ES2032802T5

ES2032802T5 - Sucedaneo de sangre semisintetico extrapuro.

Info

Publication number: ES2032802T5
Application number: ES87116556T
Authority: ES
Inventors: Carl W. Rausch; Mario Feola
Original assignee: Biopure Corp
Current assignee: Biopure Corp
Priority date: 1986-11-10
Filing date: 1987-11-10
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2007-11-10
Also published as: WO1988003408A1; AU1087188A; EP0277289B2; EP0277289B1; JPH02501067A; JP2962731B2; EP0277289A1; ES2032802T3; DE3778006D1; AU622610B2; EP0277289B8; GR3004668T3; HK37297A

Abstract

SUSTIUTO DE SANGRE Y EXTENDEDOR DE PLASMA QUE COMPRENDEN UNA SOLUCION DE HEMOGLOBINA RETICULADA SUSTANCIALMENTE LIBRE DE ENDOTOXINAS, Y PROCESO PARA PREPARARLO. EL PROCESO COMPRENDE FRACCIONAR SANGRE COMPLETA, SEPARAR UNA SOLUCION DE HEMOGLOBINA ESTERIL LIBRE DE ESTROMA, SEPARAR CROMATOGRAFICAMENTE ENDOTOXINAS DE DICHA SOLUCION DE HEMOGLOBINA Y RETICULAR LA SOLUCION DE HEMOGLOBINA LIBRE DE ENDOTOXINA RESULTANTE.

Description

Sucedáneo de sangre semisintético extrapuro.

Campo de la invención

La presente invención se ha definido en la reivindicación. Se refiere a un procedimiento para producir un sucedáneo de sangre semisintético. El sucedáneo de sangre semisintético es una preparación de hemoglobina caracterizada por su pureza, sus niveles excepcionalmente bajos de endotoxina, la ausencia de proteínas no hemoglobínicas y su perfil de reticulación molecular. El sucedáneo de sangre semisintético no tiene actividad tóxica cuando se usa como un sucedáneo y posee la propiedad de unirse reversiblemente a ligandos gaseosos tales como oxígeno y es útil para transportar y suministrar oxígeno a tejidos y órganos vitales. Adicionalmente, el sucedáneo de sangre sirve como un expansor de plasma sanguíneo para el tratamiento de enfermedades y para mantener la integridad circulatoria.

Descripción de materiales precedentes

Los organismos multicelulares complejos están provistos de tejidos especializados que están relacionados con los procesos de nutrición y excreción. La principal función de la sangre es proporcionar una conexión entre diversos órganos y células del cuerpo. La sangre, los glóbulos rojos, el plasma y otros componentes mantienen un ambiente celular constante al circular a través de cada tejido y aportar continuamente nutrientes a los tejidos y retirar productos residuales y diversos tejidos que están relacionados con las secreciones tisulares de ellos. PHISIOLOGY, Tercera Edición, Editado por Edward E, Selkurt, Página 223 (1971). La sangre es un fluido viscoso compuesto por células y plasma. Más del 99% de las células son glóbulos rojos. La principal función de los glóbulos rojos es transportar hemoglobina, que a su vez lleva oxígeno de los pulmones a los tejidos y CO_{2} desde los tejidos hasta los pulmones. Los glóbulos rojos normales contienen aproximadamente 34 gramos de hemoglobina por 100 gramos de células. Cada gramo de hemoglobina es capaz de combinarse con aproximadamente 1,33 ml de oxígeno. Véase Guyton, A. C., BASIC HUMAN PHISIOLOGY: NORMAL FUNCTION IN MECHANISMS OF DISEASE, Páginas 84-85 (1971).

Debido a la necesidad crítica y continua de un agente terapéutico útil como un sucedáneo de sangre para llevar y suministrar oxígeno y como un expansor del plasma sanguíneo, se han dirigido intensos esfuerzos de investigación al desarrollo de un sucedáneo de sangre adecuado. Existe la necesidad de un sucedáneo de sangre para reemplazar sangre perdida por hemorragia aguda, pérdidas de sangre que se producen durante operaciones quirúrgicas, procedimientos de resucitación después de perdida de sangre accidental y similares. Además, como un expansor de plasma, un sucedáneo de sangre sirve como un agente terapéutico para tratar el choque por deficiencia de volumen, como un mitigador en el choque anafiláctico y alérgico y para reemplazar la pérdida de plasma después de quemaduras y como resultado de diarrea grave.

La hemoglobina en solución tiene la capacidad de transportar oxígeno y, teóricamente, podría usarse como un sustituto de glóbulos rojos. Debido a que las soluciones de hemoglobina son oncóticamente activas, estas soluciones también expanden el volumen del plasma, proporcionando de ese modo también una función como expansor del plasma. Así, la capacidad para ser oncóticamente activas y transportar oxígeno sugiere que las soluciones de hemoglobina serían deseables para un fluido de resucitación cuando se requiere un tratamiento inicial rápido de la hipovolemia y la hipoxia tisular. Sin embargo, para funcionar como un fluido de resucitación adecuado, las soluciones de hemoglobina deben ser capaces de mantener la oxigenación celular durante períodos de tiempo específicos.

La hemoglobina presente en la sangre de mamíferos tiene una propiedad fundamental en solución de oxigenación reversible. En su forma natural, la hemoglobina de mamífero es una proteína no reticulada conjugada que tiene un peso molecular de aproximadamente 68.000 y está comprendida estructuralmente por dos pares de subunidades. Cada subunidad contiene un grupo hemo y una cadena polipeptídica, llamada globina. En los mamíferos, la hemoglobina está presente en los eritrocitos, junto con estroma que consiste en proteína, fosfolípidos y colesterol. Véase CLINICAL HEMATOLOGY, de Wintrobe, 8 Ed. Páginas 138-199, (1967).

La unión reversible del oxígeno requiere la interacción entre cuatro cadenas de hemoglobina (hemoglobina tetrámera) que resulta de la capacidad de la proteína para existir como dos estructuras cuaternarias diferentes (relajadas y tensas) que tienen diferentes afinidades hacia el oxígeno (Perutz, M. F., Prog. Clin. Biol. Res. 1: 3 (1975)). Las dos afinidades hacia el oxígeno diferentes permiten a la hemoglobina cargar oxígeno cuando la tensión de oxígeno es alta (aproximadamente 100 mm de Hg de pO2) y descargar oxígeno cuando la tensión de oxígeno es baja (aproximadamente 40 mm de Hg de pO2) y dan lugar a una conformación sigmoidal característica de la curva de disociación de oxígeno-hemoglobina. Se sabe que el estado tenso de alguna hemoglobina en los glóbulos rojos se estabiliza mediante la presencia de fosfatos orgánicos tales como 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG), con el estado tenso de la hemoglobina en solución no estabilizado debido a la ausencia de 2,3-DPG. De acuerdo con esto, la hemoglobina en solución tiene una P_{50} inferior que la hemoglobina en su estado natural (Arnone, A., Nature 237: 146 (1972)).

La hemoglobina acuosa existe en equilibrio entre las formas tetrámera (PM 68.000) y dímera (PM 34.000) (Bunn, H. F. y otros, Trans. Assn. Am. Physicians 81: 187 (1968)). Los dímeros son excretados por el riñón y dan como resultado una eliminación intravascular rápida de soluciones de hemoglobina, teniendo tales soluciones una semi-vida en plasma de 2-4 horas. De acuerdo con esto, se han dirigido esfuerzos para vencer las limitaciones inherentes de las soluciones de hemoglobina mediante la modificación molecular de la hemoglobina. El propósito de la modificación molecular es estabilizar la hemoglobina para evitar la formación de dímero y para mantener el estado de conformación tenso. Bunn y otros, previamente, demostraron que reticular la hemoglobina reducía la eliminación renal e incrementaba el tiempo de retención intravascular. Bunn y otros utilizaron bis-(N-maleimidometil)-éter; sin embargo, la solución de hemoglobina resultante tenía una alta afinidad hacia el oxígeno, es decir, una P50 de 3 mm de Hg. Se ha demostrado que el 5-fosfato de piridoxal tiene un efecto análogo al 2,3-DPG para disminuir la afinidad hacia el oxígeno, dando como resultado una P50 de 26-30 mm de Hg (Benesch, R. E., Biochem. 11: 2568 (1972)). Sin embargo, a diferencia del 2,3-DPG, el fosfato de piridoxal no actúa como un agente reticulador, dando como resultado tiempos de retención intravasculares similares a los de la hemoglobina no modificada (Greenburg, A. G. y otros, Surgery 86: 13 (1979)). Así, se ha creído que se requerirían la piridoxilación y la reticulación para producir un sucedáneo de sangre que tuviera bajas afinidades para oxígeno (P_{50} igual a 20-30 mm de Hg) y tiempos de retención intravasculares adecuados (tiempos de semi-desaparición de 20 o más horas).

En 1985, the Congress of the United States, Office of Technology Assessment (OTA), presentó un informe titulado ``Blood Policy and Technology''. En el capítulo 6 de este informe, se analizaron fuentes alternativas de productos sanguíneos, con la conclusión de que era necesario un impulso para desarrollar fuentes y sucedáneos de sangre alternativos basados en consideraciones económicas, y de seguridad y de disponibilidad. De acuerdo con el informe, el sucedáneo de glóbulos rojos ideal tendría seis propiedades: 1) una curva de disociación de oxígeno y una capacidad de transporte de oxígeno similares a las de glóbulos rojos intactos; 2) ser atóxico y no antigénico; 3) tener buenas características de flujo; 4) permanecer en la circulación durante un período de tiempo largo; 5) tener una duración de almacenaje larga; y 6) ser económico en comparación con las transfusiones de glóbulos rojos actuales. El informe también concluía que ningún sucedáneo desarrollado hasta entonces cumplía estos criterios.

Se han utilizado cuatro sistemas básicos para desarrollar un sucedáneo de sangre adecuado. En un sistema, se está desarrollando una clase de compuestos sintéticos llamados productos perfluoroquímicos. En un segundo sistema, se están desarrollando análogos sintetizados de hemoglobina. Los investigadores también están intentando ensamblar un glóbulo rojo encapsulando hemoglobina en vesículas lipídicas llamadas liposomas. Finalmente, la hemoglobina purificada se ha modificado químicamente para prolongar su circulación y mejorar sus propiedades de unión-disociación de oxígeno.

De acuerdo con el informe de la OTA, previamente, hasta la fecha, ninguno de estos sistemas ha resultado satisfactorio. Los fluorocarbonos son retirados por el sistema circulatorio como sustancias extrañas y se alojan en el hígado, el bazo y otros tejidos. Las células artificiales hechas de hemoglobina encapsulada en membranas no se han usado por muchas razones. El uso de microcápsulas hechas de polímeros sintéticos, tales como poliestireno, etilcelulosa y caucho silicónico, introduce materiales biológicamente incompatibles en un sistema vivo. Las paredes celulares de las cápsulas tienden a tener fugas, es difícil controlar la permeabilidad de la pared y estas cápsulas son demasiado rígidas y demasiado grandes para pasar a través del lecho capilar.

El uso de sangre y fracciones de sangre está lleno de desventajas. Por ejemplo, el uso de sangre entera a menudo está acompañado por el riesgo de transmisión del virus que produce la hepatitis y el virus que produce el SIDA, lo que complica la recuperación del paciente en el primer caso y es letal en el segundo. Adicionalmente, el uso de sangre entera requiere la tipificación de la sangre y la prueba de compatibilidad cruzada para evitar problemas inmunohematológicos e incompatibilidad entre donantes.

El plasma de la fracción sanguínea (BFP), que es una solución coloidal fisiológicamente equilibrada que cumple muchos de los requisitos de un expansor del volumen de sangre, no puede usarse seguramente para este propósito. La alta incidencia y el riesgo de transmitir hepatitis por suero homólogo asociada con el plasma es tan grande, que su uso ya no está garantizado.

El componente sanguíneo hemoglobina posee actividad osmótica y la capacidad para transportar e intercambiar oxígeno, pero tiene la desventaja de la rápida eliminación de la circulación por la ruta renal y a través de las paredes vasculares, dando como resultado una semi-vida muy corta y, por lo tanto, insatisfactoria.

La literatura, tanto de patentes como no relacionada con patentes, está repleta de esfuerzos para producir un sucedáneo de sangre satisfactorio a partir de hemoglobina polimerizada, reticulada, libre de estroma. Bonsen y otros, U.S. 4.001.200 y Bonsen y otros, U.S. 4.011.401, describen hemoglobina polimerizada, reticulada, ``libre de estroma'' y composiciones farmacéuticas (y métodos para usar las mismas) que comprenden hemoglobina polimerizada, reticulada, ``libre de estroma''. El procedimiento para producir la hemoglobina polimerizada, reticulada, ``libre de estroma'' de Bonsen y otros comprende someter a lisis glóbulos rojos, filtrar a través de tierra diatomácea para retirar el estroma, dializar para retirar sales y metabolitos de bajo peso molecular, polimerizar para formar hemoglobina reticulada, macromolecular, libre de estroma, soluble en agua, con una esterilización final filtrando a través de un filtro que tiene un tamaño de poros de aproximadamente 0,20 a 0,45 micras. Incluidos entre los agentes de reticulación descritos por Bonsen y otros, están dialdehídos tales como glioxal, dialdehído malónico, dialdehído succínico, glutaraldehído, adipaldehído, 3-metil-glutaraldehído, propiladipaldehído, dialdehído ftálico, tereftaldehído y dialdehído malónico.

Bonsen y otros (III, U.S. 4.053.590) amplían la descripción de Bonsen y otros ('200) y Bonsen y otros ('401) con un análisis de sucedáneos de plasma polímeros fisiológicamente aceptables como portadores para el sucedáneo de sangre. Además, se sugieren aplicaciones para usar como una solución intercambiadora de oxígeno artificial en oxigenadores convencionales tales como ``baipas'' cardíaco, dispositivos de estimulación circulatoria extracorpóreos y dispositivos de membrana de tipo de fibra hueca y de lámina para usar en la estimulación de la circulación en pacientes enfermos. Adicionalmente, la polihemoglobina se sugiere como una fuente de proteína y oxígeno en el ensayo microbiológico de alimentos para bacilos y estafilococos aerobios para asegurar que el alimento es seguro para el consumo por animales y seres humanos y como una solución de almacenamiento y conservación para órganos de mamíferos perfundidos aislados viables, para su trasplante final a un receptor.

Bonhard y otros, U.S. 4.136.093, describen una preparación de hemoglobina adecuada para inyección intravenosa que comprende un producto de condensación sustancialmente libre de pirógenos, de hemoglobina y fosfato de piridoxal. Se reivindica que la preparación de hemoglobina tiene un tiempo de retención en el sistema sanguíneo de 2 a 9 horas. El producto se produce lavando glóbulos rojos con una solución débilmente alcalina, hemolizando y tratando el material resultante con una resina de intercambio catiónico. El material se separa de la resina, se diluye hasta una concentración de hemoglobina de aproximadamente 5-9%, se ajusta hasta un pH de aproximadamente 7 a 9, se trata con 5-fosfato de piridoxal y, opcionalmente, se trata con una solución de un borohidruro y a continuación un dialdehído para reticular las moléculas de hemoglobina. La naturaleza no pirógena de la solución de infusión se obtiene mediante, como mínimo, lavado repetido con la solución débilmente alcalina.

En Bonhard y otros, U.S. 4.336.248, se acoplan moléculas de hemoglobina para incrementar su tiempo de permanencia intravascular sin disminuir significativamente la capacidad de transporte de oxígeno de la molécula. Las moléculas de hemoglobina son acopladas entre sí y/o a proteínas del suero y derivados de gelatina usando dialdehídos tales como dialdehídos alifáticos de 3-8 átomos de carbono. Opcionalmente, puede añadirse subsiguientemente fosfato de piridoxal. Las moléculas de hemoglobina acopladas se recuperan mediante precipitación con sulfato amónico.

En Simmonds y otros, U.S. 4.401.652, se describe un procedimiento para preparar una solución de hemoglobina ``libre de estroma''. El procedimiento de Simmonds y otros está adaptado particularmente para la producción a gran escala de hemoglobina ``libre de estroma'', con formación reducida de methemoglobina. El procedimiento comprende lavar células sanguíneas para retirar componentes no celulares, retirar leucocitos, típicamente mediante la filtración a través de un adsorbente adecuado que retiene preferentemente los leucocitos, sometiendo a lisis los glóbulos rojos restantes ultrasónicamente o mecánicamente, la precipitación de la hemoglobina mediante la mezcladura con un catión polivalente, un polisulfato y un anión polivalente, y la purificación final mediante filtración y diálisis. La solución de hemoglobina resultante es ``sustancialmente pura'' y está ``libre de estroma'' y otros constituyentes celulares lipoproteínicos y contiene menos de 5% de methemoglobina.

Tye, U.S. 4.529.719, describe hemoglobina tetrámera ``libre de estroma'' que se reticula con ciertos ésteres bis-disalicílicos y se modifica con 5'-fosfato de piridoxilo seguido por reducción para producir hemoglobina tetrámera covalente reticulada con bis-diamida, modificada covalentemente con 5'-fosfato de piridoxilo. Se describe que la hemoglobina tetrámera ``libre de estroma'', reticulada, modificada, está libre de enfermedades y es capaz de transportar oxígeno a tejido perfundido y permanece en el espacio intravascular. Adicionalmente, se sugiere que el producto está libre de antígenos de la superficie celular, haciéndolo adecuado para la transfusión en lugar de los glóbulos rojos.

La hemoglobina tetrámera ``libre de estroma'', reticulada, modificada, de Tye se produce empezando con glóbulos rojos de células o sangre entera recientemente extraídas, caducadas o envasadas en estado congelado. La sangre se extrae de un modo estéril a contenedores con actividad anticoagulante suficiente para prevenir la formación de coágulos. Se describe que es útil hemoglobina de una variedad de fuentes de mamífero, tales como humana, bovina, ovina o porcina. Cualquier proteína sin hemo se retira, preferiblemente mediante precipitación con zinc. La hemoglobina se libera de los glóbulos rojos mediante lisis hipotónica seguida por ultrafiltración. La hemoglobina filtrada se hace pasar a través de una etapa de filtración subsiguiente para retirar partículas de virus, agregados de proteínas y elementos del estroma. El filtro típico tiene un tamaño de poro nominal de 0,020 micras y una exclusión para proteínas globulares de 1.000.000 daltons. Se añade zinc-hierro para precipitar la hemoglobina y el precipitado se concentra mediante filtración. La proteína sin hemo se retira del filtrado. La hemoglobina resultante se reticula a continuación usando los ésteres bis-disalicílicos y se trata con piridoxi-5'-fosfato, seguido por reducción del enlace covalente con la base Schiff reversible.

Kothe y otros, U.S. 4.526.715 describen un método para producir soluciones de hemoglobina altamente purificadas libres de proteínas del plasma y lípidos estromales residuales preparada a partir de sangre humana o de sangre de animal en cantidades suficientemente grandes para aplicaciones clínicas. El procedimiento descrito comprende poner en contacto glóbulos rojos con una solución de lavado; hemolizar mediante la introducción de los glóbulos rojos concentrados en 2-3 veces el volumen de agua; separar el estroma de la hemoglobina mediante ultrafiltración y la concentración en una tercera fase de filtración utilizando una segunda unidad de ultrafiltración que tiene una permeabilidad de 10.000 a 50.0000 daltons.

Sin embargo, a pesar de los recientes avances en la preparación de sucedáneos de sangre con origen en hemoglobina reticulada ``libre de estroma'', continúa existiendo la necesidad de un sucedáneo de sangre que esté sustancialmente libre de endotoxinas, fosfolípidos y proteínas no hemoglobínicas, que sea capaz de: 1) transportar cantidades adecuadas de oxígeno al tejido bajo condiciones ambientales; 2) tener una actividad oncótica equivalente a la de la sangre entera; 3) tener un tiempo de retención intravascular adecuado; 4) ser transfusible a todos los receptores sin pruebas de compatibilidad cruzada o pruebas de sensibilidad; 5) estar libre de agentes de enfermedad tales como partículas de bacterias y virus (hepatitis, SIDA, etc.); y 6) ser almacenable con cantidades mínimas de refrigeración.

Sumario de la invención

Reconociendo la necesidad existente desde hace mucho tiempo en la especialidad de desarrollar un sucedáneo de sangre que comprenda una solución proteínica oncóticamente activa capaz de transportar oxígeno y fácilmente disponible cuando se requieren transfusiones masivas, los inventores se esforzaron para desarrollar un sucedáneo de sangre basado en una solución de hemoglobina. Además, reconociendo que las demandas masivas de tal sucedáneo de sangre requerirían volúmenes de material de partida muy por encima de los que podrían hacerse disponibles potencialmente como sangre humana descartada, un objetivo de la presente invención era generar un procedimiento para crear un sucedáneo de sangre tal en el que pudieran ser adecuadas fuentes de sangre bovina como materiales de partida.

Teniendo en cuenta estos objetivos, la siguiente invención ha dado como resultado un procedimiento para producir un sucedáneo de sangre semisintético que comprende hemoglobina bovina monómera en forma reticulada, estando dicho sucedáneo de sangre semisintético sustancialmente libre de endotoxinas, fosfolípidos y proteínas no hemoglobínicas tales como enzimas. La presente invención comprende el procedimiento de la reivindicación 1.

El producto resultante (en lo sucesivo ``hemoglobina de la invención'', es decir, el producto del procedimiento de la reivindicación 1) es un sucedáneo de sangre que está sustancialmente libre de endotoxinas, tiene una persistencia vascular de al menos dos días, tiene la propiedad de unirse reversiblemente a ligandos gaseosos tales como oxígeno y es útil para transportar y suministrar oxígeno a tejidos y órganos vitales. Como tal, el sucedáneo de sangre preparado por la presente invención es útil como un expansor de sangre y un fluido de resucitación en el tratamiento de una enfermedad y para mantener la integridad circulatoria cuando es necesario, es decir, en respuesta a pérdidas de sangre repentinas y masivas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1H son diagramas de flujo que describen el del Ejemplo 1. La Figura 1A se refiere a la fase de recogida de sangre. La Figura 1B se refiere a la fase de separación de sangre. La Figura 1C se refiere a la fase de filtración microporosa. La Figura 1D se refiere a la fase de ultrafiltración. La Figura 1E se refiere a la fase de cromatografía en columna. Las Figuras 1F y 1G se refieren a la fase de reticulación. La Figura 1H se refiere a la fase de almacenamiento y preparación del fluido para el procesamiento.

La Figura 2 es una comparación gráfica de números de plaquetas entre tres grupos de conejos, con el porcentaje de cambio desde la línea de base representado en ordenadas y el tiempo representado en abscisas. T_{1} representa el nivel de plaquetas de la línea de base; T_{2} representa el nivel de plaquetas a los 15 minutos después de la transfusión; T_{3} representa el nivel de plaquetas 1 hora después de la transfusión; T_{4} representa el nivel de plaquetas 3 horas después de la transfusión; y T_{5} representa el nivel de plaquetas 24 horas después de la transfusión. Los círculos sólidos representan el valor medio \pm el error estándar para niveles de plaquetas para seis conejos que tienen un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una solución de hemoglobina que contiene entre una y dos unidades de endotoxina (UE)/ml; los círculos claros representan el valor medio \pm el error estándar para niveles de plaquetas de cuatro conejos que tienen un tercio del volumen de sangre reemplazado por 5% Plasma Protein Fraction (producto comercial que se encuentra que contiene 0,05-0,15 UE/ml); y los cuadrados representan el valor medio \pm el error estándar para seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por hemoglobina polimerizada pura preparada de acuerdo con la presente invención, conteniendo dicha hemoglobina 0-0,35 UE/ml.

La Figura 3 es una representación gráfica que compara niveles de glóbulos blancos para conejos transfundidos en un tercio desde la línea de base a las 24 horas. Como en la Figura 2, las ordenadas representan el porcentaje de cambio, representando las abscisas el tiempo. T_{1} representa el nivel de plaquetas de la línea de base; T_{2} representa el nivel de plaquetas a los 15 minutos después de la transfusión; T_{3} representa el nivel de plaquetas 1 hora después de la transfusión; T_{4} representa el nivel de plaquetas 3 horas después de la transfusión; y T_{5} representa el nivel de plaquetas 24 horas después de la transfusión. Los círculos sólidos representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una solución de hemoglobina que contenía entre 1 y 2 UE/ml; los círculos claros representan el valor medio \pm el error estándar de cuatro conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por 5% Plasma Protein Fraction (producto comercial que se encontró que contenía 0,05-0,5 UE/ml); y los cuadrados representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre reemplazado por hemoglobina polimerizada pura preparada de acuerdo con la presente invención, que contenía 0-0,35 UE/ml.

La Figura 4 es una comparación gráfica de niveles de fibrinógeno en suero entre tres grupos de conejos. Las ordenadas representan el porcentaje de cambio en los niveles de fibrinógeno; las abscisas representan el período de tiempo, representando T_{1} la línea de base; T_{2} el valor 15 minutos después de la transfusión; T_{3} el valor 1 hora después de la transfusión; T_{4} el valor 3 horas después de la transfusión y T_{5} el valor 24 horas después de la transfusión. Los círculos sólidos representan el valor medio \pm el error estándar para seis conejos con un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una solución de hemoglobina que contenía entre 1 y 2 UE/ml; los círculos claros representan el valor medio \pm el error estándar para cuatro conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por 5% Plasma Protein Fraction (producto comercial que se encontró que contenía 0,05-0,15 UE/ml); y los cuadrados representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre reemplazado por hemoglobina polimerizada pura, que contenía 0-0,35 UE/ml.

La Figura 5 representa una comparación gráfica de los niveles de protrombina entre tres grupos de conejos. Las ordenadas representan el porcentaje de cambio en los niveles de protrombina, representando las abscisas el tiempo. T_{1} representa el nivel de protrombina de la línea de base; T_{2} representa niveles de protrombina 15 minutos después de la transfusión; T_{3} representa niveles de protrombina 1 hora después de la transfusión; T_{4} representa niveles de protrombina 3 horas después de la transfusión; y T_{5} representa niveles de protrombina 24 horas después de la transfusión. Los círculos sólidos representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una hemoglobina que contenía entre 1 y 2 UE/ml; los círculos claros representan el valor medio \pm el error estándar de cuatro conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por 5% Plasma Protein Fraction (producto comercial que se encuentra que contiene 0,05-0,15 UE/ml); y los cuadrados representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por hemoglobina polimerizada pura, que contenía 0-0,35 UE/ml.

La Figura 6 es una representación gráfica que compara niveles de creatinina en suero entre tres grupos de conejos. Las ordenadas representan el porcentaje de cambio en los niveles de creatinina en suero, representando las abscisas el tiempo. T_{1} representa el nivel de creatinina en suero de la línea de base; T_{2} representa niveles de creatinina en suero 15 minutos después de la transfusión; T_{3} representa niveles de creatinina en suero 1 hora después de la transfusión; T_{4} representa niveles de creatinina en suero 3 horas después de la transfusión; y T_{5} representa niveles de creatinina en suero 24 horas después de la transfusión. Los círculos sólidos representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una solución de hemoglobina que contenía entre 1 y 2 UE/ml (prueba Chromogenic LAL); los círculos claros representan el valor medio \pm el error estándar de cuatro conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por 5% Plasma Protein Fraction (producto comercial que se encontró que contenía 0,05-0,15 UE/ml); y los cuadrados representan el valor medio \pm el error estándar de seis conejos que tenían un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por hemoglobina polimerizada pura, que contenía 0-0,35 UE/ml.

La Figura 7 representa una comparación gráfica de los cambios en el hematocrito (Hct) después de una transfusión por hemorragia de 50% en monos. Las ordenadas representan el hematocrito, representando las abscisas el tiempo en días. Los hematocritos de monos sometidos a transfusión con hemoglobina se señalan con los círculos sólidos; los hematocritos de Plasma Protein Fraction se indican con los círculos abiertos.

La Figura 8 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 21, de un perro que sufría una transfusión con intercambio de 40% con una solución de hemoglobina reticulada preparada de acuerdo con la presente invención.

La Figura 9 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 18, de un perro que sufría una transfusión de intercambio de 25% con una solución de hemoglobina reticulada preparada de acuerdo con la presente invención.

La Figura 10 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 78, de un perro que sufría una transfusión de intercambio de 33% con una solución de hemoglobina reticulada preparada de acuerdo con la presente invención.

La Figura 11 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 47, de un perro que sufría una transfusión de 33% con solución de albúmina humana al 5%.

La Figura 12 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 23, de un perro que sufría una hemorragia de un 50% de volumen de sangre, seguida por una sustitución inmediata con solución de albúmina al 5% como una primera etapa en la transfusión de intercambio. Esto era seguido por una retirada rápida de otro 50% del volumen de sangre seguido por la sustitución por una solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la presente invención.

La Figura 13 es una representación gráfica del porcentaje de glóbulos blancos, el porcentaje de glóbulos rojos, el porcentaje de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito, desde el tiempo 0 hasta el día 30, de un perro que sufría una hemorragia de 50% seguida por la sustitución inmediata con un volumen igual de una solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la presente invención y una segunda hemorragia de 50% seguida por el reemplazo por un volumen igual compuesto por una solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la presente invención y una solución de albúmina al 50%, mezcladas en partes iguales.

La Figura 14 es una representación gráfica de la Tabla V del Ejemplo VIII. Las ordenadas representan el porcentaje de Hemoglobina de la Invención total que permanece en cada uno de sus pesos moleculares del subgrupo de composición. Las abscisas representan el tiempo en horas.

La Figura 15 es una representación gráfica de los datos recogidos a partir del trabajo experimental del Ejemplo IX. La gráfica demuestra que a medida que los glóbulos rojos se intercambian progresivamente por Hemoglobina de la Invención, empezando por debajo de un hematocrito de 20%, hay un incremento esperado en la concentración de hemoglobina en plasma total.

La Figura 16 es una representación gráfica de datos recogidos a partir del trabajo experimental del Ejemplo IX. Se intercambiaron siete animales de prueba y seis animales de control desde niveles de hematocrito iniciales con sustituciones de volúmenes que no tienen oxígeno (es decir, soluciones de lactato de Ringer e hidroxietilalmidón) hasta aproximadamente 20%. Ambos grupos mostraban una disminución similar desde valores iniciales hasta aproximadamente 20%. Por debajo de 20%, el grupo de control mostraba una disminución progresiva en el contenido de oxígeno arterial asociado con una disminución progresiva en el hematocrito. Los seis animales de control no sobrevivían. En contraste, el grupo de prueba presentaba un contenido de oxígeno arterial notablemente superior que se mantenía a pesar de la disminución progresiva del hematocrito. Los siete animales de prueba sobrevivían y aparecían clínicamente normales. En la Figura 16, las ordenadas representan el contenido de oxígeno arterial mientras que las abscisas representan el hematocrito.

La Figura 17 es una representación gráfica de datos experimentales recogidos del Ejemplo IX. Las ordenadas representan contenido de oxígeno venoso mixto mientras que las abscisas representan el hematocrito.

La figura 18 es una representación gráfica de datos recogidos del Ejemplo IX. Las ordenadas representan la contribución al contenido de oxígeno; las abscisas representan el hematocrito. La gráfica demuestra la contribución de la Hemoglobina de la Invención y de glóbulos rojos de oveja al contenido de oxígeno arterial a diversos niveles de hematocrito. En los siete animales de prueba, a medida que la Hemoglobina de la Invención se incrementaba y el hematocrito disminuía, un incremento en el porcentaje del contenido de oxígeno arterial era aportado por la Hemoglobina de la Invención. A niveles de hematocrito en el intervalo de 3%, casi 90% del contenido de oxígeno arterial es aportado por la Hemoglobina de la Invención, siendo aportado el resto por los glóbulos rojos de oveja residuales y el plasma diluido.

La Figura 19 es una representación gráfica del aporte de oxígeno durante la transfusión de intercambio. Las ordenadas representan el porcentaje del valor inicial; las abscisas representan el tiempo en horas. Durante el primer intercambio con solución de lactato de Ringer, disminuían el hematocrito así como el aporte de oxígeno. En este punto (\rightarrow), se comenzaron los intercambios con solución de Hemoglobina de la Invención. Mientras que el hematocrito de oveja se disminuía adicionalmente, el aporte de oxígeno se incrementaba de nuevo hacia los niveles de la línea de base, en asociación con la infusión de solución de Hemoglobina de la Invención. Esto demuestra que, al final del intercambio, el aporte de oxígeno se debe principalmente a la Hemoglobina de la Invención y no al hematocrito residual (aproximadamente 3%).

La Figura 20 es una representación gráfica de datos recogidos del Ejemplo X. Tanto en las Figuras 20(A) como 20(B), las ordenadas representan el porcentaje de hematocrito con relación al volumen de sangre mientras que las abscisas representan el tiempo en minutos. Tanto los grupos de prueba como los de control mostraban una disminución similar en el hematocrito durante la transfusión de intercambio.

La Figura 21 es una representación gráfica de datos experimentales recogidos en el transcurso del Ejemplo X. La Figura 21(A) son datos recogidos de cuatro perros de prueba, mientras que la Figura 21(B) son datos recogidos de tres perros de control transfundidos con solución de hidroxietilalmidón (HES). El grupo de prueba muestra un incremento progresivo en la hemoglobina en plasma (libre) hasta aproximadamente 6 por ciento durante el intercambio, en contraste con el grupo de control. Las ordenadas representan los gramos por 100 ml de volumen de sangre.

La Figura 22 es una representación gráfica de datos recogidos del Ejemplo X. La comparación de cuatro perros de prueba (figura superior) y tres perros de control (figura inferior) demuestra que los animales de prueba que recibían Hemoglobina de la Invención mantenían gastos cardíacos estables en contraste con el grupo de control que mostraba un gasto cardíaco creciente asociado con disminuir el hematocrito y el contenido de oxígeno arterial. En la Figura 22, las ordenadas representan los litros por minuto de gasto (flujo) cardíaco mientras que las abscisas representan el tiempo en minutos.

La Figura 23 representa una representación gráfica de datos recogidos durante la realización del Ejemplo X. Una comparación de cuatro perros de prueba (figura superior) y tres perros de control (figura inferior) muestra un contenido de oxígeno arterial reducido pero adecuado y bien mantenido durante el intercambio en el grupo de prueba en contraste con el grupo de control, que tenía una disminución progresiva en el contenido de oxígeno asociada con el hematocrito decreciente. En la Figura 23, las ordenadas representan el contenido de oxígeno arterial mientras que las abscisas representan el tiempo en minutos.

La Figura 24 representa una comparación gráfica de cuatro perros de prueba (figura superior) y tres perros de control (figura inferior). Las ordenadas en la Figura 23 representan contenido de oxígeno venoso mientras que las abscisas representan tiempo en minutos. El grupo de prueba muestra contenidos de oxígeno venoso reducidos pero adecuados bien mantenidos durante el intercambio en contraste con el grupo de control que tenía una disminución progresiva en el contenido de oxígeno asociada con el hematocrito decreciente.

Descripción de las modalidades preferidas

El producto preparado mediante la presente invención comprende un sucedáneo de sangre bovino que es una solución de hemoglobina reticulada que tiene una distribución del peso molecular de más de 90% en el intervalo de 68.000 a 500.000 daltons, una osmolaridad, según se mide mediante la disminución del punto de congelación, en el intervalo de 180-320 miliosmoles por litro de solución, un contenido de hemoglobina final de 5-25, preferiblemente

\hbox{9-13}

gramos por decilitro, un contenido de methemoglobina de menos de 20% y preferiblemente menos de 10%, niveles fisiológicos de cloruro sódico y cloruro potásico, menos de 1 nanomol de fosfolípido por mililitro, menos de 1 parte por millón de agente de reticulación, una P_{50} en el intervalo de 2.399,4-4,798,8 Pa (18-36 mm de Hg), preferiblemente 3.211,2-4.281,6 Pa (24-32 mm de Hg) y una semi-vida intramuscular de al menos 4 días, permaneciendo al menos una porción del material en el cuerpo durante al menos de 6 a 8 días.

Se sabe en la especialidad que el término ``P_{50}'' describe la interacción entre oxígeno y hemoglobina y representa la presión parcial de oxígeno (pO2) a una saturación de 50% de hemoglobina. Esta interacción se representa frecuentemente como una curva de disociación del oxígeno con el porcentaje de saturación de hemoglobina registrado en el eje de ordenadas y la presión parcial de oxígeno en Pa [milímetros de mercurio (mm de Hg) o torrs] registrada en las abscisas.

Por el termino ``semi-vida intravascular'' se entiende el período de tiempo en el que la cantidad inicial de hemoglobina en un ambiente in vivo cae hasta la mitad de su valor inicial.

El sucedáneo de sangre se caracteriza además por un perfil de reticulación en la cromatografía de penetración en gel de 50-70% de reticulación, sin que sea detectable material que tiene un peso molecular de menos de 68.000.

El perfil para la cromatografía de penetración en gel del sucedáneo de sangre puede caracterizarse por la integración desde un peso molecular bajo hasta un volumen excluido total donde la cantidad de reticulación es de 50% a 75 u 80%. Una modalidad preferida de la invención muestra una distribución del peso molecular de más de aproximadamente 90% en el intervalo de PM 68.000 a PM 500.000, donde no más de 10 a 15% del material está en el volumen excluido que está en el intervalo de PM 400.000 a 500.000 y superior. Después de una filtración cuidadosa, el cromatograma de penetración en gel también muestra que casi nada del material, si hay algo, está por debajo del nivel de PM 68.000. El pico de peso molecular 68.000 inicial de hemoglobina pura, según se mide mediante la cromatografía de penetración en gel, se amplía después de la polimerización de modo que el tiempo de retención del PM 68.000 está algo complejado de modo que es mayor - hasta PM 90.000. La integración puede realizarse en este pico final de modo que se encuentra que al menos 20% estará en el intervalo de PM 68.000. Esta fracción no provoca una respuesta tóxica en el animal, sino que meramente es escretada por los riñones y puede observarse en la orina durante el muestreo.

Adicionalmente, el sucedáneo de sangre preparado mediante el procedimiento de la invención está sustancialmente libre de endotoxinas y también libre de pirógenos, y no provoca ninguna de las siguientes funciones químicas y fisiológicas anormales y perjudiciales in vivo: (1) no activa el complemento; (2) no causa trastornos hemorrágicos; (3) no provoca función o agregación de plaquetas anormal; (4) no provoca tiempos de protrombina (PT) anormales; (5) no provoca tiempos de tromboplastina parciales anormales; (6) no interfiere con la tipificación o la prueba de compatibilidad cruzada de la sangre; (7) es atóxico para los riñones en 3,5 gramos por kilogramo de peso corporal u 8 gramos por decilitro de volumen de sangre en circulación; (8) exhibe una persistencia en circulación de al menos siete días; y (9) actúa como un estímulo para la eritropoyesis acelerada.

Por el término ``sucedáneo de sangre'' se entiende que es un material que tiene la capacidad de transportar y suministrar oxígeno a órganos y tejidos vitales y de mantener la presión oncótica intravascular. De acuerdo con esto, el término abarca materiales conocidos en la especialidad como ``expansores del plasma'' y también ``fluidos de resucitación''.

Se entiende que el término ``reticulado'' o ``polimerizado'' abarca tanto polihemoglobina intermolecular como intramolecular, con al menos 50% de la polihemoglobina de forma más que tetrámera.

El término ``libre de endotoxina'', para los propósitos de la presente invención, puede describirse funcionalmente como un sucedáneo de sangre que contiene menos de 1,0 unidades de endotoxina por mililitro de solución, a una concentración de 10 gramos de hemoglobina por decilitro de solución. Este sucedáneo de sangre, cuando se usa como un sustituto para aproximadamente un tercio del volumen de sangre total de un conejo, produce un porcentaje de cambio en los niveles de plaquetas en sangre, durante el tiempo, que es sustancialmente similar a la Curva delta-delta de la Figura 2, o un porcentaje de cambio en los niveles de glóbulos blancos, durante el tiempo, que es sustancialmente similar a la Curva delta-delta de la Figura 3, o un porcentaje de cambio en los niveles de fibrinógeno, durante el tiempo, que es sustancialmente similar a la Curva delta- delta de la Figura 4, o un porcentaje de cambio en los niveles de protrombina, durante el tiempo, que es similar a la Curva delta-delta de la Figura 5, o un porcentaje de cambio en los niveles de creatinina en suero, durante el tiempo, que es sustancialmente similar a la Curva delta-delta de la Figura 6.

En una modalidad preferida, el sucedáneo de sangre ``libre de endotoxinas'' preparado mediante la invención contendrá menos de 0,05, y preferiblemente menos de 0,25, lo más preferiblemente menos de 0,02 unidades de endotoxina por mililitro de solución (UE/ml) según se mide mediante el ensayo del Lisado Amebocítico de Limulus (LAL). El ensayo del LAL es descrito por Nachum y otros, Laboratory Medicine, 13: 112-117 (1982) y Pearson III y otros, Bioscience, 30: 461-464 (1980).

Por el termino ``endotoxina o endotoxinas'' se entiende los lipopolisacáridos generalmente unidos a células producidos como una parte de la capa de externa paredes celulares bacterianas, que bajo muchas condiciones son tóxicos. Cuando se inyectan en un animal, las endotoxinas provocan fiebre, diarrea, choque hemorrágico y otros daños tisulares.

Por el termino ``unidad endotóxica'' (UE) se entiende el significado dado por the United States Pharmacopeial Convention of 1983, Página 3014, que definía la UE como la actividad contenida en 0,2 nanogramos del lote estándar de referencia de EE.UU. EC-2. Un vial de EC-2 contiene 5.000 UE.

Cada una de las etapas del procedimiento se describirá con más detalle a continuación.

I. El procedimiento A. Recogida de sangre

El punto de partida en la presente invención es una fuente de eritrocitos (glóbulos rojos). Como tal, el material de partida es sangre bovina. Debido a su fácil disponibilidad, la sangre bovina obtenida de mataderos es la fuente de eritrocitos preferida.

El sistema único de la presente invención ha requerido técnicas especiales en la recogida y el manejo de sangre en grandes cantidades. Se usan trocares de recogida grandes que extraen la sangre de una manera estéril. Los trocares requieren una inserción y un manejo cuidadosos y están conectados a un tubo de aproximadamente 2 pies de longitud. Para insertar el trocar la piel debe cortarse, separarse y el trocar insertarse a continuación en los vasos principales del animal cercanos al corazón con cuidado de no pinchar el esófago. Es importante evitar la introducción de bacterias y el mantenimiento de un material libre de endotoxinas o con un nivel de endotoxinas bajo. Esto se consigue usando contenedores individuales que están precargados con un anticoagulante y que se despirogenan y se verifican de nuevo con respecto a las endotoxinas. Anticoagulantes típicos incluyen citrato sódico. En todos los casos, los niveles de endotoxinas de los contenedores deben ser menores que 0,01 unidades de endotoxina, según se detecta mediante LAL.

Esta solución se carga a continuación a recipientes pequeños que pueden contener entre 7,57-37,85 l (de 2 a 10 galones) de sangre reunida de una manera estéril y, por lo tanto, mantienen la sangre en un estado de libre de endotoxinas. La sangre recogida en su contenedor se tapa inmediatamente para evitar la exposición al ambiente. Al terminar del procedimiento de recogida, el material se refrigera, típicamente hasta aproximadamente 4ºC, para limitar el crecimiento de bacterias. No hay acumulación de sangre en este momento; la sangre se verifica más tarde con respecto a las endotoxinas y la esterilidad para asegurar que (1) ninguna vaca esté enferma; o (2) una mala técnica de recogida haya contaminado toda la partida o la recogida de ese día.

B. Separación de glóbulos rojos

La sangre se lleva hasta un centro de procesamiento, momento en el cual cada recipiente se muestrea y se verifica mediante análisis de LAL con respecto a los niveles de endotoxinas. Si el nivel de endotoxinas es superior que 6-7 UE por ml, la sangre se descarta. Sólo si el contenedor de sangre individual da por debajo de ese nivel de endotoxinas, el material se aprueba para el procesamiento secundario.

El procesamiento secundario típico de la especialidad anterior era suspender la sangre (sangre anticoagulada ACD) en una solución salina de concentración de sal fisiológica y centrifugar para separar eficazmente las proteínas del plasma y los glóbulos blancos de los glóbulos rojos. Este procedimiento de suspensión se realiza a través de varias etapas de ``lavado'', es decir, 2-4 veces, en un intento de retirar todas las proteínas libres. En el procedimiento de la presente invención, sin embargo, se encontró que este sistema era insostenible para el aumento a escala de fabricación práctico; de hecho, separar el producto de hemoglobina libre de muchos contaminantes no es necesario en absoluto para realizar este procedimiento de lavado.

En el procedimiento preferido, la sangre entera del animal, una vez que se ha verificado con respecto a las endotoxinas, se hace pasar a través de una centrífuga de tipo semicontinuo en la que los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma pueden separarse eficazmente a una escala tan grande como se desee. El procedimiento emplea una centrífuga semicontinua de tipo cubeta en la que la cubeta se mantiene de 15.000 a 18.000 rpm, es decir, una unidad Sharples AS-15. La configuración de la cubeta y la tapa se establecen con una abertura a un radio particular que permite una separación de capas discretas de modo que los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma pueden retirarse a lo largo de la operación. Aunque se prefiere la centrífuga de tipo cubeta Sharples, aparatos de separación típicos también adecuados incluyen centrífugas de cesta tales como las fabricadas por Beckman Instruments.

Para prepararla para esta operación, la centrífuga se despirogena, es decir, usando, típicamente, un hidróxido sódico 0,5 molar durante al menos 1 hora antes de la instalación en el contenedor de alojamiento de la máquina. Los canales o dispositivos de recogida superiores se manejan de un modo similar, permitiendo así la despirogenización completa de todas las superficies de contacto que puede encontrar la sangre. Una vez que las partes se han pasado a través del procedimiento de despirogenización, el sistema se monta. Se usa una bomba de lóbulos o una bomba peristáltica con diseño sanitario para barrer fluido a través de todo el sistema y las compuertas de recogida; típicamente, se usa una solución de hidróxido sódico 0,5 molar, pero también son adecuadas otras soluciones despirogenizantes conocidas en la especialidad. Al terminar el barrido, es necesario reducir el pH hasta un intervalo que es propicio para el manejo de la solución de hemoglobina. Esto se consigue a través de una purga de agua que reduce el pH hasta un intervalo de aproximadamente 7-9. En algunos casos, ha sido necesario, debido a las diferencias de densidad entre la solución de despirogenización y el agua, usar una solución ácida para ayudar a neutralizar la base fuerte empleada en la etapa de despirogenización. Todas esta soluciones deben despirogenizarse y verificarse antes de usar en los lavados.

Una vez que el pH se ha llevado por debajo de 9, se obtienen muestras a partir de las corrientes efluentes de la centrífuga y se realiza la prueba para endotoxinas. Cuando se alcanza un nivel de endotoxinas de 0,01 UE/ml o menos, el sistema está listo para la separación de la sangre. Sin embargo, en esta separación, es crítico que el caudal de la sangre a la centrífuga esté a una velocidad suficiente para limitar la cantidad de sedimentación de glóbulos rojos provocada en la centrífuga Sharples. Si el caudal es demasiado bajo, los glóbulos rojos se sedimentarán en la cubeta de la centrífuga y no se separarán o no podrán recogerse en un contenedor separado. En una centrífuga con una cubeta de 4 pulgadas de diámetro, se requiere un caudal por encima de 2,5 a 3 litros por minuto, pero que no supere 6 litros por minuto, para limitar la sedimentación. Si se emplean una cubeta más grande o diferentes fuerzas g, entonces se requieren diferentes caudales, estando los parámetros particulares dentro de la experiencia de la especialidad.

Una vez que se han establecido todos los parámetros, la sangre de las diversas partidas o diversas vacas se introduce en el sistema y el efluente (glóbulos rojos separados) se recoge bajo condiciones estériles en un contenedor separado. Sin embargo, en este punto el efluente está acumulado y ya no se trata sobre una base de animales individuales. Para eliminar cualquier variación de pH o el atrapamiento inicial potencial de bacterias en la centrífuga, se aplica nitrógeno estéril a presión positiva a la cámara donde gira la cubeta. Para una esterilización verdadera del sistema, puede aplicarse un ciclo de esterilización con vapor de agua introduciendo vapor de agua en la cámara de giro de la cubeta y tratando con vapor de agua durante hasta una hora antes de usar. Después de la terminación del tratamiento con vapor de agua, el sistema se enfría, a saber, a través de tubos refrigerantes de glicol, típicamente hasta aproximadamente 4ºC. (Después de la recogida desde el animal, es importante que la sangre se lleve hasta y se mantenga a una temperatura justo por encima de la congelación, típicamente aproximadamente 4ºC).

En la separación de los glóbulos rojos es importante que la cámara de recogida, es decir el área de los canales, donde se recogen los glóbulos rojos en la tapa de la cubeta que gira a alta velocidad, se configure de modo que se produzca un alto impacto de las células. Al chocar con estas superficies, los glóbulos rojos se rompen a través de una degradación mecánica, en oposición a usar una solución hipotónica. (En una solución hipotónica, los glóbulos rojos se hinchan y hacen que la membrana se rompa a partir de fuerzas hidráulicas). Este es un cambio con respecto a la operación normal de hinchar las células para someterlas a lisis mediante presión hidráulica hasta una degradación mecánica. Esta degradación mecánica es extremadamente rápida y no genera el alto grado de componentes de membrana celular pequeños libres encontrados por otros métodos. Los glóbulos rojos se recogen en un recipiente y se preparan para la segunda operación en la centrífuga.

C. Clarificación de glóbulos rojos

Una vez que la sangre se ha procesado y los glóbulos rojos se han separado de los glóbulos blancos y el plasma, los glóbulos rojos rotos mecánicamente se diluyen usando agua despirogenizada pura que se ha mantenido a temperatura baja, es decir, aproximadamente 4ºC. Típicamente, los glóbulos rojos rotos se diluyen al menos 50%. Los glóbulos rojos se introducen a continuación en la segunda etapa de separación; típicamente puede usarse un tipo similar de centrífuga al de la primera operación. En una modalidad preferida, se usa una centrífuga Sharples con una cubeta de 4 pulgadas que funciona de un modo semicontinuo y que gira a de 15.000 a 18.000 rpm. El caudal, sin embargo, se disminuye sustancialmente: se recomiendan 0,5 litros por minuto o menos. A diferencia de la primera etapa de procesamiento, esta etapa emplea un tipo diferente de configuración superior para la cubeta de centrifugación. No se efectúa en esta etapa la separación de dos capas tales como la composición de plasma-glóbulos blancos y la de glóbulos rojos. Esta etapa de clarificación da como resultado la separación de todos los residuos celulares de la solución de hemoglobina liberada. Debe emplearse en la segunda etapa el mismo cuidado adoptado en la primera etapa para la despirogenización y la esterilidad. Una vez que este material se ha recogido de esta segunda etapa, está listo para la filtración microporosa.

D. Filtración microporosa

La filtración microporosa puede ponerse en práctica de forma diferente que un modo de filtración bajo presión. En un sentido práctico, la filtración bajo presión no es aceptable para procesamiento a escala industrial de soluciones de hemoglobina. Para emplear la filtración microporosa satisfactoriamente, puede usarse una filtración de platos y marcos o un sistema de filtración de fibra hueca, sin embargo, debe ponerse en práctica de modo que la caída de presión a través de la membrana (la presión de transmembrana) se mantenga cuidadosamente hasta dentro de aproximadamente 3.447 x 10^{5} Pa [5 libras por pulgada cuadrada (psi)]. Si la caída de presión supera el nivel de tolerancia en de 1 a 2 psi, la membrana se obtura rápidamente con los residuos celulares restantes y la velocidad de flujo a través de la membrana cae hasta un nivel inaceptable para la purificación industrial de un modo semicontinuo.

Mientras que el flujo tangencial de este material a través de la membrana está a un caudal de 2 a 5 litros por minuto, el flujo a través de la membrana es del orden de 0,1 a 0,2 litros por minuto. Esta velocidad de trabajo se mantiene para eliminar la acumulación de residuos celulares sobre la membrana. Cuando la concentración de solución tangencial a la membrana disminuye hasta menos de 10% de la solución inicial, la solución restante se descarta o se vuelve a diluir con agua para extraer producto adicional y de ese modo producir un alto rendimiento de hemoglobina a partir del sistema.

El sistema de filtración puede utilizar bombas de lóbulos o peristálticas con diseño sanitario, disminuyendo así las juntas limitativas y los ejes que pueden provocar la introducción de bacterias y la contaminación con pirógenos. Sin embargo, pueden usarse otros diseños de bombas conocidos en la especialidad para el bombeo sanitario. Tales bombas incluyen bombas centrífugas, de engranajes y de diafragma tubular.

Los sistemas de membrana se precalientan para asegurar la despirogenización y un pH apropiado. Si se manejan inapropiadamente, se añaden pirógenos en este punto y se hace más y más difícil retirarlos a lo largo de las etapas de procesamiento restantes. La despirogenización y el control del pH se efectúan usando procedimientos de saneamiento y procedimientos de despirogenización estándar, es decir, típicamente con hidróxido sódico y lavados voluminosos con agua libre de pirógenos hasta llevar el pH hasta dentro de intervalos aceptables para el manejo de la solución de hemoglobina (<pH 9). Aunque el manejo de una limitación de presión de transmembrana de tal manera no es bien conocido y sólo se ha puesto en práctica en los últimos años sobre una base seleccionada con el procesamiento de fluidos tisulares, las técnicas adecuadas están dentro de la experiencia de la especialidad.

En una modalidad preferida, se emplea una restricción de la cara del filtrado de modo que la velocidad de flujo se limita a su condición de estado estacionario (sin obturación). Si se aplica una corriente de fluido a un sistema de membrana de flujo tangencial y la presión de entrada es aproximadamente 1.379 x 10^{5} Pa (20 psig), la presión de salida es 0 Pa y la cara del filtrado de la membrana está a 0 Pa, dando una presión de transmembrana media (ATP) de 0,689 x 10^{5} Pa (10 psi). La solución que ha de filtrarse tiene una tendencia a rellenar y extruirse en la superficie de la membrana porosa. Esencialmente obtura la membrana y no será eliminada por barrido mediante el cizallamiento tangencial creado por el flujo cruzado de fluido. Restringiendo la salida (filtrado) de modo que la ATP sea sólo 0,0689-0,1379 Pa (de 1 a 2 psi), el flujo tangencial limpia por arrastre la superficie y el flujo a través de la membrana permanece constante y sin embargo bajo en comparación con las velocidades de flujo iniciales con ATP alta. El flujo bajo condiciones de estado estacionario puede ser 0,2 litros por minuto, con 0,0689-0,1379 Pa (de 1 a 2 psi) de ATP, y de 1 a 1,2 litros por minuto con 1-379 x 10^{5} Pa (20 psi) de ATP. Sin embargo, la ATP de 1.379 x 10^{5} Pa (psi) permanecerá constante y hará que el flujo caiga rápidamente hasta flujo cero en minutos.

Con la terminación de esta primera etapa de filtración microporosa, la solución se ha esterilizado al menos parcialmente y sustancialmente todos los residuos celulares por encima de 0,45 micrómetros se han retirado. En algunos casos, puede requerirse esterilizar la solución en este punto. En estos casos, después de que se haya completado la filtración microporosa de 0,45 micrómetros, puede emplearse una filtración de 0,22 micrómetros de la misma manera que la filtración de 0,45 micrómetros. La solución resultante estará lista para las separaciones moleculares que siguen.

E. Ultrafiltración

La siguiente etapa incluye la puesta en práctica cuidadosa de una filtración de un peso molecular de 10.000 (medido en daltons) usando membranas que retienen eficazmente todo lo mayor que un peso molecular de 10.000 y que permiten que pase a su través todo lo menor que un peso molecular de 100.000. Membranas típicas están disponibles comercialmente de Millipore Corporation, y se venden bajo el nombre comercial Durapore. Todo lo que esté por debajo de estos niveles inferiores es filtrado a través del sistema de membrana. La hemoglobina (peso molecular de aproximadamente 67-68.000) pasa a través de este sistema de membrana y es recogido en un depósito.

Esta operación de filtración con membrana grande requiere una verificación cuidadosa debido a que, durante un período de horas, la membrana se obturará y el flujo de filtración disminuirá rápidamente. Por lo tanto, es necesario barrer la membrana regularmente con una solución de agua pura. El barrido reduce residuos celulares que de otro modo revestirían y ocluirían la membrana, reduciendo de ese modo la velocidad de flujo de la solución de hemoglobina. El ciclo temporal del flujo cruzado tangencial sobre esta membrana puede ser hasta 2 horas y no afecta al nivel de methemoglobina o a la viabilidad de la hemoglobina para su uso pretendido. Cuando el volumen de fluido después de la filtración microporosa se ha reducido hasta aproximadamente 30% de su volumen durante la ultrafiltración, puede añadirse agua libre de pirógenos estéril para obtener un mayor rendimiento de la solución de hemoglobina. La dilución máxima es aproximadamente 50%. Este material también puede descartarse. Si se diluye 30% del material original, de nuevo puede reducirse hasta aproximadamente 30%, momento en el que se descarta. El producto intermedio filtrado se mantiene en un depósito libre de pirógenos estéril para operaciones subsiguientes. Un dispositivo típico para efectuar la etapa de ultrafiltración es el casete Millipore® Pellicon con una membrana Durapore®; sin embargo, también pueden usarse otros dispositivos conocidos en la técnica.

La siguiente etapa de ultrafiltración requiere una retirada de material por debajo de un peso molecular de 68.000. Esto aísla la pequeña molécula hemoglobina y otros proteínas pequeñas que pueden haberse arrastrado desde el plasma de sangre entera. En todos los casos, la solución de hemoglobina se mantiene a una concentración de aproximadamente 5 a 15 gramos por decilitro. La filtración efectuada en esta etapa proporciona algún grado de concentración. A alta concentración, se exhiben velocidades de flujo bajas. En ambas operaciones de ultrafiltración en las que se emplean membranas de PM 100.000 y PM 30.000, se requieren habitualmente las etapas de despirogenización necesarias y la comprobación subsiguiente después del lavado con agua libre de pirógenos.

En la etapa de separación de PM 100.000, los pirógenos pueden retirarse ya que algunos pirógenos están en un peso molecular entre 100.000 y 1.000.000. Con la despirogenización de la membrana de un peso molecular de 30.000 y la preparación de este paquete de membranas para su procedimiento de filtración, la solución de hemoglobina ha pasado sobre este sistema de flujo tangencial para permitir la perfusión de moléculas pequeñas a través de la membrana. Puede o no usarse reciclado en esta operación, aunque se requiere en la etapa de filtración de PM 100.000. El retenido (material retenido) se mantiene en un depósito de almacenamiento y se verifica con respecto a las endotoxinas. En todos los casos, las endotoxinas deben estar por debajo de 0,5 UE por ml debido a que las operaciones subsiguientes hacen bastante difícil la retirada de altos niveles de pirógenos. Este material se almacena bajo una atmósfera de nitrógeno o argón estéril que mantiene estabilidad en el sistema de depósito. Típicamente, el nivel de methemoglobina está por debajo de 1% en este punto en el procedimiento. Las etapas de filtración deben realizarse a bajas temperaturas, típicamente a aproximadamente 4ºC. Después de la filtración, el material se congela o se divide en partes alícuotas directamente hasta tamaños de lote para el procesamiento cromatográfico a gran escala.

F. Cromatografía

Antes de la separación cromatográfica, el material está en un estado concentrado de no menos de 2 gramos por decilitro y no más de 11 gramos por decilitro. El sistema cromatográfico incluye bombas, un generador de gradiente, columnas y detectores.

Un sistema de bombeo típico comprende un sistema de bombeo de diafragma con un intervalo de 1 a 5 litros por minuto de capacidad de bombeo. Tal sistema incluye una bomba de diafragma de acero inoxidable Pulsafeeder 8480 o equivalente. Para el sistema de alimentación se usa una bomba más pequeña en la que el flujo variará de 0,1 litros por minuto a 1,5 litros por minuto. La bomba es típicamente una bomba de volumen más pequeño y sería de un diseño de diafragma tubular. Una bomba típica para esta operación es una Pulsafeeder 7120. Para configurar el sistema cromatográfico de modo que funcione apropiadamente, se requiere montar dos sistemas grandes de modo que uno se usaría como el sistema de trabajo para cromatografiar el material mientras que el otro sistema se usaría para el barrido, la limpieza y la regeneración de la columna.

Se ha fabricado un sistema de generación de la composición de disolventes y está comprendido por válvulas de control del flujo que aportan al sistema de bombeo aplicable una cantidad proporcional de dos fluidos que generan un gradiente de composición fluida durante el tiempo, de una intensidad iónica específica. La interacción iónica se usa para efectuar una separación cromatográfica de intercambio iónico en el sistema de columna. La fabricación de este sistema o sistemas equivalentes está dentro de la experiencia de la especialidad.

Una válvula de control del flujo típica es una válvula de control del flujo Baumann, que se ha programado para funcionar usando un controlador programable estándar, por ejemplo un controlador programable Texas Instrument 530. Todo el dispositivo de tuberías y tubos que van al sistema es de naturaleza sanitaria y está elaborado a partir de tubo 316L de aproximadamente 1/2 pulgadas a 1 pulgada de diámetro. El sistema de alimentación a través del generador de gradiente y a través de la bomba es presentado a un segmento de separación o una columna como se conoce en la especialidad.

La columna está hecha típicamente de tubería inoxidable. La tubería inoxidable puede interconexarse con un tubo de 1,27 cm (1/2 pulgadas) de diámetro, de modo que comprenderá una columna larga para efectuar una separación. La tubería o la columna está revestida típicamente con teflón para adaptarse a la superficie interna, lo que es útil para efectuar el relleno del medio interno del sistema de columna.

El efluente del sistema cromatográfico puede verificarse mediante una separación de la corriente y haciendo pasar esa cantidad representativa pequeña a través de un detector del índice de refracción como un modelo R401 de Waters Associates o un detector ultravioleta, típicamente un número de modelo de Waters Associates 441. Estos sistemas pueden usarse para verificar la corriente efluente de la columna para detectar el punto en el que se está eluyendo la proteína de interés.

Una vez que se han establecido todos los parámetros y se han fijado las directrices, no hay necesidad de un detector en el sistema y la recogida de fracciones puede alcanzarse a través de perfiles de elución temporales simples.

Estos materiales pueden fabricarse o adquirirse de diversos suministradores de tuberías y tubos de calidad industrial. La columna se fabrica para alcanzar una distribución uniforme de la muestra que se presenta a la parte superior de la columna y, junto con ella, la recogida de muestra uniforme procedente del efluente de la columna. La relación de longitud a diámetro es significativa ya que crear una columna que sea demasiado larga o demasiado corta afectará significativamente a la eficacia de la separación y la equilibración para realizar el intercambio iónico.

La columna está comprendida por medios de separación que permiten una adsorción irreversible de fosfolípidos (irreversible en el modo de operación simple) y una separación de intercambio iónico discreta usando un modelo especificado de elución de gradiente del disolvente. Los medios de separación comprenden partículas de gel de sílice de aproximadamente 50 a 150 micras de tamaño; el flujo a través de este material está en el intervalo de aproximadamente 2,5 litros por minuto.

El gel de sílice es de un tamaño de poro medio de 30 unidades de nm (300 Angstroms), según se mide mediante absorción de nitrógeno BET. El gel de sílice está disponible de diversos fabricantes, es decir, W.R. Grace Davison Chemical Co. Este gel es el sustrato preferido sobre el que construir la superficie derivada que da la propiedad funcionalizada para la separación de la solución de hemoglobina.

Para producir los medios de separación, es necesario derivar la superficie de sílice en primer lugar con un silano especial que crea un revestimiento de glicidoxipropiltrimetoxisilano en la superficie, con técnicas que son bien conocidas en el campo de la cromatografía, típicamente suspendiendo la sílice y el silano en un recipiente que se ha diluido parcialmente con agua. La reacción es una reacción basada en agua y este polímero revestirá la superficie de sílice. Esta reacción para revestir la sílice requiere un tiempo de reacción de 20 horas a aproximadamente 70ºC. Una vez que se ha alcanzado este revestimiento sobre la sílice, el material simplemente puede lavarse mediante una serie de lavados con metanol y acetona para crear una sílice revestida con diol, permanentemente unida. A continuación, el material se seca y se prepara para la segunda etapa o serie de etapas donde se revisten diferentes monómeros sobre la superficie y la superficie se derivará para tener una propiedad superficial de tipo amina cuaternaria para efectuar o realizar el tipo específico de separación por intercambio iónico. La fase estacionaria orgánica es una cobertura delgada de polímero reticulado. El polímero reticulado que se pone sobre la superficie se acumula a partir de dos monómeros vinílicos hidrófilos diferentes. Por ejemplo, uno puede usar un monómero tal como n-metil/alacrilamida en solución acuosa al 48% (Silar Labs) y cloruro de metilamidopropiltrimetilamonio.

Los dos monómeros tienen diversas capacidades; un monómero se copolimerizará con otro monomero funcional, es decir, uno que tiene las propiedades de intercambio iónico o absorción deseadas. Se reticulará con otras cadenas de polímeros y anclará el polímero reticulado a la superficie de sílice.

Los monómeros específicos elegidos para este propósito tienen una funcionalidad de vinilo y grupos reactivos que reaccionan de tal modo que pueden reaccionar entre sí, formando los puentes que son necesarios para revestirse la superficie y el revestimiento de una fase estacionaria que consiste en un grupo funcional amina, produciendo de ese modo una capacidad de intercambio iónico en el intervalo deseado.

Una vez que estos dos monómeros se han suspendido en la solución acuosa, así como con una solución en metanol de la sílice, la solución en suspensión se evapora dejando los monómeros revestidos sobre y dentro del gel de sílice. En esta fase la mezcla se resuspende en una nueva solución que también incluye un sistema de iniciación de radicales, tal como un producto de Dupont, Vazo 64. Para iniciar la reacción, la mezcla de reacción se calienta hasta el punto en el que debe mantenerse a 70-75ºC, ni por encima ni por debajo.

A esta temperatura la reacción avanza y el polímero se reviste sobre y se une a la superficie, incluyendo los grupos funcionales que producen la propiedad superficial usada en los medios cromatográficos. Cuando la reacción se ha completado, es necesario retirar monómero sin reaccionar con una serie de lavados con varios disolventes, tales como acetona y metanol. Después de la terminación de todos estos lavados, el material se seca y está listo para usar.

Un diámetro de columna típico es 6 pulgadas y una longitud de columna típica es 2 pies. Sin embargo, variaciones adecuadas están dentro de la experiencia de la especialidad. La presión de trabajo máxima es 500 psi. La inyección se realiza bombeando la solución en la columna, típicamente a una velocidad de 1 litro por minuto durante aproximadamente 1 minuto, a continuación la inyección se termina. Por lo tanto, el factor de carga no es mayor que 1 litro de material a 7 gramos por decilitro. Al terminar de cargar la solución de hemoglobina, un flujo isocrático de tampón (por ejemplo tampón de Tris a pH de 8,9 a 9,0) se aplica a la columna y continua fluyendo a través de la columna hasta el momento en el que se inicia el gradiente o flujo de composición variable. El tampón, como el eluyente primario, se diluye a continuación a lo largo del tiempo. Típicamente, el eluyente se elabora a partir de una solución de base de tampón de Tris que se elabora en una concentración de 1,8 gramos por litro de Tris con un pH de 8,6-9,2. El intervalo de temperatura para la elución es 3-10ºC. Estos intervalos son significativos ya que cambiar el intervalo de temperatura también cambia el pH de la solución de elución. La solución secundaria para eluir el material de interés puede prepararse usando una solución de tampón de Tris, altamente purificada de la misma manera que el tampón previo. Además, este tampón también contiene sal hasta una concentración 1 molar. Esta solución también se ajusta con respecto al pH para ser idéntica a la solución de pH original, que está en el intervalo de 8,6 a 9,2. La liberación de fosfolípidos tiene lugar antes de la elución de la hemoglobina, eluyendo endotoxinas después de que se haya recogido el pico de hemoglobina de interés.

La técnica de selección cromatográfica se realiza mediante absorción de UV, índice de refracción, usando típicamente un equipo como el descrito previamente, u observación visible de la corriente efluente. Típicamennte, la primera porción de la hemoglobina que se eluye se descarta como residuo; a continuación comienza la recogida de efluente y continúa hasta que el pico o la respuesta se ha reducido hasta de 20% a 10% de su amplitud del pico. Esto constituye la fracción que ha de recogerse y la fracción de interés para la purificación. Si el punto de recogida va más allá del tiempo de retención apropiado, entonces pueden recogerse otras proteínas y/o endotoxinas y el producto puede hacerse inutilizable. De forma similar, si se recoge antes de un tiempo de retención del pico, el material puede contener niveles inaceptables de endotoxinas. El conteo de fosfolípidos y los subcomponentes extraños de hemoglobina se descartan, tanto de los picos de pre-retención como de los picos post-retenidos. Este procedimiento de recogida da un material de producto intermedio que se ha diluido aproximadamente de 40 a 1, en un intervalo de pH de 8,9 a 9,0.

En este intervalo de pH, es necesario concentrar el material rápidamente. En este estado diluido, la aparición y la formación de methemoglobina se produce a una velocidad rápida. Para efectuar esta concentración, puede usarse una membrana de PM 10.000 o menos, son aceptables sistemas de flujo tangencial de platos y marcos o de flujo de fibra hueca. Sistemas típicos incluyen un casete Millipore® Pellicon. Cuando se alcanzan niveles de concentración de 7 a 10 gramos por decilitro y un nivel de methemoglobina de menos de 1,5%, las fracciones se recogen para el almacenamiento a largo plazo. En este punto, el material puede transportarse a un sistema de reacción para la reacción de polimerización subsiguiente.

Después de la recogida en el sistema cromatográfico, la columna cromatográfica sufre una secuencia de lavados para prepararla para una segunda carga de material no purificado. Si no se realiza esta preparación de la columna, se eluirán diversos subcomponentes y contaminantes e invalidarán los pasos subsiguientes. Típicamente, el lavado se efectúa usando un lavado de NaCl 0,5-1,0 molar libre de pirógenos al 100% durante un período de al menos 5 minutos, o 3 volúmenes de columna, y no más de 10 minutos, ó 6 volúmenes de columna. Al terminar el gradiente de tampón y el barrido con sal, la fase de fluido se devuelve a condiciones iniciales de tampón de Tris al 100% que es 0,18 gramos por litro de tampón de Tris, y el pH se ajusta hasta aproximadamente 8,9 \pm 0,1 para el procedimiento de elución de hemoglobina. Aunque se han estudiado intervalos del pH de la hemoglobina, el intervalo de pH 8,9-9 del sistema cromatográfico da el aislamiento más alto y mejor de un análogo de hemoglobina puro. A intervalos inferiores (8,6-8,4), la hemoglobina se eluye en estado puro pero la capacidad de carga de material sobre el material de separación se disminuye drásticamente. A niveles de pH de 9,5-11, se produce la formación de methemoglobina a una velocidad que la hace insostenible para mantener niveles de methemoglobina bajos. Además, existe el potencial de contaminación cruzada. Durante un período de 2 horas el nivel de methemoglobina puede incrementarse 5% a este intervalo de pH superior. El material que se eluye de la columna es una solución de hemoglobina que está sustancialmente libre de otras proteínas, endotoxinas y fosfolípidos. Este material tiene utilidad por sí mismo como un producto intermedio en la producción de un sucedáneo de sangre semisintético, libre de fosfolípidos, libre de endotoxinas, reticulado.

El almacenamiento a largo plazo de la solución de hemoglobina después de la concentración con cloruro sódico y tampón de Tris se ha llevado a cabo durante períodos de tan poco como 1 día y tanto como 6 meses. Los resultados no han mostrado degradación de producto o incremento en el nivel de methemoglobina si el producto se mantiene a -20ºC. Sin embargo, la solución, al descongelarse durante un período de 2 a 24 horas, puede exhibir un incremento en methemoglobina. Si se deja en un estado descongelado, el nivel de methemoglobina continua ascendiendo. En otros estudios en los que el material tenía un pH bajo (pH 7 e inferior) el incremento del nivel de methemoglobina es drástico, es decir un incremento de 10 puntos porcentuales en 3 horas.

La solución de hemoglobina tiene típicamente las siguientes características:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Especificaciones
de la solución de hemoglobina}\\\hline  Hemoglobina g/dl  \+
7-15 \\  Oxihemoglobina  \+ 90-100%
\\  Carboxihemoglobina  \+ 0-2% \\  Methemoglobina 
\+ 0-10% \\  pH  \+ 6,5-9,0 \\ 
Endotoxina, UE/ml  \+ <0,01 \\  Peso molecular, daltons  \+
68.000 \\  Fosfolípidos, revelados con yodo Plat para TLC -  \+ <
1 nanomol/ml \\  claros \+ \\  Análisis de aminoácidos  \+ Sin
amoniácidos de proteínas extrañas \\  Secuenciación
N-terminal  \+ 98% ^{+}  de acuerdo con la secuencia
de la  hemoglobina \\   \+ bovina \\  Gel de Page  \+ ¿Banda simple?
(sin contaminación por virus). \\  Las concentraciones de sal pueden
variar \+ \\  Cromatografía de alta resolución  \+ 99,9% ^{+} 
proteína hemoglobínica
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

G. Reacción de Polimerización (Reticulación)

Cuando el material se ha situado específicamente para la reacción de polimerización o se ha descongelado desde el estado congelado, se introduce en un reactor estéril libre de pirógenos que tiene álabes propulsores situados para efectuar una mezcladura rápida y un alto cizallamiento (un aparato típico es un fermentador Applicon de 3 litros con un propulsor de álabes planos situado a 1 pulgada del fondo del reactor y con 5 pantallas de media pulgada situadas alrededor del reactor. Esto es necesario para prevenir una gran formación de polímero cuando se añade agente de reticulación). La solución de hemoglobina añadida al reactor se pone en un sistema de recirculación y la solución de hemoglobina se retira del reactor y se hace pasar a través de una membrana de exclusión, típicamente un filtro de exclusión de PM 10.000, y se devuelve al reactor en un ambiente de bajo contenido de O_{2} (el reactor puede estar en una atmósfera de gas inerte, es decir argón). Este último procedimiento se efectúa haciendo vacío en el reactor y poniendo una atmósfera de argón sobre el líquido en este reactor. Se debe adoptar una precaución extrema para eliminar la introducción de bacterias en este punto; el material está libre de pirógenos, no exhibiendo endotoxinas mediante análisis de LAL.

Un tampón estéril libre de pirógenos (pH 8,9-9,1) se añade a continuación al reactor a través de un filtro de membrana de despirogenización, típicamente un filtro de peso molecular 10.000. Simultáneamente, un circuito de concentración de PM 10.000 se somete a un ciclo para equilibrar el volumen de fluido introducido y el fluido que sale del sistema reactor.

El tampón de reacción que se está usando para neutralizar el alto pH es una composición fisiológica de sodio, cloruro y potasio, con valores típicos de 120 miliequivalentes de sodio, 120 miliequivalentes de cloruro y 4 miliequivalentes de potasio. El pH de la solución se ajusta con HCl y base de Tris hasta un pH de 4,7 a 5,2. Si el pH es demasiado bajo durante el procedimiento de reducción del pH, se forman grandes cantidades de methemoglobina en el punto de introducción de la solución de ácido neutralizador. El procedimiento de filtración se mantiene hasta que el pH ha caído hasta un intervalo de 7,4 a 8,0 unidades de pH en el reactor. En este punto se termina la introducción y se efectúa la introducción de la solución de reticulación.

Agentes de reticulación adecuados se describen en la Patente de EE.UU. 4.001.200 de Bonsen y otros. Esta referencia resume varios reactivos de reticulación disponibles comercialmente ejemplares empezando en la columna 6, línea 66 y continuando hasta la columna 8, línea 49. La clase preferida de agentes de reticulación son los que tienen funcionalidad de aldehído, lo más preferiblemente dialdehídos, siendo el glutaraldehído el agente de reticulación de elección.

Cuando se usa glutaraldehído, el glutaraldehído se añade típicamente a una velocidad de aproximadamente 100 mililitros por hora. La solución de glutaraldehído se prepara típicamente descongelando un glutaraldehído con una especificación de alta pureza (almacenado a de -20ºC a 4ºC) en un espacio de tiempo corto, típicamente 2-5 minutos. Esta solución, que tiene preferiblemente aproximadamente una concentración de 25% de glutaraldehído, se añade a continuación a agua libre de pirógenos, cuyas proporciones constituyen una solución que es preferiblemente aproximadamente 5 mililitros de una solución al 25% diluida en 100 mililitros, a la velocidad especificada previamente para el reactor y la mezcla de reacción.

La verificación de la solución de reticulación y sus efectos sobre la reticulación (polimerización) se realiza mediante cromatografía de penetración en gel. La cromatografía de penetración en gel requiere el uso de una columna de material de relleno hidrófilo de un tamaño de poro de 30 nm (300 Angstroms) con una capacidad de resolución por encima de 24.000 platos por metro. Una columna típica está disponible de Waters Associates; un material de relleno típico es Waters Protein Pak 300SW. El cromatograma de elución que se registra se integra a lo largo del tiempo de la elución del pico y se cuantifica frente al material de partida. Preferiblemente, se alcanza un porcentaje de reticulación de 50% a 70%. Este número se determina mediante el porcentaje de material que se eluye de la columna que es menor de un peso molecular de 600.000 (daltons) y mayor de un peso molecular de 88.000 (daltons).

H. Concentración con membrana

Una vez que se ha alcanzado 50-55% de reticulación, según se calcula mediante cromatografía de penetración en gel, la solución está lista para la concentración en una membrana de 100.000 de peso molecular. Durante esta filtración en membrana, el flujo tangencial de la mezcla de reacción se hace pasar sobre la membrana con una penetración de material que es 68.000 o menos a través del sistema de membrana. Esto se realiza hasta que se ha alcanzado una reducción de 25% en el fluido.

En el punto en el que se considera que la reticulación es completa, se añade una solución de extinción, es decir una solución de lisina libre de pirógenos, pH 7. La concentración de la solución de lisina es un gramo por litro. Esta solución de lisina se añade para extinguir la reacción de polimerización de glutaraldehído con hemoglobina y para complejarse con el glutaraldehído en exceso. También se cree que este material se fijará a glutaraldehído no polimerizado unido a moléculas de hemoglobina. Al terminar esta adición, se determina la distribución del peso molecular y se encuentra que se ha estabilizado según se mide mediante cromatografía de penetración en gel. La filtración se inicia a continuación para retirar la lisina en exceso, el glutaraldehído en exceso y cualesquiera otras especies de un peso molecular que esté por debajo de PM 100.000.

La cromatografía de penetración en gel de la solución de hemoglobina no reticulada inicial exhibe tamaños del peso molecular de 16.000 a 68.000 daltons, con la cantidad mayor a 88.000 daltons. Después de la filtración, hay algo, no más de 50%, de hemoglobina de 68.000 daltons y la aparición de material de un peso molecular por debajo de 68.000 daltons no es detectable. La filtración del material después de la reticulación también proporciona la oportunidad de equilibrar los electrolitos y el pH de la solución y de ese modo da una solución fisiológica equilibrada para inyección.

Al terminar el procedimiento de filtración el material se retira del sistema y se introduce en bolsas listas para congelar. Al terminar todos los procedimientos y durante la introducción en bolsas, se extrae una muestra de material para pruebas.

II. El producto

La distribución del peso molecular del material tiene más de 90% del material en el intervalo de 68.000 daltons a 500.000 daltons. La osmolaridad, según se mide mediante la disminución del punto de congelación, es típicamente de 220 a 320 miliosmoles por litro de solución. El modelo electroforético exhibido en la electroforesis en gel muestra bandas en un intervalo del peso molecular de 68.000 a 500.000. El contenido de hemoglobina final puede ajustarse hasta de 5 a 25, preferiblemente de 9 a 13 gramos por decilitro, y el nivel de methemoglobina está por debajo de 20%, preferiblemente por debajo de 10%. Las concentraciones iónicas de cloruro sódico y potasio son atóxicas para el animal o para la especie que ha de probarse. La cromatografía en capa fina desarrollada para la detección de fosfolípidos exhibe una placa clara al revelar mediante tinción con yodo. Los fosfolípidos, según se determina mediante reducción con ácido fosfórico, no son detectables, con menos de 1 nanomol por mililitro como el límite de detección. La cromatografía de gases se usa como una medida cuantitativa para el glutaraldehído libre. Con una detección de una parte por millón mediante cromatografía de gases como el límite, no puede detectarse glutaraldehído. No están presentes otras proteínas distintas a la hemoglobina según se determina mediante técnicas de cromatografía en gel y enfoque isoeléctrico.

La solución generalmente tiene menos de 0,01 unidades de endotoxina por ml según se mide mediante ensayo de LAL (lisado amebocítico de limulus) con una escala de sensibilidad de 0,01 a 0,1, y está libre de pirógenos mediante todas las pruebas. Se han realizado estudios en conejos sobre este material que exhibe las mismas características que serían exhibidas por un material libre de pirógenos ya que los conejos no exhiben. Este material no produce ninguna respuesta de endotoxinas anormal y otros factores en los conejos que se están probando en lo que se refiere a estados hemorrágicas impuestos sobre un grupo de control de conejos a los que se les administró a continuación una fracción de plasma pura de un tercio de volumen. Debe apuntarse que, en todos los casos, hay algunos niveles elevados de enzimas y alguna histocompatibilidad que demostraban cambios en los órganos. Sin embargo, se consideró que la mayoría de estos cambios eran reversibles y, según se menciona previamente, similares a los encontrados debido a estados hemorrágicos y la sustitución por una fracción de proteína de plasma pura. Esto puede traducirse en una falta de respuesta endotoxínica y otros factores en animales superiores. La pureza, según se verifica mediante cromatografía líquida de alta resolución usando una capacidad de intercambio iónico para la separación, exhibe 4 picos discretos que, durante la cuantificación, son constantes entre partidas independientemente de la distribución del peso molecular caracterizada mediante cromatografía de penetración en gel. La sustancia producida exhibe capacidades de mantenimiento de la vida en el transporte de oxígeno, según se demuestra mediante valores de P_{50} de 1.379 x 10^{5}-3.746 Pa (de 20 a 28 mm, Torr). Además, de forma importante, las soluciones de hemoglobina preparadas mediante esta invención demuestran menos propiedades vasoconstrictoras clínicamente significativas que las mostradas por otras soluciones de hemoglobina reticulada de la especialidad anterior. El material exhibe además propiedades de apariencia celular incrementada de los glóbulos rojos en diversas especies de mamífero, y no provoca ninguna de las siguientes funciones químicas y fisiológicas anormales y perjudiciales in vivo: (1) no activa el complemento; (2) no provoca trastornos hemorrágicos; (3) no provoca una función o agregación anormal de las plaquetas; (4) no provoca tiempos de protrombina (PT) anormales; (5) no provoca tiempos de tromboplastina parciales anormales; (6) no interfiere con la tipificación de la sangre o las pruebas de compatibilidad cruzada; (7) es atóxico para los riñones en 3,5 gramos por kilogramo de peso corporal u 8 gramos por decilitro de volumen de sangre en circulación; (8) exhibe persistencia en circulación de al menos 7 días; y (9) actúa como un estímulo para la eritropoyesis acelerada. El material es típicamente como se caracteriza en la tabla siguiente.

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Caracterización
de sucedáneo de sangre típico preparado mediante
esta}\\\multicolumn{2}{|l|}{invención}\\\hline  Esterilidad, nivel 
\+ Estéril mediante una técnica de cultivo estándar, <0,01  UE/ml
de \\  de endotoxina  \+ muestra cuando se prueba mediante LAL y se
compara frente a \\  no detectable  \+ una curva estándar que varía
en sensibilidad de 0,01 UE/ml a \\   \+ 0,125 UE/ml \\\hline 
Contenido de la bolsa  \+ Na 1202 \pm 20 miliequivalentes, Cl
115 \pm 20 miliequivalentes, K \\   \+ 4,0 \pm 1 miliequivalentes \\
  \+ Hemoglobina 11 gramos  \pm  2 por decilitro, lisina <1
gramo/litro \\   \+ Glutaraldehído - nada detectable, Tris <1,5
gramos/litro \\   \+ Volumen de H _{2} O libre de pirógenos -
450-500 ml, Methemoglobina \\   \+ <10% \\   \+
Fosfolípido <1 nanomol/ml \\   \+ Distribución del peso molecular
de la hemoglobina: \\   \+ % mayor que 68.000 - al menos 50% \\   \+
% mayor que 500.000 - 8%  \pm  2% \\   \+ Osmolaridad mediante la
disminución del punto de congelación \\   \+ 220-320
miliosmoles por litro de solución \\\hline  Contenedor  \+ Fenwal
Bag Code 4R2023, 600 ml, trayectoria de fluido no  pirógeno \\   \+
estéril, suministrado por Fenwal laboratories \\  Estabilidad  \+
-20ºC, sin cambio durante más de 8 meses; 4ºC, 5 días con un \\   \+
nivel de methemoglobina por debajo de 10%
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

III. Utilidad

El sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención puede utilizarse de una manera similar a sucedáneos de sangre y expansores de sangre de la especialidad anterior sugeridos. Así, el sucedáneo de sangre puede usarse para reemplazar sangre perdida por hemorragia aguda, para reemplazar una pérdida de sangre que se produce durante operaciones quirúrgicas, en procedimientos de resucitación después de una pérdida de sangre accidental, para suministrar oxígeno y generalmente para mantener el volumen de sangre en estados relacionados. Como un expansor de plasma, el sucedáneo de sangre puede utilizarse en un choque de deficiencia de volumen, un mitigador en el choque anafiláctico y alérgico, para reemplazar plasma perdido después de quemaduras y como resultado de una diarrea.

El sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención puede utilizarse como tal para todas las especies de mamíferos, pero es particularmente útil en el tratamiento de seres humanos. El sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención es miscible con sangre de receptores y sus componentes, es sustancialmente atóxico, no antigénico, no pirogénico y, especialmente, está sustancialmente libre de endotoxinas y otras proteínas que se unen a células y libres de células. Sus propiedades coloidales-oncóticas hacen al producto especialmente útil también para mantener el nivel de la sangre y el plasma en el tratamiento de estados de enfermedad. Además, el material es extremadamente valioso ya que puede usarse sin un riesgo concomitante de transmisión de enfermedades. Además, se cree que el sucedáneo de sangre de la presente invención carece de los problemas inmunológicos que están asociados con la administración de sangre entera, y no provoca ninguna de las siguientes funciones químicas y fisiológicas anormales y perjudiciales in vivo: (1) no activa el complemento; (2) no provoca trastornos hemorrágicos; (3) no provoca función o agregación anormal de plaquetas; (4) no provoca tiempos de protrombina (PT) anormales; (5) no provoca tiempos de tromboplastina parciales anormales; (6) no interfiere con la tipificación de la sangre o la prueba de compatibilidad cruzada; (7) es atóxico para los riñones en 3,5 gramos por kilogramo de peso corporal u 8 gramos por decilitro de volumen de sangre en circulación; (8) exhibe persistencia en circulación de al menos siete días; y (9) actúa como un estímulo para la eritropoyesis acelerada. El sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención puede administrarse usando técnicas de administración que son convencionales en la especialidad, según se describe en Blood Transfusion, por Hustis.

Como un expansor de la sangre, el sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención puede mezclarse con sucedáneos de plasma polímeros fisiológicamente aceptables, solubles en agua, tales como poli(óxido de etileno), poliacrilamida, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico) y condensado de óxido de etileno-propilenglicol. El material también puede mezclarse con sucedáneos coloidales similares a plasma y expansores de plasma sanguíneo tales como polisacáridos lineales, incluyendo dextranos que tienen un peso molecular de 40.000 a 70.000, goma arábiga, pectinas, gelatina fluida equilibrada e hidroxietilalmidón.

Adicionalmente, el sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención puede usarse como una solución de intercambio de oxígeno artificial en oxigenadores convencionales. Cuando se usan para estimular la circulación en pacientes enfermos, los oxigenadores se usan ampliamente para oxigenar mecánicamente sangre venosa extracorpóreamente, utilizando una o más bombas para mantener la circulación y para la perfusión de oxígeno mediante el intercambio de gases entre la sangre en un lecho vascular aislado y el oxígeno a través de una membrana de oxigenación.

Ejemplos Ejemplo I El procedimiento de producción de sangre

En el siguiente Ejemplo, el equipo identificado entre paréntesis se identifica adicionalmente en la lista de referencias que sigue. Las Figuras 1A-1H son un diagrama de flujo para el procedimiento de este Ejemplo, correspondiendo los números de referencia del equipo del Ejemplo a los números de referencia de la figura.

A. Recogida de sangre

El punto de partida era aproximadamente 5 galones de una colección individual de una fuente de eritrocitos (glóbulos rojos) de vacas procedentes del matadero. Debido a su fácil disponibilidad, la sangre bovina obtenida de mataderos es la fuente de eritrocitos preferida.

Se usaron trocares de recogida para extraer la sangre de una manera estéril; la piel del animal se corta, se despega y los trocares se insertan a continuación en los vasos principales de los animales cerca del corazón. Se evitó la introducción de bacterias y el mantenimiento de un material libre de pirógenos o con un nivel de priógenos bajo se efectuó usando contenedores individuales de 25 litros que estaban precargados con citrato sódico despirogenizado como anticoagulante (0,5 litros). La sangre recogida se tapó inmediatamente para evitar la exposición al ambiente. Al terminar el procedimiento de recogida, el material se refrigeró hasta aproximadamente 4ºC para limitar el crecimiento de bacterias. No había acumulación de sangre de diferentes vacas en este momento. La sangre se verificó con respecto a los pirógenos y la esterilidad para asegurar que (1) ninguna vaca estuviera enferma o (2) que no se produjera contaminación durante la recogida. La sangre se transportó en un estado refrigerado desde el matadero hasta la planta de procesamiento.

B. Separación de glóbulos rojos

La sangre se bombeó usando una Bomba de Alimentación (P-301) desde los contenedores de recogida a 2,5 a 6 litros por minuto, hasta la Centrífuga de Separación (CT-301) que se hizo funcionar a de 15.000 a 18.000 rpm. El efluente de la centrífuga (glóbulos rojos separados) se recogió bajo condiciones estériles en un Depósito de Dilución (T-301) de 114 litros. En este punto el efluente se reunió y ya no se trataba sobre una base de animales individuales. Se aplicó nitrógeno estéril a presión positiva a la centrífuga para excluir bacterias.

C. Clarificación de los glóbulos rojos

Los glóbulos rojos se diluyeron en el Depósito de Dilución (T-301) usando Agua para Inyección (API) que se había mantenido a 4C. Los glóbulos rojos se bombearon mediante la Bomba de Alimentación de clarificación (P-302) a menos de 0,5 litros por minuto para el Depósito de Dilución (T-301) hasta la Centrífuga Clarificación (CT-302) que se hizo funcionar a de 15.000 a 18.000 rpm. Esta etapa de clarificación daba como resultado la separación de todos los residuos celulares de la solución de hemoglobina liberada que fluía por gravedad hasta el Depósito de Contención Estéril (T-392).

D. Filtración microporosa

La hemoglobina se bombeó desde el Depósito de Contención Estéril (T-302) mediante la Bomba de Alimentación del Microfiltro de la Fase I (P-401) a 5 litros por minuto a través del Microfiltro de la Fase I (F-401) (0,45 micrómetros). El retenido del filtro se recicló hasta el Depósito de Contención Estéril (T-302). El filtrado se bombeó a 0,5 litros por minuto mediante la Bomba del Microfiltrado de la Fase I (P-402) hasta el Depósito del Microfiltrado de la Fase I (T-402). El Depósito T-402 usado en esta fase de filtración microporosa era un recipiente de vidrio de 100 litros de capacidad y está equipado con conexiones para Agua para Inyección (API) y barrido con Compuesto Cáustico, con filtros de ventilación estériles. Los filtros microporosos son de la construcción de platos y marcos (tal como un tipo Millipore® Pellicon Cassette) y se hicieron funcionar de modo que la presión de transmembrana media (ATP) se mantuviera cuidadosamente entre 1 y 2 libras por pulgada cuadrada. Mientras el flujo tangencial del material a través de la membrana era de 2 a 5 litros por minuto, el flujo a través de la membrana era del orden de 0,1 a 0,2 litros por minuto. La velocidad de trabajo se mantuvo para eliminar la acumulación de residuos celulares sobre la membrana. Cuando la concentración de la solución tangencial a la membrana disminuía hasta menos de 10% de la solución inicial, la solución restante se descartaba. (Alternativamente, vuelve a diluirse con Agua para Inyección para alcanzar un alto rendimiento de hemoglobina a partir del sistema). La solución estaba ahora lista para las separaciones moleculares que seguían.

E. Ultrafiltración

Se bombeó hemoglobina desde el Depósito del Microfiltrado de la Fase I (T-402) a través de Ultrafiltros de la Fase I (F-501A y B) de un peso molecular de 100.000 usando la Bomba de Alimentación del Ultrafiltro de la Fase I (P-501). El retenido de los filtros se recicló al Depósito del Microfiltrado (T-402) y el filtrado se dirigió al Depósito del Ultrafiltrado de la Fase I (T-501). El caudal sobre la cara del retenido era 5 litros por minuto. El caudal del filtrado era 0,2 litros por minuto. La hemoglobina se bombeó a continuación desde el Depósito del Ultrafiltrado de la Fase I (T-501) usando la Bomba de Alimentación del Ultrafiltro de la Fase II (P-502) a través de los Ultrafiltros (F-502A y B) de la Fase II (30.000 D). El retenido se recicló al Depósito del Ultrafiltrado de la Fase I (T-501) o se dirigió al Depósito del Ultrafiltrado de la Fase II (T-502). El filtrado se eliminó. Los depósitos eran recipientes de vidrio de 100 litros de capacidad con filtros de ventilación estériles y están provistos de conexiones para lavar con API y Sosa Cáustica. Se proporcionaron conexiones debajo del Depósito del Ultrafiltrado de la Fase II (T-502) para barrer el sistema aguas abajo con API y Sosa Cáustica.

F. Cromatografía

La fase de cromatografía se automatizó basándose en un paquete de software TI-530. Las variables clave fueron protegidas por un bloqueo que aseguraba la capacidad de repetición de las operaciones del procedimiento. Se bombeó hemoglobina desde el Depósito del Ultrafiltrado de la Fase II (T-502) y se inyectó a las columnas de GDT (C-601A-D) a aproximadamente 1 litro por minuto durante un período de 1 minuto utilizando la Bomba de Alimentación de GDT (P- 601). Después de la inyección de hemoglobina el flujo de composición en gradiente o variable se inició y se inyectó en la columna usando la Bomba de Gradiente (P-602). La composición del flujo de gradiente se estableció utilizando válvulas dosificadoras controladas por ordenador. La liberación de fosfolípidos tuvo lugar antes de la elución de la hemoglobina, eluyéndose las endotoxinas después de que se hubiera recogido el pico de hemoglobina interés. A continuación, la recogida de efluente se comenzó y continuó hasta que el pico o la respuesta se había reducido hasta 20-10% de su amplitud máxima. Esto constituía la fracción que se recogía y la fracción de interés para la purificación. El gradiente continuó avanzando después de la recogida de hemoglobina para retirar contaminantes de la columna antes del comienzo del ciclo de lavado. El ciclo de lavado a través de la Bomba de Lavado (P-603) estaba comprendido por un lavado que utilizaba en primer lugar Tris-NaCl, a continuación API, a continuación Tris, lo que reequilibraba la columna de GDT antes del ciclo de inyección/elución. La hemoglobina se recogió en el Depósito de GDT (T-601), un recipiente de vidrio 100, equipado con conexiones para barrido con API y Sosa Cáustica y un filtro de ventilación estéril. Las solución es de naturaleza tetrámera con más de 99,9% en el intervalo de 68.000 daltons, según se mide mediante electroforesis en gel natural y cromatografía líquida de alta resolución. El material está libre de pirógenos y tiene un nivel de methemoglobina por debajo de 2%. La concentración es 0,2 gramos por decilitro antes de la concentración y puede concentrarse hasta 20 gramos por decilitro.

G. Reacción de polimerización (reticulación)

Se bombeó material desde el Depósito de GDT (T-601) mediante la Bomba del Reticulado de la Fase I (P-803) a través de los Filtros del Reticulado de la Fase I de 10.000 de peso molecular. El retenido se recicló al Depósito de GDT (T-601). El filtrado se eliminó. Esta etapa se continuó hasta que se obtenía una concentración de 7 a 10 gramos por decilitro y el nivel de methemoglobina era menor que 1,5%. Este material se introdujo en bolsas y se congeló o fue bombeado directamente por la Bomba de Alimentación al Fermentador de la Fase II (P-904) hasta el Fermentador del Reticulado de la Fase II (FR-902). El filtrado se eliminó. El interior del fermentador se mantuvo en un ambiente de bajo contenido de oxígeno extrayendo un vacío e introduciendo una atmósfera de argón. El volumen del sistema reactor se mantuvo constante añadiendo simultáneamente un tampón estéril libre de pirógenos (pH 8,9-9,1) al reactor a través de un filtro de membrana de despirogenización. Este tampón estaba comprendido por sodio, cloruro y potasio. El pH se ajusta con HCl y base de Tris. El agente de reticulación (glutaraldehído) se añadió a continuación al reactor.

H. Concentración con membranas

Una vez que se había alcanzado más de 50-55% de reticulación, según se calcula mediante cromatografía de penetración en gel, el material fue bombeado por la Bomba del Reticulado de la Fase II (P-904) a través del Filtro del Reticulado de la Fase II (F-905) de 100.000 de peso molecular. El retenido se recicló al Fermentador del Reticulado de la Fase II (FR-902), hasta que se había alcanzado una reducción de aproximadamente 25% en el volumen de fluido. Los electrolitos y el pH se ajustaron durante la fase de filtración para dar una solución fisiológica equilibrada para inyección.

El material se hizo fluir a continuación por gravedad hasta la máquina de llenado de bolsas. El producto se introdujo en bolsas para el almacenamiento en el congelador. El análisis de tres partidas separadas de material producido mediante el procedimiento previo, pero eliminando la etapa E opcional, producía soluciones de hemoglobina reticulada que tenían las propiedades que se indican en la sección de ``RESULTADOS'' del Ejemplo IV.

Lista de referencias

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\hskip-\parindent\small\begin{tabular}{ll}
 P-301  \+ Bomba Giratoria de Lóbulos Sanitaria
ALBIN SLP 107 P51 B1 \\  P-302  \+ Igual que
P-301 \\  P-402  \+ Igual que
P-301 \\  P-403  \+ Bomba
Peristáltica Cole Parmer Masterflex Modelo 7019 \\ 
P-501  \+ Igual que P-301 \\ 
P-502  \+ Igual que P-301 \\ 
P-601  \+ Igual que P-301 \\ 
P-602  \+ Igual que P-301 \\ 
P-603  \+ Igual que P-301 \\ 
P-905  \+ Bomba Giratoria de Lóbulos Sanitaria Albin
SLP 110 P51 B1 \\  T-301  \+ Acero inoxidable 316L
de 25 galones, interior electropulido,  fabricado por Thermo \\   \+
electron Wisconsin, Inc. \\  T-302  \+ Igual que
T-301 \\  T-401  \+ Recipiente de
Vidrio Cilíndrico 100L O-I/Schott (GER 100) \\ 
T-501  \+ Igual que P-401 \\ 
T-502  \+ Igual que P-401 \\ 
T-601  \+ Igual que P-401 \\ 
CT-301  \+ Sharples Modelo A-16 Tipo
M-35000-520 2HHY
CT-302 igual que CT-301 \\ 
F-401  \+ Carcasa de acero inoxidable con conexiones
de tuberías sanitarias,  equipada con casetes \\   \+ de filtración
de 5 pies cuadrados Millipore \\  F-402  \+ Igual
que F-401 \\  F-501A/501B  \+ Igual
que F-401 \\  F-502A/502B  \+ Igual
que F-401 \\  F-904  \+ Igual que
F-401 \\  F-905  \+ Igual que
F-401 \\  C-601A-D 
\+ Tubería y aletas revestidos con TFE, de acero inoxidable de 6 \\ 
 \+ pulgadas Resistoflex \\  FR-902  \+ Fermentador
Applicon de 3 litros (H/D=2). Agitación: 2-6
propulsores  de álabe (álabes \\   \+ de 1,5 cm x 1 cm), 3 cm y 14
cm desde el fondo del depósito, y 4 pantallas \\  Máquina de Relleno
de Bolsas  \+ Máquina de Relleno de Sobremesa Modelo
F-400- X,  Cozzi Machine Company.
\\\end{tabular}\par

Ejemplo II Distribución del peso molecular

Se efectuó este estudio para determinar la distribución del peso molecular de un producto final. Las partículas de hemoglobina con un P.M. de más de 1.000.000 podrían provocar algunos problemas clínicos en seres humanos y animales. Se diluyó 1 \mul de producto final (80 \mug de proteína) hasta 50, y estos 50 \mul se inyectaron en un sistema de HPLC Hewlett-Packard. Se usó Water Data 740 Module Station para integrar los resultados.

Desde 1980 la técnica de filtración en gel clásica que emplea geles orgánicos blandos y semirrígidos para la caracterización y la purificación de proteínas ha contado progresivamente con una competencia mayor por la cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución (HPSEC). El avance de la HPSEC está asociado con el desarrollo de columnas compatibles con tampones altamente eficaces que funcionan a una contrapresión elevada. Las columnas se rellenan con partículas de gel de sílice porosas, hidrófilas, rígidas, de una distribución de tamaños de poros predeterminada y una superficie compatible con proteínas derivada. Las proteínas se eluyen en la secuencia de un peso molecular y un tamaño decrecientes.

Se usaron en la prueba cuatro partidas libres de pirógenos con las concentraciones de Hb siguientes:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline 
Partida Nº  \+ Hb  \+ MET Hb \\\hline  2261  \+ 10,3  \+ 3,4 \\ 
2271  \+ 10,4  \+ 3,8 \\  2311  \+ 11,3  \+ 7,2 \\  2341  \+ 9,0  \+
3,5
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Se usaron los siguientes patrones de proteínas:

: 1. Azul de dextrano P.M. 2.000.000

: 2. Aldolasa P.M. 158.000

: 3. Albúmina bovina P.M. 67.000

: 4. Ovalbúmina P.M. 45.000

: 5. Ferritina P.M. 540.000

Sistema de prueba

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline 
 Columnas   \+ One Protein-Pak, 300 sw. Waters
Associates \\   Tampón   \+ 0,1 M k pH 7,8 \\   Caudal  
\+ 1 ml/minuto \\   Sistema de HPLC   \+ Hewlett Packard,
filtro detector de 280 nm del  cromatógrafo de líquidos 1090, \\  
\+ 740 Water Data Module Station
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Análisis Estadístico

Los datos se integraron usando 740 Water Data Module Station. Antes de añadir glutaraldehído, se inyectó solución de Hb (50 ml) y se supuso un tiempo de retención 9,699 para Hb con 68.000 de P.M.

El tiempo de retención para el azul de dextrano era alrededor de 4,8 minutos. El tiempo de retención para la solución de Hb 4,959 corresponde a un P.M. de más de 1.000.000.

Resultados

: Distribución del Peso Molecular:

: Longitud de onda: 254

: Caudal: 1 ml/minuto

\newpage

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline
 Tiempo de retención  \+ 2261  \+ 2271  \+ 2311  \+ 2341 \\\hline 
4,959  \+ 9,4%  \+ 7,8%  \+ 8,9%  \+ 8,5% \\  5,165  \+ 8,6%  \+
11,07%  \+ 5,2%  \+ 3,7% \\  7,362  \+ 29,3%  \+ 41,9%  \+ 33,3%  \+
33,5% \\  8,259  \+ 17,8%  \+ 15,43%  \+ 18,27%  \+ 17,5% \\  9,699 
\+ 34,9%  \+ 23,8%  \+ 34,33%  \+ 38,8%
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Conclusiones

Las 4 partidas de material mostraban una distribución de peso molecular muy constante de partida a partida. La mejor partida era 2271 con 23,8% de material no reticulado y 7,8% de partículas con peso molecular alto.

El % de material reticulado para las otras 3 partidas es:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline 
Partida Nº  \+ % No reticulado  \+ % de partículas con alto peso
molecular \\\hline  2261  \+ 34,9  \+ 9,4 \\  2311  \+ 34,3  \+ 8,9
\\  2341  \+ 36,8  \+ 8,5
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Al mismo tiempo, el porcentaje de partículas con alto peso molecular es 9,4%, 8,9% y 8,5%.

Ejemplo III Determinación de la concentración de endotoxinas

La detección de la concentración de endotoxinas dentro de una muestra de sangre reticulada se probó usando la prueba del Ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL). El LAL se ha obtenido de los extractos de los amebocitos del cangrejo de herradura. Se probó que la muestra era positiva o negativa y se determinó como tal contra una reacción de punto final elaborada mediante una serie de diluciones de una endotoxina de referencia. Se elaboró una curva de regresión estándar a partir de lecturas colorimétricas de las diluciones mencionadas previamente y el contenido de endotoxinas se determinó a partir de la interpolación de la curva.

El 18 de Enero de 1980 (38 FR 1404), la FDA anunció que el Lisado de Amebocitos de Limulus derivado de amebocitos del cangrejo de herradura es ahora un producto biológico y puede usarse en lugar de conejos. El LAL ha resultado ser un indicador sensible de endotoxina bacteriana o pirógenos dentro del producto. Debido a su alta sensibilidad para detectar endotoxinas, puede evitarse administrar a seres humanos productos que podrían provocar fiebre, choque y muerte si se encuentran demasiado altos en pirógenos.

Prueba y artículos de control

Se probaron cuatro muestras de sangre polimerizada usando la prueba del ensayo del LAL y se encontró que tenían menos de 0,01 unidades de endotoxina por ml.

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline 
Partida Nº  \+ UE/ml \\\hline  2261  \+ <0,001 \\  2271  \+
<0,001 \\  1311  \+ <0,001 \\  2341  \+ <0,001
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Materiales

1.: Tubos de ensayo de vidrio despirogenizados mediante cocción en un horno a 180ºC durante no menos de 4 horas, preferiblemente 24 horas

2.: Lisado de Amebocitos de Limulus, Lote Nº 372, sustrato de espectrozima (Cape Code Associates)

3.: Solución al 50% de ácido acético, H_{2}O usada para inyección, muestra diluida de sangre polimerizada.

Ejemplo IV Determinación de la toxicidad aguda

Se usaron tres partidas del sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención (Hb-I, Hb-II y Hb-III), denominadas hemoglobina más adelante, y fracción de proteína de plasma (PPF) humana, en un estudio controlado, para reemplazar un tercio del volumen de sangre estimado en cuatro grupos de seis conejos cada uno.

Este estudio se efectuó para evaluar la toxicidad aguda del sucedáneo de sangre preparado mediante la presente invención para administración intravenosa en conejos. El estudio está basado en términos de (1) mortalidad, (2) morbidez, (3) cambios patofisiológicos que afectan a los órganos vitales, (4) cambios patofisiológicos y (5)cambios patológicos (microscópicos). El estudio se diseña para comparar los efectos de tres partidas del sucedáneo de sangre (Hb-I, Hb-II y Hb-III) con los de fracciones de proteína de plasma (PPF) humana después de la sustitución de 1/3 del volumen de sangre estimado en 4 grupos de conejos.

Modelo experimental

Conejos macho de Nueva Zelanda de 4,0 kg de peso corporal; sedados con clorpromazina, 5 mg/kg de peso corporal I.M.; enjaulados.

Instrumentación

: (a) catéter urinario

: (b) conducto arterial (una arteria de la oreja)

: (c) conducto venosa (una vena marginal de la oreja)

: (d) electrodos de aguja para ECG

: (e) termosonda (subcutánea)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\small\begin{tabular}{|l|l|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Procedimiento
experimental}\\\hline   \+ Sedación \\  2  \+ Instrumentación \\  
\+ @ \\   \+ T _{1}  (línea de base) @ y * \\   \+ Sangrado \\  2 
\+ Infusión de sucedáneo de sangre \\   \+ @ \\   \+ T _{2}  (15
minutos después de la infusión) @ y * \\   \+ @ \\  3  \+ @ \\   \+
T _{3}  (1 hora después de la infusión) @ y * \\   \+ @ \\   \+ @ \\
 4  \+ @ \\   \+ @ \\   \+ @ \\   \+ @ \\  5  \+ @ \\   \+ @ \\   \+
T _{4}  (3 horas después de la infusión) @ y *; cánulas y electrodos
 retirados; el animal se devolvió a la jaula \\  24  \+ T _{5}  (24
horas después de la infusión) @ y * necropsia
\\\multicolumn{2}{|c|}{}\\\multicolumn{2}{|c|}{@=medida de
parámetros hemodinámicos}\\\multicolumn{2}{|c|}{*=muestra de sangre
y
orina}\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Anestesia

Los animales fueron sedados con clorpromazina, 0,5 mg/kg de peso corporal, inyectada I.M., se retuvieron en un receptáculo metálico para conejos y se dejaron respirar espontáneamente aire ambiental. La temperatura corporal se mantuvo poniendo al animal sobre una manta calentadora eléctrica.

Instrumentación

Se insertaron cánulas de plástico (calibre 22) en ambas arterias centrales de las orejas (una conectada a un transductor de presión para verificar la presión sanguínea arterial y la otra usada para la extracción y el muestreo de sangre arterial) y las venas de las orejas para la infusión de una solución de hemoglobina. Se pusieron electrodos de aguja en las patas para verificar el electrocardiograma. Se insertó un catéter en la vejiga urinaria para la medida del gasto urinario y la recogida de muestras de orina. Una sonda de temperatura se insertó subcutáneamente para verificar la temperatura corporal.

Procedimiento

Se extrajo sangre arterial en la cantidad de 20 ml/kg de peso corporal (aproximadamente 1/3 del volumen de sangre estimado) y esta cantidad se reemplazó inmediatamente con una cantidad igual de solución de hemoglobina. Toda la sangre extraída subsiguientemente para pruebas de laboratorio se reemplazó con hemoglobina, 1:1, v:v. El animal fue observado estrechamente durante un período de 3 horas (tiempo necesario para la determinación de la prueba de pirogenicidad). Durante este intervalo, se administraron dosis adicionales de clorpromazina según fuera necesario para mantener al animal sedado, y se administró una infusión intravenosa de dextrosa al 5% en 1/4 de solución salina normal, 15 mg/kg de peso corporal/hora, para reemplazar las pérdidas de agua.

El electrocardiograma, la presión sanguínea y la temperatura corporal se verificaron continuamente y se registraron a intervalos de 15 minutos. El gasto urinario se registró a intervalos de 30 minutos. Se tomaron muestras de sangre en la línea de base y 15 minutos, 1 hora y 3 horas después de la terminación de la infusión de hemoglobina. Todos los conductos de verificación se desconectaron a continuación y el animal se devolvió a su jaula, donde se dejó agua ``a voluntad''. Se tomaron muestras de sangre adicionales a las 6, 12 y 24 horas, con el animal enjaulado de nuevo en el receptáculo para conejos y usando las arterias de las orejas. Después de 24 horas, el animal fue sacrificado con una sobredosis de pentobarbital y se llevó a cabo una necropsia completa. Se prestó una atención especial a la posible presencia de pigmento de hemoglobina en las cavidades corporales, incluyendo la cámara anterior del ojo. Se tomaron secciones de todos los órganos para el examen histológico.

Las siguientes pruebas se llevaron a cabo sobre cada muestra de sangre:

: 1) CBC completo, incluyendo conteo de plaquetas (Coulter Counter),

: 2) PTT (MLA 700); fibrinógeno; productos de disociación de fibrina,

: 3) Electrolitos (sodio, potasio, cloruro y bicarbonato) (Aparato ASTRA),

: 4) P-asa alcalina, LDH, SGOT y SGPT (Aparato ASTRA),

: 5) BUN y creatinina (Aparato ASTRA),

: 6) Osmolaridad (Presión de vapor),

: 7) Concentración de hemoglobina en plasma (Bencidina)

: 8) Gases Sanguíneos Arteriales (pH de IL/Analizador de Gases Sanguíneos)

: 9) Hb Total, Oxi-Hb, Met-Hb y Contenido de O_{2} (Co-oxímetro IL 282)

: 10) P50 (Aminco Hem-0-Scan)

La orina se probó con respecto a:

: 1) concentración de hemoglobina (Benzidina)

: 2) creatinina (Aparato ASTRA)

: 3) sodio y potasio (Aparato ASTRA)

Mediante la recogida temporizada de orina y la determinación de creatinina en plasma y orina, se llevó a cabo una Prueba de Depuración de Creatinina en el intervalo de 3 horas después de la infusión de hemoglobina.

Los datos se tabularán según se muestra en las siguientes tablas.

Evaluación de Datos

Los datos obtenidos de los 6 animales en cada grupo se tabularon como Valores Medios \pm Errores Estándar. La significación estadística de los cambios con relación al tiempo se evaluó mediante el análisis de la varianza (Tabla III). Se hicieron comparaciones entre los diversos grupos de animales usando la prueba T de Student para datos pareados (Tabla IV). Los datos sin procesar para recopilar las Tablas III y IV se presentan en las Tablas I y II.

Métodos

(A) Mortalidad (B) Morbidez

Se prestó atención al desarrollo de las siguientes manifestaciones:

: 1 = choque anafiláctico

: 2 = ataques o desarrollo de déficits neurológicos

: 3 = broncoespasmo o edema pulmonar (efectos inmediatos)

: 4 = fiebre

: 5 = hemoglobinuria

: 6 = hipema

: 7 = falta de actividad normal

: 8 = depresión de las funciones normales (comer y beber) a las 24 horas

(C) Cambios patofisiológicos

Estos cambios se estudiaron de acuerdo con el siguiente esquema:

1. Observaciones clínicas

: a. peso corporal

: b. temperatura corporal

: c. ritmo cardíaco

: d. arritmias

: e. presión sanguínea (sistólica)

: f. presión sanguínea (diastólica)

: g. gasto urinario

2. Datos de laboratorio que reflejan la función respiratoria

: a. pH de la sangre arterial

: b. PaO_{2}

: c. PaCO_{2}

: d. P_{50}

3. Hemoglobina (Coulter)

: a. hematocrito

: b. hemoglobina

: c. WBC

: d. plaquetas

4. Coagulación

: a. fibrinógeno

: b. productos de descomposición de fibrina

: c. P.T.

5. Función del hígado

: a. bilirrubina total

: b. SGOT

: c. LDH

: d. SGPT

6. Función renal

: a. BUN

: b. creatinina sérica

: c. electrolitos séricos

: d. osmolalidad sérica

(D) Patología general

En la necropsia, la atención se dirigió a la extravasación de hemoglobina: a la cámara anterior del ojo, el pericardio, la pleura y el peritoneo.

El corazón, los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones se examinaron con respecto a signos generales de edema, congestión, hemorragia e infarto.

(E) Histopatología

Secciones del corazón, los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones se procesaron para y se examinaron mediante microscopía óptica.

Un método para clasificar los cambios histopatológicos se desarrolló para realizar un análisis estadístico de los datos.

El principal cambio observado en el corazón estaba representado por áreas focales de contractura de miocardio. A cada área focal encontrada en la sección transversal del ventrículo izquierdo se le asignó un grado 1 +.

En los pulmones, la patología también era desigual. Los principales cambios estabanrepresentados por edema intersticial e infiltración celular (``neumonía intersticial''). La clasificación se llevó a cabo a partir de un marco global de implicación tisular, así como a partir de la gravedad de los cambios observados en cada área implicada, desarrollando una escala de 1 a 4.

En el hígado, las principales alteraciones estaban representadas por congestión y por vacuolización centrolobular. Estos cambios se clasificaron en una escala de 1 a 4 sobre la base de ambos, el número de lóbulos implicados y la extensión de la vacuolización partiendo de la vénula centrolobular.

En el bazo, la congestión era el principal hallazgo.

En el riñón, no se encontró alteración glomerular ni necrosis tubular o bloqueo por parches pigmentarios. La principal alteración estaba representada por una vacuolización del epitelio tubular, empezando en el área subcapsular y extendiéndose desde allí hacia la junta corticomedular. El grado de esta extensión se clasificó en una escala de 1 a 4.

\newpage

Análisis estadístico

El análisis de los datos se llevó a cabo usando dos pruebas:

a): Análisis de la varianza para estudiar cambios que se producen en cada grupo de animales a diversos intervalos de tiempo; y

b): Prueba t de Student para datos pareados para estudiar los cambios que se producen a cada intervalo temporal en los diversos grupos de animales.

Los resultados de los análisis estadísticos realizados se presentan en las Tablas III y IV.

(TABLA I pasa a página siguiente)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

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11

12

13

14

Análisis de los datos Resultados

Las tres partidas de hemoglobina estudiadas aquí eran:

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll}  HbI
=  \+ Grupo 1 \\  HbII =  \+ Grupo 3 \\  HbIII =  \+ Grupo 4
\\\end{tabular}\par

Las partidas se caracterizaron como sigue

(TABLA pasa a página siguiente)

\newpage

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
  \+  \+ Hb-I  \+ Hb-II  \+
Hb-III \\\hline  1.  \+ Hemoglobina, g/dl  \+ 14,0 
\+ 13,0  \+ 10,0 \\  2.  \+ Oxihemoglobina  \+ 90,3  \+ 91,2  \+
98,6 \\  3.  \+ Carboxihemoglobina  \+ 1,6  \+ 0,9  \+ 1,7 \\  4. 
\+ Methemoglobina  \+ 8,8  \+ 10,6  \+ 2,7 \\  5.  \+ Volumen de
oxígeno, %  \+ 17,5  \+ 16,2  \+ 13,6 \\  6.  \+ Ph  \+ 75  \+ 6,55 
\+ 7,0 \\  7.  \+ Sodio, mEq/l  \+ 118,5  \+ 102,3  \+ 119,2 \\  8. 
\+ Potasio, mEq/l  \+ 3,88  \+ 4,16  \+ 2,44 \\  9.  \+ Cloruro,
mEq/l  \+ 118,0  \+ 117,3  \+ 120,9 \\  10.  \+ Osmolaridad, mOsm/kg
 \+ 244  \+ 236  \+ 242 \\  11.  \+ Endotoxinas, UE/ml  \+ <0,01 
\+ <0,01  \+ <0,01 \\  12.  \+ Peso molecular entre
68.0000-500.000  \+ 85%  \+ 80%  \+ 90% \\  13.  \+
Análisis de fosfolípidos mediante una placa de gel de sílice  \+
claro  \+  claro  \+ claro \\   \+ de TCL revelada en vapor de yodo
\+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Estas partidas se compararon con Plasma Protein Fraction humana (Plasma-Plex-Amour Pharmaceutical Company). (Grupo 2 = Grupo de Control).

(A) Mortalidad

Ninguno de los animales en los 4 grupos (6 conejos en cada grupo) morían al final del periodo de observación de 24 horas.

(B) Signos clínicos

Durante las 3 primeras horas después de la administración de hemoglobina, el único signo clínico era la hemoglobinuria. A las 24 horas, todos los animales parecían normales; es decir, con grados normales de actividad y comiendo y bebiendo normalmente. En ese momento, la hemoglobinuria había remitido.

No se produjeron cambios en el peso corporal y la temperatura.

Patología General

Ninguno de los animales presentaba en la necropsia extravasación de hemoglobina. Todos los órganos aparecían generalmente normales, con la excepción del hígado, que aparecía congestionado en aproximadamente la mitad de los animales.

Histopatología

Corazón: Se encontraron áreas focales de ``contractura'' de miocardio en el grupo de PPF, así como los grupos de hemoglobina. La gravedad de los cambios se clasificó como 1+ en el grupo de PPF, y respectivamente 1,5+, 1,7+ y 1,25+ en los Grupos 1, 3 y 4. La diferencia no era estadísticamente significativa.

Pulmones: Se encontraron áreas de edema intersticial, congestión e infiltración celular en todos los grupos, incluyendo el grupo de PPF. La gravedad de los cambios se clasificó 1,4+ para el grupo de PPF, y respectivamente 2+, 1,8+ y 1,8+ para los grupos 1, 3 y 4. De nuevo, la diferencia no era estadísticamente significativa.

Hígado: Los cambios encontrados en el hígado eran más uniformes que los observados en los otros órganos. La vacuolización centrolobular se clasificó como 1,4+ en el grupo de PPF, y respectivamente 1,5+, 1,8+ y 2+ en los Grupos 1, 3 y 4. La diferencia no era significativa.

Riñones: No se encuentra alteración glomerular ni necrosis tubular aguda o bloqueo por parches pigmentarios. Se encontró uniformemente vacuolización epitelial tubular en el área subcapsular. La extensión desde aquí hacia la unión corticomedular se clasificó como 1,6+ para el grupo de PPF, y respectivamente 1,8+, 2,15+ y 2,7+ para los Grupos 1, 3 y 4. La diferencia entre PPF y los grupos de hemoglobina era significativa sólo para el Grupo 3.

Análisis y conclusión

Los cambios tanto químicos como histopatológicos observados en este estudio eran de suaves a moderados y teóricamente reversibles. La determinación de tal reversibilidad se está investigando actualmente prolongándose el período de observación desde 24 horas hasta 1 semana.

Ejemplo V Transfusión de intercambio de conejos

Utilizando el procedimiento experimental indicado con detalle en el Ejemplo IV, tres grupos de conejos se sometieron a transfusión con hemorragia. Un grupo de seis conejos (Grupo A) tenía un tercio del volumen de sangre estimado sustituido con una solución de hemoglobina que contenía 1-2 unidades de endotoxina por ml. Un grupo de cuatro conejos (Grupo B) tenía un tercio de volumen de sangre estimado reemplazado por PPF al 5%. Otro grupo de seis conejos (Grupo C) tenía un tercio del volumen de sangre estimado reemplazado por una solución de hemoglobina preparada mediante la presente invención, esta solución se caracteriza como sigue:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{}\+
Experimento 1  \+ Experimento 2  \+ Experimento 3  \+ Media \\\hline
 1.  \+ Hemoglobina, g/dl  \+ 11,6;  \+ 11,6;  \+ 11,4;  \+ 11,5 \\ 
2.  \+ Oxi-hemoglobina, %  \+ 90,3;  \+ 90,2;  \+
90,1;  \+ 90,2 \\  3.  \+ Carboxi-Hb, %  \+ 0,1;  \+
0,3;  \+ 0,5;  \+ 0,3 \\  4.  \+ Met-Hb, %a  \+ 9,6;
 \+ 9,5;  \+ 9,7;  \+ 9,6 \\  5.  \+ Volumen de oxígeno, %  \+ 14,7;
 \+ 14,6;  \+ 14,4;  \+ 14,6 \\  6.  \+ pH, Unidades  \+ 7,140;  \+
7,161;  \+ 7,168;  \+ 7,156 \\  7.  \+ PCO _{2} , Torr  \+  14,1; 
\+ 10,4;  \+ 10,2;  \+ 11,6 \\  8.  \+ PO _{2} , Torr  \+ 147,5;  \+
147,2;  \+ 147,0  \+ 147,2 \\  9.  \+ P _{50} , Torr  \+ 28,0;  \+ 
\+  \+ 28,0 \\  10.  \+ Presión Osmótica Coloidal, Torr  \+ 20,7; 
\+ 21,0;  \+ 20,9  \+ 20,9 \\  11.  \+ Sodio, mEq/l  \+ 114,6  \+
113,9  \+ 115,1  \+ 114,5 \\  12.  \+ Potasio, Eq/l  \+ 3,72;  \+
3,63;  \+ 3,70;  \+ 3,68 \\  13.  \+ Cloruro, mEq/l  \+ 111,0;  \+
208,4;  \+ 107,2;  \+ 108,9 \\  14.  \+ Fósforo, ng %  \+ 0,097  \+
0,097  \+ 0,097  \+ 0,097 \\  15.  \+ Endotoxinas, UE/ml  \+ 0,29 
\+ 0,19  \+ 0,23  \+ 0,23 \\  16.  \+ Fosfolípidos, mediante TLC  \+
 \+  \+ ausente \+ \\\hline  17. 
\+\multicolumn{5}{|l|}{Polimerización, mediante columna, 85% por
encima de la forma  tetrámera,
cromatografía}\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Se realizaron comparaciones para cada grupo de conejos transfundidos en un tercio durante el período de 24 horas después de la transfusión con respecto a números de plaquetas, números de glóbulos blancos, niveles de fibrinógeno sérico, niveles de protrombina y niveles de creatinina sérica. Los datos recogidos aparecen en las Figuras 2-6, respectivamente. En cada una de las Figuras 2-6-, los triángulos representan valores medios (\pm error estándar) de los conejos del Grupo A, los cuadrados representan los valores medios (\pm error estándar) para los conejos del Grupo B y los círculos representan el valor medio (\pm error estándar) para los conejos del Grupo C.

Una comparación de los datos representados por las Figuras 2-6 demuestra que la solución de hemoglobina reticulada preparada mediante esta invención no provocaba mortalidad ni signos clínicamente importantes. Usando un análisis de la varianza, a las 24 horas después de la infusión, no había diferencias significativas entre los grupos, excepto por un ligero incremento en la presión sistólica y una elevación de la SGOT. La elevación de la presión sanguínea sistólica no se consideró clínicamente importante debido a que se producía dentro del intervalo clínicamente aceptable de 1.379*10^{5} Pa (+20 mm de Hg). La elevación de la SGOT se consideró espuria debido a la interferencia colorimétrica por hemoglobina plasmática. Aunque los grupos de prueba exhibían hemoglobinuria transitoria, no se detectó un incremento significativo en el BUN o la creatinina sérica. Se encontraron cambios histopatológicos similares tanto en la PPF como en la solución de hemoglobina reticulada preparada por los grupos de la presente invención. Se consideró que estas alteraciones no era específicas y parecían ser de naturaleza reversible.

Ejemplo VI Transfusión de intercambio en perros

Se realizaron estudios preliminares sobre transfusiones de intercambio en perros sobre sabuesos y perros cruzados con intercambios de volumen de sangre total que variaban entre 25%-75%. Los perros uno, dos y tres son sabuesos que pesan aproximadamente diez kilogramos cada uno, y los peros número cuatro, cinco y seis son perros cruzados que pesan aproximadamente 20 kilogramos cada uno.

El perro número uno (Figura 8) es un sabueso cuyo hematocrito inicial de 24% indicaba que era anémico antes de la transfusión. La anemia es de un tipo indeterminado. El perro se sometió a una transfusión de intercambio de 40%. La respuesta inicial se caracterizó por una rápida elevación en el hematocrito de modo que tras 1,5 horas después de la transfusión de intercambio el hematocrito se midió en 28%. Subsiguientemente, el hematocrito ascendió por encima de 36% el segundo día después de la transfusión y permanecía en el intervalo de 40% (102 días después de la transfusión). También había una elevación sostenida en la hemoglobina que inicialmente representaba tanto hemoglobina intracelular como hemoglobina plasmática libre como resultado de la infusión de prueba.

Los perfiles Chem 20 obtenidos en serie, en general, no revelaban anormalidades significativas aunque había una indicación de niveles de enzima hepática incrementados durante los nueve primeros días después de la infusión. La interpretación de estos resultados es difícil debido a la interferencia prooducida por hemoglobina libre en solución con medios automatizados estandarizados para medir enzimas del hígado.

El terrier de Boston número dos (Figura 9) es un sabueso que se sometió a una transfusión de intercambio de 25% también sin efectos clínicos adversos. El hematocrito inicial se disminuía apropiadamente después de la transfusión de intercambio y ascendía rápidamente para superar el nivel de reposo de 37% después de 8 horas. El nivel de hematocrito elevado se soste día a través del día 92º después de la transfusión y se confirma mediante incrementos paralelos apropiados en el conteo de RBC que indican una producción incrementada de glóbulos rojos. Se apuntaron cambios de enzimas hepáticas similares en la creatinina y parecían estar ligeramente elevados por encima de los niveles de reposo. Los restantes valores Chem 20 no cambiaban significativamente.

El terrier de Boston número 3 (Figura 10) es un sabueso que se sometió a una transfusión de intercambio de 33%. Se apreció una elevación similar por encima de los niveles de hematocrito de reposo después del primer día y esta se sostuvo a través del día 78º después de la transfusión.

Las enzimas hepáticas mostraban un marco ligeramente diferente en este animal. Aunque la LDH parecía tener una elevación transitoria durante los dos primeros días, los niveles de LDH eran normales a continuación. En contraste, los valores de SGOT y SGPT parecían estar moderadamente elevados sobre los niveles de reposo durante semanas después de la transfusión inicial. Clínicamente, el animal parecía no tener efectos adversos. Sin embargo, los niveles de creatinina sérica estaban ligeramente elevados después de la infusión.

El perro número cuatro (Figura 11) es un perro cruzado que pesa aproximadamente 17 kilogramos y se usó como un animal de control. Se indujo una hemorragia de 33% y el volumen de sangre extraído se reemplazo por una cantidad igual de 5% de albúmina humana. Esto fue seguido porque el nivel de hematocrito volvía hasta el normal y superaba ligeramente el valor de reposo durante los 81 días subsiguientes transcurridos.

El perro número cinco (Figura 12) es un perro cruzado que pesa aproximadamente 20 kilogramos que se sometió a una transfusión de intercambio de 75% con una disminución significativa en el hematocrito seguida por un incremento en el hematocrito que superaba el nivel de reposo el día 71º después de la transfusión. El animal mantenía un hematocrito que superaba el nivel de reposo durante los 43 días subsiguientes después de la transfusión.

Las enzimas hepáticas mostraban un ascenso transitorio en LDH y SGOT que volvían gradualmente al intervalo normal. Había una sola observación de un incremento en SGPT que pueden haber sido datos aberrantes.

El perro número seis (Figura 7) es un perro cruzado que pesa aproximadamente 20 kilogramos que se sometió a una transfusión de intercambio de 75% con hallazgos similares a los encontrados en el perro número cinco.

Todos los perros probados parecían estar bien clínicamente y experimentaban un retorno rápido a la actividad de comportamiento normal inmediatamente después de que remitieran los efectos agudos de la anestesia. No parecía haber efectos adversos a largo plazo observados en ninguno de los animales probados.

Sumario

En un estudio preliminar de toxicidad aguda y eficacia de la solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la invención, cinco perros de prueba recibían transfusiones de intercambio simples que sustituían 25-75% del volumen de sangre calculado y un perro de control se sometía a una sustitución de intercambio de 33% con albúmina al 5%.

No había mortalidad o morbidez clínica en ningún animal agudamente o durante una observación prolongada de hasta doce semanas. Todos los perros de prueba exhibían actividad normal inmediatamente después de la sustitución y experimentaban una vuelta rápida de los parámetros de RBC hasta el intervalo normal en dos semanas. Los perfiles de la química de los animales de prueba permanecían dentro de límites normales excepto por una elevación transitoria de enzimas hepáticas, un hallazgo también observado en el perro de control (perro número cuatro). Los resultados de gases sanguíneos arteriales sobre muestras tomadas durante e inmediatamente después de las transfusiones de intercambio indicaban que se mantenían valores de PO_{2} normales en todos los animales incluyendo los dos perros que sufrían intercambios de 75%.

Los perros Nº 5 y Nº 6 recibían ambos transfusiones de intercambio de aproximadamente 75% del volumen de sangre (calculado por peso corporal). El perro Nº 5 sufría una hemorragia de 50% de volumen de sangre seguida por una sustitución inmediata con solución de albúmina al 5% como una primera etapa en la transfusión de intercambio. Esto fue seguido por una retirada rápida de otro 50% del volumen de sangre, momento en el cual el Perro Nº 5 presentaba disnea manifestada por un incremento súbito en el ritmo respiratorio desde 14 por minuto hasta 38 por minuto asociado con un modelo de respiración agónico. Debido a las alteraciones clínicas obvias exhibidas por el Perro Nº 5 en este momento, se infundió rápidamente una cantidad igual de la solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la solución de la invención para restaurar el volumen de sangre hasta el normal. Durante la infusión de la solución de hemoglobina reticulada de la invención, el ritmo respiratorio volvía a 14 asociado con un cese del modelo de respiración fatigoso. Las determinaciones de gases sanguíneos antes de la primera hemorragia, después de la primera sustitución y después de la segunda sustitución indicaban que la PO_{2} permanecía dentro del intervalo normal.

El Perro Nº 6 también se sometió a una transfusión de intercambio de 75% similar al Perro Nº 5, pero esta vez reemplazando la primera hemorragia de 50% por un volumen igual de la solución de hemoglobina reticulada de la invención y la segunda hemorragia de 50% por un volumen igual compuesto por la solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la invención y albúmina al 5% mezcladas en partes iguales. Después de la primera hemorragia y sustitución, no había signos de fatiga respiratoria y no había signos de fatiga respiratoria durante o después de la segunda hemorragia y sustitución.

Las determinaciones de gases sanguíneos arteriales durante y después de la transfusión de intercambio indicaban que se mantenía una PO_{2} normal a lo largo del intercambio.

Estos datos sugieren que la solución de hemoglobina reticulada preparada mediante la invención tiene tanto una función de expansión de volumen como de transporte de oxígeno. La respuesta a una sola transfusión de la solución de hemoglobina reticulada de la invención no parecía estar asociada con un comportamiento clínico anormal o una química anormal de los parámetros hematológicos, aunque se observó una elevación transitoria en las enzimas hepáticas tanto en los perros de prueba como en el control.

Ejemplo VII Estudios de inmunogenicidad

La inmunogenicidad de la solución de hemoglobina producida de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo I y que tiene las propiedades que se caracterizan previamente (solución de hemoglobina de la invención) se probó en primates, sometidos a tres transfusiones con hemorragia de 1/3 del volumen de sangre calculado.

Seis monos Coebus, de 4 kg de peso corporal, se sedaron con ketamina, 15 mg/kg de peso corporal, intramuscularmente, y se enjaularon. Se insertaron percutáneamente cánulas estériles en una arteria y vena femoral. Se extrajo sangre de la arteria en una cantidad correspondiente a 2% del peso corporal en kilogramos (aproximadamente 1/3 del volumen de sangre). La solución de hemoglobina de la invención se infundió a través de la vena durante un período de 30 minutos. Se tomaron muestras de sangre (2,5 ml) (1) antes de la extracción de sangre, (2) 1 hora después de la infusión de hemoglobina de la invención, (3) diariamente durante 1 semana, (4) semanalmente durante 1 mes, (5) mensualmente durante 3 meses. Los sueros se probaron con respecto a la presencia de anticuerpos, usando la prueba de Ouchterlony. El mismo experimento se llevó a cabo después de 3 y 6 semanas. Así, cada animal se sometió a tres infusiones con hemoglobina de la invención a intervalos de 3 meses.

Todos los animales sobrevivían al ciclo de tres transfusiones con hemorragia. No se apreció signo de toxicidad (todos los animales parecían normales). La prueba de Ouchterlony resultaba consecuentemente negativa para todos los sueros, en todos los animales.

Ejemplo VIII Persistencia del material en la circulación

Este estudio se efectuó para demostrar la persistencia vascular única del producto de hemoglobina preparado por la invención. Desde los primeros días de la investigación sobre la hemoglobina, se ha establecido que la hemoglobina sólo se mantiene brevemente en la circulación. La nueva técnica y el producto único no sólo funcionan eficazmente sino que se mantienen en la circulación.

Para definir el peso molecular del producto, se han desarrollado datos que caracterizan el sucedáneo de sangre temporal único basado en hemoglobina de esta invención. Se ha medido la eliminación con el tiempo del material en sueros de perro y se ha podido caracterizar que el sucedáneo de sangre tiene las siguientes características al ensayar el procedimiento. En los siguientes ejemplos, la hemoglobina usada sobre los animales de prueba es el producto de hemoglobina producido de acuerdo con el Ejemplo I y se denomina Hemoglobina de la Invención.

1.1 Determinación de la distribución del peso molecular de hemoglobina en sueros de perro

Sueros de perro sabueso que se han obtenido durante experimentos de eficacia de intercambio isovolémico hasta 5% de hematocrito con hemoglobina de la invención se verificaron con relación a su distribución del peso molecular de hemoglobina mediante cromatografía de penetración en gel (HP 1090 A). Los cambios en la distribución del peso molecular con el tiempo después de la aplicación de Hemoglobina de la Invención eran como sigue.

1.1 Condiciones Analíticas

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline 
Dispositivo de HPLC  \+ HP 1090 A \\  Integrador  \+ HP 3392 \\ 
Detector  \+ Serie de diodos-UV-V/S/
(Hewlett Packard) \\  Columna de GPC  \+ TSK G 3.000 SW 300 nm x 7,5
mm \\  Eluyente  \+ 0,1 n K _{2} HPO _{4}  (pH 7,0) \\  Longitudes
de onda  \+ 260 nm (proteínas marcadoras)/405 nm (hemoglobina en
sueros de \\  de detección  \+ perro)
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Resultados

Estos resultados se tabulan en la siguiente Tabla V y más adelante se representan gráficamente en la Figura 14. Se observa fácilmente que la persistencia vascular se mantiene durante mucho más tiempo que el período de 24 horas presentado originalmente demostrado en otras soluciones.

TABLA V

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{6}{|l|}{Evaluación
de sueros de perros sabuesos}\\\hline   \+ % Hb 
\+\multicolumn{4}{|c|}{  }\\\hline  Pico Nº  \+  \+ *1  \+
*2  \+ *3  \+ *4 \\\hline  Suero de perro, valor 0  \+  \+ 3,14  \+
6,62  \+ 5,4 \+ \\  3 h 20 min  \+ 5,8  \+ 129,11  \+ 184,45  \+
239,78  \+ 719,35 \\  24 h  \+ 5  \+ 170,11  \+ 188,34  \+ 230,87 
\+ 461,74 \\  48 h  \+ 4,5  \+ 511,98  \+ 236,29  \+ 249,42  \+
249,42 \\  96 h  \+ 3,8  \+ 910,38  \+ 165,00  \+ 172,50  \+ 127,50
\\  120 h  \+ 2,8  \+ 1.058,81  \+ 80,00  \+ 80,00  \+ 40,00 \\  144
h  \+ 1,5  \+ 1.837,00  \+ 60,00  \+ 60,00  \+ 15,00 \\  168 h  \+
0,7  \+ 1.455,17  \+ 42,50  \+ 45,00  \+ 5,00 \\  216 h  \+ 0,08  \+
11,18  \+ 17,74  \+ 18,47  \+ - \\  240 h  \+ 0,09  \+ 7,25  \+
19,34  \+ 22,97  \+ - \\  294  \+ 0,1  \+ 6,52  \+ 55,05  \+ 25,35 
\+ -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

* Los números en cada volumen representan la altura máxima en centímetros por la escala total (en milivoltios)

Debido a la eliminación de hemoglobina, la concentración disminuye continuamente (véase la Tabla V). Por lo tanto, ha sido necesario trabajar con amplificaciones crecientes (``escala completa'' (mV)) del sistema integrador. Para poder comparar los picos cromatográficos de diferentes muestras, tienen que registrarse áreas de los picos de los pesos de los picos. Esto se llevó a cabo como sigue:

Las alturas de los picos se multiplicaron por la ``escala completa'' de amplificación. Podría observarse que los valores resultantes son lineales teniendo en cuenta la concentración de hemoglobina; Esto se ha verificado añadiendo Hemoglobina de la Invención a sueros de perro en concentraciones de hemoglobina de 1% a 7%. Representando gráficamente valores del logaritmo de la ``altura del pico x la escala completa'' frente al tiempo de muestreo de sueros (hasta 294 h (Tabla V)), puede obtenerse la cinética mostrada en la Figura 14. El pico Nº 1, que representa la parte de distribución del peso molecular de hemoglobina con el peso molecular más alto, muestra el valor del tiempo de retención más alto, según se espera a partir de la teoría. No pueden calcularse valores de semi-vida a partir de esta curva debido a que no revela una función exponencial ideal.

Para los componentes de hemoglobina, representados por los picos 2, 3 y 4, respectivamente, se encontraron los siguientes valores de semi-vida intravascular:

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll} 
pico 2:  \+ alrededor de 84 h \\  pico 3:  \+ alrededor de 68 h \\ 
pico 4:  \+ alrededor de 24 h
\\\end{tabular}\par

Los valores de semi-vida decrecientes, es decir, tiempo de retención intravascular más corto con peso molecular decreciente, confirman las expectativas teóricas.

\newpage

Venticuatro horas después de la infusión con Hemoglobina de la Invención, se examinó la distribución del peso molecular en el suelo y en la orina. Esta comparación muestra que exclusivamente el pico Nº 4, que representa el componente de Hb de 68.000, aparece en la orina después de ese momento.

La cantidad del componente de Hb (pico Nº 4) en el porcentaje de la distribución de peso molecular de Hemoglobina de la Invención total puede calcularse mediante la integración de las áreas de los picos (véase la siguiente Tabla VI).

TABLA VI

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|}\hline 
Muestra  \+ Area del Pico Nº 4 (% de la Distribución Total) \\\hline
 Hemoglobina de la Invención  \+ 48,0 \\  Suero 3 h 20 min  \+ 44,0
\\  28 h  \+ 38,9 \\  48 h  \+ 14,6
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

La mejor representación de la eliminación de suero se demuestra por las curvas de evaluación de la semi-vida en la Figura 14. En esta figura, que es una representación gráfica de los datos de la Tabla V, los datos son una representación en porcentaje de Hemoglobina de la Invención total que permanece en cada porcentaje de peso molecular del subgrupo.

Ejemplo IX Experimentos en ovejas Objetivo

El objetivo de este estudio era determinar la eficacia de la infusión de solución de Hemoglobina de la Invención en ovejas esplenectomizadas a través de una transfusión de intercambio repetida y la retirada de glóbulos rojos, y la disminución del hematocrito hasta aproximadamente 5%. Mediante este diseño de prueba, la eficacia potencial de las soluciones de hemoglobina de la invención puede demostrarse mediante la supervivencia en ausencia de un contenido de sangre alimentada suficiente para mantener la vida. La naturaleza, el grado y la duración del efecto terapéutico también se determinó para cada animal en este estudio.

Sustancia de prueba

Solución de Hemoglobina de la Invención según se describe previamente y según se produce mediante el Ejemplo I.

Sistema de prueba

Se usaron para este estudio ovejas de raza pura o de raza mixta que pesaban de 20,0 a 25,0 kg. Los animales se obtuvieron de una colonia comercial cuyos animales han sido certificados con respecto a la salud general antes del estudio y se sabe que son seronegativos para fiebre Q. Las ovejas se vacunaron para patógenos virales y bacterianos comunes; se probaron y se trataron con respecto a endo- y ecto-parásitos; y se trataron de otro modo para minimizar los efectos de cualquiera enfermedad que pudiera crear una variable. Los animales fueron alojados individualmente en corrales cubiertos con virutas, se alimentaron con una ración para ovejas garantizada y tenían acceso continuo a agua potable. Los parámetros ambientales se mantuvieron a 21,1ºC \pm 1,6ºC (70ºF \pm 3ºF), 45% de HR\pm y un ciclo de luz de 12 h/12 h. La estancia para los animales se trató como una estancia para animales convencional, pero los técnicos usaban guantes, batas y ropa de laboratorio cuando realizaban los procedimientos.

Instrumentación

Al menos dos semanas antes del estudio, las ovejas se mantuvieron en ayunas durante 24 horas, se pre-anestesiaron con 0,2 mg I.M. de sulfato de atropina, se anestesiaron con halotano al 4% mediante una máscara, se intubaron y se mantuvieron con halotano aproximadamente al 2%. Se realizó a continuación la esplenectomía usando técnicas asépticas a través de un sistema de la línea media ventral. El bazo fue inyectado con epinefrina 1:1000 durante este procedimiento para movilizar cualesquiera RBCs almacenados. Después de la esplenectomía, se tomaron biopsias de la médula ósea y el hígado. Se dejó a continuación que los animales se recuperaran durante 14 días y se verificaron con respecto a una buena salud continuada. Los valores hematológicos se compraron antes y después de la esplenectomía para determinar cualesquiera posibles efectos perjudiciales procedentes del procedimiento de cirugía del pre-estudio.

Para conservar el producto de hemoglobina de la invención, los intercambios iniciales se realizaron con solución de lactato de Ringer hasta que se alcanzaba un hematocrito de aproximadamente 20%. A continuación, los intercambios adicionales se realizaron usando hemoglobina de la invención hasta que el hematocrito residual era menor que 5%. Para este estudio, se seleccionaron 7 ovejas que se rastrearon con respecto a una buena salud general y se pretrataron para las enfermedades. Los animales se identificaron únicamente para este estudio. Además, se probaron 6 ovejas de control de un modo similar con Hespan™ (solución de hidroxietilalmidón) solo. Durante este estudio, una oveja se seleccionó aleatoriamente para la prueba cada uno de los ocho días de prueba. Las ovejas se mantuvieron en ayunas durante 24 horas antes del estudio y el agua se retiró aproximadamente 16 horas. Las ovejas se pesaron, se premedicaron con 0,2 mg de sulfato de atropina 1M y se anestesiaron con halotano al 4% administrado mediante una máscara facial. Cuando estaban adecuadamente anestesiadas, las ovejas se intubaron y se mantuvieron con halotano aproximadamente al 2%. La anestesia se valoró hasta la Fase III, Plano 2-3 y se mantuvo. La arteria femoral se diseccionó usando técnicas asépticas y se pusieron catéteres de calibre 15 en el vaso. Usando técnicas similares, la yugular se cateterizó con un catéter Swan-Ganz de diámetro interno grande. El animal se puso a continuación en una jaula metabólica y se dejó que se recuperara durante 2 horas. La presión sanguínea de la línea de base, medida mediante un transductor de catéter arterial, y la presión sanguínea se obtuvieron usando los catéteres implantados. Se extrajeron veinte cc de sangre cada vez para el análisis de las determinaciones hematológicas, químicas y de gases sanguíneos. Usando un método isovolumétrico, el volumen de sangre se reemplazó en cada animal, como sigue:

Procedimiento

1.: Se extrajeron de aproximadamente 400 a 600 ml del volumen circulatorio (CV) calculado del catéter de la arteria femoral. Se tomaron registros de la presión sanguínea de nuevo y después de que se produjera el choque (BP de 60/40) se infundió solución salina con lactato de Ringer en de 5 a 10 ml/minuto para reemplazar la sangre entera (volumen igual). Los registros de la presión sanguínea y las muestras se realizaron de nuevo después de esta infusión y se dejó que los animales se estabilizaran.

2.: Después del período de estabilización, las presiones sanguíneas se registraron, seguido por una segunda retirada de otros 400-600 ml de sangre. Después de esta extracción de sangre, los valores de la presión sanguínea, las muestras y la evaluación clínica con respecto a signos de choque se realizaron durante aproximadamente 10 minutos.

3.: Después del período de evaluación de 10 minutos, se administró solución de hemoglobina de la invención en un grado de infusión de 10 ml/minuto. La presión sanguínea, las muestras y los signos clínicos se verificaron durante 10 minutos para identificar estados que representarían efectos terapéuticos.

4.: Las etapas 2 y 3 se repitieron hasta que el hematocrito se reducía hasta por debajo de 5%. Los animales se observaron continuamente y se registraron los signos clínicos.

5.: Cada animal se verificó a fin de controlar cualesquiera signos asociados con la hemorragia y el tratamiento durante un período de 2 horas. Una muestra de sangre terminal de 20 cc se tomó para los análisis hematológico, químico y de gases sanguíneos antes de retirar los catéteres y cerrar los sitios de cateterización estérilmente bajo anestesia ligera con halotano.

6.: Los cambios en el gasto urinario se verificaron en una jaula metabólica y se registraron a través del tratamiento de hemorragia y los períodos de recuperación. Los valores de gases sanguíneos también se midieron durante cada fase mientras estaba colocado el catéter arterial.

7.: Cuando los animales se recuperaban de la anestesia, se devolvieron a sus jaulas y se les administró una terapia de apoyo según fuera necesario, indicada por su estado clínico. La verificación clínica exhaustiva y la terapia de apoyo continuada se proporcionaron durante 21 días.

Al principio del estudio, muestras de sangre de la línea de base se extrajeron de la vena yugular y se recogieron muestras de orina de 24 horas para el urianálisis. A intervalos diarios y a la terminación del estudio, se extrajeron muestras de sangre comparativas, se recogió orina y los exámenes oftalmológicos se repitieron. El día 14, las ovejas se anestesiaron como se describe previamente y se realizaron biopsias repetidas del hígado y la médula ósea. Los animales que morían se evaluaron mediante evaluaciones patológicas e histológicas generales. El espectro de las pruebas realizadas era:

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline 
Hematología  \+ Química clínica  \+ Gases sanguíneos (arteriales)
\\\hline  RBC  \+ SGOT  \+ PO _{2}  \\\hline  WBC  \+ SGPT  \+
PCO _{2}  \\  Conteo de Plaquetas  \+ LDG  \+ pH \\  WBC
diferenciales  \+ Fosfatasa Alcalina  \+ saturación de O _{2}  \\ 
Hemoglobina  \+ BUN  \+ contenido de O _{2}  \\  Hematocrito  \+
Creatinina \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(continuación)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline 
Hematología  \+ Química clínica  \+ Gases sanguíneos (arteriales)
\\\hline  Conteo de Reticulocitos  \+ Bilirrubina (I y D) \+ \\  con
Morfología REBC  \+ Sodio \+ \\   \+ Potasio \+ \\   \+ Cloruro \+
\\   \+ Calcio \+ \\   \+ Fósforo \+ \\   \+ Proteína Total \+ \\  
\+ Albúmina \+ \\   \+ Globulina \+ \\   \+ Relación A/G \+ \\   \+
Glucosa \+ \\   \+ Colesterol \+ \\   \+ Osmolaridad \+ \\   \+
Dióxido de Carbono \+ \\   \+ Triglicéridos \+ \\   \+ Hierro \+ \\ 
 \+ Capacidad de Acumulación \+ \\   \+ de Hierro \+ \\   \+
Urianálisis \+ \\   \+ Peso Específico \+ \\\hline   \+ pH \+
\\\hline   \+ Proteína \+ \\   \+ Glucosa \+ \\   \+ Cetonas \+ \\  
\+ Hemoglobina \+ \\   \+ Polímero de Hemoglobina \+ \\   \+ Examen
de Creatinina/ \+ \\   \+ Sedimiento \+ \\   Humor Acuoso  \+
\+ \\  Hemoglobina \+ \+ \\  RBC \+ \+ \\   Humor Acuoso  \+ \+
\\   \+ Suero y Hemoglobina \+ \\   \+ Hemoglobina Bovina \+ \\   \+
Anticuerpo \+ \\  CSF  \+ Hemoglobina Polimerizada \+ \\   \+
Hemoglobina  \+ Ferritina \\  RBC  \+ Heptiglobina \+ \\  Pruebas de
Coagulación  \+  \+ Patología General e Histológica \\  Pulmones PT 
\+  \+ Corazón \\  Hígado PTT (biopsias incluidas)  \+  \+ Riñones
(I y D) \\\hline   \+  \+ Cerebro \\\hline  Fibrinógeno  \+  \+ Ojos
\\   \+  \+ Glándulas Adrenales (I y D) \\   \+  \+ Tiroide S \\  
\+  \+ Médula Osea (biopsias \\  Hemodinámica  \+  \+ incluidas) \\ 
Gasto Cardíaco (dilución \+ \+ \\  térmica) \+ \+ \\  Presión
Arterial \+ \+ \\\hline  Presión Venosa Central \+ \+ \\\hline 
Presión de la Arteria Pulmonar \+ \+ \\  Obtenida mediante Cuña \+
\+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Todos los datos de las observaciones y las pruebas se registraron en ingresos para informes de historia, observación y prueba específicos.

Análisis estadístico

Se probaron siete ovejas usando el procedimiento de eficacia. Cada oveja tiene muestras de sangre de la línea de base y muestras de orina de 24 horas realizadas. Estos datos se obtuvieron a intervalos diarios durante el período de seguimiento. Para cada día de seguimiento, se realizaron comparaciones estadísticas usando la prueba pareada que compara cada medida de seguimiento con la medida de la línea de base correspondiente. De particular interés es una comparación de la sangre y las medidas inmediatamente después de la terminación de todas las transfusiones de intercambio con las medidas de la línea base correspondientes.

Referencias

1.: Blood Policy and Technology (Whashington, D.C.: U.S. Congress, Office Tecnology Assessment, OTA-H-260, Enero, pp. 133-150, 1985).

2.: ``Blood Groups and Blood Transfusion''. En: The Merck Veterinary Manual. 5 ed. Merck Company, Inc.; Rahway, NJ, pp. 42-49, 1979.

3.: Kolata, R.J., Burrows, C.F. y Soma, L.R., ``Shock: Pathophysiology and Management''. En.:Current Veterinary Therapy in Small Animal Practice. 7ª ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp. 32-48, 1980.

Resultados preliminares del procedimiento de eficacia en ovejas

Se incluyen en este ejemplo. Los datos sin procesar que se refieren a parámetros hemodinámicos se presentan en forma tabulada en las Tablas VII (Animales de Prueba) y VIII (Animales de Control). La representación gráfica de los datos del gas sanguíneo y los datos hemodinámicos en las Figuras 15-19 muestran que los animales de prueba mantenían contenidos de oxígeno arterial y venoso muy por encima de los niveles alcanzados en los controles que no recibían sustitución de volumen portador de oxígeno durante las transfusiones de intercambio. Todos los animales sobrevivían al intercambio. En contraste, ninguno de los animales de control sobrevivía a la transfusión de intercambio agudo. Seis de los animales de control mostraban un gasto cardíaco en deterioro a medida que los contenidos de oxígeno arterial y venoso mixto y el hematocrito caían por debajo de 10%.

En la Figura 18, la contribución de la Hemoglobina de la Invención en comparación con el hematocrito de la oveja se compara a niveles de hematocrito decrecientes. La Figura 18 demuestra que al final del intercambio, cuando el hematocrito residual está por debajo de 5%, aproximadamente 80-90% del contenido de oxígeno arterial es aportado por la Hemoglobina de la Invención en comparación con aproximadamente 10-20% que es aportado tanto por la fase líquida de la sangre como por los glóbulos rojos restantes en los animales de prueba.

Tanto el grupo de prueba como las ovejas de control respiraban aire ambiental en todos los momentos durante el experimento. Tanto el grupo de prueba como el grupo de control mostraban una disminución idéntica en el contenido de oxígeno arterial durante el primer intercambio que disminuía sus grupos respectivos desde el hematocrito de la línea de base hasta niveles de hematocrito de aproximadamente 20%. De este punto en adelante, el grupo de prueba recibía Hemoglobina de la Invención en intercambio con los glóbulos rojos de oveja naturales. En este punto, las cifras demuestran que el contenido de oxígeno se mantiene bien en los animales en los que se usa hemoglobina bovina para reemplazar la sangre extraída. En el caso de los controles, hay una disminución en el contenido de oxígeno venoso que continúa paralela a la disminución en el hematocrito ya que Hespan™ no transporta una cantidad significativa de oxígeno excepto como un gas disuelto.

La asociación del aporte de oxígeno con la hemoglobina bovina infundida se demuestra en la Figura 19 que muestra claramente el alejamiento del aporte de oxígeno descendente que está en primer lugar asociado con el hematocrito descendente en el intercambio inicial y que a continuación se incrementa en asociación con la concentración creciente de hemoglobina bovina que se usa para reemplazar los glóbulos rojos de oveja durante el intercambio.

Conclusiones

Este estudio demuestra claramente la eficacia de la Hemoglobina de la Invención como una solución de transporte de oxígeno. Los datos de los gases sanguíneos y los datos hemodinámicos están de acuerdo con la supervivencia de los animales de prueba en contraste con los animales de control, ninguno de los cuales sobrevivía a la transfusión de intercambio aguda. Puesto que los hematocritos residuales en todos los animales de prueba eran menores que 5% y, en algunos casos, entre 1 y 2%, el estudio demuestra claramente que la hemoglobina de la invención contribuía significativamente al transporte de oxígeno adecuado en los animales de prueba. Por otra parte, todos los animales de prueba sobrevivían a largo plazo sin un cuidado intensivo u oxígeno inspirado incrementado.

\newpage

TABLA VII

Análisis de Gases Sanguíneos - 7 Animales de prueba

Dinámica del oxígeno en transfusiones de intercambio

Datos originales

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lccccccc}\hline
 Oveja  \+ Peso  \+ NCT  \+ PO _{2}   \+ POS  \+ PO _{2}   \+ pH  \+
Contenido \\   \+ (kg)  \+  \+  \+ ART  \+ VEN  \+  \+ de O _{2} 
ART \\\hline  GREEN 192  \+ 25,00  \+ 31,00  \+ 82,30  \+ 48,90  \+
37,30  \+ 7,47  \+ 12,00 \\  Feb 24  \+ 25,00  \+ 18,00  \+ 72,30 
\+ 35,10  \+ 30,50  \+ 7,44  \+ 7,25 \\   \+ 25,00  \+ 17,00  \+
56,50  \+ 19,30  \+ 44,10  \+ 7,33  \+ 7,55 \\  Raza pura  \+ 25,00 
\+ 16,00  \+ 65,70  \+ 20,70  \+ 25,20  \+ 7,54  \+ 7,25 \\  Raza
pura  \+ 25,00  \+ 11,00  \+ 57,20  \+ 14,30  \+ 34,40  \+ 7,43  \+
7,90 \\  Raza pura  \+ 25,00  \+ 4,50  \+ 70,90  \+ 17,60  \+ 32,80 
\+ 7,52  \+ 8,30 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  Blue 239  \+ 23,00  \+
25,00  \+ 82,50  \+ 36,00  \+ 34,30  \+ 7,45  \+ 9,60 \\  Marzo 9 
\+ 23,00  \+ 15,00  \+ 100,40  \+ 30,90  \+ 31,60      \+ 7,43  \+
6,75 \\  Raza pura  \+ 23,00  \+ 13,00  \+ 79,30  \+ 16,60  \+ 28,80
 \+ 7,48  \+ 5,45 \\  Raza pura  \+ 23,00  \+ 1,60  \+ 95,70  \+
8,70  \+ 22,70  \+ 7,38  \+ 6,90 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  Blue
250  \+ 23,00  \+ 128,00  \+ 85,20  \+ 45,20  \+ 32,90  \+ 7,50  \+
9,95 \\  Mayo 12  \+ 23,00  \+ 16,00  \+ 85,30  \+ 32,60  \+ 32,00 
\+ 7,44  \+ 9,70 \\  Raza pura  \+ 23,00  \+ 3,00  \+ 84,30  \+
19,60  \+ 37,20  \+ 7,58  \+ 7,25 \\\hline  Oveja  \+ Peso  \+ NCT 
\+ POS  \+ PO _{2}   \+ POC _{2}   \+ pH  \+ Contenido \\   \+ (kg) 
\+  \+ ART  \+ VEN  \+  \+  \+ de O _{2}  \\\hline  AZUL 392  \+
27,30  \+ 25,00  \+ 88,90  \+ 42,50  \+ 31,70  \+ 7,49  \+ 9,95 \\ 
Agosto 11  \+ 27,30  \+ 21,00  \+ 97,30  \+ 37,80  \+ 30,20  \+ 7,51
 \+ 8,85 \\   \+ 27,30  \+ 13,00  \+ 85,70  \+ 31,40  \+ 36,30  \+
7,45  \+ 6,30 \\  Raza pura  \+ 27,30  \+ 10,00  \+ 62,60  \+ 24,60 
\+ 34,30  \+ 7,48  \+ 7,60 \\  Raza pura  \+ 27,30  \+ 4,50  \+
70,60  \+ 19,70  \+ 32,90  \+ 7,46  \+ 7,20 \\  Mestiza  \+ 27,30 
\+ 3,50  \+ 81,00  \+ 18,70  \+ 33,30  \+ 7,51  \+ 6,80 \\  Mestiza 
\+ 27,30  \+ 2,50  \+ 83,80  \+ 15,90  \+ 32,40  \+ 7,46  \+ 6,00 \\
 \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  YELLOW 99  \+ 29,00  \+ 28,00  \+ 87,50 
\+ 47,20  \+ 36,90  \+ 7,44  \+ 11,25 \\  Sep 10  \+  \+ 19,00  \+
88,80  \+ 38,30  \+ 35,80  \+ 7,43  \+ 7,25 \\  Raza pura  \+  \+
12,00  \+ 94,80  \+ 29,00  \+ 35,90  \+ 7,39  \+ 6,85 \\  Raza pura 
\+  \+ 7,00  \+ 86,00  \+ 25,10  \+ 36,50  \+ 7,37  \+ 6,65 \\  Raza
pura  \+  \+ 4,00  \+ 70,80  \+ 19,70  \+ 32,90  \+ 7,46  \+ 7,20 \\
 Mestiza  \+  \+ 3,50  \+ 81,00  \+ 18,70  \+ 33,30  \+ 7,51  \+
6,80 \\  Mestiza  \+  \+ 2,50  \+ 83,80  \+ 15,90  \+ 32,40  \+ 7,41
 \+ 6,20 \\  Raza pura  \+  \+ 1,50  \+ 95,30  \+ 20,70  \+ 33,80 
\+ 7,43  \+ 3,90 \\\hline  Oveja  \+ Peso  \+ NCT  \+ PO _{2}   \+
PO2  \+ POC _{2}   \+ pH  \+ Contenido \\   \+ (kg)  \+  \+ ART  \+
VEN  \+  \+  \+ de O _{2}  ART \\\hline  BLUE 590  \+ 28,00  \+
30,00  \+ 85,10  \+ 49,10  \+ 36,50  \+ 7,44  \+ 10,55 \\  Sept 11 
\+  \+ 20,00  \+ 82,60  \+ 16,10  \+ 36,60  \+ 7,47  \+ 7,05 \\ 
Raza pura  \+  \+ 11,00  \+ 86,10  \+ 22,10  \+ 35,90  \+ 7,46  \+
7,10 \\  Raza pura  \+  \+ 4,00  \+ 86,00  \+ 23,20  \+ 31,60  \+
7,40  \+ 7,50 \\  Raza pura  \+  \+ 2,56  \+ 87,30  \+ 21,40  \+
31,40  \+ 7,46  \+ 8,75 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  Blue 180  \+
34,54  \+ 30,00  \+ 82,60  \+ 47,20  \+ 32,60  \+ 7,41  \+ 12,65 \\ 
Sep 14  \+  \+ 18,00  \+ 59,40  \+ 36,10  \+ 33,84  \+ 7,44  \+ 8,10
\\  Raza pura  \+  \+ 8,00  \+ 127,90  \+ 20,00  \+ 15,40  \+ 7,57 
\+ 5,00 \\  Raza pura  \+  \+ 3,50  \+ 82,20  \+ 23,70  \+ 33,50  \+
7,43  \+ 9,05 \\  Raza pura  \+  \+ 3,00  \+ 81,50  \+ 23,44  \+
34,80  \+ 7,43  \+ 8,75
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VII (continuación)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lcccccc}\hline 
Oveja  \+ Línea de base  \+ Contenido  \+ Línea  \+ HGB  \+ Gasto 
\+ Línea \\   \+ de contenido  \+ de O _{2}  VEN  \+ de base  \+
plasmática  \+ cardíaco  \+ de base \\   \+ de % de O _{2}   \+  \+
del contenido  \+  \+  \+ de % CO \\   \+ de ART  \+  \+ % de
O _{2}  \+ \+ \+ \\   \+  \+  \+ VEN \+ \+ \+ \\\hline  GREEN 192 
\+ 100,00  \+ 8,35  \+ 100,00  \+ Datos  \+ 9,34  \+ 100,00 \\  Feb
24  \+ 50,64  \+ 1,55  \+ 18,56  \+ no to-  \+ 4,87  \+ 77,13 \\   
\+ 59,98  \+ 2,00  \+ 33,53  \+ mados  \+ 4,15  \+ 63,68 \\  Raza
pura  \+ 56,64  \+ 1,40  \+ 16,77  \+  \+ 3,50  \+ 55,25 \\  Raza
pura  \+ 61,72  \+ 2,10  \+ 25,15  \+  \+ 4,69  \+ 74,21 \\  Raza
pura  \+ 64,84  \+ 3,95  \+ 47,31  \+  \+ 4,61  \+ 72,94 \\    \+  
\+   \+   \+ Datos \+ \+ \\  Blue 239  \+ 100,00  \+ 6,45  \+ 100,00
 \+ no to-  \+ 5,61  \+ 100,00 \\  Marzo 9  \+ 70,31  \+ 2,90  \+
44,96  \+ mados  \+ 6,40  \+ 115,51 \\  Raza pura  \+ 56,77  \+ 0,75
 \+ 11,63  \+   \+ 2,20  \+ 39,22 \\  Raza pura  \+ 71,88  \+ 1,30 
\+ 20,16  \+ Datos  \+ 3,24  \+ 57,75 \\    \+   \+   \+   \+ no to-
\+ \+ \\  Blue 250  \+ 100,00  \+ 7,25  \+ 100,00  \+ mados  \+ 4,40
 \+ 100,00 \\  Mayo 12  \+ 97,49  \+ 2,90  \+ 40,00  \+  \+ 4,22  \+
95,91 \\  Raza pura  \+ 72,86  \+ 3,50  \+ 48,28  \+   \+ 3,75  \+
85,23 \\\hline  Oveja  \+ Línea de base  \+ Contenido  \+ Línea de 
\+ HGB  \+ Gasto  \+ Línea \\   \+ del contenido  \+ de O _{2}  VEN 
\+ base del  \+ Plasmática  \+ cardíaco  \+ de base \\   \+ de % de
O _{2}   \+  \+ contenido  \+  \+  \+ de % CO \\   \+  \+  \+ de %
de O _{2}  \+ \+ \+ \\   \+  \+  \+ VEN \+ \+ \+ \\\hline  AZUL 392 
\+ 100,00  \+ 8,10  \+ 100,00  \+ 0,00  \+ 5,57  \+ 100,00 \\ 
Agosto 11  \+ 88,94  \+ 4,70  \+ 77,05  \+ 0,00  \+ 5,09  \+ 91,36
\\   \+ 53,32  \+ 1,85  \+ 30,33  \+ 0,00  \+ 6,06  \+ 100,80 \\ 
Raza pura  \+ 76,76  \+ 2,30  \+ 37,70  \+ 1,72  \+ 4,64  \+ 83,30
\\  Raza pura  \+ 72,36  \+ 2,50  \+ 40,96  \+ 5,22  \+ 3,10  \+
55,66 \\  Mestiza  \+ 62,31  \+ 2,00  \+ 32,79  \+ 3,84  \+ 3,44  \+
61,76 \\  Mestiza  \+ 60,30  \+ 1,75  \+ 28,69  \+ 4,00  \+ 4,83  \+
86,71 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\  YELLOW 499  \+ 100,00  \+ 9,30  \+
100,00  \+ 0,00  \+ 6,03  \+ 100,00 \\  Sep 10  \+ 64,44  \+ 4,55 
\+ 48,92  \+ 0,00  \+ 5,54  \+ 91,87 \\  Raza pura  \+ 60,89  \+
2,45  \+ 26,34  \+ 2110,00  \+ 3,80  \+ 63,02 \\  Raza pura  \+
59,11  \+ 2,70  \+ 29,03  \+ 3600,00  \+ 3,83  \+ 63,52 \\  Raza
pura  \+ 64,44  \+ 3,40  \+ 36,56  \+ 4500,00  \+ 4,29  \+ 71,14 \\ 
Mestiza  \+ 50,67  \+ 2,05  \+ 22,04  \+ 3600,00  \+ 3,91  \+ 64,84
\\  Mestiza  \+ 24,89  \+ 1,25  \+ 13,44  \+ 3340,00  \+ 3,89  \+
64,51 \\  Raza pura  \+ 34,67  \+ 1,75  \+ 18,92  \+ 4220,00  \+
4,77  \+  79,10 \\\hline  Oveja  \+ Línea de base  \+ Contenido  \+
Línea de  \+ HGB del  \+ Gasto  \+ Línea \\   \+ del contenido  \+
de O _{2}  VEN  \+ base del  \+ plasma  \+ cardíaco  \+ de base \\  
\+ de % de O _{2}   \+  \+ contenido  \+  \+  \+ de % CO \\   \+ ART
 \+  \+ de % de O _{2}  \+ \+ \+ \\   \+  \+  \+ VEN \+ \+ \+
\\\hline  BLUE 590  \+ 100,00  \+ 3,80  \+ 100,00  \+ 0,00  \+ 3,62 
\+ 100,00 \\  Sept 11  \+ 66,02  \+ 3,30  \+ 46,53  \+ 0,00  \+ 4,13
 \+ 114,09 \\  Raza pura  \+ 67,30  \+ 1,55  \+ 22,79  \+ 3000,00 
\+ 2,82  \+ 77,90 \\  Raza pura  \+ 71,09  \+ 3,15  \+ 46,32  \+
4940,00  \+ 4,14  \+ 114,36 \\  Raza pura  \+ 82,04  \+ 3,10  \+
45,59  \+ 4304,00  \+ 3,18  \+ 87,85
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VII (continuación)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lcccccc}\hline 
Oveja  \+ Línea de base  \+ Contenido  \+ Línea de  \+ HGB del  \+
Gasto  \+ Línea \\   \+ del contenido  \+ de O _{2}  VEN  \+ base
del  \+ plasma  \+ cardíaco  \+ de base \\   \+ de % de O _{2}   \+ 
\+ contenido  \+  \+  \+ de % CO \\   \+ ART  \+  \+ de % de O _{2} 
\+ \+ \+ \\   \+  \+  \+ VEN \+ \+ \+ \\\hline  Blue 589  \+ 100,00 
\+ 8,05  \+ 10,00  \+ 0,00  \+ 3,87  \+ 100,00 \\  Sep 14  \+ 64,03 
\+ 3,50  \+ 43,48  \+ 0,00  \+ 2,85  \+ 84,54 \\  Raza pura  \+
69,57  \+ 2,58  \+ 32,30  \+ 4280,00  \+ 3,28  \+ 97,39 \\  Raza
pura  \+ 70,75  \+ 4,85  \+ 60,35  \+ 6816,00  \+ 3,87  \+ 114,71 \\
 Raza pura  \+ 77,08  \+ 5,75  \+ 71,43  \+ 7632,00  \+ 3,73  \+
110,59
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{cccccc}\hline 
Agotamiento  \+ línea de base  \+ Media  \+ Consumo  \+ Línea de
base  \+ Fracción \\  de oxígeno  \+ del agotamiento  \+ O _{2}   \+
de O _{2}   \+ del contenido  \+ del \\   \+ de oxígeno  \+  \+  \+
de O _{2}  en %  \+ extracto \\\hline  32,30  \+ 100,00  \+ 4,45  \+
11,25  \+ 100,00  \+ 34,76 \\  17,81  \+ 55,05  \+ 5,74  \+ 14,00 
\+ 124,44  \+ 52,66 \\  10,92  \+ 33,73  \+ 4,75  \+ 8,79  \+ 78,09 
\+ 62,91 \\  10,15  \+ 31,37  \+ 5,85  \+ 2,19  \+ 72,80  \+ 80,69
\\  14,02  \+ 45,09  \+ 5,00  \+ 19,88  \+ 96,72  \+ 763,42 \\ 
15,30  \+ 17,30  \+ 4,35  \+ 8,02  \+ 71,30  \+ 52,41 \\  \+ \+ \+
\+ \+ \\  23,42  \+ 100,00  \+ 3,15  \+ 7,60  \+ 100,00  \+ 32,31 \\
 19,02  \+ 81,21  \+ 3,85  \+ 10,85  \+ 141,28  \+ 37,03 \\  5,21 
\+ 22,25  \+ 4,70  \+ 4,50  \+ 48,49  \+ 46,26 \\  9,72  \+ 41,50 
\+ 5,60  \+ 7,89  \+ 102,73  \+ 91,16 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \\  19,05 
\+ 100,00  \+ 2,70  \+ 5,17  \+ 100,00  \+ 27,11 \\  17,81  \+ 93,59
 \+ 6,80  \+ 12,48  \+ 241,39  \+ 70,05 \\  11,81  \+ 61,97  \+ 3,75
 \+ 6,11  \+ 118,18  \+ 51,77 \\\hline  Agotamiento  \+ línea de
base  \+ Media  \+ Consumo  \+ Línea de base  \+ Fracción \\  de
oxígeno  \+ del agotamiento  \+ O _{2}   \+ de O _{2}   \+ del
contenido  \+ del \\   \+ de oxígeno  \+  \+  \+ de O _{2}  en %  \+
extracto \\\hline  29,39  \+ 100,00  \+ 3,85  \+ 7,84  \+ 100,00  \+
38,72 \\  16,50  \+ 81,28  \+ 4,15  \+ 7,74  \+ 98,7  \+ 46,91 \\ 
14,00  \+ 68,97  \+ 4,43  \+ 9,68  \+ 125,70  \+ 70,57 \\  12,90  \+
663,55  \+ 5,30  \+ 9,01  \+ 114,63  \+ 69,84 \\  8,18  \+ 40,30  \+
4,70  \+ 5,34  \+ 69,94  \+ 65,28 \\  7,61  \+ 38,47  \+ 4,20  \+
5,29  \+ 67,30  \+ 67,73 \\  10,62  \+ 52,32  \+ 4,25  \+ 7,52  \+
93,67  \+ 70,81 \\  \+ \+ \+ \+ \+ \\  23,39  \+ 100,00  \+ 1,95  \+
4,05  \+ 100,00  \+ 17,31 \\  13,85  \+ 59,21  \+ 2,70  \+ 5,12  \+
126,52  \+ 36,97 \\  8,98  \+ 38,38  \+ 4,40  \+ 5,76  \+ 142,22  \+
64,18 \\  8,78  \+ 37,54  \+ 3,95  \+ 5,82  \+ 128,89  \+ 59,45 \\ 
10,72  \+ 45,83  \+ 3,85  \+ 5,70  \+ 140,74  \+ 53,17 \\  7,69  \+
32,83  \+ 3,65  \+ 4,92  \+ 121,48  \+ 63,98 \\  3,76  \+ 16,06  \+
1,55  \+ 2,08  \+ 51,36  \+ 55,32 \\  6,41  \+ 27,40  \+ 2,15  \+
3,54  \+ 97,61  \+ 55,22
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VII (continuación)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{cccccc}\hline 
Agotamiento  \+ línea de base  \+ Media  \+ Consumo  \+ Línea de
base  \+ Fracción \\  de oxígeno  \+ del agotamiento  \+ O _{2}   \+
de O _{2}   \+ del contenido  \+ del \\   \+ de oxígeno  \+  \+  \+
de O _{2}  en %  \+ extracto \\\hline  13,60  \+ 100,00  \+ 3,75  \+
4,85  \+ 100,00  \+ 35,54 \\  12,40  \+ 76,25  \+ 3,75  \+ 5,53  \+
114,02  \+ 53,19 \\  7,15  \+ 52,42  \+ 3,55  \+ 5,57  \+ 115,26  \+
78,18 \\  11,00  \+ 91,30  \+ 4,35  \+ 6,43  \+ 132,58  \+ 58,00 \\ 
9,00  \+ 72,97  \+ 5,65  \+ 6,42  \+ 132,37  \+ 64,46 \\  \+ \+ \+
\+ \+ \\  15,05  \+ 100,00  \+ 4,60  \+ 4,34  \+ 100,00  \+ 36,34 \\
 8,19  \+ 54,90  \+ 4,69  \+ 4,21  \+ 97,03  \+ 56,82 \\  9,03  \+
60,03  \+ 5,31  \+ 5,08  \+ 117,14  \+ 70,44 \\  11,17  \+ 74,21  \+
4,10  \+ 5,21  \+ 120,01  \+ 45,82 \\  12,83  \+ 85,25  \+ 4,00  \+
5,17  \+ 119,01  \+ 41,03
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VII Análisis de gases sanguíneos - 6 Animales de control

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lcccccccccc}  
\+  \+  \+ PO _{2}   \+ PO _{2}   \+ PCO _{2}   \+ pH  \+ Contenido 
\+ Línea  \+ Contenido  \+  Línea \\   \+  \+  \+ ART  \+ VEN  \+ 
\+  \+ de O _{2}   \+ de base  \+ de  \+ de \\   \+  \+  \+  \+  \+ 
\+  \+  \+ del  \+ O _{2}   \+ base \\   \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+ 
\+ contenido  \+  \+ de O _{2}  \\   \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+
de % de O _{2}   \+  \+ en % \\\hline  Control  \+ 22,30  \+ 16,00 
\+ 89,40  \+ 34,80  \+ 36,50  \+ 7,44  \+ 6,30  \+ 100,00  \+  2,70 
\+ 100,00 \\  de  \+  \+ 9,00  \+ 90,70  \+ 26,50  \+ 33,70  \+ 7,43
 \+ 3,65   \+ 57,94  \+ 0,00  \+ 22,22 \\  HESPAN  \+  \+ 7,50  \+
96,40  \+ 23,40  \+ 32,20  \+ 7,46  \+ 3,15  \+ 50,00  \+ 0,40  \+
14,81 \\  S5  \+  \+ 6,50  \+  \+ 17,20  \+ 27,10  \+ 7,43  \+ 1,90 
\+ 30,16  \+ 0,20  \+ 7,41 \\   \+  \+ 4,00  \+  \+ 18,10  \+ 19,30 
\+ 7,41  \+ 1,65  \+ 26,19  \+ 0,20  \+ 7,41 \\  Control  \+ 21,40 
\+ 19,00  \+ 90,00  \+ 37,10  \+ 40,70  \+ 7,43  \+ 8,25  \+ 100,00 
\+ 3,40   \+ 100,00 \\  de  \+  \+ 14,00  \+ 57,70  \+ 31,20  \+
36,90  \+ 7,46  \+ 5,85  \+ 70,91  \+ 2,00  \+ 50,82 \\  HESPAN  \+ 
\+ 10,00  \+ 59,00  \+ 25,80  \+ 32,40  \+ 7,49  \+ 4,35  \+ 52,73 
\+ 0,85  \+ 25,00 \\  S6  \+  \+ 7,50  \+ 96,80  \+ 24,10  \+ 32,20 
\+ 7,49  \+ 3,45  \+ 41,82  \+ 0,40  \+ 11,46 \\   \+  \+ 6,50  \+
108,90  \+ 20,10  \+ 32,90  \+ 7,45  \+ 2,70  \+ 32,73  \+ 0,20  \+
5,88 \\   \+  \+ 5,50  \+ 110,10  \+ 17,70  \+ 32,30  \+ 7,42  \+
2,35  \+ 28,48  \+ 0,15  \+ 4,41 \\   \+  \+ 5,00  \+ 115,80  \+
15,90  \+ 27,80  \+ 7,38  \+ 2,15  \+ 26,06  \+ 0,15  \+ 4,41 \\ 
Control  \+ 20,00  \+ 23,00  \+ 91,10  \+ 39,40  \+ 39,30  \+ 7,44 
\+ 9,60  \+ 100,00  \+  5,40  \+ 100,00 \\  de  \+  \+ 17,00  \+
71,80  \+ 31,50  \+ 36,70  \+ 7,47  \+ 7,00  \+ 75,92  \+ 2,50  \+
46,30 \\  HESPAN  \+  \+ 13,00  \+ 99,00  \+ 31,70  \+ 30,00  \+
7,51  \+ 5,80  \+ 60,42  \+ 2,00  \+ 37,04 \\  S7  \+  \+ 9,00  \+
81,00  \+ 23,60  \+ 34,00  \+ 7,45  \+ 3,95   \+ 41,15  \+ 0,85  \+
15,74 \\   \+  \+ 7,00  \+ 101,20  \+ 22,20  \+ 32,20  \+ 7,47  \+
2,75  \+ 28,65  \+ 0,40  \+ 7,41 \\   \+  \+ 6,00  \+ 106,30  \+
17,90  \+ 30,70  \+ 7,48  \+ 2,50  \+ 26,04  \+ 0,25  \+ 1,63 \\  
\+  \+ 5,00  \+ 115,70  \+ 18,00  \+ 25,20  \+ 7,48  \+ 2,25  \+
23,44  \+ 0,20  \+ 3,70 \\  Control  \+ 18,20  \+ 15,00  \+ 90,90 
\+ 35,80  \+ 35,70  \+ 7,48  \+ 6,90  \+ 100,00  \+ 3,35   \+ 100,00
\\  de  \+  \+ 12,00  \+ 89,60  \+ 29,00  \+ 35,80  \+ 7,47  \+ 5,65
 \+ 81,80  \+ 1,85  \+ 55,22 \\  HESPAN  \+  \+ 8,50  \+ 84,20  \+
24,80  \+ 34,00  \+ 7,45  \+ 3,70  \+ 53,62  \+ 1,15  \+ 34,33 \\ 
S8  \+  \+ 7,00  \+ 99,80  \+ 20,80  \+ 33,00  \+ 7,45  \+ 3,30  \+
47,83  \+ 0,72  \+ 22,39 \\   \+  \+ 5,00  \+ 109,40  \+ 19,60  \+
27,00  \+ 7,47  \+ 3,05  \+ 44,20  \+ 0,30  \+ 8,96 \\   \+  \+ 4,50
 \+ 120,80  \+ 20,00  \+ 23,80  \+ 7,46  \+ 2,75  \+ 39,86  \+ 0,25 
\+ 7,46 \\  Control  \+ 19,00  \+ 17,00  \+ 86,00  \+ 34,90  \+
39,40  \+ 7,46  \+ 7,85  \+ 100,00  \+ 3,40   \+ 100,00 \\  de  \+ 
\+ 12,00  \+ 103,10  \+ 36,20  \+ 30,30  \+ 7,53  \+ 6,10  \+ 77,71 
\+ 2,75  \+ 80,88 \\  HESPAN  \+  \+ 10,00  \+ 96,00  \+ 29,50  \+
33,30  \+ 7,47  \+ 4,45  \+ 56,69  \+ 1,30  \+ 38,24 \\  S9  \+  \+
8,00  \+ 89,90  \+ 24,40  \+ 34,80  \+ 7,45  \+ 3,20   \+ 40,76  \+
0,90  \+ 26,47 \\   \+  \+ 5,50  \+ 99,90  \+ 18,30  \+ 34,80  \+
7,45  \+ 2,55  \+ 32,48  \+ 0,40  \+ 11,76
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VII (continuación)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lcccccccccc}  
\+  \+  \+ PO _{2}   \+ PO _{2}   \+ PCO _{2}   \+ pH  \+ Contenido 
\+ Línea  \+ Contenido  \+  Línea \\   \+  \+  \+ ART  \+ VEN  \+ 
\+  \+ de O _{2}   \+ de base  \+ de  \+ de \\   \+  \+  \+  \+  \+ 
\+  \+  \+ del  \+ O _{2}   \+ base \\   \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+ 
\+ contenido  \+  \+ de O _{2}  \\   \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+  \+
de % de O _{2}   \+  \+ en % \\\hline  Control  \+ 21,80  \+ 22,00 
\+ 75,60  \+ 43,20  \+ 36,30  \+ 7,49  \+ 8,90  \+ 100,00  \+ 4,75 
\+ 100,00 \\  de  \+  \+ 20,00  \+ 84,90  \+ 37,40  \+ 31,80  \+
7,49  \+ 7,95  \+ 89,33  \+ 4,30  \+ 90,53 \\  HESPAN  \+  \+ 1,00 
\+ 101,50  \+ 31,40  \+ 29,60  \+ 7,53  \+ 5,35  \+ 60,11  \+ 2,10 
\+ 44,21 \\  S10  \+  \+ 8,50  \+ 100,00  \+ 24,20  \+ 25,50  \+
3,90  \+ 3,90  \+ 43,85  \+ 0,90  \+ 18,95 \\   \+  \+ 7,00  \+
103,60  \+ 18,90  \+ 27,30  \+ 3,65  \+ 3,65  \+ 41,01  \+ 0,65  \+
13,68 \\   \+  \+ 5,00  \+ 116,50  \+ 17,00  \+ 21,10  \+ 2,85  \+
2,85  \+ 32,02  \+ 0,80  \+ 16,84
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA VIII

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{ccccccccc}  HGB
 \+ Gasto  \+ Línea de  \+ Agota-  \+ Línea de  \+ Media  \+ Consumo
 \+ Línea de  \+  Fracción \\  plasmá-  \+ car-  \+ base de  \+
miento  \+ base del  \+  \+ de  \+ base del  \+ del \\  tica  \+
díaco  \+ CO en %  \+ de O _{2}   \+ agotamiento  \+  \+ O _{2}   \+
consumo  \+  extracto \\   \+  \+  \+  \+ de O _{2}   \+  \+  \+ de
O _{2}  en % \+ \\\hline   \+ 5,62  \+ 100,00  \+ 15,90  \+ 100,00 
\+ 3,60  \+ 9,10  \+ 100,00  \+ 57,20 \\   \+ 7,08  \+ 125,76  \+
11,60  \+ 75,96  \+ 3,05  \+ 9,70  \+ 106,59  \+ 03,60 \\   \+ 6,51 
\+ 115,64  \+ 9,20  \+ 57,86  \+ 2,75  \+ 8,00  \+ 87,91  \+ 86,90
\\   \+ 4,74  \+ 84,34  \+ 4,00  \+ 25,16  \+ 1,70  \+ 3,60  \+
39,56  \+ 90,00 \\   \+ 3,01  \+ 53,56  \+ 2,20  \+ 13,84  \+ 1,45 
\+ 2,00  \+ 21,98  \+ 90,90 \\   \+ 4,77  \+ 100,00  \+ 22,224  \+
100,00  \+ 4,85  \+ 13,08  \+ 100,00  \+ 58,80 \\   \+ 5,78  \+
100,17  \+ 15,80  \+ 71,04  \+ 3,85  \+ 10,40  \+ 79,51  \+ 65,80 \\
  \+ 6,06  \+ 105,03  \+ 12,32  \+ 55,40  \+ 3,50  \+ 9,91  \+ 75,76
 \+ 80,40 \\   \+ 6,02  \+ 104,33  \+ 9,70  \+ 43,62  \+ 3,05  \+
8,58  \+ 65,60  \+ 88,50 \\   \+ 5,45  \+ 94,45  \+ 6,88  \+ 30,94 
\+ 2,50  \+ 6,36  \+ 48,70  \+ 92,60 \\   \+ 4,82  \+ 83,54  \+ 5,29
 \+ 23,79  \+ 2,20  \+ 4,96  \+ 37,92  \+ 93,80 \\   \+ 2,76  \+
47,83  \+ 2,77  \+ 12,46  \+ 2,00  \+ 2,58  \+ 19,72  \+ 93,10 \\  
\+ 4,50  \+ 100,00  \+ 21,60  \+ 100,00   \+ 4,20  \+ 9,45  \+
100,00  \+ 43,80 \\   \+ 4,83  \+ 407,33  \+ 16,90  \+ 78,24  \+
4,50  \+ 10,87  \+ 115,03  \+ 64,40 \\   \+ 5,59  \+ 124,22  \+
16,20  \+ 75,00  \+ 3,80  \+ 10,62  \+ 112,38  \+ 65,60 \\   \+ 6,19
 \+ 137,56  \+ 12,20  \+ 56,48  \+ 3,10  \+ 9,59  \+ 101,48  \+
78,60 \\   \+ 9,90  \+ 153,56  \+ 9,50  \+ 43,98  \+ 2,35  \+ 8,12 
\+ 85,93  \+ 85,50 \\   \+ 5,92  \+ 131,56  \+ 7,40  \+ 34,26  \+
2,25  \+ 6,66  \+ 70,48  \+ 90,00 \\   \+ 6,81  \+ 151,33  \+ 7,66 
\+ 35,46  \+ 2,05  \+ 6,98  \+ 73,86  \+ 91,10 \\   \+ 5,71  \+
100,00  \+ 21,60  \+ 100,00  \+ 3,55  \+ 11,10  \+  100,00  \+ 51,60
\\   \+ 7,04  \+ 106,30  \+ 18,84  \+ 87,22  \+ 3,80  \+ 12,67  \+ 
114,14  \+ 67,30 \\   \+ 5,87  \+ 128,02  \+ 14,86  \+ 68,80  \+
2,55  \+ 10,24  \+  82,25  \+ 60,90 \\   \+ 6,51  \+ 133,80  \+
13,85  \+ 64,12  \+ 2,55  \+ 10,70  \+  96,40  \+ 77,30 \\   \+ 5,84
 \+ 121,02  \+ 11,58  \+ 53,61  \+ 2,75  \+ 10,44  \+  94,05  \+
90,20 \\   \+  \+ 73,20  \+ 6,32  \+ 29,26  \+ 2,50  \+ 5,74  \+
51,71   \+ 90,90 \\   \+ 5,71  \+ 100,00  \+ 21,36  \+ 100,00  \+
4,45  \+ 12,11  \+  100,00  \+ 59,69 \\   \+ 7,04  \+ 136,17  \+
22,60  \+ 105,81  \+ 3,35  \+ 12,41  \+  94,12  \+ 57,92 \\   \+
5,87  \+ 113,54  \+ 13,75  \+ 64,37  \+ 3,15  \+ 9,73  \+  93,27  \+
70,70 \\   \+ 6,51  \+ 125,92  \+ 10,96  \+ 51,31  \+ 3,01  \+ 10,31
 \+  87,39  \+ 94,10 \\   \+ 5,84  \+ 112,96  \+ 7,84  \+ 36,70  \+
2,15  \+ 6,61  \+  70,43  \+ 84,29 \\   \+ 5,54  \+ 100,00  \+ 22,62
 \+ 100,00  \+ 4,15  \+ 10,55  \+  100,00  \+ 46,62 \\   \+ 5,93  \+
107,04  \+ 21,63  \+ 95,62  \+ 3,65  \+ 9,93  \+  94,12  \+ 45,90 \\
  \+ 6,60  \+ 119,13  \+ 16,20  \+ 71,62  \+ 3,25  \+ 9,84  \+ 
93,27  \+ 60,74 \\   \+ 6,70  \+ 120,94  \+ 11,99  \+ 53,01  \+ 3,00
 \+ 9,22  \+  87,39  \+ 76,90 \\   \+ 5,40  \+ 97,47  \+ 9,04  \+
39,96  \+ 3,00  \+ 7,43  \+  70,43  \+ 82,20 \\   \+ 6,92  \+ 124,91
 \+ 9,05  \+ 40,01  \+ 2,05  \+ 6,51   \+ 61,71  \+ 71,91
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo X Experimentos en perros Objetivo

La hemoglobina de la invención se probó con respecto a la eficacia, la tolerabilidad y los efectos secundarios sobre perros sabuesos. La disposición experimental estaba destinada a responder a la pregunta de si la preparación estudiada era capaz de asumir la función de transporte de oxígeno y la sustitución de volumen en el caso de pérdidas graves de sangre endógena, y cuán rápidamente la hemoglobina suministrada se excreta del cuerpo. La tolerabilidad y la presencia de efectos secundarios inesperados también se determinaron de forma secundaria.

Hay una indicación de una solución de transporte de O_{2} sólo cuando la cantidad restante de hemoglobina endógena ya no puede satisfacer el requerimiento de O_{2} del tejido. A partir de esto, se deduce que la anemia de los animales experimentales debe ser tan grave que se produzcan al menos lesiones detectables a partir de la deficiencia de O_{2}, y al mismo tiempo, la administración de la solución de hemoglobina evitE de forma demostrable estas lesiones.

Sustancia de prueba

Solución de Hemoglobina de la Invención como la descrita previamente y según se produce mediante el procedimiento del Ejemplo 1.

Modelo experimental

Se usaron 7 perros sabuesos de raza pura para estudiar cuáles se habían esplenectomizado aproximadamente 3 semanas antes del comienzo del estudio.

Instrumentación

Después de la premedicación y la iniciación de la anestesia, se llevó a cabo una hemodilución isovolémica a través de bombas peristálticas de una manera controlada sobre 4 animales con solución de hemoglobina de la invención hasta un hematocrito residual de 5%, y sobre 3 animales de control con una solución de hidroxietilalmidón (HES) cuya composición iónica y presión osmótica coloidal eran equivalentes a las de la solución de Hemoglobina de la Invención. Se determinó un número de parámetros durante la transfusión de intercambio y el período de seguimiento de 10 días.

Resultados de pruebas en perros

En este estudio, 4 perros de prueba recibían una transfusión de intercambio con Hemoglobina de la Invención bajo anestesia general durante un período de 3 horas con medidas aproximadamente cada 10 minutos. Todos los perros de prueba sobrevivían a la transfusión de intercambio aguda con hematocritos residuales por debajo de 5%. El análisis hemodinámico y de gases sanguíneos revelaba que todos los perros de prueba estaban bien oxigenados al final del procedimiento en contraste con los 3 perros de control que no sobrevivían a la transfusión de intercambio con la solución de hidroxietilalmidón. Los 3 perros de control tenían evidencia de una oxigenación inadecuada asociada con los niveles de hematocrito decrecientes. Las Figuras 20-24 demuestran las diferencias en los grupos de prueba y de control para los parámetros seleccionados medidos.

Conclusión

Los resultados preliminares de este estudio de eficacia demuestran que la solución de hemoglobina de la invención contribuye a la oxigenación normal de perros de prueba que están gravemente agotados en LA masa de glóbulos rojos. En contraste con los perros de control que no podían sobrevivir con niveles de hematocrito residual muy bajos, los animales de prueba sobrevivían todos a la transfusión de intercambio agudo. La conclusión de este estudio es que es evidente que la solución de Hemoglobina de la Invención transporta oxígeno bajo condiciones extremas de pérdida grave de glóbulos rojos.

Claims

1. Un procedimiento para preparar un sucedáneo de sangre atóxico que comprende una solución acuosa de hemoglobina reticulada, estando dicho sucedáneo de sangre sustancialmente libre de estroma celular, proteínas no hemoglobínicas y pirógenos y teniendo un nivel de endotoxinas que durante la administración in vivo no provoca la activación del complemento, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(1): la separación de glóbulos rojos de una fracción de sangre bovina y degradación mecánica de los glóbulos rojos para producir un material compuesto de hemoglobina y estroma, que incluye fosfolípidos, en donde la separación y la degradación mecánica se llevan a cabo mediante centrifugación durante la cual los glóbulos rojos impactan con una superficie interna de una cámara de recogida de la centrífuga para producir una solución que contiene hemoglobina;

(2): clarificar la solución que contiene hemoglobina para producir una solución de hemoglobina que está sustancialmente libre de residuos celulares;

(3): la separación mediante filtración microporosa y ultrafiltración de la hemoglobina, contaminada con al menos una porción del fosfolípido;

(4): la purificación de la hemoglobina mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de intercambio iónico para separar la hemoglobina de todas las otras proteínas residuales de los glóbulos rojos, así como los contaminantes de fosfolípido, enzimas y endotoxinas, en donde la HPLC se lleva a cabo usando un medio de separación que comprende gel de sílice con una superficie derivada para tener una propiedad superficial de tipo de amina cuaternaria e incluye la elución de la hemoglobina con tampón para establecer un gradiente o flujo de composición variable;

(5): recoger el efluente de la etapa (4) alrededor de su pico de hemoglobina;

(6): reticular la hemoglobina; y

(7): separar parcialmente la hemoglobina reticulada de la hemoglobina no reticulada para producir un producto que tiene una distribución de peso molecular definida de más de 90% entre 68.000 daltons y 500.000 daltons.