preparada de esta manera, como también los cristales solubilizados en Tris-HCl 125 mM, SDS al 4%, glicerol al 20% y 2-mercaptoetanol al 10%, pH 6,8, (tampón de muestra SDS usado para preparar muestras para análisis SDS-PAGE), está comprendida por cuatro proteínas principales y diferentes, según se estimó mediante análisis SDS-PAGE. Cinco únicos productos fueron identificados mediante análisis de aminoácidos N-terminales. Para determinar si la totalidad de estas cinco proteínas derivaban del mismo gen, o si se requieren dos o más genes para su síntesis, se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminales de cada una de estas proteínas usando química de degradación de Edman automática.

Se empleó un secuenciador en fase gaseosa modelo 470A de la empresa Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) (Hunkapiller, et al., 1983). Los respectivos derivados de PTH-aminoácido fueron identificados mediante análisis RP-HPLC de una forma en línea, empleando un análisis PTH modelo 120A de Applied Biosystems, Inc., equipado con una columna PTH-C18 de 2,1 mm de D.I. (diámetro interno) Broownlee. La determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminales de cada proteína establecerá si estas proteínas derivan del gen de toxina de B.t.t. anteriormente descrito.

La estrategia para secuenciar estas proteínas fue secuenciar proteínas de toxina de B.t.t. que correspondían a las bandas 1 y 3 (véase la Figura 6) del clon de E. Coli JM101 (pMON5436), bandas 2, 3 y 4, mediante electro-elución de las proteínas producida por B.t. var. tenebriones a partir de geles SDS-PAGE. La secuencia de B.t.t. 1 y 3 se determinó con proteínas purificadas a partir de JM101 (pMON5436). El JM101 (pMON5436), así como las demás construcciones de E. Coli (pMON5450, 5456 y 5460, infra) produce el B.t.t. en forma de estructuras refráctiles insolubles después de que los cultivos son inducidos para una expresión de nivel elevado. Las construcciones de E. Coli fueron cultivadas en medios M9 modificados a 37ºC. Se usó un cultivo cultivado durante una noche para inocular 400 ml de los medios M9 modificados en matraces fernbach de 2,4 l hasta una densidad de partida inicial de 10 unidades Klett. Se añadió ácido nalidíxico, en NaOH 0,1 N, a los cultivos, a 100 unidades Klett, hasta una concentración final de 50 \mug/ml, para inducir la expresión de proteína de toxina de B.t.t. Después de 4 horas adicionales de incubación, los cultivos fueron recolectados por centrifugación a 20.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos celulares fueron puestos en suspensión en agua hasta una densidad equivalente a 5000 unidades Klett por ml, y fueron sonicados en un baño con hielo, con un sonicador "Heat Systems Ultrasonics" a una potencia de 9, ciclo de servicio de 50%, durante un total de 5 minutos. La preparación sonicada se centrifugó durante 20 minutos a 20.000 x g a 4ºC. Los sedimentos, que contenían estructuras refráctiles y debris celular, fueron lavados dos veces con agua fría y puestos en suspensión a 10.000 equivalentes de unidades Klett por ml en agua más sulfolano al 25%. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, las preparaciones de estructuras refráctiles solubilizadas fueron centrifugadas nuevamente a 20.000 x g a 4ºC para separar materiales sin solubilizar. Se añadió Tris-HCl a la materia sobrenadante hasta una concentración final de 50 mM, pH 7,6. Las bandas 1 y 3 de B.t.t. fueron purificadas conjuntamente en una columna de intercambio iónico HR5/5 MonoQ usando un gradiente de 75 a 200 mM de NaCl en Tris-HCl 50 mM, sulfolano al 25%, pH 7,6. Las fracciones que contenían las bandas 1 y 3 de B.t.t. fueron identificadas mediante análisis SDS-PAGE al 9%, fueron reunidas, dializadas en tampón a pH 10 de carbonato de sodio 100 mM y concentradas en concentradores Amicon centricon. La proteína de toxina de B.t.t. que correspondía a la banda 3 fue purificada a partir de JM101 (pMON5456) de una manera análoga.

Las bandas que correspondían a 2 solamente y las bandas 3, 3' y 4 (véase la Figura 6, combinadas, fueron electroeluidas a partir de geles de placas SDS-PAGE al 7%, que se realizaron con 48 \mug de cristales de B.t.t. solubilizados en tampón de carbonato de sodio 100 mM, ditioteitol (DTT) 20 mM, a pH 10. Los geles fueron teñidos durante 10 minutos en azul de Coomassie R250 y fueron desteñidos en metanol al 50%, ácido acídico al 10% durante 20 minutos. Las bandas apropiadas fueron cortadas con una hoja de afeitar y la proteína de B.t.t. fue electro-eluida. Conociendo la secuencia de aminoácidos, deducida de la secuencia de DNA del gen de toxina de B.t.t. clonado en E. Coli, se identificaron la totalidad de los N-terminales de estas proteínas únicas (Figura 7).

Las proteínas correspondientes a las bandas 1 y 3 se originan a partir de 2 sucesos de iniciación traduccional independientes, que comienzan en la metionina en las posiciones 1 y 48 (Figuras 6 y 7), respectivamente. Las proteínas que corresponden a las bandas 2, 3 y 4 de B.t.t., observadas solamente en B.t. var. tenebriones y no en construcciones de E. Coli, surgieron aparentemente a partir de la escisión proteolítica de cualquiera de las bandas 1 ó 3. Estos resultados establecen que la totalidad de las cinco proteínas se originan a partir del mismo gen.

Purificación de las bandas 1 y 3 de B.t.t. para ensayar la toxicidad hacia insectos

Las proteínas de B.t.t. producidas en E. Coli que corresponden a las bandas 3 y 1 más 3, que fueron solubilizadas en sulfolano al 25% y purificadas mediante cromatografía MonoQ para un análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminales, no mostraron toxicidad hacia insectos frente a insectos del escarabajo de la patata del Colorado. En experimentos posteriores, se demostró que el sulfolano por sí mismo inactiva el B.t.t. Por lo tanto, se desarrolló un procedimiento de purificación alternativo y se usó para comparar las toxicidades insecticidas relativas de las bandas 1 y 3 de B.t.t. producidas en E. Coli, comparada con el B.t.t. solubilizado a partir de cristales nativos de B.t. var. tenebriones. Los cultivos fueron cultivados, inducidos, recolectados y se aislaron estructuras refráctiles como se describió anteriormente. Las diversas proteínas de B.t.t. fueron solubilizadas en las estructuras refráctiles usando carbonato de sodio 100 mM, pH 10. La toxina de B.t.t. solubilizada, concentrada usando células agitadas Amicon con membranas YM-10, se purificó en una columna FPLC de filtración sobre gel, de Pharmacia Superose-12, que separa las bandas 1 y 3 de B.t.t. y de otras proteínas contaminantes. Las fracciones apropiadas, basadas en un análisis SDS-PAGE, fueron reunidas, concentradas y se usaron para experimentos de toxicidad hacia insectos con insectos de escarabajo de la patata del Colorado. Las proteínas correspondientes a la banda 1 (pMON5436), banda 1 (pMON5460) y banda 3 (pMON5456) tenían una pureza mayor que 90% basada en un análisis SDS-PAGE. La banda 1, producida por pMON5460, tiene isoleucina en el aminoácido 48 en lugar de metionina (véase a continuación).

Para obtener toxina de proteína nativa a partir de B.t. var. tenebriones para comparaciones de toxicidad, se aislaron cristales nativos y se purificaron usando centrifugación con gradientes de sacarosa como se describió anteriormente. Los cristales fueron solubilizados en carbonato de sodio 100 mM, DTT 20 mM, pH 10, y se usaron para ensayos de toxicidad hacia insectos.

Todas las preparaciones de proteínas de toxinas de B.t.t. y los testigos para el ensayo con insectos contenían 0,3% de Tween 20, un tensioactivo que aumenta la capacidad de estas soluciones para unirse a las hojas de tomate. Los experimentos de toxicidad hacia insectos se realizaron revistiendo a fondo las superficies superior e inferior de hojas de tomate cortadas de 3 a 4 semanas antes, con soluciones tamponantes que contenían las proteínas de B.t.t. designadas a las concentraciones de proteínas indicadas. Después de que las soluciones se secaron con aire sobre la superficie de las hojas de tomate, una única hoja y 10 insectos de escarabajos de la patata del Colorado fueron colocados en una placa de petri y se incubaron a 22ºC durante 4 días. Se determinó el número de insectos muertos y los resultados de toxicidad se expresaron como % de mortalidad corregida (% CM); según la fórmula de Abbott anteriormente descrita. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y todos, excepto la banda 1 de B.t.t. para pMON5460, fueron repetidos en días diferentes. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla de a continuación.

TABLA V Toxicidad de proteínas de B.t.t. frente al escarabajo de la patata del Colorado

Muestra	Concentración (\mug/ml)	Mortalidad corregida (%)
B.t.t. solubilizada	100	100
	20	70
	4	10
Banda 1 purificada	100	87
(pMON5436)	20	68
	10	34
Banda 1 purificada	100	67
(pMON5460)	20	72
	10	44
Banda 3 purificada	100	91
(pMON5456)	20	64
	10	32

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La toxicidad relativa de proteínas purificadas de diferentes construcciones de E. Coli fueron comparadas con cristales de B.t.t. nativo solubilizados. La banda 1 (pMON5436) y la banda 3 (pMON5456) fueron purificadas como se ha descrito. La banda 1 (pMON5460) fue purificada usando cromatografía de filtración sobre gel. Los cristales de B.t.t. nativos fueron solubilizados en Na_{2}CO_{3} 100 mM, pH 10.

Las cantidades de toxina de B.t.t. requeridas para destruir un 50% de los insectos de escarabajos de la patata del Colorado fueron esencialmente idénticas a la banda 1 de B.t.t. aislada a partir de pMON5436 y pMON5460 y la banda 3 de B.t.t. aislada a partir de pMON5456 (Tabla V). Análogamente, todas estas preparaciones de B.t.t. purificadas a partir de E. Coli demostraron toxicidades esencialmente idénticas a las observadas con la toxina nativa solubilizada en carbonato de sodio de B.t. var. tenebriones.

Determinación de fragmentos tóxicos de proteínas de toxina de B.t.t.

Diversos grupos (Schnepf et al. 1985, Hofte et al. 1986 y Wabiko et al. 1986) han descrito que las truncaciones C-terminales de las toxinas de tipo lepidóptero no reducen la toxicidad (de los 1155 aminoácidos, una truncación hasta 607 aminoácidos no dio lugar a una pérdida de toxicidad). Por lo tanto, la mitad de los C-terminales de la proteína no son necesarios para la toxicidad. Otros han descrito también que los genes de toxinas de tipo lepidóptero que contienen deleciones C-terminales están más altamente expresados en plantas transformadas. Hay también descripciones de que para retener la toxicidad, solo se pueden hacer pequeñas truncaciones en el N-terminal (Schnepf et al. 1985, y Hofte et al. 1986). Contrariamente a estas explicaciones, se ha encontrado ahora que la toxina de tipo coleóptero de B.t.t. tiene propiedades sustancialmente diferentes. Es decir, la parte del C-terminal parece ser crítica para la toxicidad, permitiendo por lo tanto que no haya esencialmente truncaciones. Sin embargo, se pueden hacer deleciones N-terminales y mantener la toxicidad. Estas diferencias se pusieron de manifiesto usando las construcciones descritas a continuación:

Construcción de pMON5426 (deleción en BglII/BamHI)

pMON5420 fue digerido con BglII y BamHI, ligado y transformado en JM101 para crear pMON5426. Esta deleción se construyó para confirmar que el sitio BglII no estaba dentro de la región codificadora del gen de toxina de B.t.t.

Construcción de pMON5438 (HPaI, deleción C-terminal de 463 bp)

pMON5420 fue digerido con HpaI y ligado con el siguiente conector terminador sintético. El conector contiene codones sin sentido en cada marco de lectura y un saliente BglII en 5'.

5'-TAGTAGGTAGCTAGCCA-3'

3'-ATCATCCATCGATCGGTCTAG-5'

La ligadura fue digerida con BglII, para separar múltiples insertos de conector, y seguidamente re-ligada. La ligadura fue transformada en JM101 y se aisló pMON5430. Para generar un sitio NcoI al comienzo del gen truncado, al fragmento PstI de 2,32 kb de pMON5430 y la nueva construcción fue designada pMON5434. El fragmento NcoI/HindIII de 1,57 kb de pMON5434 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634, para crear pMON5438.

Construcción de pMON5441 (EcoRV, deleción C-terminal de 327 bp)

pMON5420 fue digerido con EcoRV y ligado con el conector terminador sintético. La ligadura fue digerida con BglII, para separar múltiples insertos de conector, y seguidamente re-ligada. La ligadura fue transformada en JM101 y se aisló pMON5431. Para generar un sitio NcoI al comienzo del gen truncado, el fragmento PstI de 2,32 kb de pMON9759 fue sustituido con el fragmento Pst de 1,61 kb de pMON5431, y la nueva construcción fue designada pMON5435. El fragmento Nco(/HindIII de 1,71 kb de pMON5435 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5433 para crear pMON5441.

Construcción de pMON5449 (Bal31, deleción C-terminal de 190 bp)

pMON9759 digerido con BglII fue tratado con Bal31 nucleasa durante 5 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA fue tratado por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y purificado de la agarosa mediante el procedimiento de congelación-descongelación. El conector terminador sintético fue ligado seguidamente al DNA purificado y se aisló pMON5442. El fragmento NcoI/GblII de pMON9759 fue sustituido con el fragmento del gen truncado de pMON5442 para crear pMON5445. El fragmento NoI/HindIII de pMON5445 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5449. El punto final en la deleción creada Bal31 fue determinado mediante análisis de secuencia de DNA.

Construcción de pMON5448 (XmnI, deleción C-terminal de 16 bp)

pMON5436 fue digerido con XmnI y ligado con el conector terminador sintético. La ligadura se digirió seguidamente con NcoI y BglII, y el fragmento NcoI/BglII de 1.92 kb que contenía en gel truncado fue clonado en NcoI y pMON9759 digirió con BlgII para sustituir el gen de longitud completa y crear pMON5446. El fragmento NcoI/HindIII de pMON5446 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5448.

Construcción de pMON5450 (extremos de relleno, separación del primer ATG de ORF de toxina

pMON5436 fue digerido con NcoI, los extremos rellenados usando fragmento Klenow de DNA polimerasa, ligados y transformados en JM101 para crear pMON5450. Este plásmido expresa solamente proteína de la banda 3.

Construcción de pMON5452 (deleción N-terminal de 224 bp)

El gen de B.t.t. contiene dos sitios StyI (227 y 1587) y se añadió un tercer sitio mediante la mutagénesis para crear un sitio NcoI en pMON9759. Se realizaron los siguientes experimentos para eliminar DNA de B.t.t. en 5' al par de bases 227. pMON5434 (derivado de la deleción en Hpal anteriormente descrita) fue digerido con StyI, los extremos rellenados con DNA polimerasa Klenow, ligados y transformados en JM101 para aislar pMON5444. Esta manipulación destruye los dos sitios de escisión NcoI y StyI. Esta manipulación crea una fusión en el marco con la primera metionina (aminoácido 1) y lecucina (aminoácido 77). El C terminal del gen fue añadido clonado el fragmento NdiI/KpnI de 1.9 kb de pMON9759 en pMON5444 para crear pMON5452.

Construcción de pMON5456 (mutante en banda 3, deleción N-terminal de 140 bp)

Se introdujo un sitio NcoI en pMON5420 en el ATG para la banda 3 mediante mutagénesis dirigida al sitio como se describió anteriormente usando el cebador:

Cebador de mutagénesis - BTTLOOP

CGTATTATTATCTGCATCCATGGTTCTTCCTCCCT

para crear pMON5455. La mutagénesis eliminó también la secuencia aguas arriba que codifica los 48 aminoácidos
N-terminales de la banda 1. El fragmento Nco/HindIII de pMON5455 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5456. La generación del sitio NcoI cambia el segundo aminoácido de tionina a ácido aspártico.

Construcción de pMON5460 (gen de la banda 1 mutante con MET48 cambiado a ILE)

El codón para metionina en la posición 48 en pMON9759 fue cambiado a un codón para isoleucina mediante mutagénesis dirigida al sitio, como se describió anteriormente, usando el cebador:

Cebador de mutagénesis - BTTMET

ATTATTATCTGDAGTTATTCTTAAAAACTCTTTAT

para crear pMON5458. El fragmento Nco/HindIII de pMON5458 fue clonado en el vector de expresión elevada de
E. Coli pMON5634 para crear pMON5460. Separando el codón ATG que inicia la traducción de la proteína de la banda 3, pMON5460 produce solamente proteína de la banda 1, con un residuo de isoleucina en la posición 48.

Construcción de pMON5467 (mutante en la banda 5, deleción N-terminal de 293 bp)

Se introdujo un sitio NcoI en pMON5420 para crear una deleción N-terminal de noventa y ocho aminoácidos mediante mutagénesis dirigida al sitio, usando el cebador:

Cebador de mutagénesis

TCACTTGGCCAAATTGCCATGGTATTTAAAAAGTTTGT

para crear pMON5466. Una metionina y una alanina fueron isertadas también mediante la mutagénesis. El fragmento NcoI/HindIII de pMON5466 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5467.

Resultados de toxicidad hacia insectos Truncaciones C-terminales

La actividad de la toxina para coleópteros se determinó usando escarabajos de la patata del Colorado recientemente eclosionados en un ensayo de alimentación con hojas de tomate anteriormente descrito. Los genes de B.t.t. mutantes usados para el análisis del C-terminal se muestran en las Figuras 8 y 10. pMON5438 contiene 490 aminoácidos de la proteína de toxina de B.t.t. más 3 aminoácidos codificados por el conector usado en la construcción del vector. La proteína truncada se produjo a niveles elevados en E. Coli, pero no tenía actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5441 produce una proteína que contiene 536 aminoácidos de la toxina de B.t.t. La proteína truncada se produjo a niveles elevados en E. Coli, pero no tenía actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5449 contiene 582 aminoácidos de la proteína de B.t.t. más dos aminoácidos codificados por el conector usado en la construcción del vector. La proteína truncada se produjo a niveles elevados en E. Coli, pero no tuvo actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5448 contiene 640 aminoácidos de la proteína de B.t.t. más 2 aminoácidos codificados por el conector usado en la construcción del vector. La proteína truncada se produjo a niveles muy elevados mediante E. Coli, pero la proteína no tenía actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. Estos resultados sugieren que el C terminal de la proteína de toxina de B.t.t. es necesario para la toxicidad hacia el escarabajo de la patata del Colorado. Una deleción de solamente 4 aminoácidos (pMON5448) dio lugar a una pérdida completa de actividad. Estos resultados son directamente contrarios a la bibliografía descrita con respecto a toxinas de B.t.t. de tipo lepidóptero.

Resultados de mutaciones y deleciones N-terminales

Los demás genes de B.t.t. mutantes usados para el análisis de los N terminales se muestran en las Figuras 9 y 10. Un análisis de la proteína producida por pMON5450 reveló que la producción de la banda 3 en E. Coli fue debida a la iniciación de la traducción en MET48 en lugar de un producto de escisión de proteasa. Estudios de toxicidad mostraron también que la banda 3 era tóxica. pMON5456 produce una proteína que comienza en el aminoácido 48, con el aminoácido 49 cambiado de treonina a ácido aspártico. Esta proteína se produjo a niveles elevados en E. Coli y era tóxica hacia el escarabajo de la patata del Colorado. pMON5452 produce una proteína que comienza en el aminoácido 77. Esta proteína fue expresada en E. Coli, y tenía actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5467 produce una proteína que comienza en el aminoácido 99 y tiene dos aminoácidos añadidos al N terminal (metionina y alanina). Esta proteína se produjo en E. Coli y no exhibió actividad detectable frente al escarabajo de la patata del Colorado, sin embargo, el nivel de expresión de esta variante de deleción fue significativamente inferior al de las demás variantes. Estos resultados sugieren que el N terminal de la proteína de toxina de B.t.t. puede tolerar deleciones. Una deleción de 76 aminoácidos exhibió toxicidad. Una deleción de 99 aminoácidos, sin embargo, dio lugar a una pérdida de toxicidad. pMON5460 contiene una mutación que cambió metionina en la posición 48 a isoleucina para impedir la producción de la banda 3. La toxicidad de la banda 1 producida por pMON5460 fue igual a la toxicidad de la banda 3 producida por pMON5456.

Construcción de vectores de transformación de plantas

El gen de toxina de B.t. var. tenebriones contenido en pMON5420 fue modificado para la incorporación en vectores de expresión de plantas. Se introdujo in situ BglII justo aguas arriba del codón ATG, que especifica la iniciación de la traducción de la proteína de toxina de B.t.t. de longitud completa (denominada banda 1) usando el protocolo de mutagénesis específico para el sitio de Kunkel (1985) como se describió anteriormente. La secuencia del gen de toxina de B en la región del iniciador ATG es:

ATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGAATCCGAACAATCGAAGTGAACATGATACAATA

\hfill

MetAsnProAsnAsnArgSerGluHisAspThrIle

El cebador para esta mutagénesis (bttbgl) era de una longitud de 27 nucleótidos, y tiene la secuencia:

CGGATTCATT TTAGATCTTC CTCCCTT

A continuación de la mutagénesis, un plásmido que contenía el nuevo sitio BglII fue identificado mediante digestión con BGlII, y el cambio fue verificado mediante análisis de secuencia de DNA. El plásmido resultante contenía el gen de toxina de B.t.t., en el que el nuevo sitio BglII fue designado pMON9758 (Figura 11).

El gen de toxina de B.t.t. en pMON9758 fue insertado en el vector cassette de expresión pMON316 (Sanders et al., 1987). pMON316 contiene el promotor CaMV35S y el extremo 3' del gen nopalina sintasa (NOS) con un sitio BglII para la inserción de genes entre estos dos elementos. El plásmido pMON9758 fue digerido con BglII, y se aisló un fragmento de aproximadamente 2,3 kb. Este fragmento se extiende desde el sitio BGlII justo aguas arriba del codón ATG hasta un sitio BglII que se encuentra aproximadamente 350 bp aguas abajo del codón de terminación para el gen de toxina de B.t.t. Por tanto, este fragmento contiene la secuencia codificadora completa del gen de B.t.t. y también aproximadamente 350 bp de secuencia no codificadora 3' respecto al codón de terminación. Este fragmento BGlII fue ligado con pMON316 digerido con BglII. A continuación de la transformación en E. Coli, se identificó una colonia en la que el gen de toxina de B.t.t. fue insertado en pMON316, de forma que el extremo 5' del gen de toxina era adyacente al promotor CaMV35S. Este plásmido fue designado pMON9753. Se aisló un plásmido que contenía el gen de toxina de B.t.t. en la orientación opuesta en pMON316 y fue designado pMON9754 (Figura 11).

Tanto pMON9753 como pMON9754 fueron introducidos mediante un procedimiento de apareamiento triparental en la cepa Agrobacterium tumefaciens ASE que contiene un plásmido Ti desarmado. Los cointegrados entre pMON9753 o pMON9754 y el plásmido Ti desarmado fueron identificados como se describe por Fraley et al. (1985), y sus estructuras fueron confirmadas mediante análisis Southern de DNA de Agrobacterium total.

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Han sido construidos también vectores de expresión de plantas adicionales que contienen el gen de toxina de B.t.t. (véanse las Figuras 12 y 13). En estos vectores, el gen de toxina de B.t.t. ha sido insertado en el vector de expresión de plantas pMON893 (Figura 14). Haciendo referencia a la Figura 14, el cassette de expresión pMON893 consiste en el promotor CaMV35S intensificado y el extremo 3' que incluye señales de poliadenilación a partir de un gen de soja que codifica la subunidad alfa-prima de beta-conglicina (denominada a continuación el "gen 7S"). Entre estos dos elementos está un multi-conector que contiene múltiples sitios de restricción para la inserción de genes.

El promotor CaMV35S intensificado fue construido como sigue. Un fragmento del promotor CaMV35S que se extiende entre la posición -343 y +9 fue previamente construido en pUC13 por Odell et al. (1985). Este segmento contiene una región identificada por Odell et al. (1985) que es necesaria para una expresión máxima del promotor CaMV35S. Fue cortada como un fragmento ClaI-HindIII, rematado en el extremo con DNA polimerasa I (fragmento Klenow) y se insertó en el sitio HindII de pUC18. La región aguas arriba del promotor 35S se cortó de este plásmido en forma de un fragmento HindIII-EcoRV (que se extiende desde -343 hasta -90) y se insertó en el mismo plásmido entre los sitios HindIII y PstI. Por tanto, el promotor CaMV35S intensificado contiene una duplicación de secuencias entre -343 y -90 (véase la Figura 18).

El extremo 3' del gen 7S deriva del gen 7S contenido en el clon designado 17,1 (Schuler et al., 1982). Este fragmento del extremo 3', que incluye las señales de poliadenilación, se extiende desde un sitio AvaII colocado aproximadamente 30 bp aguas arriba del codón de terminación para el gen beta-conglicinina en el clon 17,1 hasta un sitio EcoRI colocado aproximadamente 450 bp aguas abajo de este codón de terminación.

El resto del pMON893 contiene un segmento de pBR322 que proporciona un origen de replicación en E. Coli y una región para la recombinación homóloga con el T-DNA desarmado en la cepa Agrobacterium ACO (descrita a continuación). La región oriV del plásmido RK2 para un amplio espectro de hospedantes; el gen de resistencia a la estreptomicina/resistencia a la esprectinomicina de Tn7; un gen NPTII quimérico, que contiene el promotor CaMV35S y el extremo 3' nopalina sintasa (NOS), que proporciona resistencia a la kanamicina en células transformadas de la planta.

pMON9753 contenía aproximadamente 400 bp de secuencia no codificadora 3' más allá del codón de terminación. Como esta región no es necesaria para la producción de toxinas, se separó de los segmentos de genes de toxinas de B.t.t. insertados en pMON893. Con el fin de crear un gen de toxina de B.t.t. que no contenga la secuencia flanqueante en 3', se introdujo un sitio BglII justo después del codón de terminación mediante el procedimiento de Kunkel (1985). La secuencia del gen de toxina de B.t.t. alrededor del codón de terminación es:

GTTTATATAGACAAAATTGAATTTATTCCAGTGAATTAAATTAACTAGAAAGTAAAGAAG

ValTyrIleAspLysIleGluPheIleProValAsnEnd

La mutagénesis se realizó con un cebador (bttcterm) de secuencia:

CTTTCTAGTT AAAGATCTTT AATTCACTG

La mutagénesis del gen de toxina de B.t.t. se realizó en pMON9758. Un plásmido que contiene el nuevo sitio BglII se designó pMON9787 (Figura 12). Como pMON9787 contiene un sitio BglII justo aguas arriba del codón de iniciación ATG, la secuencia codificadora completa para el gen de toxina de B.t.t., esencialmente sin secuencia flanqueadora 5' o 3', está contenida en un fragmento BglII de aproximadamente 1940 bp.

Este fragmento de 1940 bp se aisló a partir de pMON9787 y se ligó con pMON893 digerido con BglII. Un plásmido en el que el extremo 5' del gen de toxina de B.t.t. era adyacente al promotor CaMV35S intensificado fue identificado y designado pMON9791 (Figura 12).

Una variante de la toxina de B.t.t. de longitud completa se produce en E. Coli a partir de un segundo codón iniciador de metionina. Esta proteína, designada "banda 3", se ha encontrado que es tóxica hacia el escarabajo de la patata del Colorado en forma de la toxina de longitud completa ("banda 1"). Es posible, como era el caso para el gen de B.t.k., que las formas truncadas del gen de B.t.t. puedan ser más fácilmente expresadas en células de plantas. Por lo tanto, se construyó un gen de toxina de B.t.t. modificado en el que la región aguas arriba del codón ATG de la banda 3 había sido separada. con el fin de separar esta secuencia, se insertó un sitio BglII justo aguas arriba de la ATG de la banda 3 mediante el procedimiento de Kunkel (1985). La secuencia que rodea a la ATG de la banda 3 es:

CCAAATCCAACACTAGAAGATTTAAATTATAAAGAGTTTTTAAGAATGACTGCAGATAAT

ProAsnProThrLeuGluAspLeuAsnTyrLysGluPheLeuArgMetThrAlaAspAsn

La mutagénesis se realizó con cebador (bttnterm) de secuencia:

ATCTGCAGTC ATTGTAGATC TCTCTTTATA ATTT

\newpage

La mutagénesis con este cebador se realizó sobre el gen de toxina de B.t.t. contenido en pMON5420. Un plásmido que contenía el nuevo sitio BglII fue designado pMON9788. Un gen de toxina de B.t.t. truncado que comenzaba en este sitio BglII de la banda 3, y que se extendía hasta el sitio BglII justo distal al codón de terminación encontrado en pMON9787, fue construido en pMON893 como sigue. pMON9788 (Figura 13) fue digerido con BglII y XbaI, y se aisló un fragmento de aproximadamente 1250 bp. Este fragmento se extiende desde la ATG de la banda 3 hasta un sitio XbaI único en el medio del gen de toxina de B.t.t. pMON9787 fue digerido también con BglII y XbaI, y se aisló un fragmento de aproximadamente 550 bp. Este fragmento se extiende desde el sitio XbaI único en el medio del gen de la toxina hasta el sitio BglII justo distal al codón de terminación. Estos dos fragmentos fueron mezclados y ligados con pMON983 digerido con BglII. Se identificó un plásmido en el que el extremo 5' respecto al gen de toxina era adyacente al promotor CaMV35S intensificado y fue designado pMON9792. pMON9792 contiene un derivado truncado N-terminal del gen de toxina de B.t.t. (Figura 13) que codifica solamente la banda 3.

Tanto pMON9791 como pMON9792 fueron introducidos en la cepa A. tumefaciens ACO que contiene un plásmito Ti desarmado. Los cointegrados han sido seleccionados y han sido usados en la transformación de tomate y patata.

ACO es una cepa desarmada similar a pTiB6SE descrita por Fraley et al. (1985). Para la construcción de ACO, la cepa Agrobacterium de partida era la cepa A208, que contiene un plásmido Ti de tipo nopalina. El plásmido Ti fue desarmado de una manera similar a la descrita por Fraley et al. (1985) de forma que esencialmente todo el T-DNA nativo fue separado, excepto el borde izquierdo y unos pocos centenares de pares de bases de T-DNA dentro del borde izquierdo. El resto del T-DNA que se extiende hasta un punto justo más allá del borde derecho, fue sustituido con un nuevo trozo de DNA que incluye (de izquierda a derecha) un segmento de pBR322, la región oriV de plásmido RK2, y el gen resistente a la kanamicina de Tn601. Los segmentos pBR322 y oriV son similares a los segmentos en pMON893, y proporcionan una región de homología para la formación de cointegrados. La estructura del plásmido Ti de ACO se muestra en la Figura 17.

Gen quimérico de toxina de B.t.t. que usa un promotor MAS

El promotor MAS fue aislado a partir de pTiA6 en forma de un fragmento EcoRI-ClaI de 1,5 kb. Este fragmento de DNA se extiende desde el sitio ClaI en el nucleótido 20.138 hasta el sitio EcoRI en 21.631 en la secuencia de Barker et al. (1983). Haciendo referencia a la Figura 15, el fragmento EcoRI-ClaI fue ligado con el vector binario pMON505 (Horsch et al. 1986), que había sido previamente digerido con EcoRI y ClaI. El plásmido resultante se designó pMON706. Un fragmento que contenía el extremo 3' de NOS fue insertado aguas abajo del promotor MAS para obtener un vector cassette de expresión en 3' MAS-NOS. El fragmento en 3' NOS fue cortado de pMON530 en forma de un fragmento BglII-BamHI de 300 bp, y fue insertado en pMON706 digerido con BglII. El plásmido resultante fue designado pMON707.

El plásmido pMON530 fue construido mediante escisión de pMON200 con NdeI para separar un fragmento NdeI de 900 bp para crear pMON503. El plásmido pMON503 fue escindido con HindIII y SmaI y se mezcló con plásmido pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, 1985) que había sido escindido también con HindIII y SmaI. Un plásmido que contenía el fragmento HindIII-SmaI de 3,8 kb de pTJS75 unido al fragmento HindIII-SmaI de 8 kb de pMON503 fue aislado y designado pMON505. A continuación el cassette CaMV35S-NOS3' fue transformado en pMON505 mediante escisión de pMON316 con StuI y HindII y aislamiento del fragmento StuI-HindIII de 2,5 kb que contenía el marcador NOS-NPTII'-NOS y el cassette CaMV35S-NOS3'. Este se añadió a pMON505 DNA escindido con StuI y HindIII. A continuación de la ligadura y transformación, un plásmido que portaba el cassette CaMV35S-NOS3' en pMON505 fue aislado y designado pMON530.

Como algunos vectores binarios tienen frecuencias grandemente reducidas de transformación en tomate si se compara con vectores co-integrantes, (McCormick et al., 1986), el cassette MAS-NOS 3' fue trasladado desde pMON707 al vector co-integrante pMON200 (Fraley et al., 1985). El plásmido pMON200 fue digerido con StuI y HindIII y se aisló un fragmento de 7,7 kb mediante electroforesis en gel de agarosa. El plásmido pMON707 fue análogamente digerido con StuI y HindIII, y se aisló un fragmento StuI-HindIII de 3,5 kb que contenía el cassette MAS-NOS 3' mediante electroforesis sobre gel de agarosa y recuperación sobre unas membranas DEAE con posterior elución con NaCl 1 M. Estos dos fragmentos de DNA fueron ligados, y el plásmido resultante fue designado pMON9741 (Figura 15). Este plásmido contiene el cassette MAS-NOS 3' en el fondo co-integrante de pMON200.

Los genes quiméricos de toxina de B.t.t. guiados por el promotor MAS se preparan mediante digestión de cualquiera de pMON9791 o pMON9792 con BglII, recuperando el fragmento codificador de toxinas y trasladando este fragmento en pMON9741, siguiendo las explicaciones proporcionadas en la presente memoria descriptiva.

Estos vectores intermedios pueden ser usados para transformar plantas que exhiben toxicidad hacia insectos coleópteros susceptibles a la proteína de toxina de B.t.t.

\newpage

Expresión de gen de toxina hacia coleópteros en plantas Transformación de plantas de tomate

Las cepas A.tumefaciens pMON9753-ASE y pMON9754-ASE fueron usadas para transformar discos de hojas de tomate mediante el procedimiento de McCormick et al. (1986). Las plantas de tomate transformadas fueron recuperadas como se describe y se ensaya para la resistencia a la kanamicina.

Toxicidad hacia insectos de plantas de tomate transgénicas

Plantas de tomate transformadas con gen de toxina de B.t.t. contenido en pMON9753 fueron ensayadas en cuanto a la expresión del gen de toxina mediante bioensayo con insectos de escarabajos de la patata del Colorado (Leptinotarsa decemlineata). Cortes de hojas de plantas que iban a ser ensayadas fueron colocados en placas de petri que contenían papel de filtro saturado con agua. Se añadieron diez o veinte insectos de escarabajo de la patata recientemente eclosionados a los cortes de hojas, y se dejaron alimentar sobre las hojas. Después de cuatro días, los insectos fueron puntuados en cuanto a la mortalidad. Además, los insectos fueron examinados en cuanto a evidencia de velocidad de crecimiento ralentizada (atrofiamiento), y el tejido de la hoja que permanece fue examinado para determinar el deterioro relativo por la alimentación.

En cada experimento se incluyeron muchas plantas no transformadas como testigos. Entre 50 y 100 plantas no transformadas han sido ensayadas ahora como testigos. De estas plantas testigos, más de 80% no muestran mortalidad para el escarabajo de la patata; aproximadamente 15% proporcionan 10% de mortalidad y 5% o menos muestran 20% de mortalidad. La mortalidad de más de 20% no ha sido observada con una planta testigo.

La Tabla VI de a continuación resume los resultados de toxicidad obtenidos con diversas plantas de tomate transgénicas pMON9753.

TABLA VI Toxicidad de plantas de tomate transgénicas que contienen pMON9753 hacia el escarabajo de la patata del Colorado

Planta	Resistencia a la kanamicina^{1}	Mortalidad del EPC (%)
		Ens. Nº 1	Ens. Nº 2	Ens. Nº 3
794	R	30	20
810	n.d.	50	20	40
871	R	30	10 (atrofiado)
886	R	50	40
887	n.d.	20	30	30
1009	n.d.	50
1044	R	20 (atrofiado)
1046	R	40 (atrofiado)	20

EPC = escarabajo de la patata del Colorado. ^{1}n.d. representa que no hay datos.

Como se muestra en la Tabla VI, han sido recuperadas diversas plantas que muestran consistentemente niveles superiores de mortalidad de escarabajo de la patata del Colorado que las plantas testigos no transformadas. Estos resultados sindican que el gen de toxina de B.t.t. está siendo expresado a niveles suficientes para destruir un número significativo de los insectos que se alimentan de estas plantas.

Expresión de toxina para coleópteros en patata

Cultivos inclinados de brotes de cultivos de patata de Kennebec son subcultivados en medios que contienen sales MS mayores y menores, 0,17 g/l de dihidrogeno-fosfato de sodio, 0,4 mg/l de tiamina-HCl, 0,1 g/l de inositol, 3% de sacarosa, 2,0 g/l de Gelrite (Kelco Co.) a pH 5,6. Los cultivos se cultivan durante 4 semanas a 24ºC en un fotoperíodo de 16 horas. Se cortan internodos de tallo en longitudes de aproximadamente 8 mm y las superficies cortadas son infectadas con Agrobacterium cepa pMON9753-ASE que ha sido linealmente extendida en una placa de agar LB y cultivada durante 2 a 3 días. pMON9753-ASE que se describe anteriormente contiene el gen quimérico de toxina de B.t.t. guiado por el promotor CaMV35S. alternativamente, se usan cepas Agrobacterium pMON9791-ACO o pMON9792-ACO que contienen genes quiméricos de toxina de B.t.t. Las secciones de tallo se colocan en medio solidificado en agar al 0,8% que contiene sales y añadidos orgánicos, como en Jarret et al. (1980), 3% de sacarosa, 3 mg/l de BA y 0,1 mg/l de NAA a pH 5,6. Después de 4 días, los explantes son transferidos a un medio de la misma composición, pero con carbenicillina a 500 mg/l y kanamicina como el agente selectivo para células transformadas de la planta a 100 mg/l. Cuatro semanas más tarde, los explantes son transferidos nuevamente a un medio de la misma composición, pero con GA_{3} a 0,3 mg/l como la única hormona. Los callos que se desarrollan en presencia de 100 mg/l de kanamicina se demuestra que contienen el enzima NPTII cuando son ensayados mediante un ensayo de transferencia que indique que las células de patata son transformadas. El tejido testigo sin inocular es inhibido a esta concentración de kanamicina. El tejido de patata transformado expresa el gen de toxina de B.t.t. El mRNA de toxina de B.t.t. puede ser detectado mediante análisis Northern, y la proteína de toxina de B.t.t. puede ser detectada mediante inmunoensayo tal como el análisis de transferencia Western. Sin embargo, en muchos casos el ensayo más sensible para la presencia de toxina de B.t.t. es el bioensayo de insectos. Las larvas de escarabajo de la patata del Colorado que se alimentan con tejido transformado padecen los efectos de la toxina.

Este procedimiento para producir células de patata transformadas resistentes a la kanamicina ha sido usado también satisfactoriamente para regenerar brotes. Los brotes que son de 1 a 2 cm de longitud son retirados de los explantes y colocados en el medio de mantenimiento del cultivo inclinado de brotes descrito anteriormente, en el que los brotes arraigan fácilmente.

Las plantas generadas de esta forma son ensayadas en cuanto a la transformación valorando la expresión del enzima NPTII y mediante la capacidad de los segmentos de tallo para formar callos en medio que contiene kanamicina. Las plantas transformadas expresan el gen de toxina de B.t.t. Puede ser detectado mRNA de toxina de B.t.t. mediante análisis Northern y la proteína de toxina de B.t.t. puede ser detectada mediante inmunoensayo tal como análisis de transferencia Western. Las larvas de escarabajo de la patata del Colorado que se alimentan en el tejido transformado padecen los efectos de la toxina.

Expresión de toxina para coleópteros en algodón

Semillas de algodón son esterilizadas superficialmente empapándolas primero durante 10 minutos en una solución detergente de agua a la que se ha añadido jabón Sparkleen, seguidamente agitándola durante 20 minutos en una solución de Chlorox al 30% que contenía 2 gotas de Tween 20 por 40 ml antes de aclararlas dos veces con agua destilada estéril. Las semillas se empapan seguidamente en benolato al 0,4% durante 10 minutos. El benolato se vierte antes de colocar las semillas asépticamente en sales MS de resistencia media solidificadas en agar. Las semillas son germinadas durante 3-10 días en la oscuridad a 32ºC. Los cotiledones e hipocotilos se separan seguidamente asépticamente y se segmentan. Los segmentos se colocan en 1) medio MS solidificado en agar que contiene 3% de glucosa, 2 mg/l de ácido naftaleno-acético (NAA) y 1 mg/l de kinetina (medio MSS) o 2) medio MS solidificado en Gelrite que contiene 3% de glucosa, vitaminas B5, 100 mg/l de inositol, 0,75 mg/l de MgCl_{2}, 0,1 mg/l de ácido diclorofenoxi-acético (2,4-D) y 0,1 ó 0,5 mg/l de kinetina (medio MST). El callo se mantiene en fotoperíodo de 16/8 a 28ºC en cualquiera de estos medios hasta que se inicie la embriogénesis. El subcultivo del callo embriogénico se hace en el mismo medio que para la iniciación, pero conteniendo 3% de sacarosa en lugar de glucosa. Los embriones somáticos son germinados trasladándolos a un medio de Stewart solidificado en Gelrite sin reguladores del crecimiento de plantas, pero conteniendo 0,75 g/l de MgCl_{2}. Los embriones germinados se trasladan a tierra en una cámara de cultivo en la que continúan cultivándose. Las plantas se trasladan seguidamente al invernadero con el fin de asentar la semilla y la flor.

La transformación de tejidos de algodón y la producción de callos y plantas transformados se realiza como sigue. Se preparan plantones asépticos como para la regeneración de plantas. Los segmentos de hipocotilos y cotiledones son inoculados con cultivos líquidos de Agrobacterium durante una noche o con Agrobacterium cultivado en placas nutrientes. Los explantes son conjuntamente cultivados durante 2-3 días en medio MSS o MST que contiene 1/10 la concentración de sales de MS. Los explantes son transferidos en papel de filtro para separar las bacterias en exceso y se colocan en placas sobre medio MSS o MSN que contienen 500 mg/l de carbenicillina y 30-100 mg/l de kanamicina. El callo que es transformado se cultivará en este medio y producirá embriones. Los embriones se cultivan en forma de plantas como se estableció para la regeneración. Las plantas son ensayadas en cuanto a la transformación mediante la valoración de la expresión de NPTII.

Cuando la cepa Agrobacterium usada para la transformación contiene un gen quimérico de toxina de B.t.t. tal como pMON9753, pMON9791 o pMON9792, el gen de toxina de B.t.t. es expresado en el callo transformado, embriones derivados de este callo y en las plantas transformadas derivadas de los embriones. Para todos estos casos, la expresión del mRNA de toxina de B.t.t. puede ser detectado mediante análisis Northern, y la expresión de la proteína de toxina de B.t.t. puede ser detectada mediante inmunoensayo tal como análisis de transferencia Western. El bioensayo de insectos puede ser la medida más sensible para la presencia de proteína de toxina.

La toxicidad hacia insectos del callo, embriones o plantas se ensaya mediante bioensayo con larvas de gorgojo del algodón (Anthonomous grandis). Las larvas de gorgojo del algodón que se alimentan en las células o plantas de algodón transformadas que expresan el gen de toxina de B.t.t. padecen los efectos de la toxina.

Expresión de genes de toxina para coleópteros en maíz

La siguiente descripción indica la preparación de protoplastos a partir de maíz, la introducción de genes quiméricos de toxinas de B.t.t. en los protoplastos mediante electroporación y la recuperación de células de maíz resistentes a la kanamicina, establemente transformadas, que expresan genes quiméricos de toxinas de B.t.t.

Preparación de protoplastos de maíz

Se preparan protoplastos a partir de una línea de suspensión de maíz en dulce mejicano negro (BMS), BMSI (ATCC 54022) como se describe por Fromm et al. (1985 y 1986). Las células en suspensión en BMSI se cultivan en medio BMS que contiene sales MS, 20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de ácido (2,4-diclorofenoxi)-acético, 200 mg/l de inositol, 130 mg/l de asparagina, 1,3 mg/l de niacina, 0,25 mg/l de tiamina, 0,25 mg/l de piridoxina, 0,25 mg/l de pantotenato de calcio, pH 5,8. Cultivos de cuarenta ml en matraces erlenmeyer de 125 ml se agitan a 150 rpm a 126ºC. El cultivo se diluye con un volumen igual de medio reciente cada 3 días. Los protoplastos son aislados a partir de células en crecimiento activo 1 a 2 días después de añadir el medio reciente. Para el aislamiento de protoplastos, las células son sedimentadas a 200 x g en una centrífuga de sobremesa de cangilones oscilantes. El material sobrenadante se recupera como medio acondicionado para cultivar los protoplastos. Seis ml de células envasadas se vuelven a poner en suspensión en 40 ml de manitol 0,2 M/CaCl_{2} 50 mM/acetato de sodio 10 mM que contiene 1% de celulasa, 0,5% de hemicelulasa y 0,02% de peptinasa. Después de incubar durante 2 horas a 26ºC, los protoplastos se separan por filtración a través de un tamiz de malla de nilón de 60 \mum, se centrifugan a 200 x g, y se lavan una vez en la misma solución sin enzimas.

Transformación de protoplastos de maíz con vectores de DNA de gen de toxina de B.t.t. usando una técnica de electroporación

Los protoplastos se preparan para la electroporación lavando en una solución que contiene fosfato de potasio 2 mM a pH 7,1, cloruro de calcio 4 mM, cloruro de sodio 140 mM y manitol 0,2 M. Después de lavar, los protoplastos se vuelven a poner en suspensión en la misma solución a una concentración de 4 x 10^{6} protoplastos por ml. Medio ml de la solución que contiene protoplastos se mezcla con 0,5 ml de la misma solución que contiene 50 microgramos de la misma solución que contiene 50 microgramos de DNA de vector de plásmido supercoloide y se coloca en una cubeta de electroporación de 1 ml. La electroporación se lleva a cabo como se describe por Fromm et al. (1986). Como se describe, se suministra una pulsación eléctrica de un capacitor de 122 ó 245 microfaradios cargado a 220 V. Después de 10 minutos a 4ºC, y 10 minutos a temperatura ambiente, los protoplastos se diluyen con 8 ml de medio que contiene sales MS, manitol 0,3 M, 2% de sacarosa, 2 mg/l de 2,4-D, 20% de medio BMS acondicionado (véase lo que antecede) y 0,1% de agarosa de bajo punto de fusión. Después de 2 semanas en la oscuridad a 26ºC, se añade medio sin manitol y que contiene kanamicina para proporcionar una concentración final de kanamicina de 100 mg/l de líquido. Después de 2 semanas adicionales, se retiran los microcallos del líquido y se colocan en un disco de filtro de membrana sobre medio solidificado en agarosa que contiene 100 mg/l de kanamicina. Aparecen callos resistentes a la kanamicina compuestos por células de maíz transformadas después de aproximadamente 1-2 semanas.

Expresión de genes de toxina de B.t.t. en células de maíz

Como se describe por Fromm et al. (1986), las células de maíz transformadas pueden ser seleccionadas mediante cultivo en medio que contiene kanamicina después de electroporación con vectores de DNA que contienen genes resistentes a la kanamicina quiméricos compuestos por el promotor CaMV35S, la región codificadora NPTII y el extremo NOS 3'. pMON9791 y pMON9792 contienen tales genes NPTII quiméricos y contienen también genes quiméricos de toxina de B.t.t. Como se describió anteriormente, los protoplastos de maíz son transformados mediante electroporación con vectores de DNA, en los que los vectores de DNA son pMON9791 o pMON9792. Después de la selección en cuanto a la resistencia a la kanamicina, las células de maíz transformadas son ensayadas en cuanto a la expresión del gen de toxina de B.t.t. Los ensayos se realizan en cuanto al mRNA de B.t.t. mediante análisis por transferencia Northern y en cuanto a la proteína de toxina de B.t.t. mediante inmunoensayo tal como análisis de transferencia Western.

Los ensayos en cuanto a la toxicidad hacia insectos se realizan alimentando larvas de gusanos de la raíz de maíz Southern (Diabrotica undecimpunctata howardi) con callos de maíz transformados. Alternativamente, se prepara un extracto de proteínas que contiene la proteína de toxina de B.t.t. a partir de células de maíz transformadas, y este extracto se incorpora en una dieta apropiada para insectos con la que se alimentan las larvas de gusanos de raíz de maíz Southern. Las larvas de gusanos de raíz que se alimentan de los tallos transformados o de los extractos de proteínas de tales callos padecen los efectos de la toxina.

Los ejemplos anteriores se proporcionan para aclarar mejor la práctica de la presente invención y no están concebidos, en modo alguno, para limitar el alcance de la presente invención.

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Claims

1. Un gen quimérico, que comprende en secuencia:

(a): un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(c): una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.

2. Un gen quimérico, que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

3. Un gen quimérico, que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (50-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

4. Un gen quimérico, que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(c): una secuencia de DNA no traducida en 3', que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.

5. Un gen quimérico, que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

6. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotor CaMV35S, promotor MAS y promotores ssRUBISCO.

7. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que el promotor es el promotor CaMV35S.

8. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que el promotor es el promotor manopina sintasa.

9. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en el que la secuencia de DNA no traducida en 3' es de un gen de proteína de almacenamiento de soja.

10. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, que comprende adicionalmente una secuencia intensificadora 5' del promotor.

11. El gen de la reivindicación 10, en el que el promotor es el promotor CaMV35S y la secuencia intensificadora tiene la secuencia de nucleótidos de los residuos 27-279 como se muestra en la Figura 18.

12. Un procedimiento para producir una plana genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(a): insertar en el genoma de una célula de una planta un gen quimérico que comprende en secuencia:

(i): un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;

(ii): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10, y

(iii): una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;

(b): obtener células transformadas de la planta; y

(c): regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;

en el que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.

13. Un procedimiento para producir una planta genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(i): un promotor que actúe en las plantas para provocar la producción de RNA;

(ii): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(b): obtener células transformadas de la planta; y

14. Un procedimiento para producir una planta genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(a): insertar en el genoma de una célula de una planta, un gen quimérico que comprende en secuencia:

(ii): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (50-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numeradas como se muestra en la Figura 10; y

(b): obtener células transformadas de la planta; y

15. Un procedimiento para producir una planta genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(ii): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(b): obtener células transformadas de la planta; y

(c): regenerar a partir de las células transformadas, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;

16. Un procedimiento para producir una planta genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros, que comprende las etapas de:

(ii): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

(iii): una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúe en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;

(b): obtener células transformadas de la planta; y

(c): regenerar a partir de las células de las plantas transformadas, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;

17. El procedimiento de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 ó 16, en el que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotor CaMV35S, promotor MAS y promotores ssRUBISCO.

18. El procedimiento de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 ó 16 en el que el promotor es el promotor CaMV35S.

19. El procedimiento de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 ó 16, en el que el promotor es el promotor manopina sintasa.

20. El procedimiento de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 ó 16, en el que la secuencia de DNA no traducida en 3' es de un gen de proteína de almacenamiento de soja.

21. El procedimiento de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 ó 16, que comprende adicionalmente una secuencia intensificadora 5' del del promotor.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el promotor es el promotor CaMV35S y la secuencia intensificadora tiene la secuencia de nucleótidos de los residuos 27-279 como se muestra en la Figura 18.

23. Una célula de planta transformada, que contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:

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(c): una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;

en la que la célula de planta transformada no es una célula de una planta dicotiledonea.

24. Una célula de planta transformada, que contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:

25. Una célula de planta transformada, que contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:

26. Una célula de planta transformada, que contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacilluss thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

27. Una célula de planta transformada, que contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:

(b): una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y

28. La célula de planta transformada de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, que contiene un gen en el que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotor CaMV35S, promotor MAS y promotores ssRUBISCO.

29. La célula de planta transformada de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, que contiene un gen en el que el promotor es el promotor CaMV35S.

30. La célula de planta transformada de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, en la que la planta se selecciona entre el grupo que consiste en tomate, patata y algodón.

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31. Una célula de planta transformada que expresa la proteína de toxina de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10,

y en la que la célula de planta transformada no es una célula de una planta dicotiledonea.

32. Una planta diferenciada, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros susceptibles, que comprende células transformadas de la planta de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, en la que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.

33. Una planta transformada que expresa la proteína de toxina de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10, en la que la célula de planta transformada no es una célula de una planta dicotiledonea.

34. Una semilla, que contiene un gen quimérico de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en la que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.

35. Una proteína de toxina sustancialmente pura de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10.

36. Una proteína de toxina sustancialmente pura de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10.

37. Una proteína de toxina sustancialmente pura de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10.

38. Una proteína de toxina sustancialmente pura de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de la proteína de longitud completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados como se muestra en la Figura 10.