KR100508043B1 - rDSPAα1의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
rDSPAα1은 상업적인 양으로 임상 표준에 적합한 순도로 생산된다. 생산 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 후에 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화도 크로마토그래피로 종결되는 일련의 크로마토그래피 단계를 이용한다.
Description
실시예 1
rDSPAα1의 세포 배양 생산
DSPA 워킹 세포 은행(Working Cell Bank)로부터의 바이알을 해동시키고, 성장 배지(WEC 5.0 배지, 윌리암스 이(Willams E) 개질 배지) 중 5% 송아지 혈청을 포함하는 롤러 병에 접종하였다. 2주에 걸쳐 세포는 4개의 롤러 병으로 확대되었고, 세포를 롤러 병으로부터 트립신 분해하여 성장 배지 1ℓ 당 각각 4×108개 세포로 4개의 1ℓ 스피너 플라스크에 접종하였다. 4일 후, 4개의 스피너로부터의 배양물을 사용하여 10ℓ 생물 반응기에 접종하였다. 접종일에 추가의 성장 배지 1ℓ 를 생물 반응기 배양물에 첨가하였다. 다음 날, 성장 배지를 사용하여 생물 반응기를 10ℓ로 채웠다. 본 프로토콜에 따라 마이크로캐리어 비드를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다. 배지의 pH는 7.0 내지 7.4로 조절하고, 살포 시스템에 의해 전기간 동안 산소 공급을 유지하였다. 온도는 34 내지 39℃로 유지하였다.
생물 반응기 내의 접종일의 세포 밀도는 1㎖ 당 8.1×105개 세포이고, 2일 후 세포 밀도는 2배로 되었고, 이때, 관류 속도를 0.5 배양액 용량/일(cv/일)로 설정하였다. 관류 속도는 세포 밀도에 비례하여 증가시켜, 생물 반응기 접종 9일 후에 밀도가 6.2×106개 세포/㎖에 도달하고, 관류가 2cv/일로 증가되도록 하였다.
이어서, 생물 반응기를 생산 배지 (WEC 5.0 배지 중 1% 송아지 혈청)로 교체하고, 2일 후 생산 수획물의 수집을 시작하여 10주간 지속하였다. 생산기 동안, 평균 세포 밀도는 약 75% 생존율을 갖는 1㎖ 당 15×106개 세포이었다. 평균 rDSPAα1 생산은 40㎎ rDSPAα1/ℓ이고, 평균 비생산율은 6pg rDSPAα1/세포/일이었다.
발효 용량의 확장은 한 반응기의 내용물 1/2을 새로운 용기에 옮겨담음으로써 이루어진다. 양 생물 반응기를 생산 배지에 놓고, 2 cv/일로 관류시키고, 생산 수획물 수집을 즉시 시작하였다.
실시예 2
rDSPAα1의 정제
1. 양이온 교환 크로마토그래피 (칼럼 A). 생물 반응기 수획물을 주변 온도 (15 내지 25℃)에서 저장하였다. 이어서, 0.45 미크론 필터를 통하여 여과한 후, 양이온 교환 칼럼에 로딩하였다. 제이.티. 베이커(J.T. Baker)가 제조한 CBX 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 단계(칼럼 A)로 수획물 정제를 시작하였다. 이 단계는 단백질의 상당한 정제를 용이하게 한다.
칼럼 A 완충액은 완충액 A1: 평형 완충액 (50mM NaOAc, pH 5.0), 완충액 A2: 세척 완충액 (50mM NaPO4, pH 7.5), 완충액 A3: 용출 완충액 (50mM NaPO4, 500 mM NaCl, pH 7.5), 완충액 A4: 스트립 완충액 (2M NaAc, pH 8.0) 및 완충액 A5: 저장 완충액 (45% EtOH, 10% HOAc)으로 이루어진다.
하기 칼럼 조작 파라미터는 6㎏의 수지가 충전되고, 15ℓ의 칼럼 용량을 갖는 칼럼에 적절하다. 4.5g 이하의 rDSPAα1을 1회 실행마다 칼럼에 로딩할 수 있다. 칼럼을 2ℓ/분 이하의 유속 및 20 psi 이하의 칼럼 압력으로 로딩시켰다. 칼럼과 모니터 설명서를 각각의 실행 전에 점검하였다. 로딩 물질 및 크로마토그래피 완충액을 사용하기 전에 헬륨을 스파징시켜(sparging) 탈기시켰다.
생물 반응기 수획물을 1.2㎜ 필터로 여과시킨 다음, 빙초산을 사용하여 pH 5.00 (±0.10)으로 적정하였다. 로딩시키기 전에, 용출액의 pH가 5.00(±0.20)이 될 때까지 칼럼을 30ℓ 이상의 완충액 A1로 평형화시켰다. 일단 칼럼이 평형화된 후, 수획물을 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 80ℓ 이상의 완충액 A1으로 재평형화시켰다. 용출액이 pH 5.00(±0.20)으로 되고 안정한 UV 기저선에 도달할 때 적절하게 칼럼을 재평형화시켰다. 칼럼을 145ℓ 이상의 완충액 A2로 세척하였다. 용출액의 pH가 7.50(±0.20)로 되고, 안정한 UV 기저선에 도달할 때 적절하게 칼럼을 세척하였다.
생성물을 30ℓ 이상의 완충액 A3로 칼럼으로부터 용출시켜, 별도의 용기에 수집하였다. 안정한 UV 기저선에 도달할 때 용출이 완결된 것으로 간주된다. 생성물을 용출시킨 후, 안정한 UV 기저선이 달성될 때까지 30ℓ 이상의 완충액 A4를 사용하여 칼럼을 스트리핑시켰다. 이어서, 칼럼을 재사용 (50회 이하로 사용)하기 위해 청정화시켰다. 칼럼 A 생성물(또는 용출물)을 2 내지 8℃에서 저장하였다. 평균 수율은 93%였고, 용출물의 평균 (단백질) 순도는 81%였다.
2. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (칼럼 B). CBX 수지 상에서 크로마토그래피시킨 후, rDSPAα1 생성물을 C4 소수성 상호작용 수지(토소-하스(Toso-Haas)) (칼럼 B)를 사용하여 크로마토그래피시켰다. 이 단계는 비 단백질성 오염물질의 상당한 제거를 쉽게 하고, 또한 가능한 바이러스 오염물질의 불활성화/제거를 돕는다. 칼럼 B 완충액은 완충액 B1: 평형 완충액 (50mM NaOAc, 500 mM NaCl, pH 4.0), 완충액 B2: 세척 및 저장 완충액 (20mM HCl), 완충액 B3: 세척 완충액 (20mM HCl, 19% EtOH), 완충액 B4: 세척 완충액 (20mM HCl, 20.5% EtOH), 완충액 B5: 용출 완충액 (20mM HCl, 29.5% EtOH) 및 완충액 B6: 스트립 완충액 (0.1N NaOH)으로 이루어진다. 하기 칼럼 조작 파라미터는 15ℓ의 칼럼 용량에 적절하다. 9g 이하의 rDSPAα1을 1회 실행마다 칼럼에 로딩할 수 있다. 칼럼을 2ℓ/분 이하의 유속 및 15psi 이하의 칼럼 압력으로 로딩시켰다. 칼럼과 모니터 설명서를 각각의 실행 전에 점검하였다.
로딩시키기 전에, 칼럼을 용출물의 pH가 4.00(±0.20)이 될 때까지 평형화시켰다. 칼럼 A 용출물을 빙초산으로 pH 4.00(±0.10)으로 적정하고, 탈기시키고 로딩하였다. 이 칼럼을 용출액이 pH 4.00(±0.20)으로 되고 안정한 UV 기저선에 도달할 때까지 30ℓ 이상의 완충액 B1으로 재평형화시켰다. 칼럼을 3가지 완충액으로 세척하였다. 첫 번째 세척에는 45ℓ 이상의 완충액 B2를 사용하였다. 용출액의 pH가 1.90(±0.20)이 되고, 안정한 UV 기저선에 도달할 때 적절하게 칼럼을 세척하였다. 두 번째로, 칼럼을 안정한 UV 기저선에 도달할 때까지 145ℓ 이상의 완충액 B3로 세척하였다. 세 번째로, 칼럼을 30ℓ 이상의 완충액 B4로 세척하고, 안정한 UV 기저선에 도달할 때 완결시켰다.
30ℓ 이상의 완충액 B5를 사용하여 rDSPA α1을 칼럼으로부터 용출시켜 별도의 용기에 수집하였다. 안정한 UV 기저선에 도달할 때까지 계속 용출시켰다. 이어서, 칼럼을 재사용(50회 이하로 사용)하기 위해 청정화시켰다. 추가 처리에 앞서 칼럼 B 생성물(또는 용출물)을 2 내지 8℃에서 최대 15일 동안 저장하였다. 평균 회수율은 91%였고, 용출물의 평균 (단백질) 순도는 97%였다.
3. 친화도 크로마토그래피 (칼럼 C). 칼럼 B 생성물을 이어서 세파크릴(Sephacryl) S-400 (Pharmacia) (칼럼 C)를 사용하여 크로마토그래피시켰다. 이 단계는 완충액 교환을 촉진시켜 제제화를 보조하고, 또한 바이러스 오염물의 불활성화/제거를 돕는다. 칼럼 C 완충액은 완충액 C1: 평형 완충액 (20mM HCl, 19% EtOH), 완충액 C2: 세척 완충액 (20mM HCl), 완충액 C3: 용출 및 저장 완충액 (200mM 글리신, 멸균 여과됨) 및 완충액 C4: 스트립 완충액 (0.1N NaOH)로 이루어진다. 하기 칼럼 조작 파라미터는 10ℓ의 칼럼 용량에 적절하다. 20g 이하의 rDSPA α1을 1회 실행마다 칼럼에 로딩할 수 있다. 칼럼을 0.5ℓ/분 이하의 유속 및 15 psi 이하의 칼럼 압력으로 로딩하였다. 하나 이상의 칼럼 B로부터의 용출액을 모은 다음, 1부의 완충액 C2 및 2부의 완충액 5로 용출액을 희석시켰다. 최종 에탄올 농도는 약 19%일 것이다.
로딩하기 전에, 칼럼을 용출액의 pH가 1.80(±0.20)이 될 때까지 15ℓ 이상의 완충액 C1을 사용하여 평형화시켰다. 로딩한 후, 칼럼을 30ℓ 이상의 완충액 C2를 사용하여 세척하였다. UV 신호가 안정하게 될 때 칼럼을 적절히 세척하였다. 생성물을 20ℓ 이상의 완충액 C2로 칼럼으로부터 용출시켜, 별도의 용기에 수집하였다. 안정한 UV 기저선에 도달할 때까지 계속 용출시켰다.
생성물을 용출시킨 후, 칼럼을 12ℓ 이상의 완충액 C4를 사용하여 스트리핑시키고 보관하여, 20회를 초과하지 않도록 재사용하였다. 칼럼 C 생성물(또는 용출물)을 완충액 C3로 1㎎/㎖ 미만의 농도로 희석시키고, 추가 처리를 위해 2 내지 8℃에서 저장하였다. rDSPA α1 의 평균 수율은 97%였고, 용출물의 평균 (단백질) 순도는 98%였다.
상기 정제 단계가 완결된 후, 70일이 넘지 않도록 저장시킨 S-400 친화도 칼럼 용출액에 대해 농축 및 제제화 단계를 수행하였다. 칼럼 C 용출액을 모으고, 저분자량 물질을 제거(30,000 달톤 컷-오프(cut-off))하는 나선형으로 감긴(spiral- wound) 한외 여과막에 의해 농축시켰다. 생성물을 발열 물질이 없는 용기에 8㎎/㎖ 이상의 농도로 수집하였다. 만니톨을 첨가하여 최종 농도를 4%로 하였다.
최종 제제화 완충액(200mM 글리신, 4% 만니톨(w/v))을 첨가하여, 벌크 제제화된 생성물의 농도를 7.5㎎/㎖으로 만들었다. 이어서, 벌크 제제화된 조성물을 멸균 여과하고, 바이알로 분배하여 냉동 건조시켰다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 데스몬두스 로툰두스(Desmondus rotundus) 타액 플라스미노겐 활성화제 α1(rDSPAα1)의 단리 및 정제 방법, 상기 방법에 의해 정제된 rDSPAα1, 이와 같이 정제된 rDSPAα1을 함유하는 제약 조성물 및 상기 정제된 rDSPAα1을 사용하는 치료 방법에 관한 관한 것이다.
발명의 배경
혈전증은 혈관 내의 혈병 형성에 의해 발생한다. 폐 색전증을 포함하는 정맥 혈전증과 급성 심근경색을 포함하는 동맥 혈전증은 구별된다. 폐 색전증 및 심근경색은 즉각적인 의료적 처치를 요하는 생명을 위협하는 병변이다.
상기 동맥 및 정맥 혈전증 치료의 널리 보급된 형태는 효소적 혈전 용해를 수행하는 플라스미노겐 활성화제의 사용이다 [Collen et al., Ann. Rev. Med., (1988), 39:405-423). 이들 물질, 소위 혈전 용해물질은 혈액 내의 피브린 용해 시스템의 불활성 전구효소인 플라스미노겐을 단백질 분해 활성 효소인 플라스민으로 전환시킨다. 플라스민은 혈병의 실질적인 성분인 섬유상 물질인 피브린을 용해시키고, 이것은 차단된 혈관을 재소통시키고 혈류를 회복시킨다. 그러나, 플라스민은 비교적 비특이적인 프로테아제이기 때문에, 완전한 지혈에 필수적인 혈액 내 성분 (예를 들면 피브리노겐)을 단백질 분해를 통하여 파괴하여 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
제1 효소적 혈전 용해물질인 스트렙토키나제 및 유로키나제는 순환계에 주사될 경우 플라스미노겐을 플라스민으로 전신적으로 전환시켜 전신적인 단백질 분해를 유도하는 화합물이다. 따라서, 상기 화합물을 사용하는 혈전 용해 치료에는 출혈에 관련된 합병증이 수반된다. 통상 t-PA로 언급되는 조직형 플라스미노겐 활성화제의 사용을 기초로 한 보다 새로운 혈전 용해 치료법이 개발되었지만, 이들 치료법도 심각한 출혈 합병증, 비교적 빈번한 재폐색의 발생률, 불균일한 효과 및 타입 1 플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI-1)와 같은 플라스미노겐 활성화제 억제제에 의한 불활성화에 대한 민감성을 포함하여 많은 결점을 갖고 있다 [Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1998)].
보다 최근에는, 플라스미노겐 활성화제 단백질이 흡혈 박쥐 (데스몬두스 로툰두스) 타액 및 타액선을부터 정제되었다 [유럽 특허 출원 제0383417호 (Baldus 등); 유럽 특허 출원 제0352119호 (Duong 등)]. 이들 플라스미노겐 활성화제 (DSPA로 명명)는 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 촉매화하는 세린 프로테아제이지만, 피브린 결합 플라스미노겐에 대하여 보다 큰 선택성을 보여 혈전 용해 치료에 사용할 때 출혈의 심도 및 빈도의 저하에 관련될 수 있다. 또한, DSPA는 PAI-1과 같은 혈장 억제제에 의해 쉽게 불활성화되지 않고, 따라서 재폐색의 빈도 저하에 관련될 수 있다.
2개의 고분자량 형태의 DSPA (α1 및 α2로 명명)는 흡혈 박쥐의 타액에서 발견할 수 있는데, 이들 2개 모두 프로테아제 도메인을 포함하여 몇 개의 도메인으로 구성되고, 피브린의 존재 하에 플라스미노겐에 강력하게 결합할 수 있다. 다양한 형태의 DSPA는 재조합 생명공학 기술에 의해 포유동물 세포 배양에서 생산되었고 [Kraetzshmer et al., Gene (1991), 105: 229-237; 유럽 특허 출원 제0352119호 (Duong 등)], 재조합 기술에 의해 제조된 DSPA (rDSPA)의 소규모 정제도 문헌에 기재되었다 [Witt et al., Blood (1992), 79:1213-1217). 그러나, 상업적 규모로 제약 제제에 적합한 순도 상태로 rDSPA의 단리 및 정제는 개시되어 있지 않다.
본 발명은 재조합 DSPAα1 (rDSPAα1)의 상업적 규모로의 단리 및 정제에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 시판 및 임상 사용이 가능할 정도로 충분히 순수하고 안정한 rDSPAα1을 제조할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 rDSPAα1의 상업적 규모로의 단리 및 정제 방법을 제공하고, 임상 사용에 적합한 제품을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 생물학적 배지로부터 rDSPAα1을 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a) rDSPAα1을 양이온 교환 수지에 선택적으로 결합시키는 로딩 조건 하에 생물학적 배지를 양이온 교환 수지에 가하는 단계;
(b) 임의로, 양이온 교환 수지를 세척하여 비rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(c) 결합된 rDSPAα1을 양이온 교환 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;
(d) rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지에 선택적으로 결합시키는 로딩 조건 하에 단계 (c)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 소수성 상호작용 수지에 가하는 단계;
(e) 임의로, 소수성 상호작용 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(f) 결합된 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;
(g) rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지에 선택적으로 결합시키는 로딩 조건 하에 단계 (f)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 친화도 크로마토그래피 수지에 가하는 단계;
(h) 임의로, 친화도 크로마토그래피 수지를 세척하여 비 DSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(i) 결합된 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지로부터 선택적으로 용출시켜 수용액 중의 실질적으로 순수한 rDSPAα1을 생성시키는 단계로 이루어진다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 방법에 의해 단리되고 정제된 rDSPAα1 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 방법에 의해 단리되고 정제된 rDSPAα1 및 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 인간의 동맥 또는 정맥 혈전증을 치료하기 위해 본 발명의 방법에 의해 단리되고 정제된 rDSPAα1을 사용하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본원의 명세서 및 청구의 범위에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 다른 언급이 없는 한 나타낸 의미를 갖는다.
"생물학적 배지"는 배양 세포를 증식시키기 위해 사용되는, 염 및 영양물질로 이루어진 규정대로 제조된 배지를 의미한다.
"조건화 배지"는 세포가 성장하는 생물학적 배지를 의미한다. 따라서, 배지는 세포의 성장에 의해 조건화되고, 세포 성장 동안 배지에 분비된 생성물을 함유한다. 이들 생성물은 성장 동안 생성된 폐기물 또는 성장 동안 세포에 의해 제조되어 배지에 분비된 단백질일 수 있다.
"양이온 교환 수지"는 수지에 결합된 이온을 주위 액체 배지의 이온으로 교환할 수 있는, 일반적으로 고형의 천연 또는 인공 물질을 의미한다. 양이온 교환 수지는 관능기에 고정된 음이온을 보유하여 반대 양이온을 교환한다.
시판되는 양이온 교환기 내의 앵커(anchor)기는 일반적으로 -C6H5O-, -SO3 -, -COO-, -PO3 - 또는 -AsO3 -이다. 보다 약한 양이온 교환 수지는 양이온의 결합 강도가 크지 않은 수지, 예를 들면 카르복실 또는 카르복시알킬 관능기를 갖는 수지이다. 또한, 보다 약한 양이온 교환 수지는 일반적으로 산성 pH에서 완전히 해리되지 않는다. 본 발명에 사용되는 특히 약한 양이온 교환 수지는 폴리에틸렌이민의 아미노기가 카르복실기로 유도체화된 폴리에틸렌이민 실란에 공유결합된 실리카 입자의 매트릭스로 이루어진다. 이러한 수지는 J. T. Baker에서 등록상표명 Widepore CBX 크로마토그래피 수지로 시판하고 있다.
"소수성 상호작용 수지"는 메틸, 에틸 또는 기타 알킬기와 같은 비하전기를 함유하는 일반적으로 고형의 천연 또는 인공 물질을 의미한다. 이러한 기는 수지를 통과하는 단백질 잔기 상의 기와 소수성 결합을 형성하여 단백질과 수지 사이의 상호작용의 세기를 기초로 한 단백질의 분리를 야기한다. 특정 소수성 상호작용 수지는 부틸기로 유도체화된 메타크릴레이트계 중합체와 에틸렌 글리콜을 공중합시켜 합성되는 반강체 구형 비드로 이루어진다. 이러한 수지는 Toso-Hass에서 등록상표명 Toyo-Pearl 650M C4로 시판하고 있다.
"친화도 크로마토그래피 수지"는 단백질 정제에 사용되는 일반적으로 고형의 천연 또는 인공 물질을 의미한다. 수지는 단백질 상의 기와 수지 상의 기 사이에 발생하는 친화도를 기초로 하여 단백질을 분리한다. 본 발명에서, 친화도 크로마토그래피 수지로서 사용되는 수지는 단백질을 그의 크기를 기초로 하여 분리하는 크기 배제 수지로서 일반적으로 사용된다. 특정 친화도 크로마토그래피 수지는 20,000 내지 8,000,000 kDa의 구형 단백질을 분획화시킬 수 있는 비드 형태의 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 공중합체이다. 이러한 수지는 Pharmacia에서 등록상표명 Sephacryl S-400으로서 시판하고 있다.
"알킬"은 탄소원자수 1 내지 18, 바람직하게는 1내지 6의 불포화결합을 함유하지 않는, 탄소 및 수소만으로 구성된 직쇄 또는 분지쇄 1가 라디칼, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필(1-메틸에틸), n-부틸, t-부틸(1,1-디메틸에틸), sec-부틸(1-메틸프로필), n-펜틸, n-헥실 등이다.
본원에서 상세하게 설명되는 정제 공정 후의 rDSPAα1 생성물의 순도에 적용되는 "실질적으로 순수한"은 최종 정제 생성물에서 전체 단백질의 80% 이상이 rDSPAα1이고, 바람직하게는 단리된 전체 단백질의 90% 이상이 rDSPAα1이고, 가장 바람직하게는 단리된 전체 단백질의 98% 이상이 rDSPAα1임을 의미한다. 단백질 함량 및 순도는 역상 HPLC 및 SDS-PAGE 겔 분석을 기초로 한다.
"비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질"은 rDSPAα1이 정제되는 생물학적 배지 내에서 발견되는 rDSPAα1 이외의 다른 모든 물질을 의미한다.
"제약상 허용되는 부형제"는 비독성으로서 그 내부에 현탁되거나 포함되는 제약 조성물의 생물학적 활성에 유해한 영향을 주지 않는, 허용되는 담체 및 생리학적 조건에 적합하도록 하기 위해 필요한 임의의 제약상 허용되는 보조제를 의미한다. 적합한 부형제는 만니톨, 숙시네이트, 글리신 또는 혈청 알부민과 같은 화합물이다.
"치료 유효량"은 rDSPAα1을 필요로 하는 인간에게 투여할 경우, 하기 정의되는 바와 같이 혈전증이라는 특징을 갖는 질병 상태에 대한 치료 효과를 달성하기에 충분한 rDSPAα1의 양을 의미한다. "치료 유효량"을 구성하는 화합물의 양은 질병 상태 및 그 심도에 따라 상이할 것이고, 당업계의 숙련가는 그의 지식 및 본원의 개시 내용을 고려하여 용이하게 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료하는" 또는 "치료"는 인간의 혈전증이라는 특징을 갖는 질병 상태의 치료를 포함하고, (i) 특히 질병 상태의 소인을 보이지만 질병 상태를 가진 것으로 진단되지는 않은 인간의 질병 상태 발생의 예방, (ii) 질병 상태의 억제, 즉 질병 상태의 진전 저지 또는 (iii) 질병 상태의 경감, 즉 질병 상태의 퇴행 유발을 포함한다.
"임의의" 또는 "임의로"는 그 뒤에 기술되는 사건 내용이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 이와 같은 기재는 상기 사건 내용이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
바람직한 실시형태의 설명
본 발명은 제약 제제에 사용하기 적합한 형태로 상업적인 규모로 rDSPAα1을 단리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. rDSPAα1은 배양 배지로 rDSPAα1 생성물을 분비할 수 있는 포유동물 세포주를 발효시켜 제조된다. 조건화 배지, 즉 포유동물 세포를 함유하는 생물 반응기로부터 얻은 배지를 수거하여 양이온 교환 수지로 시작하여 수지로부터 rDSPAα1을 선택적으로 용출시키는 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 다른 단백질 및 오염물질로부터 rDSPAα1이 분리된다. 양이온 교환 수지로부터 선택적으로 용출시켜 수득한 rDSPAα1 분획을 이어서 소수성 상호작용 수지에 가하고, 여기서 매트릭스로부터의 선택적인 용출이 제2 정제 수준을 제공한다. 용출된 rDSPAα1 분획을 이어서 친화도 크로마토그래피 수지에 가하고, 여기서 선택적인 용출이 더 높은 수준의 정제를 제공한다. 정제된 rDSPAα1은 한외여과와 같은 통상의 기술에 의해 농축된 후 동결건조된다.
본 발명은 이하에서 구체적으로 기술된 바와 같이 실시된다.
A. 단리 및 정제
1. 배양 배지 및 세포주
배양 배지는 DMEM 또는 Ham의 F12와 같은 포유동물 세포 성장에 적합한 기초 배지로 이루어진다. 특정 배지는 William의 E 배지이다 [Williams, G.M. and Gunn, J.M, Exp. Cell Res., (1974) 89:139]. 접종 성장기 동안, 기초 배지는 일반적으로 약 0.1 내지 10 중량%, 일반적으로 약 1 내지 5 중량%의 농도로 존재하는 혈청 공급원, 일반적으로 소 혈청 (BS) 또는 신생 송아지 혈청 (CS)으로 보충된다. 기타 성장 인자 또는 완충액, 예를 들면 HEPES가 첨가될 수도 있다. 관류 성장기 동안, 혈청 농도는 약 3 내지 8%, 일반적으로 약 5%의 동일한 농도로 유지된다.
본 발명에 사용하기 적합한 세포주는 현탁 배양 중에서 비부착 성장 및(또는) 마이크로캐리어 비드 상에서 부착 성장할 수 있는 포유동물 세포주를 포함한다. 이러한 조건을 충족시키는 특정 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, BHK 세포, 또는 HEK293 세포주를 포함한다 [Kraezschmer et al., Gene, (1991) 116:281-284; Petri, T., J. Bio Technology, (1995) 39: 75-83].
특히 바람직한 CHO 세포주는 DXB11이다 [Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4216-4220]. 이들 세포는 rDSPAα1의 코딩 서열 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제를 각각 함유하는 발현 벡터 pSVPA11 및 pUDHFR1로 공동형질감염된 것이다. 본 발명에 사용되는 형질전환된 CHO 세포주는 CD16으로 명명하였고, 미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁하였고, ATCC #CRL 12023이 부여되었다.
2. 배양 및 생산기의 확장
전면배양 스피너(spinner) 배양물 또는 다른 생물 반응기 배양물의 일부를 사용하여 접종한 후에, 세포 배양물을 일반적으로 약 1 내지 40 x 106 세포/ml의 생성 밀도로 확장시켰다.
목적 세포 밀도가 마이크로캐리어 비드 상에 형성된 후에, 혈청이 보충된 신선 배지를 관류시키기 시작하였다. 별법으로, 세포를 현탁 배양으로 성장시킬 수 있다. 일반적으로, 신선 배지 내의 혈청 농도는 약 2 내지 10 중량%, 보다 일반적으로는 약 3 내지 8 중량%, 보다 더 일반적으로는 약 5 중량%로 존재할 것이다. 초기 관류 속도는 약 0.25 내지 0.75 배양 용량/일, 일반적으로는 약 0.5 배양 용량/일일 것이다. 세포 성장이 증가하면서, 관류 속도는 일반적으로 약 2 내지 10일에 걸쳐서 약 1.5 내지 2.5 배양 용량/일의 최종 속도로 증가된다. 확장 동안, 예비평형화된 무균의 마이크로캐리어 비드를 반응기에 첨가하여 마이크로캐리어 비드 대 세포 밀도를 약 0.5 내지 10 g의 마이크로캐리어 비드 대 109 세포로 유지시킨다. 편리하게는, 마이크로캐리어 비드는 흡입기를 사용하여 시료관을 통하여 반응기에 첨가된다.
세포 밀도가 생산 수준에 도달한 후에, 신선 배양 배지에 대한 혈청의 첨가량은 약 0.1 내지 2.0 중량%, 일반적으로 1 중량%의 농도까지 감소될 것이다.
생산기에서의 배양은 여러개의 발효 파라미터에 대한 관심을 요한다. 온도, pH 및 용존 산소의 농도는 매일 기록된다. 추가의 배양 배지, 혈청 및 알칼리는 공급 탱크가 고갈됨에 따라 공급할 필요가 있다. 생산이 오염됨이 없이 계속되는 지를 확인하기 위하여 생성물을 함유하는 배지로서 정의된 조건화 배지의 시료는 적어도 2일마다 정기적으로 분석된다.
생물 반응기로부터 조건화 배지의 회수를 위한 공정은 공극 직경이 약 100 내지 150 미크론인 체를 사용하여 세포의 회수를 최소화한다. 현탁 배양은 생물 반응기 내에 세포를 유지시키기 위해 볼텍스 플로우 필터(vortex flow filter)를 사용한다. 회수물은 멸균 용기에 모아서 추가 처리에 앞서 최대 38일 동안 보관한다. 생물 반응기 회수물에서 발견된 rDSPAα1은 충분한 생물학적 활성을 갖는, 정제에 용이한 처리 형태로 CHO 세포로부터 분비되었다.
3. 양이온 교환 크로마토그래피
4 내지 6, 바람직하게는 약 5로 pH를 조정한 후에, 매트릭스에 대한 rDSPAα1의 본질적으로 완전한 결합을 제공하도록 선택된 조건 하에 조건화 배지 내의 rDSPAα1을 양이온 교환 매트릭스에 가한다(일반적으로 칼럼의 형태로 팩킹됨). 다른 단백질도 결합할 것이지만, 초기 결합 단계는 조건화 배지 내의 많은 목적하지 않거나 오염성인 단백질 및 기타 화합물, 예를 들면 페놀 레드가 매트릭스에 결합할 수 없고 매트릭스를 통하여 흘러가면서 제1 분리 수준을 제공한다. rDSPAα1은 단계적 용출 또는 완충액의 이온 강도 증가에 의한 선형 구배 용출에 의해 달성될 수 있는 매트릭스로부터의 선택적 용출에 의해 추가 정제된다. 각 경우에, rDSPAα1은 후술되는 바와 같은 추가의 정제를 위해 회수된다.
적합한 양이온 교환 매트릭스는 rDSPAα1에 결합할 수 있는 양이온 관능기로 유도체화된 매우 다양한 수지를 포함한다. 합성 수지, 예를 들면 카르복실, 카르복시메틸, 술포닐, 포스포릴 등과 같은 양이온 관능기로 유도체화된 실리카 겔 입자, 가교결합된 아가로스 또는 가교결합된 폴리메타크릴레이트 중합체로 이루어진 수지가 바람직하다. 비교적 약한 수지, 예를 들면 카르복실 또는 카르복시알킬 관능기, 예를 들면 카르복시메틸 또는 카르복시에틸을 갖는 수지가 특히 유용하다. 특히 바람직한 수지는 아미노기가 카르복실기로 유도체화된 폴리에틸렌이민 실란에 공유결합된 실리카 입자의 매트릭스로 이루어진다. 이러한 수지는 J.T. Baker에서 시판하는 Baker Widepore CBX (등록상표, 45 mm 비드 크기)이다.
결합 및 용출 조건은 양이온 수지의 결합 강도에 따라 변할 것이다. Baker Widepore CBX와 같은 약한 양이온 수지의 경우, 결합은 약산성, 일반적으로 4 내지 7의 pH, 바람직하게는 약 pH 5의 조건 하에서 낮은 이온 농도에서 실시될 수 있다. 매트릭스를 세척한 후, 선형 또는 단계적 용출을 사용하여 매트릭스를 상승된 이온 강도를 갖는 이동상에 노출시킴으로써 rDSPAα1을 선택적으로 용출시킬 수 있다. Baker Widepore CBX 수지의 경우, rDSPAα1은 약 100 mM 내지 500 mM NaCl의 염 농도를 사용하여 약 7.5의 pH에서 용출될 것이다. 이어서, 칼럼을 스트리핑(stripping)하고, 후속 사용을 위해 재생시킬 수 있다.
바람직하게는, Baker Widepore CBX 매트릭스의 경우 수지는 먼저 pH 5의 100 mM 아세트산나트륨 완충액으로 평형화될 것이다. 용출액의 pH가 5에서 안정될 때까지 분당 0.2 내지 2.0 컬럼 용량의 유속으로 완충액을 칼럼에 가한다. rDSPAα1을 함유하는 조건화 배지는 1.2 ㎛ 필터로 여과시킨 후, 빙초산을 사용하여 4 내지 7, 가장 바람직하게는 5의 pH로 적정한다. 이어서, 통상적으로 기어 펌프를 사용하여 분당 2.0 칼럼 용량 이하의 유속으로 배지를 칼럼에 가한다. 칼럼 매트릭스를 막을 수 있는 입자를 제거하기 위해 필터가 제공된다. 칼럼 매트릭스는 이어서 pH가 5에서 안정화될 때까지 일반적으로 약 2 내지 7의 칼럼 용량을 요하는 아세트산 평형 완충액으로 예비평형화된다. 다음으로, 용출액의 pH가 7.5에서 안정화될 때까지 분당 약 0.1 내지 0.2 칼럼 용량으로 50 mM 인산나트륨을 함유하는 pH 7.5의 세척 완충액을 칼럼에 가한다. 이어서, 50 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 7.5의 용출 완충액을 사용하여 rDSPAα1을 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출 완충액은 단백질이 더 이상 칼럼으로부터 용출되지 않을 때까지 사용된다. 2.0 M 아세트산나트륨을 함유하는 pH 8의 스트리핑 완충액을 칼럼에 가하여 매트릭스를 재생시킨다. 보관 완충액은 10% 아세트산 및 45% 에탄올을 함유한다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피
양이온 교환 매트릭스로부터 회수된 rDSPAα1 분획을 rDSPAα1이 매트릭스에 결합하도록 하는 조건, 일반적으로 높은 이온 강도 및 낮은 pH 하에서 소수성 상호작용 매트릭스 (일반적으로 칼럼 형태)에 가한다. 이어서, 선형 또는 단계적 구배를 사용하여 칼럼에 가해진 이동상의 유기 용매 농도를 증가시켜 rDSPAα1을 선택적으로 용출시킨다. rDSPAα1 분획은 추가 정제를 위해 회수된다. 이 단계는 DNA 오염을 100 내지 1000배까지 감소시키고, 잠재적 바이러스 오염물질을 불활성화시킨다.
적합한 소수성 상호작용 매트릭스는 프로필, 부틸, 옥틸, 페닐 등과 같은 공유결합된 소수성 기를 갖는 매우 다양한 비하전(uncharged) 수지를 포함한다. 수지는 가교결합 유기 중합체, 예를 들면 스티렌-디비닐벤젠, 실리카, 아가로스, 폴리메타크릴레이트 또는 매우 다양한 기타 적합한 입자 지지체의 어느 하나일 수 있다. 특히 바람직한 수지는 부틸기로 유도체화된 메타크릴레이트계 중합체와 에틸렌 글리콜의 공중합에 의해 합성되는 반강체 구형 비드로 이루어진다. 이러한 수지는 Toso-Haas에서 시판하는 Toyo-Pearl (등록상표) 650 M (40-90 ㎛ 비드)이다.
소수성 상호작용 칼럼에 대한 결합은 일반적으로 3 내지 5, 보다 일반적으로는 약 4의 산성 pH에서 높은 이온 강도의 조건 하에 수행된다. 실제로, 양이온 교환 수지로부터 용출된 rDSPAα1 분획 내에 함유된 모든 단백질은 소수성 상호작용 칼럼에 결합된다. 여러 단백질을, 매트릭스 상의 소수성기와의 소수성 상호작용의 상이한 세기를 기초로 하여, 즉 단백질의 소수성 크기 순서로 선택적으로 용출시킬 수 있다. 용출은 일반적으로 알콜 용출제, 예를 들면 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하여 단계적 또는 선형 구배를 사용하여 수행될 수 있다. 특히 바람직한 알콜은 에틸알콜이다.
바람직하게는 Toyo-Pearl C4 매트릭스의 경우, 평형은 50 mM 아세트산나트륨, 500 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 4의 평형 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 이온 교환 칼럼으로부터의 rDSPAα1 분획을 pH 4까지 적정한 후, 분획을 C4 매트릭스에 가하고, 이어서 매트릭스를 상기 평형 완충액으로 재평형화시킨다. 이어서, 칼럼을 2개의 완충액을 사용하여 다음과 같이 순차적으로 세척한다. 제1 세척 (세척 1)은 20 mM HCl을 함유하는 완충액 2 칼럼 용량 이상을 사용한다. 세척은 일정한 UV 흡광도에 의해 증명되는 바와 같이, 용출액이 다른 단백질을 함유하지 않을 때까지 계속한다. 이어서, 매트릭스를 19% 에탄올, 20 mM HCl을 함유하는 완충액 10 칼럼 용량 이상으로 세척하고 (세척 2), 다른 단백질이 용출되지 않을 때까지 20.5% 에탄올, 20 mM HCl을 함유하는 완충액으로 세척을 계속한다. rDSPAα1 생성물의 용출은 29% 에탄올, 20 mM HCl을 함유하는 pH 2.5의 완충액을 사용하여 실시된다. 생성물을 용출시킨 후, 100 mM NaOH를 함유하는 완충액 2 칼럼 용량 이상을 사용하여 칼럼을 스트리핑한다. 매트릭스는 세척 1 완충액 중에서 보관된다.
5. 친화도 크로마토그래피
소수성 상호작용 수지로부터 회수된 rDSPAα1 분획을 이어서 rDSPAα1을 친화도 매트릭스에 결합시키는 조건 하에 친화도 매트릭스 (일반적으로 칼럼 형태)에 가한다. rDSPAα1은 칼럼에 계속 결합한 상태로, 20 mM HCl 2 내지 3 칼럼 용량으로 칼럼을 세척하여 오염물질을 용출시킨다. 이 단계는 완충액 교환을 촉진시켜 제약 제제화 및 용해도를 보조하고, 잠재적 바이러스 오염물질의 불활성화/제거를 돕는다. 바람직하게는, 2.5 칼럼 용량의 완충액을 사용한다. rDSPAα1은 이어서 200 mM 글리신, 유리 염기를 함유하는 pH 4 내지 5의 완충액을 사용하여 선택적으로 용출된다. rDSPAα1 분획은 농축을 위해 회수된다.
본 발명에서 친화도 수지로서 사용되는 수지는 통상 크기 배제 수지로 사용되는 것이다. 적합한 친화도 매트릭스는 직경 25 내지 75 ㎛의 비드 형태인, 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 중합체로 이루어진 수지를 포함한다. 특히 바람직한 수지는 Pharmacia에서 시판하는, 20,000 내지 8,000,000 kDa의 구형 단백질을 분획화시킬 수 있는 Sephacryl 400(등록상표)이다.
친화도 수지에 대한 rDSPAα1의 결합은 낮은 이온 강도 및 낮은 pH의 조건 하에 달성된다. 소수성 상호작용 수지로부터 회수된 실질적으로 모든 rDSPAα1이 컬럼에 결합된다. rDSPAα1은 pH 및(또는) 이온 강도를 상승시켜 선택적으로 용출될 수 있다. 용출은 일반적으로 200 mM 글리신, 유리 염기를 함유하는 용출액을 사용하여 단계적 또는 선형 구배를 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는 Sephacryl S-400 매트릭스의 경우, 평형은 용출액의 pH가 변하지 않을 때까지 19% 에탄올, 20 mM HCl을 함유하는 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 매트릭스에 소수성 상호작용 컬럼으로부터의 rDSPAα1 분획을 로딩한 후, 용출액으로부터의 UV 신호가 일정해질 때까지 20 mM HCl을 함유하는 완충액으로 세척한다. 결합된 rDSPAα1의 용출은 200 mM 글리신을 함유하는 완충액을 사용하여 실시한다. 생성물을 용출시킨 후, 100 mM NaOH를 함유하는 완충액 2 칼럼 용량 이상을 사용하여 칼럼을 스트리핑한다. 매트릭스를 2 칼럼 용량 이상의 세척 완충액 (20 mM HCl)으로 세척한 후, 매트릭스를 상기 완충액 중에서 보관할 수 있다.
6. 농도
본 발명의 정제된 단백질은 일반적으로 여과 등에 의해서 농축될 수 있고, 동결건조되거나 통상의 제약 제제에 포함될 수 있다. 유용한 농도 및 동결건조 방법은 기술 문헌에 상세하게 기술되어 있다.
B. 제제화
1. 제약 조성물
본 발명은 동맥 및 정맥 혈전증 치료에 유용한, 상기한 방법에 의해 정제되는 상당한 치료 가치를 갖는 물질인 rDSPAα1을 제공한다.
본원에서 기술된 바와 같이 정제된 재조합 rDSPAα1은 환자에게 투여될 수 있다. 상기 물질은 치료 용도를 위해 다른 성분과 함께, 예를 들어 통상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에서 생리학상 무독성의 안정화제 및 부형제와 함께 배합될 수 있다. 이러한 배합물은 멸균여과되어 투여 바이알 중의 동결건조에 의해 투여 형태로 제제화되거나 또는 안정화된 수성 제제 중에서 보관될 수 있다.
효과적인 치료에 필요한 rDSPAα1의 양은 투여 수단, 환자의 생리적 상태 및 기타 투여되는 의약을 포함하여 많은 상이한 인자에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료 투여량은 안전 및 효능을 최적화하기 위해서 적정되어야 한다. 일반적으로, 시험관 내에서 사용되는 투여량은 상기 시약의 체내 투여에 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공한다. 효과적인 치료 투여량에 대한 동물 시험은 인간 투여량에 대한 추가의 예측 기준을 제공할 것이다. 고려될 여러가지 사항은 문헌 [Gilman et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.]에 기재되어 있다. 투여 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은, 예를 들면 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피 확산 등이다. 제약상 허용되는 담체는 물, 염수, 완충액 및 문헌 [미국 뉴저지주 라웨이 소재의 Merck & Co.사의 Merck Index]에 기재된 바와 같은 기타 화합물을 포함할 것이다. 다른 플라스미노겐 활성화제에 요구되는 투여량을 기초로 할 때, 총 80 내지 110 mg의 투여량이 필요할 것으로 예상된다 [Physician's Desk Reference, 49th ed. (1995), Medical Economics Data Production Company, pp 1083-1085].
치료 제제는 임의 통상의 투여 제제로 투여될 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여할 수 있지만, 제약 제제로서 투여하는 것이 바람직하다. 제제는 상기한 바와 같은 1종 이상의 활성 성분을 그의 1종 이상의 허용되는 담체와 함께 포함한다. 각각의 담체는 다른 성분과 혼화성이고 환자에게 무해하다는 의미에서 제약상 및 생리학상 허용되는 것이어야 한다. 제제는 경구 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 적합한 것을 포함한다. 제제는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 제약업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 [Gilman 등의 상기 문헌 및 Remington의 상기 문헌 참조].
요약하면, 발명의 요약에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시형태는
(a) 카르복실기로 유도체화된 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 실란에 공유 결합된 실리카 입자의 매트릭스로 이루어진 양이온 교환 수지에 pH 5의 생물학적 배지를 가하여 rDSPAα1을 양이온 교환 수지에 선택적으로 결합시키는 단계;
(b) 100mM NaOAc 및 50mM NaPO4를 함유하는 pH 7.5의 완충액으로 양이온 교환 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(c) 50mM 인산 나트륨 및 500mM 염화나트륨을 함유하는 pH 7.5의 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 양이온 교환 수지로부터 용출시키는 단계;
(d) 상기 단계(c)로부터의 pH 4의 rDSPAα1 함유 용출액을, 부틸기로 유도체화된 메타크릴레이트계 중합체와 에틸렌 글리콜의 공중합에 의해 합성되는 반강체 구형 비드로 이루어진 소수성 상호작용 수지에 가하여 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지에 선택적으로 결합시키는 단계;
(e) 20mM HCl로 소수성 상호작용 수지를 세척한 다음, 19% EtOH를 함유하는 20 mM HCl로 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(f) 29% 에탄올 및 20 mM 염산을 함유하는 pH 2.5의 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지로부터 용출시키는 단계;
(g) 상기 단계 (f)로부터의 pH2.5의 rDSPAα1 함유 용출액을, 20,000 내지 8,000,000 kDa의 구형 단백질을 분획화시키는, 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 중합체로 이루어진 친화도 크로마토그래피 수지에 가하여 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지에 선택적으로 결합시키는 단계;
(h) 20mM HCl로 친화도 크로마토그래피 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;
(i) pH 4 내지 5의 200mM 글리신 함유 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지로부터 선택적으로 용출시켜 수용액 중의 실질적으로 순수한 rDSPAα1을 생성시키는 단계로 이루어지는, 생물학적 배지로부터 rDSPAα1의 단리 및 정제 방법이다.
하기 구체적인 제조예 및 실시예는 본 발명의 실행을 돕기 위한 지침으로서 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
Claims (23)
- (a) pH 4 내지 7에서 생물학적 배지를 양이온 교환 수지에 가하는 단계;(b) 양이온 교환 수지를 세척하여 재조합 데스모두스 로툰두스(Desmodus rotundus) 타액 플라스미노겐 활성화제(rDSPAα1) 이외의 단백질(비 rDSPAα1 단백질) 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(c) 결합된 rDSPAα1을 양이온 교환 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;(d) pH 3 내지 5에서 단계 (c)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 소수성 상호작용 수지에 가하는 단계;(e) 소수성 상호작용 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(f) 결합된 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;(g) 낮은 pH 및 낮은 이온 강도에서 단계 (f)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 친화도 크로마토그래피 수지에 가하는 단계;(h) 친화도 크로마토그래피 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계; 및(i) 결합된 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지로부터 선택적으로 용출시켜 수용액 중의 순수한 rDSPAα1을 생성시키는 단계로 이루어지는, 생물학적 배지로부터 rDSPAα1을 정제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적 배지가 조건화 배지인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (a)에서의 양이온 교환 수지가 카르복실 또는 카르복시알킬기로 유도체화된 실리카겔 입자, 가교결합된 아가로스 또는 가교결합된 폴리메타크릴레이트 중합체로 이루어진 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 양이온 교환 수지가 아미노기가 카르복실기로 유도체화된 폴리에틸렌이민 실란에 공유결합된 실리카 입자의 매트릭스로 이루어진 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 단계 (a)에서의 로딩 조건이 pH 4 내지 7에서 배지를 가하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 단계 (c)에서의 rDSPAα1의 용출이 50 mM 인산나트륨 및 100 mM 내지 500 mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 또는 등가의 이온 강도의 완충액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (d)에서의 소수성 상호작용 수지가 탄소 1 내지 10개 길이의 알킬쇄 또는 아릴-알킬기로 유도체화된 비하전된 수지인 방법.
- 제7항에 있어서, 비하전 수지가 실리카겔 입자, 가교결합된 아가로스 또는 가교결합된 폴리메타크릴레이트 중합체로 이루어진 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 비하전 수지가 부틸기로 유도체화된 메타크릴레이트계 중합체와 에틸렌 글리콜의 공중합에 의해 합성되는 반강체(semi-rigid) 구형 비드로 이루어진 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (d)에서의 로딩 조건이 pH 3 내지 5에서 단계 (c)로부터의 용출액을 가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (d)에서의 로딩 조건이 인산을 사용하여 pH가 4로 조정된 50 mM 인산나트륨 및 500 mM 염화나트륨 중의 또는 등가의 이온 강도의 완충액 중의 단계 (c)로부터의 용출액을 가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 (f)에서의 용출이 20 mM HCl을 함유하는, 에탄올 농도가 25%보다 큰 완충액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 에탄올 농도가 28.5% 내지 30%인 방법.
- 제12항에 있어서, 에탄올 농도가 29%인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (g)의 친화도 크로마토그래피 수지가 직경 25 내지 75 ㎛의 비드 형태인, 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 공중합체로 이루어진 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 비드가 20,000 내지 8,000,000 kDa의 구형 단백질을 분획화시킬 수 있는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 단계 (g)에서의 로딩 조건이 pH 1 내지 4에서 단계 (f)로부터의 용출액을 가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 단계 (i)에서의 용출이 200 mM 글리신을 함유하는 pH 3 내지 6의 완충액 또는 등가의 이온 강도의 완충액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, rDSPAα1의 수용액을 농축하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 농축된 rDSPAα1 용액을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, rDSPAα1의 수용액을 농축하고 농축된 rDSPAα1 용액을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,(a) pH 4 내지 7에서 배지를 카르복실 또는 카르복시알킬기로 유도체화된 실리카겔 입자, 가교결합된 아가로스 또는 가교결합된 폴리메타크릴레이트 중합체로 이루어진 양이온 교환 수지에 가하는 단계;(b) 양이온 교환 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(c) 50 mM 인산나트륨 및 100 mM 내지 500 mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 또는 등가의 이온 강도의 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 양이온 교환 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;(d) pH 3 내지 5에서 단계 (c)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 실리카겔 입자, 가교결합된 아가로스 또는 가교결합된 폴리메타크릴레이트 중합체로 이루어진 소수성 상호작용 수지에 가하는 단계;(e) 소수성 상호작용 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(f) 20 mM HCl을 함유하는, 에탄올 농도가 25%보다 큰 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지로부터 선택적으로 용출시키는 단계;(g) pH 1 내지 4에서 단계 (f)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 직경 25 내지 75 ㎛의 비드 형태인, 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 중합체로 이루어진 친화도 크로마토그래피 수지에 가하는 단계;(h) 친화도 크로마토그래피 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계; 및(i) pH 3 내지 6의 200 mM 글리신을 함유하는 완충액 또는 등가의 이온 강도의 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지로부터 선택적으로 용출시켜 수용액 중의 순수한 rDSPAα1을 생성시키는 단계로 이루어지는 방법.
- (a) pH 5의 배지를 아미노기가 카르복실기로 유도체화된 폴리에틸렌이민 실란에 공유결합된 실리카 입자의 매트릭스로 이루어진 양이온 교환 수지에 가하는 단계;(b) pH 5의 양이온 교환 수지를 pH 7.5의 100 mM NaOAc 및 50 mM NaPO4로 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(c) pH 7.5의 50 mM 인산나트륨 및 500 mM 염화나트륨을 함유하는 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 양이온 교환 수지로부터 용출시키는 단계;(d) pH 4의 단계 (c)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 부틸기로 유도체화된 메타크릴레이트계 중합체와 에틸렌 글리콜의 공중합에 의해 합성된 반강체 구형 비드로 이루어진 소수성 상호작용 수지에 가하는 단계;(e) 20 mM HCl, 이어서 19% EtOH를 함유하는 20 mM HCl을 사용하여 소수성 상호작용 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계;(f) 29% 에탄올 및 20 mM HCl을 함유하는 pH 2.5의 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 소수성 상호작용 수지로부터 용출시키는 단계;(g) pH 2.5의 단계 (f)로부터의 rDSPAα1 함유 용출액을 20,000 내지 8,000,000 kDa의 구형 단백질을 분획화시킬 수 있는, 알릴 덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 가교결합된 중합체로 이루어진 친화도 크로마토그래피 수지에 가하는 단계;(h) 20 mM HCl을 사용하여 친화도 크로마토그래피 수지를 세척하여 비 rDSPAα1 단백질 및 비단백질성 오염물질을 제거하는 단계; 및(i) pH 4 내지 5의 200 mM 글리신을 함유하는 완충액을 사용하여 결합된 rDSPAα1을 친화도 크로마토그래피 수지로부터 용출시켜 수용액 중의 순수한 rDSPAα1을 생성시키는 단계로 이루어지는, 생물학적 배지로부터 rDSPAα1을 단리 및 정제하는 방법.
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