RU2703537C2 - Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека - Google Patents
Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2703537C2 RU2703537C2 RU2016132955A RU2016132955A RU2703537C2 RU 2703537 C2 RU2703537 C2 RU 2703537C2 RU 2016132955 A RU2016132955 A RU 2016132955A RU 2016132955 A RU2016132955 A RU 2016132955A RU 2703537 C2 RU2703537 C2 RU 2703537C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- plasma
- phenol
- albumin
- concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title description 10
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 title description 3
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 title description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 title description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 60
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 39
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 244000005706 microflora Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101000799852 Equus asinus Alpha-1B-glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 claims description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims 1
- CTYRPMDGLDAWRQ-UHFFFAOYSA-N phenyl hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CTYRPMDGLDAWRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 2
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N Acrinol Chemical compound CC(O)C(O)=O.C1=C(N)C=CC2=C(N)C3=CC(OCC)=CC=C3N=C21 IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 108700027921 interferon tau Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения гамма-глобулиновой и альбуминовой фракций плазмы крови с помощью химических дезинфектантов. Для этого по месту заготовки нестерильных кроводач и сепарирования крови в нестерильных условиях используют растворы сульфата аммония 80% или 100% от насыщения с 1% (м/о) фенолом, обладающие бактерицидно-бактериостатическим действием. Производят в них инкубирование образцов плазмы или сыворотки по мере сепарирования индивидуальных кроводач, далее отделяют центрифугированием гамма-глобулиновую фракцию. В надосадочный раствор вносят сухой порошок сульфата аммония до концентрации 75% от насыщения и снижают значение рН до 4,6, после отделения альбуминовой фракции в постальбуминовый безбелковый центрифугат добавляют фенол до расчетной концентрации 1% (м/о), который используют в качестве консервирующего раствора при суспендировании осадков гамма-глобулинов и альбуминов. Использование данного способа позволяет проводить заготовку и сепарирование крови в нестерильных помещениях путем создания способа инактивации бактериальной микрофлоры за счет использования бактерицидно-фракционирующих свойств фенольно-сульфатных растворов. 3 з.п. ф-лы, 6 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к биологической или медицинской промышленности, в частности, к заготовке сырья (крови человека и животных) в нестерильных условиях и его транспортировке в форме полуфабрикатов без использования режима «холодовой цепи» для промышленного фракционирования и обеспечения серийного выпуска иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов.
Техническое решение изобретения направлено на заготовку сырья в нестерильных условиях по месту сбора крови и ее сепарирования за счет инактивации бактериальной микрофлоры и ингибирования протеаз в индивидуальных или пулированных образцах плазмы или сыворотки по мере их изготовления.
Технико-технологическое оформление заготовки донорских кроводач человека устраняет проблематику бактериальной обсемененности индивидуальных образцов крови и сопряженного производства контаминированных образцов плазмы крови. Аналогичные условия в промышленном масштабе невозможно создать для заготовки абортной, плацентарной крови человека, или боенской крови сельскохозяйственных животных, или трупной крови пушных зверей. Одним из негативных свойств бактериальной обсемененности крови является приобретение пирогенных свойств плазмой (сывороткой) крови и переход пирогенов в состав фармацевтических биопрепаратов.
Известны методы обеззараживания индивидуальных и пулированных образцов плазмы. Обработка метиленовым голубым и облучение видимым светом с подобранными величинами освещенности и экспозиции используются для инактивации инфекционности вирусных агентов [1]. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №.924, 2004, p. 151-219; 2. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор). // Хим.-фарм. журнал. 2004, т. 38, №3, с. 39-47]. Сольвент-детергентный способ основан на внесении в состав исходной плазмы крови органического растворителя и неионного детергента [3. Horowitz В. Investigations into the application of tri(n-butyl)phosphate/detergent mixtures to blood derivatives. Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, 1989, p. 83-96]. Предлагается также ультрафиолетовое облучение свежезамороженной плазмы и изготовленных из обработанной плазмы факторов свертывания [4. Као К.J. Effects of leukocyte depletion and UVB irradiation on allogenecity of major histocompatibility antigens in platelet concentrates: a comparative study // Blood, 1992, p. 2931-2937].
Одним из наиболее эффективных способов обеззараживания плазмы считается обработка низкомолекулярным электрофильным соединением (Инактивин), йодоацетальдегидом в условиях сольвент-детергентного инкубирования [5. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №924, 2004, p. 151-219; 2. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор). // Хим.-фарм. журнал. 2004, т. 38, №3, с. 39-47]. На стадии НИОКР отрабатывается инактивация бактериальных и вирусных агентов на основе сверхбыстрой (миллисекунды) низкотемпературной (50-55)°C пастеризации/стерилизации (МСТ-технология).
Недостатком перечисленных методов является использование плазмы, которая производится в условиях, исключающих бактериальную контаминацию донорских кроводач. Эффективность обеззараживающих подходов оценивается при незначительном уровне контаминации индивидуальных образцов плазмы, изготовленных в стерильных условиях с последующим хранением при температуре от (-20)°C до (-65)°C, обеспечивающей бактериостатические условия.
Известны способы транспортировки и хранения плазмы в режиме холодовой цепи. Допускается низкотемпературное хранение плазмы крови при температуре (-20)°C и ниже в течение не более 7 лет [6. Сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» под редакцией Буренкова С.П. М: Изд-во Минздрава СССР, 1976, с. 203-218; 7. Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М: Медицина, 1983, с. 49-83; 8. Руководство по организации, обслуживанию и использованию оборудования холодовой цепи для крови. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2009 г., с. 8-9]. За счет быстрого замораживания плазмы до температур (-35)°C или (-40)°C возможно увеличить срок хранения плазмы крови человека без потери физиологической активности целевых белков с гемостатическим или иммуномодулирующим, или комплексным механизмом действия [9. Жибурт Е.Б. «Трансфузиология: учебник». СПб: Питер, 2002, 736 с.]. Показана возможность удлинения сроков хранения иммуносыворотки при температуре (-5 - -10)°C без потери активности антител, если ее заморозку осуществляли при (-196)°C [10. Патент RU №2151617, А61М 1/38, опубл. 27.06.2000; 11. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48].
Недостатком методов низкотемпературной транспортировки и хранения донорской плазмы (сыворотки) крови является их энергоемкость, которая для обеспечения надлежащего режима требует стационарных помещений. Не допускается оттаивание и повторное замораживание плазмы по техническим причинам, поскольку такого рода технологические нарушения оказывают негативное влияние на физиологическую активность целевых белков [11. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48]. При этом для боенской (трупной) плазмы (сыворотки) крови животных, либо для абортной и плацентарной крови человека в настоящее время не представляется возможным технически организовать получение стерильных кроводач и производство стерильных образцов индивидуальных заготовок стерильной плазмы крови.
Известны способы инактивации микрофлоры в составе плазмы (сыворотки) крови за счет использования этанола на самых первых стадиях технологии производства фармацевтических биопрепаратов. За счет увеличения концентрации этанола и варьирования рН осуществляется выделение и очистка целевых белков из плазмы (сыворотки) крови. В процессе этанольного фракционирования используются бактериостатические (8%) и бактерицидные (17-40%) концентрации этанола [6. Сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» под редакцией Буренкова С.П. М.: Изд-во Минздрава СССР, 1976, 384 с.; 7. Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, с. 75-111]. Однако, бактериально-контаминированная плазма содержит в своем составе пирогены. Удаление пирогенов бактериальной природы требует дополнительных стадий очистки целевого белка [12. Зубкова Н. Б. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты. - 2014, №1, с. 4-10; 13. Исрафилов А.Г. и др. Опыт получения апирогенных препаратов // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 8-12 апреля 1997 г.: сборник «Человек и лекарство». Российский нац. конгр. (4; 1997; Москва). - М.: "ФАРМЕДИНФО", 1997. - с. 54].
Недостатком известных методов этанольного фракционирования является использование донорской стерильной плазмы и невозможность удаления бактериальных пирогенов из состава биопрепаратов на основе стандартных технологических процессов.
Рекомендуется использование риванола в технологии фракционирования плазмы (сыворотки) крови с учетом его бактериостатического действия [14. Zhurina N.A., Shatskaia Т.L., Katushkina N.V. The virological safety and bacterial sterility of a method for fractionating blood plasma proteins with rivanol // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993, 1: p. 45-48]. С аналогичных позиций обсуждается бактериостатический эффект сульфата аммония или каприловой кислоты в технологии производства фармацевтических биопрепаратов.
Недостатком известных схем фракционирования с использованием реагентов-материалов, обладающих бактерицидно-бактериостатическим эффектом, является невозможность их применения на самых первых этапах заготовки сырья и его первичной переработки.
Представлены материалы и методы физико-химической инактивации инфекционных агентов в составе полупродуктов плазмы. Пастеризация полупродуктов альбумина, других полупродуктов плазмы и концентратов физиологически активных белков и их модифицированных форм осуществляется за счет термической обработки в сухом и влажном вариантах [15. Colvin В.Т. Effect of dry heating of coagulation factor concentrates at 80°C for 72 hours on transmission of non-A, non-B hepatitis // Lancet. - 1988. - p. 814-816; 7. Русанов В.H., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, с. 211; 16. Brackmann Н.Н., Egli Н. Acute hepatitis В infection after treatment with heatinactivated factor VIII concentrate // Lancet, 1988, p. 967].
Недостатком известных методов является инактивация потенциально возможных инфекционных агентов в основном на заключительных стадиях технологического процесса производства фармацевтических биопрепаратов. Обеззараживающее воздействие на поздних стадиях техпроцесса обеспечивает накопление в составе полупродуктов бактериальных и вирусных антигенов, в т.ч. фрагментов распада бактериальных клеток с потенциально-возможным пирогенным эффектом.
Известны методы противовирусной обработки донорской плазмы с помощью псоралена в сочетании с облучением ультрафиолетом [17. Wages D., Smith D., Walsh J. et all. Virally inactivated fresh frozen plasma transfusion in normal volunteers // Vox Sang 1998; 74, Suppl 1: p. 1290].
Недостатком указанных методов является отсутствие сведений о бактерицидных эффектах, сопутствующих целенаправленным противовирусным воздействиям. Донорские кроводачи и производство индивидуальных образцов плазмы осуществляется в стерильных условиях, что исключает микробную контаминацию плазмы и клеточных компонентов крови.
Наиболее близким техническим решением для инактивации бактериальной микрофлоры в плазме или сыворотке крови является последовательное внесение 40% фенола в глицерине до его конечной концентрации (0,7±0,2)% и, далее, через 5 дней инкубирования фенолизированной плазмы, внесение сухого сульфата аммония [18. Патент RU №2338375. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов. Опубл. 20.11.2008 г. Бюл. №32] (прототип).
Недостаток известного метода состоит в хранении контаминированной микрофлорой плазмы в нестерильном помещении в процессе ее накопления до объема реакторной закладки по мере сепарирования контаминированных микрофлорой индивидуальных образцов крови. Только затем следует стадия инактивации за счет внесения 40% раствора фенола в глицерине, которая продолжается в течение 5 суток при охлаждении до температуры (10±1)°C. Далее в фенолизированную плазму вносят порошок сульфата аммония до концентрации 50% от насыщения. Например, для убойных пунктов крупных сельскохозяйственных животных, технологически адаптированных к обработке животных в течение 20-30 минут, производство бактериально-контаминированной плазмы крови составляет 15-10 литров в 1 час, т.е. производство бактериально-контаминированной плазмы до объема 150 литров осуществляется за 10-15 часов, в течение которых плазма хранится в плазмоприемнике, расположенном в нестерильных помещениях по месту заготовки крови и ее сепарирования. Еще более длительный процесс характерен для производства плазмы (сыворотки) из абортной, плацентарной крови человека или из трупной крови пушных зверей. В известном способе процесс инактивации бактериальной микрофлоры требует внесения концентрированного 40% раствора фенола в условиях охлаждения сырья до (10±1)°C и инкубирования фенолизированной плазмы в течение 5 суток. Последующее внесение сухого сульфата аммония ограничено концентрацией 50% от насыщения, которая превышает известную концентрацию 33% от насыщения и содействует осаждению белков из альбумин-трансферриновой фракции в состав гамма-глобулинов. Таким образом, инактивация бактериальной микрофлоры в сырьевой заготовке осуществляется только через 10-15 часов после получения плазмы (сыворотки) крови в нестерильных помещениях. Кроме того, бактерицидные условия достигаются за счет внесения в состав плазмы или сыворотки крови 40% раствора фенола, который обладает в указанной концентрации локальным белок-денатурирующим эффектом, а сам процесс экспозиции фенолизированной плазмы требует охлаждения до температуры (10±1)°C и продолжается в течение 5 суток. Последующее внесение сульфата аммония до концентрации 50% от насыщения определяется, также, созданием бактерицидно-бактериостатических условий, которые нарушают распределение белков плазмы (сыворотки) крови по фракциям гамма-глобулинов и альбуминов, под действием указанной концентрации сульфата аммония.
Задача изобретения состоит в создании способа инактивации микрофлоры за счет использования бактерицидно-фракционирующих свойств фенольно-сульфатных растворов, в которых инкубируются плазма или сыворотка крови по мере сепарирования индивидуальных или пулированных кроводач в нестерильных помещениях. За счет дробного внесения образцов плазмы или сыворотки крови осуществляется разведение фенольно-сульфатных растворов до конечных концентраций сульфата аммония 27% или 33% от насыщения (1,09 и 1,34 моль/л) и бактериостатических концентраций фенола до 0,3-0,4%.
Длительность инкубирования плазмы или сыворотки в фенольно-сульфатном растворе определяется интенсивностью сепарирования крови и изготовления индивидуальных или пулированных образцов. В промышленном варианте без изменений локализации целевых белков и белкового спектра нехроматографических фракций процесс загрузки сырья может продолжаться в течение 5-13 часов при интенсивности дробного разведения от 1,079 до 1,011 исходных концентратов фенольно-сульфатных растворов образцами плазмы или сыворотки с интервалом 10-30 минут по мере их изготовления сепарированием крови. В лабораторном варианте белковый спектр фракций и содержание целевых белков также носят постоянный характер при порционном либо одновременном внесении сырьевой заготовки. После отделения центрифугированием гамма-глобулинов в надосадочный раствор вносят сухой порошок сульфата аммония до концентрации 75% от насыщения (3,04 моль/л) и снижают рН до 4,6±0,1. После отделения осадка альбуминов в безбелковый центрифугат добавляют фенол до расчетной концентрации 1,0% и используют его для суспендирования осадков гамма-глобулинов (полуфабрикаты иммуноглобулиновых биопрепаратов) и осадков альбумина (полуфабрикаты альбуминовых биопрепаратов).
Поставленная задача решается за счет использования сульфатно-фенольных растворов, обладающих бактерицидно-бактериостатическим и фракционирующим свойствами. Для инкубирования образцов плазмы (сыворотки) крови исходно используется 80% или 100% от насыщения (3,24 или 4,05 моль/л) раствор сульфата аммония с (1,0±0,1)% фенола, который разбавляется до концентрации сульфата аммония 27% или 33% от насыщения (1,09 или 1,34 моль/л) и (0,35±0,05)% фенола за счет внесения образцов плазмы (сыворотки) по мере сепарирования крови. Альбуминовые фракции плазмы (сыворотки) крови осаждают за счет внесения сухого сульфата аммония до концентрации 75% от насыщения (3,04 моль/л) при остаточной концентрации фенола (0,35±0,05) % и доведения значения рН до 4,6±0,1. Для суспендирования осадков используется фенольно-сульфатный центрифугат, полученный после осаждения альбумина, в который вносят дополнительное количество фенола. Таким образом, в фенольно-сульфатных суспензиях полуфабрикатов биопрепаратов конечная концентрация фенола составляет (0,8±0,3)%, а сульфата аммония более 50% от насыщения (2,03 моль/л) в пределах 61-75% от насыщения.
Изложенный подход апробирован в лабораторном варианте для изготовления и хранения видовых заготовок плазмы (сыворотки) лабораторных животных объемом от 125 мл до 1250 мл и в промышленных условиях до объемов 125-250 литров плазмы (сыворотки) крови сельскохозяйственных животных и пушных зверей.
Из анализа уровня техники следует, что фенол в концентрациях 0,5-5% используется для дезактивации бактерий и вирусов [19. Avram N., Paunescu G.Н., Gradinary D. et al. La resistance du virus de la leucose bovine (VLB) a certains agents physiques et chimiques / Bull. Acad. Sc. Agr. Forest, 1980, 10, p. 205-209; 20. Европейская заявка №0281978 «Инактивирование вируса СПИД в содержащих белок растворах при помощи фенола». Опубликовано РЖ ИСМ 44-65-89; 21. Красильников А.П. «Справочник по антисептике», Минск: «Вышэйшая школа», 1995, с. 122-123]. Опубликованы также условия фракционирования белков плазмы (сыворотки) крови с помощью внесения насыщенных растворов сульфата аммония до необходимых концентраций в составе инкубационной среды [22. Suomela Н. An Ion Exchange Method for Immunoglobulin G production. In: Methods of Plasma Protein Fractionation / Ed. J.M. Curling. Academic Press, London, UK, 1980, p. 107-116; 23. Скоупс P.K. Методы очистки белков. M.: Мир, 1985, 358 с; 24. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. - Л.: Химия, 1991, 240 с.]. Традиционный способ фракционирования коллоидных растворов, сложных по составу индивидуальных белков, основан на капельно-струйном внесении насыщенного раствора сульфата аммония до его конечных концентраций в инкубационной среде, но не наоборот, когда насыщенный раствор сульфата аммония разбавляют до необходимой концентрации плазмой или сывороткой крови. В известном способе концентрированный (40%) раствор фенола, способный вызвать локальную денатурацию белка, вносят в состав плазмы или сыворотки крови. Снижение максимальной концентрации фенола в процессе заготовки до (1,0±0,1)% создает условия для исключения белок-денатурирующих эффектов, индуцированных высокой концентрацией дезинфектанта. После обработки фенолом в состав плазмы или сыворотки крови в известном способе вносят сухой порошок сульфата аммония до концентрации 50% от насыщения, что не позволяет в полной мере реализовать принципы фракционирования белков под действием сульфата аммония. Использование насыщенного раствора сульфата аммония с рН 7,0±0,1 и снижение концентрации фракционирующего реагента (сульфата аммония) до 33% или 27% от насыщения за счет разведения образцами плазмы или сыворотки позволяет достичь надлежащего уровня селективности фракционирования. В известном способе экспозиция фенолизированной плазмы осуществляется в течение 5 дней и температуре (10±1)°C. Однако, используемые концентрации фенола (0,7±0,2)% не оказывают существенного действия на активность протеаз и, как следствие этого, известное техническое решение обеспечивает в течение не менее 5 дней нежелательный фермент-индуцированный процесс гидролиза белков плазмы или сыворотки крови [18. Патент RU №2338375. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов. Опубл. 20.11.2008 г. Бюл. №32] (прототип).
На современном этапе развития науки и техники не известны использование фенольно-сульфатных растворов и их составы для инкубирования индивидуальных или пулированных образцов плазмы или сыворотки по мере их изготовления в нестерильных помещениях по месту заготовки и сепарирования крови с целью получения гамма-глобулиновой и альбуминовой фракций. При этом практически сразу же за счет использования высоких концентраций сульфата аммония ингибируется активность протеаз плазмы или сыворотки крови (см. Таблицы 1, 2, 3). Использование в исходном растворе концентрации сульфата аммония 100% от насыщения не позволяет примеси альбуминов из гамма-глобулиновой фракции (II класс вирусной опасности) переводить в альбуминовые полуфабрикаты (III класс вирусной опасности). При концентрации сульфата аммония 80% от насыщения в альбуминовой фракции (III класс вирусной опасности) регистрируются примеси IgG, которые по принципу «от чистого в грязное» возможно на последующих стадиях фракционирования переводить в состав полупродуктов иммуноглобулиновых биопрепаратов. В качестве примера (см. Фигура) приведен белковый спектр фракций гамма-глобулинов (1, 2) и альбумина (3, 4) и соответствующих полуфабрикатов, полученных из плазмы крови крупного рогатого скота, в условиях загрузки индивидуальных образцов в фенольно-сульфатные растворы при исходных концентрациях сульфата аммония 100% (2, 3) и 80% (1, 4) от насыщения. Последующее суспендирование осадков гамма-глобулинов и альбуминов в постальбуминовом центрифугате при концентрации сульфата аммония более 50% от насыщения и фенола (0,8±0,3)% обеспечивает ингибирование протеаз и инактивирование микрофлоры (см. Таблицы 3 и 4). Функциональную активность целевых белков оценивали по активности антител в составе иммуноглобулиновых полуфабрикатов после их хранения в течение 220 дней, в т.ч. при температуре (20±5)°C в течение 40 дней и (10±1)°C в течение 180 дней. Отсутствие достоверных различий в активности антител по результатам иммуноферментного анализа контрольных и опытных образцов свидетельствуют об отсутствии влияния схемы производства полуфабрикатов и состава консервирующего раствора на структуру-функцию IgG (см. Таблица 5). Очищенные формы IgG в электрофоретически гомогенной и хроматографически мономерной форме концентрировали до содержания белка 100 мг/мл, подвергали стерилизующей фильтрации и закладывали на хранение в течение 12 месяцев при температуре (5±3)°C. Наличие выявленных олигомеров в пределах до 5% и отсутствие фрагментированных форм IgG (см. Таблица 6) позволяет утверждать, что схема производства полуфабрикатов и условия их эксплуатации не влияют на структурные особенности видовых IgG, т.е. белков, наиболее склонных к олигомеризации, индуцированной качеством технологического процесса. В техническом решении изобретения реализован, также, энергосберегающий эффект. Не используются энергоемкие холодовые установки на всех стадиях производства полуфабрикатов, в т.ч. их хранение и транспортировка в течение 40 дней осуществляется без применения режима «холодовой цепи». Важно также, что процесс заготовки сырья по способу полуфабрикатов, организованный в отдаленных регионах России (на расстояниях транспортировки в течение 40 дней), обеспечивает распределение белков по фракциям, избирательно обогащенным IgG и альбумином. Последнее обстоятельство позволяет сортировать сырьевую заготовку по месту изготовления полуфабрикатов с целью определения допустимого уровня микробной контаминации и наличия вирусных геномов или антител к вирусспецифическим белкам с помощью непрямых схем иммуноферментного анализа или ПНР-диагностики. Возможность определения указанных выше показателей качества уже на стадии получения гамма-глобулиновой фракции является основанием для совершенствования приборно-методической базы внутризаводской системы контроля с целью обеспечения инфекционной безопасности при транспортировке полуфабрикатов и производстве на их основе фармацевтических биопрепаратов, целевые белки которых представлены конформационно нативными формами.
Пример реализации предлагаемого способа
Стадия 1. Подготовка бактерицидно-фракционирующего раствора. Готовят бактерицидно-фракционирующий раствор на основе 80% (3,24 моль/л) или 100% (4,05 моль/л) от насыщения раствора сульфата аммония с 1% фенолом. Для этого в лабораторном варианте в мерную колбу объемом 1000 мл набирают 500 мл дистиллированной воды с температурой 25-30°C, взвешивают 10 г кристаллического фенола и при перемешивании на магнитной мешалке растворяют навеску фенола в воде. После полного растворения фенола взвешивают сульфат аммония 427 г для 80%-насыщенного (3,24 моль/л) раствора или 534,0 г для 100%-насыщенного (4,05 моль/л) раствора и при перемешивании вышеуказанным способом добавляют порционно навеску сульфата аммония. Далее доводят уровень дистиллированной водой до 1000 мл в мерной колбе и продолжают перемешивание до полного растворения сульфата аммония. При уменьшении уровня раствора, его доводят до 1000 мл дистиллированной водой.
В промышленном варианте в емкость с мерником заливают 35 л дистиллированной воды с температурой 25-30°C. Взвешивают 630 г кристаллического фенола и добавляют в емкость с водой при перемешивании якорной мешалкой на скорости 60-70 об/мин. Перемешивание ведут до полного растворения фенола. После полного растворения фенола взвешивают сульфат аммония 26,9 кг для 80%-насышенного (3,24 моль/л) раствора или 33,6 кг для 100%-насыщенного (4,05 моль/л) раствора и при перемешивании вышеуказанным способом добавляют порционно навеску сульфата аммония. Далее доводят уровень дистиллированной водой до 63 л и продолжают перемешивание до полного растворения сульфата аммония. При уменьшении уровня раствора, его доводят до 63 л дистиллированной водой.
Стадия 2. Подведение значения рН бактерицидно-фракционирующего раствора. По окончании растворения отбирают в химический стакан объемом 25 мл 1 мл раствора и разводят 19 мл дистиллированной воды. Измеряют значение рН раствора на рН-метре типа Radelkis ОР-271/1. Затем титруют раствор 1М NaHCO3 до рН 7,0-7,5. Объем 1М NaHCO3, потребовавшийся на титрование, умножают на соотношение исходного объема и объема, взятого на титрование. Полученный объем 1М NaHCO3 при перемешивании вышеуказанным способом добавляют в инактивирующий раствор. Перемешивают 10 минут и контролируют рН ранее описанным способом.
Стадия 3. Контроль показателей качества бактерицидно-фракционирующего раствора. Приготовленный раствор контролируют по концентрации фенола и сульфата аммония в соответствии с известными методами [25. ГОСТ 31940-2012 - Вода питьевая. Методы определения содержания сульфатов; 26. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96 - Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям].
Стадия 4. Внесение или загрузка образцов плазмы в процессе сепарирования индивидуальных или объединенных кроводач. К бактерицидно-фракционирующему раствору приливают плазму (сыворотку) крови порционно или однократно (для целей лабораторных исследований), либо порционно в условиях промышленного производства.
В лабораторном варианте нами апробированы нижеследующие объемы: от 63 мл до 630 мл бактерицидно-фракционирующего раствора и от 125 мл до 1250 мл плазмы (сыворотки) крови. Плазму (сыворотку) крови вносят в бактерицидно-фракционирующий раствор порционно или одновременно при перемешивании на магнитной или механической мешалке и перемешивают дополнительно в течение 2 ч при температуре 18-25°C.
В промышленном варианте в реактор емкостью 200 л, наполненный 63 л бактерицидно-фракционирующего раствора, плазму (сыворотку) крови вносят порционно от 1 до 5 литров с интервалом 10 минут до конечного объема загруженной плазмы (сыворотки) - 125 л, при перемешивании якорной мешалкой на скорости 60-70 об/мин. Дополнительное время перемешивания после полного объема загрузки (125 л) плазмы (сыворотки) крови составляет 2 часа.
Стадия 5. Осаждение гамма-глобулиновой фракции. Суспензию подвергают центрифугированию в лабораторных условиях на центрифугах типа РС-6 при напряженности гравитационного поля 4200 g в течение 30 минут или в промышленном варианте с помощью промышленных центрифуг типа ОТР-1 при напряженности гравитационного поля 10000-16000 g при скорости потока 60 л/час.
При лабораторном фракционировании в состав гамма-глобулиновой фракции переходит 30-60% от общего белка плазмы (сыворотки) крови.
При промышленном фракционировании осадки гамма-глобулиновой фракции собирают, вес сырого осадка составляет 20-50 кг, а концентрация белка 50-200 г/кг осадка.
В надосадочном растворе альбуминовой фракции концентрация белка колеблется в пределах 20-50 мг/мл.
При промышленном фракционировании объем альбуминовой фракции составляет 130-160 литров.
Стадия 6. Получение осадка альбуминовой фракции. Осаждение альбуминовой фракции осуществляют внесением в надосадочный раствор сухого порошка сульфата аммония из расчета 250-290 г/л на 1 л раствора. Сульфат аммония добавляют порционно или одновременно при постоянном перемешивании. После растворения сульфата аммония значение рН инкубационной среды доводят до 4,6±0,1 с помощью 1 моль/л раствора соляной кислоты в соответствии с методикой, описанной выше. Время дополнительного перемешивания составляет 2 часа.
Суспензию центрифугируют в лабораторных условиях на центрифугах типа РС-6 при напряженности гравитационного поля 4200 g в течение 30 мин. В промышленном варианте используют проточные центрифуги типа ОТР-1, при скорости потока 60 л/час и напряженности гравитационного поля 10000-16000 g.
В лабораторном варианте масса осадков значения не имеет. При промышленном фракционировании вес осадков составляет 20-50 кг, а концентрация белка 40-150 г/кг сырого осадка.
Стадия 7. Приготовление консервирующего раствора из надосадочной жидкости, полученной после осаждения белков альбуминовой фракции (постальбуминовый центрифугат). В надосадочном растворе концентрация белка не должна превышать 1 мг/мл.
Для приготовления консервирующего раствора к раствору центрифугата (постальбуминовый центрифугат) добавляют необходимое количество 40% раствора фенола в глицерине до конечной концентрации 1,0%. Далее раствор перемешивают в течение 30 минут. Затем значение рН инкубационной среды доводят до 6,0±0,1 с помощью 1 моль/л раствора гидроксида натрия в соответствии с методикой, описанной выше.
Стадия 8. Приготовление полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов. Сырые осадки гамма-глобулина и альбумина суспендируют в консервирующем растворе из расчета на 1 весовую часть сырого осадка добавляют 2 объема консервирующего раствора и перемешивают в течение 2 часов до образования однородной суспензии.
Информация, использованная при подготовке заявки на патент
1. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №.924, 2004, p. 151-219;
2. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор). // Хим.-фарм. журнал. 2004, т. 38, №3, с. 39-47;
3. Horowitz В. Investigations into the application of tri(n-butyl)phosphate/detergent mixtures to blood derivatives. Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, 1989, p. 83-96;
4. Kao K.J. Effects of leukocyte depletion and UVB irradiation on allogenecity of major histocompatibility antigens in platelet concentrates: a comparative study // Blood, 1992, p. 2931-2937;
5. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №924, 2004, p. 151-219;
6. Сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» под редакцией Буренкова С.П. М: Изд-во Минздрава СССР, 1976, с. 203-218;
7. Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, с. 49-83;
8. Руководство по организации, обслуживанию и использованию оборудования холодовой цепи для крови. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2009 г., с. 8-9;
9. Жибурт Е.Б. «Трансфузиология: учебник». СПб: Питер, 2002, 736 с.;
10. Патент RU №2151617, А61М 1/38, опубл. 27.06.2000;
11. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48;
12. 3убкова Н.Б. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты. - 2014, №1, с. 4-10;
13. Исрафилов А.Г. и др. Опыт получения апирогенных препаратов // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 8-12 апреля 1997 г.: сборник «Человек и лекарство». Российский нац. конгр. (4; 1997; Москва). - М.: "ФАРМЕДИНФО", 1997. - с. 54;
14. Zhurina N.A., Shatskaia Т.L., Katushkina N.V. The virological safety and bacterial sterility of a method for fractionating blood plasma proteins with rivanol // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993, 1: p.45-48;
15. Colvin В.T. Effect of dry heating of coagulation factor concentrates at 80°C for 72 hours on transmission of non-A, non-B hepatitis // Lancet. - 1988. - p. 814-816;
16. Brackmann H.H., Egli H. Acute hepatitis В infection after treatment with heatinactivated factor VIII concentrate // Lancet, 1988, p. 967;
17. Wages D., Smith D., Walsh J. et all. Virally inactivated fresh frozen plasma transfusion in normal volunteers // Vox Sang 1998; 74, Suppl 1: p. 1290;
18. Патент RU №2338375. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов. Опубл. 20.11.2008 г. Бюл. №32 (прототип);
19. Avram N., Paunescu G.Н., Gradinary D. et al. La resistance du virus de la leucose bovine (VLB) a certains agents physiques et chimiques / Bull. Acad. Sc. Agr. Forest, 1980, 10, p. 205-209;
20. Европейская заявка №0281978 «Инактивирование вируса СПИД в содержащих белок растворах при помощи фенола». Опубликовано РЖ ИСМ 44-65-89;
21. Красильников А.П. «Справочник по антисептике», Минск: «Вышэйшая школа», 1995, с. 122-123;
22. Suomela Н. An Ion Exchange Method for Immunoglobulin G production. In: Methods of Plasma Protein Fractionation / Ed. J.M. Curling. Academic Press, London, UK, 1980, p. 107-116;
23. Скоупс P.К. Методы очистки белков. M.: Мир, 1985, 358 с.;
24. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. - Л.: Химия, 1991, 240 с.;
25. ГОСТ 31940-2012 - Вода питьевая. Методы определения содержания сульфатов;
26. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96 - Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям.
Примечание: М - средняя арифметическая; ±m - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; n=5; К - контрольные образцы готовили, отбирая часть из сырых осадков γ-глобулиновой фракции плазмы крови, формирующейся при конечных концентрациях сульфата аммония и фенола, соответственно 33% от насыщения и 0,3%. Осадки суспендировали (вес/объем) в 9 объемах раствора сульфата аммония 50% от насыщения, рН (7,0±0,1) и помещали на хранение при температуре (5±3)°C. О - полуфабрикаты (опытные образцы), представлены теми же γ-глобулиновыми фракциями, которые суспендировали в фенольно-сульфатных растворах (конечные концентрации сульфата аммония - 50% от насыщения и фенола - 1±0,1%) в соотношении (вес/объем) 1:2 при рН (7,0±0,1) и хранили в течение 40 дней при температуре (15-25)°C и далее 180 дней при температуре (10±1)°C.
В контрольных и опытных образцах, представленных растворами γ-глобулинов или IgG, выделенных из их состава по ранее опубликованной методике («Прикладная биохимия и биотехнология», 2009, том 45, №3, с. 378-383), определяли активность антител. Общую концентрацию белка в исследуемых образцах устанавливали в пределах (15±1) мг/мл. Анализ выполняли в соответствии с инструктивно-методическими указаниями для иммуноферментного выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (Veri Test, ООО «Ветбиохим»), вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ-Серотест, ООО «Ветбиохим») и иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита (Векто ВКЭ-IgG, ЗАО «Вектор-Бест»). О сохранности активности антител судили по величине оптической плотности контрольных и опытных образцов при разведении их в 26 раз «Veri Test» или в 100 раз «ИРТ-Серотест» и «Векто ВКЭ-IgG». Отсутствие достоверных различий в величинах ОП между контрольными и опытными образцами свидетельствует о сохранности функциональной активности антител из класса IgG в составе полуфабрикатов при концентрации фенола (1±0,1) % и концентрации сульфата аммония в пределах 50-75% от насыщения в течение 220 дней хранения, в т.ч. в течение 40 дней при температуре (20±5)°C.
n (количество экспериментов)=3, ЛКРС - лейкоз крупного рогатого скота, ИРТ - инфекционный ринотрахеит, КЭ - клещевой энцефалит.
Уровень олигомеризации IgG определяли следующим образом. Исходно получали фенольно-сульфатный полуфабрикат согласно описанной методике в настоящем патенте. Далее, после удаления сульфат ионов (патент №2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов»), из полученных полуфабрикатов выделяли электрофоретически гомогенные и хроматографически мономерные образцы IgG (Прикладная биохимия и биотехнология», 2009, том 45, №3, с. 378-383). Полученные образцы IgG концентрировали до 100 мг/мл, вносили стабилизатор и подвергали стерилизующей фильтрации, далее отбирали контрольные образцы и оставляли их на хранение при температуре (5±3)°С в течение 12 мес. Уровень олигомеризации IgG определяли в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям», с. 25.
Claims (4)
1. Способ заготовки и сепарирования крови для получения гамма-глобулиновой и альбуминовой фракций плазмы крови с помощью химических дезинфектантов, отличающийся тем, что по месту заготовки нестерильных кроводач и сепарирования крови в нестерильных условиях используют растворы сульфата аммония 80% или 100% от насыщения с 1% (м/о) фенолом, обладающие бактерицидно-бактериостатическим действием, производят в них инкубирование образцов плазмы или сыворотки по мере сепарирования индивидуальных кроводач, далее отделяют центрифугированием гамма-глобулиновую фракцию, в надосадочный раствор вносят сухой порошок сульфата аммония до концентрации 75% от насыщения и снижают значение рН до 4,6, после отделения альбуминовой фракции в постальбуминовый безбелковый центрифугат добавляют фенол до расчетной концентрации 1% (м/о), который используют в качестве консервирующего раствора при суспендировании осадков гамма-глобулинов и альбуминов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс заготовки и сепарирования крови совмещен по времени и месту с инактивацией контаминирующей микрофлоры в составе плазмы или сыворотки по мере их изготовления.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки сразу же, по мере их изготовления сепарированием крови, вносят в раствор, в котором максимальная концентрация фенола составляет 1,0±0,1% (м/о), позволяющая исключить белок-денатурирующий эффект дезинфектанта.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки сразу же, по мере их изготовления сепарированием крови, вносят в раствор, в котором концентрация сульфата аммония исходно составляет 100% или 80% от насыщения для ингибирования протеазной активности, что особо значимо при заготовке гемолизной крови.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132955A RU2703537C2 (ru) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132955A RU2703537C2 (ru) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016132955A RU2016132955A (ru) | 2018-02-14 |
| RU2016132955A3 RU2016132955A3 (ru) | 2018-06-29 |
| RU2703537C2 true RU2703537C2 (ru) | 2019-10-21 |
Family
ID=61227564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016132955A RU2703537C2 (ru) | 2016-08-09 | 2016-08-09 | Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2703537C2 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU301158A1 (ru) * | А. Е. Киселев, А. А. Фром, А. А. Никитенко , В. М. Русанов Центральный ордена Ленина институт гематологии , переливани | Способ приготовления альбумина | ||
| RU2007423C1 (ru) * | 1991-06-04 | 1994-02-15 | Институт биофизики клетки РАН | Способ очистки сывороточного альбумина |
| RU2122863C1 (ru) * | 1996-09-26 | 1998-12-10 | Институт ревматологии РАМН | Способ получения иммунорегуляторного глобулина |
| EA000757B1 (ru) * | 1996-03-08 | 2000-04-24 | Си Эс Эл ЛИМИТЕД | Разделение компонентов плазмы крови с помощью фильтрующих средств на основе целлюлозы |
| RU2338375C2 (ru) * | 2006-09-04 | 2008-11-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Удмуртский государственный университет" | Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов |
-
2016
- 2016-08-09 RU RU2016132955A patent/RU2703537C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU301158A1 (ru) * | А. Е. Киселев, А. А. Фром, А. А. Никитенко , В. М. Русанов Центральный ордена Ленина институт гематологии , переливани | Способ приготовления альбумина | ||
| RU2007423C1 (ru) * | 1991-06-04 | 1994-02-15 | Институт биофизики клетки РАН | Способ очистки сывороточного альбумина |
| EA000757B1 (ru) * | 1996-03-08 | 2000-04-24 | Си Эс Эл ЛИМИТЕД | Разделение компонентов плазмы крови с помощью фильтрующих средств на основе целлюлозы |
| RU2122863C1 (ru) * | 1996-09-26 | 1998-12-10 | Институт ревматологии РАМН | Способ получения иммунорегуляторного глобулина |
| RU2338375C2 (ru) * | 2006-09-04 | 2008-11-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Удмуртский государственный университет" | Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016132955A3 (ru) | 2018-06-29 |
| RU2016132955A (ru) | 2018-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4370264A (en) | Method for the cold sterilization of preparations containing blood coagulation factor VIII | |
| JP5178518B2 (ja) | 超高収率静注免疫グロブリン製剤 | |
| JP2000511519A (ja) | 生物学的製品の最終滅菌法 | |
| Lowenhaupt et al. | Pletelet Accumulation observed by Electron Microscopy in the Early Phase of Renal Allotransplant Rejection | |
| ES2836131T3 (es) | Procedimiento de esterilización de un lisado de plaquetas | |
| US7879332B2 (en) | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
| Castro et al. | Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gamma dose for prevention of transfusion‐associated graft‐versus‐host disease | |
| Terpstra et al. | Potential and limitation of UVC irradiation for the inactivation of pathogens in platelet concentrates | |
| Rightsel et al. | Tissue-culture cultivation of cytopathogenic agents from patients with clinical hepatitis | |
| SE528214C2 (sv) | Förfarande för framställning av blodplättslysat | |
| US8293242B2 (en) | Ultra-high yield of alpha-1-anti-trypsin | |
| US20240024459A1 (en) | Method for producing an antigen corresponding to the inactivated sars-cov-2 virus, antigen corresponding to the inactivated sars-cov-2 virus, antigenic composition, kits, and uses thereof | |
| RU2703537C2 (ru) | Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека | |
| MX2013008365A (es) | Inactivacion viral por caprilato. | |
| JP2002525131A (ja) | 生物学的組成物においてウイルスを選択的に不活化する方法 | |
| AU2006231531A1 (en) | Methods and precipitating reagents for isolating proteins from proteinaceous material | |
| RU2338375C2 (ru) | Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов | |
| Werz et al. | Strategies to avoid virus transmissions by biopharmaceutic products | |
| US6881573B2 (en) | Augmented solvent/detergent method for inactivating enveloped and non-enveloped viruses | |
| RU2696480C1 (ru) | Способ производства гамма-глобулинового полуфабриката с повышенным содержанием противовирусных антител из боенской крови вакцинированных коров | |
| JP2003513052A (ja) | 病原体を不活性化する方法 | |
| US4490357A (en) | Simplified in-vitro interferon production | |
| Shultz et al. | Cytotoxicity of rabbit blood for Listeria monocytogenes | |
| JP4132151B2 (ja) | プリオンの不活化方法 | |
| Czuprynski et al. | Killing of Listeria monocytogens by conventional and germfree rat sera |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190923 |