CN100580082C

CN100580082C - 一种重组葡激酶冻干制剂、制备方法和应用

Info

Publication number: CN100580082C
Application number: CN03119315A
Authority: CN
Inventors: 吴以岭
Original assignee: Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Beijing Yiling Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: CN1446912A

Abstract

本发明提供一种重组葡激酶冻干制剂、制备方法和应用，制剂中包括7、36、43位氨基酸上完成突变的葡激酶，制剂中还包括赋型剂甘露醇、缓冲剂磷酸盐、EDTA、渗透剂氯化钠其中一种或几种。重组葡激酶冻干制剂作为溶栓药物在临床上应用，可制成临床上溶栓的冻干粉末制剂形式、静脉及肌肉注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式。

Description

一种重组葡激酶冻干制剂、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组葡激酶冻干制剂、其制备方法和作为溶栓药物的应用，属于生物制药技术领域。

背景技术

心脑血管疾病是目前危害人民健康的第一杀手，其中急性心肌梗塞等血栓性疾病是造成病人死亡的主要病因。虽然目前临床上已有一些市售的溶栓药物，但在其溶栓效果、溶栓的特异性和药物价格等方面仍存在很多亟待解决的问题。葡激酶(Staphylokinase，简称SAK)是一种由金黄色葡萄球菌产生的蛋白质，分子量为15.5KD，它能与纤溶酶原特异性地结合，形成复合物，激活纤溶酶原使之变为纤溶酶，从而特异性地降解纤维蛋白，使血栓溶解。根据国外文献报道，葡激酶的溶栓效果优于链激酶和尿激酶等，至少与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)相当，且副作用更小，是一种最有发展前景的溶栓候选药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在7、36、43位氨基酸上完成突变的重组葡激酶，并与甘露醇等添加剂结合制备冻干制剂，作为溶栓药物在临床上应用。

本发明的技术方案是这样实现的：这种重组葡激酶冻干制剂，其特征在于制剂中包括如下重组葡激酶分离基因的核苷酸序列及编码的氨基酸序列：

TCA AGT TCA TTC GAC AAA GCA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly

CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TAT

Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr

GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA

Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala

TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACT

Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr

TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC

Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val

CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA

Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

TAA，

＊＊＊，

重组序列长度是411个碱基，重组序列特征为第19-21个碱基是密码子GCA、第106-108个碱基密码子GGA；第127-129碱基是密码子CGT，对应氨基酸是Ala，Gly和Arg。

所述的重组葡激酶冻干制剂中还包括赋型剂甘露醇、缓冲剂磷酸盐、EDTA、渗透剂氯化钠其中一种或几种。

所述的重组葡激酶冻干制剂的组成比例为：重组葡激酶10mg、甘露醇15mg、磷酸氢二钠3.4mg、磷酸二氢钠0.63mg、EDTA 1.0mg、氯化钠8.5mg。

本发明的重组葡激酶冻干制剂的制备方法包括

(1)、重组葡激酶工程菌的构建：

选择金黄色葡萄球菌株进行染色体DNA的分离，引物为：

F_SAK：5’GGAATTCATATGTCAAGTTCATTCGACAA 3’

R_SAK：5’CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAACAACC 3’

以上述染色体DNA为模板进行PCR扩增；使用pBV220为表达载体，大肠杆菌BL21株为宿主菌，利用限制性内切酶EcoRI和BamHIPCR反应扩增的葡激酶基因，同时以相同的酶消化表达载体pBV220，电泳回收，在T4DNA连接酶的作用下使载体与基因连接，转化E.coli BL21感受态细胞，挑取转化克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，震荡培养过夜，提取转化子的质粒DNA，利用EcoRI和BamHI酶切，将酶切产物反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出有葡激酶基因插入的重组质粒作为工程菌株；

(2)、发酵

将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，在30℃震荡培养过夜，作为一级种子液；以0.1-0.5％的浓度接种于含氨苄青霉素LB培养基中，30℃震荡培养过夜，作为发酵种子液；再以LB作为培养液，接种5-6％发酵种子液进行罐培养，搅拌转速300rpm，通气量0.8-1.0vvm，溶氧值一般由发酵起始逐渐降低，取OD₆₀₀至3-3.5之间启动升温诱导程序，待升温至42℃诱导开始后，分批添加葡萄糖以补充营养，通过调节搅拌速度，使DO值保持在40％以上，诱导5小时后收菌；将发酵菌在pH7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，于冰浴条件下，超声破碎；

(3)、纯化

将发酵菌在pH7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，于冰浴条件下，超声破碎；阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，将破碎后的上清液穿过阴离子交换层析柱，收集穿过峰；再将收集的蛋白液以0.1N稀磷酸调pH为6.20，至阳离子层析柱纯化，使重组葡激酶蛋白分子吸附于柱填料上，先用pH6.20缓冲液冲洗，去掉未结合的蛋白，然后，用含NaCl的磷酸盐EDTA pH6.20缓冲液洗脱，收集洗脱峰；再经S200凝胶过滤层析纯化，收集洗脱峰；

(4)、制剂

用含0.1mol/L氯化钠，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，2mmol/L的EDTA的溶剂将重组葡激酶稀释至8.0mg/ml，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入稳定剂及赋形剂为1.5％的甘露醇(重量百分比)，将重组葡激酶以10mg/瓶分装于处理过的西林瓶中，然后进行冷冻干燥。

所述的重组葡激酶的制备方法步骤(1)中所述的金黄色葡萄球菌株选择为1697株。

所述的重组葡激酶的制备方法步骤(1)中所述的PCR扩增反应条件为94℃ 40秒、54℃ 40秒、72℃ 2分钟，共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸5分钟。

所述的重组葡激酶的制备方法步骤(3)中所述的超声破碎细菌，采用间歇破碎并保持在冰浴中进行，每次30秒，间隔30秒。

本发明的重组葡激酶冻干制剂作为溶栓药物的应用，可制成临床上溶栓的冻干粉末制剂形式、静脉及肌肉注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式。

本发明的重组葡激酶冻干制剂临床试验结果分析：葡激酶的溶栓潜力已在患AMI及外周动脉梗塞的病人中进行了评价。在两项小型中试研究中，10个用血管造影术证实的冠状动脉梗塞的病人经静脉给予10mg重组葡激酶，即在30分钟先注射1mg药团，再输液给予9mg，同时与阿司匹林和肝素联合用，在八个病人中获得冠状动脉完全再通，一个人部分再通，再灌流

延迟约为20分钟。纤维蛋白原、血纤溶酶原及α₂-抗纤溶酶的血浆水平维持不变，证明葡激酶在体内具有高度的纤维蛋白特异性。另外，在13个透壁(transmural)心肌梗塞的病人中，进行了一项造影剂药团葡激酶，伴有阿司匹林以及静脉注射肝素的中试研究。第一位患者具有大面积前壁梗塞，采用双药团两次20mg葡激酶，间隔15分钟治疗，结果产生了非致死性中度致残的脑内出血。因此，其余12个患者在血管造影术监控下给予了相应药团注射。开始时20mg葡激酶在5分钟内注射完毕，在60分钟时间内行血管造影术监测溶栓进程，如梗塞相关动脉再通不全则追加10mg，结果7例(58％)在给药后60分钟时获得完全再通。其余5例，给予第二个剂量(10mg/5分钟)，结果其中三人在90分钟时完全回流，总回流率在90分钟时达83％。在这些临床试验的基础上，在102例患者中进行了双药团葡激酶15mg间隔30分钟给药(50例患者)，对前置(front loaded)rt-PA(52例患者)的比较研究。结果，用葡激酶治疗病人的68％以及rt-PA治疗病人的57％在给药后90分钟时获得了完全回流。葡激酶是纤维蛋白选择性的，且不引起变态反应，但是大多数病人两周后产生中和抗体。这些中试规模的临床研究表明，静脉内给予葡激酶在急性心梗病人是一种强力迅速并具高度纤维蛋白选择性的溶栓剂。与目前临床应用的相关溶栓药品相比，葡激酶具有以下优点：可避免全身性纤溶酶原的活化；不会引起全身性凝血系统失灵，降低出血综合征。

从葡激酶的结构和功能特性分析，由于它本身就是一种原核蛋白，不存在蛋白表达后的加工和修饰等问题，而且分子链内和链间没有二硫键存在，这使得利用基因工程技术大批量生产成为可能，从而可以大大降低生产成本。近年来，DNA重组等分子生物学技术发展迅速，利用基因工程进行生物制药目前已经是成熟和广泛应用的手段。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术内容：

(1)、重组葡激酶工程菌的构建：

本发明选择采用金黄葡萄球菌1697(取自中国科学院微生物所菌种保藏中心)进行染色体DNA的分离，取0.5ml金黄色葡萄球菌1697株的保存菌液接种于100ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜，7000rpm4℃离心8分钟收集菌体，用20ml TE洗菌体一次，20ml TE重悬菌体，加入120μl蛋白酶K混匀，加入2.2ml 10％的SDS混与，37℃温浴1小时，以等体积的酚抽提一次(颠倒混匀1分钟)，用0.1体积的3M NaAc(pH5.2)，等体积的异丙醇，沉淀2小时，12000rpm4℃离心10分钟，取沉淀，用75％的乙醇洗一次，溶于200μl双蒸水中，取2μl样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时取适量检测其OD₂₆₀和OD₂₈₀，测定其纯度和浓度。

葡激酶基因分离：根据引物的设计原则，设计了一对寡核苷酸引物，在引物的5′端引入了EcoRI酶切位点，在3′端引入了BamHI酶切位点，并调节了SD序列与起始密码子之间的距离及碱基组成，序列为：

F_SAK：5’GGAATTCATATGTCAAGTTCATTCGACAA 3’

R_SAK：5’CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAACAACC 3’

PCR扩增反应：以上述染色体DNA为模板，进行PCR扩增，反应过程为：94℃ 40秒，54℃ 40秒，72℃ 2分钟，共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸5分钟，取扩增产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳。

葡激酶基因的鉴定(DNA序列分析)：利用灭菌的双蒸水将PCR产物稀释一倍，再利用酚/氯仿抽提一次，酒精沉淀DNA，并溶于灭菌的双蒸水中，构建测序质粒，具体方法是：取适量的PCR产物和pBV220载体，分别以EcoRI和BamHI双酶切，电泳回收，两者按一定的比例混合，在T₄ DNA连接酶的作用下进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取转化子的质粒DNA，以EcoRI和BamHI双酶切分析，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示，重组克隆中有外源DNA插入，进一步提取其质粒DNA，利用pBV220测序引物和自动序列分析仪进行DNA序列测定。分离基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列如上所述。分析结果显示，本发明分离的基因序列除个别的点突变外，整个序列基本与文献报道的SAK相一致，但由于个别碱基的突变，从而导致了相应氨基酸的变异。

表达质粒的构建：本发明使用pBV220为表达载体，大肠杆菌BL21株为宿主菌，利用限制性内切酶EcoRI和BamHIPCR反应扩增的葡激酶基因，同时以相同的酶消化表达载体pBV220，电泳回收，在T4 DNA连接酶的作用下使载体与基因连接，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取转化克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，震荡培养过夜，提取转化子的质粒DNA，利用EcoRI和BamHI酶切，将酶切产物反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出有葡激酶基因插入的重组质粒作为工程菌株；

(2)、发酵生产

种子制备：将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，作为一级种子液；以0.1-0.5％的浓度接种于含氨苄青霉素LB培养基中，30℃震荡培养过夜，作为发酵种子液；发酵种子液的细胞应处于对数生长后期，细胞密度OD₆₀₀在2.5-3.0间，此时细胞密度较高，活力强。

发酵生产：以LB作为培养液，接种5-6％发酵种子液进行罐培养，搅拌转速300rpm，通气量0.8-1.0vvm，溶氧值一般由发酵起始的100％逐渐降低，取OD₆₀₀至3-3.5之间启动升温诱导程序，待升温至42℃诱导开始后，分批添加葡萄糖以补充营养，通过调节搅拌速度，使DO值保持在40％以上，诱导5小时后目的蛋白的表达量达到最高，因此一般在诱导5小时后收菌。发酵最终OD₆₀₀值一般为11.0-14.0之间，于4℃以下6000rpm离心15分钟收菌，将发酵菌体用以0.1mol/L NaCl，20mmol/L磷酸盐和EDTA缓冲液(pH7.8)洗涤菌体沉淀两次，称湿菌重量，-20℃冷冻备用；

(3)、纯化

超生破碎：将发酵菌在磷酸盐和EDTA缓冲液(20mM磷酸盐pH7.6，2mMEDTA)悬浮，置于冰浴中，利用超声破碎仪破碎细菌，破碎过程中，由于超声波的作用而产生大量的热量，因此采用间歇破碎的方法，并保持在冰浴中进行。每次30秒，间隔30秒，以防破碎液温度升高造成蛋白失活。以1g细菌加10ml缓冲液比例为宜。

阴离子交换层析纯化：阴离子交换层析柱(O Sepharose FF)用pH7.6 20mM的磷酸盐EDTA缓冲液平衡，利用离子交换负吸附的方法，将破碎后的上清穿过阴离子交换层析柱，使重组葡激酶蛋白穿过，收集穿过峰，而大部分菌体蛋白吸附于层析柱上。经过此步骤纯化后，去掉大部分杂蛋白，使重组葡激酶的纯度得到提高，从而达到初步纯化的作用。

阳离子交换层析纯化：将经过阴离子交换层析纯化收集的蛋白液以0.1N稀磷酸调pH为6.20，上样至阳离子层析柱(SP Sepharose FF)的纯化，使重组葡激酶蛋白分子吸附于柱填料上，先用20mM的磷酸盐EDTA pH6.20缓冲液冲洗，去掉未结合的蛋白，然后，用含0.2M的NaCl 20mM的磷酸盐EDTApH6.20缓冲液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测结果显示，0.2M NaCl洗脱液中的重组葡激酶蛋白的纯度进一步增加。

凝胶过滤层析：选择Amersham-Pharmacia Biotech公司生产的SephacrylS200为凝胶过滤介质。首先以缓冲液(20mM磷酸盐pH7.4，2mM EDTA，0.1MNaCl)洗脱两个柱体积，然后将阳离子柱0.2M NaCl的洗脱液上样，以1.2ml/分钟的流速进行洗脱，收集洗脱峰，将洗脱液进行SDS-PAGE检测，结果显示，洗脱液中重组葡激酶蛋白呈现单一条带，无杂蛋白带出现。

(4)、制剂

经层析柱纯化的重组葡激酶通过SDS-PAGE电泳后，用银染的方法对其纯度进行确定，然后用Lowry法测定蛋白浓度并计算总的蛋白含量。

根据药理学实验数据，重组葡激酶血液中药浓度约为0.9～1.7μg/ml，给药剂量也有一定的区间范围，一般在0.25～0.4mg/kg体重。从临床应用的角度来看，一般选择首先静脉快速给药10mg，然后根据病情的变化和进一步治疗的需要，再缓慢静脉滴注10mg或不再给药。因此本发明给出的一个实施例确定重组葡激酶的分装剂量为10mg/瓶。

每瓶制剂中的组成成份为：

重组葡激酶10mg

甘露醇15mg

磷酸氢二钠3.4mg

磷酸二氢钠0.63mg

EDTA 1.0mg

氯化钠8.5mg

制剂方法包括：

用含0.1mol/L氯化钠，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，2mmol/L的EDTA的溶剂将重组葡激酶稀释至8.0mg/ml，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，加入稳定剂及赋形剂为1.5％的甘露醇(重量百分比)。将重组葡激酶以10mg/瓶分装于处理过的西林瓶中，然后进行冷冻干燥。冻干后采用真空封口，加铝塑外盖，-20℃保存。

0.1mol/L氯化钠溶液和1.5％的甘露醇与人体血液渗透压相近，磷酸盐缓冲液接近人体血液的酸碱度，微量的EDTA为抑制在纯化过程中可能极微量残存的蛋白酶活性。

甘露醇用量的是依据制剂冻干后成型外观确定的，利用20％甘露醇注射液为辅料来源，分别在重组葡激酶原液中加入2％、4％、6％和10％的20％甘露醇注射液后冻干。冻干后制剂的溶栓活性无明显差别，但甘露醇含量低于总体积1.2％时，制剂成型较差，高于1.2％未见差异，所以选用1.5％甘露醇浓度。

人血白蛋白是成品冻干及贮存过程中主要的稳定剂，制剂研制中试用过多种不同浓度的人血白蛋白及不添加人血白蛋白，以冻干后溶栓活性和制剂成型外观为指标，初步试验观察结果认为，不添加及添加不同浓度的人血白蛋白，对制剂冻干后外观无影响，溶栓活性未见显著性差异。同时由于目前血液制品管理还存在一些问题，血液来源的生物制品在质量控制上仍存在风险性。所以综合以上考虑本发明放弃使用人血白蛋白，对于不含人血白蛋白的冻干制剂，观察了一年时间，其溶栓活性基本没有变化。

重组葡激酶序列表

<110>河北以岭医药研究院有限公司

<120>一种重组葡激酶冻干制剂和应用

<160>2

<210>1

<211>411

<212>DNA

<213>重组葡激酶(recombinant stephylokinase)

<220>

<221>mutation，Old_sequence

<222>(19)...(21)，(115)...(118)，(127)...(129)

<223>n＝A或C或T或G

<400>1

TCA AGT TCA TTC GAC AAA GCA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGT

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1 5 10 15

TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

20 25 30

GAT GGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT

Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro

35 40 45

ATT AAA CCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

50 55 60

GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65 70 75 80

TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

85 90 95

AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

100 105 110

GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

115 120 125

ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAA

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys ***

130 135

<210>2

<211>136

<212>PRT

<213>重组葡激酶(recombinant stephylokinase)

<220>

<221>CONFLICT，VARIANT，CHAIN，SITE

<222>(7，36，43)

<400>2

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

20 25 30

Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro

35 40 45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

50 55 60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65 70 75 80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

85 90 95

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

115 120 125

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys ***

130 135

Claims

1、一种重组葡激酶冻干制剂，其特征在于制剂中包括重组葡激酶10mg、赋型剂甘露醇15mg、缓冲剂磷酸氢二钠3.4mg、磷酸二氢钠0.63mgEDTA 1.0mg、渗透剂氯化钠8.5mg，其中重组葡激酶的氨基酸序列如下：

＊＊＊；编号第7位、第36位，43位氨基酸是Ala，Gly和Arg。

2、根据权利要求1所述的重组葡激酶冻干制剂，其特征在于所述氨基酸序列葡激酶的核苷酸序列如下：

TAA，

重组序列长度是411个碱基，重组序列特征为第19-21个碱基是密码子GCA、第106-108个碱基是密码子GGA；第127-129碱基是密码子CGT。

3、重组葡激酶冻干制剂的制备方法包括：

(1)、重组葡激酶工程菌的构建：

选择金黄色葡萄球菌株进行染色体DNA的分离，葡激酶基因分离引物为：

F_SAK：5’GGAATTCATATGTCAAGTTCATTCGACAA 3’

R_SAK：5’CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAACAACC 3’

以上述染色体DNA为模板进行PCR扩增；使用pBV220为表达载体，大肠杆菌BL21株为宿主菌，利用限制性内切酶EcoRI和BamHIPCR反应扩增的葡激酶基因，同时以相同的酶消化表达载体pBV220，电泳回收，在T4 DNA连接酶的作用下使载体与基因连接，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取转化克隆接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，震荡培养过夜，提取转化子的质粒DNA，利用EcoRI和BamHI酶切，将酶切产物反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出有葡激酶基因插入的重组质粒作为工程菌株；

(2)、发酵

将含有重组质粒的克隆菌株接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃震荡培养过夜，作为一级种子液；以0.1-0.5％的浓度接种于含氨苄青霉素LB培养基中，30℃震荡培养过夜，作为发酵种子液；再以LB作为培养液，接种5-6％发酵种子液进行罐培养，搅拌转速300rpm，通气量0.8-1.0vvm，溶氧值一般由发酵起始逐渐降低，取OD₆₀₀至3-3.5之间启动升温诱导程序，待升温至42℃诱导开始后，分批添加葡萄糖以补充营养，通过调节搅拌速度，使DO值保持在40％以上，诱导5小时后于4℃以下离心收菌，将发酵菌体用缓冲液洗涤沉淀，-20℃冷冻备用；

(3)、纯化

将发酵菌在pH7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，于冰浴条件下，超声破碎；阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，将破碎后的上清液穿过阴离子交换层析柱，收集穿过峰；再将收集的蛋白液以0.1N稀磷酸调pH为6.20，至阳离子层析柱纯化，使重组葡激酶蛋白分子吸附于柱填料上，先用pH6.20缓冲液冲洗，去掉未结合的蛋白，然后，用含NaCl的磷酸盐EDTApH6.20缓冲液洗脱，收集洗脱峰；再经S200凝胶过滤层析纯化，收集洗脱峰；

(4)、制剂

4、根据权利要求3所述的重组葡激酶的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的金黄色葡萄球菌株选择为1697株。

5、根据权利要求3所述的重组葡激酶冻干制剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的PCR扩增反应条件为94℃40秒、54℃40秒、72℃2分钟，共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸5分钟。

6、根据权利要求3所述的重组葡激酶冻干制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的超声破碎细菌，采用间歇破碎并保持在冰浴中进行，每次30秒，间隔30秒。

7、权利要求1所述的重组葡激酶冻干制剂在制备溶栓药物中的应用，其特征在于可制成临床上溶栓的冻干粉末制剂形式、静脉及肌肉注射溶液制剂形式。