ES2200177T3 - Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acecular de globlulo rojo. - Google Patents
Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acecular de globlulo rojo.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE HEMOGLOBINA BASICAMENTE LIBRE DE TETRAMERO, BASICAMENTE LIBRE DE ESTROMA, POLIMERIZADO, PIRODOXILADO. TAMBIEN SE PRESENTA UN PRODUCTO DE HEMOGLOBINA BASICAMENTE LIBRE DE TETRAMERO, BASICAMENTE LIBRE DE ESTROMA, POLIMERIZADO, PIRODOXILADO QUE SE INFUNDE EN PACIENTES HUMANOS EN UNA CANTIDAD DE HASTA ALREDEDOR DE 5 LITROS.
Description
Procedimiento y aparato para preparar un
sustituto acelular de glóbulo rojo.
La presente invención se refiere a procedimientos
y aparatos para preparar productos sustitutos de glóbulos rojos, a
saber, productos de hemoglobina. Se refiere además a un sustituto
acelular de glóbulos rojos que comprende una solución de
hemoglobina piridoxilada, polimerizada, reticulada, exenta
esencialmente de tetrámeros, que está exenta de contaminantes de
estroma.
Durante varios años, los bancos de sangre han
proporcionado sangre completa para transfusiones durante
intervenciones quirúrgicas debidas a traumatismos o por otras
circunstancias. Sin embargo, la sangre completa obtenida de donantes
humanos no es adecuada para diversas utilizaciones. En particular,
la utilización de sangre completa es problemática debido al
requisito del grupo sanguíneo del donante y de la toxicidad
producida por virus y otros contaminantes. Estos problemas son
especialmente relevantes para situaciones de urgencia, tales como la
utilización por los militares. Por consiguiente, se han dedicado
muchos esfuerzos al desarrollo de sustitutos de sangre completa
obtenida a partir de donantes humanos. Este desarrollo ha
producido varias modificaciones a la sangre de procedencia humana o
de otros mamíferos. La hemoglobina exenta de estroma es conocida en
la técnica por sus aptitudes para el transporte de oxígeno y de
unión reversible al oxígeno (o ligando). Debido a que los problemas
de toxicidad han excluido su utilización como sustituto de sangre,
la hemoglobina exenta de estroma ha necesitado modificaciones
adicionales para proporcionar un producto no tóxico,
farmacéuticamente útil.
Estas modificaciones incluyen (1) hacer que la
hemoglobina esté exenta o sustancialmente exenta de estroma y de
contaminantes de estroma; (2) piridoxilación; (3) polimerización o
reticulación; (4) eliminación del tetrámero y (5) modificación con
monóxido de carbono u otros ligandos.
Sin embargo, las soluciones de hemoglobina
preparadas mediante estas técnicas, mientras que son capaces de
transportar suficientes cantidades de oxígeno para mantener la
vida, han sido acosadas con muchos efectos secundarios y
propiedades indeseables. Por ejemplo, un principal efecto secundario
problemático consiste en la disminución del funcionamiento del
riñón. Estos cambios se piensa que son debidos a la presencia de
contaminantes no deseados tales como la endotoxina bacteriana o los
fragmentos de membranas de glóbulos rojos (estroma). Mientras que
los contaminantes como los citados pueden producir de hecho
alteraciones renales, las soluciones de hemoglobina prácticamente
exenta de los contaminantes anteriores producen todavía una
disfunción renal sustancial. La causa de la disfunción renal se ha
atribuido a cantidades fisiológicamente inaceptables de tetrámero de
hemoglobina no polimerizado. Otros efectos secundarios indeseables
de la infusión de hemoglobina tetrámera son la vasoconstricción,
la hemoglobinuria, la disminución del ritmo cardíaco, la elevación
de la presión sanguínea media arterial y el extravasado del
infundido especialmente en la cavidad peritoneal.
En la práctica, ningún sustituto de sangre
derivado de hemoglobina ha tenido éxito para evitar totalmente los
problemas de toxicidad. Estos productos también presentan periodos
de conservación inaceptablemente bajos después de la administración
a pacientes humanos. Tales periodos de conservación requieren
transfusiones del volumen sanguíneo de forma repetida durante
periodos de tiempo cortos. Por consiguiente, existe una necesidad
fundamental de productos de hemoglobina que no sean tóxicos para
los pacientes y que presenten periodos de conservación
considerables después de la administración. Desde luego, estos
productos deben ser capaces de transportar de forma reversible el
oxígeno a los tejidos de una manera similar a la que se consigue
con la sangre completa.
El documento
US-A-5.464.814 describe un
procedimiento para preparar un polímero de hemoglobina de un peso
molecular medio de aproximadamente 120.000 Da.
El documento
EP-A-361.720 da a conocer una
solución de un sustituto de sangre basado en hemoglobina. No se
describe ninguna distribución del peso molecular.
El documento
US-A-5.194.590 describe hemoglobina
polimerizable en un intervalo de peso molecular de 120.000 a
600.000 Da. La media es de aproximadamente 120.000 Da.
La presente invención proporciona sustitutos de
hemoglobina que no son tóxicos para pacientes humanos y que
presentan periodos de conservación considerables de 15 horas, por
lo menos, cuando se administran a pacientes humanos. Los productos
de hemoglobina de la invención están exentos de estroma,
piridoxilados y polimerizados además de estar exentos de
contaminantes víricos y de otros tóxicos. Además, estos productos
están exentos considerablemente de leucocitos (glóbulos blancos) y
plaquetas.
La presente invención también abarca
procedimientos para preparar los sustitutos inventivos de
hemoglobina. Los procedimientos incluyen la eliminación de
leucocitos y plaquetas de la sangre; lavando y lisando los glóbulos
rojos; eliminando los contaminantes del estroma y el estroma por
filtración y tratamiento con calor; preparando la forma desoxi de
la hemoglobina; piridoxilación y polimerización; además de
purificación y concentración; y desoxigenación. El producto
resultante se puede formular a continuación para proporcionar un
producto de hemoglobina con concentraciones de varios electrolitos
dentro de márgenes fisiológicos normales.
La invención también proporciona una formulación
acuosa de hemoglobina piridoxilada, polimerizada, en la que la
hemoglobina es una hemoglobina polimerizada con glutaraldehído que
contiene material tetrámero, que presenta el perfil de peso
molecular de la Figura 3. Esta formulación se puede utilizar para
preparar un sustituto de glóbulos rojos acelulares. En este
aspecto, la formulación se purifica en primer lugar para eliminar
el tetrámero y a continuación se combina con cantidades apropiadas
de electrolitos para producir un sustituto de glóbulos rojos,
acelular, fisiológicamente aceptable que puede, por consiguiente,
ser utilizado para tratar un paciente humano que requiere una
infusión de un transportador de oxígeno.
La Figura 1 es un diagrama esquemático que
representa una parte del procedimiento y del equipo utilizado para
producir una solución de hemoglobina desoxigenada preparada por
piridoxilación y polimerización.
La Figura 2 es un diagrama esquemático que
representa una parte del procedimiento y del aparato comenzando por
la piridoxilación y polimerización y dando como resultado un
producto polimerizado de hemoglobina, desoxigenado, purificado,
piridoxilado y una parte del procedimiento y aparato utilizado para
formular el producto de hemoglobina final que tiene
concentraciones fisiológicas de electrolitos.
La Figura 3 es un gráfico de HPLC de material
polimerizado después del tratamiento con glicina antes de la
purificación. El producto está indicado con picos en los tiempos
de retención (RT) 15,57, 16,08, 17,00 y 18,19. El material tetrámero
está indicado por los picos a RT de 19,88 y 20,51. El polímero es
76,2% de este material.
La Figura 4 es un gráfico de HPLC del producto de
hemoglobina de la invención. La hemoglobina polimerizada está
indicada por los picos a RT de 15,7,16,33, 17,32 y 18,56. El
tetrámero está indicado por los picos a RT 21,18.
La Figura 5 es un diagrama esquemático que
representa el procedimiento de purificación por cromatografía en
columna empleado en la invención.
La Figura 6 es un diagrama esquemático que
representa el procedimiento de purificación por filtración en
membrana empleado en la invención.
La presente invención se refiere a un sustituto
de glóbulos rojos que comprende hemoglobina fundamentalmente
exenta de tetrámeros, reticulada, polimerizada, piridoxilada, que
está sustancialmente exenta de estroma, de contaminantes de estroma
y de otros contaminantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "reticulado" significa la sustitución química de
"puentes" moleculares en o dentro de una molécula, o entre
moléculas con el fin de alterar la forma, en tamaño, la función o
las propiedades físicas de la molécula. Las moléculas reticuladas
pueden estar polimerizadas o no polimerizadas, es decir, las
moléculas reticuladas pueden ser tetrámeras.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "tetrámero" se refiere a moléculas de hemoglobina con
un peso molecular de aproximadamente 64 Kd; esto es, el término se
refiere tanto a las moléculas de hemoglobina naturales como a las
reticuladas intramolecularmente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "esencialmente exento de tetrámero" indica el nivel
de pureza con respecto a la contaminación del tetrámero al cual no
se presentan ya determinadas respuestas biológicas al tetrámero
administrado a un mamífero. Un criterio principal es la ausencia de
alteraciones en la función renal cuando se infunden cantidades
farmacéuticamente eficaces, esto es, a un nivel de pureza de
aproximadamente 99% o mejor (está presente menos de aproximadamente
el 1% de tetrámero). El producto preferido producido por el
procedimiento inventivo contiene no más de aproximadamente 0,8% de
tetrámero basado en el peso de hemoglobina total (THb). En otras
palabras, un producto esencialmente exento de tetrámero según la
invención contiene no más que cantidades fisiológicamente
aceptables de tetrámero no polimerizado de hemoglobina. Los
productos particularmente preferidos de la invención contienen
menos de aproximadamente el 0,5% de tetrámero; los productos más
particularmente preferidos de la invención contienen
aproximadamente del 0,3 al 0,4% de tetrámero. Se ha observado que
dichas cantidades de tetrámero son fisiológicamente aceptables.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos "producto ultrapurificado" o "producto
purificado" tienen el mismo significado que el término
"esencialmente exento de tetrámero".
Tal como se utiliza en la presente memoria, el %
de hemoglobina total (THb) se define como gramos de
hemoglobina/100 ml de solución.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "solución de polimerización" significa una solución
que contiene un agente "reticulante" o polimerizante, tales
como glutaraldehído, imidoésteres, diaspirina u otros, en un
excipiente bioquímicamente adecuado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término polimerizado significa la colocación de puentes
moleculares entre moléculas o subunidades tetrámeras, en las que
el tamaño y el peso de la molécula polimerizada resultante aumenta
con respecto a la hemoglobina natural o tetrámera. La hemoglobina
polimerizada no es hemoglobina tetrámera.
Por solución de hemoglobina, tal como se utiliza
en la presente memoria, se entiende una solución de hemoglobina
tetrámera o moléculas polimerizadas de hemoglobina, en la que las
moléculas no están contenidas dentro de glóbulos rojos. Dicha
solución necesita estar exenta o sustancialmente exenta de estroma
de glóbulos rojos o contaminantes de estroma. Sin embargo, las
soluciones preferidas de hemoglobina polimerizada están exentas de
estroma de glóbulos rojos y de contaminantes de estroma.
El término "membrana semipermeable"
significa una membrana permeable a determinadas especies
moleculares y no a otras, y, a saber, una membrana que actúa como
filtro selectivo excluyendo determinados pesos moleculares.
El producto del procedimiento según la presente
invención, solución de hemoglobina polimerizada, piridoxilada,
esencialmente exenta de hemoglobina tetrámera (natural o
intramolecularmente reticulada), de estroma y de diversos otros
contaminantes, producidos a partir de hemoglobina tetrámera, tratada
con calor, inactivada víricamente, es fisiológicamente aceptable
además de terapeúticamente y clínicamente útil. El producto
presenta capacidad reversible de unión al oxígeno que es necesaria
para las propiedades de transporte de oxígeno. Más notablemente, el
producto demuestra buenas propiedades de carga y descarga en el uso
que se correlacionan al tener una curva de disociación
oxígeno-hemoglobina (P_{50}) similar a la sangre
completa. El producto se une al oxígeno con gran afinidad en los
capilares a través de los pulmones y a continuación libera oxígeno
en los tejidos del cuerpo. El producto tampoco necesita estudios
de compatibilidad con el receptor.
El producto presenta asimismo una vida media
cuando se administra a pacientes humanos de aproximadamente por lo
menos 15 horas y más preferentemente de aproximadamente 24 horas.
Este producto de hemoglobina se puede infundir en pacientes en
cantidades de hasta aproximadamente 3,0 l e incluso hasta
aproximadamente 5,0 l. En otras palabras, el producto de hemoglobina
de la inventiva se puede utilizar para rellenar prácticamente todo
el volumen sanguíneo de pacientes humanos sin producir
vasoconstricción, toxicidad renal, hemoglobinuria u otros problemas
asociados a la administración intravenosa de portadores sintéticos o
semisintéticos de oxígeno y sustitutos de la sangre. Por lo tanto,
la invención incluye un procedimiento para practicar una
transfusión a un paciente, preferentemente un paciente humano, con
una cantidad de producto de hemoglobina exento de estroma, exento
de tetrámero, polimerizado, piridoxilado, que no es tóxico para el
paciente, en el que la cantidad es hasta por lo menos
aproximadamente 5,0 l. Dicho procedimiento incluye conectar el
paciente o sujeto a un dispositivo de infusión o a otro equipo para
infusionar o transfusionar al paciente.
El procedimiento de la presente invención es
único porque proporciona un producto con una concentración de
tetrámero de no más de aproximadamente el 1% y, más
preferentemente, no más de aproximadamente el 0,8% en peso basado en
el peso de hemoglobina total en la solución. El procedimiento de la
presente invención proporciona una ventaja adicional en que puede
hacer que el producto final esté prácticamente exento de antígenos
y patógenos microbianos y víricos. Es decir tales antígenos y
patógenos microbianos y víricos se reducen a concentraciones
indetectables. El producto es estéril según se determina por
análisis indicado en la Farmacopea de Estados Unidos, capítulo
XXIII <71>. Ejemplos de dichos antígenos y patógenos,
incluyen, por ejemplo, bacterias, rickettsias, hongos, protozoos,
virus y otros organismos. De forma más significativa, el
procedimiento proporciona un producto biológico exento de virus que
produce hepatitis y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA).
Por lo que se refiere a las propiedades
fisiológicas, el producto biológico de la presente invención,
cuando se infunde en cantidades de hasta por lo menos
aproximadamente 5,0 l, no produce vasoconstricción, toxicidad renal,
hemoglobinuria y otros problemas implicados en la administración
intravenosa de conocidas soluciones de hemoglobina que contienen
cantidades fisiológicamente indeseables de hemoglobina tetrámera.
La administración intravenosa del producto producido por el
procedimiento descrito en la presente memoria no produce ningún
descenso apreciable en la producción de orina, ningún descenso
apreciable en la tasa de filtración glomerular, ni ningún cambio
apreciable en el color de la orina producida.
Por consiguiente, el procedimiento de la
invención proporciona un sustituto acelular de glóbulos rojos útil
para el tratamiento de traumatismos, infarto de miocardio,
apoplejia, anemia de corta duración y trastornos por insuficiencia
de oxígeno, tales como hipoxemia, hipoxia o hipoxia en etapa final
debidas a la alteración o fallo del pulmón en la sangre
completamente oxigenada. El producto también es útil para el
tratamiento de cualquier enfermedad o estado médico que requiera un
fluido reanimativo (p. ej.: traumatismo, choque específicamente
hemorrágico), un expansor del volumen intravascular o una
transfusión de intercambio. Además del tratamiento médico, el
producto puede ser útil en la conservación de órganos para
trasplantes.
El proceso inventivo comprende los siguientes
procedimientos:
- 1. aspiración y filtración de glóbulos rojos
- 2. lavado/lisis de células
- 3. tratamiento con calor
- 4. concentración por ultrafiltración
- 5. desgasificación
- 6. modificación química
- 7. purificación
- 8. policoncentración de UP
- 9. desoxigenación
- 10. formulación
El material de partida preferido en el
procedimiento de la presente invención es sangre humana completa
caducada o glóbulos rojos concentrados. Además, se pueden utilizar
también sangre (sin fecha) no caducada. Preferentemente, no se
utiliza sangre completa en este procedimiento si ha estado
almacenada durante más de 2 semanas después de la fecha de
expiración indicada en la bolsa. La utilización de sangre completa
caducada en más de 2 semanas proporciona una dificultad adicional
en la extracción de hemoglobina y en la separación de los restos
celulares tales como las proteínas y contaminantes del
estroma.
Todos los procedimientos descritos en la presente
memoria son aplicables a otras sangres de mamífero con posibles
modificaciones menores dentro de la experiencia en la materia. La
mayoría de los procesos se pueden realizar a aproximadamente 2ºC
hasta aproximadamente 8ºC, con preferencia aproximadamente a
4ºC.
Durante la aspiración y filtración de los
glóbulos rojos, se extraen los glóbulos rojos (RBC) asépticamente
de las bolsas del donante sin introducir aire a la sangre y se
pasan a través de una serie de filtros para producir una suspensión
de RBC con cantidades reducidas de leucocitos y plaquetas. La
suspensión resultante se somete a continuación a lavado/lisis
celular.
La suspensión se lava en atmósfera de monóxido de
carbono con una solución de NaCl aproximadamente al 1% para
eliminar las proteínas residuales del plasma. Los RBC lavados se
tratan a continuación con agua para inyectables (WFI), para lisar
las células y la mezcla resultante se clarifica utilizando una
unidad de filtración de flujo cruzado. El producto clarificado se
trata a continuación con calor para precipitar el material
adicional del estroma que se elimina por filtración. El producto de
este procedimiento es una solución de hemoglobina exenta de estroma
(SFH) con una THb de aproximadamente 3% (p/v).
La solución de hemoglobina tratada con calor y
exenta de estroma que contiene carboxihemoglobina, se concentra y
se desgasifica para dar una solución de SHF que contiene
desoxihemoglobina. La desgasificación implica en primer lugar
saturar la solución de carboxihemoglobina con oxígeno durante
aproximadamente 16 horas para dar una solución de hemoglobina
oxigenada y aproximadamente el 7% en peso, basado en el peso total
de hemoglobina, de carboxihemoglobina. Posteriormente, el oxígeno
es impulsado con nitrógeno, argón o helio para formar una solución
que no contiene hemoglobina, es decir, hemoglobina no acomplejada
y aproximadamente el 7% en peso, basado en el peso total de
hemoglobina, de oxihemoglobina. La solución desgasificada
resultante se filtra y se transfiere a un recipiente para su
modificación química.
Después de la desgasificación, la solución de
hemoglobina exenta de estroma se peridoxila utilizando
piridoxal-5'-fosfato (P5P) en una relación molar de piridoxal-5'-fosfato a hemoglobina de aproximadamente 1:1 a 3:1. Por otra parte, la hemoglobina exenta de estroma se puede piridoxilar utilizando piridoxal-5'-fosfato de
2- Nor-2 formilo. Un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio o preferentemente borohidruro de sodio, se añade a la mezcla de piridoxilación. Los reactivos en exceso y las sales se eliminan por diálisis frente a agua exenta de pirógenos o, preferentemente, diafiltración con WFI. La hemoglobina piridoxilada se polimeriza a continuación con una solución de glutaraldehído.
piridoxal-5'-fosfato (P5P) en una relación molar de piridoxal-5'-fosfato a hemoglobina de aproximadamente 1:1 a 3:1. Por otra parte, la hemoglobina exenta de estroma se puede piridoxilar utilizando piridoxal-5'-fosfato de
2- Nor-2 formilo. Un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio o preferentemente borohidruro de sodio, se añade a la mezcla de piridoxilación. Los reactivos en exceso y las sales se eliminan por diálisis frente a agua exenta de pirógenos o, preferentemente, diafiltración con WFI. La hemoglobina piridoxilada se polimeriza a continuación con una solución de glutaraldehído.
La solución de hemoglobina piridoxilada, exenta
de estroma se polimeriza utilizando una solución acuosa de
glutaraldehído. La duración de la polimerización y la cantidad de
glutaraldehído añadido depende del volumen de solución de
hemoglobina, del rendimiento deseado de polímeros y de la
distribución deseada de peso molecular. En general, los tiempos
más prolongados de polimerización aumentan el rendimiento y la
distribución del peso molecular de los polímeros. Un rendimiento de
aproximadamente el 75% en peso de polímeros, basado en el peso
total de hemoglobina, se obtiene en aproximadamente 16 a 18 horas.
El punto final preferido de la polimerización se define como el
punto en el que la solución contiene aproximadamente el 75% en peso
de polímeros, basado en el peso de hemoglobina total, controlado
por HPLC por exclusión de tamaño. Como alternativa, el punto final
se define como el punto en el que la solución contiene
aproximadamente el 65% de polímeros, basado en el peso total de
hemoglobina, es decir, aproximadamente 2,5 horas.
La reacción de polimerización se enfría
bruscamente mediante la adición de glicina acuosa. El tampón se
debe añadir tan rápidamente como sea posible. Las reticulaciones se
estabilizan a continuación añadiendo, otra vez tan rápidamente como
se posible, una solución de borohidruro de sodio acuoso. Esta
solución polimerizada se concentra posteriormente y a continuación
se filtra por diálisis en una atmósfera de oxígeno para oxigenar
la solución. Se añade, por último, agua a la solución hasta que la
solución contiene aproximadamente el 4% en peso de hemoglobina.
La polimerización según la invención produce un
rendimiento en polímeros con un peso molecular estrecho que oscila
tal como se muestra en la Figura 3 y en el Ejemplo 1 más
adelante.
La solución de hemoglobina piridoxilada,
polimerizada, se purifica a continuación por cromatografía en
columna, filtración, p. ej.: filtración en membrana, o ambas, para
eliminar la hemoglobina residual no polimerizada (tetrámera) de la
solución. La solución de hemoglobina polimerizada purificada se
concentra a continuación hasta aproximadamente el 6% utilizando un
aparato de ultrafiltración en preparación para intercambio de
gases.
La solución concentrada se desoxigena a
continuación con nitrógeno. La desoxigenación tiene lugar a
aproximadamente 10 a 12ºC, hasta que la cantidad de oxihemoglobina
en la solución es menor de aproximadamente el 16% en peso de la
hemoglobina total.
La solución resultante de hemoglobina
desoxigenada, purificada y polimerizada se concentra a
continuación por ultrafiltración en atmósfera de nitrógeno, en un
recipiente enfriado. El pH se ajusta a aproximadamente 8,8 a 9,0, y
las cantidades de electrolitos se pueden ajustar según sea
necesario a concentraciones representativas del plasma normal.
Además, se pueden añadir opcionalmente antioxidantes convencionales
tales como glutation, ascorbato o glucosa. Después que se concentra
la solución a la concentración deseada, preferentemente alrededor
del 10% en peso de hemoglobina polimerizada, piridoxilada,
purificada, exenta de tetrámeros, exenta de estroma, se esteriliza
la solución por filtración y se transfiere mediante un aparato de
transferencia estéril en recipientes adecuados farmacéuticamente
aceptables.
Las propiedades de la solución resultante de
hemoglobina se muestran a continuación:
| Hemoglobina polimerizada | |
| Hemoglobina total (g/dl)^{1} | 9,5-12,0 |
| Metahemoglobina (% de Hb total)^{1} | <8,0 |
| Carboxihemoglobina (% de Hb total)^{1} | <5,0 |
| P_{50} (torr)^{1} | 23-32 |
| Osmolalidad (mmol/kg)^{2} | 280-360 |
| Sodio (mmol/l)^{3} | 135-155 |
| Potasio (mmol/l)^{3} | 3,5-4,5 |
| Cloruro (mmol/l)^{3} | 85-110 |
| Hierro libre (ppm)^{4} | <2,0 |
| P. molecular dist.-pico de 128 Kd (%)^{5} | 10-24 |
| P. molecular dist.-pico de 192 Kd (%)^{5} | 18-30 |
| P. molecular dist.-pico de 256 Kd (%)^{5} | 45-70 |
\newpage
| Hemoglobina polimerizada | |
| Tetrámero (64 K) (%)^{5} | <0,8 |
| Endotoxina (EU/ml)^{6} | <0,03 |
| Fosfolípidos (ng/Hb)^{7} | <50 |
| Glicolípidos (ng/Hb)^{7} | <2 |
| ^{1} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada espectrosfotométricamente. | |
| ^{2} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por osmometría. | |
| ^{3} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por electrodo de ion específico. | |
| ^{4} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por absorción atómica. | |
| ^{5} Determinado por HPLC de exclusión de tamaño. | |
| ^{6} Determinado por LAL utilizando un análisis disponible en el comercio de Associates of Cape Cod, | |
| los componentes del análisis tienen los nº de catálogos 100-5, 800-1 y 3100-5. | |
| ^{7} Determinado por HPTLC. |
Los ejemplos siguientes demuestran determinados
aspectos de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que
estos ejemplos se incluyen con fines ilustrativos únicamente y no
pretenden ser totalmente definitivos en relación con las
condiciones y el alcance de la presente invención. Todas las
temperaturas se expresan en grados Celsius, a menos que se
especifique de otra manera. Todos los porcentajes, p. ej.: de
hemoglobina total (THb), a menos que se indique de otra manera, se
expresan en peso/volumen (p/v). También se debería reconocer que
cuando se han dado las condiciones de reacción típicas (p. ej.:
temperatura, tiempos de reacción), se pueden utilizar las
condiciones que están por encima y por debajo de estos intervalos
específicos, aunque generalmente de forma menos conveniente.
A menos que se indique lo contrario, todos los
recipientes y depósitos utilizados en el proceso inventivo se
construyeron de acero inoxidable 316-L,
preferentemente de un grado farmacéutico de dicho acero inoxidable
que ha sido muy pulido y, por consiguiente, se limpia fácil y
rápidamente. Las diversas tuberías y tubos de conexión están
fabricados con el mismo acero inoxidable o de Teflon o tubería de
silicona de grado farmacéutico. Los filtros y membranas utilizados
en el proceso se pueden adquirir en Millipore Inc.,
Pall-Filtron o Cuno Inc.
La vida media del producto resultante de la
invención se determina in vivo en mamíferos, p. ej.:
humanos. Típicamente, se extrae una muestra de sangre de un
mamífero, un periodo de tiempo después que el mamífero se ha
infundido con el producto. Se determina a continuación la cantidad
de producto centrifugando la muestra de sangre, expresando la
porción de plasma, determinando espectrofotométricamente las
concentraciones de hemoglobina en el plasma y a continuación
correlacionando la cantidad de producto que permanece en el
mamífero con la vida media del producto.
La cromatografía por exclusión de tamaño, HPLC,
según la invención se realiza como sigue:
Se diluye la muestra con tampón de fosfato de
potasio 0,2 M, pH 6,9 a 0,2 g/dl, se filtra a través de un filtro
de 0,2 \mu y se inyecta en un sistema HPLC que consta de los
siguientes componentes (en orden del flujo del sistema):
| 1. Bomba Pharmacia modelo 2248 | ||
| - la fase móvil es fosfato de potasio 0,2 M, pH 6,9 | ||
| - el caudal es 1,0 ml/minuto | ||
| 2. Tubería PEEK o de titanio de 45 cm, 0,010 pulg. I.D. | ||
| 3. Inyector Rheodyne modelo 7725i con un bucle para muestras PEK de 200 \mul | ||
| 4. Tubería PEEK o de titanio de 18 cm, 0,010 pulg. I.D. | ||
| 5. Filtro Upchurch modelo A431 de 0,5 \mu | ||
| 6. Tubería PEEK o de titanio de 9 cm, 0,010 pulg. I.D. |
\newpage
| 7. Precolumna Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 \times 7,8 mm | ||
| 8. Tubería PEEK o de titanio de 24 cm, 0,010 pulg. I.D. | ||
| 9. Columna analítica Phenomenex Biosep SEC S-3000 600 \times 7,8 mm | ||
| 10. Tubería PEEK o de titanio de 23 cm, 0,010 pulg. I.D. | ||
| 11. Detector Pharmacia Uvicord SD UV | ||
| - longitud de onda: | 280 nm | |
| - célula de flujo: | vol.: 8 \mul., longitud de paso: 2,5 mm | |
| - intervalo: | 2 AUFS | |
| - constante de tiempo: | 10 segundos |
La absorbancia del pico a 280 nm es registrada
por un integrador LKB 2221, que integra las áreas de los picos
individuales y calcula el área de la Hemoglobina total de cada
especie polimérica.
Una comprensión adicional de la invención se
puede obtener a partir de los ejemplos siguientes no
limitativos.
En relación ahora con la Fig. 1, las bolsas de
donante 20 de sangre caducada (sangre total o glóbulos
rojos concentrados) se colocan en un aparato de aspiración
aséptica 22 adecuado. Como ejemplo de aparato de aspiración
adecuado existe un sistema con dos posiciones de aspiración. Una
vez se coloca una bolsa de donante en la posición de aspiración,
una aguja en el aparato de aspiración pincha la bolsa del donante,
introduce aproximadamente 150 ml de una solución de cloruro de sodio
acuoso al 1% (p/v) y aspira la sangre caducada de la bolsa del
donante a presión reducida o al vacío. La sangre aspirada se pasa a
través de un filtro 24 de 100 \mu de espesor y
posteriormente a través de filtros en serie 26 de 5 \mu de
espesor. A medida que la sangre pasa a través de los filtros de
5\mu de espesor, se eliminan los leucocitos de la sangre.
Típicamente, se aspiran aproximadamente 170 unidades de sangre
total caducada, se filtran y se transfieren posteriormente al
Depósito 1, tal como se muestra en la Fig. 1. Se lavan a
continuación los filtros con aproximadamente 75 litros de solución
acuosa de cloruro de sodio al 1% (p/v).
Antes de la introducción de la sangre en el
Depósito 1, se carga el Depósito 1 con aproximadamente 70 l de una
solución de cloruro de sodio al 1%. Después que se han aspirado,
filtrado y transferido todas las 170 unidades de sangre completa
caducada y se han enjuagado los filtros, el depósito contiene
aproximadamente 250 litros de una solución de hemoglobina total al
4%. Durante las etapas de aspiración y filtración, el depósito se
mantiene a presión reducida, es decir, un vacío de 20 a 28 '' de Hg.
Una vez se ha transferido toda la sangre caducada al Depósito 1,
se desconecta el vacío y se introduce monóxido de carbono en el
depósito con el fin de que el depósito contenga una atmósfera de
monóxido de carbono.
El Depósito 1 se acopla a un filtro de flujo
tangencial 28 de 0,65 \mu tal como se muestra en la Fig.
1. La carga inicial de 250 litros de solución de hemoglobina total
al 4% se concentra a aproximadamente 125 l de una solución de
hemoglobina total al 8% mediante microfiltracción a través del
filtro de flujo tangencial. El pH de la solución de hemoglobina en
este momento es de aproximadamente 6 a 6,5. Después de concentrar
la hemoglobina total al 8%, se lava la solución añadiendo una
solución de cloruro de sodio al 1% (p/v), filtrando por diálisis y
eliminando el filtrado a la misma velocidad que se añade el
cloruro de sodio. Los 125 l de solución de hemoglobina se lavan
típicamente con aproximadamente 8 volúmenes de solución de cloruro
de sodio al 1% (aproximadamente 1.000 l). Después de lavar, se
concentra la solución hasta aproximadamente 70 l, es decir,
hemoglobina total al 14% aproximadamente y se añade "agua para
inyectables" (WFI) para llevar el volumen de la solución hasta
aproximadamente 180 l. Con la adición del WFI, las células se
hinchan y se rompen liberando la hemoglobina en la solución. La
concentración de la solución de hemoglobina resultante es
aproximadamente el 5% de la hemoglobina total (THb).
La solución resultante se clarifica mientras
permanece en el Depósito 1. La solución se concentra en primer
lugar hasta aproximadamente 50 l y el filtrado se transfiere al
Depósito 2. A medida que se bombea la solución a través del filtro,
los contaminantes de estroma de glóbulos rojos y el material de la
pared celular es retenido y eliminado por el filtro. Los 50 l
restantes de solución en el Depósito 1 se lavan (se filtran por
diálisis) con aproximadamente 2,5 volúmenes de WFI. Estos 2,5
volúmenes de lavado se añaden al Depósito 2. El material restante en
el Depósito 1 se concentra a continuación hasta aproximadamente 20
l y se añade el filtrado al Depósito 2. El volumen resultante en
el Depósito 2 es aproximadamente 280 l de una solución de
hemoglobina total al 3,3%.
La solución resultante de hemoglobina exenta de
estroma se trata a continuación con calor en el Depósito 2 a una
temperatura de aproximadamente 60 a 62ºC durante un periodo de
aproximadamente 10 horas. Durante este periodo, se agita la
solución de forma moderada. A medida que se calienta la solución y
sobrepasa una temperatura de aproximadamente 55ºC, se forma un
precipitado.
La solución resultante de hemoglobina tratada con
calor, de THb al 33% (p/v), exenta de estroma se filtra a
continuación a través de un filtro 30 de 0,2 \mu, después
por un filtro 32 de 0,1 \mu y se transfiere al Depósito 3.
La solución de hemoglobina filtrada se concentra a continuación
hasta aproximadamente THb al 18%, posteriormente se lava y se
filtra por diálisis con 4 volúmenes de WFI (180 l). La
concentración y la filtración por diálisis se realizan utilizando un
ultrafiltro 34 para peso molecular de 10 kilodalton (kd).
El desagüe 35 asociado al ultrafiltro 34 recoge el
filtrado. En este momento, los 45 l de solución de hemoglobina total
al 18% contienen menos de 50 ng de fosfolípido por gramo de
hemoglobina, menos de 2 ng de glicolípido por gramo de hemoglobina,
menos del 1% de metahemoglobina, menos de aproximadamente 0,03
unidades de endotoxina por mililitro a un pH de aproximadamente 6 a
6,5. Esta hemoglobina en solución es carboxihemoglobina.
La solución de carboxihemoglobina resultante se
transfiere a continuación al Depósito 4, en el que se oxigena en
primer lugar la carboxihemoglobina y a continuación se desoxigena.
El Depósito 4 está equipado con un anillo barboteador de gas
acoplado a las líneas de gases de oxígeno y nitrógeno, con una
alimentación desde el fondo del depósito hasta un aparato de
pulverización dosificada colocado en la parte superior del
Depósito 4 y con un recogedor de espuma de rebose conectado al
bidón de espuma 1, de modo que la espuma generada en el
Depósito 4 se alimenta al bidón de espuma 36, en el que la
espuma condensa dentro del líquido y se vuelve a alimentar al
Depósito 4. El Depósito 4 incluye además una serie de anillos Pall
que rellenan aproximadamente un tercio del volumen del depósito. El
bidón de espuma 36 comprende un venteo de gas para la
eliminación del gas. La solución en el Depósito 4 es una solución
de hemoglobina total al 13%.
Durante una primera etapa de oxigenación, se
burbujea oxígeno a través de la solución en una cantidad
suficiente para tener una dispersión uniforme de gas en el
recipiente. El depósito, de 200 l de volumen, se barbotea con gas a
un caudal de aproximadamente 25 l/min. La oxigenación de la
carboxihemoglobina, se realiza durante un periodo de
aproximadamente 16 horas, de modo que la solución resultante
contiene menos del 5% de carboxihemoglibina basada en el peso de
hemoglobina total. La oxigenación se realiza a una temperatura de
aproximadamente 10ºC. La espuma generada en el Depósito 4 se recoge
en el bidón de espuma 36 y después de sedimentar, se vuelve
a transferir la solución resultante al Depósito 4.
Después de la oxigenación, se barbotea la
solución a un caudal de nitrógeno similar durante aproximadamente
6 horas o hasta menos del 10% de oxihemoglobina, basada en el peso
de hemoglobina total que permanece en solución. El barboteo de
nitrógeno se realiza a una temperatura de aproximadamente 10ºC y a
un pH de aproximadamente 6 a 6,5. Como alternativa, la
carboxihemoglobina, se podría transformar en desoxihemoglobina
utilizando un intercambiador de membrana. Obsérvese que no existe
prácticamente desnaturalización de hemoglobina como sería de
esperar normalmente en la etapa de formación de espuma. La solución
desoxigenada resultante se prepara ahora para la modificación
química.
Con relación ahora a la Fig. 2, la solución de
desoxihemoglobina se transfiere al Depósito 5 para la modificación
química. A continuación se añade al Depósito 5 que contiene la
solución de desoxihemoglobina a aproximadamente 4ºC, una solución
acuosa de piridoxil-5-fosfato (P5P)
(93,75 g/l) en una relación molar de P5P a hemoglobina de 1:1 a
3:1. Es preferible una relación molar de P5P a hemoglobina de 2:1.
La piridoxilación se realiza a una temperatura de aproximadamente
4ºC. La solución de P5P se añade típicamente durante 1 minuto
aproximadamente y se mezcla durante 15 minutos aproximadamente,
después de lo cual se añade una solución de borohidruro de
sodio/hidróxido de sodio a la solución de hemoglobina a una
relación molar de borohidruro de sodio a hemoglobina de
aproximadamente 20:1. Una solución acuosa adecuada de borohidruro
de sodio/hidróxido de sodio contiene 0,8 g de hidróxido de sodio
por cada 2 litros y 90,8 g de borohidruro de sodio por cada 2
litros. La solución de borohidruro se añade tan rápidamente como sea
posible durante un periodo de aproximadamente 1 minuto y a
continuación se agita durante una hora. Los 50 l de solución
resultante de hemoglobina piridoxilada se filtran por diálisis
posteriormente utilizando el ultrafiltro 38 de 10 K Dalton
para eliminar el exceso de reaccionantes con 4 volúmenes de WFI.
El desagüe 40 asociado al ultrafiltro 38 recoge el
filtrado del filtro 38.
Después de la filtración por diálisis con 4
volúmenes, es decir, 200 l de WFI, se polimeriza la hemoglobina.
Al Depósito 5 que contiene la hemoglobina piridoxilada se añade
suficiente WFI para preparar una solución de hemoglobina total al
4,5% (aproximadamente 175 l de solución de hemoglobina). Se añade
una solución de glutaraldehído a la solución de hemoglobina
piridoxilada a una relación molar de glutaraldehído a hemoglobina
de aproximadamente 24:1. La solución de glutaraldehído se añade a
la solución de hemoglobina, típicamente, durante un periodo de
aproximadamente 2,5 horas mediante una bomba dosificadora. Se deja
que proceda la reacción de polimerización durante aproximadamente
18 horas. La distribución deseada del peso molecular es
aproximadamente 75% de polímero y 25% de tetrámero. Los polímeros
deseados tienen pesos moleculares inferiores a aproximadamente
600.000 con una fracción predominante de pesos moleculares que se
sitúa en el intervalo de 100.000 a 350.000.
Cuando la reacción de polimerización alcanza la
distribución de pesos moleculares deseada (después de
aproximadamente 18 horas), se añade (como enfriamiento brusco)
glicina acuosa (aproximadamente 166 g/l) a la solución de
hemoglobina a una relación molar de glicina a hemoglobina de 140:1.
Véase la Fig. 3 que es un gráfico de HPLC del producto
polimerizado resultante de hemoglobina, enfriado bruscamente con
glicina. La solución resultante se mezcla a continuación durante
aproximadamente 10 minutos, después de los cuales se añade a la
solución de hemoglobina una solución de borohidruro de
sodio/hidróxido de sodio (con la concentración indicada
anteriormente) a una relación molar de borohidruro de sodio a
hemoglobina de 28:1. Esta mezcla resultante se agita durante
aproximadamente 1 hora. La solución se concentra a continuación
hasta aproximadamente 50 l (ultrafiltro 38) y se lava con 4
volúmenes (200 l) de WFI. Se añade a la solución concentrada una
alícuota adicional de borohidruro de sodio en la misma relación
molar indicada anteriormente y se mezcla de nuevo durante 1 hora.
La solución resultante se lava con 4 volúmenes de WFI (200 l)
produciendo hemoglobina polimerizada, piridoxilada, exenta de
estroma que se ha tratado con calor.
Se oxigena la solución resultante dejando reposar
la solución bajo una atmósfera de oxígeno y se transfiere
posteriormente a un sistema de purificación 42. La
purificación se puede conseguir por cromatografía en columna,
filtración, preferentemente filtración en membrana (filtración por
diálisis) o una combinación de filtración y cromatografía en
columna.
En una forma de realización, la solución se
transfiere al recipiente de alimentación a la cromatografía,
Depósito 6, tal como se muestra en la Figura 5. En esta forma de
realización, la solución resultante de oxihemoglobina se diluye a
continuación hasta aproximadamente 200 l (hemoglobina total al 4%)
en el Depósito 6 y se ajusta la concentración de cloruro a 22 mM
con solución de cloruro de sodio. No es necesario ningún ajuste de
concentración de sodio.
A continuación se cromatografían cinco alícuotas
de 40 l de solución de hemoglobina resultante utilizando la Columna
44. La Columna 44 contiene un gel de afinidad que es
un gel de agarosa modificado con un colorante amarillo (disponible
en el comercio en Affinity Chromatography, Ltd., como Mimetic
Yellow nº 1) con mayor afinidad para el polímero que para el
tetrámero.
La cromatografía se realiza de la forma
siguiente. Se cargan 40 l de solución de hemoglobina oxigenada,
polimerizada, piridoxilada, exenta de estroma en la Columna
44. Se lava la columna con 15 volúmenes de columna
(aproximadamente 750 l) de tampón acuoso de NaCl 30 mM para
eliminar el tetrámero. Se lava la columna a continuación con
aproximadamente 250 l de tampón de cloruro de sodio 300 mM para
lavar el polímero. Se recogen las fracciones de polímero en el
Depósito 7. Las fracciones no deseadas se envían al desagüe
46. Después se elimina cada alícuota, se regenera la
columna con solución HCl 15 mM (150 l), se reequilibra con NaCl
acuoso 30 mM (250 l) y se carga a la columna otra alícuota de la
solución de alimentación (40 l). Se lava de nuevo la columna con
NaCl 30 mM, seguido de NaCl 300 mM. Se añaden alícuotas de 40 l de
solución de hemoglobina a la columna y se cromatografía hasta que
el Depósito 6 está vacío.
Se ultrafiltran (concentran) las fracciones
recogidas en el Depósito 7 utilizando el filtro 48 asociado
al desagüe 50, hasta un volumen de aproximadamente 40 l (6%
de hemoglobina total). Se transfiere a continuación la solución
concentrada de hemoglobina a un Depósito 8 de intercambio de gas
para desoxigenación.
Como alternativa, se transfiere la solución a un
recipiente de reciclo de la filtración 10, tal como se muestra en
la Fig. 6. Se diluye a continuación la hemoglobina a
aproximadamente THb al 4% en el Depósito 10. La solución de THb al
4% se filtra por diálisis a continuación utilizando NaCl 10 mM y
un filtro 52 para peso molecular 300.000 disponible en el
comercio en Pall-Filtron. Se continúa la filtración
hasta que el 97% del material de hemoglobina pasa a través del
filtro y dentro del Depósito 11. (En el Depósito 10 se retiene
aproximadamente el 3% del material, es decir, los polímeros de
elevado peso molecular). Se determina espectrofotométricamente la
cantidad de hemoglobina utilizando un cooxímetro.
El material resultante en el Depósito 11 es
aproximadamente el 2 al 4% de THb y contiene aproximadamente el 7
al 10% de tetrámero basado en la THb. El 2 al 4% de THb se filtra
por diálisis a continuación utilizando NaCl 10 mM y un filtro
54 para peso molecular de 10.000, disponible en el comercio
en Pall-Filtron asociado al desagüe o a la trampa
56. Se continúa la filtración hasta que la concentración de
tetrámero, determinada por cromatografía por exclusión de tamaño
utilizando una columna BioSep SEC-S3000 de 600
\times 7,8 mm, es menor del 0,8% de la masa de hemoglobina en
peso. La solución de hemoglobina purificada resultante permanece
inicialmente en el Depósito 11 y se transfiere posteriormente al
Depósito 8 de intercambio de gas para desoxigenación.
El Depósito 8 de intercambio de gas puede ser el
mismo depósito que el Depósito 4 o, preferentemente, un depósito
diferente. El Depósito 8 de intercambio de gas está equipado
esencialmente del mismo modo que el Depósito 4 de intercambio de gas
de la Fig. 1 y está conectado al bidón de espuma 58 de una
manera idéntica a la del Depósito 4 y el bidón de espuma
36. La desoxigenación se realiza aproximadamente en 2,5
horas con barboteo de nitrógeno a aproximadamente 10ºC y a un pH de
solución de aproximadamente 7,5. El barboteo de nitrógeno se
continúa hasta que aproximadamente menos del 16% de oxihemoglobina,
basado en el peso de hemoglobina total, permanece en solución. La
solución de desoxihemoglobina resultante se transfiere
posteriormente al Depósito 9 para su formulación.
En el Depósito 9 de formulación, se concentra en
primer lugar la solución hasta aproximadamente el 7% de
hemoglobina total y se ajusta el pH hasta aproximadamente 8,8 a 9,0
a 4ºC. El pH se ajusta utilizando NaOH 0,2 M. Se añaden a
continuación soluciones de electrolito a la solución de hemoglobina
a pH 8,8 a 9,0. Se añaden glucosa y glicina para conseguir
concentraciones finales de aproximadamente 5 g/l y 1,75 g/l
respectivamente. Se añade a la solución cloruro de potasio para
obtener una concentración en potasio de aproximadamente 3,5 a 4,5
mM. Se añade a continuación cloruro de sodio 3 M para obtener una
concentración en cloruro de 85 a 110 mM. Posteriormente se añade
lactato de sodio para obtener una concentración de ión sodio de
135 a 155 mM. Por último, se añade una solución de ácido ascórbico
0,45 molar para aumentar la concentración de ácido ascórbico hasta
aproximadamente 1.000 mg/l. El ácido ascórbico se añade como
conservante/antioxidante para el almacenamiento. La solución de
hemoglobina resultante tiene una osmolalidad final de
aproximadamente 280 a 360 mmol por kg.
La solución de hemoglobina formulada se concentra
a continuación a aproximadamente el 10% de hemoglobina total
utilizando el filtro 60 asociado a la trampa 62 y la
solución de hemoglobina al 10% se esteriliza a continuación por
filtración mediante el filtro 64 y se llena asépticamente en
bolsas preesterilizadas.
En la Tabla 1 se muestran las propiedades del
producto preparado en este ejemplo, Lote A. Además, en la Tabla 1
se muestran las propiedades de los Lotes B y C, preparados ambos
según el procedimiento indicado anteriormente para el Lote A.
| Lote | |||
| Prueba | A | B | C |
| Hemoglobina, g/dl | 10,4 | 10,2 | 10,2 |
| Metahemogloblina, % | 4,6 | 6,0 | 5,6 |
| Carboxihemoglobina, % | 0,2 | 1,4 | 1,5 |
| P_{50} (Torr, pH 7,35-7,45, | 28,5 | 26,8 | 27,0 |
| pCO_{2} 35-40 torr) | |||
| Osmolalidad, mmol/l | 318 | 320 | 317 |
| Sodio, mmol/l | 142 | 144 | 142 |
| Potasio, mmol/l | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Cloruro, mmol/l | 98 | 99 | 94 |
| Hierro libre, ppm | 0,7 | 1,2 | 1,4 |
| Distribución del peso | 128:16 | 128:11 | 128:16 |
| molecular, % a cada PM | 192:26 | 192:23 | 192:26 |
| (Kd) | 256^{8}:58 | 256^{8}:66 | 256^{8}:58 |
| Tetrámero, % | 0,4 | 0,3 | 0,4 |
| Endotoxina, EU/ml | <0,03 | <0,03 | <0,03 |
| ^{8} El material comprende también una pequeña cantidad de material de elvado peso molecular. |
En los puntos anteriores se ha proporcionado una
descripción detallada de formas de realización preferidas de la
presente invención con fines ilustrativos y no limitativos.
Claims (13)
1. Solución acuosa de hemoglobina piridoxilada,
polimerizada con glutaraldehído, con un contenido en tetrámeros no
superior al 0,8% en peso, basado en el peso de hemoglobina total en
la solución y con una distribución de peso molecular, basada en el
peso de hemoglobina total en la solución, de
- \bullet
- 10 al 24% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 128 kd,
- \bullet
- 18 al 30% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 192 kd, y
- \bullet
- 45 al 70% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 256 kd, determinado por HPLC por exclusión de tamaño.
2. Solución de hemoglobina según la
reivindicación 1, en la que la solución tiene una vida media en un
paciente humano de aproximadamente 15 horas.
3. Solución de hemoglobina según la
reivindicación 1, en la que la solución tiene una vida media en un
paciente humano de aproximadamente 24 horas.
4. Solución de hemoglobina según la
reivindicación 1, en la que la solución se puede infundir en una
cantidad de hasta aproximadamente 5 litros.
5. Solución de hemoglobina según la
reivindicación 1, en la que la solución es capaz de ser infundida
en un paciente humano en una cantidad de hasta 3 litros sin
producir una disminución en el funcionamiento del riñón, y la
solución tiene una vida media en un paciente humano de
aproximadamente 24 horas.
6. Solución según la reivindicación 1 que
comprende:
(a) una hemoglobina total comprendida entre 9,5 y
12,0 g/dl;
(b) una metahemoglobina total inferior al 8% de
la hemoglobina total;
(c) una carboxihemoglobina total inferior al 5%
de la hemoglobina total;
(d) una disociación de
oxígeno-hemoglobina comprendida entre 23 y 32
torr;
(e) una osmolalidad comprendida entre 280 y 360
mol/kg;
(f) una concentración de sodio comprendida entre
135 y 155 mmol/l;
(g) una concentración de potasio comprendida
entre 3,5 y 4,5 mmol/l;
(h) una concentración de cloruro comprendida
entre 85 y 110 mmol/kg;
(i) un hierro libre total inferior a 2,0 ppm;
(j) endotoxina inferior a 0,03 EU/ml;
(l) fosfolípidos inferior a 50 ng/Hb;
(m) glicolípidos inferior a 2 ng/Hb; y
(n) un contenido en tetrámero de 0,3 a 0,4%.
7. Solución según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que la preparación de hemoglobina
comprende aproximadamente el 16% de polímero de hemoglobina con un
pico de peso molecular de aproximadamente 128 kd, aproximadamente
el 26% de polímero de hemoglobina con un pico de peso molecular de
aproximadamente 192 kd y aproximadamente el 58% de polímero de
hemoglobina con un pico de peso molecular de aproximadamente 256
kd, determinados mediante HPLC por exclusión de tamaño.
8. Procedimiento para preparar una solución de
hemoglobina piridoxilada, polimerizada con glutaraldehído según la
reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- eliminación de los leucocitos de la sangre por filtración a través de un filtro con un tamaño de poro medio mínimo suficiente para impedir el paso de leucocitos;
- (b)
- lavado del filtrado en una atmósfera de dióxido de carbono con solución de NaCl al 1% para eliminar las proteínas residuales del plasma;
- (c)
- lisis de glóbulos rojos diluyendo el filtrado lavado (b) con agua;
- (d)
- filtración de la suspensión obtenida para producir una solución de hemoglobina exenta de estroma y de material de la pared celular;
- (e)
- calentamiento de la solución de hemoglobina de (d) durante aproximadamente 10 horas hasta una temperatura aproximada de 60 a 62ºC y filtración de la solución de hemoglobina tratada con calor para eliminar el estroma adicional y los contaminantes con estroma precipitados en la etapa de calentamiento;
- (f)
- concentración y filtración por diálisis del filtrado, de la solución de hemoglobina tratada con calor para dar una solución de carboxihemoglobina;
- (g)
- desgasificación de la solución barboteando oxígeno y a continuación nitrógeno a través de la solución de hemoglobina a una temperatura de aproximadamente 10ºC para producir una espuma;
- (h)
- tratamiento de la solución desgasificada de (g) con 1 a 3 moles de piridoxal-5'-fosfato por mol de hemoglobina en presencia de un borohidruro y filtrado a continuación para dar una solución de hemoglobina piridoxilada;
- (i)
- tratamiento de la solución filtrada de la hemoglobina piridoxilada de (h) con una solución acuosa de glutaraldehído para dar la distribución molecular deseada de polímeros de hemoglobina y aproximadamente el 75% en peso de polímeros, basado en el peso total de hemoglobina;
- (k)
- adición rápida de una solución acuosa de glicina para enfriar bruscamente (detener) la reacción de polimerización y a continuación adición rápida de una solución acuosa de borohidruro de sodio para estabilizar las reticulaciones;
- (l)
- concentración de la solución obtenida en (k) y a continuación filtración por diálisis en atmósfera de oxígeno;
- (m)
- purificación de la solución de oxígeno obtenida en (l) para eliminar el tetrámero y desoxigenar la solución hasta que la cantidad de oxihemoglobina en la solución sea menor de aproximadamente el 16% en peso de la hemoglobina total; y
- (n)
- ajuste del pH y de las concentraciones de la solución obtenida en (m) para representar la del plasma normal.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que en la etapa (h) se piridoxila la solución desgasificada
poniendo en contacto la solución desgasificada con
piridoxal-5'-fosfato a una relación
molecular de piridoxal-5'-fosfato a
hemoglobina de 2:1.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el piridoxal-5'-fosfato se
pone en contacto con hemoglobina y borohidruro durante
aproximadamente una hora.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que en la etapa (i) se polimeriza la hemoglobina en solución
piridoxilada poniendo en contacto la solución piridoxilada con
glutaraldehído a una relación molar de glutaraldehído a hemoglobina
de aproximadamente 24:1.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que en la etapa (i) se pone en contacto la solución
piridoxilada con glutaraldehído durante aproximadamente 18
horas.
13. Solución acuosa de hemoglobina según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como producto
farmacéutico.
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