[go: up one dir, main page]

EA038367B1 - АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА (TfR) И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ - Google Patents

АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА (TfR) И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Download PDF

Info

Publication number
EA038367B1
EA038367B1 EA201592213A EA201592213A EA038367B1 EA 038367 B1 EA038367 B1 EA 038367B1 EA 201592213 A EA201592213 A EA 201592213A EA 201592213 A EA201592213 A EA 201592213A EA 038367 B1 EA038367 B1 EA 038367B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
tfr
antibody fragment
antibodies
amino acid
Prior art date
Application number
EA201592213A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201592213A1 (ru
Inventor
Инь Чжан
Джой Ю Зучеро
Джасвиндер Этвол
Джессика Коуч
Марк ДЕННИС
Джеймс Эрнст
Райан Уоттс
Грегори А. Лазар
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Publication of EA201592213A1 publication Critical patent/EA201592213A1/ru
Publication of EA038367B1 publication Critical patent/EA038367B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антителам против рецептора трансферрина. Кроме того, изобретение относится к получению указанного антитела, а именно к нуклеиновой кислоте, кодирующей его, и клетке-хозяину, содержащей указанную нуклеиновую кислоту. Описана фармацевтическая композиция для лечения неврологического расстройства, содержащая указанное антитело, а также его применения для лечения неврологического расстройства, переноса связанного с ним соединения через гематоэнцефалический барьер, в способе увеличения экспонирования CNS субъекта для соединения, в способе увеличения удерживания соединения в CNS.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам антирецептор трансферрина и к способам их использования.
Родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет временной заявки на патент США № 61/825477, поданной 20 мая 2013 г., которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.
Список последовательностей
Список последовательностей подается параллельно с описанием в качестве текстового файла в формате ASCII через EFS-Web, с именем файла P5641Rl-WO_SL.txt, время создания 16 мая 2014 г. и размер 154599 байт. Список последовательностей, поданный через EFS-Web, представляет собой часть описания и тем самым включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.
Уровень техники
Проникновение в головной мозг больших молекул лекарственных средств сильно ограничено посредством в основном непроницаемого гематоэнцефалического барьера (BBB). Среди многих стратегий для преодоления этого препятствия необходимо использовать пути трансцитоза эндогенных рецепторов, экспрессируемых в капиллярном эндотелии головного мозга. Конструируются рекомбинантные белки, такие как моноклональные антитела для этих рецепторов, чтобы сделать возможной опосредуемую рецепторами доставку больших молекул в головной мозг. Стратегии доведения до максимума потребления головного мозга, при этом сводя к минимуму обратный трансцитоз обратно в кровь, а также доведения до максимума степени аккумуляции после дозирования терапевтического препарата, осуществляются с помощью таких данных, что антитела с низким сродством к рецепторам BBB предлагают потенциальную возможность существенного увеличения переноса через BBB и удерживания в CNS (центральной нервной системе) ассоциированных терапевтических остатков/молекул, по сравнению с типичными антителами с высоким сродством к таким рецепторам (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011:Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44). Однако эти антитела не связываются специфично с TfR человека и приматов.
Сущность изобретения
Моноклональные антитела имеют огромный терапевтический потенциал для лечения неврологических заболеваний или заболеваний центральной нервной системы (CNS), но их прохождение в головной мозг ограничено гематоэнцефалическим барьером (BBB). В прошлом исследования показали, что очень малый процент (приблизительно 0,1%) IgG, циркулирующих в кровотоке, проходят через BBB в CNS (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52:1158-1164 (1974)), при этом концентрация антител в CNS может быть недостаточной, чтобы сделать возможным устойчивое воздействие. Ранее было обнаружено, что процент антител, которые распределяются в CNS, мог бы быть улучшен с использованием рецепторов BBB (т.е. рецептора трансферрина, рецептор инсулина и т.п.) (см., например, WO 9502421). Например, антитело антирецептор BBB может быть сделано мультиспецифичным для нацеливания на один или несколько желаемых антигенов CNS, или одна или несколько гетерологичных молекул могут связываться с антителом антирецептор BBB, в любом случае, антитело антирецептор BBB может помочь в доставке терапевтической молекулы в CNS через BBB.
Однако нацеливание на рецептор BBB традиционного специфичного антитела с высоким сродством, как правило, дает в результате ограниченное увеличение переноса через BBB. Позже авторы обнаружили, что величина потребления антитела и распределение антител в CNS среди исследуемых антител антирецептор BBB обратно пропорциональна его сродству связывания с рецептором BBB. Например, антитело с низким сродством к рецептору трансферрина (TfR), дозируемое при терапевтических уровнях дозы, сильно улучшает перенос через BBB и удерживание в CNS антитела анти-TfR по отношению к антителу анти-TfR с более высоким сродством и делает возможным более легкое получение терапевтических концентраций в CNS (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011)). Доказательство такого переноса через BBB достигают с использованием биспецифичного антитела, которое связывает как TfR, так и фермент, расщепляющий белок-предшественник амилоида (APP), β-секретазу (BACE1). Одна системная доза биспецифичного антитела анти-TfR/BACE1, полученного с помощью генной инженерии с использованием методологии этого изобретения, не только дает в результате значительное потребление антитела в головном мозге, но также кардинально понижает уровни Ae40 в головном мозге по сравнению с одним только моноспецифичным анти-BACE1, говоря о том, что проницаемость BBB зависит от сильнодействия αнτu-BACE1 (Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra44 (2011)).
Эти данные и эксперименты освещают несколько возможных механизмов, стоящих за увеличением потребления антитела в CNS, с использованием подхода с антителами с более низким сродством. Вопервых, антитела антирецептор BBB (BBB-R) с высоким сродством (например, анти-TfRA из Atwal et al. and Yu et al., выше) ограничивают потребление в головном мозге из-за быстрого насыщения BBB-R в сосудистой системе головного мозга, уменьшая, таким образом, общее количество антитела, потребляемого в головном мозге, а также ограничивая его распределение в сосудистой системе. Строго говоря,
- 1 038367 понижения сродства к BBB-R улучшает потребление и распределение в головном мозге, с устойчивым сдвигом, наблюдаемым при локализации от сосудистой системы к нейронам и ассоциированным нейропилям, распределенным в CNS. Во-вторых, более низкое сродство антител к BBB-R, как предполагается, ослабляет способность антитела к возвращению на сосудистую сторону BBB с помощью BBB-R со стороны CNS мембраны, поскольку общее сродство антитела к BBB-R является низким и локальная концентрация антитела на стороне CNS BBB является ненасыщающей из-за быстрого диспергирования антитела в отделе CNS. В-третьих, in vivo, и как наблюдается для системы TfR, антитела с более низким сродством к BBB-R не выводятся из системы так же эффективно, как и антитела с более высоким сродством к BBB-R, и таким образом, они остаются при более высоких циркулирующих концентрациях, чем их аналоги с более высоким сродством. Это является преимущественным, поскольку уровни циркулирующих антител поддерживаются при терапевтических уровнях в течение более продолжительного периода времени для антитела с более низким сродством, чем для антитела с более высоким сродством, что, как следствие, улучшает потребление антитела в головном мозге в течение более продолжительного периода времени. Кроме того, это улучшение экспонирования как для плазмы крови, так и для головного мозга, может уменьшить частоту дозирования в клинике, что имело бы потенциальное преимущество не только для восприимчивости и удобства пациента, но также и для облегчения любых возможных побочных воздействий или нецелевых воздействий антитела и/или терапевтического соединения, связанного с ним.
Антитела BBB-R с низким сродством, описанные в упоминаемой выше работе, выбирают/получают с помощью генной инженерии, чтобы исключить отрицательное влияние на естественное связывание между трансферрином и TfR и, таким образом, устранить потенциальные побочные воздействия, связанные с переносом железа. Тем не менее, при введении определенных таких антител мышам наблюдаются некоторые заметные побочные воздействия. Мыши демонстрируют первичную реакцию устойчивого обеднения популяции ретикулоцитов, сопровождаемую быстрым наступлением острых клинических симптомов. Хотя мыши восстанавливаются как после острых клинических симптомов, так и после уменьшения уровней ретикулоцитов, по ходу дела, устранение или иное ослабление этого влияния на ретикулоциты является, очевидно, желательным для антитела анти-TfR, чтобы его можно было использовать безопасно в качестве терапевтической молекулы. Обнаружено, что первичная реакция на введение анти-TfR (устойчивое обеднение ретикулоцитов и острые клинические признаки) вызывается по большей части активностью антитело-зависимой опосредуемой клетками цитотоксичности (ADCC) антитела, при этом остаточное воздействие обеднения ретикулоцитов опосредуется с помощью пути комплемента.
Эти предыдущие исследования использовали антитела мыши, которые специфично связываются с TfR мыши, но которые не распознают специфично TfR приматов или человека.
Соответственно, настоящее изобретение предлагает антитела и их функциональные части, которые распознают специфично TfR как приматов, так и человека, чтобы упростить исследования безопасности и эффективности на приматах с помощью антител перед терапевтическим или диагностическим применением на людях. Исследования in vitro с использованием линии клеток эритробластов человека и первичных клеток костного мозга, обработанных антителами анти-TfR человека, по настоящему изобретению демонстрирует, что устойчивое обеднение TfR-положительных эритроидных клеток может так же наблюдаться в клеточных системах человека/приматов, как и на мышах (см., например, пример 4).
Соответственно, в настоящем документе предлагаются также модификации антител по настоящему изобретению для значительного понижения или устранения нежелательного уменьшения популяции Tfэкспрессирующих ретикулоцитов при введении антител анти-TfR, при этом по-прежнему делая возможным увеличение переноса через BBB, увеличение распределения в CNS и удерживания в CNS, обеспечиваемого антителами анти-TfR человека/приматов, введенных при терапевтических концентрациях. В настоящем документе предлагаются несколько общих подходов для ослабления наблюдаемого воздействия антител анти-TfR по настоящему изобретению как на первичное, так и на остаточное обеднение ретикулоцитов, и они могут использоваться по отдельности или в сочетании.
В одном из подходов эффекторная функция антитела анти-TfR человека/цино (обезьян циномолгус) уменьшается или устраняется для уменьшения или устранения активности ADCC. В другом подходе сродство антитела анти-TfR человека/цино к TfR человека или приматов дополнительно уменьшается таким образом, что взаимодействия антитела с популяцией ретикулоцитов являются менее вредными для этой популяции. Третий подход направлен на уменьшение количества антитела анти-TfR человека/цино, которое присутствует в плазме крови, для уменьшения экспонирования популяции ретикулоцитов для потенциально вредных концентраций антитела. Четвертый подход пытается защитить, стабилизировать и/или восполнить популяции ретикулоцитов таким образом, что любое потенциальное обеднение популяции ретикулоцитов в циркуляции или в костном мозге посредством введения антитела анти-TfR человека/цино предотвращается, уменьшается или ослабляется.
Уменьшение или устранение эффекторной функции, как описано в настоящем документе, может осуществляться посредством: (i) уменьшения или устранения гликозилирования антитела млекопитающих дикого типа (например, посредством продуцирования антитела в окружающей среде, где такое гликозилирование не может осуществляться, посредством мутации в одной или нескольких точках присоединения углеводов таким образом, что антитело не может гликозилироваться, или посредством химиче
- 2 038367 ского или ферментативного удаления одного или нескольких углеводов из антитела после того, как оно гликозилируется); (ii) посредством уменьшения или устранения способности антитела анти-TfR человека/цино к связыванию с Fc рецептором (например, посредством мутации Fc области, посредством делеции в Fc области или устранения Fc области); или (iii) посредством использования изотипа антитела, о котором известно, что оно имеет минимальную эффекторную функцию или не имеет ее (т.е. включая, но не ограничиваясь этим, IgG4).
Уменьшение активирования комплемента антителом, как описано в настоящем документе, может осуществляться посредством уменьшения или устранения способности антитела анти-TfR человека/цино к связыванию C1q (например, посредством мутации, делеции в Fc области или устранения Fc области, или посредством модификации части антитела анти-TfR человека/цино иной, чем Fc часть), или посредством подавления иным образом активирования или активности системы комплемента (например, посредством совместного введения одного или нескольких ингибиторов активирования пути комплемента или активности пути комплемента).
При связывании антитела анти-TfR человека/цино с TfR человека или цино на ретикулоцитах или на других типах клеток, экспрессирующих высокие уровни TfR, запускается их обеднение, как для антител анти-TfR человека/цино, иллюстрируемых в настоящем документе, уменьшение связывания антител с TfR человека или цино на ретикулоцитах или на других типах клеток должно, в свою очередь, уменьшить величину обеднения ретикулоцитов или других типов клеток в циркуляции или в костном мозге, наблюдаемую при введении антитела. Сродство антитела анти-TfR человека/цино к TfR приматов или человека может модифицироваться с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе, и как показано в примерах.
Уменьшение количества антитела анти-TfR человека/цино, присутствующего в плазме крови, для уменьшения экспонирования популяции ретикулоцитов для потенциально вредных концентраций антитела, может осуществляться несколькими способами. Один из способов заключается просто в уменьшении количества антитела, которое дозируется, потенциально, в это же время увеличивая также частоту дозирования, так что максимальная концентрация в плазме понижается, но поддерживается уровень в сыворотке, достаточный для эффективности, в то же время по-прежнему находящийся ниже порога побочного воздействия обеднения клеток. Другой способ, который может объединяться с модификациями дозирования, заключается в выборе или получении с помощью генной инженерии антитела анти-TfR, которое имеет pH-чувствительное связывание с TfR, так что оно связывается с TfR на поверхности клеток в плазме крови при pH 7,4 при желательном низком сродстве, как описано в настоящем документе, но при интернализации в эндосомальном компартменте, такое связывание с TfR быстро и значительно уменьшается при относительно более низком pH этого компартмента (pH 5,5-6,0). Такая диссоциация может защитить антитело от выведения, опосредуемого антигеном, или повысить количество антитела, которое либо доставляется в CNS, либо рециклируется обратно через BBB - в любом случае, эффективная концентрация антитела увеличивается по сравнению с антителом анти-TfR, которое не имеет такой pH-чувствительности, без увеличения вводимой дозы антитела, и в свою очередь, потенциально позволяет понизить дозу антитела при одновременном понижении риска побочных воздействий.
Защита, стабилизация и/или восполнение популяции ретикулоцитов может осуществляться с использованием фармацевтических или физических способов. В дополнение к антителу анти-TfR человека/цино совместно с ним может вводиться по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент (одновременно или последовательно), который ослабляет отрицательные побочные воздействия антитела на популяции ретикулоцитов. Примеры таких терапевтических агентов включают, но не ограничиваясь этим, эритропоэтин (EPO), добавки, содержащие железо, витамин C, фолиевую кислоту и витамин B12. Физическая замена эритроцитов (т.е. ретикулоцитов) является также возможной, например, посредством трансфузии с помощью сходных клеток, которые могут происходить от другого индивидуума со сходным типом крови или могут предварительно извлекаться из субъекта, которому вводили антитело анти-TfR человека/цино.
Специалист в данной области увидит, что любое сочетание упомянутых выше способов можно использовать для получения с помощью генной инженерии антитела (и/или режима его дозирования) с оптимальным балансом между (i) желательным низким сродством к TfR приматов или человека, которое будет доводить до максимума перенос антитела и любых конъюгированных соединений в CNS; (ii) сродством конъюгированного соединения (включая в качестве неограничивающего примера, вторую или дополнительную специфичность связывания антигена у антитела анти-TfR человека/цино) к его антигену в CNS, поскольку это важно для того количества соединения, которое должно присутствовать в CNS для получения терапевтического воздействия; (iii) скоростью выведения антитела анти-TfR человека/цино; (iv) лабильностью анти-TfR/конъюгированного соединения при низких pH для облегчения высвобождения конъюгированного соединения на стороне CNS/головного мозга BBB и (v) влиянием на популяции ретикулоцитов.
Также будет ясно, что воздействие обеднения ретикулоцитов, наблюдаемое в настоящем документе, для введения антитела анти-TfR, может быть полезным при лечении любого заболевания или расстройства, где проблема заключается в сверхпролиферации ретикулоцитов. Например, при врожденной поли
- 3 038367 цитемии или при истинной неопластической полицитемии, повышенные количества эритроцитов из-за гиперпролиферации, например, ретикулоцитов, дают в результате загущение крови и сопутствующие физиологические симптомы. Введение антитела анти-TfR человека/цино по настоящему изобретению, где эффекторная функция антитела консервируется, по меньшей мере частично, сделало бы возможным селективное удаление популяции незрелых ретикулоцитов без влияния на нормальный перенос трансферрина в CNS. Дозирование такого антитела может модулироваться таким образом, что острые клинические симптомы могли бы сводиться к минимуму (например, посредством дозирования при очень низкой дозе или через большие временные интервалы), как хорошо понимают в данной области.
Антитела αнти-TfR/BACE1 и анти-TfR/Ae, каждое, представляют собой обещающие и новые терапевтические кандидаты для лечения болезни Альцгеймера. Кроме того, технология биспецифичного нацеливания на основе переноса, опосредуемого рецепторами (RMT), открывает дверь для широкого диапазона потенциальных терапевтических препаратов против заболеваний CNS. Настоящее изобретение предлагает способы получения с помощью генной инженерии терапевтических препаратов, проникающих через BBB, которые значительно улучшают перенос через BBB и распределение в CNS терапевтических препаратов без обеднения ретикулоцитов.
Соответственно, в первом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает изолированное антитело, которое связывается с рецептором трансферрина человека (TfR) и TfR приматов, где антитело не ингибирует связывания трансферрина с TfR. В одном из аспектов связывание представляет собой специфичное связывание. В другом аспекте антитело, кроме того, не ингибирует связывания белка гемахроматоза человека (HFE) с TfR. В одном из аспектов связывание представляет собой специфичное связывание. В одном из аспектов антитело представляет собой моноклональное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой антитело человека. В другом аспекте антитело представляет собой гуманизированное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой химерное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывает TfR человека и TfR приматов. В другом аспекте TfR приматов происходит от обезьян циномолгус.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления антитело содержит HVR-L1, HVRL2 и HVR-L3, соответственно, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO: 50, 51 и 52 и HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 соответственно, содержащие последовательности аминокислот SEQ ID NO: 53, 156 и 55. В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления антитело содержит (a) последовательность VH, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательностей аминокислот с SEQ ID NO: 153; (b) последовательность VL, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательностей аминокислот с SEQ ID NO: 105; или (c) последовательность VH как в (a) и последовательность VL как в (b). В другом таком аспекте антитело содержит последовательность VL, SEQ ID NO: 105 и последовательность VH, SEQ ID NO: 153. В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления антитело связано с терапевтическим соединением. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления антитело связано с агентом для получения изображений или меткой. В одном из таких аспектов антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, и терапевтическое соединение необязательно образует одну из частей мультиспецифичного антитела. В одном из таких аспектов мультиспецифичное антитело содержит первый сайт связывания антигена, который связывает TfR, и второй сайт связывания антигена, который связывает антиген головного мозга. В одном из таких аспектов, антиген головного мозга выбирается из группы, состоящей из β-секретазы 1 (BACE1), Λβ, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), тау, аполипопротеина E (ApoE), α-синуклеина, CD20, хантингтина, прионного белка (PrP), обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), паркина, презенилина 1, презенилина 2, γ-секретазы, репептора гибели 6 (DR6), белка предшественника амилоида (APP), рецептора p75 нейротрофина (p75NTR) и каспазы 6. В другом таком аспекте мультиспецифичное антитело связывается как TfR, так и с BACE1. В другом таком аспекте мультиспецифичное антитело связывается как с TfR, так и с Λβ. В другом таком аспекте терапевтическое соединение представляет собой лекарственное средство против неврологического расстройства.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из упомянутых выше антител. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает клетку хозяина, содержащую такую нуклеиновую кислоту. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ продуцирования любого из упомянутых выше антител, включающий культивирование такой клетки хозяина, что продуцируется антитело, и необязательно дополнительно включающий извлечение антитела из клетки хозяина.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает фармацевтический препарат, содержащий любое из упомянутых выше антител и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения в качестве лекарственного препарата. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает применение любого
- 4 038367 из упомянутых выше антител при производстве лекарственного препарата для лечения неврологического расстройства. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения при лечении неврологического расстройства. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения при переносе одного или нескольких соединений через BBB. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления предлагается применение любого из упомянутых выше антител при производстве лекарственного препарата для переноса одного или нескольких соединений через BBB.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ переноса соединения через BBB субъекта, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что антитело переносит соединение, связанное с ним, через BBB. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антител, для которой экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте, способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов, терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозирования, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления предлагается способ увеличения экспонирования CNS субъекта для соединения, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что антитело переносит соединение, связанное с ним, через BBB. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту человеку. В другом таком аспекте, величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfRнасыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ повышения удержания в CNS соединения, вводимого субъекту, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что удерживание соединения в CNS увеличивается. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ лечения неврологического расстройства у млекопитающего, включающий лечение млекопитающего с помощью любого из упомянутых выше антител. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS. В другом таком аспекте неврологическое расстройство относится к субъекту человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрация антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте, способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает изолированное антитело, которое связывается с TfR человека и TfR приматов, где антитело не ингибирует связывания трансферрина с TfR и где одно или несколько свойств антитела модифицируются для уменьшения или устранения вли- 5 038367 яния антитела на ретикулоциты и/или для уменьшения тяжести или присутствия острых клинических симптомов у субъекта или млекопитающего, которого лечат с помощью антитела. В одном из аспектов связывание представляет собой специфичное связывание. В другом аспекте антитело, кроме того, не ингибирует связывания HFE с TfR. В одном из аспектов антитело представляет собой моноклональное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой антитело человека. В другом аспекте антитело представляет собой гуманизированное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой химерное антитело. В другом аспекте антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывает TfR человека и TfR примата. В другом аспекте TfR примата происходит от обезьяны циномолгус.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления антитело модифицируется в одном или нескольких положениях аминокислот в VH или VL до аминокислоты, показанной для этого положения на фиг. 4E-1 и 4E-2. В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления одно или несколько свойств антитела выбирают из эффекторной функции Fc области антитела, функции активирования комплемента антитела и сродства антитела к TfR. В одном из таких аспектов свойство представляет собой эффекторную функцию в Fc области антитела. В другом таком аспекте свойство представляет собой функцию активирования комплемента антитела. В другом таком аспекте свойство представляет собой сродство антитела к TfR. В одном из таких аспектов эффекторная функция или функция активирования комплемента уменьшается или устраняется по отношению к антителу дикого типа такого же изотипа. В одном из аспектов эффекторная функция уменьшается или устраняется с помощью способа, выбранного из понижения гликозилирования антитела, модификации изотипа антитела до изотипа, который имеет естественным образом уменьшенную или устраненную эффекторную функцию, и модификации Fc области.
В одном из таких аспектов эффекторная функция уменьшается или устраняется посредством понижения гликозилирования антитела. В одном из таких аспектов гликозилирование антитела уменьшается с помощью способа, выбранного из продуцирования антитела в окружающей среде, которая не дает возможности для гликозилирования дикого типа; удаления углеводных групп, уже присутствующих на антителе; и модификации антитела таким образом, что гликозилирование дикого типа не осуществляется. В одном из таких аспектов гликозилирование антитела уменьшается посредством продуцирования антитела в окружающей среде, которая не дает возможности для гликозилирования дикого типа, такого как продуцирование в системе продуцирования клеток типа, отличного от млекопитающих, или когда антитело продуцируется синтетически. В одном из таких аспектов антитело продуцируется в системе продуцирования клеток, отличной от млекопитающих. В другом таком аспекте антитело продуцируется синтетически. В другом таком аспекте гликозилирование антитела уменьшается посредством модификации антитела таким образом, что гликозилирование дикого типа не осуществляется, например, где Fc область антитела содержит мутацию в положении 297, так что аспарагиновый остаток дикого типа в этом положении заменен другой аминокислотой, которая отрицательно влияет на гликозилирование в этом положении.
В другом таком аспекте эффекторная функция уменьшается или устраняется посредством по меньшей мере одной модификации Fc области. В одном из таких аспектов, эффекторная функция или функция активирования комплемента уменьшается или устраняется посредством делеции всей Fc области или ее части, или посредством получения с помощью генной инженерии такого антитела, что оно не содержит Fc области или отличной от Fc области, конкурирующей за эффекторную функцию или за функцию активирования комплемента. В другом таком аспекте по меньшей мере одна модификация Fc области выбирается из точечной мутации Fc области для ослабления связывания с одним или несколькими Fc рецепторами, выбранной из следующих положений: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 и 439; точечной мутации Fc области для ослабления связывания с C1q, выбранной из следующих положений: 270, 322, 329 и 321; устранения некоторой части или всей Fc области и точечной мутации в положении 132 домена CH1. В одном из таких аспектов модификация представляет собой точечную мутацию Fc области для ослабления связывания с C1q, выбранной из следующих положений: 270, 322, 329 и 321. В другом таком аспекте модификация представляет собой устранение некоторой части или всей Fc области. В другом таком аспекте функция активирования комплемента уменьшается или устраняется посредством делеции всей Fc области или ее части или посредством получения с помощью генной инженерии такого антитела, что оно не включает Fc области, которая вовлечена в путь комплемента. В одном из таких аспектов антитело выбирается из Fab или одноцепочечного антитела. В другом таком аспекте отличная от Fc область антитела модифицируется для уменьшения или устранения активирования пути комплемента с помощью антитела. В одном из таких аспектов модификация представляет собой точечную мутацию области CH1 для ослабления связывания с C3. В одном из таких аспектов точечная мутация находится в положении 132 (см., например, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(41):38217-38223).
В одном из аспектов время полужизни антитела повышается посредством модификации в области связывания FcRn. В одном из аспектов модификация представляет собой замещение аминокислоты, выбранное из следующих положений: 251 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434, 436, 238, 265, 272, 286,
- 6 038367
303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434. В одном из аспектов модификация представляет собой замещение, выбранное из следующих: M252Y, S254T, T256E, N434A и
Y436I.
В одном из аспектов антитело объединяют с дополнительным соединением, которое ослабляет или вносит вклад в уменьшение влияния на уровни ретикулоцитов или на острые клинические симптомы. В одном из таких аспектов дополнительное соединение защищает ретикулоциты от связанного с антителом обеднения или поддерживает рост, развитие или восполнение ретикулоцитов. В другом таком аспекте дополнительное соединение выбирается из эритропоэтина (EPO), добавки, содержащей железо, витамина C, фолиевой кислоты и витамина B12 или эритроцитов или ретикулоцитов.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления сродство антитела к TfR уменьшается, как измерено по отношению к антителу дикого типа того же изотипа, не имеющему пониженного сродства к TfR. В одном из таких аспектов антитело имеет KD или IC50 по отношению к TfR примерно от 1 пМ примерно до 100 мкМ. В другом аспекте величина дозы и/или частота введения антитела модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления антитело связывается с терапевтическим соединением. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления антитело связывается с агентом для получения изображений или с меткой. В одном из таких аспектов антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, и терапевтическое соединение необязательно образует одну из частей мультиспецифичного антитела. В одном из таких аспектов мультиспецифичное антитело содержит первый сайт связывания антигена, который связывает TfR, и второй сайт связывания антигена, который связывает антиген головного мозга. В одном из таких аспектов антиген головного мозга выбирают из группы, состоящей из β-секретазы 1 (BACE1), Λβ, эпидермального фактора роста рецептора (EGFR), рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), тау, аполипопротеина E (ApoE), αсинуклеина, CD20, хантингтина, прионного белка (PrP), обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), паркина, презенилина 1, презенилина 2, γ-секретазы, репептора гибели 6 (DR6), белка предшественника амилоида (APP), рецептора нейротропина p75 (p75NTR) и каспазы 6. В другом таком аспекте мультиспецифичное антитело связывается как с TfR, так и с BACE1. В другом таком аспекте мультиспецифичное антитело связывается как с TfR, так и с Λβ. В другом таком аспекте терапевтическое соединение представляет собой лекарственное средство против неврологического расстройства.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из упомянутых выше антител. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает клетку хозяина, содержащую такую нуклеиновую кислоту. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ продуцирования любого из упомянутых выше антител, включающий культивирование такой клетки-хозяина таким образом, что продуцируется антитело, и необязательно дополнительно включающий извлечение антитела из клетки-хозяина.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает фармацевтический препарат, содержащий любое из упомянутых выше антител и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения в качестве лекарственного препарата. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает применение любого из упомянутых выше антител при производстве лекарственного препарата для лечения неврологического расстройства. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения при лечении неврологического расстройства. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления настоящее изобретение предлагает любое из упомянутых выше антител для применения с целью переноса одного или нескольких соединений через BBB. В другом аспекте указанного выше варианта осуществления предлагается применение любого из упомянутых выше антител при производстве лекарственного препарата для переноса одного или нескольких соединений через BBB.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ переноса соединения через BBB у субъекта, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что антитело переносит соединение, связанное с ним, через BBB. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту-человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота вве- 7 038367 дения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В другом аспекте рассмотренного выше варианта осуществления предлагается способ увеличения экспонирования CNS субъекта для соединения, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что антитело переносит соединение, связанное с ним, через BBB. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту-человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfRнасыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ увеличения удержания в CNS соединения, вводимого субъекту, включающий экспонирование любого из упомянутых выше антител для BBB таким образом, что удерживание в CNS соединения увеличивается. В другом таком аспекте BBB принадлежит субъекту-человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
В одном из аспектов указанного выше варианта осуществления предлагается способ лечения неврологического расстройства у млекопитающего, включающий лечение млекопитающего с помощью любого из упомянутых выше антител. В одном из таких аспектов неврологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления CNS. В другом таком аспекте неврологическое расстройство относится к субъекту-человеку. В другом таком аспекте величина дозы и/или частота введения модулируется для уменьшения концентрации антитела, для которого экспонируются эритроциты. В другом таком аспекте способ дополнительно включает стадию мониторинга субъекта относительно обеднения эритроцитов. В другом таком аспекте антитело, связанное с соединением, вводится в терапевтической дозе. В одном из таких аспектов терапевтическая доза является TfR-насыщающей. В другом таком аспекте введение антитела осуществляется в дозе и/или частоте дозы, калибруемой для сведения к минимуму острых клинических симптомов от введения антитела.
Будет понятно, что любой из упомянутых выше способов и композиций по настоящему изобретению может быть объединен с другими и/или с дополнительными аспектами настоящего изобретения, описанными в настоящем описании.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 изображает трехмерную кристаллическую структуру димера TfR в комплексе с Tf на основе файла pdb 3SM9. Отмечена апикальная область TfR, не связывающаяся с Tf.
Фиг. 2A-2B изображают анализ FACS связывания супернатантов родительских клонов гибридомы мышей с TfR человека и циномолгус, транзиторно экспрессируемыми в клетки 293 в присутствии 1 мкМ голо-Tf человека. Если не указано иного, линия, ограничивающая серое поле, на каждом графике представляет собой фон от детектирования антител, серая линия средней толщины представляет собой связывание с 293 клетками, которые эндогенно экспрессируют базальные уровни TfR человека, толстая черная линия представляет связывание с транзиторно экспрессируемым TfR человека и тонкая серая линия представляет связывание с транзиторно экспрессируемым TfR цино.
Фиг. 2C изображает результаты перекрестно-реактивных конкурентных анализов антитела человека/циномолгус, как описано в примере 1. Девять из четырнадцати клонов, как обнаружено, блокируют связывание антитела с апикальным связыванием согласно фаговому дисплею.
Фиг. 3A-1, 3A-2, 3B-1, 3B-2, 3C-1, 3C-2, 3D-1 и 3D-2 изображают последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей клонов гибридомы, которые связываются с апикальными и неапикальными областями TfR. Последовательности могут дополнительно подразделяться по эпитопу и сходству последовательностей на класс I-III (апикальное связывание) и класс IV (неапикальное связывание). HVR согласно Kabat указаны посредством подчеркивания.
Фиг. 4A-1, 4A-2, 4B-1, 4B-2, 4C-1, 4C-2, 4D-1 и 4D-2 изображают выравнивания гуманизированных последовательностей для (A) 15G11, (B) 7A4/8A2, (C) 7G7 и (D) 16F6. Каждая последовательность легко- 8 038367 го или тяжелого вариабельного домена мыши (вторая строчка) выравнивается по ближайшей зародышевой линии человека или по консенсусному вариабельному домену (первая строчка). Гуманизированная версия для каждого антитела показана внизу (третья строчка). Отличия от зародышевой линии человека или от консенсусной последовательности затенены. Последовательности HVR, которые прививаются в каркас человека, обведены прямоугольником. Показаны определения CDR согласно Kabat.
Фиг. 4E-1 и 4E-2 показывают, что группы антител класса I-III, вариантные формы антител с модификациями на одном или нескольких остатках FR сохраняют сродство и специфичность связывания.
Фиг. 5 изображает связывание hu7A4.v15, hu15G11.v5 и hu7G7.v1 с huTfR в присутствии 6,3 мкМ голо-Tf. Связывание антитела на иммобилизованных huTfR показано в присутствии (пустые символы и прерывистые линии) или в отсутствие (закрашенные символы и сплошные линии) 6,3 мкМ голо-Tf.
Фиг. 6A-B изображают результаты анализов связывания HFE-HuTfR и блокирования HFE, описанных в примере 1. Фиг. 6A показывает связывание антитела при увеличивающихся концентрациях huTfR, захваченных с помощью иммобилизованных HFE. Фиг. 6B показывает связывание huTfR на иммобилизованных HFE в присутствии увеличенной концентрации антитела.
Фиг. 7A-B изображают анализы связывания 15G11.v5 и 7A4.v5 IgG и вариантов Fab Ala с TfR цино и человека, демонстрирующие воздействия на сродство мутаций Ala в CDR-L3 и CDR-H3 каждого антитела, оцениваемых как IgG, с помощью связывания ELISA, и IgG или Fab - с помощью анализа SPR иммобилизованных TfR человека или цино, как описано в примере 2.
Фиг. 8А-В и 9А-В изображают результаты экспериментов, оценивающих воздействия статуса эффекторной функции на активность ADCC антител анти-TfR человека (анти-hTFR) в первичных мононуклеарных клетках костного мозга человека или в линии клеток эритробластов человека, как описано в примере 4.
Фиг. 10 изображает схему дозирования и отбора образцов для исследований на приматах, описанных в примере 5.
Фиг. 11A-11B изображают фармакокинетические результаты экспериментов, описанных в примере 5, конкретно, индивидуальные и средние по группам концентрации в сыворотке анти-TfR1/BACE1, антиTfR2/BACE1 и анти-gD, как функцию времени после однократного внутривенного введения болюса при 30 мг/кг на обезьянах циномолгус в сыворотке (фиг. 11A) и CSF (фиг. 11B).
Фиг. 12A-12E изображают фармакодинамические результаты экспериментов, описанных в примере 5, конкретно, индивидуальные и средние по группам концентрации анти-TfR1/BACE1, анти-TfR2/BACE1 и анти-gD в плазме (A) или в CSF (B-E) как функцию времени после однократного внутривенного введения болюса при 30 мг/кг обезьянам циномолгус. Верхние панели показывают уровни Αβ1-40 в плазме (фиг. 12Α) и CSF (фиг. 12B), в то время как нижние панели показывают уровни растворимого APP (фиг. 12C), уровни растворимого APPe (фиг. 12D) и отношение sAPPe/sAPPa (фиг. 12E) как функцию времени.
Фиг. 13A-13D изображают результаты отбора гематологических образцов, осуществляемого в течение исследований, описанных в примере 5. В каждой из указанных временных точек общее количество ретикулоцитов (фиг. 13A), эритроцитов (фиг. 13B), гемоглобина (фиг. 13D) и процент незрелых ретикулоцитов в общем пуле ретикулоцитов (фиг. 13C) измеряют с использованием стандартных методик.
Фиг. 14 изображает схему дозирования и отбора образцов для исследования на приматах, описанного в примере 6.
Фиг. 15A-15B изображают фармакодинамические результаты (A) и концентрации антитела в головном мозге (B) для экспериментов, описанных в примере 6. Конкретно, фиг. 15A показывает индивидуальные и средние по группам отношения анти-TfR1/BACE1, анти-TfR2/BACE1, анти-gD и анти-BACE1 для sAPPe/sAPPa в CSF, как функцию времени после однократного внутривенного введения болюса при 30 мг/кг обезьянам циномолгус. Фиг. 15B показывает индивидуальные концентрации антитела антиTfR1/BACE1, анти-TfR2/BACE1, анти-gD и анти-BACE1 в различных областях головного мозга через 24 ч после дозирования.
Фиг. 16A-B изображают последовательности аминокислот легких и тяжелых цепей клона YW412.8 анти-BACE1, полученного из наивной библиотеки фаговых дисплеев природного разнообразия, и форм YW412.8 с созревшим сродством. Фиг. 16A изображает выравнивания вариабельных легких (VL) последовательностей (SEQ ID NO. 132-137). Фиг. 16B изображает выравнивания вариабельных тяжелых (VH) последовательностей (SEQ ID NO. 138-139). На обеих фигурах последовательности HVR для каждого клона показаны с помощью областей, обведенных прямоугольником, при этом первый прямоугольник показывает HVR-L1 (фиг. 16A) или HVR-H1 (фиг. 16B), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (фиг. 16A) или HVR-H2 (фиг. 16B) и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (фиг. 16A) или HVR-H3 (фиг. 16B).
Фиг. 17А-В изображают последовательности аминокислот легких и тяжелых цепей клона Fab 12 антитела анти-BACE1, полученных из наивной библиотеки фаговых дисплеев синтетического разнообразия, и формы Fab 12 с созревшим сродством. Фиг. 17A изображает выравнивания последовательности легкой цепи (SEQ ID NO. 140-143). Фиг. 17B изображает выравнивания последовательности тяжелой
- 9 038367 цепи (SEQ ID NO. 144). На обеих фигурах последовательности HVR для каждого клона показаны с помощью областей, обведенных прямоугольником, при этом первый прямоугольник показывает HVR-L1 (фиг. 17A) или HVR-H1 (фиг. 17B), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (фиг. 17A) или HVR-H2 (фиг. 17B) и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (фиг. 17A) или HVR-H3 (фиг. 17B).
Фиг. 18А-В изображают тяжелую цепь (фиг. 18A; SEQ ID NO. 145) и легкую цепь (фиг. 18B; SEQ ID NO. 146) иллюстративного антитела анти-Ae.
Фиг. 19 изображает фармакокинетические свойства анти-TfR1/BACE1, анти-TfR52A/BACE1 и антиTfR53A/BACE1, как описано в примере 5.
Фиг. 20 изображает фармакокинетические свойства антител анти-TfRD/BACE1 и анти-gD IgG2a мышиных с мутациями эффекторной функции Fc LALAPG, как описано в примере 7.
Фиг. 21 изображает общее количество и количество незрелых ретикулоцитов у мышей через 24 ч после введения дозы 50 мг/кг антител анти-TfRD/BACE1 и анти-gD IgG2a мышиных с мутациями эффекторной функции Fc LALAPG, как описано в примере 7.
Фиг. 22 изображает общее количество ретикулоцитов у мышей через 24 ч после введения дозы 50 мг/кг антител анти-TfR52A/BACE1 (N297G), анти-TfR52A/BACE1 (LALAPG), анти-TfR52A/BACE1 (LALAPG/YTE), TfR52A/BACE1 (LALAPG/AI) мышам, нокаутированным рецепторами трансферрина человека, как описано в примере 8.
Фиг. 23 изображает результаты экспериментов, оценивающих влияние статуса эффекторной функции на активность ADCC антител анти-TfR/gD, анти-TfR/BACE1 (N297G), анти-TfR/BACE1 (LALAPG), анти-TfR/BACE1 (N297G/434A/436I) и анти-TfR/BACE1 (LALAPG/YTE) в первичных мононуклеарных клетках костного мозга человека или в линии клеток эритробластов человека, как описано в примере 8.
Фиг. 24 изображает последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи 1511GV.5 (легкая цепь - SEQ ID NO: 105 и тяжелая цепь - SEQ ID NO: 108) и вариантов сродства 15G11.52A (легкая цепь - SEQ ID NO: 105 и тяжелая цепь - SEQ ID NO: 153), 15G11.53A (легкая цепь - SEQ ID NO: 105 и тяжелая цепь - SEQ ID NO: 154) и 15G11.92A (легкая цепь - SEQ ID NO: 151 и тяжелая цепь - SEQ ID NO: 108). HVR согласно Kabat показаны посредством подчеркивания.
Фиг. 25 изображает конкурентный анализ сравнения между 15G11v.5 и анти-TfRC12, как описано в примере 1.
Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения
1. Определения.
Сродство относится к силе суммы общих нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иного, как используется в настоящем документе, сродство связывания относится к собственному сродству связывания, которое отражает взаимодействие 1:1 между элементами пары связывания (например, антителом и антигеном). Сродство молекулы X к ее партнеру Y может, в целом, быть представлено с помощью константы диссоциации (KD, которая представляет собой отношение скорости отсоединения X от Y (kd или Koff) к скорости ассоциации X и Y (ka или kon)). Суррогатное измерение для сродства одного или нескольких антител к их мишени представляет собой их половинную максимальную ингибиторную концентрацию (IC50), меру того, сколько антитела требуется для ингибирования связывания известного лиганда с целевым антителом на 50%. Сродство может измеряться с помощью обычных способов, известных в данной области, включая те, которые описаны в настоящем документе. Конкретные иллюстративные и примерные варианты осуществления для измерения сродства связывания описаны в настоящем документе.
Гематоэнцефалический барьер или BBB относится к физиологическому барьеру между периферическим кровообращением и головным мозгом и спинным мозгом (т.е. CNS), который формируется с помощью плотных переходов с помощью плазматических мембран эндотелия капилляров головного мозга, создающих плотный барьер, который ограничивает перенос молекул в головной мозг, даже очень малых молекул, таких как мочевина (60 Да). Гематоэнцефалический барьер в головном мозге, гематоспинальный барьер в спинном мозге и гематоретинальный в сетчатке глаза представляют собой сплошные капиллярные барьеры в CNS, и они коллективно упоминаются в настоящем документе как гематоэнцефалический барьер или BBB. BBB также охватывает гемато-CSF барьер (хороидное сплетение), где барьер состоит из эпендимных клеток вместо капиллярных эндотелиальных клеток.
Термины амилоид β, β-амилоид, 'Άβ'', амилоидв и 'Άβ'', используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к фрагменту белка предшественника амилоида (APP), который продуцируется при расщеплении APP посредством β-секретазы 1 (BACE1), а также к его модификациям, фрагментам и любым функциональным эквивалентам, включая, но не ограничиваясь этим, Aβl-40 и Aβl-42. Aβ, как известно, существует в мономерной форме, а также ассоциируется с образованием олигомеров и фибриллярных структур, которые могут обнаруживаться в качестве составляющих элементов амилоидных бляшек. Структура и последовательности таких пептидов Aβ хорошо известны специалистам в данной области, и способы продуцирования указанных пептидов или извлечения их из головного мозга и других тканей описаны, например, в Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129:885-890
- 10 038367 (1984).
Кроме того, пептиды Αβ являются также коммерчески доступными в разнообразных формах.
Иммуноглобулин анти-Ae, антитело анти-Ae и антитело, которое связывает Ae используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и относятся к антителу, которое специфично связывается с Ae человека. Неограничивающий пример антитела анти-Ae представляет собой кренезумаб. Другие неограничивающие примеры антител анти-Ae представляют собой соланезумаб, бапинезумаб, гантенезумаб, адуканумаб, понезумаб и любые другие антитела анти-Ae, описанные в следующих публикациях: WO 2000162801, WO 2002046237, WO 2002003911, WO 2003016466, WO 2003016467, WO 2003077858, WO 2004029629, WO 2004032868, WO 2004032868, WO 2004108895, WO 2005028511, WO 2006039470, WO 2006036291, WO 2006066089, WO 2006066171, WO 2006066049, WO 2006095041, WO 2009027105.
Термины кренезумаб и MABT5102A используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к конкретному антителу анти-Ae, которое связывается с мономерными, олигомерными и фибриллярными формами Ae, и которые связаны с CAS registry number 1095207. В одном из вариантов осуществления, такое антитело содержит последовательности, приведенные на фиг. 18A и 18B.
Носитель аполипопротеина E4 или носитель ApoE4 используются в настоящем документе взаимозаменяемо с положительным по аполипопротеину E4 или положительным по ApoE4 и относится к индивидууму, имеющему по меньшей мере одну аллель аполипопротеина E4 (или ApoE4). Индивидуум с нулем аллелей ApoE4 упоминается в настоящем документе как являющийся отрицательным по ApoE4 или не носитель ApoE4. См. также Prekumar, et al., 1996, Am. J. Pathol. 148:2083-95.
Термин церебральный вазогенный отек относится к избыточной аккумуляции внутрисосудистой жидкости или белка во внутриклеточных или внеклеточных пространствах головного мозга. Церебральный вазогенный отек детектируется, например, с помощью MRI (магнитной резонансной томографии) головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим FLAIR MRI, и может быть бессимптомным (бессимптомный вазогенный отек) или связанным с неврологическими симптомами, такими как спутанность сознания, головокружение, тошнота и летаргия (симптоматичный вазогенный отек) (см. Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011).
Термин церебральное макрокровоизлияние относится к внутричерепному кровоизлиянию или кровотечению в головном мозге, площадь которого составляет больше примерно 1 см в диаметре. Церебральное макрокровоизлияние детектируется, например, с помощью MRI головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим Т2*-взвешенную GRE MRI, и может быть бессимптомным (бессимптомное макрокровоизлияние) или связанными с симптомами, такими как временное или постоянное очаговое ослабление моторики или сенсорики, атаксия, афазия и дизартрия (симптоматичное макрокровоизлияние) (см., например, Chalela J.A., Gomes J. Expert Rev. Neurother. 2004 4:267, 2004 and Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011).
Термин церебральное микрокровоизлияние относится к внутричерепному кровоизлиянию или кровотечению в головном мозге, площадь которого составляет меньше примерно чем 1 см в диаметре. Церебральное микрокровоизлияние детектируется, например, с помощью MRI головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим, T2*-взвешенную GRE MRI, и может быть бессимптомным (бессимптомное микрокровоизлияние) или может потенциально быть связанным с такими симптомами, как временное или постоянное очаговое ослабление моторики или сенсорики, атаксия, афазия и дизартрия (симптоматичное микрокровоизлияние). См., например, Greenberg, et al., 2009, Lancet Neurol. 8:165-74.
Термин сулькальный выпот относится к выпоту жидкости в бороздке или в извилине головного мозга. Сулькальные выпоты детектируются, например, с помощью MRI головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим FLAIR MRI. См. Sperling et al. Alzheimer's & Dementia, 7:367, 2011.
Термин поверхностный сидероз центральной нервной системы относится к кровотечению или кровоизлиянию в субарахноидальной области головного мозга и детектируется, например, с помощью MRI головного мозга, включая, но не ограничиваясь этим T2*-взвешенную GRE MRI. Симптомы, указывающие на поверхностный сидероз центральной нервной системы, включают перцептивную глухоту, мозжечковую атаксию и пирамидальные признаки. См. Kumara-N, Am. J. Neuroradiol. 31:5, 2010.
Термин амилоидоз, как используется в настоящем документе, относится к группе заболеваний и расстройств, вызываемых амилоидом или амилоидоподобными белками или ассоциированных с ними, и включает, но не ограничиваясь этим, заболевания и расстройства, вызываемые присутствием или активностью амилоидоподобных белков в мономерном, фибриллярном или полимерном состоянии, или в любом сочетании из этих трех состояний, включая амилоидные бляшки. Такие заболевания включают, но не ограничиваясь этим, вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, например заболевания, включая, но не ограничиваясь этим, неврологические расстройства, такие как болезнь Альцгеймера (AD), заболевания или состояния, характеризуемые потерей когнитивной способности памяти, такие, например, как умеренные когнитивные нарушения (MCI), деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное кровоизлияние в мозг с амилоидозом (Голландского типа), Гуамский комплекс болезнь Паркинсона деменция и другие заболевания, которые основаны на амилоидоподобных белках или ассоциируются с ними, такие как прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественный склероз, болезнь Крейтц- 11 038367 фельда-Якоба, болезнь Паркинсона, деменция, связанная с ВИЧ, ALS (боковой амиотрофический склероз), миозит с включенными тельцами (IBM), диабет взрослых, эндокринная опухоль и сенильный сердечный амилоидоз, и разнообразные заболевания глаз, включая дистрофию желтого пятна, связанную с друзами невропатию зрительного нерва, глаукому и катаракту, связанные с отложениями β-амилоидов.
Глаукома представляет собой группу заболеваний зрительного нерва, включающих потерю ганглионных клеток сетчатки (RGC) в виде характерной структуры оптической нейропатии. RGC представляют собой нервные клетки, которые передают зрительные сигналы от глаза в головной мозг. Каспаза-3 и Каспаза-8, два главных фермента в апоптическом процессе, активируются в процессе, приводящем к апоптозу RGC. Каспаза-3 расщепляет белок предшественник амилоида (APP) с продуцированием нейротоксичных фрагментов, включая Άβ. Без защитного воздействия APP аккумуляция Άβ в слое ганглионных клеток сетчатки приводит в результате к гибели RGC и необратимой потере зрения.
Глаукома часто, но не всегда, сопровождается повышением глазного давления, которая может быть результатом блокировки циркуляции водной среды или ее дренирования. Хотя повышенное внутриглазное давление является важным фактором риска для развития глаукомы, нельзя определить порог внутриглазного давления, который, определенно, вызывал бы глаукому. Повреждение может также вызываться плохим кровоснабжением витальных волокон зрительного нерва, слабостью структуры нерва и/или проблемой со здоровьем самих нервных волокон. Нелеченая глаукома приводит к постоянному повреждению зрительного нерва и возникающей в результате потере поля зрения, которая может постепенно привести к слепоте.
Термин легкая болезнь Альцгеймера или легкая AD, как используется в настоящем документе (например, пациент с диагнозом легкая AD), относится к стадии AD, отличающейся оценкой MMSE от 20 до 26.
Термин легкая - умеренная болезнь Альцгеймера или легкая - умеренная AD, как используется в настоящем документе, охватывает как легкую, так и умеренную AD, и отличается оценкой MMSE от 18 до 26.
Термин умеренная болезнь Альцгеймера или умеренная AD, как используется в настоящем документе (например, пациент с диагнозом умеренная AD), относится к стадии AD, отличающейся оценкой MMSE от 18 до 19.
Центральная нервная система или CNS относится к комплексу нервных тканей, которые контролируют функции организма, и она включает головной мозг и спинной мозг.
Рецептор гематоэнцефалического барьера (в настоящем документе сокращенно BBB-R) представляет собой трансмембранный рецепторный белок, экспрессируемый в эндотелиальных клетках головного мозга, который может переносить молекулы через гематоэнцефалический барьер. Примеры BBB-R включают, но не ограничиваясь этим, рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), рецепторы липопротеинов низкой плотности, включающие, без ограничения, белок 1, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LR1), и белок 8, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP8), переносчик глюкозы 1 (Glut1) и связывающий гепарин фактор роста подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF). Иллюстративный BBB-R в настоящем документе представляет собой рецептор трансферрина (TfR).
Термин рецептор трансферрина или TfR, как используется в настоящем документе, относится к любому нативному TfR из любого источника - позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иного. Термин охватывает полноразмерный непроцессированный TfR, а также любую форму TfR, которая получается в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает встречающиеся в природе варианты TfR, например сплайсированные варианты или аллельные варианты. TfR представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой примерно 180000), состоящей из двух дисульфидно связанных субъединиц (каждая с видимой молекулярной массой примерно 90000), вовлеченный в потребление железа у позвоночных животных. В одном из вариантов осуществления TfR в настоящем документе представляет собой TfR человека (hTfR), содержащий последовательность аминокислот, как приведено в Schneider et al. Nature 311:675-678 (1984), например, (SEQ ID NO: 1). В других вариантах осуществления TfR в настоящем документе представляет собой TfR приматов (pTfR), содержащий последовательность аминокислот, как приведено в ссылке Genbank AFD 18260.1 (SEQ ID NO: 2). Для сравнения, последовательность TfR мыши можно найти в ссылке Genbank AAH54522.1 (SEQ ID NO: 3). Неврологическое расстройство, как используется в настоящем документе, относится к заболеванию или расстройству, которое воздействует на CNS и/или которое имеет этиологию в CNS. Иллюстративные заболевания или расстройства CNS включают, но не ограничиваясь этим, невропатию, амилоидоз, рак, глазное заболевание или расстройство, вирусные или микробные инфекции, воспаление, ишемию, нейродегенеративное заболевание, эпилепсию, расстройства поведения и лизосомную болезнь накопления. Для целей настоящей заявки CNS будет, как понимается, включать глаз, который, обычно отделяется от остальной части организма, гематоретинальным барьером. Конкретные примеры неврологических расстройств включают, но не ограничиваясь этим, нейродегенеративные заболевания (включая, но не ограничиваясь
- 12 038367 этим, заболевание с тельцами Леви, постполиомиелитный синдром, синдром Ши-Дрегера, оливомостомозжечковую атрофию, болезнь Паркинсона, множественную системную атрофию, стриатонигральную дегенерацию, таутопатии (включая, но не ограничиваясь этим, болезнь Альцгеймера и супрануклеарный паралич), прионные заболевания (включая, но не ограничиваясь этим, губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота, скрепи, синдром Крейтцфельда-Якоба, куру, болезнь Герштмана-ШтрауслераШайнкера, хроническую вастинг-болезнь и фатальную наследственную инсомнию), бульбарный паралич, боковой амиотрофический склероз и гетеродегенеративные расстройства нервной системы (включая, но не ограничиваясь этим, болезнь Канавана, болезнь Хантингтона, нейрональный цероидлипофусциноз, болезнь Александра, синдром Туретта, синдром курчавых волос Менкеса, синдром Кокэйна, синдром Халервордена-Шпатца, болезнь Лафора, синдром Ретта, гепатолентикулярную дегенерацию, синдром Леша-Нихана и синдром Унферрихта-Лундборга), деменцию (включая, но не ограничиваясь этим, болезнь Пика и спинально-церебеллярную атаксию), рак (например, CNS, включая метастазы в головной мозг, возникающие в результате рака где-либо в организме).
Лекарственное средство против неврологического расстройства представляет собой лекарственное средство или терапевтический агент, который лечит одно или несколько неврологических расстройств. Лекарственные средства против неврологических расстройств по настоящему изобретению включают, но не ограничиваясь этим, антитела, пептиды, белки, естественные лиганды одной или нескольких мишеней в CNS, модифицированные версии естественных лигандов одной или нескольких мишеней в CNS, аптамеры, ингибиторные нуклеиновые кислоты (т.е. малые ингибиторные РНК (siRNA) и короткие шпилечные РНК (shRNA)), рибозимы и малые молекулы или активные фрагменты любого из упомянутых выше соединений. Иллюстративные лекарственные средства против неврологических расстройств по настоящему изобретению описываются в настоящем документе и включают, но не ограничиваясь этим. антитела, аптамеры, белки, пептиды, ингибиторные нуклеиновые кислоты и малые молекулы, и активные фрагменты любых из упомянутых выше соединений, которые либо сами собой представляют, либо специфично распознают и/или воздействуют (т.е. ингибируют, активируют или детектируют ее) на антиген в CNS или целевую молекулу, такую как, но не ограничиваясь этим, белок предшественник амилоида или его части, амилоид β, β-секретаза, γ-секретаза, тау, α-синуклеин, паркин, хантингтин, DR6, презенилин, ApoE, глиома или другие маркеры рака CNS и нейротрофины. Неограничивающие примеры лекарственных средств против неврологических расстройств и расстройств, при которых их можно использовать для лечения, приводятся в следующей далее табл. 1.
Таблица 1
Неограничивающие примеры лекарственных средств против неврологических расстройств и соответствующие расстройства, для лечения которых их можно использовать .
Лекарственное средство Неврологическое расстройство
Антитело анти-ВАСЕ1 Болезнь Альцгеймера, острое и хроническое повреждение мозга, инсульт
Антитело анти-Abeta болезнь Альцгеймера
Антитело анти-Тау болезнь Альцгеймера, таутопатии
Нейтрофин Инсульт, острое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга
Нейротрофический фактор, полученный из головного мозга (BDNF), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2) Хроническое повреждение головного мозга (нейрогенез)
Антитело анти-рецептор эпидерсального фатора роста (EGFR) Рак мозга
Невральный фактор, полученный из линии глиальных клеток (GDNF) Болезнь Паркинсона
- 13 038367
Нейротрофический фактор, полученный из головного мозга (BDNF) Боковой амиотрофический склероз, депрессия
Лизосомальный фермент Расстройства лизосомального накопления головного мозга
Силиарный нейротрофический фактор (CNTF) Боковой амиотрофический склероз
Нейрегулин-1 Шизофрения
Антитело анти-НЕИ2 (например, транстузумаб, пертузумаб, и тому подобное) Метастазы в головной мозг от НЕИ2-положительного рака
Антитело анти-VEGF (например, бевацизумаб) Возобновляющаяся или вновь диагностируемая глиобластома, возобновляющаяся злокачественная глиома, метастазы в головной мозг
Агент для получения изображений представляет собой соединение, которое имеет одно или несколько свойств, которое позволяет детектировать прямо или косвенно его присутствие и/или положение. Примеры таких агентов для получения изображений включают белки и низкомолекулярные соединения, содержащие меченый остаток, который делает возможным детектирование.
Антиген CNS или антиген головного мозга представляет собой антиген, экспрессируемый в CNS, включая головной мозг, на которое может нацеливаться антитело или малая молекула. Примеры таких антигенов включают, без ограничения, β-секретазу 1 (BACE1), амилоид β (Aβ), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), тау, аполипопротеин E4 (ApoE4), α-синуклеин, CD20, хантингтин, прионный белок (PrP), обогащенную лейциновыми повторами киназу 2 (LRRK2), паркин, презенилин 1, презенилин 2, γ-секретазу, репептор гибели 6 (DR6), белок предшественник амилоида (APP), рецептор нейротрофина p75 (p75NTR), рецептор интерлейкина 6 (IL6R), рецептор TNF 1 (TNFR1), интерлейкин 1 β (ILIP) и каспазу 6. В одном из вариантов осуществления антиген представляет собой BACE1.
Термин BACE1, как используется в настоящем документе, относится к любой нативной βсекретазе 1 (также называемой фермент 1, расщепляющий β-сайт белка предшественника амилоида, ассоциированная с мембраной аспарагилпротеаза 2, мемапсин 2, аспартилпротеаза 2 или Asp2) от любого источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иного. Термин охватывает полноразмерную непроцессированную BACE1, а также любую форму BACE1, которая получается в результате процессинга в клетке. Термин также охватывает встречающиеся в природе варианты BACE1, например сплайсированные варианты или аллельные варианты.
Последовательность аминокислот иллюстративного полипептида BACE1 представляет собой последовательность для BACE1 человека, изоформа A, как сообщается в Vassar et al., Science 286:735-741 (1999), которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте. Существуют несколько других изоформ BACE1 человека, включая изоформы B, C и D. См. UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817, которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.
Термины антитело анти-в-секретаза, антитело анти-BACE1, антитело, которое связывается с βсекретазой и антитело, которое связывается с BACE1 относятся к антителу, которое может связывать BACE1 с достаточным сродством, так что антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на BACE1. В одном из вариантов осуществления степень связывания антитела анти-BACE1 с неродственным белком, отличным от BACE1, меньше примерно чем 10% от связывания антитела с BACE1, как измерено, например, с помощью радиоиммунного анализа (RIA). В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с BACE1, имеет константу диссоциации (Kd) <1 мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <0,1 нМ, <0,01 нМ или <0,001 нМ (например, 10-8М или меньше, например от 10-8М до 10-13М, например от 10-9М до 10-13М). В определенных вариантах осуществления антитело анти-BACE1 связывается с эпитопом BACE1, который является консервативным среди BACE1 от различных видов и изоформ. В одном из вариантов осуществления предлагается антитело, которое связывается с эпитопом на BACE1, связанным с антителом анти-BACE 1 YW412.8.31. В других вариантах осуществления предлагается антитело, которое связывается с экзосайтом в BACE1, расположенным в каталитическом домене BACE1. В одном из вариантов осуществления предлагается антитело, которое конкурирует с пептидами, идентифицируемыми в Kornacker et al., Bio
- 14 038367 chem. 44:11567-11573 (2005), которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте (например, пептиды 1, 2, 3, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 2-12, 3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 912, 10-12, 4, 5, 6, 5-10, 5-9, рандомизированные, Y5A, P6A, Y7A, F8A, I9A, P10A и L11A), за связывание с BACE1. Иллюстративные последовательности антитела BACE1 изображены на фиг. 15A-B и 16A-B. Одно из иллюстративных антител в настоящем документе содержит вариабельные домены антитела YW412.8.31 (например, как на фиг. 15A-B).
Белок с нативной последовательностью в настоящем документе относится к белку, содержащему последовательность аминокислот белков, встречающихся в природе, включая встречающиеся в природе варианты белка. Термин, как используется в настоящем документе, включает белок, как изолированный из его естественного источника или как полученный рекомбинантно.
Термин антитело в настоящем документе используется в самом широком смысле и охватывает разнообразные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител постольку, поскольку они демонстрируют желаемую активность связывания антигенов.
Фрагмент антитела относится к молекуле иной, чем интактное антитело, которое содержит часть интактного антитела, которое связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Nelson, MAbs (2010) 2(1):77-83) и включают, но не ограничиваясь этим, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител, включая, но не ограничиваясь этим, одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), продукты слияния связывающих антиген доменов легкой и/или тяжелой цепи, с линкером или без него (и необязательно, в тандеме); и моноспецифичные или мультиспецифичные молекулы, связывающие антиген, сформированные из фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь этим, мультиспецифичные антитела, сконструированные из множества вариабельных доменов, в которых отсутствуют Fc области).
Термин моноклональное антитело, как используется в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов, например содержащих встречающиеся в природе мутации, или они могут возникнуть во время продуцирования моноклонального антитела, такие варианты, как правило, присутствуют в малых количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, содержат антитела, направленные против различных детерминантов (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против одного детерминанта на антигене. Прилагательное моноклональное указывает на характер антитела как получаемого, по существу, из гомогенной популяции антител, и оно не должно рассматриваться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть приготовлены с помощью разнообразных методик, включая, но не ограничиваясь этим, метод гибридомы (см., например, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)), методы с использованием рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567), методы фагового дисплея (например, с использованием методик, описанных в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)), и способы, использующие трансгенных животных, содержащих все локусы иммуноглобулина человека или часть их, такие способы и другие иллюстративные способы получения моноклональных антител описываются в настоящем документе. Конкретные примеры моноклональных антител в настоящем документе включают химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека, включая их фрагменты, связывающие антиген.
Моноклональные антитела в настоящем документе конкретно включают химерные антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(цепей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, постольку, поскольку они демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
Акцепторный каркас человека для целей настоящего документа представляет собой каркас, содержащий последовательность аминокислот каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученный из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, как определено ниже. Акцепторный каркас человека, полученный из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может содержать его последовательность аминокислот, или он может содержать изменения в последовательности аминокислот. В некоторых вариантах осуществления количество изменений аминокислот составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше или 2 или меньше. В некоторых вариантах осуществления акцепторный каркас VL человека идентичен по последовательности последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или последовательности
- 15 038367 консенсусного каркаса человека.
Консенсусный каркас человека представляет собой каркас, который представляет собой наиболее часто встречающиеся остатки аминокислот при выборе последовательностей каркаса VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological of Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. В одном из вариантов осуществления для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как в Kabat et al., выше. В одном из вариантов осуществления для VH подгруппа представляет собой подгруппу III, как в Kabat et al., выше.
Гуманизированные формы антител (например, мышиных), не принадлежащих человеку, представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную от антител, не принадлежащих человеку. По большей части гуманизированные антитела представляют собой антитела человека (антитела реципиента), в которых остатки из гипервариабельный области реципиента заменяются остатками из гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющих желаемую специфичность, сродство и емкость. Например, в определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все по меньшей мере из одного, а, как правило, из двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все HVR (например, CDR) соответствуют остаткам антитела, не принадлежащего человеку, и все или, по существу, все области каркаса (FR) соответствуют областям антитела человека. В некоторых случаях остатки FR иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками, не принадлежащими человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не содержатся в антителе реципиента или в донорском антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного определения характеристик антитела. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все по меньшей мере из одного, а, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все гипервариабельные области соответствуют областям антитела, не принадлежащего человеку, и все или, по существу, все FR представляют собой области антитела человека, за исключением замещения (замещений) FR, как отмечено выше. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть постоянной области антитела, как правило, антитела человека. Гуманизированная форма антитела, например антитела, не принадлежащего человеку, относится к антителу, которое подвергается гуманизации. Относительно дополнительных деталей см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992).
Антитело человека в настоящем документе представляет собой антитело, содержащее структуру последовательностей аминокислот, которая соответствует структуре последовательности аминокислот антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученного из источника, отличного от человека, которая использует репертуары антител человека или другие последовательности, кодирующие антитело человека. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее связывающие антиген остатки, не принадлежащие человеку. Такие антитела могут идентифицироваться или приготавливаться с помощью разнообразных методик, включая, но не ограничиваясь этим, продуцирование с помощью трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации продуцировать антитела человека в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулина (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year в Immune, 7:33 (1993); и патенты США №№ 5591669, 5589369 и 5545807)); выбор из библиотек фаговых дисплеев, экспрессирующих антитела человека или фрагменты антител человека (см., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Johnson et al., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); патенты США №№ 5565332 и 5573905); генерирование посредством активируемых in vitro В-лимфоцитов (см. патенты США №№ 5567610 и 5229275) и изоляцию из гибридом, продуцирующих антитела человека.
Мультиспецифичное антитело в настоящем документе представляет собой антитело, имеющее специфичность связывания по меньшей мере с двумя различными эпитопами. Иллюстративные мультиспецифичные антитела могут связываться как с TfR, так и с антигеном головного мозга. Мультиспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифичных антител F(ab')2). Полученные с помощью генной инженерии антитела с двумя, тремя или более (например, четырьмя) функциональными сайтами связывания антигена также рассматриваются (см., например, заявку на патент США № 2002/0004587 A1, Miller et al.). Мультиспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител.
Антитела в настоящем документе включают варианты последовательностей аминокислот с измененной активностью связывания антигена или биологической активностью. Примеры таких изменений аминокислот включают антитела с повышенным сродством к антигену (например, антитела с созревшим сродством) и антитела с измененной Fc областью, если она присутствует, например, с измененной
- 16 038367 (повышенной или пониженной) антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC) (см., например, WO 00/42072, Presta, L. и WO 99/51642,
Iduosogie et al.); и/или с повышенным или пониженным временем полужизни в сыворотке (см., например,
WO 00/42072, Presta, L.).
Вариант с модифицированным сродством имеет один или несколько замещенных остатков гипервариабельной области или каркаса исходного антитела (например, исходного химерного, гуманизированного или антитела человека), которые изменяют (повышают или понижают) сродство. Обычный путь генерирования таких замещенных вариантов использует фаговый дисплей. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют с генерированием всех возможных замещений аминокислот на каждом сайте. Варианты антител, генерируемые таким образом, получают с помощью фагового дисплея одновалентным образом из нитевидных частиц фагов в виде слияний с продуктом гена III M13, упакованного внутри каждой частицы. Затем осуществляют скрининг вариантов, полученных с помощью фагового дисплея, на их биологическую активность (например, сродство связывания). Для идентификации возможных сайтов гипервариабельной области для модификации можно осуществить аланин-сканирующий мутагенез для идентификации остатков гипервариабельных областей, вносящих значительный вклад в связывание антигена. Альтернативно или в дополнение к этому, может быть выгодным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и его мишенью. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами на замещение в соответствии с технологиями, разработанными в настоящем документе. После генерирования таких вариантов панели вариантов подвергают воздействию скрининга, и антитела с измененным сродством могут выбираться для дальнейшей разработки.
pH-чувствительный вариант антитела представляет собой вариант антитела, который имеет сродство связывания с целевым антигеном при первом pH иное, чем при связывании с этим целевым антигеном при другом pH. В качестве неограничивающего примера антитело анти-TfR по настоящему изобретению может быть выбрано или получено с помощью генной инженерии, чтобы оно имело pHчувствительное связывание с TfR, с тем, чтобы оно связывалось с желательным низким сродством (как описано в настоящем документе) с TfR поверхности клетки в плазме при pH 7,4, но при интернализации в эндосомальном компартменте, быстро диссоциировало бы от TfR при относительно низких pH (pH 5,56,0); такая диссоциация может защитить антитело от опосредуемого антигеном выведения и увеличить количество антитела, которое либо доставляется в CNS, либо рециклируется обратно через BBB - в любом случае, эффективная концентрация антитела увеличивается по сравнению с антителом анти-TfR, которое не содержит такой чувствительности к pH (см., например, Chaparro-Riggers et al. J. Biol. Chem. 287(14):11090-11097; Igawa et al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1208). Желательное сочетание сродства при pH сыворотки и при pH эндосомального компартмента может легко быть определено для TfR и конъюгированного соединения специалистом в данной области.
Антитело в настоящем документе может конъюгироваться с гетерологичной молекулой, например, для увеличения времени полужизни или стабильности или для иного усовершенствования антитела. Например, антитело может связываться с одним или несколькими небелковыми полимерами, например, полиэтиленгликолем (PEG), пропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и пропиленгликоля. Фрагменты антитела, такие как Fab', связанные с одной или несколькими молекулами PEG, представляют собой иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения. В другом примере, гетерологичная молекула представляет собой терапевтическое соединение или агент для визуализации (т.е. детектируемую метку), и антитело используется для переноса такой гетерологичной молекулы через BBB. Примеры гетерологичных молекул включают, но не ограничиваясь этим, химическое соединение, пептид, полимер, липид, нуклеиновую кислоту и белок.
Антитело в настоящем документе может представлять собой вариант с гликозилированием, такой, что любой углевод, присоединенный к Fc области, если он присутствует, изменяется, либо модифицируется относительно присутствия/отсутствия, либо модифицируется относительно типа. Например, антитела с созревшей структурой углеводов, в которой отсутствует фукоза, присоединенная к Fc области антитела, описаны в заявке на патент США № 2003/0157108 (Presta, L.). См. также US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитела с бисекцией N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к Fc области антитела, упоминаются в WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. и в патенте США № 6602684, Umana et al. Антитела по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc области антитела, обсуждаются в WO 1997/30087, Patel et al. См., также, WO 1998/58964 (Raju, S.) и WO 1999/22764 (Raju, S.) относительно антител с измененным углеводом, присоединенным к их Fc области. См.также US 2005/0123546 (Umana et al.), описывающий антитела с модифицированным гликозилированием. Мутация консенсусной последовательности гликозилирования в Fc области (Asn-X-Ser/Thr в положениях 297-299, где X не может представлять собой пролина), например, посредством мутации Asn этой последовательности, с заменой на любую другую аминокислоту, посредством помещения Pro в положение 298 или модификации положения 299 с заменой на любую аминокислоту иную, чем Ser или Thr, должно подавлять гликозилирование в этом положении (см., например, Fares Al-Ejeh et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:5519s-5527s; Imperiali and Shannon, Biochemistry (1991) 30
- 17 038367 (18):4374-4380; Katsuri, Biochem J. (1997) 323(Pt 2):415-419; Shakin-Eshleman et al, J. Biol. Chem. (1996)
271:6363-6366).
Термин гипервариабельная область или HVR, как используется в настоящем документе, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности (области, определяющие комплементарность или CDR) и/или образуют структурно определенные петли (гипервариабельные петли) и/или содержат остатки, вступающие в контакт с антигеном (контакт с антигеном). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). Иллюстративные HVR в настоящем документе включают:
(a) гипервариабельные петли, осуществляемые на остатках аминокислот 26-32 (L1), 50-52 (L2), 9196 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) CDR, осуществляемые на остатках аминокислот 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological of interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) контакты с антигенами, осуществляемые на остатках аминокислот 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); и (d) сочетания (a), (b) и/или (c), включающие остатки аминокислот HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).
В одном из вариантов осуществления, остатки HVR содержат остатки, идентифицируемые на фиг. 3A-D или 4A-D, в табл. 4 или табл. 5 или еще где-либо в настоящем описании.
Если не указано иного, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, FR остатки) нумеруются в настоящем документе в соответствии с Kabat et al., выше.
Остатки каркаса или FR представляют собой остатки вариабельного домена иные, чем остатки гипервариабельной области как определено в настоящем документе. FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR, как правило, появляются в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)FR3-H3(L3)-FR4. В определенных вариантах осуществления один или несколько FR остатков могут модифицироваться для модулирования стабильности антитела или для модулирования трехмерного позиционирования одной или нескольких HVR антитела, например, для усиления связывания.
Полноразмерное антитело представляет собой антитело, которое содержит вариабельную область связывания антигена, а также постоянный домен легкой цепи (CL) и постоянные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Постоянные домены могут представлять собой постоянные домены с нативной последовательностью (например, постоянные домены с нативной последовательностью человека) или варианты их последовательностей аминокислот.
Термины полноразмерное антитело, интактное антитело и цельное антитело используются в настоящем документе взаимозаменяемо для упоминания антитела, имеющего структуру по существу, сходную с нативной структурой антитела или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc область, как определено в настоящем документе.
Голое антитело относится к антителу, которое не конъюгируется с гетерологичным остатком (например, с цитотоксичным остатком или радиоизотопной меткой). Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.
Нативные антитела относятся к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулина с различными структурами. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. От N- до C-окончания каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три постоянных домена (CH1, CH2 и CH3). Подобным же образом от N- до C-окончания каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует постоянный легкий домен (CL). Легкая цепь антитела может быть приписана к одному из двух типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ), на основе последовательности аминокислот его постоянного домена.
Эффекторные функции антитела относится к тем биологическим активностям антитела, которые дают в результате активирование иммунной системы иное, чем активирование пути комплемента. Такие активности по большей части находятся в Fc области (Fc области нативной последовательности или Fc области последовательности аминокислот варианта) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают, например, связывание Fc рецептора и опосредуемую антитело-зависимыми клетками цитотоксичность (ADCC). В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему документу, по существу, не имеет эффекторной функции. В другом варианте осуществления, антитело по настоящему документу сохраняет минимальную эффекторную функцию. Способы модифицирования или устранения эффекторной функции хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь этим, устранение всей Fc области, ответственной за эффекторную функцию, или его части (т.е. использование антитела или фрагмента антитела в формате, где отсутствует вся Fc область или ее часть, такого, но не ограничиваясь этим, как фрагмент Fab, одноцепочечное антитело, и т.п., как описано в настоящем документе
- 18 038367 и как известно в данной области; модификацию Fc области в одном или нескольких положениях аминокислот для устранения эффекторной функции (влияющих на Fc связывания: положения 238, 239, 248, 249, 252, 254, 256, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 311, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 436, 437, 438 и 439; и модификацию гликозилирования антитела (включая, но не ограничиваясь этим, продуцирование антитела в окружающей среде, которая не дает возможности для гликозилирования для млекопитающих дикого типа, удаление одной или нескольких углеводных групп из уже гликозилированного антитела и модификацию антитела в одном или нескольких положениях аминокислот для устранения способности антитела к гликозилированию в этих положениях (включая, но не ограничиваясь этим N297G и N297A и D265A).
Функции активирования комплемента антитела или свойства антитела, которые делают возможным или запускают активирование пути комплемента используются взаимозаменяемо, и относятся к тем биологическим активностям антитела, которые вовлечены в путь активирования комплемента иммунной системы субъекта или стимулируют его. Такие активности включают, например, связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и могут опосредоваться как Fc частью, так и отличной от Fc частью антитела. Способы модификации или устранения функции активирования комплемента хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь этим, устранение всей Fc области, ответственной за активирование комплемента, или ее части (т.е. использование антитела или фрагмента антитела в формате, где отсутствует вся Fc область или ее часть, таком как, но не ограничиваясь этим, фрагмент Fab, одноцепочечное антитело и т.п., как описано в настоящем документе и как известно в данной области, или модификацию Fc области в одном или нескольких положениях аминокислот для устранения или уменьшения взаимодействий с компонентами комплемента или способности к активированию компонентов комплемента, таких как положения 270, 322, 329 и 321, как известно, вовлеченные в связывание C1q), и модификацию или устранение части области, отличной от Fc, ответственной за активирование комплемента (т.е. модифицирование CH1 области в положении 132 (см., например, Vidarte et al., (2001) J. Biol. Chem. 276 (41):38217-38223)).
В зависимости от последовательности аминокислот постоянного домена их тяжелых цепей, полноразмерные антитела могут быть приписаны к различным классам. Имеется пять главных классов полноразмерных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Постоянные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны в данной области.
Термин рекомбинантное антитело, как используется в настоящем документе, относится к антителу (например, химерному, гуманизированному антителу или антителу человека или к его фрагменту, связывающему антиген), которое экспрессирутся рекомбинантной клеткой хозяином, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело.
Термины клетка-хозяин, линия клеток-хозяев и культура клеток-хозяев используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые может вводиться экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают трансформанты и трансформированные клетки, которые включают первичные трансформированные клетки и потомство, полученное от них, вне зависимости от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты исходной клетки но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как было получено посредством скрининга или выбрано для исходных трансформированных клеток, включаются в рассмотрение в настоящем документе. Примеры клеток хозяев для продуцирования рекомбинантных антител включают: (1) клетки млекопитающих, например клетки яичников китайского хомячка (CHO), COS, клетки миеломы (включая клетки Y0 и NS0), клетки почек детенышей хомяка (BHK), клетки Hela и Vero; (2) клетки насекомых, например sf9, sf21 и Tn5; (3) клетки растений, например, растений, принадлежащих к роду Nicotiana (например, Nicotiana tabacum); (4) клетки дрожжей, например дрожжей, принадлежащих к роду Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae) или к роду Aspergillus (например, Aspergillus niger); (5) бактериальные клетки, например клетки Escherichia coli или клетки Bacillus subtilis, и т.п.
Как используется в настоящем документе, специфично связывающееся или специфично связывается с относится к антителу, селективно или предпочтительно связывающемуся с антигеном. Сродство связывания, как правило, определяется с использованием стандартного анализа, например анализа Скатчарда, или методики поверхностного плазмонного резонанса (например, с использованием BIACORE®).
Антитело, которое связывается с таким же эпитопом в качестве антитела сравнения относится к антителу, которое блокирует связывание антитела сравнения с его антигеном при конкурентном анализе на 50% или больше, и наоборот, антитело сравнения блокирует связывание антитела с его антигеном при конкурентном анализе на 50% или больше. В одном из вариантов осуществления, антитело анти-BACE1, образующее одно из биспецифичных или мультиспецифичных антител по настоящему изобретению, связывает эпитоп BACE1, связываемый с помощью YW412.8.31. Иллюстративный конкурентный анализ приводится в настоящем документе.
- 19 038367
Термин цитотоксичный агент, как используется в настоящем документе, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает осуществление клеточной функции и/или вызывает гибель или разрушение клетки. Цитотоксичные агенты включают, но не ограничиваясь этим, радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды винка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты ингибиторы роста; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и разнообразные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные в настоящем документе.
Эффективное количество агента, например фармацевтического препарата, относится к количеству эффективному при необходимых дозах и в течение периодов времени необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.
Термин Fc область в настоящем документе используется для определения C-конечной области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть постоянной области.
Термин включает Fc области нативной последовательности и Fc области вариантов. В одном из вариантов осуществления Fc область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного окончания тяжелой цепи. Однако C-конечный лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или не присутствовать. Если в настоящем документе не указано иного, нумерация остатков аминокислот в Fc области или в постоянной области осуществляется в соответствии с системой нумерации EC, также называемой индекс EC, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological of Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Термин рецептор FcRn или FcRn, как используется в настоящем документе, относится к Fc рецептору (n означает неонатальный), который, как известно, вовлечен в перенос материнских IgG в фетус через плаценту человека или приматов или желточный мешок (кролика) и новорожденному из молозива через тонкий кишечник. Также известно, что FcRn вовлечен в поддержание постоянных уровней IgG в сыворотке посредством связывания молекул IgG и рециклирования их в сыворотку. Область связывания FcRn или область связывания рецептора FcRn относится к той части антитела, которая взаимодействует с рецептором FcRn. Определенные модификации области связывания FcRn антитела увеличивают сродство антитела или его фрагмента к FcRn, а также увеличивают время полужизни молекулы in vivo. Замещения аминокислот в одном или нескольких из следующих положений аминокислот 251 256, 285, 290, 308, 314, 385, 389, 428, 434 и 436 увеличивают взаимодействие антитела с рецептором FcRn. Замещения в следующих далее положениях также увеличивают взаимодействие антитела с рецептором FcRn: 238, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замещение из (патента США № 7371826).
Иммуноконъюгат представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая, но не ограничиваясь этим, метку или цитотоксичный агент. Необязательно, такое конъюгирование осуществляется через линкер.
Линкер, как используется в настоящем документе, представляет собой структуру, которая ковалентно или нековалентно соединяет антитело анти-TfR с гетерологичной молекулой. В определенных вариантах осуществления линкер представляет собой пептид. В других вариантах осуществления линкер представляет собой химический линкер.
Метка представляет собой маркер, соединенный с антителом по настоящему документу и используется для детектирования или получения изображений. Примеры таких меток включают радиоизотопную метку, флуорофор, хромофор или афинную метку. В одном из вариантов осуществления метка представляет собой радиоизотопную метку, используемую для получения изображений, например tc99m или 1123, или спиновую метку для получения изображений с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитная резонансная томография, MRI), такую, опять же, как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец, железо и т.п.
Индивидуум или субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваясь этим, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов иных, чем люди, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В определенных вариантах осуществления индивидуум или субъект представляет собой человека.
Изолированное антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонента его естественной окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления антитело очищается до чистоты более чем 95 или 99%, как определяется, например, с помощью электрофоретических (например, SDSPAGE, изоэлектрической фокусировки (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографических (например, ионообменной хроматографии или ВЭЖХ с обращенной фазой) способов. Относительно способов оценки чистоты антитела, см., например, Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Изолированная нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отде- 20 038367 лена от компонента ее естественной окружающей среды. Изолированная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует экстрахромосомально или в хромосомальном положении, которое отличается от ее естественного хромосомального положения.
Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело анти-TfR, относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты, встроенную в один вектор или в раздельные векторы, и такая молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты присутствует в одном или нескольких положениях в клетке-хозяине.
Термин вставка в упаковку используется для упоминания инструкций, вручную вставляемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировании, введении, сочетанной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.
Процент (%) идентичности последовательностей аминокислот по отношению к последовательности полипептидов сравнения определяется как процент остатков аминокислот в рассматриваемой последовательности, которые являются идентичными с остатками аминокислот в последовательности полипептидов сравнения, после выравнивания последовательностей и введения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая никакие консервативные замещения в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности последовательностей аминокислот может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием публично доступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программное обеспечение Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине последовательностей, которые сравнивают. Для целей в настоящем документе, однако, значения % идентичности последовательностей аминокислот генерируют с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc., и код источника подан вместе с документацией пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован как U.S. Copyright Registration No. TXU 10087. Программа ALIGN-2 является публично доступной от Genentech, Inc., South San Francisco, California, или может быть компилирована из кода источника. Программа ALIGN-2 должна быть компилирована для использования на оперативной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.
В ситуациях, где ALIGN-2 используется для сравнения последовательностей аминокислот, % идентичности последовательностей аминокислот данной последовательности аминокислот A с данной последовательностью аминокислот B (это можно альтернативно перефразировать как % идентичности данной последовательности аминокислот A, которая имеет или содержит определенный % идентичности последовательностей аминокислот с данной последовательностью аминокислот B или по сравнению с ней) вычисляется следующим образом: 100 умножить на X/Y, где X представляет собой количество остатков аминокислот, оцениваемых как идентичные совпадения с помощью программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании программой A и B, и где Y представляет собой общее количество остатков аминокислот в B. Будет очевидно, что когда длина последовательности аминокислот A не равна длине последовательности аминокислот B, % идентичности последовательностей аминокислот A по отношению к B не будет равен % идентичности последовательностей аминокислот B по отношению к A. Если конкретно не утверждается иного, все значения % идентичности последовательностей аминокислот, используемые в настоящем документе, получают, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
Термин фармацевтический препарат относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы позволить биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому препарат должен вводиться.
Фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате иному, чем активный ингредиент, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничиваясь этим, буфер, наполнитель, стабилизатор или консервант.
Как используется в настоящем документе, лечение (и его грамматические варианты, такие как лечить или леченый) относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественный ход событий для индивидуума, который лечится, и может осуществляться либо для профилактики, либо в ходе клинической патологии. Желаемые воздействия лечения включают, но не ограничиваясь этим, предотвращение появления или возобновления заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение появления метастаз,
- 21 038367 уменьшение скорости развития заболевания, облегчение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению используют для замедления развития заболевания или для замедления хода заболевания.
Термин вариабельная область или вариабельный домен относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных области каркаса (FR) и три гипервариабельных области (HVR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6thed., W.H. Freeman и Co., page 91 (2007).) Один VH или VL домен может быть достаточным для придания специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть изолированы с использованием домена VH или VL от антитела, которое связывает антиген, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352:624-628 (1991).
Термин вектор, как используется в настоящем документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки хозяина, в которую он вводится. Определенные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они связаны в рабочем состоянии. Такие векторы упоминаются в настоящем документе как векторы экспрессии.
2. Композиции и способы.
A. Продуцирование антител анти-TfR и их конъюгатов.
В одном из аспектов настоящее изобретение основывается, частично, на антителах анти-TfR, которые можно использовать для переноса желаемых молекул через BBB. В определенных вариантах осуществления предлагаются антитела, которые связываются с TfR человека. В определенных вариантах осуществления предлагаются антитела, которые связываются как с TfR человека, так и с TfR приматов. Антитела по настоящему изобретению являются полезными, например, для диагностики или лечения заболеваний, воздействующих на головной мозг и/или CNS.
A. Иллюстративные антитела анти-TfR.
В одном из аспектов настоящее изобретение предлагает изолированные антитела, которые связываются с TfR. В определенных вариантах осуществления антитело анти-TfR по настоящему изобретению связывается специфично как с TfR человека, так и с TfR приматов. В определенных таких вариантах осуществления антитело анти-TfR по настоящему изобретению не ингибирует связывания трансферрина с TfR. В определенных таких вариантах осуществления антитело анти-TfR по настоящему изобретению связывается с апикальным доменом TfR. В других определенных таких вариантах осуществления антитело анти-TfR по настоящему изобретению связывается с неапикальным доменом TfR. В определенных аспектах антитела анти-TfR можно использовать для переноса одного или нескольких конъюгированных соединений для получения изображений или терапевтических соединений через BBB.
Предлагается антитело анти-TfR, где антитело содержит вариабельный домен (VL) легкой цепи, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательностей с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 105. В определенных вариантах осуществления VL последовательность, имеющая по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность содержит замещения (например, консервативные замещения), инсерции или делеции, по сравнению с последовательностью сравнения, но антитело анти-TfR, содержащее такую последовательность, сохраняет способность к связыванию с TfR. В определенных вариантах осуществления в целом от 1 до 10 аминокислот замещаются, вставляются и/или удаляются в последовательности из SEQ ID NO: 105. В определенных вариантах осуществления замещения, инсерции или делеции осуществляются в областях вне HVR (т.е. в FR). Необязательно, антитело анти-TfR содержит последовательность VL в SEQ ID NO: 105, включая посттрансляционные модификации этой последовательности.
В другом аспекте настоящего изобретения антитело анти-TfR в соответствии с любым из рассмотренных выше вариантов осуществления представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. В одном из вариантов осуществления антитело анти-TfR представляет собой фрагмент антитела, например Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или фрагмент F(ab')2. В другом варианте осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело, например интактное антитело IgG1, IgG2, IgG3 или антитело IgG4 или другой класс или изотип антитела, как определено в настоящем документе.
В другом аспекте антитело анти-TfR в соответствии с любым из рассмотренных выше вариантов осуществления может включать любой из признаков по отдельности или в сочетании, как описано в разделах 1-7, ниже.
1. Сродство антитела.
В определенных вариантах осуществления антитело, предлагаемое в настоящем документе, имеет константу диссоциации (Kd) <1 мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <0,1 нМ, <0,01 нМ или <0,001 нМ (на- 22 038367 пример, 10-8М или меньше, например от 10-8М до 10-13М, например от 10-9М до 10-13М).
В определенных аспектах настоящего изобретения антитело анти-TfR с низким сродством по настоящему изобретению выбирается, например, на основе результатов примера 5 и Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011) и Yu et al, Sci. Transl. Med. 25 May 201 1:Vol. 3, Issue 84, p.84ra44, которые показывают, что такие антитела против TfR с низким сродством демонстрируют улучшенное потребление в CNS (например, в головном мозге) и/или устойчивость в головном мозге/CNS. Для идентификации таких антител с низким сродством доступны несколько анализов для измерения сродства антитела, включая, без ограничения, анализ Скатчарда и методику поверхностного плазмонного резонанса (например, с использованием BIACORE®). В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело имеет сродство к TfR человека или приматов примерно от 5 нМ или примерно от 20 нМ, или примерно от 100 нМ, примерно до 50 мкМ, или примерно до 30 мкМ, или примерно до 10 мкМ, или примерно до 1 мкМ, или примерно до 500 нМ. Таким образом, сродство может находиться в пределах примерно от 5 нМ примерно до 50 мкМ или в пределах примерно от 20 нМ примерно до 30 мкМ, или в пределах примерно от 30 нМ примерно до 30 мкМ, или в пределах примерно от 50 нМ примерно до 1 мкМ, или в пределах примерно от 100 примерно до 500 нМ, например, как измерено с помощью анализа Скатчарда или BIACORE®. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитело имеет время полужизни при диссоциации с TfR меньше чем 1 мин, меньше чем 2 мин, меньше чем 3 мин, меньше чем 4 мин, меньше чем 5 мин или меньше чем от 10 и примерно до 20 мин, или примерно до 30 мин, как измерено с помощью анализа конкурентного связывания или BIACORE®.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ получения антитела, пригодного для переноса лекарственного средства против неврологического расстройства через гематоэнцефалический барьер, включающий выбор антитела из панели антител против TfR, поскольку оно имеет сродство TfR, которое находится в пределах примерно от 5 или примерно от 20 нМ, или примерно от 100 нМ, примерно до 50 мкМ, или примерно до 30 мкМ, или примерно до 10 мкМ, или примерно до 1 мкМ, или примерно до 500 мМ. Таким образом, сродство может находиться в пределах примерно от 5 нМ примерно до 50 мкМ или в пределах примерно от 20 нМ примерно до 30 мкМ, или в пределах примерно от 30 нМ примерно до 30 мкМ, или в пределах примерно от 50 нМ примерно до 1 мкМ, или в пределах примерно от 100 примерно до 500 нМ, как измерено, например, с помощью анализа Скатчарда или BIACORE®. Как будет понятно специалисту в данной области, конъюгирование гетерологичной молекулы/соединения с антителом часто будет уменьшать сродство антитела к его мишени, например, из-за стерического затруднения или даже устранения одного плеча связывания, если антитело делается мультиспецифичным с помощью одного или нескольких плеч, связывающихся с антигеном иным, чем исходная мишень антитела. В одном из вариантов осуществления антитело с низким сродством по настоящему изобретению, специфичное к TfR, конъюгированное с анти-BACE1, имеет Kd по отношению к TfR, как измерено с помощью BIACORE, примерно 30 нМ. В другом варианте осуществления антитело с низким сродством по настоящему изобретению, специфичное по отношению к TfR, конъюгированное с BACE1, имеет Kd по отношению TfR, как измерено с помощью BIACORE, примерно 600 нМ. В другом варианте осуществления антитело с низким сродством по настоящему изобретению, специфичное к TfR, конъюгированное с BACE1, имеет Kd по отношению TfR, как измерено с помощью BIACORE, примерно 20 мкМ. В других вариантах осуществления антитело с низким сродством по настоящему изобретению, специфичное к TfR, конъюгированное с BACE1, имеет Kd по отношению TfR, как измерено с помощью BIACORE, примерно 30 мкМ.
В одном из вариантов осуществления Kd измеряют с помощью анализа связывания радиоактивно меченого антигена (RIA). В одном из вариантов осуществления RIA осуществляют с помощью версии Fab антитела, представляющего интерес, и его антигена. Например, сродство связывания в растворе Fab с антигеном измеряют посредством уравновешивания Fab с помощью минимальной концентрации (125I)меченого антигена в присутствии последовательных титров немеченого антигена, затем захвата связанного антигена с помощью планшета, покрытого антителом анти-Fab (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Для установления условий анализа многолуночные планшеты MICROTITER (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл покрытия, захватывающего антитело анти-Fab (Cappel Labs), в 50 мМ карбоната натрия (pH 9,6), а впоследствии блокируют с помощью 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение 2-5 ч при комнатной температуре (приблизительно 23°C). На неадсорбирующем планшете (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [125I]-ангигена смешивают с последовательными разбавлениями Fab, представляющих интерес (например, совместимых с оценками антитела анти-VEGF, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)).
Затем Fab, представляющий интерес, инкубируется в течение ночи; однако инкубирование может продолжаться в течение более продолжительного периода (например, примерно 65 ч), чтобы обеспечить достижение равновесия. После этого, смеси переносят в захватывающий планшет для инкубирования при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% раствора полисорбата 20 (TWEEN-20®) в PBS. Когда планшеты сушат, добавляют 150 мкл/лунка сцинтилянта (MICROSCINT-20™; Packard), и планшеты считают на γ-счетчике TOPCOUNT™
- 23 038367 (Packard) в течение 10 мин. Концентрации каждого Fab, которые дают 20% от максимального связывания или меньше, выбирают для использования в конкурентных анализах связывания.
В одном из аспектов RIA представляет собой анализ Скатчарда. Например, антитело анти-TfR, представляющее интерес, может йодироваться с использованием лактопероксидазного способа (Bennett and Horuk, Methods in Enzymology 288 pg. 134-148 (1997)). Радиоактивно меченое антитело анти-TfR очищают от свободного 125I-Na с помощью гель-фильтрации с использованием колонки NAP-5, и измеряют его удельную активность. Конкурентные реакционные смеси по 50 мкл, содержащие фиксированную концентрацию йодированного антитела и уменьшающиеся концентрации последовательно разбавленного немеченого антитела, помещают в 96-луночные планшеты. Клетки, транзиторно экспрессирующие TfR, культивируют в средах роста, состоящих из модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM) (Genentech), дополненной 10% FBS, 2 мМ L-глютамина и 1 х пенициллинастрептомицина, при 37°C в 5% CO2. Клетки отделяют от чашек с использованием Sigma Cell Dissociation Solution и промывают буфером для связывания (DMEM с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ HEPES, pH 7,2 и 0,2% азида натрия). Промытые клетки добавляют при примерной плотности 200000 клеток в 0,2 мл буфера для связывания в 96-луночные планшеты, содержащие по 50 мкл конкурентных реакционных смесей. Конечная концентрация немеченого антитела при конкурентной реакции с клетками изменяется, начиная от 1000 нМ, а затем уменьшается посредством кратного разбавления 1:2 для 10 концентраций, и включая образец, содержащий только буфер с нулевым добавлением. Конкурентные реакции с клетками для каждой концентрацией немеченого антитела анализируются трехкратно. Конкурентные реакции с клетками инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. После 2-часового инкубирования, конкурентные реакции переносят на фильтровальный планшет и промывают четыре раза буфером для связывания с целью разделения свободных и связанных йодированных антител. Фильтры считают с помощью γ-счетчика, и данные по связыванию оценивают с использованием алгоритма подгонки Munson and Rodbard (1980) для определения сродства связывания антитела.
Иллюстративный анализ BIACORE® с использованием композиции по настоящему изобретению может быть осуществлен следующим образом.
Kd измеряют с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE®-2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с использованием набора анти-Fc человека (BiAcore Inc., Piscataway, NJ). Вкратце, биосенсорные чипы на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антитело анти-Fc человека разбавляют с помощью 10 мМ ацетата натрия, pH 4,0, до 50 мкг/мл перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/мин с получением приблизительно 10000 единиц реакции (RU) связанного белка. После инжекции антитела 1М этаноламина инжектируют для блокировки непрореагировавших групп. Для измерений кинетики, моноспецифичные или мультиспецифичные варианты антитела анти-TfR инжектируют в HBS-P с получением примерно 220 RU (единиц реакции), затем инжектируют двукратные последовательные разбавления MuTfR-His (от 0,61 до 157 нМ) в HBS-P при 25°C при скорости потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) вычисляют с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) с помощью одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (Kd) вычисляется как отношение koff/kon. См., например, Chen et al, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).
В соответствии с другим вариантом осуществления Kd измеряют с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE®-2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, с использованием набора анти-Fc человека (BiAcore Inc., Piscataway, NJ). Вкратце, биосенсорные чипы на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5, BIACORE, Inc.) активируются с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антитело анти-Fc человека разбавляют 10 мМ ацетата натрия, pH 4,0, до 50 мкг/мл перед инжектированием при скорости потока 5 мкл/мин с получением приблизительно 10000 единиц реакции (RU) связанного белка. После инжектирования антитела инжектируют 1М этаноламина для блокировки непрореагировавших групп. Для измерения кинетики, варианты антитела анти-TfR инжектируют в HBS-P с получением примерно 220 RU, затем двукратные последовательные разбавления TfR-His (от 0, 61 до 157 нМ) инжектируют в HBS-P при 25°C при скорости потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) вычисляют с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2) с помощью одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (Kd) вычисляется как отношение koff/kon. См., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865881 (1999).
В настоящей области известны несколько способов определения IC50 для данного соединения; обычный подход заключается в осуществлении анализа конкурентного связывания, такого как описано в настоящем документе. В целом, высокое значение IC50 показывает, что требуется больше антитела для
- 24 038367 ингибирования связывания известного лиганда, и таким образом, что сродство антитела к этому лиганду является относительно низким. Наоборот, низкое значение IC50 показывает, что требуется меньше антитела для ингибирования связывания известного лиганда, и таким образом, что сродство антитела к этому лиганду является относительно высоким.
Иллюстративный конкурентный анализ ELISA для измерения значения IC50 представляет собой анализ, при котором возрастающие концентрации вариантов антител анти-Tf или анти-TfR/антиген головного мозга (т.е. анти-TfR/BACE1, анти-TfR Abeta и т.п.) используются для конкуренции с биотинилированным известным антителом анти-TfR за связывание с TfR. Конкурентный анализ ELISA анти-TfR осуществляют на планшетах Maxisorp (Neptune, N.J.), покрытых 2,5 мкг/мл очищенного внеклеточного домена TfR мышиных в PBS при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают с помощью PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). Титры каждого индивидуального антитела анти-TfR или анти-TfR/антиген головного мозга (т.е. анти-TfR/BACE 1 или анти-TfR/Ae) (последовательные разбавления 1:3) объединяют с биотинилированным известным антителом анти-TfR (конечная концентрация 0,5 нМ) и добавляют на планшет в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05%) Tween 20 и добавляют на планшет HRP-стрептавидин (Southern Biotech, Birmingham), и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и биотинилированное антитело анти-TfR, связанное на планшете, детектируют с использованием субстрата ТМВ (BioFX Laboratories, Owings Mills).
2. Фрагменты антител.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой фрагмент антитела.
Фрагменты антител включают, но не ограничиваясь этим, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv и другие фрагменты, описанные ниже. Относительно обзора определенных фрагментов антител, см. Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Относительно обзора фрагментов scFv, см., например, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США №№ 5571894 и 5587458. Относительно обсуждения фрагментов Fab и F(ab')2, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих повышенное время полужизни in vivo, см. патент США № 5869046.
Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя сайтами связывания антигена, которые могут быть бивалентными или биспецифичными. См., например, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описываются в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие все вариабельные домены тяжелой цепи или их часть или все вариабельные домены легкой цепи антитела или их часть. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент США № 6248516 B1).
Фрагменты антител могут быть получены с помощью различных методик, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое переваривание интактного антитела, а также продуцирование посредством рекомбинантных клеток хозяев (например, Е. coli или фага), как описано в настоящем документе.
3. Химерные и гуманизированные антитела.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой химерное антитело. Определенные химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:681-6855 (1984)). В одном из примеров химерное антитело содержит вариабельную область, не принадлежащую человеку (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, отличного от человека, такого как обезьяна), и постоянную область человека. Химерные антитела, представляющие интерес, в настоящем документе включают приматизированные антитела, содержащие связывающие антиген последовательности вариабельного домена, полученные от примата, отличного от человека (например, мартышковых, таких как бабуин, макак-резус или обезьяна циномолгус) и последовательности постоянной области человека (патент США № 5693780). В другом примере химерное антитело представляет собой антитело с переключением синтеза, у которого класс или подкласс отличается от класса или подкласса исходного антитела. Химерные антитела включают их фрагменты, связывающие антиген.
В определенных вариантах осуществления химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не принадлежащее человеку, гуманизируется для уменьшения иммуногенности для человека, в то же время сохраняя специфичность и сродство исходного антитела, не принадлежащего человеку. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например CDR (или их части), получают из антитела, не принадлежащего человеку, a FR (или их части) получают из последовательности антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно будет также содержать по меньшей мере часть постоянной области человека. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещаются соответствующими остатками из антитела, не принадлежащего человеку (например, антитела, из которого получают остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности
- 25 038367 или сродства антитела.
Гуманизированные антитела и способы их получения обсуждаются, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) и дополнительно описываются, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); в патентах США №№ 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (описывающей прививку области, определяющей специфичность (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описывающей изменение поверхности); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (описывающей перемешивание FR); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описывающей подход направленной селекции к перемешиванию FR).
Области каркаса человека, которые можно использовать для гуманизации, включают, но не ограничиваясь этим, области каркаса, выбранные с использованием способа наилучшей подгонки (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); области каркаса, полученные из консенсусной последовательности антител человека из конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol, 151:2623 (1993)); области созревшего (соматически мутировавшего) каркаса человека или области зародышевой линии каркаса человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и из областей каркаса, полученных при скрининге FR библиотек (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Антитела человека.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой антитело человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных технологий, известных в данной области. Антитела человека в целом описаны в van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001), и в Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Антитела человека могут быть получены посредством введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицируется для продуцирования интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенное провоцирование. Такие животные, как правило, содержат все те локусы иммуноглобулина человека или их часть, которые заменяют локусы эндогенного иммуноглобулина или которые присутствуют экстрахромосомально или встраиваются неупорядоченно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей локусы эндогенного иммуноглобулина, как правило, дезактивируются. Относительно обзора способов получения антител человека от трансгенных животных, см. Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№ 6075181 и 6150584, описывающие методику XENOMOUSE™; патент США № 5770429, описывающий методику HUMAB®; патент США № 7041870, описывающий методику K-M MOUSE®, и публикацию заявки на патент № US 2007/0061900, описывающую методику VELOCIMOUSE®). Вариабельные области человека от интактных антител, генерируемых такими животными, могут дополнительно модифицироваться, например, посредством объединения с другой постоянной областью человека.
Антитела человека могут также быть получены с помощью способов, основанных на гибридоме. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продуцирования моноклональных антител человека. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).) Антитела человека, генерируемые посредством методики гибридомы В-лимфоцитов человека, также описываются в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают те, которые описаны, например, в патенте США № 7189826 (описывающих получение моноклональных антител IgM человека из линий клеток гибридомы) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описывающей гибридомы человек-человек). Методика гибридомы человека (методика Trioma) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005), и в Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
Антитела человека могут также генерироваться посредством изолирования последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранных из библиотек фаговых дисплеев, полученных от человека. Такие последовательности вариабельного домена могут затем объединяться с желаемым постоянным доменом человека. Методики выбора антител человека из библиотек антител описаны ниже.
5. Антитела, полученные из библиотек.
Антитела по настоящему изобретению могут изолироваться посредством скрининга комбинаторных библиотек относительно антител с желаемой активностью или активностями. Например, в данной области известны различные способы генерирования библиотек фаговых дисплеев и скрининга таких библиотек относительно антител, обладающих желаемыми характеристиками связывания. Такие способы обсуждаются, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), и дополнительно описываются, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks and Bradbury, в Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu
- 26 038367 et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004).
В определенных способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL клонируются по отдельности с помощью цепной реакции полимеразы (PCR) и рекомбинируют случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем могут просматриваться относительно фага, связывающего антиген, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Фаговый дисплей, как правило, отображает фрагменты антител, либо как одноцепочечные Fv(scFv) фрагменты, либо как Fab фрагменты. Библиотеки от иммунизированных источников обеспечивают антитела с высоким сродством к иммуногену без требования конструирования гибридом. Альтернативно, может клонироваться наивный репертуар (например, от человека) для получения антител из одного источника для широкого диапазона не своих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки могут также быть получены синтетически посредством клонирования неперегруппированных сегментов V-генов от стволовых клеток и с использованием праймеров PCR, содержащих случайную последовательность, для кодирования сильно вариабельных областей CDR3 и для осуществления перегруппировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки антител человека, включают, например, патент США № 5750373 и публикации патентов США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, изолированных из библиотек антител человека, рассматриваются в настоящем документе как антитела человека или фрагменты антител человека.
6. Мультиспецифичные антитела.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, например биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичность связывания по меньшей мере для двух различных сайтов. В определенных вариантах осуществления одна из специфичностей связывания предназначена для TfR, а другая для любого другого антигена. В определенных вариантах осуществления биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами TfR. Биспецифичные антитела могут также использоваться для локализации цитотоксичных агентов в клетках, которые экспрессируют TfR. Биспецифичные антитела могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антитела.
Методики получения мультиспецифичных антител включают, но не ограничиваясь этим, рекомбинантное совместное экспрессирование двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина, имеющих различные специфичности (см. Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)), и генную инженерию выступ во впадину (см., например, патент США № 5731168). Мультиспецифичные антитела могут также быть получены посредством конструирования электростатических управляющих эффектов для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004A1); перекрестного связывания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); использования лейциновых 'молний' для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); использование методики диател для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) и использование одноцепочечных димеров Fv(sFv) (см., например Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и приготовление триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).
Антитело или фрагмент в настоящем документе также включает Fab двойного действия или DAF, содержащий сайт связывания антигена, который связывается с TfR, а также с другим, отличным от него антигеном (см., например, US 2008/0069820).
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, связывание осуществляется посредством генерирования мультиспецифичного антитела (например, биспецифичного антитела). Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания по меньшей мере к двум различным антигенам или эпитопам. В одном из вариантов осуществления мультиспецифичное антитело содержит первый сайт связывания антигена, который связывает TfR, и второй сайт связывания антигена, который связывает антиген головного мозга, такой как β-секретаза 1 (BACE1) или Ae, и другие антигены головного мозга, описанные в настоящем документе.
Иллюстративный антиген головного мозга, связываемый с помощью мультиспецифичного/биспецифичного антитела, представляет собой BACE1, и иллюстративное антитело, связывающееся с ним, представляет собой антитело YW412.8.31 на фиг. 16A-B в настоящем документе.
В другом варианте осуществления антиген головного мозга представляет собой Ae, примеры таких антител описаны в WO 2007068412, WO 2008011348, WO 20080156622 и WO 2008156621, в явном виде включаемых в настоящий документ в качестве ссылок, при этом иллюстративное антитело к Ae включает антитело IgG4 MABT5102A, содержащее последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепи, на
- 27 038367 фиг. 11A и 11B соответственно.
Методики получения мультиспецифичных антител включают, но не ограничиваясь этим, рекомбинантное совместное экспрессирование двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина, имеющих различные специфичности (см. Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)) и генную инженерию выступ во впадину (см., например, патент США № 5731168). Мультиспецифичные антитела могут также быть получены посредством конструирования электростатических управляющих эффектов для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004 A1); перекрестного связывания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); использования лейциновых 'молний' для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); использования методики диател для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) и использования одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см., например Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)) и приготовления триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).
Полученные с помощью генной инженерии антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания антигена, включая антитела осьминоги или иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами (DVD), также включаются в настоящий документ (см., например, US 2006/0025576 A1 и Wu et al. Nature Biotechnology (2007)).
7. Варианты антител.
В определенных вариантах осуществления рассматриваются варианты последовательностей аминокислот антител, предложенных в настоящем документе. Например, может быть желательным улучшение сродства связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты последовательности аминокислот антитела могут быть получены посредством введения соответствующих модификаций в последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или инсерции и/или замещения остатков в последовательностях аминокислота антитела. Может осуществляться любое сочетание делеций, инсерции и замещений для получения конечного конструкта, при условии, что конечный конструкт обладает желаемыми характеристиками, например связывает антиген.
a) Варианты замещений, инсерций и делеций.
В определенных вариантах осуществления предлагаются варианты антител, имеющие одно или несколько замещений аминокислот. Сайты, представляющие интерес, для мутагенеза с помощью замещений включают HVR и FR. Консервативные замещения показаны в табл. 2 под заголовком Предпочтительные замещения. Более существенные изменения приводятся в табл. 2 под заголовком Иллюстративные замещения и дополнительно описываются ниже со ссылками на классы боковых цепей аминокислот. Замещения аминокислот могут вводиться в антитело, представляющее интерес, и в продукты, просматриваемые относительно желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, уменьшения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.
Т аблица 2
Исходный остаток Иллюстративные замещения Предпочтительные замещения
Ala (А) Val; Leu; lie Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
- 28 038367
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (С) Scr; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
He (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu
Leu (L) норлейцин; lie; Val; Met; Ala; Phe lie
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Leu
Аминокислоты могут группироваться в соответствии с общими свойствами боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, He;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замещения будут давать замену элемента одного из этих классов на другой класс.
Один из типов вариантов с замещением включает замещение одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Как правило, полученный в результате вариант(варианты) выбранный для дальнейших исследований, будет иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенное сродство, пониженную иммуногенность) по сравнению с исходным антителом и/или будет иметь, по существу, сохраненные определенные биологические свойства исходного антитела. Иллюстративный вариант с замещением представляет собой антитело с созревшим сродством, которое может быть удобным генерировать, например, с использованием методик созревания сродства на основе фагового дисплея, таких как те, которые описаны в настоящем документе. Вкратце, один или несколько остатков HVR мутируют, и варианты антител получают с помощью фагового дисплея и просматривают на конкретную биологическую активность (например, сродство связывания).
Изменения (например, замещения) могут осуществляться, например, в HVR, для улучшения сродства антитела. Такие изменения можно осуществлять в горячих точках HVR, т.е. на остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутациям с высокой частотой в течение процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или на остатках, которые вступают в контакт с антигеном, при этом полученный в результате вариант VH или VL исследуют на сродство связывания. Созревание сродства посредством конструирования и повторного выбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В некоторых вариантах осуществления созревания сродства вводится разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, с помощью любого из разнообразных способов (например, PCR со склонностью к ошибкам, перемешивания цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создается вторичная библиотека. Затем осуществляют скрининг библиотеки для идентификации любых вариантов антитела с желаемым сродством. Другой способ введения разнообразия включает HVR-направленные подходы, при которых рандомизируются
- 29 038367 несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз).
Остатки HVR, вовлеченные в связывание с антигеном, могут быть специфично идентифицированы, например, с использованием аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.
В определенных вариантах осуществления замещения, инсерции или делеции могут осуществляться в одной или нескольких HVR постольку, поскольку такие изменения не уменьшают существенно способности антитела к связыванию антигена. Например, в HVR можно осуществлять консервативные изменения (например, консервативные замещения, как предлагается в настоящем документе), которые не уменьшают существенно сродства связывания. Такие изменения могут находиться, например, вне остатков, вступающих в контакт с антигеном, в HVR. В определенных вариантах осуществления вариантов VH и VL последовательностей, предложенных выше, каждая HVR либо остается неизменной, либо содержит не более одного, двух или трех замещений аминокислот.
Полезный способ для идентификации остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями для мутагенеза, называется аланин-сканирующий мутагенез, как описано в and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе остаток или группа целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируются и заменяются нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения того, влияет ли это на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замещения могут вводиться в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к начальным замещениям. Альтернативно или в дополнение к этому, кристаллическая структура комплекса антиген-антитело может использоваться для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние с ними остатки могут быть сделаны мишенями или устранены в качестве кандидатов на замещение. Можно осуществить скрининг вариантов для определения того, содержат ли они желаемые свойства.
Инсерции в последовательности аминокислот включают амино- и/или карбоксилконечные слияния, находящиеся в пределах длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, а также инсерции внутри последовательности из одного или множества остатков аминокислот. Примеры конечных инсерции включают антитело с N-конечным метионильным остатком. Другие варианты инсерции для молекулы антитела включают слияние с N-или C-окончанием антитела фермента (например, ADEPT) или полипептида, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке.
b) Варианты с гликозилированием.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, изменяется для увеличения или уменьшения той степени, до которой антитело гликозилировано. Добавление или удаление сайтов гликозилирования в антитело может быть удобным осуществлять посредством такого изменения последовательности аминокислот, при котором создается или удаляется один или несколько сайтов гликозилирования.
Когда антитело содержит Fc область, углевод, присоединенный к ней, может изменяться. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный, двухантеннарный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 домена CH2 Fc области. См., например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может содержать разнообразные углеводы, например маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, соединенную с GlcNAc, в стебле двухантеннарной структуры олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления могут осуществляться модификации олигосахарида в антителе по настоящему изобретению для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.
В одном из вариантов осуществления предлагаются варианты антитела, имеющие структуру углевода, в котором отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или косвенно) к Fc области. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1 до 80%, от 1 до 65%, от 5 до 65% или от 20 до 40%. Количество фукозы определяется посредством вычисления среднего количества фукозы в сахарной цепи на Asn297, по отношению к сумме всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), как измерено с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к аспарагиновому остатку, расположенному около положения 297 в Fc области (EC нумерация остатков Fc области); однако Asn297 может также располагаться примерно за ±3 аминокислоты до или после положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за малого разброса последовательностей в антителах. Такие варианты с фукозилированием могут иметь улучшенную функцию ADCC. См., например, публикации патентов США №№ 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (yowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к дефукозилированным или фукоза-дефицитным вариантам антител, включают US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Примеры линий клеток, способных продуцировать дефукозилированные антитела, вклю- 30 038367 чают линию клеток Lec13CHO, дефицитную по фукозилированию белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка на патент США № 2003/0157108 Al, Presta, L.; и WO 2004/056312 A1,
Adams et al., в частности пример 11), и линии нокаутированных клеток, такие как клетки с геном α-1,6фукозилтрансферазы, FUT8, нокаутированные клетки CHO (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech.
Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006) и WO 2003/08107).
Кроме того, предлагаются варианты антител с разделенными пополам олигосахаридами, например, в которых двухантеннарный олигосахарид, присоединенный к Fc области антитела, делится пополам посредством GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное фукозилирование и/или улучшенную функцию ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); в патенте США № 6602684 (Umana et al); и в US 2005/0123546 (Umana et al.). Варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc области, также предлагаются. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Варианты Fc области.
В определенных вариантах осуществления одна или несколько модификаций аминокислот могут вводиться в Fc область антитела, предложенного в настоящем документе, тем самым генерируя вариант Fc области. Вариант Fc области может содержать последовательность Fc области человека (например, Fc область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую модификацию аминокислот (например, замещение) в одном или нескольких положениях аминокислот.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение рассматривает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для применений, в которых является важным время полужизни антитела in vivo, и при этом определенные эффекторные функции (такие как активирование комплемента и ADCC) являются ненужными или вредными. Могут осуществляться анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo, чтобы подтвердить уменьшение/обеднение активностей CDC и/или ADCC. Например, могут осуществляться анализы связывания Fc рецептора (FcR), чтобы убедиться, что для антитела отсутствует связывание FcyR (следовательно, вероятно отсутствует активность ADCC), но сохраняется способность связывания FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK клетки экспрессируют только FcyRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессирование FcR в гематопоэтических клетках приводится в табл. 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC молекулы, представляющей интерес, описаны в патенте США № 5500362 (см., например Hellstrom, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:70597063 (1986)) и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно, можно использовать методы нерадиоактивных анализов (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные клетки киллеры (NK). Альтернативно или в дополнение к этому, активность ADCC молекулы, представляющей интерес, может оцениваться in vivo, например, на животной модели такой, как та, которая описывается в Clynes et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Анализ связывания C1q может также осуществляться для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q, и, следовательно, у него отсутствует активность CDC. См., например, анализ ELISA связывания C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активирования комплемента может быть осуществлен анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Связывание FcRn и определение выведения/времени полужизни in vivo также могут осуществляться с использованием способов, известных в данной области (см., например, Petkova, S.B. et al., lntl. Immunol. 18 (12):1759-1769 (2006)).
Неограничивающие примеры антител с уменьшенной эффекторной функцией включают антитела с замещением одного или нескольких остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 Fc области (патент США № 6737056). Такие Fc мутанты включают Fc мутанты с замещениями в двух или более положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый Fc мутант DANA с замещением остатков 265 и 297 аланином (патент США № 7332581).
Описаны определенные варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (См., например, патент США № 6737056; WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2):6591-6604 (2001)).
В определенных вариантах осуществления вариант антитела содержит Fc область с одним или несколькими замещениями аминокислот, которые улучшают ADCC, например, замещениями в положениях 298, 333 и/или 334 Fc области (нумерация остатков EC).
В некоторых вариантах осуществления осуществляют изменения в Fc области, которые дают в ре- 31 038367 зультате изменение (т.е. либо улучшение, либо ухудшение) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США № 6194551, WO 99/51642 и в
Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Антитела с увеличенными временами полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным Fc рецептором (FcRn), который является ответственным за перенос материнских IgG фетусу (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc область с одним или несколькими замещениями в ней, которые улучшают связывание Fc области с FcRn. Такие неограничивающие варианты Fc включают варианты с замещениями в одном или нескольких остатках Fc области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например замещение остатка 434 Fc области (патент США № 7371826).
См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821 и WO 94/29351 относительно других примеров вариантов Fc области.
d) Полученные с помощью генной инженерии цистеиновые варианты антител.
В определенных вариантах осуществления может быть желательным создание полученных с помощью генной инженерии цистеиновых антител, например thioMAb, в которых один или несколько остатков антитела замещены цистеиновыми остатками. В конкретных вариантах осуществления замещенные остатки появляются на доступных сайтах антитела. Посредством замещения этих остатков цистеином реакционноспособные тиольные группы позиционируются тем самым на доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими остатками, такими как остатки лекарственных средств или остатки линкер-лекарственное средство, для создания иммуноконъюгата, как дополнительно описывается в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления любые один или несколько из следующих остатков могут быть замещены цистеином: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; A118 (нумерация EC) тяжелой цепи и S400 (нумерация EC) Fc области тяжелой цепи.
Полученные с помощью генной инженерии цистеиновые антитела могут генерироваться, как описано, например, в патенте США № 7521541.
e) Производные антител.
В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в настоящем документе, может дополнительно модифицироваться, чтобы оно содержало дополнительные небелковые остатки, которые известны в данной области и являются легкодоступными. Остатки, пригодные для дериватизации антитела, включают, но не ограничиваясь этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо неупорядоченные сополимеры) и декстран или поли(нвинилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропилпропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси.
Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве, благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным.
Количество полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться, и если присоединено больше одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. Как правило, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, может определяться на основе соображений, включающих, но не ограничиваясь этим, конкретные свойства или функции антитела, которые должны быть улучшены, то, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных состояниях, и т.п.
В другом варианте осуществления предлагаются конъюгаты антитела и небелкового остатка, которые могут селективно нагреваться при экспонировании для излучения. В одном из вариантов осуществления небелковый остаток представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны, и они включают, но не ограничиваясь этим, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый остаток до такой температуры, при которой клетки, находящиеся рядом с антителом-небелковым остатком, погибают.
B. Рекомбинантные способы и композиции.
Антитела могут продуцироваться с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567. В одном из вариантов осуществления предлагается изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело анти-TfR, описанное в настоящем документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать последовательность аминокислот, содержащую VL, и/или последовательность аминокислот, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В другом варианте осуществления предлагаются один или несколько векторов (например, векторов экспрессии), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления
- 32 038367 предлагается клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких вариантов осуществления клетка-хозяин содержит (например, трансформируется с его помощью): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VL антитела, и последовательность аминокислот, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислот, содержащую VH антитела. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин является эукариотической, например представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном из вариантов осуществления предлагается способ получения антитела анти-TfR, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как приведено выше, при условиях, пригодных для экспрессирования антитела, и необязательно, извлечение антитела из клетки-хозяина (или культурной среды клеткихозяина).
Для рекомбинантного продуцирования антитела анти-TfR, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, например, как описано выше, изолируется и вставляется в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессирования в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может легко быть изолирована и секвенирована с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессирования векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в настоящем документе. Например, антитела могут продуцироваться в бактериях, в частности, когда не нужны гликозилирование и Fc эффекторная функция. Относительно экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактерии, см., например, патенты США №№ 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, которая описывает экспрессирование фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессирования антитело может изолироваться из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и может дополнительно очищаться.
В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как нитевидные грибки или дрожжи, являются пригодными для использования хозяевами для клонирования или экспрессирования векторов, кодирующих антитело, включая штаммы грибков и дрожжей, где пути гликозилирования являются германизированными, что дает в результате продуцирование антитела со структурой гликозилирования, которая частично или полностью соответствует человеку. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Клетки хозяева пригодные для экспрессирования гликозилированного антитела также получаются из многоклеточных организмов (беспозвоночных животных и позвоночных животных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и клетки насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые могут использоваться в связи с клетками насекомых, в частности, для трансфицирования клеток Spodoptera frugiperda.
Культуры клеток растений также могут использоваться в качестве хозяев. См., например, патенты США №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие методику PLANTIBODIES™ для продуцирования антител в трансгенных растениях).
Клетки позвоночных можно также использовать в качестве хозяев. Например, полезными могут быть линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другие примеры полезных линий клеток хозяев млекопитающих представляют собой линию клеток CV1 почек обезьян, трансформированную посредством SV40 (COS-7); линию клеток почек эмбриона человека (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детеныша хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1); клетки почек африканской зеленой обезьяны (VERO76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почек собачьих (MDCK); клетки печени крысы баффало (BRL 3A); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, как описано, например, в Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие полезные линии клеток хозяев млекопитающих включают клетки яичников китайского хомячка (CHO), включая клетки DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) и линии клеток шеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Относительно обзора определенных линий клеток хозяев млекопитающих пригодных для продуцирования антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
C. Анализы.
Антитела анти-TfR, предложенные в настоящем документе, могут идентифицироваться, просматриваться или характеризоваться относительно их физических/химических свойств и/или биологических активностей с помощью разнообразных анализов, известных в данной области.
- 33 038367
1. Анализ связывания и другие анализы.
Доступны разнообразные методики для определения связывания антитела с TfR. Один из таких анализов представляет собой иммуносорбентный анализ с помощью связанного фермента (ELISA) для подтверждения способности связывания с TfR человека (и с антигеном головного мозга). В соответствии с этим анализом планшеты, покрытые антигеном (например, рекомбинантным TfR), инкубируют вместе с образцом, содержащим антитело анти-TfR, и определяют связывание антитела с антигеном, представляющим интерес.
В одном из аспектов антитело по настоящему изобретению исследуют относительно его активности связывания антигена, например, с помощью известных способов, таких как ELISA, Western blot и т.п.
В другом аспекте можно использовать конкурентные анализы для идентификации антитела, которое конкурирует с любым из антител по настоящему изобретению за связывание с TfR. В определенных вариантах осуществления такое конкурирующее антитело связывается с таким же эпитопом (например, с линейным или конформационным эпитопом), как связан с любым из антител по настоящему изобретению, более конкретно, с любым из эпитопов, специфично связанных с антителами в классе I, классе II, классе III или классе IV, как описано в настоящем документе (см., например, пример 1 и табл. 4). Подробные иллюстративные способы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, приведены в Morris (1996) Epitop Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В иллюстративном конкурентном анализе иммобилизованный TfR инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с TfR (например, одно или несколько из антител, описанных в настоящем документе), и второе немеченое антитело, которое исследуют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с TfR. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный TfR инкубируется в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубирования при условиях, дающих возможность для связывания первого антитела с TfR, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, связанное с иммобилизованным TfR. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным TfR, существенно уменьшается в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом, это показывает, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с TfR. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Анализы активности.
В одном из аспектов предлагаются анализы для идентификации антител анти-TfR, имеющих биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, перенос соединения, ассоциированного/конъюгированного с антителом, через BBB в головной мозг и/или CNS. Также предлагаются антитела, имеющие такую биологическую активность in vivo и/или in vitro.
В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению исследуется на такую биологическую активность.
D. Иммунноконъюгаты.
Настоящее изобретение также предлагает иммунноконъюгаты, содержащие антитело анти-TfR по настоящему документу, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксичными агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, агенты для ингибирования роста, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
В одном из вариантов осуществления антитело анти-TfR по настоящему документу связано с лекарственным средством против неврологического расстройства, химиотерапевтическим агентом и/или агентом для получения изображений для более эффективного переноса лекарственного средства, химиотерапевтического агента и/или радиофармацевтического средства через BBB.
Ковалентное конъюгирование может быть либо прямым, либо через линкер. В определенных вариантах осуществления прямое конъюгирование осуществляется посредством конструирования белка слияния (т.е. посредством генетического слияния двух генов, кодирующих антитело анти-TfR, и, например, лекарственное средство против неврологического расстройства, и экспрессирования их в виде одного белка). В определенных вариантах осуществления прямое конъюгирование осуществляется посредством образования ковалентной связи между реакционноспособной группой на одной из двух частей антитела анти-TfR и соответствующей группой или акцептором, например, на неврологическом лекарственном средстве. В определенных вариантах осуществления прямое конъюгирование осуществляется посредством модифицирования (т.е. генетического модифицирования) одной из двух молекул, которые должны конъюгироваться, для включения реакционноспособной группы (в качестве неограничивающих примеров, сульфгидрильной группы или карбоксильной группы), которая образует ковалентное присоединение к другой молекуле, которая должна конъюгироваться, при соответствующих условиях. В качестве одного из неограничивающих примеров молекула (например, аминокислота) с желаемой реакционноспособной группой (например, цистеиновым остатком) может вводиться в антитело анти-TfR, и образуется дисульфидная связь, например, с неврологическим лекарственным средством. Способы ковалентного конъюги- 34 038367 рования нуклеиновых кислот с белками также известны в данной области (т.е. фотосвязывание, см., например, Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74:77-95 (2005)).
Нековалентное конъюгирование может представлять собой любые средства нековалентного присоединения, включая гидрофобные связи, ионные связи, электростатические взаимодействия и т. п., как можно легко понять специалисту в данной области.
Конъюгирование также может осуществляться с использованием разнообразных линкеров. Например, антитело анти-TfR и неврологическое лекарственное средство могут конъюгироваться с использованием различных бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глютаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), бис-диазониевые производные (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этиленлдиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
Например, рициновый иммунотоксин может быть приготовлен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриамипентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративный хелатирующий агент для конъюгирования радиоактивного нуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Пептидные линкеры, состоящие из однойдвадцати аминокислот, соединенных пептидными связями, также могут использоваться. В определенных таких вариантах осуществления аминокислоты выбираются из двадцати встречающихся в природе аминокислот. В определенных других таких вариантах осуществления одна или несколько аминокислот выбираются из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глютамина и лизина. Линкер может представлять собой отщепляемый линкер, облегчающий высвобождение неврологического лекарственного средства при доставке в головной мозг. Можно использовать, например, кислотно-лабильный линкер, пептидазачувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США № 5208020).
Настоящее изобретение в явном виде рассматривает, но не ограничиваясь этим, конъюгаты, полученные с помощью кросс-линкерных реагентов, включая, но не ограничиваясь этим, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфоGMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA).
В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антителолекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгируется с одним или несколькими лекарственными средствами, включая, но не ограничиваясь этим, майтансиноид (см. патенты США №№ 5208020, 5416064 и европейский патент EP 0425235 B1); ауристатин, такой как остатки DE и DF лекарственного средства монометилауристатина (MMAE и MMAF) (см. патенты США №№ 5635483 и 5780588 и 7498298); доластатин; калихимицин или его производное (см. патенты США №№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США № 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксель, паклитаксель, ларотаксель, тезетаксель и ортатаксель; трихотхецин и CC1065.
В другом варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в настоящем документе, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь этим, цепь A дифтерии, несвязывающиеся активные фрагменты токсина дифтерии, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модеццина, α-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
В другом варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в настоящем документе, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоактивного конъюгата. Доступны разнообразные радиоактивные изотопы для получения радиоактивных конъюгатов. Примеры включают At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. Когда для детектирования используют радиоактивный конъюгат, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc99m или I123, или спиновую метку для получения изображений с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитная резонансная томография, MRI), такую, опять же, как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
- 35 038367
E. Способы и композиции диагностики и детектирования.
В определенных вариантах осуществления любое из антител анти-TfR, предложенных в настоящем документе, являются полезными для детектирования присутствия TfR в биологическом образце. Термин детектирование, как используется в настоящем документе, охватывает количественное или качественное детектирование. В определенных вариантах осуществления биологический образец содержит клетку или ткань, например кровь (например, незрелые эритроциты), CSF и ткань, содержащую BBB.
В одном из вариантов осуществления предлагается антитело анти-TfR для использования в способе диагностики или детектирования. В другом аспекте предлагается способ детектирования присутствия TfR в биологическом образце. В определенных вариантах осуществления способ включает вступление в контакт биологического образца с антителом анти-TfR, как описано в настоящем документе, при условиях, дающих возможность для связывания антитела анти-TfR с TfR и для детектирования того, образуется ли комплекс между антителом анти-TfR и TfR. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления антитело анти-TfR используется для выбора субъектов, пригодных для терапии с помощью антитела анти-TfR, например, когда TfR представляет собой биомаркер для выбора пациентов.
Иллюстративные расстройства, которые могут диагностироваться с использованием антитела по настоящему изобретению, включают расстройства с участием незрелых эритроцитов, благодаря тому факту, что TfR экспрессируется в ретикулоцитах и по этой причине является детектируемым с помощью любых антител по настоящему изобретению. Такие расстройства включают анемию и другие расстройства, возникающие из-за пониженных уровней ретикулоцитов, или врожденную полицитемию или истинную неопластическую полицитемию, где повышенные количества эритроцитов из-за гиперпролиферации, например ретикулоцитов, дает в результате загущение крови и сопутствующие физиологические симптомы.
В определенных вариантах осуществления предлагаются меченые антитела анти-TfR. Метки включают, но не ограничиваясь этим, метки или остатки, которые детектируются непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-оплотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также такие остатки, как ферменты или лиганды, которые детектируются опосредованно, например, с помощью ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Иллюстративные метки включают, но не ограничиваясь этим, радиоизотопы 32Р, 14C, 125I, 3H и 131I, флюорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и их производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон, люциферазы, например люциферазу светлячков и бактериальную люциферазу (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, βгалактозидазу, глюкоамилазу, лизозим, сахаридоксидазы, например глюкозаоксидазу, галактозаоксидазу и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанные с ферментом, который использует перекись водорода для окисления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидазу или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.
В одном из вариантов осуществления у интактного антитела отсутствует эффекторная функция. В другом варианте осуществления интактное антитело имеет пониженную эффекторную функцию. В другом варианте осуществления интактное антитело получают с помощью генной инженерии, чтобы оно имело пониженную эффекторную функцию. В одном из аспектов антитело представляет собой Fab. В другом аспекте антитело имеет одну или несколько Fc мутаций, уменьшающих или устраняющих эффекторную функцию. В другом аспекте антитело имеет модифицированное гликозилирование, например, благодаря продуцированию антитела в системе, в которой отсутствуют нормальные ферменты гликозилирования человека. В другом аспекте основная цепь Ig модифицируется до цепи, которая естественным образом обладает пониженной эффекторной функцией или вообще ее не имеет.
Доступны разнообразные методики для определения связывания антитела с TfR. Один из таких анализов представляет собой иммуносорбентный анализ с помощью связанного фермента (ELISA) для подтверждения способности к связыванию с TfR человека (и с антигеном головного мозга). В соответствии с этим анализом планшеты, покрытые антигеном (например, рекомбинантным TfR), инкубируются вместе с образцом, содержащим антитело анти-TfR, и определяется связывание антитела с антигеном, представляющим интерес.
Анализы для оценки потребления системно вводимого антитела и другой биологической активности антитела могут осуществляться, как описано в примерах или как известно для антитела антиантиген CNS, представляющего интерес.
В одном из аспектов предлагаются анализы для идентификации антител анти-TfR, конъюгированных (либо ковалентно, либо нековалентно) с антителами анти-BACE1, имеющими биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, ингибирование активности аспартилпротеазы BACE1. Также предлагаются антитела, имеющие такую же биологическую активность in vivo и/или in vitro, например, как оценивается с помощью гомогенного флуоресцентного анализа HTRF с разрешением по времени или микрогидродинамического капиллярного электрофоретического анализа (MCE) с использованием синтетических пептидов в качестве субстрата или in vivo в линиях клеток, ко
- 36 038367 торые экспрессируют субстраты BACE1, такие как APP.
F. Фармацевтические препараты.
Фармацевтические препараты для анти-TfR, как описано в настоящем документе, приготавливают посредством смешивания такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются, как правило, нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваясь этим, буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид, бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (меньше примерно, чем 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; формирующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители по настоящему документу дополнительно включают агенты для диспергирования лекарственных средств в кишечнике, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например растворимые гликопротеины гиалуронидазы человека PH-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Определенные иллюстративные sHASEGPs и их способы использования, включая rHuPH20, описаны в публикациях патентов США № 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном из аспектов sHASEGP объединяется с одной или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Иллюстративные лиофилизированные препараты антитела описаны в патенте США № 6267958. Водные препараты антитела включают те, которые описаны в патенте США № 6171586 и в WO 2006/044908, последние препараты включают гистидин-ацетатный буфер.
Препарат по настоящему документу может также содержать несколько активных ингредиентов, как необходимо для конкретного показания, которое лечится, предпочтительно ингредиентов с комплементарными активностями, которые не влияют отрицательно друг на друга. Например, было бы желательным предложить один или несколько активных ингредиентов для лечения невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, рака, расстройства глазного заболевания, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения или воспаления CNS. Такие иллюстративные лекарственные препараты обсуждаются в настоящем документе ниже. Такие активные ингредиенты присутствуют соответствующим образом в сочетании, в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.
Активные ингредиенты могут быть захвачены в приготовленные микрокапсулы, например, с помощью методик коацервации, или посредством полимеризации на границе раздела, например, микрокапсул из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли(метилметакрилатных) микрокапсул, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средство (например, в липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Один или несколько активных ингредиентов могут инкапсулироваться в липосомах, которые соединены антителами анти-TfR, описанными в настоящем документе (см., например, публикацию заявки на патент США № 20020025313).
Могут быть приготовлены препараты с задержкой высвобождения. Соответствующие примеры препаратов с задержкой высвобождения включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, эти матрицы имеют форму формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Неограничивающие примеры матриц с задержкой высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полиактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глютаминовой кислоты и γ-этил-L-глютамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочная кислотагликолевая кислота и леупролида ацетата) и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Препараты, которые должны использоваться для введения in vivo, как правило, являются стерильными. Стерильность может быть легко получена, например, с помощью фильтрования через мембраны для стерильного фильтрования.
- 37 038367
G. Терапевтические способы и композиции.
Любое из антител анти-TfR, предложенных в настоящем документе, можно использовать в терапевтических способах. В одном из аспектов предлагается антитело анти-TfR для применения в качестве лекарственного препарата. Например, настоящее изобретение предлагает способ переноса терапевтического соединения через гематоэнцефалический барьер с уменьшением или устранением влияния на популяции эритроцитов, включающий экспонирование антитела анти-TfR, связанного с терапевтическим соединением (например, мультиспецифичного антитела, которое связывается как с TfR, так и с антигеном головного мозга), для BBB таким образом, что антитело переносит терапевтическое соединение, связанное с ним, через BBB. В другом примере настоящее изобретение предлагает способ переноса лекарственного средства против неврологического расстройства через гематоэнцефалический барьер, включающий экспонирование антитела анти-TfR по настоящему изобретению, связанного с лекарственным средством против расстройства головного мозга (например, мультиспецифичного антитела, которое связывается как с TfR, так и с антигеном головного мозга), для BBB таким образом, что антитело переносит лекарственное средство против неврологического расстройства, связанное с ним, через BBB с уменьшением или устранением влияния на популяции эритроцитов. В одном из вариантов осуществления BBB имеется у млекопитающего (например, человека), например, такого, которое имеет неврологическое расстройство, включая, без ограничения: болезнь Альцгеймера (AD), инсульт, деменцию, мышечную дистрофию (MD), множественный склероз (MS), боковой амиотрофический склероз (ALS), кистозный фиброз, синдром Эйнджелмена, синдром Лиддла, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, болезнь Педжета, рак, травматическое повреждение головного мозга и т.п.
В одном из вариантов осуществления неврологическое расстройство выбирается из невропатического расстройства, амилоидоза, рака (например, включая рак CNS или рак головного мозга), глазного заболевания или расстройства, вирусной или микробной инфекции, воспаления (например, CNS или головного мозга), ишемии, нейродегенеративного заболевания, эпилепсии, расстройства поведения, лизосомной болезни накопления и т.п. Антитела по настоящему изобретению являются особенно полезными для лечения таких неврологических расстройств благодаря их способности переносить один или несколько ассоциированных активных ингредиентов/связанных терапевтических соединений через BBB и в CNS/головной мозг, где такие расстройства находят их молекулярную, клеточную или вирусную/микробную основу.
Невропатические расстройства представляют собой заболевания или нарушения нервной системы, отличающиеся несоответствующей или неконтролирируемой передачей нервных сигналов или ее отсутствием, и включают, но не ограничиваясь этим, хроническую боль (включая ноцицептивную боль), боль, вызываемую повреждением тканей организма, включая боль, связанную с раком, невропатическую боль (боль, вызываемую нарушениями в нервах, спинном мозге или в головном мозге) и психогенную боль (полностью или по большей части связанную с психологическим расстройством), цефалгию, мигрень, невропатию и симптомы и синдромы, часто сопровождающие невропатические расстройства, такие как головокружение или тошнота.
Для невропатического расстройства, может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой анальгетик, включая, но не ограничиваясь этим, наркотический/опиоидный анальгетик (т.е. морфин, фентанил, гидрокодон, меперидин, метадон, оксиморфон, пентазоцин, пропоксифен, трамадол, кодеин и оксикодон), нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (NSAID) (т.е. ибупрофен, напроксен, диклофенак, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, индометацин, кеторолак, мефенамовую кислоту, мелоксикам, набуметон, оксапрозин, пироксикам, сулиндак и толметин), кортикостероид (т.е. кортизон, преднизон, преднизолон, дексаметазон, метилпреднизолон и триамцинолон), агент против мигрени (т.е. суматриптин, алмотриптам, фроватриптам, суматриптам, ризатриптам, элетриптам, золмитриптам, дигидроэрготамин, элетриптам и эрготамин), ацетаминофен, салицилат (т.е. аспирин, холин салицилат, магний салицилат, дифлунизал и салсалат), антиконвульсант (т.е. карбамазепин, клоназепам, габапентин, ламотригин, прегабалин, тиагабин и топирамат), болеутоляющие средства (т.е. изофлуран, трихлорэтилен, галотан, севофлуран, бензокаин, хлорпрокаин, кокаин, циклометикаин, диметокаин, пропоксикаин, прокаин, новокаин, пропаракаин, тетракаин, артикаин, бупивакаин, картикаин, цинхокаин, этидокаин, левобупивакаин, лидокаин, мепивакаин, пиперокаин, прилокаин, ропивакаин, тримекаин, сакситоксин и тетродотоксин) и ингибитор cox-2 (т.е. целококсиб, рофекоксиб и валдекоксиб). Для невропатического расстройства с головокружениями может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой агент против головокружения, включая, но не ограничиваясь этим, меклизин, дифенгидрамин, прометазин и диазепам. Для невропатического расстройства с тошнотой, может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой агент против тошноты, включая, но не ограничиваясь этим, прометазин, хлорпромазин, прохлорпемазин, триметобензамид и метоклопрамид.
Амилоидозы представляют собой группу заболеваний и расстройств, связанных с внеклеточными белковыми отложениями в CNS, включая, но не ограничиваясь этим, вторичный амилоидоз, возрастной амилоидоз, болезнь Альцгеймера (AD), умеренные когнитивные нарушения (MCI), деменцию с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное кровоизлияние в мозг с амилоидозом (голландского типа); Гуам
- 38 038367 ский комплекс болезнь Паркинсона деменция, церебральную амилоидную ангиопатию, болезнь Хантингтона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественный склероз; болезнь КрейтцфельдаЯкоба, болезнь Паркинсона, трансмиссивную губчатую энцефалопатию, деменцию, связанную с ВИЧ, амиотропный латеральный склероз (ALS), миозит с включенными тельцами (IBM) и глазные заболевания, связанные с отложениями β-амилоидов (т.е. дистрофию желтого пятна, связанную с друзами невропатию зрительного нерва и катаракту).
Против амилоидоза может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое включает, но не ограничиваясь этим, антитело или другую связывающуюся молекулу (включая, но не ограничиваясь этим, малую молекулу, пептид, аптамер или другой белковый связывающий агент), которая специфично связывается с мишенью, выбранной из β-секретазы, тау, презенилина, белка предшественника амилоида или его частей, пептида β-амилоида или их олигомеров или фибрилл, репептора гибели 6 (DR6), рецептора конечных продуктов усиленного гликозилирования (RAGE), паркина и хантингтина; ингибитор холинэстеразы (т.е. галантамин, донепезил, ривастигмин и такрин); антагонист рецептора NMDA (т.е. мемантин), деплетор моноамина (т.е. тетрабеназин); эрголоид мезилат; антихолинергический антипаркинсонический агент (т.е. проклидин, дифенгидрамин, тригексилфенидил, бензтропин, бипериден и тригексилфенидил); дофаминергический антипаркинсонический агент (т.е. энтакапон, селегилин, прамипексол, бромкриптин, ротиготин, селегилин, ропинирорл, расагилин, апоморфин, карбидопа, леводопа, перголид, толкапон и амантадин); тетрабеназин; противовоспалительное лекарственное средство (включая, но не ограничиваясь этим, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (т.е. индометацин и другие соединения, перечисленные выше); гормон (т.е. эстроген, прогестерон и леупролид); витамин (т.е. фолат и никотинамид); димеболин; гомотаурин (т.е. 3-аминопропансульфоновую кислоту; 3 APS); модулятор активности рецепторов серотонина (т.е. ксалипроден); интерферон и глюкокортикоид.
Раковые заболевания CNS отличаются аберрантной пролиферацией одной или нескольких клеток CNS (т.е. нервных клеток) и включают, но не ограничиваясь этим, глиому, глиобластому мультиформ, менингиому, астроцитому, невриному слухового нерва, хондрому, олигодендроглиому, медуллобластому, ганглиоглиому, шванному, нейрофиброму, нейробластому и экстрадуральные, интрамедуллярные или интрадуральные опухоли.
Против рака может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой химиотерапевтический агент. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфор-амид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабиол (дронабинол, MARINOL®); β-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSA ®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные горчицы, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамм, мехлоретамм оксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловую горчицу; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихимицин, в частности калихимицин гаммаП и калихимицин омегаП (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энединовые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, сактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN® (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и диоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6меркатопурин, триамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, фиоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; агенты против опухоли надпочечников, такие как амино, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилу
- 39 038367 рацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихинон; элфорнитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглюцид; галлий нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лосоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, ИЛИ); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазихон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-C); тиотепа; таксоиды, например паклитаксель TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора ABRAXANETM, полученный с помощью генной инженерии препарат паклитакселя в наночастицах альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксель TAXOTERE® (RhonePoulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; генцитабин (GEMZAR®); 6-тиогуанин; меркатопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN®); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN®); оксалиплатин; лейкововин; винорельбин (NAVELBINE®); новатрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA®); фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из указанных выше соединений; а также сочетания двух или более из указанных выше соединений, такие как CHOP, сокращенное наименование препарата для сочетанной терапии из циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона, и FOLFOX, сокращенное наименование для режима лечения с помощью оксалиплатина (ELOXATF TM), объединенного с 5-FU и лейкововином.
В это определение также включаются химиотерапевтические агенты, которые представляют собой антигормональные агенты, которые действуют для регулировки, уменьшения, блокировки или ингибирования воздействия гормонов, которые могут способствовать росту рака и часто имеют форму системного или предназначенного для лечения организма в целом препарата. Они сами могут представлять собой гормоны. Примеры включают антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен EVISTA®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, опаристон и торемифен FARESTON®; антипрогестероны; даун-регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD); агенты, которые функционируют для подавления или выключения яичников, например агонисты гормона, высвобождающего леутинизирующий гормон (LHRH), такие как леупролид ацетат LUPRON® и ELIGARD®, гозерелин ацетат, бусерелин ацетат и триптерелин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продуцирование эстрогенов в надпочечниках, такие, например, как 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестрол ацетат MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместание, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®. В дополнение к этому такое определение химиотерапевтических агентов включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат DIDROCAL®, NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат ZOMETA®, алендронат FOSAMAX®, памидронат AREDIA®, тилудронат SKELID® или ризедронат ACTONEL®; а также троксацитабин (аналог 1,3-диоксолан нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности те, которые ингибируют экспрессирование генов в путях передачи сигналов, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, такие, например, как PKC-α, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTF®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; лапатиниб дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016) и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из указанных выше соединений.
Другая группа соединений, которые могут быть выбраны в качестве неврологических лекарственных средств для лечения или предотвращения рака, представляют собой противораковые иммуноглобулины (включая, но не ограничиваясь этим, транстузумаб, петузумаб, бевацизумаб, алемтуксумаб, цетуксимаб, гемтузумаб озогамицин, ибритумомаб тиуксетан, панитумаб и ритуксимаб). В некоторых случаях антитела в конъюгировании с токсичной меткой или конъюгатом можно использовать для нацеливания и уничтожения желаемых клеток (т.е. раковых клеток), включая, но не ограничиваясь этим, тозитумомаб вместе с радиоизотопной меткой 131I или транстузумаб эмтанзин.
Глазные заболевания или расстройства представляют собой заболевания или расстройства глаз, которые для целей настоящего документа считаются органами CNS, отделенными с помощью BBB. Глазные заболевания или расстройства включают, но не ограничиваясь этим, расстройства склеры, роговицы, радужной оболочки и ресничного тела (т.е. склерит, кератит, язву роговицы, эрозию роговицы, снежную слепоту, ожог глаз, поверхностный точечный кератит Тайджесона, неоваскуляризацию роговицы, дистрофию Фукса, кератоконус, сухой кератоконъюнктивит, воспаления радужной оболочки глаза и увеи
- 40 038367 ты), расстройства хрусталика (т.е. катаракту), расстройства сосудистой оболочки и сетчатки глаза (т.е. отслоение сетчатки, ретиношизис, гипертоническую ретинопатию, диабетическую ретинопатию, ретинопатию, ретинопатию недоношенных, возрастную дистрофию желтого пятна, дистрофию желтого пятна (влажную или сухую), эпиретинальную мембрану, пигментную дистрофию сетчатки и макулярный отек), глаукому, плавающее помутнение, расстройства зрительного нерва и зрительных путей (т.е. наследственную нейропатию зрительного нерва Лебера и друзы диска зрительного нерва), расстройства глазных мышц/аккомодации/рефракции бинокулярного движения (т.е. косоглазие, офтальмопарез, прогрессирующую внешнюю офтальмоплегию, эзотропию, экзотропию, дальнозоркость, близорукость, астигматизм, анизометропию, старческую дальнозоркость и паралич глазных мышц), расстройства зрения и медицинскую слепоту (т.е. амблиопию, наследственный амвроз Левера, скотому, цветовую слепоту, полную цветовую слепоту, никталопию, медицинскую слепоту, речную слепоту и микроофтальмию/колобому), красный глаз, зрачок Аргилла Робертсона, кератомикоз, ксерофтальмию и анданиридию.
Против глазного заболевания или расстройства может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой антиангиогенный офтальмологический агент (т.е. бевацизумаб, ранибизумаб и пегаптаниб), офтальмологический агент против глаукомы (т.е. карбахол, эпинефрин, демекарийбромид, апраклонидин, бримонидин, бринзоламид, левобунолол, тимолол, бетаксолол, дорзоламид, биматопрост, картеолол, метипранолол, дипивефрин, травопрост и латанопрост), ингибитор угольной ангидразы (т.е. метазоламид и ацетазоламид), офтальмологическое антигистаминое средство (т.е. нафазолин, фенилэфрин и тетрагидрозолин), смазывающее вещество для глаз, офтальмологический стероид (т.е. фторметолон, преднизолон, лотепреднол, дексаметазон, дифлупреднат, римексолон, флуоцинолон, медризон и триамцинолон), офтальмологический анестетик (т.е. лидокаин, пропаракаин и тетракаин), офтальмологическое противоинфекционное средство (т.е. левофлоксацин, гатифлоксацин, ципрофлоксацин, моксифлоксацин, хлорамфеникол, бацитрацин/полимиксин b, сульфацетамид, тобрамицин, азитромицин, безифиоксацин, норфлоксацин, сульфизоксазол, гентамицин, идоксуридин, эритромицин, натамицин, грамицидин, неомицин, офлоксацин, трифлуридин, ганцикловир, видарабин), офтальмологический противовоспалительный агент (т.е. нерафенак, кеторолак, флурбипрофен, супрофен, циклоспорин, триамцинолон, диклофенак и бромфенак) и офтальмологическое антигистаминное средство или деконгестант (т.е. кетотифен, олопатадин, эпинастин, нафазолин, кромолин, тетрагидрозолин, пемироласт, бепостатин, нафазолин, фенилэфрин, недокромил, лодоксамид, фенилэфрин, эмедастатин и азеластин).
Вирусные или микробные инфекции CNS включают, но не ограничиваясь этим, инфекции вирусов (т.е. гриппа, ВИЧ, вируса полиомиелита, краснухи), бактерий (т.е. Neisseria sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Proteus sp., E. coli, S. aureus, Pneumococcus sp., Meningococcus sp., Haemophilus sp. и Mycobacterium tuberculosis) и других микроорганизмов, таких как грибки (т.е. дрожжи, Cryptococcus neoformans), паразитов (т.е. toxoplasma gondii), или амеб, приводящие в результате к патофизиологии CNS, включая, но не ограничиваясь этим, менингит, энцефалит, миелит, васкулит и абсцесс, которые могут быть острыми или хроническими.
Против вирусного или микробного заболевания может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое включает, но не ограничиваясь этим, противовирусное соединение (включая, но не ограничиваясь этим, адамантановое противовирусное лекарственное средство (т.е. римантадин и амантадин), противовирусный интерферон (т.е. пегинтерферон a-2b), антагонист рецептора хемокинов (т.е. маравирок), ингибитор переноса цепи интегразы (т.е. ральтегравир), ингибитор нейраминидазы (т.е. озельтамивир и занамивир), ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (т.е. эфавиренз, этравирин, делавирдин и невирапин), нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (тенофовир, абакавир, ламивудин, зидовудин, ставудин, энтекавир, эмтрицитабин, адефовир, зальцитабин, тельбивудин и диданозин), ингибитор протеазы (т.е. дарунавир, атазанавир, фосампренавир, типранавир, ритонавир, нельфмавир, ампренавир, индинавир и саквинавир), пуриновый нуклеозид (т.е. валацикловир, фамцикловир, ацикловир, рибавирин, ганцикловир, вальганцикловир и цидофовир) и разнообразные противовирусные лекарственные средства (т.е. энфувиртид, фоскарнет, паливизумаб и фомивирсен)), антибиотик (включая, но не ограничиваясь этим, аминопенициллин (т.е. амоксициллин, ампициллин, оксациллин, нафциллин, клоксациллин, диклоксациллин, флукоксациллин, темоциллин, азлоциллин, карбенициллин, тицарциллин, мезлоциллин, пиперациллин и бакампициллин), цефалоспорин (т.е. цефазолин, цефалексин, цефалотин, цефамандол, цефтриаксон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефадроксил, цефрадин, лоракарбеф, цефотетан, цефуроксим, цефрозил, цефаклор и цефокситин), карбапенем/пенем (т.е. имипенем, меропенем, эртапенем, фаропенем и дорипенем), монобактам (т.е. азтреонам, тигеноман, норкардицин A и табтоксинин-β-лактам, ингибитор β-лактамазы (т.е. клавулановую кислоту, тазобактам и сульбактам) в конъюгировании с другим β-лактамовым антибиотиком, аминогликозид (т.е. амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, стрептомицин, тобрамицин, и паромомицин), ансамицин (т.е. гелданамицин и гербимицин), карбацефем (т.е. лоракабеф), гликопептиды (т.е. тейкопланин и ванкомицин), макролид (т.е. азитромицин, клэритромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, тролеандомицин, телитромицин и спектиномицин), монобактам (т.е. азтреонам), хинолон (т.е. ципрофлокса
- 41 038367 цин, эноксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, тровафлоксацин, грепафлоксацин, спарфлоксацин и темафлоксацин), сульфонамид (т.е. мафенид, сульфонамидохризоидин, сульфацетамид, сульфадиазин, сульфаметизол, сульфаниламид, сульфасалазин, сульфизоксазол, триметоприм, триметоприм и сульфаметоксазол), тетрациклин (т.е. тетрациклин, демеклоциклин, доксициклин, миноциклин и окситетрациклин), противоопухолевый или цитотоксичный антибиотик (т.е. доксорубицин, митоксантрон, блеомицин, даунорубицин, дактиномицин, эпирубицин, идарубицин, пликамицин, митомицин, пентостатин и вальрубицин) и разнообразные антибактериальные соединения (т.е. бацитрацин, колистин и полимиксин В)), противогрибковые средства (т.е. метронидазол, нитазоксанид, тинидазол, хлорохин, йодхинол и паромомицин) и противопаразитарные средства (включая, но не ограничиваясь этим, хинин, хлорохин, амодиахин, пириметамин, сульфадоксин, прогуанил, мефлохин, атовахон, примахин, артемезинин, галофантрин, доксициклин, клиндамицин, мебендазол, пирантел памоат, тиабендазол, диэтилкарбамазин, ивермектин, рифампин, амфотерицин В, мералсопрол, эфорнитин и альбендазол). Воспаление CNS включает, но не ограничиваясь этим, воспаление, которое вызывается повреждением CNS, которое может представлять собой физическое повреждение (т.е. из-за несчастного случая, хирургической операции, травмы головного мозга, повреждения спинного мозга, сотрясения головного мозга) и повреждение, вызванное одним или несколькими другими заболеваниями или расстройствами CNS (т.е. абсцессом, раком, вирусной или микробной инфекцией) или связанное с ним.
Против воспаления CNS может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое соответствует самому воспалению (т.е. нестероидный противовоспалительный агент, такой как ибупрофен или напроксен), или такое, которое лечит причину воспаления (т.е. противовирусный или противораковый агент).
Ишемия CNS, как используется в настоящем документе, относится к группе расстройств, относящихся к аберрантному кровотоку или сосудистому поведению в головном мозге или вызывающих его, и включает, но не ограничиваясь этим: местную ишемию головного мозга, общую ишемию головного мозга, инсульт (т.е. субарахноидальное кровоизлияние и внутримозговое кровоизлияние) и аневризму.
Против ишемии может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое включает, но не ограничиваясь этим, тромболитическое лекарственное средство (т.е. урокиназу, альтеплазу, ретеплазу и тенеклеплазу), ингибитор агрегации тромбоцитов (т.е. аспирин, цилостазол, клопидогрель, прасугрель и дипиридамол), статин (т.е. ловастатин, правастатин, флувастатин, розувастатин, аторвастатин, симвастатин, церивастатин и питавастатин) и соединение для улучшения кровотока или гибкости сосудов, включая, например, лекарственные препараты против повышенного кровяного давления.
Нейродегенеративные заболевания представляют собой группу заболеваний и расстройств, ассоциированных с потерей функций или гибелью нервных клеток в CNS, и включают, но не ограничиваясь этим, адренолейкодистрофию, болезнь Александра, болезнь Альпера, боковой амиотрофический склероз, атаксию-телеангиэктазию, болезнь Баттена, кокаиновый синдром, кортикобазальную дегенерацию, дегенерацию, вызываемую амилоидозом или ассоциированную с ним, атаксию Фридрейха, лобно-височную лобарную дегенерацию, болезнь Кеннеди, множественную системную атрофию, множественный склероз, первичный латеральный склероз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, спинальную мышечную атрофию, поперечный миели, болезнь Рефсума и спинально-церебеллярную атаксию.
Против нейродегенеративного заболевания может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой гормон роста или нейротрофический фактор; примеры включают, но не ограничиваясь этим, полученный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), фактор роста нервных клеток (NGF), нейротрофин-4/5, фактор роста фибробластов (FGF)-2 и другие FGF, нейротрофин (NT)-3, эритропоэтин (EPO), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор эпидермального роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF)- α, TGF-β, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1ra), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейртурин, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), херегулин, нейрегулин, артемин, персефин, интерлейкины, нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GFR), фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (CSF), CSF гранулоцитов-макрофагов, нетрины, кардиотрофин-1, белки хеджехоги, ингибиторный фактор лейкемии (LIF), мидкин, плейотрофин, морфогенетичекие белки костей (BMP), нетрины, сапозины, семафорины и фактор стволовых клеток (SCF).
Заболевания эпилепсии и расстройства CNS включают несоответствующую и/или аномальную электропроводимость в CNS, и они включают, но не ограничиваясь этим, эпилепсию (т.е. малый эпилептический припадок, атонический припадок, доброкачественную детскую эпилепсию, ювенильный абсанс, клонические судороги, комплексные парциальные судороги, лобную эпилепсию, лихорадочные судороги, младенческие судороги, ювенильную миоклоническую эпилепсию, ювенильную абсансную эпилепсию, синдром Леннокса-Гасто, синдром Ландау-Клефнера, синдром Драве, синдром Отахары, синдром Веста, миоклонические судороги, митохондриальные расстройства, прогрессирующий миоклонический эпилептический припадок, психогенные судороги, рефлекторную эпилепсию, синдром Расмуссена, простые парциальные судороги, вторичные генерализованные судороги, височную эпилепсию, то
- 42 038367 ноклонические судороги, тонические судороги, психомоторные эпилептические припадки, лимбическую эпилепсию, парциальные припадки, генерализованные припадки, эпилептический статус, абдоминальную эпилепсию, акинетические припадки, спонтанные припадки, массивные двухсторонние миоклонические судороги, катамениальную эпилепсию, судороги с падениями, эмоциональные судороги, фокальный эпилептический припадок, эпилептические припадки смеха, Джексоновскую эпилепсию, болезнь Лафора, моторные судороги, многофокальный эпилептический припадок, ночные эпилептические припадки, фотогенную эпилепсию, псевдоэпилепсию, сенсорную эпилепсию, слабовыраженную эпилепсию, лесную эпилепсию, эпилепсию при абстинентном синдроме и зрительные рефлекторные эпилептические припадки).
Против эпилептического расстройства может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое представляет собой антиконвульсант или противоэпилептик, включая, но не ограничиваясь этим, барбитуратные антиконвульсанты (т.е. примидон, метарбитал, мефобарбитал, аллобарбитал, амобарбитал, апробарбитал, альфенал, барбитал, браллобарбитал и фенолбарбитал), бензодиазепиновые антиконвульсанты (т.е. диазепам, клоназепам и лоразепам), карбаматные антиконвульсанты (т.е. фельбамат), антиконвульсанты на основе ингибитора угольной ангидразы (т.е. ацетозоламид, топирамат и зонизамид), дибензазепиновые антиконвульсанты (т.е. рафмамид, карбамазепин и окскарбазепин), антиконвульсанты на основе производных жирных кислот (т.е. дивалпроекс и вальпроевую кислоту), аналоги γаминомасляной кислоты (т.е. прегабалин, габапентин и вигабатрин), ингибиторы повторного потребления γ-аминомасляной кислоты (т.е. тиагабин), ингибиторы трансаминазы γ-аминомасляной кислоты (т.е. вигабатрин), гидантоиновые антиконвульсанты (т.е. дифенин, этотоин, фосдифенин и медифенин), разнообразные антиконвульсанты (т.е. лакозамид и сульфат магния), прогестины (т.е. прогестерон), оксазолидиндионовые антиконвульсанты (т.е. параметадион и триметадион), пирролидиновые антиконвульсанты (т.е. леветиракетам), сукцинимидные антиконвульсанты (т.е. этосуксимид иметсуксимид), триазиновые антиконвульсанты (т.е. ламотригин) и мочевинные антиконвульсанты (т.е. фенацемид и фенетурид).
Расстройства поведения и расстройства CNS, отличающиеся аберрантным поведением со стороны подверженного им субъекта, включают, но не ограничиваясь этим, расстройства сна (т.е. инсомнию, парасомнию, ночные страхи, расстройства сна, связанные с циркодианным ритмом и нарколепсию), расстройства настроения (т.е. депрессию, суицидальную депрессию, страх, хронические аффективные расстройства, фобии, приступы паники, обсессивно-компульсивное расстройство, расстройство гиперактивности с дефицитом внимания (ADHD), расстройство дефицита внимания (ADD), синдром хронической усталости, агорафобию, расстройство пост-травматического стресса, биполярное расстройство), расстройства питания (т.е. анорексию или булимию), психозы, поведенческие расстройства развития (т.е. аутизм, синдром Ретта, синдром Аспергера), расстройства личности и психотические расстройства (т.е. шизофрения, бредовое расстройство и т.п.).
Против расстройства поведения может быть выбрано неврологическое лекарственное средство из соединения, модифицирующего поведение, включая, но не ограничиваясь этим, атипичные антипсихотические средства (т.е. рисперидон, аланзапин, априпипразол, хетиапин, палиперидон, азенапин, клозапин, илоперидон и зипразидон), фенотиазиновое антипсихотическое средство (т.е. прохлорпемазин, хлорпромазин, флуфеназин, перфеназин, трифлуоперазин, тиоридазин и мезоридазин), тиоксантеновое антипсихотическое средство (т.е. тиотиксен), разнообразные антипсихотические средства (т.е. пимозид, литий, молиндон, галоперидол и локсапин), селективный ингибитор повторного потребления серотонина (т.е. циталопрам, эсциталопрам, пароксетин, флуоксетин и сертралин), ингибитор повторного потребления серотонина-норепинефрина (т.е. дулоксетин, велафаксин, десвелафаксин, трициклический антидепрессант (т.е. доксепин, кломипрамин, амоксапин, нортриптилин, амитриптилин, тримипрамин, имипрамин, протриплитин и дезипрамин), тетрациклический антидепрессант (т.е. миртазапин и мапротилин), фенилпиперазиновый антидепрессант (т.е. тразодон и нефазодон), ингибитор моноаминоксидазы (т.е. изокарбоксазид, фенелзин, селегилин и транилципромин), бензодиазепин (то есть алпразолам, эстазолам, флуразептам, клоназепам, лоразепам и диазепам), ингибитор повторного потребления норэпинефринадопамина (т.е. бупропион), стимулятор CNS (т.е. фентермин, диэтилпропион, метамфетамин, декстроамфетамин, амфетамин, метилфенидат, дексметилфенидат, лиздексамфетамин, модафинил, пемсолин, фендиметразин, бензфетамин, фендиметразин, армодафинил, диэтилпропион, кофеин, атомоксетин, доксапрам и мазиндол), анксиолитическое/седативное/снотворное средство (включая, но не ограничиваясь этим, барбитурат (т.е. секобарбитал, фенобарбитал и мефобарбитал), бензодиазепин (как описано выше), и разнообразные анксиолитические/седативные/снотворные средства (т.е. дифенгидрамин, натрий оксибат, залеплон, гидроксизин, хлораль гидрат, аолпидем, буспирон, доксепин, эсзопиклон, рамелтеон, мепробамат и этхлорвинол)), секретин (см., например, Ratliff-Schaub et al. Autism 9:256-265 (2005)), опиоидный пептид (см., например, Cowen et al., J. Neurochem. 89:273-285 (2004)) и нейорпептид (см., например, Hethwa et al. Am. J. Physiol. 289:E301-305 (2005)).
Лизосомные расстройства накопления представляют собой метаболические расстройства, которые в некоторых случаях ассоциируются с CNS или имеют CNS-специфичные симптомы; такие расстройства включают, но не ограничиваясь этим, болезнь Тея-Сакса, болезнь Гоше, болезнь Фабри, мукополисаха- 43 038367 ридоз (типы I, II, III, IV, V, VI и VII), болезнь накопления гликогена, GMl-ганглиозидоз, метахроматическую лейкодистрофию, болезнь Фарбера, лейкодистрофию Канавана и типы 1 и 2 нейронного цероидного липофусциноза, болезнь Нимана-Пика, болезнь Помпе и болезнь Краббе.
Против лизосомной болезни накопления может быть выбрано неврологическое лекарственное средство, которое само по себе имеет активность фермента, которая ослабляется при заболевании, или иным образом воспроизводит ее. Иллюстративные рекомбинантные ферменты для лечения лизосомных расстройств накопления включают, но не ограничиваясь, те, которые приведены, например, в публикации заявки на патент США № 2005/0142141 (т.е. a-L-идуронидазу, идуронат-2-сульфатазу, N-сульфатазу, αN-ацетилглюкозаминидазу, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу, β-галактозидазу, арилсульфатазу B, βглюкуронидазу, кислую α-глюкозидазу, глюкоцереброзидазу, α-галактозидазу A, гексозаминидазу A, кислую сфингомиелиназу, β-галактоцереброзидазу, β-галактозидазу, арилсульфатазу A, кислую церамидазу, аспартоацилазу, пальмитоил-протеинтиоэстерезу 1 и трипептидиламинопептидазу 1).
В других вариантах осуществления заболевания, связанные с неправильным сверхпродуцированием эритроцитов или вызываемые им, или заболевания, где сверхпродуцирование эритроцитов является воздействием заболевания, могут предотвращаться или лечиться посредством воздействия обеднения ретикулоцитов, наблюдаемого в настоящем документе для антител анти-TfR, сохраняющих, по меньшей мере, частичную эффекторную функцию. Например, при наследственной или неопластической истиной полицитемии повышенные количества эритроцитов из-за гиперпролиферации, например, ретикулоцитов дает в результате загущение крови и сопутствующие физиологические симптомы (d'Onofrio et al., Clin. Lab. Haematol. (1996) Suppl. 1:29-34). Введение антитела анти-TfR по настоящему изобретению, где, по меньшей мере, частичная эффекторная функция антитела сохраняется, сделала бы возможным селективное удаление популяции незрелых ретикулоцитов без влияния на нормальный перенос трансферрина в CNS. Дозирование такого антитела модулировалось бы таким образом, что острые клинические симптомы могли бы сводиться к минимуму (т.е. посредством дозирования при очень низкой дозе или через большие временные интервалы), как хорошо известно в данной области.
В одном из аспектов антитело по настоящему изобретению используется для детектирования неврологического расстройства до наступления симптомов и/или для оценки тяжести или продолжительности заболевания или расстройства. В одном из аспектов антитело делает возможным детектирование и/или получение изображений неврологического расстройства, включая получение изображений с помощью радиографии, томографии или магнитной резонансной томографии (MRI).
В одном из аспектов предлагается антитело анти-TfR с низким сродством по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. В других аспектах предлагается антитело анти-TfR с низким сродством для применения при лечении неврологического заболевания или расстройства (например, болезни Альцгеймера) без обеднения эритроцитов (т.е. ретикулоцитов). В определенных вариантах осуществления предлагается модифицированное антитело анти-TfR с низким сродством для использования в способе лечения, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитело анти-TfR с низким сродством, модифицированное для улучшения его безопасности, для использования в способе лечения индивидуума, имеющего неврологическое заболевание или расстройство, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела анти-TfR (необязательно, связанного с лекарственным средством против неврологического расстройства). В одном таком варианте осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитело анти-TfR, модифицированное для улучшения его безопасности, для использования при уменьшении или ингибировании образования амилоидных бляшек у пациента, имеющего риск неврологического заболевания или расстройства (например, болезнь Альцгеймера) или страдающего от него. Индивидуум в соответствии с любым из рассмотренных выше вариантов осуществления необязательно представляет собой человека. В определенных аспектах антитело анти-TfR по настоящему изобретению для использования в способах по настоящему изобретению улучшает потребление лекарственного средства против неврологического расстройства, с которым оно связано.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает для использования антитела анти-TfR с низким сродством по настоящему изобретению при производстве или приготовлении лекарственного препарата. В одном из вариантов осуществления лекарственный препарат предназначен для лечения неврологического заболевания или расстройства. В другом варианте осуществления лекарственный препарат предназначен для использования в способе лечения неврологического заболевания или расстройства, включающем введение индивидууму, имеющему неврологическое заболевание или расстройство, эффективного количества лекарственного препарата. В одном таком варианте осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения болезни Альцгеймера. В одном из вариантов осуществления способ включает введение индивидууму, имеющему болезнь Альцгей- 44 038367 мера, эффективного количества мультиспецифичного антитела по настоящему изобретению, которое связывает как BACE1, так и TfR или как Abeta, так и TfR. В одном таком варианте осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. Индивидуум в соответствии с любым из рассмотренных выше вариантов осуществления может представлять собой человека.
Антитела анти-TfR по настоящему изобретению могут использоваться при терапии либо сами по себе, либо в сочетании с другими агентами. Например, антитело анти-TfR по настоящему изобретению может вводиться совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В определенных вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой терапевтический агент, эффективный при лечении такого же или иного неврологического расстройства, как то, для лечения которого используется антитело анти-TfR. Иллюстративные дополнительные терапевтические агенты включают, но не ограничиваясь этим, разнообразные неврологические лекарственные средства, описанные выше, ингибиторы холинэстеразы (такие как донепезил, галантамин, ровастигмин и такрин), антагонисты рецепторов NMDA (такие как мемантин), ингибиторы агрегации пептидов амилоида β, антиоксиданты, модуляторы γ-секретазы миметики фактора роста нервов (NGF) или генную терапию NGF, агонисты PPARy, ингибиторы редуктазы HMS-CoA (статины), ампакины, блокаторы кальциевых каналов, антагонисты рецепторов GABA, ингибиторы гликогенсинтазакиназы, внутривенный иммуноглобулин, агонисты мускариновых рецепторов, модуляторы никотиновых рецепторов, активную или пассивную иммунизацию пептида амилоида β, ингибиторы фосфодиэстеразы, антагонисты рецепторов серотонина и антитела антипептид амилоида β. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент выбирается по его способности ослаблять одно или несколько побочных воздействий неврологического лекарственного средства.
Как иллюстрируется в настоящем документе, определенные антитела анти-TfR могут иметь побочные воздействия, которые отрицательно влияют на популяции ретикулоцитов у субъекта, которого лечат с помощью антитела анти-TfR. Таким образом, в определенных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, выбранный из-за его способности ослаблять такое отрицательное побочное воздействие на популяции ретикулоцитов, вводится совместно с антителом анти-TfR по настоящему изобретению. Примеры таких терапевтических агентов включают, но не ограничиваясь этим, агенты для увеличения популяции эритроцитов (т.е. ретикулоцитов), агенты для поддержания роста и развития эритроцитов (т.е. ретикулоцитов) и агенты для защиты популяции эритроцитов от воздействий антитела анти-TfR; такие агенты включают, но не ограничиваясь этим, эритропоэтин (EPO), добавки, содержащие железо, витамин C, фолиевую кислоту и витамин B12, а также физическое восполнение эритроцитов (т.е. ретикулоцитов) с помощью, например, вливания сходных клеток, которые могут происходить от другого индивидуума со сходным типом крови или могут предварительно извлекаться у субъекта, которому вводят антитело анти-TfR. Для специалиста в данной области будет понятно, что в некоторых случаях агенты, предназначенные для защиты существующих эритроцитов (т.е. ретикулоцитов), предпочтительно вводятся субъекту до терапии с помощью антитела анти-TfR или одновременно с ней, в то время как агенты, предназначенные для поддержания или инициирования повторного роста/развития эритроцитов или популяций клеток крови (т.е. ретикулоцитов или популяции ретикулоцитов), предпочтительно вводятся одновременно с терапией с помощью антитела анти-TfR или после нее, так что такие клетки крови могут восполняться после лечения с помощью антитела анти-TfR.
В определенных других таких вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент выбирается из-за его способности ингибировать или предотвращать активирование пути комплемента при введении антитела анти-TfR. Примеры таких терапевтических агентов включают, но не ограничиваясь этим, агенты, которые отрицательно влияют на способность антитела антиTfR к связыванию или активированию пути комплемента, и агенты, которые ингибируют одно или несколько молекулярных взаимодействий с путем комплемента, и описываются в целом, в Mollnes and Kirschftnk (2006) Molec. Immunol. 43:107-121, содержание которой в явном виде включается в настоящий документ в качестве ссылки.
Такие сочетанные терапии, отмеченные выше, в настоящем документе охватывают сочетанное введение (когда два или более терапевтических агента включаются в один и тот же или в различные препараты) и раздельное введение, в этом случае введение антитела по настоящему изобретению может осуществляться до, во время и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или вспомогательного вещества. В одном из вариантов осуществления введение антитела анти-TfR и введение дополнительного терапевтического агента осуществляется с разницей по времени в пределах примерно одного месяца, или в пределах примерно одной, двух или трех недель, или в пределах примерно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней. Антитела по настоящему изобретению могут также использоваться в сочетании с другими видами интервенционной терапии, такими как, но не ограничиваясь этим, радиационная терапия, поведенческая терапия или другие виды терапии, известные в данной области и соответствующие неврологическому расстройству, которое должно лечиться или предотвращаться.
Антитело анти-TfR по настоящему изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент)
- 45 038367 может вводиться с помощью любых пригодных для использования средств, включая парентеральное, интрапульмонарное и интраназальное введение, и, по желанию, местного лечения, внутрираневого введения. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться с помощью любого пригодного для использования способа, например с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, отчасти, от того, является ли введение кратким или хроническим. В настоящем документе предполагаются разнообразные временные графики дозирования, включая, но не ограничиваясь этим, однократное или множественное введение в различные моменты времени, введение болюса и импульсное вливание.
Антитела по настоящему изобретению могут приготавливаться, дозироваться и вводиться способом, соответствующим хорошей медицинской практике. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное расстройство, которое лечится, конкретное млекопитающее, которое лечится, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, временной график введения и другие факторы, известные медицинским работникам. Антитело не должно приготавливаться, но необязательно приготавливается вместе с одним или несколькими агентами, используемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого расстройства или для предотвращения, ослабления или облегчения одного или нескольких побочных воздействий введения антитела. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препарате, типа расстройства или лечения и от других факторов, обсуждаемых выше. Они, как правило, используются при таких же дозировках и с помощью таких же способов введения, как описывается в настоящем документе, или в пределах примерно от 1 до 99% дозировок, описанных в настоящем документе, или при любой дозировке и с помощью любого способа, который эмпирически/клинически определяется как соответствующий.
Для предотвращения или лечения заболевания, соответствующая дозировка антитела по настоящему изобретению (когда оно используется отдельно или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими агентами) будет зависеть от типа заболевания, которое должно лечиться, типа антитела, тяжести и хода заболевания, от того, вводится ли антитело для превентивных или терапевтических целей, от предыдущей терапии, от клинической истории пациента и от реакции на антитело и от суждения наблюдающего врача. Антитело вводится соответствующим образом пациенту за один раз или в течение ряда сеансов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) антитела может представлять собой начальную пробную дозировку для введения пациенту, например, посредством одного или нескольких отдельных введений или с помощью непрерывного вливания. Одна типичная ежедневная доза может находиться в пределах примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от факторов, рассмотренных выше. Для многократных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение, как правило, быть продлено до тех пор, пока не произойдет желаемого подавления симптомов заболевания. Одна иллюстративная дозировка антитела может находиться в пределах примерно от 0,05 примерно до 40 мг/кг. Таким образом, пациенту могут вводиться одна или несколько доз примерно по 0,5, 2,0, 4,0, 5,0, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мг/кг (или любое их сочетание). Такие дозы могут вводиться с промежутками, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент принимает примерно от двух примерно до двадцати доз или, например, примерно шесть доз антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следуют одна или несколько более низких доз. Однако могут быть полезными и другие режимы дозирования. Будет очевидно, что один из способов уменьшения воздействия на популяции ретикулоцитов посредством введения антитела анти-TfR заключается в модификации количества доз или временного режима дозирования таким образом, что в кровотоке присутствуют в целом более низкие количества циркулирующего антитела для взаимодействия с ретикулоцитами. В одном из неограничивающих примеров может вводиться более низкая доза антител анти-TfR с большей частотой, чем это было бы при более высокой дозе. Используемая доза может соответствовать балансу между количеством антитела, которое должно доставляться в CNS (которое само по себе связано со сродством с CNS антиген-специфичной частью антитела), сродством этого антитела к TfR и тем, вводится ли соединение (соединения), защищающее эритроциты (т.е. ретикулоциты), стимулирующее рост и развитие или ингибирующее путь комплемента, совместно с антителом или последовательно. Ход этой терапии легко отслеживается с помощью обычных методик и анализов, как описано в настоящем документе и как известно в данной области.
Понятно, что любой из указанных выше препаратов или терапевтических способов может осуществляться с использованием иммуноконъюгата по настоящему изобретению вместо антитела анти-TfR или в дополнение к нему.
H. Промышленные изделия.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается промышленное изделие, содержащее материалы полезные при лечении, предотвращении и/или диагностике расстройств, описанных выше. Промышленное изделие содержит контейнер и метку или вставку в упаковку, на контейнере или связанную с ним. Пригодные для использования контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, меш
- 46 038367 ки с растворами для внутривенного ведения и т.п. Контейнеры могут быть сформированы из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предотвращения и/или диагностики состояния, и может иметь узел стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую с помощью иглы для гиподермических инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело по настоящему изобретению. Этикетка или вставка в упаковку показывает, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, промышленное изделие может содержать (a) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (b) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция содержит дополнительный цитотоксичный или иной терапевтический агент. Промышленное изделие в этом варианте осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать вставку в упаковку, показывающую, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или в дополнение к этому, промышленное изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатный солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, желательные с промышленной точки зрения и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Понятно, что любое из указанных выше промышленных изделий может содержать иммуноконъюгат по настоящему изобретению вместо антитела анти-TfR или в дополнение к нему.
Примеры
Пример 1. Генерирование, характеризация и гуманизация перекрестно-реактивных антител антиTfR человека/цино.
Сначала осуществляют процесс фагового пэннинга наивных антител в попытке идентификации антител перекрестно-реактивных по отношению как к TfR человека, так и к TfR обезьяны циномолгус (цино), которые в дальнейшем не конкурируют с Tf за связывание с TfR (Lee et al. JMB (2004) 10731093). Такого перекрестно-реактивного, не конкурирующего с Tf клона не идентифицируют в этом процессе фагового пэннинга. Однако идентифицируют два антитела, которые являются полезными при характеризации генерируемых впоследствии клонов гибридомы.
Идентифицируют виды перекрестно-реактивного антитела, которое конкурирует с Tf за связывание с TfR человека или цино (Tf-конкурирующее антитело). Эпитоп другого клона, специфичный для TfR человека, картируется в апикальном домене huTfR с использованием химерных рецепторов TfR мыши/человека (фиг. 1). Этот клон, связывающийся с апикальным доменом, теряет связь с huTfR, когда последовательность TfR мыши в апикальном домене замещают в положении huTfR.
Затем осуществляют основанный на иммунизации подход к генерированию перекрестнореактивных антител анти-TfR человека/цино. Внеклеточный домен TfR человека (ecd), содержащий Nконечную метку His и белок гемахроматоза человека (HFE), экспрессируют и очищают, как описано (Bennet et al., Nature (2000) 403, 46-53). Получают анологичный конструкт ecd TfR цино. TfR цино экспрессируют и очищают сходным способом. Перекрестно-реактивные антитела TfR человека и цино генерируют посредством иммунизации 5 мышей Balb/C в подошву лапы с помощью 6 доз (два раза в неделю), содержащих по 2 мкг, каждая, ecd cynoTfR и huTfR. Все сыворотки мышей являются положительными по FACS, и все мыши являются слитыми. Из 1632 просмотренных гибридом 111 являются положительными согласно ELISA относительно связывания с TfR как человека, так и цино.
Полученные в результате ELISA-положительные гибридомы просматривают посредством FACS в присутствии 1 мкМ голо-Tf человека на связывание с 293 клетками, транзиторно экспрессирующими TfR человека или цино. Вкратце, анализ FACS осуществляют с использованием 293 клеток, трансфицированных полноразмерным TfR человека или цино с использованием липофектамина 2000 плюс (Invitrogen) за 48-72 ч перед анализом FACS. Нетрансфицированные (контрольные) и трансфицированные 293 клетки промывают два раза буфером FACS (PBS содержащий 1% BSA), добавляют 50 мкл супернатанта гибридомы (нормированного на 10 мкг/мл) к клеткам 293 в присутствии 1 мкМ голо-Tf человека и инкубируют на льду в течение 30 мин. Клетки промывают два раза буфером FACS, добавляют 50 мкл PE-козы-антиFcY мышиных (Jackson ImmunoResearch) к клеткам и инкубируют их на льду в течение 30 мин. Клетки промывают буфером FACS и повторно суспендируют в 100 мкл буфера FACS для анализа.
клонов являются положительными относительно связывания TfR как человека, так и цино (фиг. 2A и 2B). Эти клоны дополнительно субклонируют и оценивают на связывание с TfR как человека, так и цино, с помощью ELISA и картируют эпитоп на huTfR с использованием клона фага с апикальным связыванием, идентифицированного выше. Вкратце, конкурентный анализ ELISA фага с апикальным доменом осуществляют на планшетах Maxisorp, покрытых 2 мкг/мл очищенного TfR человека или цино, в PBS при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием Superblock с казеином (Thermo Scientific, Hudson, NH). В каждую лунку добавляют 30-мкл аликвоту супернатанта гибридомы (нормированного на 10 мкг/мл) в течение 45 мин. За этим следует добавление 30 мкл фага, связывающегося с апикальным доменом, при OD (оптической плотности) 0,05 в течение 15
- 47 038367 мин. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и добавляют на планшет разбавленное 1:1000 HRPмыши-анти M13 (GE healthcare) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20, и связанный фаг детектируют с использованием субстрата ТМВ (BioFX
Laboratories, Owings Mills). Девять из четырнадцати клонов, как обнаружено, блокируют связывание антитела с апикальным связыванием, согласно фаговому дисплею (см. фиг. 2C).
Сродство антител измеряют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Biacore™, GE Healthcare). Антитело анти-His (Qiagen) связывается на четырех различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 BIACORE™ (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) при значении в пределах между 6000 и 8000 RU. Иммобилизация осуществляется посредством неупорядоченного связывания через амино группы с использованием протокола, поставляемого производителем. 10X HBS-P (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) разбавляют в воде и используют в качестве буфера для разбавления и проточного буфера. Очищенный TfR человека или цино захватывается, после этого инжектируют 3-кратные последовательные разбавления IgG или Fab при скорости потока 30 мл/мин с использованием способа одноцикловой кинетики. Постоянные сродства определяют с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1: 1 или с использованием стационарной модели, когда kon или koff находятся ниже пределов детектирования. Равновесную константу диссоциации (KD) вычисляют как отношение константы скорости ассоциации (kon) и константы скорости диссоциации (koff). Результаты показаны на фиг. 2C.
Каждую гибридому клонируют. РНК в целом изолируют от гибридом с использованием мининабора RNeasy (Qiagen). cDNA генерируют с использованием SMART 5' RACE cDNA Amplification kit (Clontech) на основе инструкций производителя. Вариабельную область каждого антитела амплифицируют с использованием UPM (5' олиго), поставляемого в наборе, и 3' олиго, который отжигается по отношению к постоянной области. Затем продукт PCR в целом клонируют в вектор pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) для секвенирования. После анализа последовательностей гибридомы могут дополнительно подразделяться на 4 группы (фиг. 3A-3D). Клоны, которые конкурируют с антителом с апикальным связыванием, попадают в 3 родственных класса последовательностей (фиг. 3A-C). 4 неапикальных клона (фиг. 3D) состоят из 2 родственных клонов и 2 других уникальных последовательностей. CDR легкой и тяжелой цепи каждого клона приводятся в табл. 3.
Таблица 3 _____CDR легких и тяжелых цепей перекрестно-реактивных антител анти-TfR цино/человека_____
S I о К 2 ф b S S к Тяжелая/ легкая HVR1 SEQ ID № HVR2 SEQ ID № HVR3 SEQ ID №
7А4 Легкая RASESVDSYGNSFMH 29 RASNLES 30 QQSNEAPPT 31
Тяжелая DYAMH 32 GISTYFGRTNYNQKFKG 33 GLSGNYVM DY 34
8А2 Легкая RASESVDSYGNSFMH 35 RASNLES 30 QQSNEGPPT 36
Тяжелая DYGMH 37 VISFYSGKTNYNQKFMG 38 GLSGNYVVDY 39
15D2 Легкая RASESVDSYGNSFMH 35 RASNLES 30 QQSNEGPPT 36
Тяжелая DYAMH 32 VISPYSGRTNYNQNFKG 40 GLSGNYVMDY 34
10D11 Легкая RASESVDSYGNSFMH 41 RASNLES 30 QHSNEDPPT 42
Тяжелая DYGMH 37 VISPYSGKTNYSQKFKG 43 GLSGNFVMDF 44
7В10 Легкая RASESVDSYGNSFMH 29 RASNLES 30 QQSNEGPPT 31
Тяжелая DYAMH 32 GISTYFGRTNYNQKFKG 33 GLSGNYVMDY 34
CDR легких цепей консенсусного класса I RASESVD(S/D)YG(N/P) SFMH 45 RASNLES 30 Q(Q/H)SNE(A/G/D)PPT 46
CDR тяжелых цепей консенсусного класса I DY (A/G)MH 47 (G/V)IS(T/F/P)Y(F/S)G(R/ K) TNY (N/S) Q (K/N) F (K/M) G 48 GLSGN(Y/F)V (M/V)D(Y/F) 49
- 48 038367
15 G11 Легкая RASDNLYSNLA 50 DATNLAD 51 QHFWGTPLT 52
Тяжелая SYWMH 53 EINPTNGRTNY1EKFKS 54 GTRAYHY 55
16G5 Легкая RASENIYSNLA 56 AATDLAD 57 QHFWGTPLT 52
Тяжелая SYWMH 53 EINPTNGRTNYNENFKS 58 GTRAYHF 59
13C3 Легкая RASDNIYSNLA 60 AATNLAD 61 QHFWGTPLM 62
Тяжелая SYWMH 53 EINPINGRTNYSEKFKK 63 GTRAYHY 55
16G4 Легкая RASDNIYSNLA 60 AVTNLAD 64 QHFWGTPLT 52
Тяжелая SYWMH 53 EINPSNGRTNYNETFKS 65 GTRAYHY 55
CDR легких цепей
консенсусного RAS(E/D)N(L/1)YSNLA 66 (D/А)(A/V)T(N/D)LAD 67 QHFWGTPL(T/M) 68
класса II
CDR тяжелых цепей консенсусного класса II SYWMH 53 EINP(T/l/S)NGRTNY(I/N/S) E(K/N/T)FK(S/K) 69 GTRAYH(Y/F) 70
16F6 Легкая RASKSISKYLA 71 SGSTLQS 72 QQHNEYPWT 73
Тяжелая SEYAWN 74 YISYSGTTSYNPSLKS 75 YGYGNPATR YFDV 76
7G7 Легкая RAROSVSTSSYSFMH 77 YASIQES 78 QHTWEIPFT 79
Тяжелая SYWMH 80 NIYPGSGSTKYDERFKS 81 GGYDSRAWFAY 82
4С2 Легкая RARQSVSTSSYSFMH 77 YASIQES 78 QHTWEIPFT 79
Тяжелая SYWMH 80 NIYPGSGSTKYDERFKS 83 GGYDSRAWFAH 84
1В12 Легкая TTSSSVPSSYEH 85 STSNLAS 86 HQYHRSPFT 87
Тяжелая DYYMY 88 SISNGGDNTYYPDTVKG 89 QGALYDGYYR GAMDY 90
13D4 Легкая RAGQDITNYLN 91 YTSRLHS 92 QQANTLPYT 93
Тяжелая NYWIE 94 EILPGSGSTKYNEKFKG 95 RGGYGYDGEFAY 96
(R/T)(A/T)(R/S/G)
CDR легких цепей консенсусного класса IV (Q/S) (S/-) (V/-) (S/-) (T/-)(S/V/D)(S/P/I) (Y/S/T)(S/N) 97 (Y/S)(A/T)S(I/N/R)(Q/L) (E/A/H)S 98 (Q/H)(H/Q)(T/Y/A)(W /Н/N)(E/R/T)(I/S/L) P(F/Y)T 99
(F/Y)(M/F/L)(H/N)
CDR тяжелых цепей консенсусного класса IV (S/D/N)Y(W/Y)(M/I) (H/Y/E) 100 (N/S/E)I (Y/S/L) (P/N)G(S/ G) (G/D) (S/N)T(K/Y)Y(D/P/ N) (E/D) (R/K/T) (F/V)К (S/G) 101 (G/Q/R)G(Y/A/G)(D/L /Y) (S/Y/G) (R/D/Y) (A /G/D)(W/Y/G)(F/Y/E) (R/F/-)(G/-) (A/-)(M/-(A/D)(Y/H) 102
Репрезентативные клоны из каждого класса (15G11, 7A4, 16F6 и 7G7) приводятся для иллюстрации в настоящем документе с целью гуманизации и дополнительной характеризации. Гуманизация осуществляется с использованием прививок HVR вместе с включением выбранных верньерных положений, как изображено ниже на фиг. 4A-4E. 15G11 гуманизируют посредством прививки HVR в вариабельных доменах человека IGKV1-NL1*01 и IGHV1-3*01. Сочетания различных верньерных положений мыши включаются в гуманизированные варианты, как изображено на фиг. 4E. Гуманизированный вариант 15G11 15G11.v5 содержит выбранные верньерные положения в VL (положения 43 и 48) и VH (положения 48, 67, 69, 71 и 73), как изображено на фиг. 4A. В дополнение к этому N-окончание VH изменено с Q на E. Для гуманизации 7A4 делают прививку HVR с использованием HVR тяжелой цепи 7A4 и легкой цепи 8A2 (7A4 и 8A2 представляют собой родственные клоны, фиг. 3A). HVR прививают в вариабельных доменах человека IGKV4-1*01 и IGHV1-2*02. Сочетания различных верньерных положений мыши включаются в гуманизированные варианты, как изображено на фиг. 4E. Гуманизированный вариант 7A4 7A4.v15 содержит выбранные верньерные положения в VL (положение 68) и VH (положения 24 и 71) и изменение CDR-L3 G94A, как изображено на фиг. 4B. 7G7 гуманизируют посредством прививки HVR в консенсусных вариабельных доменах человека каппа 4 и подгруппы I вместе с выбранными верньерными положениями в VH (положение 93), как изображено на фиг. 4C. Это гуманизированный вариант называется 7G7.v1. 16F6 гуманизируют посредством прививки HVR в вариабельных доменах человека IGKV1-9*01 и IGHV4-59*01. Сочетания различных верньерных положений мыши включают в гуманизированные варианты, как изображено на фиг. 4E. Гуманизированный вариант 16F6 16F6.v4 содержит 2 изменения в VL (148L и F71Y), а также выбранные верньерные положения в VL (положения 43 и 44) и VH (положения 71 и 78), как изображено на фиг. 4D.
- 49 038367
Таблица 4
CDR легкой и тяжелой цепи гуманизированных антител/Fab
Наименование клона Тяжелая/ легкая CDR1 SEQ ID № CDR2 SEQ ID № CDR3 SEQ ID №
15G11.v5 Легкая RASDNLYSNLA 50 DATNLAD 51 QHFWGTPLT 52
Тяжелая SYWMH 53 EINPTNGRTNYIEKFKS 54 GTRAYHY 55
7А4.vl5 Легкая RASESVDSYGNSFMH 29 RASNLES 30 QQSNEAPPT 127
Тяжелая DYAMH 32 GISTYFGRTNYNQKFK G 33 GLSGNYVM DY 34
7G7.vl Легкая RAROSVSTSSYSFMH 77 YASIQES 78 QHTWEIPFT 79
Тяжелая SYWMH 80 NIYPGSGSTKYDERFKS 81 GGYDSRAWF AY 82
16F6.v4 Легкая RASKSISKYLA 71 SGSTLQS 72 QQHNEYPWT 73
Тяжелая SEYAWN 74 YISYSGTTSYNPSLKS 75 YGYGNPATR YFDV 76
Сродство гуманизированных вариантов по отношению к TfR человека и цино определяют с помощью SPR как IgG (фиг. 4E). Выбранные клоны также анализируют с помощью SPR как Fab для оценки одновалентного сродства (табл. 7). В обоих случаях эксперименты SPR осуществляют, как описано выше.
Таблица 5
Данные Biacore по связыванию выбранных Fab-форматированных вариантов
HuTfR CynoTfR Отношение Cy/hu
Образец Ka Kd KD Ka Kd KD
MU15G11. Fab 1,38E+06 4,65E-03 3,37E-09 1,07E+06 6,23E-03 5,81E-09 1,72
MU15G11. Fab 6,34E+05 1,52E-03 2,41E-09 4,85E+05 3,68E-03 7,57E-09 3, 15
HU15G11.vl. Fab 6,38E+05 0,006986 1,09E-08 5,05E+05 0,0373 7,39E-08
HU15G11.v3. Fab 6,42E+05 0,004657 7,26E-09 4,83E+05 0,0201 1,09E-08
Hul5Gll.v5. Fab 4,56E+05 0,004063 8,91E-09
hul5Gll.v5. Fab 7,76E+05 0,003643 4,70E-09 1,41E+06 0,02184 1,56E-08 3,4
Mu7A4. Fab 1,65E+06 3,13E-04 1,90E-10 1,14E+06 8,45E-04 7,41E-10 3, 9
Hu7A4.v5. Fab 2,24E+06 1,53E-03 6,86E-10 1,18E+06 6,41E-03 5, 44E-09
Hu7A4.v8. Fab 9,28E+05 1,07E-03 1,15E-09 7,97E+05 6,81E-03 8,55E-09
Hu7A4.v9.Fab 1,71E+06 6,86E-04 4,01E-10 8,08E+05 3,42E-03 4,23E-09
Hu7A4.vl2. Fab 3,32E+06 8,44E-04 2,55E-10 1,74E+06 3,31E-03 1,90E-09
hu7A4.vl5. Fab 9,10E+05 3,17E-04 3,48E-10 3,78E+05 0,001618 4,28E-09 11
Hu7G7.vl Fab 1,44E+05 0,006594 4,58E-08 3,84E+04 0,007231 1,88E-07 4,4
Mul6F6. Fab 6,07E+04 1,90E-04 3,13E-09 5,11E+04 1,37E-03 2,68E-08 8,56
Hui6F6.v4. Fab 1,31E+05 1,69E-04 1,29E-09 9,89E+04 2,44E-03 2,47E-08 19, 1
Эпитопы связывания для антител подтверждаются повторно следующим образом.
Осуществляют ELISA с блокированием Tf-TfR на планшетах Maxisorp, покрытых 2 мкг/мл очищенного TfR человека в PBS, при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). На планшеты добавляют 50 мкл 12,5 мкМ голо-Tf человека (R&D Systems, Minneapolis, MN) в течение 40 мин. На планшеты добавляют 50-мкл титры hu7A4.v15, hu15G11.v5, антитела, конкурирующего с Tf и hu7G7.v1 (начиная с 10 мкг/мл, последовательные разбавления 1:3), и инкубируют в течение 20 мин. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и добавляют разбавленное 1:1000 HRP-козы-анти-Fcγ человека (Jackson ImmunoResearch) на планшет и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и детектируют с использованием субстрата TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).
Осуществляют анализ ELISA связывания HFE-TfR на планшетах Maxisorp, покрытых 1 мкг/мл HFE в PBS, при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). Титр TfR человека (начиная при 100 мкг/мл, последовательное разбавление 1:3) добавляют на планшет и инкубируют в течение 1 ч. 1 мкг/мл of hu15G11.v5, hu7A4.v15 или hu7G7.v1 добавляют затем на планшет в течение 1 ч. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и добавляют на планшет разбавленное 1:1000 HRP-козы-анти-Fcγ человека (Jackson ImmunoResearch) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и детектируют с использованием субстрата TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills). Осуществляют анализ ELISA с блокированием HFE-TfR на планшетах Maxisorp, покрытых 1 мкг/мл HFE в PBS, при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). На планшете
- 50 038367
NUNC™, титр hu7A4.v15, hu15G11.v5, антитела конкурирующего с Tf, голо-Tf человека и контрольный IgG (400 мкг для всех антител, 8000 мкг/мл для голотрансферрина, последовательное разбавление 1:3) объединяют с 2 мкг/мл биотинилированного TfR человека и инкубируют в течение 1 ч. Смесь затем добавляют на планшет, покрытый HFE, в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и разбавленное 1:1000 HRP-стрептавидин (SouthernBiotech, Birmingham) добавляют на планшет и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и детектируют биотинилированный TfR человека, связанный на планшете с использованием субстрата ТМВ (BioFX Laboratories, Owings Mills).
На связывание этих гуманизированных вариантов с TfR не оказывает влияния присутствие 6,3 мкМ голо-Tf, в то время как связывание антитела, конкурирующего с Tf, которое связывается с сайтом связывания Tf на TfR, ингибируется (фиг. 5). Кроме того, гуманизированные 7A4.v15, 15G11.v5 и 7G7.v1 попрежнему могут связывать HFE, захваченный huTfR, показывая, что на них не влияет связывание huTfR с иммобилизованным HFE (фиг. 6A). В родственном эксперименте 7A4.v15 и 15G11.v5 не блокируют связывание биотинилированного TfR с иммобилизованным HFE. В противоположность этому это взаимодействие блокируется антителом, конкурирующим с Tf и голо-Tf (фиг. 6B). HFE и Tf, как известно, имеют общий эпитоп, сходный с TfR (Bennet et al., Nature (2000) 403, 46-53).
Иммобилизованные 15G11v.5 и анти-TfR оценивают на связывание с ECD биотинилированного TfR человека или с одновалентным фагом M13, осуществляющим фаговый дисплей апикального домена TfR человека. Анти-TfRC12 получают из фаговой библиотеки синтетических антител, для которых осуществляют пэннинг по отношению к ECD TfR человека, и оно связывается с сайтом на TfR человека, который конкурирует со связыванием трансферрина. Антитела наносят в виде покрытия при 1 мкг/мл в PBS на планшеты Maxisorp. Связанный биотинилированный ECD TfR человека или фаг апикального домена TfR детектируют с помощью HRP-стрептавидина (GE health care, RPN 4401V) или HRP-анти-M13 (GE health care, 27-9421-01) соответственно. Фиг. 25 показывает, что 15G11v.5 связывается с апикальным доменом TfR человека. Сайт связывания 15G11v.5 картируется в апикальном домене, это сайт, удаленный от сайтов связывания лигандов TfR.
Пример 2. Получение с помощью генной инженерии сродства перекрестно-реактивных антител анти-TfR человека/цино.
В дополнение к гуманизированным вариантам, описанным выше, получают дополнительные, полученные с помощью генной инженерии варианты со сродством. В настоящем документе иллюстрируется получение с помощью генной инженерии сродства 15G11.v5 и 7A4.v15. Варианты со сродством генерируют посредством осуществления индивидуальных замещений аланина в CDR-L3 или CDR-H3 с использованием стандартных методик. Эти варианты просматриваются как IgG с помощью ELISA и SPR для идентификации положений, важных для связывания TfR человека и цино; одновалентное сродство выбранных вариантов как Fab также определяется. Вариант со сканированием Ala IgG или Fab экспрессируются в клетках 293 и связываются с TfR человека или цино, количественно определенным с помощью ELISA на планшетах Maxisorp, покрытых 1,8 мкг/мл антитела козы анти-FcY человека (Jackson ImmunoResearch) в PBS, при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). Супернатанты, содержащие экспрессируемый IgG, последовательно разбавляют 1:5 и добавляют на планшет в течение 1 ч. Очищенные hu15G11.v5 или hu7A4.v15 используют в качестве страндартов (разбавленные 1:5, начиная при 1 мкг/мл). Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и добавляют на планшет разбавленное 1:1000 HRP-козы-анти каппа (Southern Biotech) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и детектируют с использованием субстрата TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills). Связывание также оценивают с помощью SPR, как описано выше. Результаты показаны на фиг. 7A (варианты 15G11.v5) и 7B (варианты 7A4.v15).
Дополнительные варианты 15G11.v5 с индивидуальными аланиновыми замещениями в положениях в CDR-L1, CDR-L2, CDR-H1 и CDR-H2 также генерируются, экспрессируются и сначала просматриваются на связывание с TfR человека и цино с помощью анализа ELISA (табл. 6). Анализ ELISA связывания Hu/Cy осуществляют на планшетах Maxisorp, покрытых 2 мкг/мл очищенного TfR человека или цино в PBS при 4°C в течение ночи. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и блокируют с использованием блокирующего буфера Superblock в PBS (Thermo Scientific, Hudson, NH). Супернатанты культуры клеток, содержащие экспрессируемые варианты IgG со Ala-сканами, последовательно разбавляют 1:5 и добавляют в лунки в течение 1 ч. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и добавляют на планшет разбавленное 1:1000 HRP-козы-анти-Fcγ человека (Jackson ImmunoResearch) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
Планшеты промывают PBS/0,05% Tween 20 и детектируют с использованием субстрата TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills).
- 51 038367
Таблица 6
Анализ ELISA Ala вариантов IgG hu15G11.v5
EC50cynoTfR (нг/мл) EC50HuTfR (нг/мл)
HVR-H1 HVR-H2 HVR-L1 15G11.v5 1,8 0, 8
G2 6A 6, 1 1,1
Y2 7A 1467,1 21,1
Т2 8А 0, 8 0,4
F2 9A 12,5 1,5
ТЗОА 0, 9 0,4
S31A 0, 1 0, 05
Y32A 1,4 0,4
W3 3A 362,5 59, 6
М3 4А 1, 1 0,4
G4 9A Е50А I51A N52A Р52аА Т53А R5 6A N58A Y59A I60A Е61А К62А F63A К64А S65A R2 4A S2 6A D2 7A N2 8A L2 9A Y3 0A S31A N32A L33A 1,1 409, 7 0, 6 0, 9 8,1 0,7 5405,4 80,4 0,7 0,7 0, 6 0,7 0, 6 0, 6 0,7 0, 4 0, 6 0, 8 0, 8 0, 9 1, 0 0,7 4,0 0, 1 0,3 20, 6 0,2 0,3 3, 9 0,3 55, 1 6, 3 0,3 0,3 0,2 0,3 0,4 0,3 0,2 0, 1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 1, 6 0, 05
ID50A 0,5 1 0,2
Т52А 0,3 0,2
N53A 0, 6 0,3
L54A 0, 6 0,4
D5 6A 0,5 0,3
Затем выбранные варианты очищаются, и их одновалентное сродство к TfR человека или цино оценивают с помощью SPR (табл. 7).
- 52 038367
Таблица 7
Одновалентный анализ SPR выбранных аланиновых вариантов Fab 15G11.v5
HuTfR CynoTfR Отношение Cy/hu
Ka Kd KD Ka Kd KD
Hul5Gll.v5 Fab 6,74E+05 4,74E-03 7,03E-09 4,51E+5 1,27E-02 2,82E-08 4,0
Hui5G11.НС32А Fab 2,38E+05 1,78E-03 7,47E-09 1,77E+05 8,51E-03 4,80E-08 6, 4
Hui5G11.HC34A Fab 5,64E+05 4,03E-03 7,14E-09 3,04E+05 9,90E-03 3,26E-08 4, 6
Hui5G11.HC52A Fab 5,30E+05 2,36E-02 4,44E-08 4,87E+05 5,67E-02 1,17E-07 2, 6
Hui5G11.HC52A Fab 5,64E+05 1,96E-02 3,46E-08 ND ND ND ND
Hui5G11.HC51A Fab 4,33E+05 1,04E-02 2,39E-08 3,13E+05 3,29E-02 1,05E-07 4,4
Hui5G11.HC53A Fab 8,90E+05 1,15E-02 1,29E-08 4,84E+05 2,50E-02 5,18E-08 4,0
Hui5G11.HC54A Fab 2,06E+05 8,71E-03 4,24E-08 2,80E+05 1,69E-02 6,02E-08 1,4
Пример 3. Конструирование и анализ in vitro биспецифичного антитела анти-TfR человека.
Определенные варианты упомянутых выше антител переформатируются как биспецифичные антитела со вторым плечом, специфично связывающимся с BACE1. Антитела анти-TfR человека Hu15G11.v5, Hu15G11.LC92A, Hu15G11.HC52A и Hu15G11.HC53A используются для получения с помощью генной инженерии плеча для связывания TfR биспецифичного антитела с использованием методики конструирования биспецифичного антитела 'выступ во впадину' (Carter, P. (2001) J. Immunol. Methods 248, 7-15; Ridgway, J.B., Presta, L.G., and Carter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621; Merchant, A.., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G., and Carter, P. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 677-681; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., and Carter, P. (1997) J. Mol. Biol. 270, 26-35). В дополнение к мутациям типа выступа и впадины в Fc для анти-TfR (впадина) и анти-BACE1 (выступ) все половинки антител содержат мутации в Fc области, которые аннулируют эффекторную функцию (N297G) и Hu15G11.v5, и Hu15G11.LC92A содержат дополнительную мутацию Fc, которая аннулирует эффекторную функцию (D265A). Половинки антител типа выступ и впадина очищаются отдельно от E.coli и объединяются при отношении 1:1,1 антиTfR для предотвращения образования гомодимеров анти-TfR. Сборка биспецифичного антитела завершается посредством восстановительного отжига в течение по меньшей мере трех дней при комнатной температуре в буфере, содержащем восстановленный глютатион при отношении 100 х к антителу и 200мМ аргинина, pH 8,0. После сборки биспецифичные антитела очищают с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий. Сборка подтверждается с помощью жидкостной хроматографии-массспектрометрии и SDS-PAGE. С помощью эксклюзионной хроматографии и спектроскопии многоуглового лазерного рассеяания подтверждается, что очищенные антитела являются гомогенными и монодисперсными.
Полученные в результате биспецифичные антитела называются 15G11.v5 (анти-TfR1), 15G11.W92A (15G11.LC92A или анти-TfR2), Hu15G11.N52A (анти-TfR52A) и Hu15G11.T53A (анmи-TfR53A).
Одновалентное сродство и кинетика по отношению к TfR человека и цино определяются для 115G11.v5 и 115G11.W92A с помощью SPR, как выше (см. табл. 9). Анти-TfR1 и анти-TfR2 обладают сродством одновалентного связывания сходным с анти-TfRA и анти-TfRD, относительно связывания с TfR мыши (см. Atwal et al., Sci. Transl. Med. 3, 84ra43 (2011); Yu et al., Sci. Transl. Med. 25 May 2011:Vol. 3, Issue 84, p. 84ra44).
Таблица 8
Одновалентный SPR анализ 15G11.v5 (TfR1) и 15G11.W92A (LC92A, TfR2)
HuTfR CynoTfR Отношение cyno/human
Ka Kd KD Ka Kd KD
Hul5Gll.v5 Fab 6,74E+ 05 4,74E -03 7, 03E -09 4,51E+ 05 1,27E -02 2,82E -08 4,0
Биспецифичные HU15G11.W92A 1,28E+ 05 3,77E -02 2,95E -07 8,36E+ 04 5, 20E -02 6, 22E -07 2,1
В дополнение к этому сродство связывания анти-TfR1, анти-TfR2, биспецифичных антител Hu15G11.N52A и Hu15G11.T53A измеряют по отношению к TfR человека и цино с помощью SPR, как описано ранее. Как показано в табл. 9 ниже, анти-TfR52A и анти-TfR53A имеют сродство связывания к TfR человека и цино в пределах между значениями для TfR1h15G1Lv5 и TfR2LC92A.
- 53 038367
Таблица 9
Антитела анти-TfR цино/человека (нМ)
TfR человека TfR цино
Tf p^hl5Gll. v5 10 37
TfR2LC92A 270 810
TfR252A 52 343
TfR253A 24 143
Пример 4. Воздействие содержащих эффекторы и не содержащих эффекторов моноспецифичных и биспецифичных антител на линию клеток эритролейкемии человека и на первичные мононуклеарные клетки костного мозга.
Предыдущие исследования на мышах определили, что антитела, связывающие TfR мышиных с эффекторной функцией и/или со способностями связывания комплемента, селективно обедняют TfRэкспрессирующие ретикулоциты. Чтобы убедиться, является ли обеднение, наблюдаемое при исследованиях на мышах, уникальным для системы мышиных, осуществляют дополнительные эксперименты с использованием анти-TfR, которые связываются с TfR человека.
Анализы ADCC осуществляют с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых доноров людей в качестве эффекторных клеток. Линия клеток эритролейкемии человека (HEL, ATCC) и первичные мононуклеарные клетки костного мозга человека (AllCells, Inc.) используют в качестве целевых клеток. Для сведения к минимуму разброса среди доноров, который потенциально мог бы возникнуть, из-за аллотипических различий в остатке в 158 положении в FcyRIIIA, доноры крови ограничиваются теми, которые несут генотип гетерозиготного RcyRIIIA (F/V158) в первом наборе экспериментов (фиг. 8A-B). Для второго набора экспериментов (фиг. 9A-B) в качестве целевых клеток используют только клетки HEL, с PBMC от здоровых доноров людей, несущих либо генотип F/V158, либо генотип FcyRIIIA V/V158. Генотип V/V158 также включается в этот анализ из-за известной ассоциации с повышением активности ADCC, опосредуемой NK клетками, а также способности связывать антитела IgG4 (Bowles and Weiner, 2005; Bruhns et al. 2008). Клетки считают и жизнеспособность определяют с помощью Vi-CELL®(Beckman Coulter; Fullerton, CA), следуя инструкциям производителя.
PBMC изолируют с помощью центрифугирования в градиенте плотности с использованием пробирок для разделения крови Uni-Sep™ (Accurate Chemical & Scientific Corp.; Westbury, NY). Целевые клетки в 50 мкл среды для анализа (RPMI-1640 с 1% BSA и 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина) высевают в 96-луночный круглодонный планшет при 4х104/лунка. На планшеты, содержащие целевые клетки, добавляют последовательные разбавления исследуемых и контрольных антител (50 мкл/лунка), с последующим инкубированием при 37°C при 5% CO2 в течение 30 мин, чтобы сделать возможной опсонизацию. Конечные концентрации антител находятся в пределах от 0,0051 до 10000 нг/мл после 5-кратных последовательных разбавлений в целом для 10 точек данных. После инкубирования 1,0х106 эффекторных клеток PBMC в 100 мкл среды для анализа добавляют в каждую лунку с получением отношения эффекторные клетки:целевые клетки 25:1, и планшеты инкубируют в течение дополнительных 4 ч. По окончании инкубирования планшеты центрифугируют и супернатанты исследуют на активность лактатдегидрогеназы (LDH) с использованием Cytotoxicity Detection Kit™ (Roche Applied Scinece; Indianapolis, B). Реакционную смесь LDH добавляют к супернатантам и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин при постоянном встряхивании. Реакцию завершают с помощью 1М H3PO4 и измеряют коэффициент поглощения при 490 нМ (фон, измеренный при 650 нМ, вычитают для каждой лунки) с использованием считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax Plus. Коэффициент поглощения лунок, содержащих только целевые клетки, служит в качестве контроля для фона (низкий контроль), при этом лунки, содержащие целевые клетки, лизированные с помощью Triton-X100, обеспечивают максимальный доступный сигнал (высокий контроль). Независимую от антител клеточную цитотоксичность (AICC) измеряют в лунках, содержащих целевые и эффекторные клетки без добавления антитела. Степень удельной ADCC вычисляют следующим образом:
Аддо (образец) - А49О (AICC) % ADCC = 100 х ----------------------------------------------Аддо (высокий контроль) - Аддо (низкий контроль)
Значения ADCC для разбавлений образца изображают в виде графика зависимости от концентрации антитела и кривые доза-реакция подгоняют с помощью четырехпараметрической модели с использованием SoftMax Pro.
В первом наборе экспериментов активность ADCC различных конструктов TfR антиеловек оценивают с использованием либо линии клеток эритролейкемии человека (клетки HEL), либо первичных мононуклеарных клеток костного мозга человека в качестве целевых клеток. Двухвалентное антитело антиTfR 1 человека 15G11, компетентное относительно эффекторной функции IgG1, и биспецифичная форма этого антитела с плечом анти-BACE1 в формате IgG1 человека, содержащая мутации D265A и N297G для аннулирования эффекторной функции (см. пример 3), исследуются при различных концентрациях
- 54 038367 при анализе ADCC, с использованием IgGl анти-gD WT в качестве отрицательного контроля и антитела мышиных HLA человека (класс I) в качестве положительного контроля. Результаты показаны на фиг. 8A и 8B. Либо для клеток HEL в качестве мишеней (фиг. 8A), либо для мононуклеарных клеток костного мозга в качестве мишеней (фиг. 8B), моноспецифичное эффектор-положительное антитело анти-TfR человека 15G11 демонстрирует значительную активность ADCC. Эта активность является сходной с активностью антител анти-HLA человека положительного контроля относительно клеток HEL и находится на устойчивом, но более низком уровне по отношению к положительному контролю на мононуклеарных клетках костного мозга. Чуть более низкий уровень, наблюдаемый в эксперименте с мононуклеарными клетками костного мозга, вероятно, связан с тем фактом, что только часть гетерогенной смеси миелоидной и эритроидной линий клеток PBMC, используемых в эксперименте, экспрессирует высокие уровни TfR, в то время как клетки HEL имеют консистентно высокое экспрессирование TfR по популяции клональных клеток. Как резкий контраст, биспецифичное, не содержащее эффекторов антитело анти-TfR человека/BACE1 не демонстрирует никакой активности ADCC ни в клетках HEL, ни в мононуклеарных клетках костного мозга, подобно отрицательному контролю.
Во втором наборе экспериментов оценивают влияние переключения изотипа антитела в этой системе анализа. Процедура анализ ADCC идентична той, которая описана выше, с тем исключением, что все целевые клетки представляют собой клетки HEL, а эффекторные клетки представляют собой PBMC от здоровых доноров людей, несущих либо гетерозиготный генотип FcYRIIIa-V/F158, либо гомозиготный генотип FcYRIIIa-V/V158. Все исследуемые антитела анти-TfR человека являются биспецифичными, с анти-gD на трех различных основных цепях Ig: IgG1 человека дикого типа, IgG1 человека с мутацией N297G и IgG4 человека.
Исследуют также антитело анти-Abeta с основной цепью IgG4 человека, и антитела мыши антиHLA человека (класс I) служат в качестве положительного контроля. Результаты показаны на фиг. 9A и 9B. Как ожидалось на основе известной ассоциации между активированием эффекторной клетки и генотипом V/V158 (Bowles and Weiner 2005), активность ADCC более устойчиво демонстрируется донором PBMC V/V158 (оказывается влияние ~45% целевых клеток) по сравнению с донорами FA/158 (оказывается влияние ~25% целевых клеток) (сравните фиг. 9A и фиг. 9B). Антитела анти-TfR/gD с IgG1 дикого типа индуцируют устойчивую ADCC в клетках HEL, в то время как анти-TfR/gD с не содержащим эффекторов IgG1 не показывают никакой активности ADCC в клетках HEL, воспроизводя результаты из первого набора экспериментов. Отметим, что при концентрациях 100 нг/мл или выше, антитела антиTfR/gD изотипа IgG4 показывают умеренную активность ADCC. Эта активность не наблюдается в результатах для IgG4 анти-Abeta, показывая, что для ADCC активности требуется связывание TfR. Эти данные коррелируют с предыдущими сообщениями, что IgG4 имеет минимальную, но измеряемую эффекторную функцию (Adolffson et al., J. Neurosci. 32(28):9677-9689 (2012); van der Zee et al. Clin Exp. Immunol. 64:415-422 (1986)); Tao et al., J. Exp. Med. 173:1025-1028 (1991)).
Пример 5. Оценка in vivo биспецифичных антител анти-TfR человека/BACE1.
A. Фармакокинетические, фармакодинамические исследования и исследования безопасности.
Для оценки концентраций лекарственных средств, эффектов фармакодинамики и безопасности биспецифичных антител анти-TfR человека in vivo, обезьяны циномолгус (Macaca fascicularis) дозируются биспецифичными антителами с использованием клона 15G11 антитела анти-TfR, спаренного с таким же плечом анти-BACE1, как используется в предыдущих примерах (анти-TfR1/BACE1), или клоном 15G11.LC92A, спаренным с таким же плечом анти-BACE1, как используется в предыдущих примерах (анти-TfR2/BACE1) или Hu15G11.N52A (анти-TfR52A/BACE1) и Hu15G11.T53A (анти-TfR53A/BACE1). Эти биспецифичные антитела имеют формат IgG1 человека с мутациями N297G или D265A и N297G, аннулирующими эффекторную функцию, как описано ранее. В качестве контроля используют молекулу антиgD на IgG1 человека. Это исследование осуществляют на приматах, отличных от человека, поскольку кросс-реактивность этих антител анти-TfR ограничивается приматами, отличными от человека, и людьми. В дополнение к этому исследования показали, что механизмы переноса лекарственных средств между отделами спинно-мозговой жидкости (CSF) и плазмы могут быть сходными между людьми и приматами (Poplack et al., 1977). Антитела вводятся с помощью однократной внутривенной (IV) инъекции болюса в сафенную вену в дозе 30 мг/кг здоровым обезьянам циномолгус со стационарно установленными катетерами в мозжечковомозговой цистерне. В различные моменты времени до 60 дней после дозирования отбирают образцы плазмы, сыворотки и (CSF). Анализ образцов включает гематологию (цельной крови), клиническую химию (сыворотки), концентрацию антитела (сыворотки и CSF) и фармакодинамическую реакцию на антитело (плазма и CSF). См. фиг. 10 относительно подробной схемы отбора образцов.
Концентрации дозируемых антител в сыворотке и CSF обезьян циномолгус измеряют с помощью анализа ELISA с использованием покрытия из антител овцы анти-IgG человека, абсорбированного обезьяной, с последующим добавлением образцов сыворотки, начиная от разбавления 1:100 и заканчивая посредством добавления антитела козы анти-IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена, абсорбированного обезьяной, для детектирования. Анализ имеет стандартный диапазон кривой 0,78-50
- 55 038367 нг/мл и предел детектирования 0,08 мкг/мл. Результаты ниже этого предела детектирования сообщаются как не регистрируемые (LTR).
Фиг. 11A-B показывают результаты фармакокинетического анализа для антител анти-TfR1/BACE1 и анти-TfR2/BACE1. Фармакокинетический профиль для антитела анти-gD является таким, как ожидается для типичного антитела IgG1 человека в обезьянах циномолгус со средним выведением 3,98 мл/день/кг. Оба антитела анти-TfR/BACE1 выводятся быстрее чем анти-gD, вероятно, благодаря периферическому выведению, опосредуемому мишенью. Анти-TfR1/BACE1 имеет более быстрое выведение в соответствии с тем, что оно имеет самое высокое сродство связывания с TfR, в то время как антиTfR2/BACE1 показывает улучшенный фармакокинетический профиль (т.е. более длительное экспонирование в сыворотке) по сравнению с анти-TfR1/BACE1, вероятно, благодаря его пониженному сродству к TfR. Выведение для анти-TfR1/BACE1 и анти-TfR2/BACE1 составляет 18,9 мл/день/кг и 8,14 мл/день/кг соответственно. Все антитела детектируются в CSF приблизительно при одной тысячной от концентрации в сыворотке. Однако имеется высокий разброс и, в целом, детектируемых различий в концентрации антител в CSF между молекулами нет.
Таблица 10
Средние (±SD) оценки параметра PK для всех исследуемых антител после однократного внутривенного введения дозы болюса при 30 мг/кг обезьянам циномолгус (n=5)
Антитело AUCall (день* мкг/мл) AUCinf (день* мкг/мл) Стах (мкг/мл) CL (мл/день/кг) vss (мл/кг)
анти-gD 7640+1790 7930+1910 912+141 3,98+1,05 51,3+10,2
aHTH-TfRVBACEl 1610+240 1610+237 809+132 18,9+2,54 41,0+8,18
анти-TfR2/ВАСЕ1 3750+528 3750+530 850+69,2 8,14+1,21 41,2+6,06
SD = стандартное отклонение; IV = внутривенно; AUCall = площадь под кривой концентрация-время от времени 0 до времени последней измеряемой концентрации; AUQinf = площадь под кривой концентрация-время, экстраполированной до бесконечности; Cmax = наблюдаемая максимальная концентрация в сыворотке; CL = выведение; Vss = объем распределения в стационарном состоянии; min = минимум, max = максимум.
Фиг. 19 показывает результаты фармакокинетического анализа для антител анти-TfR1/BACE1, антиTfR52A/BACE1 и анти-TfR53A/BACE1. Все антитела анти-TfR/BACE1 выводятся быстрее, чем анти-gD, вероятно, благодаря периферическому выведению, опосредуемому мишенью. Анти-TfR1/BACE1 показывает самое быстрое выведение, соответствующее тому, что оно имеет самое высокое сродство связывания с TfR, в то время как анти-TfR52A/BACE1 и анти-TfR53A/BACE1 показывают улучшенный фармакокинетический профиль (т.е. более длительное экспонирование в сыворотке) по сравнению с антиTfR1/BACE1, вероятно, благодаря пониженному сродству к TfR у анти-TfR52A/BACE1 и антиTfR53A/BACE1.
Чтобы увидеть фармакодинамическое воздействие в ответ на дозирование анти-TfR/BACE1, авторы измеряли уровни Ap1-40 и sAPPa и pAPPp в плазме и CSF обезьян циномолгус. Ap1-40 измеряют с помощью ELISA с использованием специфичного поликлонального покрытия из антител анти-Ap1-40, с последующим добавлением образцов и заканчивают добавлением моноклонального антитела мыши анти-Ap1-40 человека, конъюгированного с пероксидазой хрена, для детектирования. Анализ имеет предел детектирования 60 пг/мл для плазмы и 140 пг/мл для CSF. Результаты ниже этой концентрации считаются не детектируемыми (LTR). Концентрации в CSF sAPPa и sAPPp определяют с использованием мультиспотового анализа sAPPa/sAPPp (Mesoscale Discovery (Gaithersburg, MD)). CSF оттаивают на льду, затем разбавляют 1:10 в 1% BSA в TBS-T (10 мМ Tris буфера, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20). Анализ осуществляют согласно протоколу производителя. Анализ имеет нижний предел значений количественного определения 0,05 нг/мл для sAPPa и 0,03 нг/мл для sAPPp.
Фиг. 12A-E приводят сводку фармакодинамического поведения антител. На периферии уровни Ap1-40 в плазме остаются неизменными после введения анти-gD, но транзиторно уменьшаются после введения анти-TfR/BACE1. Оба варианта понижают уровни Ap1-40 в плазме при максимальном ингибировании 50%, достигаемом через 1 день после дозирования.
Уровни Ap1-40 в плазме постепенно восстанавливаются, при этом животные, получающие антиTfR1/BACE1, возвращаются к фоновым уровням Ap1-40 примерно через 14 дней после дозирования. Уровни Ap1-40 возвращаются к фоновым уровням в пределах между 21 и 30 днями после дозирования у животных, которых лечат анти-TfR2/BACE1. Оба антитела анти-TfR/BACE1 понижают уровни Ap1-40 в CSF, при этом изменений не наблюдается у животных, которым дозируют анти-gD. Введение антиTfR1/BACE1 дает в результате более значительное уменьшение уровней Ap1-40 в CSF (среднее максимальное ингибирование 50% от фонового), чем для анти-TfR2/BACE1 (среднее максимальное ингибирование 20% от фонового). Продуцирование sAPPp ингибируется у животных, леченых анти-TfR/BACE1,
- 56 038367 но не у животных, которые получали анти-gD. Подобно результатам для Αβ40 aHmu-TfR1/BACE1 имеет более сильное ингибиторное воздействие на продуцирование sAPPe, чем aнти-TfR2/BACE1, продуцирование sAPPa стимулируется во время ингибирования BACE1 как aнти-TfR1/BACE1, так и антиTfR2/BACE1, и реакция имеет обратную корреляцию с уровнем ингибирования, наблюдаемым для sAPPe и Ae1-40. sAPPa и sAPPe представляют собой первичные продукты процессирования белка предшественника амилоида (APP), и их уровни сильно скоррелированы. Отношение sAPPe/sAPPa нормирует результаты на потенциальные изменения в фоновом экспрессировании APP или потенциальные преданалитические различия при сборе CSF и манипуляциях с ней в ходе исследований. Отношение sAPPe/sAPPa в CSF с анти-TfR1/BACE1 демонстрирует более устойчивый эффект PD, чем aнти-TfR2/BACE1. Таким образом, эти результаты поддерживают вовлеченность мишени (т.е. BACE1) для антител aнти-TfR/BACE1.
Реакция PD для антител aнти-TfR52A/BACE1 и aнти-TfR53A/BACE1 также коррелирует с продолжительностью экспонирования антитела и понижением сродства плеча к TfR показывает увеличение уменьшения Ae40 (данные не показаны). Эти данные также поддерживают вовлеченность мишени в этих биспецифичных антителах.
В целом, эти результаты говорят, что биспецифичное антитело aнти-TfR/BACE1 со сродством к TfR человека в пределах между сродством aнти-TfR1/BACE1 и aнти-TfR2/BACE1, вероятно, имело бы желаемый фармакокинетический/фармакодинамический баланс.
В настоящем исследовании не наблюдается никаких сигналов относительно безопасности. Нет никаких доказанных воздействий на любые параметры гематологии или клинической химии для обезьян, получающих 30 мг/кг любого введенного биспецифичного антитела, до 60 дней после дозирования. Важно, что уровни ретикулоцитов остаются неизменными при лечении либо aнти-TfR1/BACE1, либо aнти-TfR2/BACE1 (фиг. 13), как и ожидалось, поскольку эти антитела имеют ослабленную эффекторную функцию, и средний уровень циркулирующих ранних ретикулоцитов с высокими уровнями TfR у нормальных приматов является очень низким (см. пример 4).
Пример 6. Оценка биспецифичных антител aнти-TfR/BACE1 человека in vivo.
Для исследования соотношения между фармакодинамикой антитела в CSF и фармакокинетикой в головном мозге обезьянам циномолгус (Macaca fascicularis) дозируют биспецифичные антитела антиTfR'/BACE1 или aнти-TfR2/BACE1, как в предыдущем примере. Эти биспецифичные антитела имеют формат IgG1 человека с мутациями D265A и N297G, аннулирующими эффекторную функцию. В качестве контроля используют молекулу анти-gD на IgG1 человека. Для сравнения авторы также дозируют двухвалентное антитело aнти-BACE1, которое представляет собой такой же клон, как используется для биспецифичных антител. Антитела вводятся посредством однократной внутривенной (IV) инъекции болюса в сафенную вену в дозе 30 мг/кг здоровым обезьянам циномолгус со стационарно установленными катетерами в мозжечковомозговой цистерне. Фоновые образцы CSF собирают за 24 и 48 ч перед дозированием, и другой образец CSF собирают через 24 ч после дозирования (как показано схематически на фиг. 14). После сбора CSF через 24 ч после дозирования осуществляют вливание солевого раствора животным, и головной мозг собирают для анализа концентрации антитела. Различные области головного мозга гомогенизируют в 1% NP-40 (Cal-Biochem) в PBS, содержащем таблетки полного мини-коктейля ингибиторов протеаз, не содержащего EDTA (Roche Diagnostics). Гомогенизированные образцы головного мозга вращают при 4°C в течение 1 ч перед центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант изолируют для измерения уровней антитела в головном мозге с использованием способа ELISA, описанного в предыдущем примере. Кровь также собирают для подтверждения периферического экспонирования и реакций фармакодинамики, которые являются сходными с наблюдениями авторов в примере 5.
Фармакодинамические воздействия aнти-TfR1/BACE1 и aнmи-TfR2/BACE1, как оценивается, в CSF также являются сходными с эффектами, наблюдаемыми в предыдущем примере. Фиг. 15 демонстрирует, что отношение sAPPe/sAPPa в CSF устойчиво уменьшается после дозирования aнти-TfR1/BACE1. АнтиTfR2/BACE1 не показывает явного уменьшения через 24 ч после дозирования при этих исследованиях. Анти-ВАСЕ1 также не показывает воздействия. Анализ концентраций антитела в головном мозге показывает, что как контрольный IgG, так и антитело aнти-BACE1 имеют ограниченное потребление в головном мозге при уровнях, которые чуть превышают предел детектирования в анализе авторов (в среднем ~670 пМ). Анти-TfR2/BACE1 имеет в ~3 раза улучшенное потребление в головном мозге по сравнению с контрольным IgG (в среднем ~2 нМ), и aнτи-TfR1/BACE1 имеет наилучшее потребление в головном мозге, в ~15 раз больше, чем контрольный IgG (в среднем ~10 нМ). Концентрации антитела в головном мозге для различных антител коррелируют с реакцией фармакодинамики, наблюдаемой в CSF в исследованиях авторов, при этом aнти-TfR1/BACE1 имеет наилучшее потребление в головном мозге и наиболее устойчивое воздействие фармакодинамики, и aнти-TfR2/BACE1 имеет меньшее потребление в головном мозге и более умеренное воздействие.
Эти результаты расширяют предыдущие данные авторов, демонстрируя, что биспецифичные антитела, связывающие TfR, улучшают потребление в головном мозге приматов, отличных от человека. У приматов, как и мышей, вероятно, имеется оптимальное сродство к TfR, которое лучше всего балансиру
- 57 038367 ет потребление в головном мозге и выведение, опосредуемое TfR. В примере авторов, aHTu-TfR1/BACE1 с более высоким сродством демонстрирует хорошее потребление в головном мозге, и на него влияет периферическое выведение, опосредуемое мишенью. TfR2/BACE1 с уменьшенным сродством имеет улучшенные свойства при выведении, но, видимо, имеет настолько низкое связывание с TfR, что не может эффективно переноситься с помощью TfR (в основном таким же путем, когда имеющее низкое сродство антитело анти-TfR TfRE в патенте США US 2012/0171120 переходит через некоторый порог сродства, за которым сродство является слишком низким, чтобы сделать возможным достаточное взаимодействие между антителом и TfR так, что антитело оставалось бы ассоциированным с TfR, когда TfR начинает процесс транслокации). По результатам этого эксперимента биспецифичное антитело анти-TfR/BACE1 человека/цино, имеющее сродство к TfR в пределах между TfR1 и TfR2, согласно предсказаниям, должно иметь улучшенные свойства потребления и выведения по сравнению либо с анти-TfR1/BACE1, либо с анти-TfR2/BACE1 в этой системе.
Пример 7. Создание дополнительных не содержащих эффекторов мутаций в контексте биспецифичного антитела рецептора трансферрина.
Другие мутации в Fc области, которые аннулируют эффекторную функцию, в дополнение к N297G и D26A, исследуются на их способность уменьшать или предотвращать обеднение TfRэкспрессирующих ретикулоцитов. Конкретно, Fc мутации L234A, L235A и P329G (LALAPG), которые описаны в публикации заявки на патент США № 2012/021531, которая включается в настоящий документ в качестве ссылки, вводятся в антитело анти-TfRD/BACE1 (которое описано в публикации международной заявки на патент № 2013/177062, и которая включается в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте).
Фармакокинетический анализ и количество ретикулоцитов после однократного введения антитела мышам осуществляют следующим образом.
Самки мышей C57B/6 дикого типа в возрасте 6-8 недель используются для всех исследований. Уход за животными осуществляется в соответствии с официальными инструкциями. Мышам дозируют внутривенно однократную дозу 50 мг/кг либо антитела анти-gD (IgG2a мышиных) с мутациями LALAPG, антитела анти-TfRD/BACE1 (химера крысы/мышиных) с мутациями LALAPG. Общий объем инъекции не превышает 250 мкл и антитела разбавляют в D-PBS, при необходимости (Invitrogen). Через 24 ч цельную кровь собирают перед вливанием в пробирки микроконтейнеры с EDTA (BD Diagnostics), дают возможность для оседания в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 5000xg в течение 10 мин. Верхний слой плазмы переносят в новые пробирки для измерений антитела.
Общие концентрации антитела в плазме мышей измеряют с использованием для ELISA антитела анти-IgG2a мыши (аллотип a)/антитела анти-IgG2a мыши (аллотип a). 384-луночные иммунопланшеты Maxisorp NUNC (Neptune, NJ) покрывают антителом мыши анти-IgG2a мыши, аллотип A, антителом, специфичным к аллотипу A (BD/Pharrnigen San Jose, CA), в течение ночи при 4°C. Планшеты блокируются с помощью PBS, 0,5% BSA в течение 1 ч при 25°C. Каждое антитело (анти-gD и биспецифичные варианты анти-TfR/BACE1) используют в качестве стандарта для количественного определения концентрации антитела. Планшеты промывают PBS, 0,05% Tween-20 с использованием устройства для промывки для микропланшетов (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT), и стандарты и образцы, разбавленные в PBS, содержащем 0,5% BSA, 0,35М NaCl, 0,25% CHAPS, 5 мМ EDTA, 0,2% BgG, 0,05% Tween-20 и 15 м.д. Proclin® (Sigma-Aldrich), добавляют в течение 2 ч при 25°C. Связанное антитело детектируют с помощью биотин-конъюгированного антитела мыши анти-IgG2a мыши, аллотип A, антитела специфичного к аллотипу A (BD/Pharmigen San Jose, CA). Связанное антитело, конъюгированное с биотином, детектируют с помощью стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA). Образцы проявляют с использованием 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) и коэффициент поглощения измеряют на 450 нМ с помощью устройства для считывания Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Hudson, NH). Концентрации определяют из стандартной кривой с использованием программы четырехпараметрической нелинейной регрессии. Анализ имеет нижний предел значения количественного определения (LLOQ) 78,13 нг/мл в плазме. Статистический анализ различий между экспериментальными группами осуществляют с использованием двуххвостного непарного tтеста.
При введении антител анти-TfRD/BACE1, содержащих мутации Fc LALAPG, мыши не демонстрируют клинических симптомов, как наблюдалось ранее с использованием антител с полной эффекторной функцией. См. Couch et al., Sci. Trans. Med. 5:183ra57 (2013). Фиг. 20 показывает результаты фармакокинетического анализа.
В дополнение к этому количество незрелых ретикулоцитов и ретикулоцитов в целом определяют с использованием Sysmex XT2000iV (Sysmex, Kobe, Japan) в соответствии с инструкциями производителей. Через 24 ч после дозирования не наблюдается различий в доле незрелых ретикулоцитов или в общем количестве ретикулоцитов по сравнению с любым исследуемым антителом, как видно на фиг. 21. Эти результаты говорят о том, что мутация LALAPG не только аннулирует эффекторную функцию антитела, но также уменьшает связывание комплемента и опосредуемое комплементом выведение ретикулоцитов, видное даже для не содержащего эффектора каркаса антитела (Couch et al. 2013). Это соответствует дру- 58 038367 гому сообщению о том, что включение мутации LALA в IgGl человека может ограничивать связывание комплемента (Hessell et al. Nature 449:101-104 (2007)).
Пример 8. Получение биспецифичных вариантов FcRnHIGH.
Для увеличения времени полужизни биспецифичных антител и, тем самым, потенциального увеличения концентрации антитела в головном мозге получают биспецифичные варианты, содержащие мутации в постоянном домене IgG, а конкретно, в домене, связывающемся с Fc рецептором новорожденных (FcRn) (мутации FcRnHIGH). Домен связывания FcRn участвует в переносе антител от матери к плоду. См. Story et al., J. Exp. Med., 180:2377 2381, 1994. Замещения аминокислот в домене связывания FcRn увеличивает сродство постоянного домена к FcRn, увеличивая тем самым время полужизни антитела.
Мутации домена связывания FcRn M252Y, S254T и T256E (YTE), как описано, увеличивают связывание FcRn и, таким образом, увеличивают время полужизни антител. См. опубликованную заявку на патент США № 2003/0190311 и Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006). В дополнение к этому мутации домена связывания FcRn N434A и Y436I (AI), как описано, также увеличивают связывание FcRn. См. Yeung et al., J. Immunol. 182:7663-7671 (2009). Мутации YTE (M252Y/S254T/T256E) и AI (N434/Y436I) включены в биспецифичные антитела, как анти-TfR52A/BACE1, так и анти-TfR2/BACE1, содержащие либо WT IgG1 человека, либо не содержащие эффекторов мутации LALAPG или N297G. В дополнение к этому мутации FcRnHIGH осуществляют в антителе hIgG1 анти-gD в качестве контроля. Мутации конструируют с использованием мутагенеза по Кункелю, антитела экспрессируются транзиторно в клетках CHO, и белки очищаются с использованием хроматографии на белке A с последующей эксклюзионной хроматографией (SEC).
Связывание вариантов антител FcRnHIGH с FcRn измеряется с использованием BIAcore. Белки FcRn человека и обезьяны циномолгус экспрессируются в CHO и очищаются с использованием аффинной хроматографии на IgG. Данные получают на инструменте BIAcore T200. Сенсорный чип серии S CM5 (GE Healthcare, Cat. BR100530) активируют с помощью реагентов EDC и NHS в соответствии с инструкциями поставщика, и антитело анти-Fab (Human Fab capture kit, GE Health care Bio-science. AB SE-7 184, Uppsala, Sweden) связывают с получением приблизительно 10000 единиц отклика (RU), с последующей блокировкой непрореагировавших групп с помощью 1 метаноламина. Для измерений сродства сначала осуществляют инжекцию антител при скорости потока 10 мкл/мин, для захвата приблизительно 1000 RU на 3 различных проточных ячейках (FC), за исключением FC1 (для сравнения), а затем инжектируют 2кратные последовательные разбавления FcRn человека (или FcRn цино) в буфере pH6 (0,1М фосфат натрия), от низких концентраций (1 нМ) до высоких (25 мкМ) (скорость потока: 30 мкл/мин), одно за другим, в одном и том же цикле без регенерации между инъекциями. Регистрируют сенсограммы и осуществляют вычитание для сравнения и буфера перед оценкой с использованием BIAcore T200 Evaluation Software (version 2,0). Сродство определяют посредством анализа уровня связывания в стационарном состоянии на основании модели связывания 1:1. Сродство связывания для вариантов LALAPG, N297G, LALAPG.YTE и LALAPG.AI антитела анти-TfR52A/BACE1 показаны в табл. 11 ниже. Данные показывают, что варианты FcRnHIGH увеличивают сродство при эндосомальных условиях (pH 6) к FcRn как человека, так и цино.
Таблица 11
Антитело Эффекторная функция FcRn High FcRn человека FcRn цино
KD при pH6 (mkM) KD при pH6 (mkM)
Анти-TfR.52А/ВАСЕ1.hlgGl WT WT
Анти-TfR.52А/ВАСЕ1.hlgGl.N297G N297G WT 1,3 2,1
Анти-TfR.52А/ВАСЕ1.hlgGl.LALAPG LALAPG WT 0, 8 1,2
Анти-TfR.52A/BACE1.hlgGl.N297G.YTE N297G YTE
Анти-TfR.52A/BACE1.hlgGl.LALAPG.YTE LALAPG YTE 0,2 0,2
Анти-TfR.52A/BACE1.hlgGl.N297G.AI N297G N434A/Y436I
Анти-TfR.52A/BACE1.hlgLALAPG.AI LALAPG N434A/Y436I 0, 6 0,4
Анти-TfR.52A/BACE1.hlgGl.N297G.A N297G N434A
AHTH-TfR2/BACEl.hlgGl N297G N297G WT 1,7 2,1
AHTH-TfR2/BACEl.hlgGl.LALAPG LALAPG WT 1,1 1,2
Анти-TfR2/RAP.El.hlgGl.LALAPG.YTE LALAPG YTE 0,3 0,2
Анти-gG.hlgGl WT WT 0,7 0, 9
Анти-gG.hlgGl.YTE WT YTE
Анти-gG.hlgGl.AI WT N434A/Y436I 0,3 0,4
Анти-gG.hlgGl.A WT N434A 0, 1 0,7
Выбранные варианты FcRnHIGH будут исследоваться на обезьянах циномолгус для определения то- 59 038367 го, может ли повышение сродства к FcRn улучшить фармакокинетические свойства и/или увеличить экспонирование для головного мозга антитела анти-TfR/BACE1.
Для оценки безопасности мутаций, не имеющих эффекторов, и мутаций FcRnHIGH, определенные биспецифичные антитела вводятся мышам, нокаутированным рецептором трансферрина человека, которые экспрессируют рецептор трансферрина человека. Мыши, нокаутированные huTfR, генерируются следующим образом.
Конструкт для нацеливания cDNA TfR человека на локус C57BL/6 Tfrc в клетках ES получают с использованием сочетания методик рекомбинирования (Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18), pp. 6913-22 2006; Liu et al. Genome Research (2003) vol. 13 (3), pp. 476-84) и стандартных методик молекулярного клонирования.
Вкратце, кассета (cDNA TfR человека, SV40 pA и frt-PGK-em7-Neo-BGHpA-frt), фланкированная с помощью коротких гомологических групп с геном Tfrc мыши, используется для модификации Tfrc C57BL/6J BAC (библиотека RP23 BAC) посредством рекомбинирования. Кассета cDNA TfR человека вставляется в эндогенную ATG, и остаток экзона 2 Tfrc плюс начала интрона 2 удаляется. Целевая область в BAC затем возвращается в pBlight-TK (Warming et al. Molecular and Cellular Biology vol. 26 (18), pp. 6913-22 2006) вместе с фланкирующими геномными последовательностями Tfrc в качестве гомологичных плечей для нацеливания на клетки ES. Конкретно, 5' гомологичное плечо, 2950 bp, соответствует (сборке NCBI37/mm9): chr.16:32,610,333-32,613,282 и 3' гомологичное плечо, 2599 bp, соответствует chr.16:32, 613, 320-32, 615, 918. Конечный вектор подтверждается посредством секвенирования ДНК.
Вектор Tfrc/TFRC KI линеаризуется с помощью NotI и C57BL/6N C2 и нацеливается на клетки ES с использованием стандартных способов (6418-положительная и ганцикловир-отрицательная селекция). Положительные клоны идентифицируются с использованием PCR и анализа TaqMan и подтверждаются посредством секвенирования модифицированного локуса. Правильно нацеленные клетки ES трансфицируются плазмидой Flpe для удаления Neo, и затем клетки ES вводятся как инъекция в бластоцисты с использованием стандартных методик. Зародышевую передачу получают после скрещивания полученных в результате химер с самками C57BL/6N.
Конкретно, антитела, перечисленные в таблице, ниже, вводят мышам, нокаутированным huTfR, в виде однократной дозы 50 мг/кг и через 24 ч извлекают кровь и исследуют ретикулоциты, huIg1, N297G.
_____________________________________________________________________ Таблица 12
Антитело Изотип Количество мышей
Анти-gD hulgl, N297G 6
aHTH-TfR52A/BACEl hulgGl, N297G 6
ант - Tf R52a/BACE 1 hulgGl, LALAPG 6
анти- Tf R52a/BAGE 1 hulgGl, LALAPG/YTE 6
анти- Tf R52a/BACE 1 hulgGl, LALAPG/AI 6
После введения антител анти-TfR52A/BACE1 LALAPG, LALAPG/YTE или LALAPG/AI (группы 3-5 в табл. 12), мыши, нокаутированные TfR человека, не проявляют клинических симптомов или потери ретикулоцитов (фиг. 22), как наблюдалось ранее с использованием антител анти-TfR с полной эффекторной функцией (Couch et al. 2013). Эти результаты показывают, что включение мутаций LALAPG в каркас IgG1 человека также аннулирует эффекторную функцию и, кроме того, говорит, что добавление мутаций либо YTE, либо AIFcRnHIGH не влияет отрицательно на желаемые свойства мутаций LALAPG, чтобы сделать антитело не содержащим эффекторов.
Осуществляют также анализы ADCC для подтверждения не содержащего эффекторов статуса сочетаний мутаций LALAPG, LALAPG/YTE и LALAPG/AI в линии клеток, полученных от человека. Как и ранее, линия клеток эритролейкемии человека (HEL, ATCC) используется в качестве клеток мишени с PBMC от здоровых доноров людей, несущих либо генотип F/V158, либо генотип FcyRIIIA V/V158. Генотип V/V158 также включается в настоящий анализ из-за известной ассоциации с увеличением активности ADCC, опосредуемой NK клетками, а также способности связывать антитела IgG4 (Bowles and Weiner, 2005: Bruhns et al. 2008). Клетки считают, и их жизнеспособность определяется с помощью Vi-CELL® (Beckman Coulter; Fullerton, CA), следуя инструкциям производителя.
PBMC изолируют с помощью центрифугирования в градиенте плотности с использованием пробирок для разделения крови Uni-Sep™ (Accurate Chemical & Scientific Corp.; Westbury, NY). Целевые клетки в 50 мкл среды для анализа (RPMI-1640 с 1% BSA и 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина) высевают в 96-луночный круглодонный планшет при 4х104/лунка. Последовательные разбавления исследуемых и контрольных антител (50 мкл/лунка) добавляют в планшеты, содержащие целевые клетки, с последующим инкубированием при 37°C с 5% CO2 в течение 30 мин, чтобы сделать возможной опсонизацию. Конечные концентрации антител в пределах от 0,0051 до 10000 нг/мл измеряют после 5-кратных последовательных разбавлений в целом для 10 моментов времени. После инкубирования 1,0х106 эффекторных клеток PBMC в 100 мкл среды для анализа добавляют в каждую лунку для получения отношения
- 60 038367 эффекторные клетки : целевые клетки 25:1, и планшеты инкубируют в течение дополнительных 4 ч. Планшеты центрифугируют в конце инкубирования и супернатанты исследуют на активность лактатдегидрогеназы (LDH) с использованием Cytotoxicity Detection Kit™ (Roche Applied Science; Indianapolis, B). Реакционную смесь с LDH добавляют к супернатантам, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин при постоянном встряхивании. Реакцию завершают с помощью 1М H3PO4, и коэффициент поглощения измеряют при 490 нМ (фон, измеренный при 650 нМ, вычитают для каждой лунки) с использованием считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax Plus. Коэффициент поглощения лунок, содержащих только целевые клетки, служит в качестве контроля для фона (низкий контроль), в то время как лунки, содержащие целевые клетки, лизированные с помощью Triton-X100, обеспечивают максимальный доступный сигнал (высокий контроль). Независимую от антитела клеточную цитотоксичность (AICC) измеряют в лунках, содержащих целевые и эффекторные клетки без добавления антитела. Доля конкретных ADCC вычисляется следующим образом:
А49о (образец) - А490 (AICC) % ADCC = 100 х --------------------------------------------А490 (высокий контроль) - А4 90 (низкий контроль)
Значения ADCC разбавлений образца изображают в виде графика зависимости от концентрации антитела, и кривые доза-реакция подгоняют к четырехпараметрической модели с использованием SoftMax Pro.
Результаты анализа ADCC показаны на фиг. 23. Как и ожидалось, эффектор-положительное антитело анти-TfR человека (анти-TfR1/gD IgG1 WT) демонстрирует значительную активность ADCC на клетках HEL. В противоположность этому варианты антитела анти-TfR52A/BACE1, содержащие мутации LALAPG, LALAPG/YTE или LALAPG/AI, не демонстрируют никакой активности ADCC на клетках HEL, подобно отрицательному контролю, антителу анти-TfR52A/gD N297G.
Хотя изложенное выше настоящее изобретение описано в некоторых подробностях в качестве иллюстрации и примера для целей ясности понимания, описания и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие рамки настоящего изобретения. Описание всей патентной и научной литературы, цитируемой в настоящем документе, в явном виде включается во всей его полноте в качестве ссылок.

Claims (49)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или фрагмент антитела, которое связывается с рецептором трансферрина человека (TfR), где антитело или фрагмент антитела содержит HVR-H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53, HVR-H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 156, HVR-H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, HVR-L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 50, HVR-L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 51 и HVR-L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52.
  2. 2. Антитело или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела связывается с TfR приматов.
  3. 3. Антитело или фрагмент антитела по п.1 или 2, где антитело или фрагмент антитела не ингибирует связывание трансферрина с TfR.
  4. 4. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3, которое представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.
  5. 5. Антитело или фрагмент антитела по п 4, которое представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.
  6. 6. Антитело или фрагмент антитела по п.4, которое представляет собой химерное антитело или его фрагмент.
  7. 7. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-6, где антитело или фрагмент антитела содержит:
    a) VH с последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 153; или
    b) VL с последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105; или
    c) VH с последовательностью, как указано в (a), и VL с последовательностью, как указано в (b); или d) VH с последовательностью с SEQ ID NO: 153; или
    e) VL с последовательностью с SEQ ID NO: 105; или
    f) VH с последовательностью, как указано в (d), и VL с последовательностью, как указано в (e).
  8. 8. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-6, содержащее VH с последовательностью SEQ ID NO: 153 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 105.
  9. 9. Антитело или фрагмент антитела по п.1, где одно или несколько свойств антитела или фрагмента антитела изменено, что приводит к уменьшению или прекращению воздействия антитела или фрагмента антитела на ретикулоциты и/или к снижению тяжести или исчезновению острых клинических симптомов у индивида, получившего терапию антителом или фрагментом антитела, где одно или несколько свойств
    - 61 038367 выбраны из эффекторной функции Fc-области антитела и функции активации комплемента антитела, где эффекторная функция и функция активации комплемента снижена или прекращена по сравнению с антителом дикого типа того же изотипа.
  10. 10. Антитело или фрагмент антитела по п.9, где антитело или фрагмент антитела связывается с TfR приматов.
  11. 11. Антитело или фрагмент антитела по п.9 или 10, где антитело или фрагмент антитела не ингибирует связывание трансферрина с TfR.
  12. 12. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.9-11, которое представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.
  13. 13. Антитело или фрагмент антитела по п.12, которое представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.
  14. 14. Антитело или фрагмент антитела по п.13, которое представляет собой химерное антитело или его фрагмент.
  15. 15. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.9-14, где антитело или фрагмент антитела содержит:
    (a) VH с последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 153; или (b) VL с последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105, или (c) VH с последовательностью, как указано в (a), и VL с последовательностью, как указано в (b); или (d) VH с последовательностью SEQ ID NO: 153; или (e) VL с последовательностью SEQ ID NO: 105; или (f) VH с последовательностью, как указано в (d), и VL с последовательностью, как указано в (e).
  16. 16. Антитело по любому из пп.9-14, содержащее VH с последовательностью SEQ ID NO: 153 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 105.
  17. 17. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.9-16, где эффекторная функция уменьшается или исчезает благодаря способу, выбранному из уменьшения гликозилирования антитела или фрагмента антитела, модификации изотипа антитела до изотипа, который естественным образом обладает пониженной эффекторной функцией или у которого эта функция отсутствует, и модификации Fc-области.
  18. 18. Антитело или фрагмент антитела по п.17, где гликозилирование антитела или фрагмента антитела уменьшается благодаря способу, выбранному из получения антитела или фрагмента антитела в условиях, которые препятствуют природному гликозилированию; удаления углеводных групп, уже присутствующих на антителе или фрагменте антитела; и модификации антитела или фрагмента антитела таким образом, что природное гликозирование не происходило.
  19. 19. Антитело или фрагмент антитела по п.18, где Fc-область антитела или фрагмента антитела содержит мутацию в положении 297, такую как замена природного аспарагинового остатка на другую аминокислоту, которая мешает гликозилированию в этом положении.
  20. 20. Антитело или фрагмент антитела по п.19, где эффекторная функция уменьшается или исчезает из-за делеции всей или части Fc-области или за счет конструирования антитела или фрагмента антитела, которое не содержит Fc-области или области, отличающейся от Fc-области, отвечающей за эффекторную функцию или функцию активации комплемента.
  21. 21. Антитело или фрагмент антитела по п.20, где модификация выбрана из точечной мутации Fcобласти для ослабления связывания с одним или несколькими рецепторами Fc, выбранной из следующих положений: 234, 235, 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 и 439; из точечной мутации Fc-области для ослабления связывания с C1q, выбранной из следующих положений: 270, 322, 329 и 321; из удаления части или всей Fc-области и из точечной мутации в положении 132 домена CH1.
  22. 22. Антитело или фрагмент антитела по п.21, где модификация представляет собой N297G; D265A и N297A; или D265A и N297G; или L234A, L235A и P329G.
  23. 23. Антитело или фрагмент антитела по п.22, где модификация представляет собой L234A, L235A и P329G.
  24. 24. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.9-23, где время полужизни антитела повышается посредством модификации в FcRn-связывающемся домене антитела в положении, выбранном из 252, 254, 256, 434 и 436.
  25. 25. Антитело или фрагмент антитела по п.24, где модификация представляет собой M252Y, S254T и T256E или N434A и Y436I.
  26. 26. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-25, где антитело или фрагмент антитела связано с терапевтическим соединением, где терапевтическое соединение представляет собой лекарственное средство против неврологического расстройства.
  27. 27. Мультиспецифическое антитело или фрагмент мультиспецифического антитела, которое связы-
    - 62 038367 вается с рецептором трансферрина человека (TfR), содержащее первый антиген-связывающий сайт и второй антиген-связывающий сайт, где первый антиген-связывающий сайт содержит HVR-H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53, HVR-H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 156, HVR-H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, HVR-L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 50, HVR-L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 51 и HVR-L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52, и второй антиген-связывающий сайт мультиспецифического антитела связывается с антигеном головного мозга.
  28. 28. Мультиспецифическое антитело или фрагмент мультиспецифического антитела по п.27, где антиген головного мозга выбран из группы, состоящей из β-секретазы 1 (BACE1), Ав, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), тау, аполипопротеина E (ApoE), α-синуклеина, CD20, хантингтина, прионного белка (PrP), обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), паркина, презенилина 1, презенилина 2, γ-секретазы, репептора гибели 6 (DR6), белка предшественника амилоида (APP), рецептора p75 нейротрофин (p75NTR) и каспазы 6.
  29. 29. Мультиспецифическое антитело или фрагмент мультиспецифического антитела по п.28, где мультиспецифичное антитело или фрагмент мультиспецифического антитела связывается как с TfR, так и с BACE1, или где мультиспецифичное антитело или фрагмент мультиспецифического антитела связывается как с TfR, так и с Ав.
  30. 30. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-26.
  31. 31. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая мультиспецифическое антитело или фрагмент мультиспецифического антитела по любому из пп.27-29.
  32. 32. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.30 или 31, для продукции антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-29.
  33. 33. Способ получения антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-26, включающий культивирование клетки-хозяина по п.32 и восстановление антитела или фрагмента антитела из клеткихозяина.
  34. 34. Способ получения мультиспецифического антитела или фрагмента мультиспецифического антитела по любому из пп.27-29, включающий культивирование клетки-хозяина по п.32 и восстановление мультиспецифического антитела или фрагмента мультиспецифического антитела из клетки-хозяина.
  35. 35. Фармацевтический состав для лечения неврологического расстройства, содержащий антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-29 и фармацевтически приемлемый носитель.
  36. 36. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-26 для получения лекарственного препарата для лечения неврологического расстройства, выбранного из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, злокачественного новообразования, глазной болезни, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления центральной нервной системы (ЦНС).
  37. 37. Применение мультиспецифического антитела или фрагмента мультиспецифического антитела по любому из пп.27-29 для получения лекарственного препарата для лечения неврологического расстройства, выбранного из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, злокачественного новообразования, глазной болезни, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления центральной нервной системы (ЦНС).
  38. 38. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-26 для лечения неврологического расстройства, выбранного из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, злокачественного новообразования, глазной болезни, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления центральной нервной системы (ЦНС).
  39. 39. Применение мультиспецифического антитела или фрагмента мультиспецифического антитела по любому из пп.27-29 для получения лекарственного препарата для лечения неврологического расстройства, выбранного из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, злокачественного новообразования, глазной болезни, эпилептического расстройства, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания, ишемии, расстройства поведения и воспаления центральной нервной системы (ЦНС).
  40. 40. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-26 для переноса одного или нескольких соединений через гематоэнцефалический барьер (BBB).
  41. 41. Применение мультиспецифического антитела или фрагмента мультиспецифического антитела по любому из пп.27-29 для переноса одного или нескольких соединений через гематоэнцефалический барьер (BBB).
  42. 42. Способ переноса соединения через гематоэнцефалический барьер (BBB) индивида, включаю-
    - 63 038367 щий введение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.26-29, связанного с соединением.
  43. 43. Способ повышения воздействия соединения на ЦНС индивида, включающий введение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.26-29, связанного с соединением, где антитело или фрагмент антитела усиливает действие соединения на ЦНС.
  44. 44. Способ повышения удерживания соединения в ЦНС, включающий введение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.26-29 индивиду и, таким образом, повышение удержания соединения в ЦНС индивида.
  45. 45. Способ лечения неврологического расстройства, выбранного из группы, состоящей из невропатического расстройства, нейродегенеративного заболевания, эпилептического расстройства, расстройства поведения, воспаления и злокачественного новообразования ЦНС, глазной болезни, лизосомной болезни накопления, амилоидоза, вирусного или микробного заболевания или ишемии, связанной с неврологическими симптомами, у млекопитающего, включающий введение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.26-29 млекопитающему.
  46. 46. Способ по п.45, в котором неврологическим расстройством страдает человек, и величина дозы и/или частота введения индивиду изменяют для уменьшения концентрации антитела или фрагмента антитела, которое влияет на эритроциты индивида.
  47. 47. Способ по п.46, дополнительно включающий стадию мониторинга уменьшения количества эритроцитов у индивида.
  48. 48. Способ по п.46 или 47, в котором антитело или фрагмент антитела, связанные с соединением, вводят в терапевтической дозе, где терапевтическая доза является TfR-насыщающей.
  49. 49. Способ по любому из пп.46-48, в котором введение антитела или фрагмента антитела осуществляется в дозе и с частотой введения, калибруемыми для максимального уменьшения острых клинических симптомов, возникающих при введении антитела или фрагмента антитела.
EA201592213A 2013-05-20 2014-05-20 АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА (TfR) И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ EA038367B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361825477P 2013-05-20 2013-05-20
PCT/US2014/038847 WO2014189973A2 (en) 2013-05-20 2014-05-20 Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201592213A1 EA201592213A1 (ru) 2016-04-29
EA038367B1 true EA038367B1 (ru) 2021-08-16

Family

ID=50983167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201592213A EA038367B1 (ru) 2013-05-20 2014-05-20 АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА (TfR) И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Country Status (25)

Country Link
US (3) US9708406B2 (ru)
EP (3) EP3594240B1 (ru)
JP (1) JP6612214B2 (ru)
KR (1) KR102293064B1 (ru)
CN (1) CN105358578B (ru)
AR (1) AR096364A1 (ru)
AU (3) AU2014268726B2 (ru)
CA (1) CA2908743C (ru)
CL (1) CL2015003406A1 (ru)
CR (1) CR20150618A (ru)
EA (1) EA038367B1 (ru)
ES (1) ES2970063T3 (ru)
HK (1) HK1215584A1 (ru)
HR (1) HRP20240107T1 (ru)
HU (1) HUE065593T2 (ru)
IL (2) IL242088B2 (ru)
MA (1) MA38632B1 (ru)
MX (1) MX2015015970A (ru)
PE (2) PE20151926A1 (ru)
PH (2) PH12021550015A1 (ru)
PL (1) PL3594240T3 (ru)
SG (2) SG11201509566RA (ru)
TW (1) TWI573805B (ru)
UA (1) UA119235C2 (ru)
WO (1) WO2014189973A2 (ru)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2881966C (en) 2012-08-24 2020-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
CN111057147B (zh) 2014-01-06 2023-11-10 豪夫迈·罗氏有限公司 单价血脑屏障穿梭模块
WO2016077840A2 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Ossianix, Inc. TfR SELECTIVE BINDING COMPOUNDS AND RELATED METHODS
CN107001473B (zh) * 2014-11-19 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-运铁蛋白受体抗体及使用方法
JP6993228B2 (ja) 2014-11-19 2022-03-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体／抗ｂａｃｅ１多重特異性抗体および使用方法
TWI726879B (zh) * 2015-05-04 2021-05-11 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 抗ｃｄ７１抗體類、可活化之抗ｃｄ７１抗體類及使用彼等之方法
CN107847568B (zh) * 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
EP3315515A4 (en) 2015-06-24 2019-06-05 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. HYBRID PROTEIN CONTAINING A BDNF
ES2908009T3 (es) 2015-06-24 2022-04-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad adaptada
CN114409783A (zh) 2015-06-24 2022-04-29 Jcr制药股份有限公司 通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体
AR106189A1 (es) * 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
CN116514976A (zh) 2016-03-04 2023-08-01 Jn生物科学有限责任公司 针对tigit的抗体
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
CN109996544A (zh) 2016-06-27 2019-07-09 加利福尼亚大学董事会 癌症治疗组合
EP3494216A1 (en) 2016-08-06 2019-06-12 Ossianix, Inc. In vivo methods for selecting peptides that cross the blood brain barrier, related compositions and methods of use
WO2018071913A2 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modular tetrameric bispecific antibody platform
WO2018111976A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Pd-l1 binding fibronectin type iii domains
AU2017378226A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Janssen Biotech, Inc. CD8A-binding fibronectin type III domains
US10611823B2 (en) 2016-12-14 2020-04-07 Hanssen Biotech, Inc CD137 binding fibronectin type III domains
MY187741A (en) 2016-12-26 2021-10-18 Japan Chem Res Novel anti-human transferrin receptor antibody capable of penetrating blood-brain barrier
TWI791006B (zh) 2016-12-26 2023-02-01 日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司 包含bdnf之融合蛋白質
CA3049424A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Avidity Biosciences Llc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
SG11201907419PA (en) * 2017-02-17 2019-09-27 Denali Therapeutics Inc Transferrin receptor transgenic models
US10143187B2 (en) 2017-02-17 2018-12-04 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
US10457717B2 (en) 2017-02-17 2019-10-29 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
AU2018221731C1 (en) 2017-02-17 2021-11-18 Denali Therapeutics Inc. Engineered transferrin receptor binding polypeptides
BR112019018541A2 (pt) 2017-03-09 2020-04-14 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos cd147, anticorpos cd147 ativáveis e métodos de produção e uso dos mesmos
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
IL271193B2 (en) 2017-06-07 2025-01-01 Regeneron Pharma Preparations and methods for internalizing enzymes
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
CN119019564A (zh) 2017-08-01 2024-11-26 Ab工作室有限公司 双特异性抗体及其用途
WO2019023809A1 (en) 2017-08-02 2019-02-07 Stressmarq Biosciences Inc. ANTIBODIES BINDING TO ACTIVE ALPHA-SYNUCLEINE
RS64584B1 (sr) * 2017-08-10 2023-10-31 Denali Therapeutics Inc Konstruisani polipeptidi koji se vezuju za transferinski receptor
WO2019070577A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Denali Therapeutics Inc. FUSION PROTEINS COMPRISING SUBSTITUTE ENZYM THERAPY ENZYMES
TWI816715B (zh) 2017-11-17 2023-10-01 美商默沙東有限責任公司 對免疫球蛋白樣轉錄本3(ilt3)具特異性之抗體及其用途
CN118638788A (zh) 2017-12-06 2024-09-13 艾维迪提生物科学公司 治疗肌萎缩和强直性肌营养不良的组合物和方法
SG11202006420TA (en) * 2018-01-10 2020-08-28 Denali Therapeutics Inc Transferrin receptor-binding polypeptides and uses thereof
KR20200116952A (ko) * 2018-02-05 2020-10-13 제이씨알 파마 가부시키가이샤 약제를 근육에 송달하기 위한 방법
SG11202007363TA (en) * 2018-02-07 2020-08-28 Regeneron Pharma Methods and compositions for therapeutic protein delivery
WO2019222663A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
EP3810186B1 (en) 2018-06-21 2022-09-28 Novo Nordisk A/S Novel compounds for treatment of obesity
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
EP3830259A4 (en) 2018-08-02 2022-05-04 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETED COMPLEXES AND THEIR USES IN THE TREATMENT OF FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
EP3829645A4 (en) * 2018-08-02 2022-05-18 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETED COMPLEXES AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF FIBRODYSPLASIA OSSIFICANS PROGRESSIVA
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
MA53616A (fr) * 2018-08-16 2022-05-04 Denali Therapeutics Inc Protéines bispécifiques modifiées
CN109336973B (zh) * 2018-10-11 2021-08-24 中国科学院昆明动物研究所 抗转铁蛋白抗体及其用途
KR102692543B1 (ko) 2018-10-26 2024-08-07 재단법인 목암생명과학연구소 Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
KR102630499B1 (ko) * 2018-12-21 2024-01-30 어비디티 바이오사이언시스 인크. 항트랜스페린 수용체 항체 및 이의 용도
CA3125316A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to tfr
CN114650844A (zh) 2019-09-23 2022-06-21 西托姆克斯治疗公司 抗cd47抗体、可活化抗cd47抗体及其使用方法
EP4045061A4 (en) * 2019-10-14 2024-04-17 ARO Biotherapeutics Company FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS BINDING TO CD137
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
WO2021092482A1 (en) * 2019-11-06 2021-05-14 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for transferrin receptor 1 targeting
BR112022012230A2 (pt) 2019-12-23 2022-08-30 Denali Therapeutics Inc Variantes de progranulina
EP4085251B1 (en) 2020-01-02 2024-07-31 F. Hoffmann-La Roche AG Method for determining the amount of a therapeutic antibody in the brain
WO2021142260A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for modulation of acvr1
MX2022011499A (es) 2020-03-19 2022-10-07 Avidity Biosciences Inc Composiciones y metodos para tratar la distrofia muscular facioescapulohumeral.
US11446387B2 (en) * 2020-03-27 2022-09-20 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating muscle dystrophy
KR20220164773A (ko) * 2020-04-08 2022-12-13 앨리어다 테라퓨틱스, 인코포레이티드 혈액-뇌 장벽 전달용 조성물 및 방법
CA3176246A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Arcus Biosciences, Inc. Antibodies to tigit
BR112023021325A2 (pt) 2021-04-14 2023-12-19 Aro Biotherapeutics Company Domínios de fibronectina tipo iii de ligação a cd71
EP4323008A1 (en) 2021-04-14 2024-02-21 ARO Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
AR125406A1 (es) * 2021-04-23 2023-07-12 Univ Pennsylvania Nuevas composiciones con motivos selectivos para el cerebro y composiciones que las contienen
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
AU2022309028A1 (en) 2021-07-09 2024-01-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023287238A1 (ko) * 2021-07-15 2023-01-19 한양대학교 산학협력단 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
WO2023034409A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Biogen Ma Inc. Anti-transferrin receptor antibodies and uses thereof
KR20240055874A (ko) 2021-09-16 2024-04-29 어비디티 바이오사이언시스 인크. 안면견갑상완 근이영양증을 치료하는 조성물 및 방법
AU2023254846A1 (en) 2022-04-15 2024-10-10 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2024026494A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to transferrin receptor 1
IL317261A (en) 2022-07-29 2025-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a modified transferrin receptor locus
WO2024026471A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Alector Llc Cd98hc antigen-binding domains and uses therefor
AU2023314807A1 (en) 2022-07-29 2025-03-06 Alector Llc Transferrin receptor antigen-binding domains and uses therefor
AU2023321962A1 (en) 2022-08-12 2025-02-20 Epibiologics, Inc. Degradation of egfr using a bispecific binding agent
WO2024155066A1 (ko) * 2023-01-16 2024-07-25 주식회사 시그널바이오 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
WO2024200267A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Bioarctic Ab Bispecific antibody binding to the protease-like domain of the human transferrin receptor htfr1
TW202444759A (zh) * 2023-03-24 2024-11-16 美商戴納立製藥公司 Ａβ靶向蛋白及使用方法
WO2025024334A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
WO2025021790A2 (en) 2023-07-24 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012075037A1 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2013177062A2 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20559A (en) 1858-06-15 Reducing wheel-tires
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JPS633262A (ja) * 1986-06-24 1988-01-08 Toshiba Corp 網状赤血球の分析方法及び装置
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
AU675057B2 (en) 1989-09-07 1997-01-23 Alkermes, Inc. Process for the preparation of transferrin receptor specificantibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0652775B1 (en) 1992-07-27 2000-04-19 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2369292C (en) 1999-04-09 2010-09-21 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of modulating the activity of functional immune molecules
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
US20030180714A1 (en) 1999-12-15 2003-09-25 Genentech, Inc. Shotgun scanning
EP1242438B1 (en) 1999-12-29 2006-11-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
SK288711B6 (sk) 2000-02-24 2019-11-05 Univ Washington Humanizovaná protilátka, jej fragment a ich použitie, polynukleová kyselina, expresný vektor, bunka a farmaceutický prostriedok
EP2857516B1 (en) 2000-04-11 2017-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
MXPA03002974A (es) 2000-10-06 2004-05-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas que producen composiciones de anticuerpo.
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2005503789A (ja) 2001-08-17 2005-02-10 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗Ａβ抗体
US20040241164A1 (en) 2001-08-17 2004-12-02 Bales Kelly Renee Use of antibodies having high affinity for soluble ab to treat conditions and diseases related to ass
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
AU2003236022A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells with modified genome
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
US20060130158A1 (en) * 2002-08-30 2006-06-15 Turner Andrew J Modified transferrin fusion proteins comprising duplicate transferrin amino or carboxy terminal domains
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
AU2003279216A1 (en) 2002-10-09 2004-05-04 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20050142141A1 (en) 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
RU2326127C2 (ru) 2002-12-16 2008-06-10 Джинентех, Инк. Варианты иммуноглобулинов и их применение
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2520853A1 (en) 2003-03-28 2005-03-31 Centocor, Inc. Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
TWI374893B (en) 2003-05-30 2012-10-21 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US8597911B2 (en) * 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
ES2550311T3 (es) 2003-11-05 2015-11-06 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
BR122018071968B8 (pt) 2003-11-06 2021-07-27 Seattle Genetics Inc conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
KR101245983B1 (ko) 2004-03-31 2013-06-28 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｔｇｆ-베타 항체
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
ATE537189T1 (de) 2004-04-30 2011-12-15 Inst Nat Sante Rech Med Anti-tfr-antikörper
CA2569692C (en) * 2004-06-07 2015-07-21 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
AU2005290250A1 (en) 2004-07-30 2006-04-06 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
EP1799260A4 (en) 2004-09-29 2011-09-28 Centocor Inc ANTI-AMYLOID ANTIBODIES, COMPOSITIONS, TECHNIQUES AND USES
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP1838348B1 (en) 2004-12-15 2013-06-26 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
ES2396555T3 (es) 2004-12-15 2013-02-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide
EP1838349A1 (en) 2004-12-15 2007-10-03 Neuralab, Ltd. Amyloid beta antibodies for use in improving cognition
ES2259270B1 (es) 2005-03-09 2007-11-01 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal.
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007068412A2 (en) 2005-12-12 2007-06-21 Ac Immune Sa A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US7892544B2 (en) 2006-07-14 2011-02-22 Ac Immune Sa Humanized anti-beta-amyloid antibody
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101245107B (zh) * 2007-02-14 2010-10-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 抗人转铁蛋白受体人源抗体及其应用
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CN101802007B (zh) 2007-06-12 2017-08-25 Ac免疫有限公司 抗β淀粉样蛋白单克隆抗体
AU2008267038B2 (en) 2007-06-12 2014-08-07 Ac Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
US9370531B2 (en) 2007-08-31 2016-06-21 New York University Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
EP2691417B2 (en) 2011-03-29 2024-10-30 Roche Glycart AG Antibody fc variants
CN107001473B (zh) * 2014-11-19 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-运铁蛋白受体抗体及使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012075037A1 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2013177062A2 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIEN-LY NGA; YU Y JOY; BUMBACA DANIELA; ELSTROTT JUSTIN; BOSWELL C ANDREW; ZHANG YIN; LUK WILMAN; LU YANMEI; DENNIS MARK S; WEIMER: "Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 211, no. 2, 10 February 2014 (2014-02-10), US, pages 233 - 244, XP009179491, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.20131660 *
Biocompare: "anti-Transferrin Receptor (p90, CD71) (TFRC) antibody (APC) ABIN238474 from antibodies-online", Biocompare.com, 1 August 2014 (2014-08-01), XP055133157, Retrieved from the Internet: URL:http://www.biocompare.com/9776-Antibodies/4144935-anti-Transferrin-Receptor-p90-CD71-TFRC-antibody-APC/ [retrieved on 2014-08-04], the whole document *
COUCH JESSICA A; YU Y JOY; ZHANG YIN; TARRANT JACQUELINE M; FUJI REINA N; MEILANDT WILLIAM J; SOLANOY HILDA; TONG RAYMOND K; HOYTE: "Addressing safety liabilities of TfR bispecific antibodies that cross the blood-brain barrier.", SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE (A A A S), US, vol. 5, no. 183, 1 May 2013 (2013-05-01), US, pages 183ra57 , 53 - 64, XP008163922, ISSN: 1946-6242, DOI: 10.1126/scitranslmed.3005338 *
DANIELS, T.R. ; DELGADO, T. ; RODRIGUEZ, J.A. ; HELGUERA, G. ; PENICHET, M.L.: "The transferrin receptor part I: Biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer", CLINICAL IMMUNOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 121, no. 2, 1 November 2006 (2006-11-01), AMSTERDAM, NL, pages 144 - 158, XP024941315, ISSN: 1521-6616, DOI: 10.1016/j.clim.2006.06.010 *
HOREJSI V; ANGELISOVA P; BAZIL V; KRISTOFOVA H; STOYANOV S; STEFANOVA I; HAUSNER P; VOSECKY M; HILGERT I: "MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN LEUKOCYTE ANTIGENS II. ANTIBODIES AGAINST CD45 T200 CD3 T3 CD43 CD10 CALLA TRANSFERRIN RECEPTOR T9 A NOVEL BROADLY EXPRESSED 18-KDA ANTIGEN MEM-43 AND A NOVEL ANTIGEN OF RESTRICTED EXPRESSION MEM-74", FOLIA BIOLOGICA (PRAHA)., AKADEMIE VED CESKE REPUBLIKY * USTAV MOLEKULARNI GENETIKY, CZ, vol. 34, no. 1, 1 January 1988 (1988-01-01), CZ, pages 23 - 34, XP009179511, ISSN: 0015-5500 *
LSbio: "CD71/Transferrin Receptor Mouse anti-Human Monoclonal (APC) (MEM-75) Antibody-LS-C46200-LSBio", 1 August 2014 (2014-08-01), XP055133366, Retrieved from the Internet: URL:http://www.1sbio.com/Documents/PDF/Antibodies/46016 [retrieved on 2014-08-05], the whole document *
PAUL STEVEN M: "Therapeutic antibodies for brain disorders", SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE (A A A S), US, vol. 3, no. 84, 25 May 2011 (2011-05-25), US, pages 84ps20, XP009155720, ISSN: 1946-6242, DOI: 10.1126/scitranslmed.3002620 *
POLÁKOVÁ K; KARPATOVÁ M: "Characterization of a new monoclonal antibody (TR-19) against human transferrin receptor and its application in topographic study.", NEOPLASMA., VYDAVATEL'STVO SLOVENSKEJ AKADEMIE VIED VEDA, SK, vol. 38, no. 1, 1 January 1991 (1991-01-01), SK, pages 21 - 31, XP009179512, ISSN: 0028-2685 *
RUDIKOFF S, ET AL.: "Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 79, 1 March 1982 (1982-03-01), US, pages 1979 - 1983, XP007901436, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.79.6.1979 *
TAETLE R, CASTAGNOLA J, MENDELSOHN J: "MECHANISMS OF GROWTH INHIBITION BY ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR MONOCLONAL ANTIBODIES", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, vol. 46, no. 04, PART 01, 1 April 1986 (1986-04-01), pages 1758 - 1763, XP008061610, ISSN: 0008-5472 *
TRACY R. DANIELS, EZEQUIEL BERNABEU, JOS� A. RODR�GUEZ, SHABNUM PATEL, MAGGIE KOZMAN, DIEGO A. CHIAPPETTA, EGGEHARD HOLLER, JULIA : "The transferrin receptor and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - GENERAL SUBJECTS, ELSEVIER, vol. 1820, no. 3, 1 March 2012 (2012-03-01), pages 291 - 317, XP055133141, ISSN: 03044165, DOI: 10.1016/j.bbagen.2011.07.016 *
WHITE S; TAETLE R; SELIGMAN P A; RUTHERFORD M; TROWBRIDGE I S: "COMBINATIONS OF ANTI-TRANSFERRIN RECEPTOR MONOCLONAL ANTIBODIES INHIBIT HUMAN TUMOR CELL GROWTH IN-VITRO AND IN-VIVO EVIDENCE FOR SYNERGISTIC ANTIPROLIFERATIVE EFFECTS", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, vol. 50, no. 19, 1 January 1990 (1990-01-01), pages 6295 - 6301, XP008073808, ISSN: 0008-5472 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022201773A1 (en) 2022-04-07
EP4324480A2 (en) 2024-02-21
CN105358578B (zh) 2021-08-06
HK1215584A1 (zh) 2016-09-02
AU2014268726A1 (en) 2015-11-19
KR20160011198A (ko) 2016-01-29
PH12015502565B1 (en) 2016-02-29
UA119235C2 (uk) 2019-05-27
US20210087288A1 (en) 2021-03-25
US20150110791A1 (en) 2015-04-23
EA201592213A1 (ru) 2016-04-29
US20180002433A1 (en) 2018-01-04
CL2015003406A1 (es) 2016-07-15
TWI573805B (zh) 2017-03-11
AR096364A1 (es) 2015-12-23
BR112015029009A2 (pt) 2017-09-19
PL3594240T3 (pl) 2024-04-02
CA2908743A1 (en) 2014-11-27
JP2016526878A (ja) 2016-09-08
PH12015502565A1 (en) 2016-02-29
AU2014268726B2 (en) 2019-10-31
KR102293064B1 (ko) 2021-08-23
IL242088B1 (en) 2023-08-01
MA38632A1 (fr) 2018-09-28
EP4324480A3 (en) 2024-05-08
PH12021550015A1 (en) 2022-05-11
MA38632B1 (fr) 2019-10-31
EP3594240C0 (en) 2023-12-06
CA2908743C (en) 2024-06-25
US9708406B2 (en) 2017-07-18
IL304243A (en) 2023-09-01
EP2999716A2 (en) 2016-03-30
EP3594240A1 (en) 2020-01-15
AU2020200355A1 (en) 2020-02-06
HRP20240107T1 (hr) 2024-04-12
PE20151926A1 (es) 2016-01-07
IL242088A (ru) 2015-12-31
EP3594240B1 (en) 2023-12-06
CN105358578A (zh) 2016-02-24
US10808036B2 (en) 2020-10-20
SG10202003997UA (en) 2020-06-29
TW201500373A (zh) 2015-01-01
SG11201509566RA (en) 2015-12-30
PE20210649A1 (es) 2021-03-26
IL242088B2 (en) 2023-12-01
HUE065593T2 (hu) 2024-06-28
WO2014189973A3 (en) 2015-03-05
JP6612214B2 (ja) 2019-11-27
MX2015015970A (es) 2016-09-08
ES2970063T3 (es) 2024-05-24
CR20150618A (es) 2016-02-08
WO2014189973A2 (en) 2014-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11098129B2 (en) Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
US10808036B2 (en) Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
AU2022204500B2 (en) Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
EP3221361B1 (en) Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
US20180000964A1 (en) Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
US20220033520A1 (en) Modified antibody fcs and methods of use
BR112015029009B1 (pt) Anticorpos, formulação farmacêutica e usos de um anticorpo