NO324121B1 - Vandig losning av pyridoksylert, polymerisert hemoglobin og fremgangsmate for fremstilling derav. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en vandig løsning av pyridoksylert, polymerisert hemoglobin og fremgangsmåte for fremstilling derav. Den angår en acellulær rød blodlegeme-erstatning som omfatter en i hovedsak tetramer-fri, tverrbundet, polymerisert, pyridoksylert hemoglobinløsning som er fri for stromale forurensninger.

Blodbanker har i årevis sørget for helblod som erstatning under opera-sjoner, på grunn av trauma eller for andre situasjoner. Helblod fra humane blod-givere er imidlertid ikke egnet for mange forskjellige anvendelser. Spesielt er anvendelsen av helblod problematisk på grunn av kravene til donortyper, stabilitet og problemer med holdbarhet, samt toksisitet forårsaket av vimser og andre forurensninger. Disse problemer er spesielt relevante i nødsituasjoner, så som ved anvendelse av blod i militære sammenhenger. Det er derfor brukt mye krefter på å utvikle erstatninger for helblod oppnådd fra humane donorer. Denne utvikling har resultert i forskjellige modifikasjoner av blod fra humane eller andre kilder i form av pattedyr. Stromaf ritt hemoglobin er kjent innenfor fagområdet for å ha kapasitet for oksygentransport og reversibel oksygenbinding (eller ligandbinding). Ettersom toksisitetsproblemer har utelukket anvendelse som bloderstatning, har det for stromaf ritt hemoglobin vært nødvendig med ytterligere modifikasjoner for å tilveiebringe et ikke-toksisk, anvendbart farmasøytisk produkt.

Disse modifikasjoner inkluderer (1) å gjøre hemoglobin fritt eller i hovedsak fritt for stroma eller stromale forurensninger; (2) pyridoksylering; (3) polymerisasjon eller tverrbinding; (4) fjerning av tetramer, og (5) modifisering med karbonmonoksyd eller andre ligander.

Hemoglobinløsninger fremstilt ved disse teknikker har imidlertid, selv om de er i stand til å bære tilstrekkelige mengder oksygen for å underholde liv, hatt mange uheldige bivirkninger og egenskaper. Én problematisk hovedvirkning er f.eks. minskning i nyreytelse. Disse endringer ble antatt å komme av nærværet av uønskede forurensninger så som bakteriell endotoksin eller fragmenter av røde cellemembraner (stroma). Selv om forurensninger så som disse kan gi renale endringer, gir hemoglobinløsninger som i hovedsak er fri for de ovenfor angitte forurensninger likevel betydelig nyre-dysfunksjon. Årsaken til nyre-dysfunsjonen er blitt tilskrevet fysiologisk uakseptable mengder av ikke-polymerisert hemoglobintetramer. Andre uønskede bivirkninger av infusjon av tetramert hemoglobin er vaskulær constrictio, hemoglobinuria, nedgang i hjertefrekvensen, forhøyelse av det midlere arterielle blodtrykk og ekstravasalisering av infusat spesielt inn i peritonealhulrommet.

I praksis har det med de kjente hemoglobin-avledede bloderstatninger ikke lykkes fullstendig å unngå toksisitetsproblemer. Disse produkter har også uaksep-tabel lav halveringstid etter administrering til menneskelige pasienter. Slike halveringstider krever erstatning av blodvolum gjentatte ganger over korte tids-perioder. Det er derfor et betydelig behov for hemoglobinprodukter som er ikke-toksiske for pasienter og som har betydelige halveringstider etter administrering. Disse produkter må selvsagt være i stand til reversibelt å transportere oksygen til vev på en måte som tilsvarer den som oppnås ved hjelp av helblod.

I et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en vandig løsning av pyridoksylert, polymerisert hemoglobin som ikke inneholder mer enn omtrent 1% av fysiologisk akseptable mengder av hemoglobintetramer,

kjennetegnet ved at den omfatter:

10-24 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 128 kDa,

18-30 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 192 kDa,

45-70 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 256 kDa, som bestemt ved størrelseseksklusjons-HPLC.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer hemoglobinløsninger som ikke er toksiske for mennesker og som har betydelige halveringstider på minst 15 timer ved administrering til mennesker. Hemoglobinløsningene ifølge oppfinnelsen er stromafrie, pyridoksylerte og polymeriserte, og er fri for forurensninger i form av virus og andre toksiske forbindelser. Videre er disse løsninger stort sett fri for leukocytter (hvite blodlegemer) og blodplater.

I et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av løsningen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at den omfatter: (a) føring av utdatert blod eller ikke-utdatert blod gjennom en egnet

aspirasjonsinnretning ved redusert trykk for å fremstille aspirert blod;

(b) fjerning av leukocytter fra det aspirerte blod ved filtrering av en blanding som inneholder røde blodlegemer gjennom en serie filtere med en

minimummidlere porestørrelse som er tilstrekkelig til å forhindre gjennom-gang av leukocytter; (c) tilsetning av karbonmonoksyd til produktet fra (b) for å fremstille en hemo-globinløsning med en pH-verdi på under 7; (d) vasking av løsningen fra (c) med en 1% natriumkloridløsning, for å få en vasket løsning; (e) fortynning av den vaskede løsning fra (d) med vann for å danne en løsning av lysede celler; (f) filtrering av løsningen av lysede celler gjennom et filter for å fremstille en hemoglobinløsning som er fri for stromafomrensninger og celleveggma-teriale; (g) oppvarming og filtrering av hemoglobinløsningen fra (f) til en temperatur på ca. 60-62°C i ca.10 timer for å få en varmebehandlet, stromaf ri hemoglobin-løsning; (h) konsentrering og diafiltrering av den varmebehandlede stromafrie hemo-globinløsning for å for en karboksyhemoglobinløsning; (i) avgassing av karboksyhemoglobinløsningen ved å dusje oksygen og så nitrogen gjennom den varmebehandlede løsning ved en temperatur på ca. 10°C for å få et skum og slik at det oppnås en avgasset, varmebehandlet hemoglobinløsning; (j) eventuell pyridoksylering av den avgassede løsning under anvendelse av pyridoksal-5"-fosfat i et molforhold pyridoksal-5"-fosfat til hemoglobin på ca. 1:1 til 3:1 for å få en løsning av pyridoksylert hemoglobin; (k) polymerisering av løsningen av fra (j) under anvendelse av en vandig glutaraldehydløsning for å fremstille en løsning av polymerisert hemoglobin med en vektfordeling på ca. 65-75% polymer og 25-35% tetramer; (k1) stopping (quenching) av polymerisasjonen i (k); (k2) tilsetting av et stabiliserende middel til blandingen i (k1); (I) oksygenering og fortynning av den polymeriserte løsning inntil løsningen inneholder ca. 4 vekt% hemoglobin; (m) rensing av løsningen fra (I) for å fjerne tetramert hemoglobin og oppsamling av renset polymerisert hemoglobin, idet løsningen inneholder mindre enn 0,8% tetramer, basert på den totale vekt av hemoglobin;

(n) deoksygenering av det rensede polymeriserte hemoglobin med nitrogen; (o) justering av pH-verdien og elektrolyttnivået i løsningen av renset

polymerisert hemoglobin til ca. 8,8-9,0;

(p) konsentrering og sterilisering av den pH-justerte løsning fra (o).

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåter for fremstilling av de oppfunnede hemoglobinløsninger. Fremgangsmåtene inkluderer fjerning av leukocytter og blodplater fra blod; vasking og lysing av de røde blodlegemer; fjerning av stromale forurensninger og stroma ved filtrering og varmebehandling; fremstilling av deoksyformen av hemoglobinet; pyridoksylering og polymerisasjon; ytterliger rensing og konsentrasjon, og deoksygenering. Det resulterende hemoglobinprodukt kan så formuleres for å tilveiebringe et hemoglobinprodukt som har nivåer av forskjellige elektrolytter innenfor normale fysiologiske områder.

Det beskrives også en vandig formulering av pyridoksylert, polymerisert hemoglobin, hvor hemoglobinet er et glutaraldehyd-polymerisert hemoglobin som inneholder tetramert materiale og som har molekylvektprofilen som vist på fig. 3. Denne formulering kan anvendes for å fremstille et acellulært rød blodlegeme-substitutt. I dette aspekt renses formuleringen først for å fjerne tetramer og kombineres så med passende mengder elektrolytter for å produsere en fysiologisk akseptabel, acellulær, rød blodlegeme-erstatning, som deretter kan anvendes for å behandle en menneskelig pasient hvor det er nødvendig med en infusjon av en oksygenbærer.

Fig. 1 viser skjematisk den del av prosessen og utstyret som anvendes for å gi en deoksygenert hemoglobinløsning klargjort for pyridoksylering og polymerisasjon. Fig. 2 viser skjematisk den del av prosessen og apparatet som begynner med pyridoksylering og polymerisasjon og som resulterer i et deoksygenert, renset, pyridoksylert, polymerisert hemoglobinprodukt, og den del av prosessen og apparatet som anvendes for å formulere det endelige hemoglobinprodukt som har fysiologiske nivåer av elektrolytter. Fig. 3 viser en HPLC-opptegnelse av polymerisert materiale etter glycin-behandling og før rensing. Polymerisert produkt indikeres ved topper ved reten-sjonstider (RT) 15,57,16,08, 17,00 og 18,19. Tetramert materiale indikeres ved topper ved RT 19,88 og 20,51. Polymer er 76,2% av dette materiale. Fig. 4 viser en HPLC-opptegnelse av hemoglobinproduktet ifølge oppfin-nelsen. Polymerisert hemoglobin indikeres ved toppene ved RT 15,7,16,33,17,32 og 18,56. Tetramer indikeres ved toppene ved RT 21,18. Fig. 5 viser skjematisk en renseprosess ved hjelp av kolonnekromatografi, og som anvendes i oppfinnelsen. Fig. 6 viser skjematisk en membranfiltreringsrenseprosess som anvendes i oppfinnelsen.

Det beskrives en acellulær rød blodlegeme-erstatning omfattende et i hovedsak tetramerfritt, tverrbundet, polymerisert, pyridoksylert hemoglobin som i hovedsak er fritt for stroma, stromale forurensninger og andre forurensninger.

Slik den er anvendt her, betyr betegnelsen "tverrbundet" den kjemiske anbringelse av molekylære "broer" på eller i et molekyl eller mellom molekyler med det formål å endre formen, størrelsen, funksjonen og de fysikalske karakteristikker for molekylet. Tverrbundne molekyler kan være polymerisert eller ikke-polymerisert, dvs. at tverrbundne molekyler kan være tetramere.

Som anvendt her, angir betegnelsen "tetramer" hemoglobinmolekyler med en molekylvekt på ca. 64Kd, dvs. at betegnelsen angir både naturlige og intra-molekulært tverrbundne hemoglobinmolekyler.

Slik den er anvendt her, angir betegnelsen "i hovedsak tetramerfri" renhets-nivået når det gjelder tetramerforurensning ved hvilket det ikke lenger forekommer visse biologiske responser på tetramer administrert i et pattedyr,. Et hoved-kriterium er fraværet av endringer i nyrefunksjon dersom farmasøytisk effektive mengder infuseres, dvs. ved et renhetsnivå på ca. 99% eller bedre (mindre enn ca. 1% tetramer er til stede). Det foretrukne produkt fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inneholder ikke mer enn ca. 0,8% tetramer, basert på vekten av totalt hemoglobin (THb). Med andre ord inneholder et i hovedsak tetramerfritt produkt i henhold til oppfinnelsen ikke mer enn fysiologisk akseptable mengder, det vil si omtrent 1% av upolymerisert hemoglobintetramer. Spesielt foretrukne produkter ifølge oppfin-nelsen inneholder mindre enn ca. 0,5% tetramer; de mest foretrukne produkter ifølge oppfinnelsen inneholder ca. 0,3-0,4% tetramer. Slike mengder tetramer er blitt funnet å være fysiologisk akseptable.

Slik den er anvendt her, har betegnelsene "ultrarenset produkt" eller "renset produkt" den samme betydning som betegnelsen "i hovedsak tetramerfri".

Som anvendt her, defineres prosent totalt hemoglobin (THb) som gram hemoglobin/100 ml løsning.

Som anvendt her, betyr betegnelsen "polymeriseringsløsning" en løsning som inneholder et "tverrbindende" eller polymeriserende middel, så som glutaraldehyd, imidoestere, diaspirin eller andre, i en biokjemisk egnet bærer.

Slik den er anvendt her, betyr betegnelsen polymerisert anbringelsen av molekylære broer mellom molekyler eller tetramerer, hvor størrelsen og vekten av det resulterende polymeriserte molekyl er øket i forhold til naturlig eller tetramert hemoglobin. Polymerisert hemoglobin er ikke tetramert hemoglobin.

Med en løsning av hemoglobin som anvendt her, menes en løsning av tetramere hemoglobinmolekyler eller polymeriserte hemoglobinmolekyler hvor molekylene ikke befinner seg i et rødt blodlegeme. En slik løsning behøver ikke være fri eller i hovedsak fri for rødt blodlegeme-stroma eller stromale forurensninger. Foretrukne polymeriserte hemoglobinløsninger er imidlertid fri for rødt blodlegeme-stroma og stromale forurensninger.

Med betegnelsen "semipermeabel membran" menes en membran som er permeabel for noen molekyltyper og ikke for andre, dvs. en membran som virker som et selektivt filter som ekskluderer visse molekylvekter.

Produktet av fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse, nemlig en polymerisert, pyridoksylert hemoglobinløsning i hovedsak fri for tetramert (naturlig eller intramolekylært tverrbundet) hemoglobin, stromale og forskjellige andre forurensninger, fremstilt fra varmebehandlet virusinaktivert tetramert hemoglobin, er fysiologisk akseptabelt, samt terapeutisk og klinisk anvendbart. Produktet har reversibel oksygenbindingskapasitet som er nødvendig for oksygentransport-egenskaper. Det som er mest verdt å merke seg er at produktet viser gode ladnings- og avladningskarakteristikker ved anvendelse og som henger sammen med det å ha en oksygen-hemoglobin-dissosiasjonskurve (P50) som ligner på den for helblod. Produktet binder oksygen med høy affinitet i kapillarene gjennom lungene og frigir så adekvat oksygen til vev i kroppen. Produktet krever heller ikke kompatibilitetsstudier med mottakeren.

Produktet har også en halveringstid når det administreres til mennesker på minst ca. 15 timer og mer foretrukket ca. 24 timer. Dette hemoglobinprodukt kan infuseres i pasienter i mengder på opptil ca. 3,0 I og til og med opptil ca. 5,0 I. Med andre ord kan hemoglobinproduktet anvendes for å komplet-tere i hovedsak alt av en menneskelig pasients blodvolum uten å forårsake vaso-konstriktion, nyretoksisitet, hemoglobinuria eller andre problemer i sammenheng med intravenøs administrering av syntetiske eller semisyntetiske oksygenbærere og bloderstatninger. Det beskrives således en fremgangsmåte for over-føring til en pasient, fortrinnsvis en menneskelig pasient, av en mengde av et stromafritt, tetramerfritt, polymerisert, pyridoksylert hemoglobinprodukt som ikke er toksisk for pasienten, hvor mengden er opptil minst ca. 5,0 I. En slik metode inkluderer at det på pasienten eller individet festes en infusjonsinnretning eller en annen slik innretning for infusjon eller transfusjon til pasienten.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er unik ved at den gir et produkt som har et nivå av tetramer som ikke er mer enn ca. 1 % og mer foretrukket ikke mer enn ca. 0,8 vekt%, basert på vekten av det totale hemoglobin i løsningen. Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse tilveiebringer en ytterligere fordel ved at den kan gjøre sluttproduktet i hovedsak fritt for mikrobielle og viraie antigener og patogener. Slike mikrobielle og viraie antigener og patogener reduseres til ikke påvisbare nivåer. Produktet er sterilt som bestemt ved analysen som er angitt i United States Pharmacopeia. XXIII, kap. <71>. Eksempler på slike antigener og patogener inkluderer for eksempel bakterielle, rickettsiale, fungale, protozoane, viraie og andre organismer. Viktigst av alt tilveiebringer fremgangsmåten en biologisk prosedyre som er fri for virus som forårsaker hepatitt og AIDS (ervervet immunsvikt syndrom).

Når det gjelder de fysiologiske egenskaper, forårsaker den biologiske løsning ifølge denne oppfinnelse når den infuseres i mengder på opptil minst 5,0 I, ikke vasokonstriktion, nyretoksisitet, hemoglobinuria og andre problemer i sammenheng med intravenøs administrering av kjente hemoglobinløsninger som inneholder fysiologisk uønskede mengder av tetramert hemoglobin. Intravenøs administrering av løsningen fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet her resulterer ikke i noen tydelig minskning i urinproduksjon, ingen minskning av betydning i glomerular filtreringsgrad, ingen minskning av ekstravasation i det peritoneale hulrom og ingen endring av betydning av farven på den produserte urin.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer derfor en acellular rød blodlegeme-erstatning, som kan anvendes ved behandling av trauma, myokardialt infarkt, slag, akutt anemi og oksygenmangel-sykdommer så som hypoxemia, hypoxia eller hypoxia i sluttstadium på grunn av svekkelse eller svikt i lungen til fullstendig å oksygenere blod. Produktet er også nyttig ved behandling av hvilken som helst sykdom eller medisinsk tilstand som krever et resuscitativt fluid (f.eks. trauma, spesielt hemoragisk sjokk), intravaskulær volumutvider eller utbytte-transfusjon. I tillegg til medisinsk behandling kan produktet være anvendbart for konservering av organer for transplantasjoner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter de følgende prosedyrer:

1. aspirasjon og filtrering av røde blodlegemer

2. cellevask/lysing

3. varmebehandling

4. ultrafiltreringskonsentrasjon

5. avgassing

6. kjemisk modifisering

7. rensing

8. UP-polykonsentrasjon

9. deoksygenering

10. formulering

Det foretrukne utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er utdatert helblod fra mennesker eller pakkede røde blodlegemer. I tillegg kan ikke-utdatert blod (inndatert) også anvendes. Fortrinnsvis anvendes ikke helblod i denne fremgangsmåte dersom det har vært lagret i mer enn 2 uker etter den utløpsdato som er angitt på pakningen. Anvendelsen av helblod som er utdatert med mer enn 2 uker, tilveiebringer ytterligere vanskeligheter ved ekstra-hering av hemoglobinet og fjerning av cellerester så som stromale proteiner og forurensninger.

Alle fremgangsmåter beskrevet heri kan anvendes på blod fra andre pattedyr med mulighet til små modifikasjoner som er innenfor fagmannens kunnskaper. De fleste av fremgangsmåtene kan gjennomføres ved ca. 2°C til ca. 8°C, fortrinnsvis ca. 4°C.

Under aspirasjon og filtrasjon av røde blodlegemer ekstraheres de røde blodlegemer (RBC = red blood cells) aseptisk fra donorpakninger uten å føre luft inn i blodet, og føres over en serie filtere for å resultere i en RBC-suspensjon som har reduserte mengder av leukocytter og blodplater. Den resulterende suspensjon gjennomgår så cellevasking/lysing.

Suspensjonen vaskes under karbonmonoksyd-atmosfære med en ca. 1% NaCI-løsning for å fjerne rester av plasmaproteiner. De vaskede RBC behandles så med vann for injeksjon (VFI) for lysing av cellene, og den resulterende blanding klares under anvendelse av en tverrstrømmings-filtreringsenhet. Det klarede produkt varmebehandles så for å felle ut ytterligere stromalt materiale, som fjernes ved filtrering. Produktet fra denne prosedyre er en stromaf ri hemoglobin (SFH) - løsning med en THb på ca. 3% (vekt/volum).

Den varmebehandlede og stromafrie hemoglobinløsning som inneholder karboksyhemoglobin, konsentreres og avgasses for å gi en SFH-løsning som inneholder deoksyhemoglobin. Avgassing omfatter først metting av karboksy-hemoglobinløsningen med oksygen i ca. 16 timer for å gi en løsning av oksygenert hemoglobin og ca. 7 vekt%, basert på den totale vekt av hemoglobin, karboksyhemoglobin. Deretter drives oksygenet av med nitrogen, argon eller helium for å danne en løsning som inneholder fritt hemoglobin, dvs. hemoglobin som ikke befinner seg i kompleks form, og ca. 7 vekt%, basert på den totale vekt av hemoglobin, oksyhemoglobin. Den resulterende avgassede løsning filtreres og over-føres til en beholder for kjemisk modifikasjon.

Etter avgassingen pyridoksyleres den stromafrie hemoglobinløsning under anvendelse av pyridoksal-5'-fosfat (P5P) i et molforhold pyridoksal-5'-fosfat til hemoglobin på ca. 1:1 til 3:1. Alternativt kan det stromafrie hemoglobin pyridoksyleres under anvendelse av 2-Nor-2-formyl-pyridoksal-5'-fosfat. Et reduksjons-middel så som natrium-cyanoborhydrid eller fortrinnsvis natriumborhydrid settes til pyridoksyleringsblandingen. Overskudd av reagenser og salter fjernes ved dialyse mot pyrogenfritt vann eller fortrinnsvis ved diafiltrering med VFI. Det pyridoksylerte hemoglobin polymeriseres med en glutaraldehydløsning.

Den stromafrie, pyridoksylerte hemoglobinløsning polymeriseres under anvendelse av en vandig glutaraldehydløsning. Varigheten for polymerisasjonen og mengden av glutaraldehyd som tilsettes avhenger av volumet av hemoglobin-løsningen, det ønskede utbytte av polymerer og den ønskede molekylvekt-fordeling. Generelt øker lengre polymerisasjonstider utbyttet og molekylvektfordelingen for polymerene. Et utbytte på omtrent 75 vekt% polymerer, basert på den totale vekt av hemoglobin, oppnås i løpet av ca. 16-18 timer. Det foretrukne endepunkt for polymerisasjonen defineres som det punkt hvor løsningen inneholder ca. 75 vekt% polymerer, basert på den totale hemoglobinvekt, som målt ved størrelsesutelukkelses-HPLC. Alternativt defineres endepunktet som det punkt hvor løsningen inneholder ca. 65% polymerer, basert på den totale vekt av hemoglobin, dvs. ca. 2,5 timer.

Den polymeriserte reaksjon bråkjøles ved tilsetning av vandig glycin. Bufferen må tilsettes så hurtig som mulig. Tverrbindingene stabiliseres så ved tilsetning, også denne gang så hurtig som mulig, av en løsning av vandig natriumborhydrid. Denne polymeriserte løsning konsentreres deretter og diafiltreres så under en atmosfære av oksygen for å oksygenere løsningen. Til slutt settes vann til løsningen inntil løsningen inneholder ca. 4 vekt% hemoglobin.

Polymerisasjon i henhold til oppfinnelsen resulterer i et høyt utbytte av polymerer med et smalt molekylvektområde, som vist på fig. 1 og i eksempel 1 i det følgende.

Den polymeriserte, pyridoksylerte hemoglobinløsning renses så ved kolonnekromatografi, filtrering, f.eks. membranfiltrering, eller begge deler, for å fjerne rester av upolymerisert (tetramert) hemoglobin fra løsningen. Den rensede, polymeriserte hemoglobinløsning konsentreres så til ca. 6% under anvendelse av et ultrafiltreringsapparat ved preparering for gassutbytting.

Den konsentrerte løsning deoksygeneres så med nitrogen. Deoksy-generingen finner sted ved ca. 10-12°C inntil mengden av oksyhemoglobin i løsningen er mindre enn ca. 16 vekt% av det totale hemoglobin.

Den resulterende deoksygenerte, rensede og polymeriserte hemoglobin-løsning konsentreres så ved ultrafiltrering under en nitrogenatmosfære i en avkjølt beholder. pH-verdien justeres til ca. 8,8-9,0, og mengdene av elektrolytter kan justeres som nødvendig til nivåer som representerer nivået for normalt plasma. I tillegg kan det eventuelt tilsettes konvensjonelle antioksydanter så som glutation, askorbat eller glukose. Etter at løsningen er konsentrert til det ønskede nivå, fortrinnsvis ca. 10 vekt% polymerisert, pyridoksylert, renset, tetramerfritt, stromaf ritt hemoglobin, steriliseres løsningen ved filtrering og overføres ved hjelp av et sterilt overføringsapparat til egnede farmasøytisk akseptable beholdere.

Karakteristikkene for den resulterende hemoglobinløsning er vist nedenfor:

De følgende eksempler viser visse aspekter av foreliggende oppfinnelse. Det skal imidlertid forstås at disse eksempler er for illustrasjonsformåi. Alle temperaturer er uttrykt i grader Celsius dersom ikke annet er angitt. Dersom ikke annet er angitt, er alle prosentangivelser, f .eks. for totalt hemoglobin (THb), uttrykt som vekt/volum. Det skal også forstås at dersom typiske reaksjonsbetingelser (f.eks. temperatur, reaksjonstider) er angitt, kan betingelsene både over og under disse spesifikke områder også anvendes, selv om dette generelt er mindre bra.

Dersom intet annet er angitt, er alle beholdere og tanker som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen laget av 316-L rustfritt stål, fortrinnsvis en

farmasøytisk kvalitet av slikt rustfritt stål, som er høypolert og derfor kan rengjøres lett og hurtig. De forskjellige forbindelsesrøhedninger eller -slanger er laget av det samme rustfrie stål eller av en farmasøytisk kvalitet Teflon eller silikon. Filtrene og membranene anvendt i fremgangsmåten kan kjøpes fra Millipore Inc., Pall-Filtron eller Cuno Inc.

Halveringstiden for det resulterende produkt ifølge oppfinnelsen bestemmes in vivo i pattedyr, f.eks. mennesker. Typisk tas en blodprøve fra pattedyret en tidsperiode etter at pattedyret har fått en infusjon med produktet. Mengden av produktet bestemmes så ved sentrifugering av blodprøven, uttrykking av plasma-porsjonen, bestemmelse av plasmahemoglobinivåer ved hjelp av spektrometri og så korrelering av mengden av produkt som blir igjen i pattedyret til halveringstiden for produktet.

Størrelsesutelukkelseskromatografi-HPLC gjennomføres som følger: Prøven fortynnes med 0,2 M pH 6,9 kaliumfosfatbuffer til 0,2 g/dl, filtreres gjennom et 0,2 u.m filter og injiseres i et HPLC-system, som består av de følgende komponenter (i rekkefølge av systemflyt): 1. Pharmacia modell 2848 pumpe - mobil fase er 0,2 M pH 6,9 kaliumfosfat

- strømningsgraden er 1,0 ml/minutt

2. 45 cm PEEK- eller titanrør med indre diameter 0,254 mm

3. Rheodyne modell 7725i injektor med 200 \ i\ PEEK prøvesløyfe

4. 18 cm PEEK- eller titanrør, 0,254 mm indre diameter

5. Upchurch modell A 431, 0,5 |im filter

6. 9 cm PEEK- eller titanrør, 0,254 mm indre diameter

7. Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 x 7,8 mm Guard-kolonne

8. 24 cm PEEK- eller titanrør, 0,254 mm indre diameter

9. Phenomenex Biosep SEC S-3000 600 x 7,8 mm analytisk kolonne

10. 23 cm PEEK- eller titanrør, 0,254 mm indre diameter

11. Pharmacia Uvicord SD UV-detektor - bølgelengde: 280 nm

- strømningscelle: 8 uJ volum, 2,5 mm veilengde

- område: 2 AUFS

- tidskonstant: 10 sekunder

Toppabsorpsjonen ved 280 nm tas opp ved hjelp av en LKP 2221 integrator, som integrerer hvert enkelt toppareale og beregner det totale hemo-globinareale for hver polymertype.

Ytterligere forståelse av oppfinnelse kan oppnås fra de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Nå med referanse til fig. 1 befinner donorposer 20 med utdatert blod (helblod eller pakkede røde blodlegemer) seg i et egnet aseptisk aspirasjonsapparat 22. Et eksempel på et egnet aspirasjonsapparat er et system som har to aspira-sjonsstasjoner. Straks en donorpose er anbrakt i aspirasjonsstasjonen, punkterer en nål i aspirasjonsapparatet donorposen, fører inn ca. 150 ml av en 1% (vekt/ volum) vandig natriumkloridløsning, og aspirerer det utdaterte blod fra donorposen under redusert trykk eller vakuum. Det aspirerte blod føres gjennom et filter 24 med 100 u,m dybde og deretter gjennom to filtere 26 med 5 u.m dybde, i serie. Når blodet går gjennom filtrene med 5 jim dybde, fjernes leukocytter fra blodet. Typisk aspireres ca. 170 enheter utdatert helblod, filtreres og overføres deretter til tank 1, som vist på fig. 1. Filtrene renses så med ca. 75 liter av en 1% (vekt/volum) vandig natriumkloridløsning.

Før innføringen av blodet i tank 1, anbringes det i tanken ca. 70 I av en 1% vandig natriumkloridløsning. Etter at alle 170 enheter med utdatert blod er blitt aspirert, filtrert og overført og filtratene er blitt renset, inneholder tanken ca. 250 liter av en løsning med 4% totalt hemoglobin. Under aspirasjons- og filtrerings-trinnene holdes tank 1 ved redusert trykk, dvs. et vakuum på 50-71 cm Hg. (20-28" Hg). Straks alt det utdaterte blod er blitt overført til tank 1, slås vakuumet av og karbonmonoksyd føres inn i tanken slik at tanken inneholder en atmosfære av karbonmonoksyd.

Tank 1 kobles til et 0,65 urn filter 28 med tangensial strømning, som vist på fig. 1. Den første sats med 250 liter løsning med totalt 4% hemoglobin konsentreres til ca. 125 I av en løsning med totalt 8% hemoglobin ved mikrofiltrering gjennom filteret med tangensial strømning. pH-verdien for hemoglobinløsningen ved dette punkt er ca. 6 til 6,5. Etter konsentrering til 8% totalt hemoglobin vaskes løsningen ved tilsetning av 1% (vekt/volum) natriumkloridløsning for diafiltrering og fjerning av filtratet i samme grad som det tilsettes natriumkloridløsning. De 125 I hemoglobinløsning vaskes typisk med ca. 8 volumenheter av 1% natriumklorid-løsningen (ca. 1000 I). Etter vasking konsentreres løsningen til ca. 70 I, dvs. ca. 14% totalt hemoglobin, og "vann for injeksjon" (VFI) settes til for å bringe volumet av løsningen opp til ca. 180 I. Med tilsetningen av VFI sveller cellene og sprekker slik at hemoglobin frigis inn i løsningen. Konsentrasjonen av den resulterende hemoglobinløsning er ca. 5% totalt hemoglobin (THb).

Den resulterende løsning klares mens den fremdeles er i tank 1. Løsningen konsentreres først til ca. 50 I, og filtratet overføres til tank 2. Når løsningen pumpes over filteret, forblir rødblodlegeme-stromaforurensninger og cellevegg-materiale og fjernes av filteret. De gjenværende 50 I løsning i tank 1 vaskes (diafiltreres) med ca. 2,5 volumenheter VFI. Disse 2,5 volumenheter vaskeløsning settes til tank 2. Materialet som blir igjen i tank 1 konsentreres så til ca. 20 I, og filtratet settes til tank 2. Det resulterende volum i tank 2 er ca. 280 I av en løsning med 3,3% totalt hemoglobin.

Den resulterende løsning av stromafritt hemoglobin varmebehandles så i tank 2 ved en temperatur på ca. 60-62°C i en tidsperiode på ca. 10 timer. I løpet av denne tid agiteres løsningen moderat. Når løsningen varmes opp og overstiger en temperatur på ca. 55°C, dannes det en felling.

Den resulterende 3,3% THb (vekt/volum) stromafrie, varmebehandlede hemoglobinløsning filtreres så gjennom et 0,2 u.m filter 30, fulgt av et 0,1 urn filter 32, og overføres til tank 3. Den filtrerte hemoglobinløsning konsentreres så til ca. 18% THb og vaskes og diafiltreres deretter med 4 volumenheter VFI (180 liter). Konsentrasjonen og diafiltreringen gjennomføres under anvendelse av et 10 kilo-dalton (kd) molekylvekt-ultrafilter 34. Avløp 35 i forbindelse med ultrafilter 34 samler opp filtrat. Ved dette punkt inneholder de 45 I løsning med totalt 18% hemoglobin mindre enn 50 ng fosfolipid pr. gram hemoglobin, mindre enn 2 ng glykolipid pr. gram hemoglobin, mindre enn 1% methemoglobin, mindre enn ca. 0,03 endotoksinenheter av endotoksin pr. milliliter ved en pH-verdi på ca. 6 til 6,5. Dette hemoglobin i løsningen er karboksyhemoglobin.

Den resulterende karboksyhemoglobinløsning overføres så til tank 4, hvor karboksyhemoglobinet først oksygeneres og deretter deoksygeneres. Tank 4 er utstyrt med en gass-skyllingsring koblet til oksygen- og nitrogen-gassrørledninger, en tilførselsanordning fra bunnen av tanken til et måle-sprayapparat anbrakt på toppen av tank 4 og en skumoverløps-oppsamler forbundet med skumbeholder 1, slik at skum generert i tank 4 føres inn i skumbeholder 36 hvor skummet konden-seres til væske og føres tilbake til tank 4. Tank 4 omfatter videre et sett av Pall Ringer, som fyller opp omtrent en tredjedel av tankvolumet. Skumbeholder 36 inkluderer en gassventil for fjerning av gass. Løsningen i tank 4 er en løsning med 13% totalt hemoglobin.

Under et første oksygeneringstrinn dusjes oksygen gjennom løsningen i en grad tilstrekkelig til at det oppnås en ensartet dispersjon av gass i beholderen. Beholderen, som har et volum på 200 I, dusjes med gass i en mengde på ca. 25 l/min. Oksygenering av karboksyhemoglobinet gjennomføres i en tidsperiode på ca. 16 timer slik at den resulterende løsning inneholder mindre enn 5% karboksyhemoglobin, basert på vekten av totalt hemoglobin. Oksygenering gjennomføres ved en temperatur på ca. 10°C. Skummet som er generert i tank 4, samles opp i skumbeholder 36, og etter avsetning føres den resulterende løsning tilbake til tank 4.

Etter oksygenering dusjes løsningen med en lignende strøm av nitrogen i ca. 6 timer eller inntil mindre enn 10% oksyhemoglobin, basert på vekten av totalt hemoglobin, blir igjen i løsningen. Nitrogendusjingen gjennomføres ved en temperatur på ca. 10°C og ved en pH-verdi på ca. 6 til 6,5. Alternativt kunne karboksyhemoglobin bli omdannet til deoksyhemoglobin under anvendelse av en membranbytter. Det skal bemerkes at det i hovedsak ikke finner sted noen denaturering av hemoglobinet, noe som normalt ville være ventet fra skummings-trinnet. Den resulterende deoksygenerte løsning gjøres nå klar for kjemisk modifisering.

Nå med referanse til fig. 2, overføres deoksyhemoglobinløsningen til tank 5 for kjemisk modifisering. Til tank 5, som inneholder deoksyhemoglobinløsningen ved ca. 4°C, settes det så en vandig løsning av pyridoksyl-5-fosfat (P5P) (93,75 g/l) i et molforhold P5P til hemoglobin på 1:1 til 3:1. Et molforhold P5P til hemoglobin på 2:1 foretrekkes. Pyridoksyleringen gjennomføres ved en temperatur på ca. 4°C. P5P-løsningen tilsettes typisk i løpet av ca. 1 minutt og blandes i ca. 15 minutter, hvoretter det tilsettes en natriumborhydrid/natriumhydroksyd-løsning til hemoglobinløsningen i et molforhold natriumborhydrid til hemoglobin på ca. 20:1. En egnet vandig natriumborhydrid/natriumhydroksyd-løsning inneholder 0,8 g natriumhydroksyd pr. 2 liter og 90,8 g natriumborhydrid pr. 2 liter. Borhydrid-løsningen tilsettes så hurtig som mulig i løpet av en tidsperiode på ca. 1 minutt, og deretter omrøres det i én time. Den resulterende løsning på 50 I pyridoksylert hemoglobin diafiltreres deretter under anvendelse av et 10K Dalton ultrafilter 38 for å fjerne overskudd av reaktanter med 4 volumenheter VFI. Avløp 40 i forbindelse med ultrafilter 38 samler opp filtratet fra filter 38.

Etter diafiltrering med 4 volumenheter, dvs. 200 liter, VFI, polymeriseres hemoglobinet. Til tank 5, som inneholder det pyridoksylerte hemoglobin, tilsettes det tilstrekkelig VFI til å fremstille en løsning med 4,5% totalt hemoglobin (ca. 175 I hemoglobinløsning). En glutaraldehydløsning settes til den pyridoksylerte hemo-globinløsning i et molforhold glutaraldehyd til hemoglobin på ca. 24:1. Glutar-aldehydløsningen settes typisk til hemoglobinløsningen i løpet av en tidsperiode på ca. 2,5 timer ved hjelp av en målepumpe. Polymerisasjonsreaksjonen får fortsette i ca. 18 timer. Den målgitte molekylvektfordelingen er ca. 75% polymer og 25% tetramer. Målpolymerene har molekylvekter på mindre enn ca. 600 000 med en overveiende fraksjon av molekylvekter i området 100 000 - 350 000.

Når polymerisasjonsreaksjonen når den målgitte molekylvektfordeling (etter ca. 18 timer), tilsettes (for å bråkjøle) vandig glycin (ca. 166 g/l) til hemoglobin-løsningen i et molforhold glycin til hemoglobin på 140:1. Se fig. 3, som er en HPLC-opptegnelse av det resulterende polymeriserte, glycin-bråkjølte hemoglobinprodukt. Den resulterende løsning blandes så i ca. 10 minutter, hvoretter en natriumborhydrid/natriumhydroksyd-løsning (med den konsentrasjon som er angitt i det foregående) settes til hemoglobinløsningen i et molforhold natriumborhydrid til hemoglobin på 28:1. Denne resulterende blanding omrøres i ca. 1 time. Løsningen konsentreres så til ca. 50 I (ultrafilter 38) og vaskes med 4 volumenheter (200 I) VFI. En ytterligere alikvot natriumborhydrid med det samme molforhold som angitt ovenfor, settes til den konsentrerte løsning, og det blandes igjen i 1 time. Den resulterende løsning vaskes med 4 volumenheter VFI (200 I), noe som resulterer i polymerisert, pyridoksylert, stromafritt hemoglobin, som er blitt behandlet.

Den resulterende løsning oksygeneres ved at løsningen får stå under en oksygenatmosfære og deretter overføres den til et rensesystem 42. Rensingen kan oppnås ved kolonnekromatografi, filtrering, fortrinnsvis membranfiltrering (diafiltrering), eller en kombinasjon av filtrering og kolonnekromatografi.

I én utførelse overføres løsningen til kromatografi-tilførselsbeholder, tank 6, som vist på fig. 5.1 denne utførelse fortynnes den resulterende løsning av oksyhemoglobin til ca. 200 I (4% totalt hemoglobin) i tank 6, og konsentrasjonen av klorid justeres til 22 mM med natriumkloridløsning. Ingen justering av natrium-konsentrasjonen er nødvendig.

Fem 40 ml alikvoter av den resulterende hemoglobinløsning kromatograferes så ved anvendelse av kolonne 44. Kolonne 44 inneholder en affinitetsgel, som er en agarosegel modifisert med et gult farvestoff (kommersielt tilgjengelig fra Affinity Chromatography, Ltd., som Mimetic Yellow nr. 1) med større affinitet for polymer enn tetramer.

Kromatograferingen gjennomføres som følger: 40 I oksygenert, polymerisert, pyridoksylert, stromafri hemoglobinløsning anbringes på kolonne 44. Kolonnen vaskes med 15 kolonnevolumer (ca. 750 I) 30 mM vandig NaCI-buffer for å fjerne tetramer. Kolonnen vaskes så med ca. 250 I av en 300 mM natrium-kloridbuffer for å vaske av polymeren. Polymerfraksjoner samles opp i tank 7. Uønskede fraksjoner sendes til avløp 46. Etter at hver alikvot er fjernet, regenereres kolonnen med 15 mM HCI-løsning (150 I), som igjen er satt i likevekt med 30 mM vandig NaCI (250 I) og en annen alikvot tilførselsløsning (40 I) anbringes på kolonnen. Kolonnen vaskes igjen med 30 mM NaCI, fulgt av 300 mM NaCI. 40 I alikvoter av hemoglobinløsning settes til kolonnen og kromatograferes inntil tank 6 er tom.

De oppsamlede fraksjoner i tank 7 ultrafiltreres (konsentreres) under anvendelse av filter 48 som står i forbindelse med avløp 50 til et volum på ca. 40 I (6% totalt hemoglobin). Den konsentrerte hemoglobinløsning overføres så til gassutvekslingstank 8 for deoksygenering.

Alternativt overføres løsningen til en filtrerings-resirkuleringsbeholder 10, som vist på fig. 6. Hemoglobinet fortynnes da til ca. 4% THb i tank 10. Den 4% THb-løsning diafiltreres så under anvendelse av 10 mM NaCI og et 300 000 molekylvekt-filter 52, som er kommersielt tilgjengelig fra Pall-Filtron. Filtreringen fortsettes inntil ca. 97% av hemoglobinmaterialet går gjennom filteret og inn i tank 11. (Ca. 3% av materialet, dvs. polymerer med høy molekylvekt, blir igjen i tank 10). Mengden av hemoglobin bestemmes spektrofotometrisk under anvendelse av et cooximeter.

Det resulterende materiale i tank 11 inneholder ca. 2-4% TH6 og inneholder ca. 7-10% tetramer, basert på THb. De 2-4% THb diafiltreres så under anvendelse av 10 mM NaCI og et 100 000 molekylvekt-filter 54, som er kommersielt tilgjengelig fra Pall-Filtron, og som er forbundet med avløp eller felle 56. Filtreringen fortsettes inntil nivået av tetramer, som bestemt ved størrelsesutelukkelses-kromatografi under anvendelse av en BioSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm kolonne er mindre enn 0,8% av vekten av hemoglobinmassen. Den resulterende rensede hemoglobinløsning forblir først i tank 11 og overføres deretter til gassutvekslingstank 8 for deoksygenering.

Gassutvekslingstank 8 kan være den samme som tank 4 eller fortrinnsvis en annen tank. Gassutvekslingstank 8 er utstyrt i hovedsak på samme måte som gassutvekslingstank 4 på fig. 1, og er forbundet med skumbeholder 58 på samme måte som i tank 4 og skumbeholder 36. Deoksygenering gjennomføres i løpet av ca. 2,5 timer med en nitrogendusj ved ca. 10°C og en løsnings-pH på ca. 7,5. Nitrogendusjing fortsettes inntil mindre enn ca. 16% oksyhemoglobin, basert på vekten av totalt hemoglobin, blir igjen i løsningen. Den resulterende deoksyhemo-globinløsning overføres deretter til tank 9 for formulering.

I formuleringstank 9 konsentreres først løsningen til ca. 7% totalt hemoglobin, og pH-verdien justeres til ca. 8,8 til 9,0 ved 4°C. pH-verdien justeres under anvendelse av 0,2 M NaOH. Elektrolyttløsninger settes så til hemoglobinløsningen ved pH 8,8 til 9,0. Glukose og glycin tilsettes for å oppnå endelige konsentrasjoner på hhv. ca. 5 g/l og 1,75 g/l. Kaliumklorid settes til løsningen for å oppnå en kaliumkonsentrasjon på ca. 3,5 til 4,5 mM. 3 M natriumklorid tilsettes så for å oppnå en 85-110 mM kloridkonsentrasjon. Deretter tilsettes natriumlaktat for å oppnå en 135-155 mM konsentrasjon av natriumion. Til sist tilsettes en 0,45 molar askorbinsyreløsning for å forhøye askorbinsyrekonsentrasjonen opp til ca. 1000 mg/l. Askorbinsyre tilsettes som konserveringsmiddel/antioksydant for lagring. Den resulterende hemoglobinløsning har en endelig osmolalitet på ca. 280-360 mmol pr. kg.

Den formulerte hemoglobinløsning konsentreres så til ca. 10% totalt hemoglobin under anvendelse av filter 60, som står i forbindelse med felle 62, og den 10% hemoglobinløsning steriliseres så ved filtrering ved hjelp av filter 64 og fylles aseptisk i på forhånd steriliserte poser.

Karakteristikkene for produktet fremstilt i dette eksempel, sats A, er vist i tabell 1.1 tillegg er karakteristikkene for satser B og C, som begge er fremstilt i henhold til prosedyren angitt ovenfor for sats A, vist i tabell 1.

I det foregående er det gitt en detaljert beskrivelse av foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse med det formål å illustrere oppfinnelsen.

Claims (16)

1. Vandig løsning av pyridoksylert, polymerisert hemoglobin som ikke inneholder mer enn omtrent 1% av fysiologisk akseptable mengder av hemoglobintetramer, karakterisert ved at den omfatter:

10-24 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 128 kDa,

18-30 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 192 kDa,

45-70 vekt% av totalt hemoglobin av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 256 kDa, som bestemt ved størrelseseksklusjons-HPLC.

2. Vandig løsning i følge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: a) totalt hemoglobin på mellom 9,5 til 12,0 g/dl, b) totalt methemoglobin på mindre enn 8 vekt% av totalt hemoglobin, c) totalt karboksyhemoglobin på mindre enn 5 vekt% av totalt hemoglobin, d) natriumkonsentrasjon på mellom 135 til 155 mmol/L, e) kaliumkonsentrasjon på mellom 3,5 til 4,5 mmol/L, f) kloridkonsentrasjon på mellom 85 til 110 mmol/kg.

3. Vandig løsning i følge krav 2, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: g) totalt fritt jern på mindre enn 2,0 ppm, h) total tetramer på mindre enn 0,8 vekt% av totalt hemoglobin, og i) endotoksin på mindre enn 0,03 EU/ml.

4. Vandig løsning i følge krav 3, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: j) fosfolipider på mindre enn 50 ng/Hb, k) glykolipider på mindre enn 2 ng/Hb.

5. Vandig løsning i følge krav 2, karakterisert ved at den har en osmolaritet på mellom 280 til 360 mmol/kg.

6. Vandig løsning i følge krav 2, karakterisert ved at den har en oksygen-hemoglobindissosiasjon på mellom 23 til 32 torr.

7. Løsning av hemoglobin i følge krav 1, karakterisert ved at løsningen har en halveringstid i en human pasient på omtrent 15 timer.

8. Løsning av hemoglobin i følge kravl, karakterisert ved at løsningen har en halveringstid i en human pasient på omtrent 24 timer.

9. Løsning av hemoglobin i følge krav 1, karakterisert ved at løsningen produserer ingen merkbar reduksjon i nyrefunksjon når infusert inn i en human pasient i en mengde på opp til omtrent 5 liter.

10. Løsning av hemoglobin i følge krav 1, karakterisert ved at løsningen produserer ingen merkbar reduksjon i nyrefunksjon når infusert inn i en human pasient i en mengde på opp til omtrent 5 liter, og løsningen har en halveringstid i en human pasient på omtrent 24 timer.

11. Løsning i følge krav 1, karakterisert ved a t hemoglobinet er et glutaraldehyd-polymerisert hemoglobin.

12. Løsning i følge krav 1, karakterisert ved a t hemoglobinet omfatter omtrent 16% hemoglobinpolymer med en molekylvekt på omtrent 128 kDa, omtrent 26 % av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 192 kDa og omtrent 58 % hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 256 kDa.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en løsning ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: (a) føring av utdatert blod eller ikke-utdatert blod gjennom en egnet aspirasjonsinnretning ved redusert trykk for å fremstille aspirert blod; (b) fjerning av leukocytter fra det aspirerte blod ved filtrering av en blanding som inneholder røde blodlegemer gjennom en serie filtere med en minimummidlere porestørrelse som er tilstrekkelig til å forhindre gjennom-gang av leukocytter; (c) tilsetning av karbonmonoksyd til produktet fra (b) for å fremstille en hemo-globinløsning med en pH-verdi på under 7; (d) vasking av løsningen fra (c) med en 1% natriumkloridløsning, for å få en vasket løsning; (e) fortynning av den vaskede løsning fra (d) med vann for å danne en løsning av lysede celler; (f) filtrering av løsningen av lysede celler gjennom et filter for å fremstille en hemoglobinløsning som er fri for stromaforurensninger og celleveggma-teriale; (g) oppvarming og filtrering av hemoglobinløsningen fra (f) til en temperatur på ca. 60-62°C i ca. 10 timer for å få en varmebehandlet, stromaf ri hemoglobin-løsning; (h) konsentrering og diafiltrering av den varmebehandlede stromafrie hemo-globinløsning for å for en karboksyhemoglobinløsning; (i) avgassing av karboksyhemoglobinløsningen ved å dusje oksygen og så nitrogen gjennom den varmebehandlede løsning ved en temperatur på ca. 10°C for å få et skum og slik at det oppnås en avgasset, varmebehandlet hemoglobinløsning; G) eventuell pyridoksylering av den avgassede løsning under anvendelse av pyridoksal-5"-fosfat i et molforhold pyridoksal-5"-fosfat til hemoglobin på ca. 1:1 til 3:1 for å få en løsning av pyridoksylert hemoglobin; (k) polymerisering av løsningen av fra (j) under anvendelse av en vandig glutaraldehydløsning for å fremstille en løsning av polymerisert hemoglobin med en vektfordeling på ca. 65-75% polymer og 25-35% tetramer; (k1) stopping (quenching) av polymerisasjonen i (k); (k2) tilsetting av et stabiliserende middel til blandingen i (k1); (I) oksygenering og fortynning av den polymeriserte løsning inntil løsningen inneholder ca. 4 vekt% hemoglobin; (m) rensing av løsningen fra (I) for å fjerne tetramert hemoglobin og oppsamling av renset polymerisert hemoglobin, idet løsningen inneholder mindre enn 0,8% tetramer, basert på den totale vekt av hemoglobin; (n) deoksygenering av det rensede polymeriserte hemoglobin med nitrogen;

(0) justering av pH-verdien og elektrolyttnivået i løsningen av renset polymerisert hemoglobin til ca. 8,8-9,0; (p) konsentrering og sterilisering av den pH-justerte løsning fra (o).

14. Vandig løsning ifølge krav 1, hvor hemoglobinet er pyridoksylert, og løsningen er karakterisert ved at den omfatter: (a) et totalt hemoglobinnhold på mellom 9,5 og 12,0 g/dl; (b) et totalt methemoglobininnhold på mindre enn 8% av det totale hemoglobin; (c) et totalt karboksyhemoglobininnhold på mindre enn 5% av det totalte hemoglobin; (d) en oksygen-hemoglobindissosiasjon på mellom 23 og 32 torr; (e) en osmolalitet på mellom 280 og 360 mmol/kg; (f) en natriumkonsentrasjon på mellom 135 og 155 mmol/l; (g) en kaliumkonsentrasjon på mellom 3,5 og 4,5 mmol/l; (h) en kloridkonsentrasjon på mellom 85 og 110 mmol/kg;

(1) et totalt innhold av fritt jern på mindre enn 2,0 ppm; (j) en 128 Kd topp-molekylvekt-fordeling på mellom 10 og 24%; (k) en 192 Kd topp-molekylvekt-fordeling på mellom 18 og 30%; (I) en 256 Kd topp-molekylvekt-fordeling på mellom 45 og 70%; (m) et totalt tetramerinnhold på mindre enn 0,8%; (n) endotoksininnhold på mindre enn 0,03 EU/ml; (o) fosfolipidinnhold på mindre enn 50 ng/Hg, og (p) glykolipidinnhold på mindre enn 2 ng/Hg.

15. Vandig løsning ifølge krav 1, hvor hemoglobinet er pyridoksylert, og løsningen er karakterisert ved at den omfatter omtrent 16% hemoglobinpolymer med en molekylvekt på omtrent 128 kDa basert på vekt av det totale hemoglobinet, omtrent 26 % av hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 192 kDa basert på vekt av det totale hemoglobinet og omtrent 58 % hemoglobinpolymer med molekylvekt på omtrent 256 kDa basert på vekt av det totale hemoglobinet.

16. Løsning i følge krav 15, karakterisert ved a t hemoglobin-løsningen ikke produserer noen merkbar reduksjon i nyrefunksjon når infusert i en human pasient i en mengde på opp til omtrent 1,5 liter.