SE528214C2 - Förfarande för framställning av blodplättslysat - Google Patents

Description

25 30 35 2 faktor vid framställning av dessa odlingsmedium. Vidare har även etiska önskemål ökat efterfrågan på odlings- medium som inte framställts genom hjärtpunktering av levande kalvfoster.

Dessutom kan det, i och med uppmärksamheten kring BSE, vara fördelaktigt ur smittsynpunkt med ett annat ursprung än bovint. Det har därför blivit intressant att kunna framställa odlingsmedium med samma funktionalitet som FBS, men från annat djurslag.

Sammanfattning av uppfinningen Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att till- handahålla ett koncentrerat blodplättlysat, vilket erhål- lits från blodplättsrik plasma från helblod av djur, såväl unga som vuxna djur.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för framställning av blod- plättlysatet, vilket förfarande löser ovannämnda problem och ger en bättre produkt med ett högre utbyte, Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålls ett förfarande för framställning av ett blodplättlysat ut- gående från blodplättsrik plasma från helblod av djur, vilket helblod har tillsatts ett citrat för att undvika koagulering, kännetecknat av (a) att den blodplättsrika plasman koncentreras genom ultrafiltrering för erhållande av en koncentrerad blodplättsrik plasma, (b) att vatten sätts till den koncentrerade blod- plättsrika plasman för lysering av ingående blodplättar, (C) att Ca”'sätts till den lyserade koncentrerade blodplättsrika plasman för koagelbildning av andra beståndsdelar än lyserade blodplättar, var- vid den koncentrerade blodplättsrika plasman efter tillsättning av Ca” får stå vid högst 37°C, företrädesvis 18-25°C, under 3-8 h, företrädesvis ca 5 h, - www. n: ~~ .- '*,~,~ ç P1 'rm »f'\ 1" '151 \..'.'r\rr.-r4.. ~. i~ .-.:'c=- ' - 'y *vara 14.191. .z-Hf.. .\1....~ ßifi 10 15 20 25 30 35 528 214 3 (d) att koaglet centrifugeras, varvid det erhålles ett blodplättslysat, som huvudsakligen består av lyserade blodplättar, samt ett koagulat, och (e) att blodplättslysatet efter centrifugeringen genomgår ett filtreringssteg.

Vidare tillhandahålls användning av ett blodplätt lysat, som framställts av blodplättsrik plasma från hel- blod av djur, i ett cellodlingsmedium, vilket omfattar, förutom blodplättlysatet enligt uppfinningen, ett konven- tionellt näringssubstrat och eventuellt fetalt bovint serum eller annan faktor, t ex fibronektin, som kan be- främja vissa celler, för odling av animalieceller, såsom Vero-, Hybridom 39,5- och CHO~celler.

Föredragna utföringsformer enligt föreliggande upp- finning framgår av underkraven.

De djur som avses med föreliggande uppfinning kan i princip vara alla djur, både ungdjur och vuxna djur, från vilka man kan erhålla erforderlig mängd blod.

Företrädesvis utnyttjas blod som utvinns vid slakt, och blodet kommer huvudsakligen från vuxna djur. Exempel på djur som är lämpliga för användning vid föreliggande upp- finning är slaktdjur och andra farmdjur av typ nöt, gris, får, get, häst eller fågel. Företrädesvis används helblod av nöt eller gris.

De djur som används vid föreliggande uppfinning ska vara friska djur som uppfyller de krav som ställs vid veterinärbesiktning av djur avsedda för livsmedelsända- mål.

Blodplättlysatet som erhållits i enlighet med före- liggande uppfinning är särskilt användbart för odling av animalieceller. Blodplättlysatet kan helt eller delvis ersätta fetalt bovint serum vid cellodling.

Beskrivning av föredragna utföringsformer V Efter avtappning av blod från djur kyls blodet snabbt, företrädesvis till ca +4°C, inom någon minut. Ett citrat, såsom natriumcitrat, sätts till blodet för att 'f ;*-..i“-¥lf'f=L-lFE' .ÄB\F'ÅWII?IZ~I'ÉR lífiïäïfii..íyïišïiïfiåfífil“EÄLÉZXJIÉOIQUL 10 15 20 25 30 528 214 4 förhindra koagulering. Eventuellt kan blodet därefter lagras i kyltankar fram till vidare bearbetning.

Inför vidare bearbetning kontrolleras blodet bakte- riologiskt och sensoriskt för att säkerställa att blodet uppfyller de krav som ställs på produkter för livsmedels- (SLV) samt motsvarande bestämmelser inom EU samt USA. Er- ändamål, såsom Svenska Statens Livsmedelsverks krav, farenhetsmässigt har vi funnit att lämpliga övre gränser för bakteriehalt i blodet är de som anges i tabell I nedan. Sensorisk analys görs genom lukttest av blodet, där blod med avvikande lukt kasseras.

Bakteriologiska prover tas företrädesvis på helblod.

»Tabell I Bakteriologisk gräns för att blodet ska vara godkänt att användas Antal bakterier/g Aerobt bakterietal < 100 000 (tryptonglykosextrakt agar 30°C i 3 dygn) E. coli A < 10 Staphylococcus aureus < 100 Blodet ska företrädesvis även ha en temperatur mellan 0°C och 7°C och en ålder av max 72 h.

Ur helblodet tas ett separat prov för hemolysbedöm- ning av plasmadelen. Hemolystalet är ett mått pà mängden lyserade röda blodkroppar och bedöms enligt en skala mellan l och 8. Det blod som används vid föreliggande uppfinning har företrädesvis ett hemolystal av 1-5, mer föredraget 1-3, ännu mer föredraget 1-2.

Utifrån de resultat som erhålls vid analyserna av- görs om blodet kan användas eller inte.

Efter analys separeras blodet i röda blodkroppar och blodplättsrik plasma. Företrädesvis används en blodsepa- rator, men även andra lämpliga, traditionella separatorer kan användas. Blodet hålles hela tiden kylt, lämpligen vid ca +4°C. 10 15 20 25 30 35 »S28 214 5 Därefter koncentreras den blodplättsrika plasman genom ultrafiltrering, där den blodplättsrika plasman koncentreras från ca 6% till cirka 20% proteinhalt, före- trädesvis till ca 12% proteinhalt. Efter ultrafiltrering kan citrat tillsättas som kompensation för den mängd citrat som förloras vid koncentreringen, varefter den koncentrerade blodplättsrika plasman eventuellt fryses, för lagring och/eller analysering samt vidare lysering av ingående blodplättar. Efter eventuell frysning upptinas den frysta plasman, företrädesvis vid en temperatur lägre än 37°C, mer föredraget lägre än 209C, mest föredraget lägre än l2°C. Upptiningen sker på grund av temperatur- restriktionen med fördel i ett rum med reglerad tempera- tur, såsom t ex ett kylskåp eller kylrum.

Efter att den koncentrerade blodplättsrika plasman upptinats tillsätts vatten för lysering av ingående blod- plättar. Vatten kan även tillsättas till den frysta kon- centrerade blodplättsrika plasman för att påskynda upp- tiningen. Vattnet som tillsätts utgörs företrädesvis av avjoniserat vatten, vilket ger bättre skillnad i osmo- tiskt tryck. Mängden tillsatt vatten är företrädesvis cirka 1 del vatten till 2 delar koncentrerad blodplätts- rik plasma. Lyseringen bör ske vid en temperatur som inte överstiger 37°C, företrädesvis lägre än 22°C, mer före- draget lägre än 10°C, ännu mer föredraget lägre än 5°C.

Företrädesvis sker lyseringen med vatten under minst 1 h.

För bildande av koagel av andra beståndsdelar än lyserade blodplättar inblandas sedan en vätska innehål- lande Ca”-joner, t ex i form av kalciumklorid-2-hydrat, företrädesvis vid ett förhållande av 1:1 (koncentrerad blodplättsrik plasmazèaæ-lösning).

Blandningen får sedan stå vid högst 37°C,-företrä- desvis ca 18-25°C, under 3-8 h, företrädesvis under ca 5 h. Efter cirka 3 h bör kontroll göras för att säker- ställa att koaguleringen har påbörjats. Vid ingen eller dålig koagulering-tillsätts mer Ca"-joner. Koagulering vid rumstemperatur (ca 20 °C) är viktig. Om koaguleringen 10 15 20 25 30 35 6 sker vid lägre temperatur, alternativt under kortare tid, är det stor risk att blandningen inte har koagulerat klart. I detta fall kan en efterkoagulering ske vid fil- treringen av blodplättslysatet, alternativt när det fil- trerade blodplättslysatet förvaras i frys eller används vid rumstemperatur. Vid koagulering under för lång tid, eventuellt i kombination med för hög temperatur, kan det uppstå mikrobiologiska problem genom mikrobiologisk tillväxt.

Efter koagulering sönderdelas det bildade koaglet och centrifugeras därefter, varvid det erhålles en klar, ljusröd övervätska, blodplättlysat, som innehåller huvud- delen av de lyserade blodplättarna, och som sediment er- hålls det koncentrerade koaglet. Vid en föredragen ut- föringsform centrifugeras koaglet vid ca 6000 RCF (Rela- tiv Centrifugalkraft) i 30 minuter och vid cirka 20°C. ^"Även andra med centrifugering och filtrering jäm- förbara koncentreringssteg, såsom sådana som bygger på affinitetsprincipen, kan användas vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning.

Efter centrifugering hälls supernatanten, dvs blod- plättlysatet, av och sparas. Vid en föredragen utförings-I form tillsätts därefter citrat till blodplättlysatet, företrädesvis 0,1-2,0 vikt%, mer föredraget 0,3-1,0 vikt%, för att binda eventuellt överskott av Ca”-joner och därmed minska risken för eventuell efterkoagulering.

Efter centrifugering genomgår blodplättlysatet ett fil- treringssteg. Filtreringssteget innefattar företrädesvis filtrering genom sil/filterduk och/eller sterilfiltre- ring. Då filtreringssteget innefattar filtrering genom sil/filterduk kan detta göras direkt efter centrifuge- ring, men även efter eventuell tillsats av citrat. Vid en föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning inne- fattar filtreringssteget även en förfiltrering innan blodplättlysatet sterilfiltreras.

Förfarandet enligt uppfinningen kan ske kontinuer- ligt, satsvis eller som en blandning av båda delar. Om så eawssarfa ar øsrrnrxmnoaamilyïsfiää1012i¿2121c1fise 10 15 20 25 30 35 528 214 7 önskas kan även fler koncentreringssteg, såsom Centrifu- geringssteg, filtreringssteg etcetera införas. Förfaran- det kan även optimeras genom t ex ytterligare centrifuge- ring och filtrering för att öka utbyte och kvalitet på slutprodukten.

Cellodlingsmediet som kan erhållas under användning av blodplättlysatet enligt föreliggande uppfinning inne- fattar, förutom föreliggande blodplättlysat, ett närings- medium innehållande salter, faktor, mm och eventuellt FBS. Näringsmediet kan vara varje lämpligt, konventio- nellt näringsmedium, t ex ett som anges i Sigma-katalogen utgiven av Sigma Chemical Company.

Uppfinningen kommer nu att vidare illustreras med referens till följande exempel. Exemplen är endast av- sedda att vara belysande och ska inte på något sätt ses som begränsande för uppfinningen.

Exempel Exempel la Framställning av 5 satser bovint blodplättlysat Från en kontinuerlig process för separering av blod- plättsrik plasma ur helblod från slaktdjur av nöt togs den blodplättsrika plasman. En sensorisk och bakterio- logisk analys av helblodet gav resultat som var godtag- bara i enlighet med vad som beskrivits ovan. Plasman i helblodet hade ett hemolystal varierande mellan 1 och 4.

Av-helblodet erhölls, under användande av blodseparator av typ Alfa laval HMRPX 714 HGV, ca 60% blodplättsrik plasma, dvs av 5 000 liter blod erhölls cirka 3 000 liter blodplättsrik plasma.

Den blodplättsrika plasman koncentrerades till cirka 12% proteinhalt genom ultrafiltrering under användning av X-Flow-membran av typ tubulära av polysulfon med ett cut- off av 100 000 Dalton. Härvid erhölls ca 1 500 liter kon- centrerad blodplättsrik plasma. Till den koncentrerade blodplättsrika plasman sattes 16 liter natriumcitratlös- ning (25 kg trinatriumcitrat löst i 75 kg vatten) per 1 000 liter koncentrerad blodplättsrik plasma, för att 10 15 20 25 30 528 214 8 kompensera för den mängd citrat som förlorats vid ultra- filtreringen. Den koncentrerade blodplättsrika plasman flingfrystes och analyserades avseende protein-, järn- och endotoxinhalt. Citrathalten antogs vara 7,5 g/kg koncentrerad blodplättsrik plasma. Därefter togs en del koncentrerad blodplättsrik plasma ut ur frys, upptinades och avjoniserat vatten tillsattes vid förhållandet 1:0,5 (koncentrerad blodplättsrik plasmazvatten) för lysering av blodplättar, och blandningen fick stå under minst 1 h.

Under tiden blandades en CaCl2-lösning innefattande 3 g kalciumklorid-2-hydrat per 1 000 g avjoniserat vatten.

Efter lyseringen tillsattes under omröring CaCl2- lösningen vid ett förhållande av 1:1 (koncentrerad blod- plättsrik plasma:CaCl2-lösning) och blandningen fick stå i rumstemperatur i cirka 5 timmar. Till tre av de fem satserna fick extra Ca”-joner tillsättas för att uppnå tillräcklig koagulering.

Efter koagulering sönderdelades koaglet för Centri- fugering i en Centrifug av typ Sorvall RC5C, rotor H-12000, vid 6000 RCF, 2090, under 30 minuter, varvid det erhölls en supernatant, blodplättlysat, och ett koncen- trerat koagel. Därefter filterades blodplättlysatet genom en sil.

Till blodplättlysatet sattes sedan natriumcitrat (O,375 vikt%). Därefter filtrerades blodplättlysatet' genom två Millipore-filter; först genom ett förfilter av typ Milligard CWSSM4S03 och sedan genom ett sterilfilter av typ Millipak Gamma Gold MPGL2GCA3. Det sterila blod- plättlysatet filtrerades ner i sterila E-kolvar och över- fördes sedan till sterila rör för förvaring. Rören för- varades sedan i frys vid ca -l8°C. ' I tabell II visas betingelserna vid vilka de fem satserna av bovint blodplättlysat (BBPLJ framställdes.

Tabell II Beteckning BBPL(2l) BBPL(22) BBPL(28) BBPL(05) BBPL(l0) Upptining 4 h vid 24 h, 4 h vid 24 h, 24 h, (tid, temp) 20°C + 4°C 20°C + 4°C 4°C 17 h vida 17 h vid ' ëlñi i' 1031 ä? BIÉWLÉÉ FT' .ltßï ï-*IV E28 214 9 4°c 4°C Mängd konc 906 800 1006 862 964 blodplätts- rik plasma (gram) Mängd 453 400 507 431 « 492 vatten för lysering (gram) “ ' - ' g Tid och 1 h, 1 h vid 1 h, 1 g vld 12 h temp för 2o°c 4°c + 20°C 4 C + lysering 7 dagar ' 7 dagar vid vid -1s°c -18°C Mängd 907 800 1006 V 862 964 CaClßlÖS' ning för koagulering (gram) Extra till- -0 2,4 - 3,5 0 218 sats av Caclg (gram) ' Tid och 5,5 h, 5+1 h, 5+l h, 5 hf 4+1°hf temp för -2o°c 2o°c 20°C 20°C 20 C koagulering Erhållen 2112 1903 2363 1977 2285 mängd lös- ning (gram) Tilisatt 7,9 7,1 9,3 - 7,4 8,7 mängd Na- citrat (gram) ?F AF\PÄ?EN?a?ami1yï$E\210íüåáâäåïêlëlå 10 l5 20 25 30 35 523 214 10 Exempel lb Framställning_av porcint blodplättlysat Från ett kontinuerligt förfarande för separering av blodplättsrik plasma ur helblod från slaktdjur av gris togs den blodplättsrika plasman. En sensorisk och bakte- riologisk analys av helblodet gav resultat som var god- tagbara i enlighet med vad som beskrivits ovan. Plasman i helblodet hade ett hemolystal varierande mellan l och 4.

Av helblodet erhölls, under användande av blodseparator av typ Alfa Laval HMRPX 714 HGV, ca 55%- blodplättsrik plasma, dvs av 5 000 1 blod erhölls cirka 2 750 liter blodplättsrik plasma.

Den blodplättsrika plasman koncentrerades först till cirka 12% proteinhalt genom ultrafiltrering under använd- ning av X-Flow-membran av typ tubulära av polysulfon med ett cut-off av 100 000 Dalton. Därvid erhölls cirka l 375 l koncentrerad blodplättsrik plasma. Till den kon- centrerade blodplättsrika plasman sattes 15 l natrium- citratlösning (25 kg trinatriumcitrat löst i 75 kg vatten) per l000 liter koncentrerad blodplättsrik plasma för att kompensera för den mängd citrat som förlorats vid ultrafiltreringen. Den koncentrerade blodplättsrika plas- man flingfrystes och analyserades avseende protein-, järn- och endotoxinhalt. 0 Därefter togs den koncentrerade blodplättsrika plas- man ut ur frysen, upptinades och avjoniserat vatten till- sattes vid förhållandet l:O,5 (koncentrerad blodplättsrik plasma:vatten), och blandningen fick därefter stå under l h.

-En CaCl2-lösning innehållande 3 g kalciumklorid-2- hydrat per 1 000 g avjoniserat vatten blandades. Efter lyseringen tillsattes under omröring CaCl2-lösningen vid ett förhållande av l:l (koncentrerad blodplättsrik plasmazlösning), och blandningen fick stå i rumstempe- ratur under cirka 5 h.

Efter koagulering sönderdelades koaglet för centri- fugering i en centrifug av typ Sorvall RC5C, rotor 10 15 20 25 Cfl FJ CO NJ ...s JÄ ll H-12000, vid 6000 RCF, 20°C, under 30 minuter, varvid det erhölls en supernatant, blodplättlysat, och ett koncen- trerat koagel. Därefter filterades blodplättlysatet genom en sil. - Till blodplättlysatet sattes sedan natriumcitrat (0,375 vikt%). Därefter filtrerades blodplättlysatet genom två Millipore-filter, först genom ett förfilter av typ Milligard CWSSM4S03 och sedan genom ett sterilfilter av typ Millipak Gamma Gold MPGL2GCA3. Det sterila blod- plättlysatet filtrerades ner i sterila E-kolvar och över- fördes sedan till sterila rör för förvaring i frys vid ca -l8°C.

I tabell III visas betingelserna vid vilka det porcina blodplättlysatet (PBPL) framställdes Tabell III ' PBPL (03) Upptining (tid, temp) 5 h vid 20°C + 17 h vid 4°C Mängd koncentrerad blodplättsrik 9919 plasma (gram) Mängd vatten för lysering, 503 (gram) i i Tid och temp för lysering 1 h, 20°C Mängd CaCl¿-lösning för 950 koagulering (gram) Extra tillsats av CaCl2 (gram) O.

Tid och temp för koagulering 5 h, 20°C Erhållen mängd lösning (gram) l856~ Tillsatt mängd Na-citrat (gram) 7,0 Exempel 2 Cellodlingsförsök under användning av blodplättlysat Cellerna odlades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med hög glykoshalt (4,5 g/l), med tillsats av O,l% penicillin-streptomycin (PEST), 4 mM L-glutamin och 10% respektive 5% blodplättlysat enligt uppfinningen eller 5% FBS eller 5% respektive 10% kommersiellt PS (porcint serum). 5% FBS respektive 5% och 10% PS användes som kontroll. Cellerna odlades vid 37°C och 7,5% C02.

Före utsådd anpassades cellerna till det nya odlings- <fl f? F? ïaíïï, FÉL'I“I1".:“~É'E“~. ÉICFf':?nš.ij"'=_ SE X2 i f) l 3322 ï 2 IL "i f* lå 10 15 20 25 30 35 12 mediet under åtminstone två passager, där cellerna dela- des ca 1:5 till 1:10 i T-25-kolvar. Efter denna anpass- ning av cellerna gjordes uppskalning till T-75-kolvar.

För att bestämma koncentrationen av celler som skördades för utsådd räknades cellerna i en Bürkerkammare och färgades med trypanblàtt. För räkning av startkoncentra- tionen av celler efter utsådd och koncentrationen vid varje cellräkningsdag användes en flödescytometer.

Flödescytometern som användes var av typ FACSCalibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, USA.

Cellernas viabilitet mättes med fluorescensfärgning av typ Sytox Green Nucleic Acid Stain (Molecular Probes, Eugene, USA). Sytox penetrerar intakta cellmembran. Denna upptagning ses som grön fluorescens vid excitation från en argonlaserstråle vid 488 nm.

Cellinjerna som användes var av typen Vero (African green monkey transformed kidney epitheial cells), Hybridom 39,5 härledda från möss samt CHO-celler (Chinese Hamster Ovary).

Cellkoncentration och -viabilitet mättes på flödes- cytometern. För att analysera effektiviteten av blod- plättlysatet enligt föreliggande uppfinning beräknades en kvot mellan cellkoncentrationen vid respektive mätning och utsàddskoncentrationen. Genom denna beräkning togs _hänsyn till respektive utsåddskoncentration.

Exempel 2a Cellodlingsförsök under användning av bovint blodplättlysat ' I tabell IV visas kvoten mellan cellkoncentration för utvalda dagar och utsàddskoncentrationen för Vero- celler. Försöket utfördes med bovint blodplättlysat (BBPL), 5 olika satser, samt med FBS som referens. 10 15 20 528 214 13 Tabell IV oag 5% Fas 10% BBPL 10% BBPL 10% BBPL 10% BBPL 10% BBPL (05) (10) (21) (22) (28) 0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1 0,51 0,47 0,53 0,41 0,51 0,37 4 9,64 9,77 10,01 6,83 9,17 9,10 7 19,79 15,55 11,37 14,09 10,15 13,21 9 19,00 11,31 9,77 1 9,13 5,65 10,19 Dessa resultat visar tydligt att Vero-celler växer med ett tillfredsställande resultat under användning av blodplättlysatet enligt föreliggande uppfinning. Resulta- ten som erhölls var fullt jämförbara med de som erhölls med 5% FBS. Emellertid sjönk värdena för blodplättlysatet enligt uppfinningen vid dag 8, förmodligen på grund av att näringsämnena börjat ta slut.

I tabell V visas kvoten mellan cellkoncentration för utvalda dagar och utsàddskoncentrationen för Hybridom 39,5-celler. Försöket utfördes med bovint blodplättlysat (BBPL), 5 olika satser, samt med FBS som referens.

Tabell V .

Dag 5% EBS 10% BBPL 10% BBPL lO% BBPL 10% BBPL 10% BBPL , (05) (10) (21) (22) (28) 0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1 2,56 2,56 2,18 2,01 2,09 02,02 3 3,47 4,24 6,05 1 7,21 4,03 3,66 4 0,87 1,00 1,40 2,05 ~0,97 0,81 Resultaten som erhölls vid detta försök visar att Hybridom 39,5-cellerna växer mycket tillfredsställande under användning av blodplättlysatet enligt föreliggande uppfinning. Resultaten som erhölls vid dag 3 och 4 efter utsådd var bättre än det resultat som erhölls med 5% FBS. 'ïI/"Ûä 'rff}=.'šfffï2ï«1'šf"^~, il-ff-Fíftäjnji.ljfxíšïïfi l C12 'i *'22 \_2I!. 01 l 6 10 15 20 25 528 214 14 Exemgel 2b _ Cellodlingsförsök under användning av porcint blod- Qlättlysat I tabell VI visas kvoten mellan cellkoncentration för utvalda dagar och utsåddskoncentrationen för Vero- celler. Försöket utfördes med porcint blodplättlysat (PBPL), 2 olika koncentrationer, samt med FBS och PS som referenser.

Tabell VI Dag 5% 10% PBPL 5% PBPL 10% PS 5% PS FBS (03) (03) 0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1 0,63 0,73 0,65 0,44 0,46 2 5,08 5,98 4,67 3,80 2,56 4 12,84 12,05 9,90 8,13 7,23 7 24,36 17,93 11,48 13,08 9,58 Dessa resultat visar tydligt att även blodplättlysat enligt uppfinningen, erhållet från gris, gav tillfreds- ställande resultat vid odling av Vero-celler, vilka' resultat var bättre än de som uppnàddes under användning av kommersiellt PS.

I tabell VII visas kvoten mellan cellkoncentrationen för utvalda dagar och utsåddskoncentrationen för 39,5 Hybridom-celler. Försöket utfördes med porcint blod- plättlysat (PBPL), samt med FBS och PS som referenser.

-' Tabell VII Dag 5% FBS 10% PBPL 5% PBPL 10% PS 5% PS 0 _1,00_ 1,00 ,1,00 1,00 1,00 1 2,67 2,32 1,84 2,72 2,47 2, 10,88 13,27, 8,16» 11,07_ 9,29 3 16,51 15,82 9,29 17,30 10,45 4 6,46 6,97 7,56 9,40 4,36 Dessa resultat visar tydligt att blodplättlysat enligt uppfinningen, erhållet från gris, gav tillfreds- ställande resultat vid odling av 39,5 Hybridom-celler.

I tabell VIII visas kvoten mellan cellkoncentration för utvalda dagar och utsâddskoncentrationen för CHO- celler. Försöket utfördes med porcint blodplättlysat .fä i i ii i ä l-“ïá-flfëif š5F-*.ïÄ'EÉi\1'§“~. ' 1. din: *528 214 15 (PBPL), 2 olika koncentrationer, samt med FBS och PS som referenser. I Tabell VIII Dag 5% FBS 10% PBPL 5% PBPL 10% PS 5% PS (03) I (03) 0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1 0,62 40,79 0,76 0,42 0,27 3 7,07 8,23 8,03 4,54 2,20 4 - 13,53 22,85 24,53 10,63 5,03 6 24,81 29,13 41,24 27,35 12,77 5 Även dessa resultat visar tydligt att användning av porcint blodplättlysat enligt föreliggande uppfinning ger mycket tillfredsställande resultat, i detta fall vid odling av CHO-celler, och utgör ett utmärkt substitut för såväl FBS som PS. 10 fin"~tl*fš.

Claims (16)

10 15 20 25 30 35 16 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett blodplätt- lysat utgående från blodplättsrik plasma från helblod av djur, vilket helblod tillsatts ett citrat för att undvika koagulering, k ä n n e t e c k n a t av a) att den blodplättsrika plasman koncentreras genom ultrafiltrering för erhållande av en koncentrerad blodplättsrik plasma, b) att vatten sätts till den koncentrerade blod- plättsrika plasman för lysering av ingående blod- plättar, c) att Ca"'sätts till den lyserade koncentrerade blodplättsrika plasman för koagelbildning av andra beståndsdelar än lyserade blodplättar, var- vid den koncentrerade blodplättsrika plasman efter tillsättning av Ca” får stå vid högst 37°C, företrädesvis 18-25°C, under 3-8 h, företrädesvis ca 5 h, d) att koaglet centrifugeras, varvid det erhålles ett blodplättlysat, som huvudsakligen består av lyserade blodplättar, samt ett koagulat, och e) att blodplättslysatet efter centrifugeringen genomgår ett filtreringssteg.

2. ; Förfarande enligt krav 1, varvid den blodplätts- rika plasman vid ultrafiltreringen koncentreras från cirka 6% till cirka 20% proteinhalt, mer föredraget cirka 12% proteinhalt.

3. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid den koncentrerade blodplättsrika plasman efter ultra- filtrering fryses för lysering samt lagring och/eller analysering.

4. Förfarande enligt krav 3, varvid den koncentre- rade blodplättsrika plasman efter frysning upptinas. wfsanwammf *~._ï~í-'ï=”è*aïn,i 'i j; ÉL-Éïílllv Lfišïgï líšl få 10 15 20 25 30 35 528 214 17

5. Förfarande enligt krav 4, varvid upptining av den koncentrerade blodplättsrika plasman sker vid en tempera- tur lägre än 37°C, mer föredraget lägre än 20°C, före- trädesvis lägre än l2°C.

6. Förfarande enligt krav 5, varvid upptiningen sker i ett rum med reglerad temperatur, företrädesvis ett kyl- skåp eller kylrum.

7. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid vattnet som tillsätts för lysering är avjoniserat vatten.

8. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid lyseringen genom tillsättning av vatten sker vid en temperatur lägre än 37°C, företrädesvis lägre än 22°C, mer föredraget lägre än 10°C, ännu mer föredraget lägre än 5°C.

9. Förfarande enligt krav 8, varvid lyseringen sker under minst 1 h.

10. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid citrat sätts till vätskan efter centrifugering för att förhindra eventuell efterkoagulering.

11. Förfarande enligt krav 10, varvid mängden till- satt citrat är 0,1-2,0 vikt%, vikt%.

12. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid den blodplättsrika plasman är av livsmedelskvalitet. företrädesvis 0,3-1,0

13. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid filtreringssteget innefattar filtrering genom sterilfiltrering.

14. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid filtreringssteget även innefattar förfiltrering.

15. Förfarande enligt krav 14, varvid förfiltre- ringen sker genom filterduk och/eller förfilter.

16. Förfarande enligt något av föregående krav, var- vid den blodplättsrika plasman från helblod av djur är från nöt eller gris.