EA026017B1

EA026017B1 - Фармацевтические композиции тенектеплазы

Info

Publication number: EA026017B1
Application number: EA201300746A
Authority: EA
Inventors: Махешвари Кумар Мишра; Санджай Сингх; Притиранджан Бхандари
Original assignee: Геннова Байофармасьютикалз Лтд.
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2017-02-28
Also published as: MY171723A; PL2654770T3; NZ611706A; BR112013015914A2; JP2014502608A; AU2011346515B2; JP6375112B2; MX2013007381A; BR112013015914B1; US9943575B2; DK2654770T3; EA201300746A1; MX356199B; CN103391785A; EP2654770A1; AU2011346515A1; PT2654770T; US20130323227A1; ES2687850T3; LT2654770T

Abstract

Изобретение раскрывает внутривенную болюсную инъекцию для лечения острого ишемического инсульта у пациентов-людей, включающую безопасное и эффективное количество тенектеплазы, неорганический фармацевтически приемлемый буфер, фармацевтически приемлемые стабилизирующие агенты и фармацевтически приемлемый носитель, где эффективная и безопасная доза тенектеплазы при введении составляет около 0,2 мг/кг массы тела.

Description

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям производного человеческого тканевого активатора плазминогена, известного как тенектеплаза (ТЫК) для лечения блокады мозговых артерий, которая вызывает инсульты основного и минорного типов, такие как острый ишемический инсульт (ΑΙδ). Изобретение также относится к составам, обладающим оптимальной эффективностью и безопасностью по сравнению с известными терапевтическими агентами, идентифицированным в клинических испытаниях указанных композиций, содержащих конкретные количества ΤΝΚ в качестве активного ингредиента.

Предшествующий уровень техники

Тканевой активатор плазминогена (ТРА) вовлечен в разрушение неспецифических тромбов в системе кровообращения. ΤΝΚ представляет собой производное ТРА, в котором семь аминокислот нативной последовательности модифицированы так, что новая молекула обладает измененной специфичностью по отношению к белку фибрину и измененными фармакокинетическими свойствами, приводящими к измененным фармакодинамическим эффектам. ΤΝΚ представляет собой 527-аминокислотный гликопротеин молекулярной массы 70 кДа. Тенектеплаза была одобрена для применения в медицинских продуктах для лечения острого инфаркта миокарда и некоторых других связанных с тромбозом и эмболией разрывов кровеносных сосудов в различных органах. Недавно она была предложена для лечения острого ишемического инсульта, и для этой цели было проведено несколько клинических исследований, но эти исследования не дали никакого заключения по поводу безопасной и эффективной дозы ΤΝΚ при ΑΙδ.

Активаторы плазминогена - это ферменты, которые активируют плазминоген с получением сериновой протеазы плазмина, которая в свою очередь разрушает фибрин. Среди активаторов плазминогена, используемых в качестве лекарственных средств, представлены: а) стрептокиназа [бактериальный белок], Ь) урокиназа, [фермент, синтезируемый в почках] и с) человеческий тканевой активатор плазминогена [фермент, вырабатываемый сосудистым эндотелием]. Также в разработке находятся другие ферменты, которые являются потенциальными кандидатами в качестве фибринолитических лекарственных средств. Механизмы действия этих активаторов отличаются: стрептокиназа образует комплекс с плазминогеном, генерируя активность плазмина, урокиназа непосредственно расщепляет плазминоген, а ТРА образует третичный комплекс с фибрином и плазминогеном, приводя к активации плазминогена и к растворению тромбов ίη δίΐιι. Природный человеческий ТРА имеет период полужизни в плазме, как правило, 8-10 мин. Однако целесообразно увеличение периода полужизни так, чтобы фибринолитическая терапия могла вводиться эффективно в короткий период времени с получением результатов с большей лечебной эффективностью. Таким образом, было создано несколько аминокислотных и делеционных мутантов белка и их тестировали на улучшение характеристик ТРА. ΤΝΚ имеет шесть мутаций, которые удваивают период полужизни [до 20-24 мин] по сравнению с ТРА и обладает улучшенными характеристиками, такими как более высокая специфичность к фибриновым сгусткам одновременно меньшая аффинность к ингибитору активатора плазминогена-1.

ΤΝΚ впервые была описана в υδ 5385732, где она была получена с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием специально созданной клеточной линии млекопитающего. Некоторые другие патенты охватывают различные аспекты получения и применения ΤΝΚ, а именно υδ 5728567, υδ 5714145, υδ 5366886, υδ 5094953, υδ 5407819 и υδ 6506598. В υδ 5407819 описан способ получения варианта ТРА путем замены конкретной аминокислоты в аминокислотной последовательности. В υδ 5612029 описан вариант ТРА, который гликозилирован в любых положениях на участке 103-105 и лишен функциональной углеводной структуры в положении 117 последовательности человеческого ТРА дикого типа. В υδ 5520911 описано получение ДНК-последовательностей, кодирующих ТРА-вариант. В υδ 5424198 описан способ выработки ТРА трансформированными клетками, содержащими мутантный ген ΌΗΡΚ или ген ΌΗΡΚ дикого типа в комбинации с генами ТРА. Эти и некоторые другие документы также охватывают различные заболевания или показания, при которых ΤΝΚ может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с образованием тромбов. Одним из патологических состояний, охваченных υδ 20080107641, является ΑΙδ. Однако в данной заявке нет описания какого-либо способа идентификации безопасной и эффективной дозы ΤΝΚ для лечения ΑΙδ у пациентовлюдей. Вместо этого, в ней прогнозируется применение безопасной дозы на основе теоретических моделей существующих матриц данных, не предлагая при этом никакого конкретного способа тестирования и количественной оценки идентифицированных эффективных доз. Таким образом, текущий уровень техники не учитывает неудовлетворенную потребность в идентификации безопасных и эффективных доз ΤΝΚ при лечении ΑΙδ и эффективных фармацевтических композиций (составов) для лечения ΑΙδ. Настоящее изобретение учитывает вышеупомянутую потребность и предлагает улучшенные и более эффективные составы ΤΝΚ для лечения ΑΙδ у пациентов-людей, причем предлагаются составы, которые являются безопасными, а также легкими для введения в течение короткого периода времени.

Существуют некоторые исследования, в которых упоминается применение ΤΝΚ при лечении ΑΙδ, однако в них нет описания какого-либо состава с ΤΝΚ, содержащего количества ΤΝΚ, которые безопасны и эффективны по побочным эффектам, как раскрыто в данном документе. Кроме того, ΤΝΚ, используемый для приготовления составов, получают с использованием новой технологии системы непрерыв- 1 026017 ной ферментации на основе перфузии, которую ранее не использовали для получения белка ΤΝΚ.

Известны различные составы для лечения ΑΙδ, в которых используется ΤΝΚ. Однако до сих пор ни один из них не был одобрен каким-либо из органов, регулирующих лекарственные средства, как безопасный и эффективный при рассмотрении анализа риск-выгода. Учитывая этот пробел, в данном документе раскрыты некоторые составы ΤΝΚ, которые обладают целевыми свойствами, удовлетворяющими требованиям безопасности и эффективности лекарственного средства для лечения ΆΙδ. Некоторые аспекты способа, используемого в настоящем описании для получения ΤΝΚ высокой степени чистоты, известны в области, к которой принадлежит изобретение. Однако в данном документе используется несколько новых, не известных в данной области, элементов для получения, приготовления, отбора, тестирования и особенно клинической оценки составов ΤΝΚ для лечения ΑΙδ.

Цели изобретения

Основной целью изобретения является идентификация эффективного и безопасного количества ΤΝΚ при лечении ΑΙδ у пациентов-людей. Другой целью изобретения является разработка составов ΤΝΚ, которые безопасны и эффективны при лечении ΑΙδ у объектов-людей. Еще одной целью изобретения является проведение клинических испытаний для идентификации количества ΤΝΚ, которое безопасно и эффективно при лечении ΑΙδ. Следующей целью изобретения является применение технологии ферментации на основе перфузии для рекомбинантного получения ΤΝΚ, используемого для достижения вышеописанных целей.

Сущность изобретения

Получение ΤΝΚ осуществляли с помощью технологии рекомбинантной ДНК в клетках яичника китайского хомячка (СНО) в системе непрерывной ферментации на основе перфузии. Данный способ, кроме возможности масштабирования до промышленных применений, предусматривает крупномасштабное получение белка с более высоким качеством и в большем количестве. Рекомбинантную клеточную линию, продуцирующую ΤΝΚ в качестве секретируемого белка, получали и отбирали по целевым свойствам ΤΝΚ и использовали для составов ΤΝΚ для лечения ΑΙδ у пациентов-людей. Эти составы, содержащие различные количества ΤΝΚ, тестировали в клинических испытаниях для идентификации безопасного и эффективного количества ΤΝΚ, требуемого для оптимального лечения ΑΙδ у пациентов-людей. В изобретении раскрыты данные клинических испытаний, определяющие количество ΤΝΚ, которое является безопасным и эффективным при лечении ΑΙδ. ΤΝΚ получали с использованием системы непрерывной ферментации на основе перфузии. В первой части получали клеточные линии млекопитающих (СНО) с использованием методов молекулярной и клеточной биологии. Эти клеточные линии затем подвергали скринингу на предмет уровня экспрессии секретируемого ΤΝΚ и выделяли клеточную линию с высокоэкспрессирующимся ΤΝΚ для дальнейшей разработки процесса получения ΤΝΚ фармацевтической категории качества. Во второй части ΤΝΚ-продуцирующие клетки выращивали в системе непрерывной ферментации на основе перфузии для крупномасштабного получения ΤΝΚ, а собранную отработанную среду хранили для дальнейшей обработки. В третьей части собранное подвергали хроматографическим стадиям для получения большого количества в высокой степени чистой и эффективной ΤΝΚ в качестве активного ингредиента для дальнейшего получения составов для клинических применений. В четвертой части получали ряд составов ΤΝΚ и исследовали их по различным параметрам, таким как стабильность, эффективность и другие фармакологические свойства, в биоанализах. В пятой части полученные составы ΤΝΚ исследовали в клинических испытаниях для идентификации безопасного и эффективного количества ΤΝΚ, требуемого для лечения ΑΙδ у объектов, подвергнутых лечению, при определенных условиях. В этих исследованиях идентифицировали ряд параметров, требуемых для безопасного и эффективного использования ΤΝΚ, в форме инъецируемых составов при лечении ΑΙδ.

Подробное описание

Специалисту в области медицины и фармакологии известно, что для целей получения безопасных и эффективных фармацевтических композиций существует хорошая стратегия разработки нескольких составов количества активного ингредиента с различными вспомогательными веществами и тестирования их в целевых условиях так, чтобы можно было идентифицировать безопасную и эффективную дозу нового лекарственного средства для конкретных показаний. Роль вспомогательных веществ является важной, поскольку они обеспечивают дополнительные свойства типа стабильности, легкости доставки, объема и т.д. Основной целью данного изобретения является разработка улучшенного препарата ΤΝΚ для применения в качестве фармацевтических композиций для лечения острого ишемического инсульта у пациентов-людей, при этом являющегося безопасным и эффективным по сравнению с известными составами. Другая цель данного изобретения относится к применению клинических тестов с использованием определенных количеств ΤΝΚ для определения безопасного и эффективного количества ΤΝΚ при лечении ΑΙδ. Кроме того, нет понимания множества аспектов технологии рекомбинантной ДНК, процесса разработки и получения, которые влияют на продуктивность и свойства конечных продуктов. Таким образом, существует потребность в новых способах получения продуктов технологии рДНК, которые улучшены по сравнению с существующими методами и технологиями. Целью данного изобретения является разработка безопасных и эффективных фармацевтических композиций/составов для лечения острого ишемического инсульта у человека, где ΤΝΚ продуцируется из клеточной линии СНО, разработан- 2 026017 ной бе ηονο, и используется в системе непрерывной ферментации на основе перфузии для крупномасштабного получения ΤΝΚ.

В первой части получали клеточную линию СНО, экспрессирующую на более высоком уровне ΤΝΚ в качестве секретируемого белка. Использованные методы молекулярной биологии, биохимии и аналитические методы являются стандартными и обычно применяемыми в данной области. Плазмида, экспрессирующая в клетках млекопитающих, используемая для создания экспрессирующей клеточной линии, содержала элемент СМУ промотора/энхансера перед искусственным геном ΤΝΚ, после которого следовала последовательность поли-А §У40 для терминации транскрипции. Эта же плазмида также содержала ген ΌΗΡΚ под контролем промотора 8У40, заканчивающийся §У40 поли-А хвостом. Данную плазмиду трансфецировали в клетки СНО, отрицательные по нативному гену ΌΗΡΚ (клеточная линия СНО-ЭНРК-). Выделяли одну клеточную линию с самым высоким уровнем экспрессии ΤΝΚ и использовали далее [пример 1 и 2].

Во второй части ΤΝΚ-экспрессирующие клетки СНО использовали для крупномасштабного получения ΤΝΚ в системе непрерывной ферментации на основе перфузии. Около 6-12х10⁹ клеток иммобилизовали в активной зоне перфузионного биореактора. Этим клеткам давали расти в среде ΙΜΌΜ, содержащей ΕΒδ, в течение около нескольких дней, до тех пор пока не будет получена требуемая клеточная масса при постоянной концентрации глюкозы около 1-2 г/л хемостатическим способом. Во время фазы получения среду меняли на СНО-δ-δΡΜ II без ΕΒδ и ферментацию продолжали в течение нескольких месяцев в условиях подпитки глюкозой, по мере того как получали определенную концентрацию необработанного продукта ΤΝΚ в собранной среде для дальнейшей обработки. Собранную среду отбирали в стерильные контейнеры и хранили при 4°С до следующего использования в последующих стадиях очистки [примеры 3, 5 и 7].

В третьей части собранную среду, содержащую необработанную ΤΝΚ, подвергали ряду последовательных хроматографических стадий. Это включало стадию захвата на сродство к красителю с последующей стадией очистки с использованием колонки, аффинной к лизину, и конечную стадию доочистки с использованием ионообменной хроматографии. В табл. А изображены различные стадии хроматографической очистки, приводящие к увеличению в несколько раз количества очищенного белка, которое определяли с помощью ДСН-ПААГ денсиометрии/НР§ЕС. Перед тем как собранный бульон подвергли процессу очистки, количество ΤΝΚ в нем составляло около 80% белка. В конце последней стадии ионообменной хроматографии (1ЕС) чистота белка составляла по меньшей мере 95%. Типы смол, используемых для стадий аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, используемых в методе, описанном в данном документе, могут быть заменены на другие смолы с подобными свойствами. Методы очистки, описанные в данном документе, представляют собой иллюстративные примеры стратегии очистки, используемой для получения ΤΝΚ для лечения ΑΙδ, и они не ограничиваются использованием определенных типов описанных хроматографических смол, поскольку с равной эффективностью могут использоваться другие подобные методы разделения. Нерасфасованную массу ΤΝΚ хранили в концентрации около 5 мг/мл при -80°С [примеры 4, 5 и 7].

Таблица А

Повышение чистоты ΤΝΚ

Хроматографическая стадия	Количество ΤΝΚ, в мл	Чистоты ΤΝΚ, в %
Собрано	10 мкг	-80
ПАС-1	0,5 мг	-90
ЬАС-2	2 мг	-92
1ЕС-3	5 мг	>95

В четвертой части были получены различные составы раствора, содержащего ΤΝΚ, в интервале от 0,1 до 0,24 мг/мл на 10-мл флакон в лиофилизированной форме. В одном типе составов соотношение компонентов составило 1 ч. ΤΝΚ, 11 ч. Ь-аргинина, 3,4 ч. фосфорной кислоты и 0,086 ч. полисорбата-20 в качестве лиофилизированнонного порошка. Эти составы подвергали обычным тестам и использовали в клинической оценке ΤΝΚ для лечения ΑΙδ [пример 6].

В пятой части клиническое тестирование и эффективность составов ΤΝΚ в лечении ΑΙδ оценивали в многоцентровом открытом исследовании, включающем в себя около 35 объектов, подвергаемых лечению. На основе данных, полученных в данном исследовании, получали безопасное и эффективное количество ΤΝΚ, требуемое для лечения ΑΙδ [пример 8].

Изобретение, подробно описанное выше, иллюстрируется с помощью следующих примеров с целью демонстрации применимости изобретения. Воплощения, приведенные ниже, никоим образом не ограничивают изобретение от более широких применений для получения композиций/составов белков, подобных ΤΝΚ. Описание данного изобретения также может использоваться в получении белков, которые являются аналогами ТРА. Фигуры носят иллюстративный характер и не ограничивают более широкого применения изобретения в том, что касается качества и чистоты получаемого и включаемого в состав композиции белка.

- 3 026017

Список чертежей

Фиг. 1 - грамм ΤΝΚ в очищенных фракциях, окрашенный серебром в восстанавливающем ДСНПААГ: 1) маркер молекулярной массы (снизу 21, 31, 45, 66 и 96 кДа); 2) собранный бульон; 3) Э-1 после ЭЛС; 4) Э-2 после ЬАС; 5) Э-3 после 1ЕС и 6) стандартный образец.

Фиг. 2 - грамм ΤΝΚ в очищенных фракциях, окрашенный серебром в невосстанавливающем ДСНПААГ: 1) маркер молекулярной массы (снизу 21, 31, 45, 66 и 96 кДа); 2) собранный бульон; 4) Э-1 после ЭЛС; 5) Э-2 после ЬАС; 3) Э-3 после 1ЕС и 6) стандартный образец.

Фиг. 3 - иллюстративный график НР8ЕС невосстановленного ΤΝΚ после финальной хроматографической стадии: ΤΝΚ-пептид (время удерживания: 26,653 мин) более чем 99% чистоты.

Фиг. 4 - иллюстративный график НР8ЕС восстановленного ΤΝΚ после финальной хроматографической стадии: ΤΝΚ-пептид одноцепочечный (время удерживания: 25,093 мин) и ΤΝΚ-пептид двухцепочечный (время удерживания: 29,247 мин) более чем 99% чистоты.

Фиг. 5 - иллюстративная стандартная кривая для измерения биоактивности ΤΝΚ.

Примеры

Пример 1. Методы молекулярной биологии, биохимии и аналитические методы.

Основные используемые методы молекулярной биологии, биохимии и аналитические методы известны в области, к которой принадлежит изобретение. Могут предусматриваться стандартные методы, и они не описаны, если имеются в общедоступной литературе. Штаммы, используемые в качестве бактериальных клеток-хозяев, выделены из Е. сой Κ-12, а плазмиды и ДНК-элементы, используемые для получения экспрессирующих векторов, взяты из общедоступных плазмид или сконструированы и синтезированы на месте и интегрированы для создания требуемых элементов. Пептидная последовательность, используемая для получения искусственного гена ΤΝΚ, представляет собой нативную человеческую последовательность ТРА, содержащую аминокислотные замены, такие как

ТЬгЮЗАзп, Азп117С1п, Еуз296А1а,

Н13297А1а, А§е298А1а и А§е299А1а

ГМРАМККОЬССУЬЬЬСаАУРУ5Р80Е1НАКГКК0АК.5У0У1СКРЕКТ0М1У00Н05АУЬ

1ДУЕК8№ЕУЕУС1УД5ОКА(2СН5УР^,УКЗС5ЕРК.СРМОСгТС(2С)АЕУР8РРУСфСРЕОРА(3

КССЕГОТЮАТСУЕОрС13УКОТ\У8ТАЕ8САЕС™\УМ88АЕА<ЗКРУ5<ЖКРОА1КЕОЕСН

НДУСККРМШЗКР1УСУУРКАОКУЗЗЕГС5ТРАСЗЕСЖЗРСУРОКаЗАУКОТНЗЬТЕ86А

3ΟΕΡ\νΝΚΜΓΕΙΟ?4νΥΤΑΓ9ΝΡ3Α0ΑΕαΤΌΚΤΤΝΥ€ΚΝΡη6ΡΑΚΡλνθΗνΕΚΝΚΡΕΤ\νΕΥΟ ^VΡЗСЗΤСС^Κ^Υ8^Ρ^ΡΚIΚΟΟ^ΡΑ^IΑЗΗΡ\У^ΑΑIΡΑΚΗΚΚ8ΡΟΕΚΡ^СσСI^I85С»I

ΕΒΑΑΗσΡΟΕΚΡΡΡΗΗΕΤνίΕΟΚΤΥΚλνΡΟΕΕΕρΚΡΕνΕΚΥΐνΗΚΕΡΡϋΟΤΥΡΝΡΙΑΕΕφΕ

К5О55КСАрЕ58УУКТУСЕРРАОЕ<ЗЕРО\УТЕСЕЕ8ОУОКНЕЛЕ8РРУ8ЕКЕКЬЛНУКЕУ

Ρ33ΚεΤ5φΗΕΕΝΚΤνΤΟΝΜΕ0ΑΟΡΤΕ.3ΟΟΡ9ΑΝΕΗΡΑεφ0Ο3Ο0ΡΕνεΕΝϋ0ΚΜΤΕν

0ΙΙ31¥0Ε0ε09ΚΡνΡ0νΥΤΚνΤΝΥΕΟ\νΐΚΡΝΜΚΡ].

Все последующие синтетические ДНК-элементы основаны на этой последовательности и интегрированы в клонирующие и экспрессирующие в клетках млекопитающих векторы с использованием стандартных методов. Для подтверждения идентичности и целостности этих элементов осуществляли секвенирование ДНК, при этом последовательности проверяли вручную.

Пример 2. Получение клеточной линии клеток млекопитающего для экспрессии ΤΝΚ.

Искусственную ДНК-последовательность ΤΝΚ человеческого гена ТРА, содержащую шесть вышеописанных мутаций, синтезировали искусственно. Данную последовательность клонировали в плазмидный вектор, содержащий элементы для эффективной сверхэкспрессии белка в клетках яичника китайского хомячка (СНО) в виде белка, секретирующегося в среду. В векторе за элементом СМУ энхансера/промотора следовал искусственный ген ΤΝΚ, за которым следовал элемент терминации транскрипции §У40 полиА. Эта же плазмида также экспрессировала в виде отдельного цистрона ген ΌΗΡΚ под контролем раннего промотора 8У40 и терминатора 8У40 полиА. Ген ΌΗΡΚ также использовали в качестве маркера экспрессии в рекомбинантных клетках СНО для детекции ΤΝΚ-положительных клеток. Вектор трансфецировали в клеточную линию СНО, отрицательную по дигидрофолат-редуктазе (ΌΗΡΚ) (ϋϋΚχΒΠ) и выделяли геномно-интегрированные стабильные клоны с устойчивой экспрессией секретирующегося ΤΝΚ. Уровень экспрессии ΤΝΚ в различных отобранных клонах тестировали с использованием вестерн-блоттинга и ДСН-ПААГ с последующими методами количественной ОТ-ПЦР для создания клеточных линий со стабильной и устойчивой экспрессией белка. Одну клеточную линию с хорошей продуктивностью ΤΝΚ использовали для создания основного клеточного банка, из которого получали рабочий клеточный банк и использовали в процессах, предшествующих крупномасштабной перфузионной ферментации. ΤΝΚ, секретированный каждым клоном, тестировали на предмет целостности и качества белка; кроме того осуществляли тесты для определения ферментных активностей, ассоциированных с данным белком, в соответствии со стандартами фармакопеи для медицинских применений.

Пример 3. Сверхэкспрессия ΤΝΚ в клетках СНО.

- 4 026017

Аминокислотная последовательность ΤΝΚ экспрессировалась под контролем конститутивной экспрессирующей системы СМУ промотора/энхансера в клетках СНО. Здесь применили новую технологию непрерывной ферментации, называемую перфузионным биореактором, для крупномасштабного получения белка. ΤΝΚ-продуцирующие клетки СНО растили в среде ΙΜΌΜ [ΙΝνίΤΚΟΟΕΝ] в присутствии фетальной бычьей сыворотки (ЕВ§). Из культуры около 1х10⁶ рекомбинантных клеток получали конечное количество клеток около 6-12х10⁹ с использованием последовательной амплификации клеток в культуральных флаконах и в роллерах в течение периода времени, составляющего несколько дней. Условия культивирования, поддерживаемые на протяжении всех стадий в процессе наработки клеточной массы, были следующими: температура 36,5°С, СО₂ 5% и РВ§ 10%. Конфлюентность клеток поддерживали на уровне >90% площади поверхности роста во флаконах и колбах на протяжении всех стадий перед сбором клеток для следующей стадии. Периодически осуществляли микроскопию и биохимические тесты для детекции нормального состояния и целостности растущих клеток. Затем их удаляли с помощью мягкой обработки трипсином для переноса в биореактор, который оснащен зондами рН и ΌΟ, и средой для поддержания клеток в активной зоне реактора, где удерживаются клетки.

Стерилизованный 5-Ь реактор затем инокулировали клетками 6-12х10⁹ и давали им расти в течение 3-4 дней в присутствии глюкозы с концентрацией около 1-2 г/л. Данный процесс приводит к установлению нормального состояния клеток в реакторе. Параметры реактора были следующие: температура 36,6°С, аэрация 1,0 л/мин, рН в интервале 7,2-7,4 [поддерживали в присутствии СО₂ и насыщенного раствора бикарбоната натрия], вращение 100 об/мин, растворенный кислород 30%. После помещения клеток на подложку среду меняли со среды ΙΜΌΜ, содержащей ЕВ§, на СИО-δ-δΡΜ II [ΙΝνίΤΚΟΟΕΝ] без РВ§. Данную среду использовали на протяжении стадии получения продукта. В начале фазы биореактора собирали и удаляли около 100 л исходной среды. Температуру реактора поддерживали на уровне 33,5°С во время фазы получения продукта и около 100 л среды, содержащей клетки, собирали каждый день, поддерживая при этом уровень глюкозы в реакторе в интервале 0,3-1,5 г/л. В этих условиях перфузионный реактор может произвести до 10000 л среды, содержащей клетки, в течение 3-4 месяцев. Партии собранного бульона фильтровали через фильтры 0,45 мм, собирали в стерильные контейнеры и хранили при 28°С до следующего использования. Пулы собранного бульона периодически тестировали на предмет содержания ΤΝΚ и стерильности известными способами [фиг. 1 и 2].

Пример 4. Очистка ΤΝΚ.

Пулы собранного бульона тестировали на предмет содержания ΤΝΚ, его целостности и стерильности [фиг. 1 и 2]. В одной 1000-л партии для очистки проводили серии хроматографических стадий. В первой стадии партию около 1000 л собранного бульона с содержанием ΤΝΚ около 10 мг/л загружали на колонку (300x500 мм) быстрой жидкостной хроматографической системы (РЬС), содержащей 11 л активированной аффинной смолы с красителем (смола В1ие Зерйатоке 6 ЕЕ; ΟΕ НеаКйсате). Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером-1 (УБ-1, фосфат натрия 20 мМ, ΝαΤΊ 0,15М, рН 7,2) путем пропускания 2 колоночных объемов (КО) со скоростью потока около 100-150 см/ч. Собранный бульон загружали на колонку с линейной скоростью потока около 100-150 см/ч, с последующим пропусканием УБ-1 2 КО со скоростью потока около 100 см/ч. За этим следовали 2-3 КО промывочного буфера (ПБ-1, фосфат натрия 20 мМ, ΝαΤΙ 2М, рН 7,2) со скоростью потока 100-150 см/ч. Связанный белок-мишень элюировали путем пропускания около 4 КО элюирующего буфера-1, (ЭБ-1, фосфат натрия 20 мМ, ΝαΤ1 1М, мочевина 3М, рН 7,2) и собирали на основе поглощения при 280 нм. Элюат (Э-1) анализировали на предмет количества белка и его чистоты с помощью электрофореза ДСН-ПААГ. На этой стадии содержание ΤΝΚ в суммарном белке составило около 90%. Во второй стадии буфер меняли с использованием гель-фильтрационной хроматографии. Э-1 загружали на колонку (300x750 мм), содержащую 25 л смолы для гель-фильтрации (Зерйабех 0-25). Колонку затем промывали с использованием 2 КО заменяющего буфера (фосфат натрия 20 мМ, рН 7.2) с линейной скоростью потока около 100-150 см/ч, и элюат (Э-2) собирали в стерильный контейнер. В третьей стадии Э-2 загружали на колонку (200x500 мм), содержащую 4.5 л активированной аффинной смолы, содержащей Ь-лизин (смола Букше НуретИ; Ра11 Согр.). Колонку затем уравновешивали уравновешивающим буфером-2 (УБ-2, фосфат натрия 20 мМ, полисорбат-20 0,043%, рН 7,2) путем пропускания 2 колоночных объемов (КО) со скоростью потока около 100150 см/ч, с последующим пропусканием 2 КО ПБ-2 (фосфат натрия 20 мМ, ИаС1 1Μ, полисорбат-20 0,043%, рН 7,2) со скоростью потока около 100 см/ч. Связанный белок-мишень элюировали путем пропускания 2 КО элюирующего буфера-2, (ЭБ-2, аргинин 0,5М, ЕАСА (эпсилон-аминокапроновая кислота) 0,2М, полисорбат-20 0,043%, рН 7,8, которое регулировали фосфорной кислотой) и собирали на основе поглощения при 280 нм. Элюат (Э-3) анализировали на предмет количества белка и чистоты с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза (фиг. 1 и 2). На этой стадии содержание ΤΝΚ в суммарном белке составило более чем 95%. За этим следовала замена буфера с помощью 0ЕС на буфер для хранения большого объема материала (Ь-аргинин 55 г/л, фосфорная кислота 17 г/л, полисорбат-20 430 мг/л, рН 7,6±0,2). Конечная концентрация ΤΝΚ в растворе составила около 2 мг/мл, раствор хранили в замороженном виде до момента следующего использования. Данный раствор ΤΝΚ затем концентрировали с использованием анионообменной смолы (смола СарЮ ф, 0Ε НеаИЪсате) до 5 мг/мл перед получением составов.

- 5 026017

Пример 5. Аналитические тесты.

В процессе получения и очистки внутреннее содержание ΤΝΚ в образцах определяли с помощью стандартных методов восстанавливающего и не восстанавливающего ДСН-ПААГ [фиг. 1 и 2]. Г отовили 10% гели ДСН-ПААГ и загружали в каждую лунку 50 мкг образца белка. Для определения содержания одноцепочечного и мономерного варианта в образцах использовали методы восстанавливающей и не восстанавливающей НРБЕС [высокоэффективная эксклюзионная хроматография] соответственно. Колонки, используемые для методов НР8ЕС, представляли собой колонки на основе силикагеля для эксклюзионной хроматографии для разделения молекул размером 10-500 кДа [фиг. 4 и 5]. Стандартные и тестируемые образцы прогоняли в идентичных условиях анализа. Проводили периодические внутренние анализы биоактивности для отслеживания качества и целостности белка.

Пример 6. Составы ΤΝΚ.

Готовили различные составы ΤΝΚ для тестирования безопасности и эффективности ΤΝΚ при лечении ΑΙδ. Составы были на основаны на соотношениях, таких как 1 ч. ΤΝΚ, 11 ч. Ь-аргинина, 3.4 ч. фосфорной кислоты и 0,086 ч. полисорбата-20 в качестве лиофилизированных продуктов. Концентрация раствора ΤΝΚ-материала, используемого для данного приготовления, составляла 5 мг/мл ΤΝΚ. После смешивания компонентов без осаждения ΤΝΚ в растворе составы лиофилизировали с получением стабильных порошкообразных форм. Готовили ряд лифилизированных составов с количеством ΤΝΚ в интервале от 0,10, 0,14, 0,18, 0,20 и 0,24 ΤΝΚ на 1 мл на 10-мл флакон при восстановлении с помощью 10 мл воды для инъекции и хранили при температуре около 4°С до момента следующего использования. Тестируемые составы подвергли различным тестам стабильности, и было обнаружено, что составы сравнимы по содержанию и стабильности в течение одного года. Лиофилизированные составы при восстановлении 10 мл стерильной воды для инъекций давали вышеупомянутое количество ΤΝΚ на 1 мл в прозрачных растворах для тестирования в клинических испытаниях.

Пример 7. Биоанализ ΤΝΚ.

Биологическую эффективность суммарного и включенного в состав композиции ΤΝΚ определяли с помощью быстрого турбидиметрического анализа фибринолиза, взятого из протокола монографии Европейской фармакопеи для альтеплазы. В прозрачный 1,5-мл многолуночный планшет добавляли растворы 20 мкл человеческого плазминогена (1 мг/мл) и 1 мл человеческого фибриногена (2 мг/мл) смешивали и выдерживали при 0°С. В отдельном 1,5-мл многолуночном планшете готовили растворы 0,5 мл человеческого тромбина (33 МЕ/мл) и 0,5 мл тестируемого или эталонного ΤΝΚ (1 мг/мл суммарного белка), смешивали и переносили на 37°С. Все разведения проводили с помощью буферного раствора, как описано ранее, 200 мкл эталонной/тестируемой смеси добавляли к смеси плазминоген/фибриноген и инкубировали при 37°С. После видимого образования мутных сгустков в течение 30 с в пробирках образовывались пузырьки, поскольку протекал фибринолиз. Записывали моменты времени, когда в пробирку добавляли смеси тромбина и когда образовывался последний пузырек, получая, таким образом, время фибринолиза в секундах. Определяли время фибринолиза тестируемых и эталонных образцов ΤΝΚ и рассчитывали биоактивность тестируемого материала ΤΝΚ в международных единицах (МЕ) на 1 мл для партии, используемой в данном примере, согласно протоколу ЕР. На фиг. 5 представлена иллюстративная стандартная кривая для измерения биоактивности ΤΝΚ. Биоактивность партии, используемой в данном документе, составила 203 МЕ/мг. В табл. В и С изображены количества эталонных образцов и тестируемых образцов ΤΝΚ, полученных в анализе биоактивности, т.е. в анализе фибринолиза.

Таблица В

Биоанализ ΤΝΚ: эталонные образцы

δΤΟΝο.	Концентрация белка, (нг/мл) Эталон. 8Τϋ.	Время (сек.) до фибринолиза для 8ТВ [среднее 21
1	100	4078,29
2	200	2978,02
3	400	2139,05
4	800	1529,98
5	1600	1086,62

Таблица С

ΤΝΚ-биоанализ: тестируемые образцы

Тест Образец Νο.	Концентрация белка (нг/мл) тестируемого образца	Время (сек.) до фибринолиза для Образца [среднее 21	Рассчитанное количество ΤΝΚ в Образце (нг/мл) с использованием δΤϋ- кривой
1	100	3930,16	96,4
2	200	2970,70	199,5
3	400	2135,70	399,4
4	800	1538,90	804,7
5	1600	1091,50	1607,2

- 6 026017

Пример 8. Тестирование и эффективность составов ΤΝΚ.

Клинические испытания составов ΤΝΚ для ΆΙδ осуществляли с использованием известных методов, используемых в клинической медицине. В многоцентровом открытом клиническом испытании на эффективность и безопасность ΤΝΚ при лечении острого ишемического инсульта (ΑΙδ) у пациентов в течение 4,5 ч с момента приступа, использовали две дозы со случайным графиком введения ΤΝΚ - 0,1 мг/кг IV (внутривенная инъекция) болюсная инъекция и 0,2 мг/кг IV болюсная инъекция. ΤΝΚ инъецировали в виде болюсной IV инъекции после подтверждения отсутствия кровоизлияния в мозг с помощью КТ, проводимой в течение периода 5-10 с. Дозу 0,1 мг/кг IV получали 14 пациентов, а дозу 0,2 мг/кг IV получал 21 пациент. ΝΓΗ-δδ (Шкала инсультов Национального института здравоохранения) рассматривалась как основной параметр эффективности. В обеих группах было статистически значимое улучшение среднего значения бальной оценки ΝΓΗ-δδ в течение 24-часового интервала (табл. 1-3). Данное улучшение поддерживалось во время 7-дневной оценки. Улучшение бальной оценки ΝΣΗ-δδ >4 рассматривалось как клинически значимое улучшение (табл. 2). Группы, которым вводили 0,2 мг/кг, демонстрировали более высокую степень проявления эффективности по данному параметру в течение 24 ч (80,95%), которая увеличивалась до 95,24% на 7 день. Хотя нет статистически значимого различия между группами с двумя дозировками, эти данные предполагают, что доза 0,2 мг/кг является предпочтительной. При использовании более жесткого критерия улучшения бальной оценки ΝΣΗ-δδ >8 (табл. 3), группы, которым вводили 0,2 мг/кг, продемонстрировали статистически значимое увеличение степени проявления улучшения на 7 день (р=0,015), которое подтвердило, что доза 0,2 мг/кг является предпочтительной. Эффективность ΤΝΚ 0,2 мг/кг IV для №Η-δδ>4 наблюдали у 80,95% пациентов по сравнению с 49,51% в исследовании 1АСТ ΙδίΓοΚο 2006; 37(7):1810-5] с использованием альтеплазы 0,6 мг/кг IV (р=0,0087), и 46,52% в исследовании ΜΝΩδ [ΝΕ1Μ 1995; 333(24): 1581-87] с использованием альтеплазы 0,9 мг/кг IV (р=0,0043), и 65,5% в индийском исследовании [Αηη [ηΠίαη Асаб Νοιποί 2008; 11:221-4] с использованием альтеплазы 0,9 мг/кг IV (р=0,0172). Эти данные продемонстрировали, что доза 0,2 мг/кг IV ΤΝΚ обладала значимо более высокой эффективностью, чем альтеплаза. Что касается более жесткого критерия Ν1Ηδδ>8, то ΤΝΚ продемонстрировал эффективность у 28,57% объектов, что было численно выше, чем данные для ΤΝΚ 0,2 мг/кг (24%), полученные На1еу 2005 ΙδίΓοΚο 2005; 36: 607-612], и статистически не значимым по сравнению с данными На1еу 2010 ΙδίΓοΚο 2010; 41: 707-11] (35,5%) для дозы ΤΝΚ 0,25 мг/кг. В каждой группе отсутствовали симптоматические ЮН (кровоизлияния в мозг). Бессимптомные ЮН детектировали с помощью КТ через 48 ч у одного объекта в группе с дозой 0,1 мг/кг и у 2 объектов в группе 0,2 мг/кг. Всего сообщалось о 3 (8,57%) бессимптомных случаях ЮН. В исследовании На1еу 2010 сообщалось о случаях симптоматических и бессимптомных ЮН у 11,29% (=7/62) и у 20% (=10/50) в исследовании На1еу 2005 с использованием ΤΝΚ. В предыдущих исследованиях с использованием альтеплазы сообщалось о симптоматических ЮН у 7% объектов и о случаях бессимптомных ЮН у 31% объектов (ΝΕ1Μ 1995, 333, 24, 1581-7). Раскрытые новые данные продемонстрировали, что эффективность ΤΝΚ при лечении АК выше, чем известная эффективность альтеплазы.

Таблица 1

Улучшение среднего значения бальной оценки NIΗ-δδ

	Исследуемые группы	р-значение *
0,1 мг/кг N=14	0,2 мг/кг N=21
Исходная точка (среднее*станд. откл.)	10,07*3,89	12,95*5,08	0,081
24 ч после инъекции (Среднее±станд. откл.)	6,43*4,6	5,90*4,06	0,72
48 ч после инъекции (среднее ± станд. откл.)	5,57*4,48	4,24*3,57	0,31

День 7 после инъекции (Среднее±станд. откл.)	4 29*4,23	3,20*4,13	0,45
р-значение по сравнению с исходным	0,0009	<0,0001	ΝΑ

# - р-значение при сравнении между группами; применяли 1-критерии, @ - р-значение при сравнении исходного значения и значения в день 7 внутри группы; применяли 1-критерий,

Р <0,05 статистически значимое; ΝΑ - не применимо; Ν - количество пациентов.

- 7 026017

Таблица 2

ΝΙΗ-δδ улучшение > 4 пункта

ΝΙΗ83 улучшение > 4	Исследуемые группы	р-значение'
0,1 мг/кг	0,2 мг/кг
Через 24 ч	8 (57,14)	17 (80,95)	0,15
Через 48 ч	10(71,43)	20 (95,24)	0,133
на 7 день п(%)	11 (78,57)	20 (95,24)	0,279
р-значение	0,41	0,34	ΝΑ

# - р-значение при сравнении между группами, @ - р-значение при сравнении значений в момент 24 ч и день 7 внутри группы,

Р <0,05 статистически значимое; ΝΑ - не применимо; N - количество пациентов.

Точный тест Фишера применяли для пропорций, η - пропорция пациентов.

Таблица 3

ΝΙΗ-δδ улучшение > 8 пунктов

ΝΙΗ88 улучшение > 8	Исследуемые группы	р-значение*
0,1 мг/кг N=14	0,2 мг/кг N=21
через 24 ч п(%)		6(28,57)	0,202,
через 48 ч п(%)	2 (14,29)	9(42,86)	0,136
на 7 день	2 (14,29)	12(57,14)	0,015
р-значение	1	0,118	ΝΑ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Внутривенная болюсная инъекция для лечения острого ишемического инсульта у пациентовлюдей, включающая:

a) безопасное и эффективное количество тенектеплазы,

b) неорганический фармацевтически приемлемый буфер;

c) фармацевтически приемлемые стабилизирующие агенты и

ά) фармацевтически приемлемый носитель, где эффективная и безопасная доза тенектеплазы при введении составляет около 0,2 мг/кг массы тела.
2. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где используемый буфер предпочтительно представляет собой фосфорную кислоту/фосфат.
3. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где используемый стабилизирующий агент предпочтительно представляет собой Ь-аргинин.
4. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где другой используемый стабилизирующий агент предпочтительно представляет собой полисорбат.
5. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду.
6. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где компоненты лиофилизируют в виде порошка для восстановления водой для инъекций перед использованием.
7. Внутривенная болюсная инъекция по п.1, где общая доза вводится в течение 10 с в пределах 6 ч после приступа.
8. Фармацевтический набор реагентов для внутривенной болюсной инъекции по п.1, включающий:

(a) пробирку, содержащую лиофилизированную композицию тенектеплазы; и (b) инструкции по применению композиции для лечения острого ишемического инсульта у пациентов-людей при введении дозы тенектеплазы, которая составляет не более чем 0,20 мг/кг массы тела, в виде внутривенной болюсной инъекции в течение 10 с, где оптимальная болюсная доза тенектеплазы составляет около 0,2 мг/кг массы тела.
9. Набор реагентов по п.8, в котором количество тенектеплазы составляет около 2 мг/мл при вос- 8 026017 становлении водой для инъекций.
10. Набор реагентов по п.8, в котором общая доза вводится в виде внутривенной болюсной инъекции в пределах 6 ч после острого ишемического инсульта.