[go: up one dir, main page]

EA019962B1 - Конъюгаты цитотоксинов - Google Patents

Конъюгаты цитотоксинов Download PDF

Info

Publication number
EA019962B1
EA019962B1 EA200970648A EA200970648A EA019962B1 EA 019962 B1 EA019962 B1 EA 019962B1 EA 200970648 A EA200970648 A EA 200970648A EA 200970648 A EA200970648 A EA 200970648A EA 019962 B1 EA019962 B1 EA 019962B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
group
alkyl
groups
Prior art date
Application number
EA200970648A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970648A1 (ru
Inventor
Билал Суфи
Винсен Герлавэ
Лян Чэнь
Санджив Гангвар
Цян Чжан
Дэвид Б. Пассмор
Original Assignee
МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. filed Critical МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си.
Publication of EA200970648A1 publication Critical patent/EA200970648A1/ru
Publication of EA019962B1 publication Critical patent/EA019962B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/552—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being an antibiotic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/556—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells enzyme catalyzed therapeutic agent [ECTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D501/00—Heterocyclic compounds containing 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. cephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C07D501/14—Compounds having a nitrogen atom directly attached in position 7
    • C07D501/16—Compounds having a nitrogen atom directly attached in position 7 with a double bond between positions 2 and 3
    • C07D501/59—Compounds having a nitrogen atom directly attached in position 7 with a double bond between positions 2 and 3 with hetero atoms directly attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к конъюгатам цитотоксинов формулы, описанной ниже, где значения X, L, p, F, L, D, m определены в формуле изобретения. Указанные конъюгаты могут быть избирательно доставлены к целевому месту действия в активной форме, после чего расщепляются для высвобождения активного лекарственного средства.

Description

В настоящем изобретении предлагаются линкеры и расщепляемые субстраты, которые присоединены к лекарственному средству и лиганду и расщепляются ίη νίνο. Линкеры и расщепляемые субстраты применяются в существующих пролекарствах и конъюгатах цитотоксинов по изобретению, а также в качестве других диагностических и терапевтических фрагментов.
Предпосылки изобретения
Многие терапевтические средства, в частности те, которые являются особенно эффективными в химиотерапии рака, часто проявляют острую токсичность ίη νίνο, особенно токсичность в отношении костного мозга и слизистых оболочек, а также хроническую сердечную и неврологическую токсичность. Такая высокая токсичность может ограничить их применение. Разработка более безопасных и более специфических терапевтических средств, особенно противоопухолевых средств, желательна с точки зрения повышения эффективности против клеток опухоли, а также уменьшения частоты и тяжести побочных эффектов таких средств (токсичность, разрушение не опухолевых клеток и т.п.). Другое затруднение в случае существующих терапевтических средств состоит в их субоптимальной стабильности в плазме. Добавление функциональных групп для стабилизации таких соединений приводило к существенному снижению активности. Соответственно, желательно идентифицировать пути стабилизации соединений при сохранении приемлемых уровней терапевтической активности.
Хотя поиск более селективных цитотоксических средств ведется чрезвычайно активно в течение многих десятилетий, ограничивающая дозу токсичность (т.е. нежелательная активность цитотоксинов в нормальных тканях) представляет собой одну из основных причин неуспешной терапии рака. Например, известно, что СС-1065 и дуокармицины являются чрезвычайно мощными цитотоксинами.
СС-1065 был изначально выделен из ЗйерЮшусек хе1ег1К1к в 1981 г. компанией υρ)ο1ιη (Напка е! а1., 1. АпйЬю!. 31: 1211 (1978); Магйп е! а1., 1. АпйЬю!. 33: 902 (1980); Майш е! а1., 1. АпйЬю!. 34: 1119 (1981)), было обнаружено, что он обладает мощной противоопухолевой и противомикробной активностью как ίη νίίτο, так и в экспериментах на животных (Ь1 е! а1., Саг1сег Век. 42: 999 (1982)). СС-1065 связывается с двухцепочечной Β-ΌΝΑ в пределах незначительного желобка (8\\νηκοη е! а1., Саг1сег Век. 42: 2821 (1982)) с предпочтительной последовательностью 5'-ά(Α/ΟΝΤΤΑ)-3' и 5'-ά(ΑΑΑΑΑ)-3' и алкилирует положение N3 3'-аденина расположенной слева частью молекулы СР1 (Ниг1еу е! а1., Заенсе 226: 843 (1984)). Несмотря на мощную и противоопухолевую активность с широким спектром действия, СС-1065 не может применяться у человека, поскольку вызывает отсроченную гибель экспериментальных животных.
Многие аналоги и производные СС-1065 и дуокармицинов известны из уровня техники. Исследования структуры, способов синтеза и свойств многих соединений были рассмотрены, например, Βο^Γ е! а1., Апдехт. СНеш. Ιηΐ. Εά. Εη§1. 35: 1438 (1996) и Βο§ογ е! а1., Сйет. Веν. 97: 787 (1997).
Группой в Κλό\\ή Ηη1<1<ο Κομ^τι Οο., Μά. был получен целый ряд производных СС-1065. См., например, патенты США 5101038, 5641780, 5187186, 5070092, 5703080, 5070092, 5641780, 5101038, 5084468 и опубликованную заявку РСТ νθ 96/10405, а также опубликованную европейскую заявку 0537575 А1.
Компания υρΐοΒη (Рйаттааа υρ)ο1ιη) также активно действует в направлении получения производных СС-1065. См., например, патенты США 5739350, 4978757, 5332837 и 4912227.
Исследования также фокусируются на разработке новых терапевтических средств, которые существуют в форме пролекарств, соединений, способных к превращению в лекарства (терапевтически активные соединения) ίη νίνο при определенных химических или ферментных модификациях их структуры. Для целей уменьшения токсичности такое превращение предпочтительно ограничивается местом действия или целевой тканью вместо кровеносной системы или не целевой ткани. Однако даже пролекарства создают проблемы, поскольку многие характеризуются низкой стабильностью в крови и сыворотке, в результате присутствия ферментов, которые разлагают или активизируют пролекарства до того, как пролекарства достигнут целевых участков в пределах организма больного.
В Βπκΐοΐ-Муегк 8с.|шЬЬ описаны конкретные, расщепляемые лизосомальными ферментами конъюгаты противоопухолевых лекарственных средств. См., например, патент США 6214345. В указанном патенте предлагается аминобензилоксикарбонил.
В ЗеаШе Сеие^ск были опубликованы патентные заявки США 2003/0096743 и 2003/0130189, в которых описаны п-аминобензиловые эфиры в средствах доставки лекарственных средств. Линкеры, описанные в указанных заявках, ограничиваются композициями аминобензиловых эфиров.
Другими группами также описаны линкеры. См., например, άе Οτοο! е! а1., 1. Меά. СНеш. 42, 5277 (1999); άο Οτοο! е! а1. 1. Отд. СНеш. 43, 3093 (2000); άο Οτοο! е! а1., 1. Μαά. Сйет. 66, 8815, (2001);
- 1 019962 \νϋ 02/083180; Саг1 е! а1., 1. Меб. СНет. Ьей. 24, 479, (1981); Όι.ιΗο\νο1ιί1< е! а1., Вюогд & Меб. СНет. Ьей.
8, 3347 (1998). Такие линкеры включают спейсер аминобензилового эфира, удлиненный электронный каскад и системы циклизации спейсера, циклизацию элиминационных спейсеров, таких как ν-аминоаминокарбонилы и линкер п-аминобензилоксикарбонил.
Стабильность цитотоксических лекарственных средств, в том числе стабильность ίη νίνο, попрежнему представляет собой важную проблему, требующую решения. Кроме того, токсичность многих соединений делает их менее применимыми, таким образом, необходимы композиции, которые уменьшают токсичность лекарственного средства, например образование расщепляемого пролекарства. Таким образом, несмотря на успехи в данной области, продолжает существовать потребность в разработке усовершенствованных терапевтических средств для лечения млекопитающих, в частности человека, более конкретно, цитотоксинов, которые проявляют высокую специфичность действия, сниженную токсичность и улучшенную стабильность в крови относительно известных соединений сходной структуры. Данное изобретение направленно на удовлетворение перечисленных потребностей.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение относится к конъюгатам лекарственное средство-лиганд, где лекарственное средство и лиганд связаны через пептидил или другой линкер, и к конъюгатам лекарственное средстворасщепляемый ферментом субстрат. Указанные конъюгаты представляют собой мощные цитотоксины, которые могут быть избирательно доставлены к целевому месту действия в активной форме, после чего расщепляются для высвобождения активного лекарственного средства.
Один из вариантов представляет собой соединение формулы
в которой Ь1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Р представляет собой линкер, содержащий структуру
где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь2 представляет собой самоуничтожающийся линкер и содержит
где каждый из К17, К18 и К19 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, и ν равно целому числу от 0 до 4;
о равно 1;
Ь4 представляет собой линкерную группу;
р представляет собой 0 или 1;
X4 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов; и
Ό содержит структуру
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и О представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного
- 2 019962 алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23;
Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я3 представляет собой ОЯ11, где Я11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)Я Я , С(О)ОЯ , Ο’(Ό)ΝΚ Я , Р(О)(ОЯ12)2, С(О)СНЯ12Я13, 8Я12 и §1Я12Я13Я14, где Я12, Я13 и Я14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, Я12 и Я13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я4, Я4, Я5 и Я5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ^2, Ν^16, ^(О)Я15, ОС(О)1МЯ15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ \Я и О(СН2)^(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из Я4, Я4, Я5 и Я5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп;
η равно целому числу от 1 до 20;
Я15 и Я16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, Я6 и Я7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
Я7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к Я6, где X1 представляет собой уходящую группу,
Я11 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е; или его фармацевтически приемлемая соль.
Другой вариант представляет собой соединение формулы
в которой Ь1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Е представляет собой линкер, содержащий структуру
где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь2 представляет собой самоуничтожающийся линкер;
о равно 0 или 1;
Ь4 представляет собой линкерную группу;
р представляет собой 0 или 1;
X представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов; и
Ό содержит структуру
- 3 019962
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23;
В23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
В3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=0), 8В11, ΝΗΒ11 и ОВ11, где В11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)В12В13, С(О)ОВ12, С(О)1МВ12В13, Р(О)(ОВ12)2, С(О)СНВ12В13, 8В12 и 81В12В13В14, где В12, В13 и В14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где В12 и В13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
В4, В4, В5 и В5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, N0·. ЧВ'В', ^(О)В15, ОС(О)1МВ15В16, ОС(О)ОВ15, С(О)В15, 8В15, ОВ15, СВ15=№16 и О(СН2)У(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из В4, В4, В5 и В5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, п равно целому числу от 1 до 20;
В15 и В16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где В15 и В16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
как минимум один из В4, В4, В5 и В5 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е и содержит
где ν равно целому числу от 1 до 6;
27' 28 28' каждый из В , В , В и В независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
В6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, В6 и В7 соединены с образованием циклопропильного кольца; и
В7 представляет собой СН2-Х' или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к В6, где
X1 представляет собой уходящую группу; или его фармацевтически приемлемая соль.
Другой вариант представляет собой соединение формулы
- 4 019962 в которой Ь1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Р представляет собой линкер, содержащий структуру
о где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь3 представляет собой спейсерную группу, включающую первичный или вторичный амин, или функциональную карбоксильную группу, где, если Ь3 присутствует, т равно 0 и амин Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной карбоксильной группой Ό или карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной аминогруппой Ό;
о равно 0 или 1;
Ь4 представляет собой линкерную группу, где Ь4 содержит
непосредственно присоединенный к Ν-концу (АА1)С;
Я20 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
каждый из Я25, Я25, Я26 и Я26 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
и I независимо равны целым числам от 1 до 6;
р представляет собой 1;
X4 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов; и
Ό содержит структуру
К' где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23;
Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=0), 8Я11, NΗЯ11 и ОЯ11, где Я11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)Я12Я13, С(О)ОЯ12, С(О)1МЯ12Я13, Р(О)(ОЯ12)2, С(О)СНЯ12Я13, 8Я12 и 81Я12Я13Я14, где Я12, Я13 и Я14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где Я12 и Я13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я4, Я4, Я5 и Я5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, за- 5 019962 мещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΟ2, ΝΚ15Β16, \С(О)Н'. ОС(О)1ЧК.15К16, ОС(О)ОК15, С(О)К15, 8К15, ОН15, ОН' \К и О(СН2)пЫ(СНз)2, или члены любой смежной пары, состоящей из К4, К4, К5 и К5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, п равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, К6 и К7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к К6, где
X1 представляет собой уходящую группу, как минимум один из К4, К4, К5, К5, К15 или К16 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Р;
или его фармацевтически приемлемая соль.
Дополнительный вариант представляет собой соединение, имеющее следующую структуру:
в которой Ь1 представляет собой самоуничтожающийся спейсер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
X2 представляет собой расщепляемый субстрат;
Ό содержит структуру
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΒ23;
К23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
К3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=О), 8К11, ΝΗΒ11 и ОК11, где К11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)К12К13, С(О)ОК12, С(О)\К';К';. Р(О)(ОК12)2, С(О)СНК12К13, 8К12 и 81К12К13К14, где К12, К13 и К14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где К12 и К13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, К6 и К7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к К6, где
XI представляет собой уходящую группу;
К4, К4, К5 и К5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гете- 6 019962 роарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΟ2, ΝΚ15Κ16, ЫС(О)К15, ОС(О)1МЯ15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, (Ή ΝΗ и
О(СН2)пЫ(СНз)2, или члены любой смежной пары, состоящей из Я4, Я4, Я5 и Я5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, п равно целому числу от 1 до 20;
Я15 и Я16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
как минимум один из группы Я4, Я4, Я5 и Я5 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с X2 и выбирают из группы, состоящей из
30' 31 31' где Я , Я , Я и Я независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила; и ν равно целому числу от 1 до 6;
или его фармацевтически приемлемая соль.
Другой вариант представляет собой соединение, имеющее следующую структуру:
в которой кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Ζ и X независимо представляют собой группы, выбранные из О, 8 и NЯ23;
Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=О), 8Я11, NНЯ11 и ОЯ11, где Я11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)Я12Я13, С(О)ОЯ12, С(О)1МЯ12Я13, Р(О)(ОЯ12)2, С(О)СНЯ12Я13, 8Я12 и 81Я12Я13Я14, где Я12, Я13 и Я14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где Я12 и Я13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, Я6 и Я7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
Я7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к
Я6, где X1 представляет собой уходящую группу;
Я5, Я5' и Я32 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоал- 7 019962 кила, галогена, ΝΟ2, ΝΚ15Κ16, ЫС(О)К15, ОС(О)ИК15К16, ОС(О)ОК15, С(О)К15, 8К15, ОК15, СК15=ЫК16 и
О(СН2)пМ(СН3)2;
η равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
или его фармацевтически приемлемая соль.
Дополнительный вариант представляет собой соединение, имеющее следующую структуру:
в которой кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Ζ и X независимо представляют собой группы, выбранные из О, 8 и ΝΚ23;
К23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
К4, К4, К5, К5 и К33 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΌ;. ΝΗ М'(О)К ОС(О)№15К16, ОС(О)ОК15, С(О)К15, 8К15, ОК15, СК ’ ΝΗ и
О(СН2)^(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из К4, К4, К5 и К5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп;
п равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов,
К33 содержит одну или несколько расщепляемых групп;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, К6 и К7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к К6, где X1 представляет собой уходящую группу; или его фармацевтически приемлемая соль.
Другой вариант представляет собой соединение, выбранное из
- 8 019962
- 9 019962
- 10 019962
*Нг
где г равно целому числу от 0 до 24.
Любое из этих соединений может использоваться в качестве или для формирования конъюгатов лекарственное средство-лиганд.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическим препаратам. Такие препараты обычно содержат соединение-конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способам применения соединений-конъюгатов по изобретению. Например, в изобретении предлагается способ уничтожения клеток, в котором конъюгатное соединение по изобретению вводят в клетку в количестве, достаточном, чтобы вызвать гибель клетки. В предпочтительном варианте клетка представляет собой опухолевую клетку. В другом варианте изобретения предлагается способ задержки или остановки роста опухоли у млекопитающего субъекта, где соединение-конъюгат по изобретению вводят субъекту в количестве, достаточном, чтобы замедлить или остановить рост опухоли.
Другие аспекты, преимущества и объекты изобретения станут понятными из обзора детального описания ниже.
Краткое описание чертежей
Не ограничивающие и не исчерпывающие варианты настоящего изобретения описаны со ссылкой на следующие фигуры. Номера на фигурах обозначают сходные части на всех фигурах, если не указано иное.
Для лучшего понимания настоящего изобретения будет приведена ссылка на подробное описание ниже, которое следует трактовать в связи с приложенными фигурами, где:
фиг. 1-3 представляют графики среднего объема опухоли, медианного объема опухоли и медианы % изменения массы тела соответственно по отношению к показателям дней после введения дозы в первом исследовании ίη νίνο;
фиг. 4-6 представляют графики среднего объема опухоли, медианного объема опухоли и медианы % изменения массы тела соответственно по отношению к показателям дней после введения дозы во втором исследовании ίη νίνο;
фиг. 7 содержит логистические кривые, аппроксимированные для различных конъюгатов антителотоксин и полученные значения ЕС50, в клетках ЕЫСаР и 786-0;
фиг. 8 показывает графики среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для третьего исследования ίη νίνο;
фиг. 9 показывает графики медианного изменения массы тела по отношению к показателям дней после введения дозы для третьего исследования ίη νίνο;
фиг. 10 показывает графики среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после вве
- 11 019962 дения дозы для четвертого исследования ίη νίνο;
фиг. 11 показывает графики медианного изменения массы тела по отношению к показателям дней после введения дозы для четвертого исследования ίη νίνο;
фиг. 12 показывает график среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для пятого исследования ίη νίνο;
фиг. 13 показывает график среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для шестого исследования ίη νίνο;
фиг. 14 показывает график среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для седьмого исследования ίη νίνο;
фиг. 15 показывает график среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для восьмого исследования ίη νίνο;
фиг. 16 показывает график среднего объема опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы для девятого исследования ίη νίνο.
Подробное описание изобретения
Сокращения
В изобретении приняты следующие обозначения и сокращения:
А1а - аланин;
Вос - трет-бутилоксикарбонил;
СР1 - циклопропапирролоиндол;
СЬ/ - карбобензокси;
ДХМ (ΌΟ’Μ) - дихлорметан;
ДДХ (ΌΌΟ) - 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон;
ДИПЭА (ΌΙΡΕΑ) - диизопропилэтиламин;
ДМДА (ΌΜΏΑ) - Ν,Ν'-диметилэтилендиамин;
КДК (ЯВР) - круглодонная колба;
ДМФА (ΌΜΡ) - Ν,Β-диметилформамид;
ГАТУ (НАТи) - №[[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1-ил]метилен]-Ыметилметанаминия гексафторфосфат Ν-оксид;
символ Е представляет собой ферментно расщепляемую группу;
ЭДКИ (ΈΌΟΊ) - 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид;
РМОС - 9-флуоренилметилоксикарбонил;
НОАГ - 7-аза-1-гидроксибензотриазол;
Ьеи - лейцин;
ПАБК (РАВА) - парааминобензойная кислота;
ПЭГ (РЕС) - полиэтиленгликоль;
ДБУ (ϋΒϋ) - 1,8-диазабицикло(5,4,0)ундец-7-ен;
ДИЭА(О1ЕА) - диизопропилэтиламин;
ПМБ (РМВ) - параметоксибензил;
ТБАФ (ТВАР) - тетрабутиламмония фторид;
ТБСО (ТВ8О) - трет-бутилдиметилсилиловый эфир;
ТЭА (ТЕА) - триэтиламин;
ТФУ (ТРА) - трифторуксусную кислоту;
ЭДК (ΕΌ0) - (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид);
ТБТУ (ТВТИ) - (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат);
ГОБТ (НОВТ) - Ν-гидроксибензотриазол;
символ Ц представляет собой терапевтическое средство, диагностическое средство или определяемую метку.
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, в целом имеют такое же значение, какое им обычно придает средний специалист в области, к которой относится данное изобретение. В целом, номенклатура, используемая в данном описании, и лабораторные методики в области культивировании клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии нуклеиновых кислот, а также гибридизации, описанные ниже, хорошо известны и обычно применяются в уровне техники. Стандартные методы применяются для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов. В общем, ферментные реакции и стадии очистки выполняются в соответствии со спецификациями производителей. Методы и методики, в общем, выполняются в соответствии с обычными методами из уровня техники и различными источниками общего характера (в общем см. БатЬгсюк е1 а1. ΜοΚαιΙοΓ ΟΊοηίη§: А ^аЬο^аΐο^у Маниок 2'1 еб. (1989), ^16 8рг1нд ΗοΦογ ^аЬο^аΐο^у Рге§8, СЫй 8рг1нд ΗοΦογ. Ν.Υ., которое включено в данное описание путем ссылки), приведенными в данном документе. Номенклатура, используемая в данном описании и описании лабораторных методик в области аналитической химии и органического синтеза, приведенных ниже, хорошо известна и обычно применяется в уровне техники. Стандартные методы или их модификации применяются для химического синтеза и химических анализов.
- 12 019962
Термин терапевтическое средство обозначает соединение, которое в терапевтически эффективном количестве осуществляет желательное терапевтическое действие на млекопитающее. Для лечения раковых новообразований желательно, чтобы терапевтическое средство также обладало способностью входить в клетку-мишень.
Термин цитотоксин обозначает терапевтическое средство, оказывающее желательное воздействие, т.е. цитотоксическое действие на раковые клетки. Цитотоксическое означает, что средство останавливает рост или вызывает гибель клеток. Модельные цитотоксины включают, например, не ограничиваясь ими, комбретастатин, дуокармицины, противоопухолевые антибиотики СС-1065, антрациклины и родственные соединения. Другие цитотоксины включают микотоксины, рицин и его аналоги, калихеамицины, доксирубицин и мейтанзиноиды.
Термин пролекарство и термин конъюгат лекарственного средства применяются в данном описании равнозначным образом. Оба термина обозначают соединение, в форме конъюгата относительно безобидное для клеток, которое выборочно разлагается до фармакологически активной формы в определенных условиях, например ферменты, расположенные в пределах или поблизости клеток-мишеней.
Термин маркер обозначает соединение, пригодное для характеристики опухолей или другого медицинского состояния, например диагностики, контроля прогрессирования опухоли и анализа факторов, выделяемых клетками опухоли. Маркеры рассматриваются как подмножество диагностических средств.
Термин селективный при использовании в связи с ферментным расщеплением означает, что скорость расщепления линкерного фрагмента превышает скорость расщепления пептида со случайной последовательностью аминокислот.
Термины направляющая группа и направляющее средство обозначают фрагмент, который (1) способен направлять соединение, к которому он присоединен (например, терапевтическое средство или маркер), к клетке-мишени, например к определенному виду опухолевых клеток; или (2) предпочтительно активизируется в целевой ткани, например опухолевой. Нацеливающая группа или направляющее средство может представлять собой низкомолекулярное соединение, которое включает соединения как не пептидной, так и пептидной природы. Нацеливающая группа также может представлять собой макромолекулу, что включает сахариды, лектины, рецепторы, лиганд для рецепторов, белки, например альбумин телячьей сыворотки, антитела и т.д. В предпочтительном варианте настоящего изобретения направляющая группа представляет собой антитело или фрагмент антитела, более предпочтительно моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела.
Термин саморазрушающийся спейсер обозначает бифункциональный химический фрагмент, способный ковалентно связывать два химических фрагмента в молекулу из 3 частей с обычной стабильностью. Саморазрушающийся спейсер способен самопроизвольно отделяться от второго фрагмента, если расщепляется связь с первым фрагментом.
Термин определяемая метка обозначает фрагмент, проявляющий определяемое физическое или химическое свойство.
Термин расщепляемая группа обозначает нестабильный ίη νίνο фрагмент. Предпочтительно расщепляемая группа позволяет активацию маркера или терапевтического средства путем отщепления маркера или средства от остальной части конъюгата. Функционально определенный, линкер предпочтительно расщепляется ίη νίνο биологическим окружением. Расщепление может быть результатом какоголибо процесса, например, не ограничиваясь ими, ферментного, восстановительного, рН и т.п. Предпочтительно расщепляемая группа выбрана таким образом, что активация происходит в целевом местоположении воздействия, которое может представлять собой участок в клетках- или тканях-мишенях или около них (например, клетки карциномы), или, например, на участке терапевтического воздействия или активности маркера. Такое расщепление может быть ферментным, и примеры расщепляемых ферментами групп включают природные аминокислоты или пептидные последовательности, которые заканчиваются природной аминокислотой, и присоединены к карбоксильному концу линкера. Хотя степень увеличения скорости расщепления не критична для изобретения, предпочтительными примерами расщепляемых линкеров являются такие, в которых как минимум около 10% расщепляемых групп расщепляются в кровотоке в пределах 24 ч после введения, наиболее предпочтительно как минимум около 35%.
Термин лиганд подразумевает любую молекулу, которая специфично связывается или вступает в реакцию образования ассоциатов или комплексов с рецептором, субстратом, антигенным детерминантом или другим сайтом связывания на клетке- или ткани-мишени. Примеры лигандов включают антитела и их фрагменты (например, моноклональное антитело или его фрагмент), ферменты (например, фибринолитические ферменты), модификаторы биологического ответа (например, интерлейкины, интерфероны, эритропоэтин или колониестимулирующие факторы), пептидные гормоны, а также их антигенсвязывающие фрагменты.
Термин реакция циклизации, используемый в связи с циклизацией пептида, гидразина или дисульфидного линкера, указывает на циклизацию линкера в кольцо и инициирует разделение комплекса лекарственное средство-лиганд. Его скорость может быть измерена ех 8Йи, и процесс завершается с образованием как минимум 90, 95 или 100% продукта.
- 13 019962
Термины полипептид, пептид и белок используются в данном описании равнозначным образом для обозначения полимера из остатков аминокислот. Термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько остатков аминокислоты представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к полимерам природных аминокислот и полимеру не встречающихся в природе аминокислот. Эти термины также включают термин антитело.
Термин аминокислота обозначает аминокислоты природного и синтетического происхождения, а также аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые функционируют сходным образом с аминокислотами природного происхождения. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, впоследствии модифицированные, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот обозначают соединения с такой же базовой химической структурой, как у природных аминокислот, т.е. α-атом углерода, связанный с атомом водорода, карбоксильной группой, аминогруппой и группой В, например гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метилсульфоний. В таких аналогах модифицированы группы В (например, норлейцин) или модифицированы скелеты пептида, но сохранена такая же базовая химическая структура, как в природных аминокислотах. Одной из подходящих аминокислот является, в частности, цитруллин, представляющий собой прекурсор аргинина и участвующий в образовании мочевины в печени. Миметики аминокислот обозначают химические соединения со структурой, отличной от общей химической структуры аминокислоты, но с функцией подобной природной аминокислоте. Термин не встречающаяся в природе аминокислота обозначает стереохимическую форму Ό 20 природных аминокислот, описанных выше. Кроме того, следует понимать, что термин не встречающаяся в природе аминокислота включает гомологи природных аминокислот и синтетически измененные формы природных аминокислот. Синтетически измененные формы включают, не ограничиваясь ими, аминокислоты с укороченными или удлиненными на 1-2 атома углерода алкиленовыми цепями, аминокислоты, содержащие необязательно замещенные арильные группы, и аминокислоты, содержащие галогенированные группы, предпочтительно галогенированные алкильные и арильные группы. При присоединении к линкеру или конъюгату по изобретению, аминокислота находится в форме аминокислоты боковой цепи, где группа карбоновой кислоты в аминокислоте заменена кетогруппой [С(О)]. Таким образом, например, аланиновая боковая цепь представляет собой -С(О)-СΗ(NΗ2)-СΗ3 и т.д.
Аминокислоты и пептиды могут быть защищены блокирующими группами. Блокирующая группа представляет собой атом или химический фрагмент, который защищает Ν-конец аминокислоты или пептида от нежелательных реакций и может использоваться в ходе синтеза конъюгата лекарственное средство-лиганд. Он должен оставаться присоединенным к Ν-концу в ходе синтеза и может быть удален после завершения синтеза конъюгата лекарственного средства химическими или другими средствами, которые обеспечивают его селективное удаление. Блокирующие группы, подходящие для защиты Ν-конца, хорошо известны из уровня техники в области химии пептидов. Примеры блокирующих групп включают, не ограничиваясь ими, водород, Ό-аминокислоту и карбобензоксихлорид (СЬх).
Нуклеиновая кислота обозначает дезоксинуклеотиды или рибонуклеотиды и их полимеры в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Этот термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные остатки оснований скелета или связи, которые являются синтетическими, природными и неприродными, обладающие сходными свойствами связывания с эталонной нуклеиновой кислотой, которые метаболизируются до некоторой степени сходным образом с эталонными нуклеотидами. Примеры таких аналогов включают, не ограничиваясь ими, фосфортиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК).
Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в неявной форме включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены с вырождением кодонов) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. Конкретно, замены с вырождением кодонов могут быть осуществлены генерацией последовательностей, в которых третье положение одного или несколько выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Ва1хсг е! а1., Νιιοίοίο Λοίά Век. 19: 5081 (1991); ОЫзика е! а1., 1. ΒίοΙ. СНеш. 260: 2605-2608 (1985); ВоззоБш е! а1., Μοί. Се11. РгоЬез 8: 91-98 (1994)). Термин нуклеиновая кислота используется равнозначным образом с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид.
Обозначение 'ννν, используемое как связь или показанное перпендикулярно к связи, указывает точку, в которой показанный фрагмент присоединен к остатку молекулы, твердой подложке и т.п.
Термин алкил, отдельно или как часть другого заместителя, обозначает, если не указано иное, углеводородный радикал с неразветвленной или разветвленной цепью, или циклический, или их комбинацию, который может быть полностью насыщенным, моно- или полиненасыщенным, и может включать ди- и поливалентные радикалы, содержащие указанное количество атомов углерода (т.е. С'-С10 подразумевает от 1 до 10 атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, не ог
- 14 019962 раничиваясь ими, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенная алкильная группа - это группа, содержащая одну или несколько двойных или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, не ограничиваясь ими, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(6утадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил, а также их и высшие гомологи и изомеры. Термин алкил, если не указано иное, также предназначен включать производные алкила, определенные более подробно ниже, такие как гетероалкил. Алкильные группы, которые ограничены углеводородными группами, носят название гомоалкил.
Термин алкилен, отдельно или как часть другого заместителя, подразумевает двухвалентный радикал, происходящий от алкана, например, не ограничиваясь им, -СН2СН2СН2СН2-, и дополнительно включает группы, описанные ниже как гетероалкилен. Обычно алкильная (или алкиленовая) группа будет содержать от 1 до 24 атомов углерода, причем группы, содержащие 10 или меньше атомов углерода, в настоящем изобретении предпочтительны. Низший алкил или низший алкилен - это алкильная или алкиленовая группа с более короткий цепью, в общем содержащая 8 или меньше атомов углерода.
Термин гетероалкил, отдельно или в комбинации с другим термином, обозначает, если не указано иное, стабильный углеводородный радикал с неразветвленной или разветвленной цепью, или циклический, или их комбинацию, содержащий указанное количество атомов углерода и как минимум один, гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где атомы азота, углерода и серы необязательно могут быть окисленными, и гетероатом азота необязательно может быть четвертичным. Г етероатом(ы) О, Ν, 8 и 81 могут размещаться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы или в положении, в котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примеры включают, не ограничиваясь ими, -СН2-СН2-О-СН3, -СН2-СН2-ПН-СН3, -СН2-СН2^(СН3)-СН3, -СН2-8-СН2-СН3, -СН2-СН2, -8(О)-СН3, -СН2-СН2-8(О)2-СН3, -СН=СН-О-СН3, -81(^3)3, -СН2-СН=^ОСН и
-СН=СН-Н(СН3)-СН3. До двух гетероатомов могут быть размещены последовательно, например, -СН2-ПН-ОСН3 и -СН2-О-81(СН3)3. Также термин гетероалкилен, отдельно или как часть другого заместителя, подразумевает двухвалентный радикал, происходящий от гетероалкила, например, не ограничиваясь ими, -СН2-СН2-8-СН2-СН2- и -СН2-8-СН2-СН2-ПН-СН2-. В случае гетероалкиленовых групп, гетероатомы также могут занимать один оба конца цепи (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т.п.). Термины гетероалкил и гетероалкилен включают поли(этиленгликоль) и его производные (см., например, 811саг\\а1сг Ро1утег5 Са1а1од, 2001). Кроме того, для мостиковых алкиленовых и гетероалкиленовых групп, направление, в котором записана формула мостиковой группы, не подразумевает никакой конкретной ориентации мостиковой группы. Например, формула С(О)2Я' представляет как -С(О)2Я'-, так и -Я'С(О)2.
Термин низший в сочетании с терминами алкил или гетероалкил обозначает фрагмент, содержащий от 1 до 6 атомов углерода.
Термины алкокси, алкиламино, алкилсульфонил и алкилтио (или тиоалкокси) используются в их обычном значении и обозначают алкильные группы, присоединенные к остатку молекулы через кислородный атом, аминогруппу, группу 8О2 или атом серы соответственно.
Термин арилсульфонил обозначает арильную группу, присоединенную к остальной части молекулы через группу 8О2, и термин сульфгидрильный обозначает группу 8Н.
В целом, ацильный заместитель также выбирается из группы, указанной выше. В данном описании термин ацильный заместитель обозначает группы, присоединенные к и занимающие валентность карбонильного атома углерода, который прямо или косвенно присоединен к полициклическому ядру соединений по настоящему изобретению.
Термины циклоалкил и гетероциклоалкил, отдельно или в комбинации с другими терминами, обозначают, если не указано иное, циклические версии замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила соответственно. Дополнительно, в случае гетероциклоалкила гетероатом может занять положение, в котором гетероцикл присоединен к остатку молекулы. Примеры циклоалкила включают, не ограничиваясь ими, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкила включают, не ограничиваясь ими, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п. Атомы гетероатомов и углерода в циклических структурах необязательно окислены.
Термин галоген, отдельно или как часть другого заместителя, обозначают, если не указано иное, атом фтора, хлора, брома или йода. Дополнительно, такие термины, как галогеналкил предназначены включать моногалогеналкил и полигалогеналкил. Например, галоген(С1-С4)алкил предназначен включать, не ограничиваясь ими, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил и т.п.
Термин арил обозначает, если не указано иное, замещенный или незамещенный полиненасыщенный, ароматический, углеводородный заместитель, который может представлять собой одинарное кольцо или несколько колец (предпочтительно от 1 до 3 колец), конденсированных или связанных ковалент
- 15 019962 ной связью. Термин гетероарил обозначает арильные группы (или кольца), которые содержат от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из Ν, О и 8, где атомы азота, углерода и серы необязательно окислены, и атом(ы) азота необязательно являются четвертичными.
Гетероарильная группа может быть присоединена к остатку молекулы через гетероатом. Не ограничивающие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил,
1- пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил,
2- тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил и 6-хинолил. Заместители для каждой из вышеуказанных арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы приемлемых заместителей, описанной ниже. Арил и гетероарил также включают системы колец, где одно или несколько неароматических колец в системе конденсированы или другим способом связаны с арильной или гетероарильной системой.
Для краткости, термин арил при использовании в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил) включает как арильные, так и гетероарильные кольца, как определено выше. Таким образом, термин арилалкил предназначен включать те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил, пиридилметил и т.п.), включая те алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовой группы) заменен, например, атомом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).
Каждый из упомянутых выше терминов (например, алкил, гетероалкил, арил и гетероарил) включает как замещенные, так и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого вида радикала приведены ниже.
Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, которые часто называют алкиленом, алкенилом, петероалкиленом, гетероалкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гетероциклоалкилом, циклоалкенилом и гетероциклоалкенилом) в целом носят название заместители алкила и заместители гетероалкила соответственно, и они могут представлять собой одну или несколько разнообразных групп, выбранных из, но не ограничиваясь ими, 0Я', =0, =ΝΚ', =Ν-ΘΚ', -ΝΚ'Κ, -8Я', -галоген, -81Я'ЯЯ', -0С(0)Я', -С(0)Я', -С02Я', -ΟΘΝΚ'Κ, -00(0)ΝΚ'Κ, -ΝΚ0(Θ)Κ', -ΝΚ'-0(0)ΝΚΚ', -ЫКС(0)2К', -НЯ-С(НЯ'Я)=НЯ', -8(0)Я', -8(0)2Я', -8(0)2ΝΚ'Κ, -ΝΚ802Κ', -СН и -Ν02 в количестве от нуля до (2т'+1), где т' равно общему количеству атомов углерода в таком радикале. Каждый из Я', Я, Я' и Я предпочтительно независимо обозначает водород, замещенные или незамещенные гетероалкильные, замещенные или незамещенные арильные, например арильные, замещенные 1-3 атомами галогена, замещенные или незамещенные алкильные, алкокси или тиоалкокси группы, или арилалкильные группы. Если соединение по изобретению содержит более чем одну группу Я, например, каждая из групп Я независимо выбирается из групп Я', Я, Я' и Я, если присутствует более чем одна из этих групп. Если Я' и Я присоединены к одному и тому же атому азота, они могут быть соединены с атомом азота с образованием 5-, 6-, или 7-членного кольца. Например, -НЯ'Я предназначен включать, не ограничиваясь ими, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. На основе приведенного обсуждения заместителей, специалисту в данной области будет понятно, что термин алкил предназначен включать группы, в том числе атомы углерода, связанные с группами, кроме атомов водорода, например галогеналкил (например, -СЕ3 и -СН2СЕ3) и ацил (например, -С(0)СН3, -С(0)СЕ3, -С(0)СН20СН3 и т.п.).
Подобно заместителям, описанным для алкильного радикала, заместители арила и заместители гетероарила, в целом, носят название заместителей арила и заместителей гетероарила соответственно и варьируют и выбирают из, например, галогена, -0Я', =0, =НЯ', =Х-0Я', -ΝΕΈ. -8Я', -галогена, -81Я'ЯЯ', -0С(0)Я', -С(0)Я', -С02Я', -С0НЯ'Я, -ОСЕНЯЯ, -НЯС(0)Я', -НЯ'-С(0)НЯЯ', -НЯС(0)2Я', -NЯ-С(NЯ'Я)=NЯ', -8(0)Я', -8(0)2Я', -8(0)2НЯ'Я, -НЯ802Я', -СМ и -Ν02, -Я', -Ν3, -СН(Рй)2, фтор(С1-С4)алкокси и фтор(С4-С4)алкил в количестве от нуля до общего количества открытых валентностей на системе ароматических колец; где Я', Я, Я' и Я предпочтительно независимо выбирают из водорода, (С1-С8)алкила и гетероалкила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенный арил)-(С1-С4)алкила и (незамещенный арил)окси(С4-С4)алкил. Если соединение по изобретению содержит более чем одну группу Я, например, каждая из групп Я выбирается независимо из групп Я', Я, Я' и Я, если присутствует более чем одна из этих групп.
Два из заместителей арила при смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены на заместитель формулы -Т-С(О)-(СЯЯ')ч-и-, где Т и и независимо представляют собой -ИЯ-, -0-, -СЯЯ'- или одинарную связь и μ равно целому числу от 0 до 3. Альтернативно, два из заместителей при смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены на заместитель формулы -А-(СН2)Г-В-, где А и В независимо представляют собой -СЯЯ'-, -0-, -НЯ-, -8-, -8(0)-, -8(0)2-, -8(0)2ΝΡ'- или одинарную связь и г равно целому числу от 1 до 4. Одна из одинарных связей образованного таким образом нового кольца может быть необязательно заменена двойной связью. Альтернативно, два из заместителей при смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -(СЯЯ')к-Х-(СЯЯ')б-, где к и б независимо
- 16 019962 равны целым числам от 0 до 3 и X представляет собой -0-, -ΝΚ'-, -8-, -8(0)-, -8(0)2-или -8(0)2ΝΚ'-. Заместители К, К', К и К' предпочтительно независимо выбираются из водорода и замещенного или незамещенного (С1-С6)алкила.
В данном описании термин дифосфат включает, не ограничиваясь им, эфир фосфорной кислоты, содержащей две фосфатные группы. Термин трифосфат включает, не ограничиваясь им, эфир фосфорной кислоты, содержащей три фосфатные группы. Например, конкретные лекарственные средства, содержащие дифосфат или трифосфат, включают
В данном описании термин гетероатом включает кислород (О), азот (Ν), серу (8) и кремний (81).
Обозначение К - это общее сокращение, которое представляет группу заместителя, которую выбирают из замещенных или незамещенных алкильных, замещенных или незамещенных гетероалкильных, замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклильных групп.
Термин фармацевтически приемлемый носитель в данном описании обозначает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, принимающий участие в переноске или транспорте химического средства.
Фармацевтически приемлемые носители включают фармацевтически приемлемые соли, где термин фармацевтически приемлемые соли включает соли активных соединений с относительно нетоксичными кислотами или основаниями, в зависимости от конкретных заместителей, содержащихся в соединениях, описанных в данном описании. Если соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислую функциональную группу, основно-аддитивные соли могут быть получены путем обеспечения контакта нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желательного основания, в не разведенном виде или в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых основно-аддитивных солей включают соли натрия, калия, кальция, аммония, органических аминов или магния, и подобные соли. Если соединения по настоящему изобретению содержат относительно основную функциональную группу, кислотно-аддитивные соли могут быть получены путем обеспечения контакта нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желательной кислоты, в не разведенном виде или в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей включают полученные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромоводородная, азотная, угольная, одноосновная соль угольной кислоты, фосфорный, одноосновная соль фосфорной кислоты, двухосновная соль фосфорной кислоты, серная, одноосновная соль серной кислоты, йодоводородная или фосфористые кислоты и т.п., а также соли, полученные из относительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, яблочная, малоновая, бензойная, янтарная, суберовая, фумаровая, молочная, манделовая, фталевая, бензолсульфоновая, п-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и т.п. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и т.п., и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуроновая кислота и т.п. [см., например, Вегде с1 а1., Р11агтассиНеа1 8аПк, ,ΙοιίΓηαΙ ο£ Р11агтассиНеа1 8οίοηοο. 1977, 66, 1-19). Некоторые конкретные соединения по настоящему изобретению содержат как основные, так и кислотные функциональные группы, которые позволяют соединениям превращаться как в основно-аддитивные, так и в кислотно-аддитивные соли.
Нейтральные формы соединений предпочтительно регенерируют, обеспечивая контакт соли с основанием или кислотой и выделяя исходное соединение в обычной форме. Форма исходного соединения отличается от различных солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в других отношениях соли равноценны форме исходного соединения для целей настоящего изобретения.
В дополнение к солевым формам настоящее изобретение обеспечивает соединения, которые находятся в форме пролекарства. Пролекарства соединений, описанных в данном описании, представляют
- 17 019962 собой соединения, которые легко подвергаются химическим изменениям в физиологических условиях, чтобы обеспечить соединения по настоящему изобретению. Дополнительно, пролекарства могут быть превращены в соединения по настоящему изобретению химическими или биохимическими методами в окружении ех νίνο. Например, пролекарства могут быть медленно превращены в соединения по настоящему изобретению при помещении в резервуаре трансдермального пластыря с подходящим ферментным или химическим реактивом.
Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в не сольватированных формах, а также в сольватированных формах, в том числе в гидратированных формах. В целом, сольватированные формы равноценны не сольватированным формам и находятся в пределах контекста настоящего изобретения. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в многочисленных кристаллических или аморфных формах. В целом, все физические формы равноценны с точки зрения применения, предусмотренного настоящим изобретением, и находятся в пределах контекста настоящего изобретения.
Некоторые соединения по настоящему изобретению содержат асимметрические атомы углерода (оптические центры) или двойные связи; рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры и отдельные изомеры находятся в пределах контекста настоящего изобретения.
Соединения по настоящему изобретению могут также содержать неприродные пропорции атомных изотопов для одного или несколько атомов, из которых состоят такие соединения. Например, соединения могут содержать метку в виде радиоактивного изотопа, такого как тритий (3Н), йод-125 (1251) или углерод-14 (14С). Все изотопные вариации соединений по настоящему изобретению, радиоактивный или нет, находятся в пределах контекста настоящего изобретения.
Термин присоединяющий фрагмент или фрагмент для присоединения направляющей группы обозначает фрагмент, который позволяет присоединение направляющей группы к линкеру. Типичные присоединяющие группы включают, для иллюстрации и, не ограничиваясь ими, алкил, аминоалкил, аминокарбонилалкил, карбоксиалкил, гидроксиалкил, алкилмалеимид, алкил-№гидроксилсукцинимид, поли(этиленгликоль)-малеимид и поли(этиленгликоль)-№гидроксисукцинимид, все из которых могут быть дополнительно замещены. Линкер может также содержать присоединяющий фрагмент, фактически присоединенный к направляющей группе.
В данном описании термин уходящая группа обозначает часть субстрата, которая отщепляется от субстрата в ходе реакции.
Термин антитело в данном описании включает антитела целиком и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающая часть) или их одинарные цепи. Антитело обозначает гликопротеин, содержащий как минимум две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (УН) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3 и может принадлежать к мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон изотипу. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (Уь) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, Съ, который может принадлежать к каппа или лямбда изотипу. Участки УН и Уъ могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, которые носят название определяющих комплементарность участков (СОК), перемежающиеся более консервативными участками, которые носят название каркасных участков (РК). Каждый УН и Уъ состоит из трех СОК и четырех РК, организованных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СОК3, РК4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первым компонентом (С1с|) классической системы комплемента.
Термины фрагмент антитела или антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела) в данном описании обозначают один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов в пределах терминов фрагмент антитела или антигенсвязывающая часть антитела, включают (ί) РаЬ фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уъ, УН, Сь и СН1; (ίί) фрагмент Р(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; (ш) фрагмент Р6, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) фрагмент Рν, состоящий из доменов Уъ и УН одного плеча антитела, (ν) фрагмент 6АЬ (^атб е! а1. (1989), №11иге. 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) изолированный участок, определяющий комплементарность (СОК). Кроме того, хотя два домена фрагмента Рν, Уъ и УН, кодируют отдельные гены, они могут быть соединены, с использованием рекомбинантных методов, синтетическим линкером, который дает им возможность существовать в виде одноцепочечного белка, в котором пара участков Уъ и УН образуют одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Рν (5сГу); см., например, Βίτά е! а1. (1988), 8с1епсе, 242: 423-426 апб Нийоп е! а1. (1988), Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 85: 5879-58831. Такие одноцепочечные антитела также находятся в
- 18 019962 пределах термина антигенсвязывающая часть антитела. Такие фрагменты антитела получают, используя обычные методы, известные специалисту в данной области, и проводят скрининг фрагментов в такой же форме, как и для интактных антител.
Термин моноклональное антитело в данном описании обозначает препарат молекул антитела одинакового молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует одинаковую специфичность связывания и сродство в отношении конкретного эпитопа.
Для получения моноклональных или поликлональных антител может применяться любая техника, известная из уровня техники (см., например, КоЫег & МИЧет, №11игс 256: 495-497 (1975); КохЬог е! а1., 1тшипо1оду Тобау 4: 72 (1983); Со1е е! а1., р. 77-96 в Мопос1опа1 ЛпНЬоШек апб Сапсег Тйегару, А1ап Я. Ь188, 1пс. (1985)).
Методы продуцирования поликлональных антител известны специалисту в данной области. Инбредный штамм мышей (например, мыши ВАЬВ/С) или кроликов иммунизируют белком, используя стандартный адъювант, такой как адъювант Фрейнда, и стандартный протокол иммунизации. Иммунный ответ животного на иммуногенный препарат контролируют, отбирая тестовые образцы крови и определяя титр реактивности бета-субъединиц. Если получены подходящие высокие титры антител к иммуногену, кровь животного собирают и готовят антисыворотки. Дальнейшее фракционирование антисывороток для обогащения антителами, реакционноспособными в отношении белка, может быть осуществлено при желании.
Моноклональные антитела могут быть получены различными методами, знакомыми специалистам в данной области. Если коротко, клетки селезенки животного, иммунизированного целевым антигеном, делают бессмертными, обычно путем слияния с клеткой миеломы (см. КоЫег & МПЧет, Еиг. 1. 1ттипо1. 6: 511-519 (1976)). Альтернативные методы получения бессмертных клеток включают трансформацию с помощью вируса Эпштейна-Барр, онкогенов или ретровирусов или другие методы, хорошо известные из уровня техники.
В предпочтительном варианте антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело. Химерные или гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть получены на основании последовательности мышиного моноклонального антитела. ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, может быть получена из целевой мышиной гибридомы и сконструирована таким образом, чтобы содержать последовательности не мышиного (например, человеческого) иммуноглобулина, с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Например, чтобы создать химерное антитело, мышиные вариабельные участки могут быть присоединены к человеческим константным участкам, с использованием методов, известных из уровня техники (см. например, патент США 4816567, выданный СаЬШу е! а1.,). Для создания гуманизированного антитела, мышиные участки СЭЯ могут быть вставлены в человеческую структуру с использованием методов, известных из уровня техники (см., например, патент США 5225539, выданный \Ут1ег, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Циееп е! а1.).
В другом предпочтительном варианте антитело представляет собой человеческое антитело. Такие человеческие антитела могут генерироваться путем иммунизации трансгенных или трансхромосомных мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулина мыши инактивированы, и введены экзогенные гены человеческого иммуноглобулина. Такие мыши известны из уровня техники (см., например, патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; выданные ЬопЬегд и Кау; патенты США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданные Кисйег1арай е! а1.; и РСТ публикацию РО 02/43478, 1§Ыба е! а1.) Человеческие антитела также могут быть получены с использованием методов показа фага для скрининга библиотек человеческих генов иммуноглобулина. Такие методы дисплея фага для выделения человеческих антител также известны из уровня техники (см., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698, выданные Ьабпег е! а1.; патенты США 5427908 и 5580717, выданные Оо\\ег е! а1.; патенты США 5969108 и 6172197, выданные МсСаГГеПу е! а1.; и патенты США 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные бпййЬв е! а1.
Твердая подложка в данном описании обозначает материал, который является в существенной мере нерастворимым в выбранной системе растворителей или который может быть легко отделен (например, осаждением) от выбранной системы растворителей, в которой он растворим. Твердые подложки, подходящие для практики данного изобретения, могут содержать группы, которые активируются или способны к активации, чтобы позволить выбранным молекулам присоединиться к твердой подложке. Твердая подложка также может представлять собой субстрат, например микрочип, пластину или лунку, с которой связывается отдельное или несколько соединений по изобретению.
Реакционноспособная функциональная группа в данном описании обозначает группы, в том числе, но не ограничиваясь ими, олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галогениды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазо, диазоний, нитро, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, сульфеновые кислоты, изонитрилы, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, ортоэфиры,
- 19 019962 сульфиты, енамины, инамины, производные мочевины, псевдомочевины, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азиды, азосоединения, азоксисоединения и нитрозосоединения. Реакционноспособные функциональные группы также включают группы, используемые для получения биоконъюгатов, например Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, малеимиды и т.п. (см., например, Негтапкоп, Вюсоп]ида1е Тес1т1С|иек, Асабетк ргекк, 8ап О|едо, 1996). Способы получения каждой из указанных функциональных групп хорошо известны в данной области, и их применение или модификация для конкретной цели находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, 8апб1ег апб Каго, ебк. Огдашс Еипс!юпа1 Сгоир Ргерага!юпк, Асабетю Ргекк, 8ап И1едо, 1989). Реакционноспособные функциональные группы могут быть защищенными или незащищенными.
Соединения по изобретению получают в виде одинарного изомера (например, энантиомер, цистранс, изомер положения, диастереомер) или смеси изомеров. В предпочтительном варианте соединения получают как в существенной мере одинарный изомер. Способы получения в существенной мере изомерно чистых соединений известны из уровня техники. Например, энантиомерно обогащенные смеси и чистые энантиомерные соединения могут быть получены с использованием синтетических промежуточных соединений, которые являются энантиомерно чистыми, в комбинации с реакциями, которые оставляют стереохимию хирального центра неизменной или приводят к ее полной инверсии. Альтернативно, конечный продукт или промежуточные соединения вдоль пути синтеза могут быть разделены на одинарные стереоизомеры. Способы инверсии или сохранения конфигурации специфического стереоцентра и способы разделения смесей стереоизомеров хорошо известны из уровня техники, и навык выбора подходящего способа для конкретной специфической ситуации находится в пределах квалификации специалиста в данной области. См. для общей информации Еигшкк е! а1. (ебк.), Уоде1'к Епсус1ореб1а о£ РгасНса1 Огдашс СНет1к1гу 5* Еб., Ьопдтап 8с1епНДс апб Тес11шса1 Ь!б., Еккех, 1991, р. 809-816 и Не11ег, Асс. СНет. Кек. 23: 128 (1990).
Линкеры.
Настоящее изобретение предусматривает конъюгаты лекарственное средство-лиганд, где лекарственное средство связано с лигандом через химический линкер. В некоторых вариантах линкер представляет собой пептидильный линкер и изображается в данном описании как (Е4)р-Е-(Ь1)т. Другие линкеры включают гидразиновые и дисульфидные линкеры и изображаются в данном описании как (Е4)р-Н-(Ь1)т или (Ь4)р-1-(Ь1)т соответственно. В добавление к линкерам, присоединенным к лекарственному средству, в настоящем изобретении также предлагаются расщепляемые плечи линкера, подходящие для прикрепления, по существу, к любым видам молекул. Примером аспекта плеча линкера по изобретению в данном описании является ссылка на их прикрепление к терапевтическому фрагменту. Однако специалисту в данной области будет понятно, что линкеры могут быть присоединены к различным видам молекул, в том числе, не ограничиваясь ими, диагностическим средствам, аналитическим средствам, биологическим молекулам, направляющим агентам, определяемым меткам и т.п.
Использование пептидильных и других линкеров в конъюгатах лекарственное средство-лиганд описано во Временных патентных заявках США, серийные номера 60/295196; 60/295259; 60/295342; 60/304908; 60/572667; 60/661174; 60/669871; 60/720499; 60/730804; и 60/735657 и патентных заявках США, серийные номера 10/160972; 10/161234; 11/134685; 11/134826; и 11/398854, в патенте США 6989452 и патентной заявке РСТ под номером РСТ/И82006/37793, все из которых включены в данное описание путем ссылки.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к линкерам, пригодным для присоединения направляющих групп к терапевтическим средствам и маркерам. В другом аспекте изобретения предлагаются линкеры, которые придают стабильность соединениям, уменьшают их токсичность ш νί\Ό или оказывают другое благоприятное воздействие на их фармакокинетику, биодоступность и/или фармакодинамику. В общем, предпочтительно в таких вариантах, линкер расщепляется, высвобождая активное лекарственное средство, как только лекарственное средство доставлено к месту его действия. Таким образом, в одном варианте изобретения линкеры по изобретению не оставляют следов своего присутствия, таким образом, что после удаления с терапевтического средства или маркера (например, в ходе активации) следов присутствия линкера не остается.
В другом варианте изобретения линкеры характеризуются их способностью расщепляться на участке в непосредственной близости или около клетки-мишени, например в месте терапевтического действия или активности маркера. Такое расщепление может быть ферментным по своей природе. Такой признак помогает уменьшить системную активацию терапевтического средства или маркера, уменьшая токсичность и системные побочные эффекты. Предпочтительные расщепляемые группы для расщепления ферментами включают пептидные связи, эфирные связи и дисульфидные связи. В других вариантах линкеры чувствительны к рН и расщепляются при изменении рН.
Важный аспект настоящего изобретения представляет собой способность управлять скоростью, с которой расщепляются линкеры. Часто желателен линкер, который расщепляется быстро. В некоторых вариантах, однако, линкер, который расщепляется медленнее, может быть предпочтительным. Например, в препарате с замедленным высвобождением или в препарате с быстрым и медленным высвобождением компонента может быть полезно обеспечить линкер, который расщепляется медленнее. В VΟ 02/096910
- 20 019962 предлагается несколько конкретных комплексов лекарственное средство-лиганд, содержащих гидразиновый линкер. Однако отсутствует возможность настроить композицию линкера в зависимости от необходимой скорости циклизации, и в описанных конкретных соединениях лиганд отщепляется от лекарственного средства с более медленной скоростью, чем предпочтительная для многих конъюгатов лекарственное средство-линкер. И наоборот, гидразиновые линкеры по настоящему изобретению предусматривают интервал значений скорости циклизации, от очень быстрой до очень медленной, таким образом позволяя выбрать конкретный гидразиновый линкер, основываясь на желательной скорости циклизации. Например, очень быстрая циклизация может быть достигнута с помощью гидразиновых линкеров, которые образуют одинарное 5-членное кольцо при расщеплении. Предпочтительные значения скорости циклизации для целенаправленной доставки цитотоксического средства к клеткам достигаются с использованием гидразиновых линкеров, которые при расщеплении образуют два 5-членных кольца или одинарное 6-членное кольцо из линкера, содержащего две метильных группы в геминальном положении (присоединенные к одному и тому же атому). Показано, что влияние гем-диметила ускоряет скорость реакции циклизации по сравнению с одинарным 6-членным кольцом без двух метильных групп в геминальном положении. Это происходит в результате уменьшенного натяжения в кольце. Иногда, однако, заместители могут замедлять реакцию вместо ее ускорения. Часто причины замедления могут быть выявлены в стерических помехах. Как показано в примере 2.4, замена гем-диметила позволяет реакции циклизации протекать намного быстрее по сравнению с соединением, где углерод в геминальном положении представляет собой СН2.
Важно отметить, однако, что в некоторых вариантах линкер, который расщепляется медленнее, может быть предпочтительным. Например, в препарате с замедленным высвобождением или в препарате как с быстрым, так и медленным высвобождением компонента, может быть полезно обеспечить линкер, который расщепляется медленнее. В некоторых вариантах медленная скорость циклизации достигается использованием гидразиновых линкеров, которые при расщеплении образуют одинарное 6-членное кольцо, без гем-диметильного замещения, или одинарное 7-членное кольцо.
Линкеры также служат целям стабилизации терапевтического средства или маркера против деградации при нахождении в кровотоке. Этот признак обеспечивает существенное преимущество, поскольку такая стабилизация приводит к увеличению периода полувыведения из кровотока присоединенного средства или маркера. Линкер также служит целям аттенуации активности присоединенного средства или маркера, таким образом, что конъюгат проявляет относительно доброкачественные свойства при нахождении в кровотоке и оказывает желательный эффект, например токсический, после активации на участке целевого воздействия. Для конъюгатов терапевтического средства такой признак линкера служит целям улучшения терапевтического индекса средства.
Стабилизирующие группы предпочтительно выбирают таким образом, чтобы ограничить клиренс и метаболизм терапевтического средства или маркера ферментами, которые могут присутствовать в крови или не целевой ткани и, кроме того, выбирают таким образом, чтобы ограничить транспорт средства или маркера в клетки. Стабилизирующие группы служат целям блокирования разложения средства или маркера и могут также действовать для обеспечения других физических характеристик средства или маркера. Стабилизирующая группа также может улучшать стабильность средства или маркера в процессе хранения в форме препарата или субстанции.
В идеале, стабилизирующая группа пригодна для стабилизации терапевтического средства или маркера, если она служит целям защиты средства или маркера от разложения, что проверяется в процессе хранения средства или маркера в крови человека при 37°С на протяжении 2 ч, причем расщепление средства или маркера ферментами, присутствующими в крови человека в заданных условиях испытания составляет менее 20%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 2%.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, содержащим такие линкеры. Более конкретно, изобретение относится к пролекарствам, которые могут применяться для лечения заболевания, особенно для химиотерапии рака. Конкретно, использование линкеров, описанных в данном описании, предусматривают пролекарства, которые демонстрируют высокую избирательность действия, сниженную токсичность и улучшенную стабильность в крови в сравнении с пролекарством подобной структуры.
Линкеры по настоящему изобретению, описанные в данном документе, могут присутствовать в разнообразных положениях в пределах цитотоксического конъюгата.
Таким образом, предлагается линкер, который может содержать любую из многочисленных групп как часть цепи, которая будет расщепляться ίη νίνο, например в кровотоке со скоростью, которая превышает скорость для конструкций, где такие группы отсутствуют. Также предлагаются конъюгаты плеч линкера с терапевтическими и диагностическими средствами. Линкеры пригодны для образования пролекарственных аналогов терапевтических средств и обратного присоединения терапевтического или диагностического средства к направляющему агенту, определяемой метке или твердой подложке. Линкеры могут быть инкорпорированы в комплексы, которые включают цитотоксины по изобретению.
- 21 019962
В дополнение к расщепляемой пептидной, гидразиновой или дисульфидной группе, одна или несколько линкерных саморазрушающихся групп Ь1 необязательно вводится между цитотоксином и направляющим агентом. Такие линкерные группы могут также быть описаны как спейсерные группы и содержат как минимум две реакционноспособные функциональные группы. Обычно одна функциональная химическая группа спейсерного фрагмента связывается с функциональной химической группой терапевтического средства, например цитотоксина, в то время как другая функциональная химическая группа спейсерного фрагмента используется для образования связи с функциональной химической группой направляющего агента или расщепляемого линкера. Примеры химических функциональных групп спейсерного фрагмента включают гидрокси, меркапто, карбонильные, карбокси-, амино-, кето- и меркаптогруппы.
Саморазрушающиеся линкеры, представленные Ь1, в общем представляют собой замещенную или незамещенную алкильную, замещенную или незамещенную арильную, замещенную или незамещенную гетероарильную или замещенную или незамещенную гетероалкильную группу. В одном из вариантов алкильные или арильные группы могут содержать от 1 до 20 атомов углерода. Они также могут содержать полиэтиленгликольный фрагмент.
Примеры спейсерной группы включают, например, 6-аминогексанол, 6-меркаптогексанол, 10-гидроксидекановую кислоту, глицин и другие аминокислоты, 1,6-гександиол, β-аланин,
2- аминоэтанол, цистеамин (2-аминоэтантиол), 5-аминопентановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту,
3- малеимидобензойную кислоту, фталид, α-замещенные фталиды, карбонильную группу, эфиры аминаля, нуклеиновые кислоты, пептиды и т.п.
Спейсер может служить для введения дополнительной молекулярной массы и химической функциональной группы в комплекс цитотоксин-направляющий агент. В целом, дополнительная масса и функциональная группа будут влиять на период полувыведения из сыворотки и другие свойства комплекса. Таким образом, путем тщательного выбора спейсерных групп, могут быть получены комплексы цитотоксина с интервалом значений периода полувыведения из сыворотки.
Спейсер(ы), размещенный(е) в непосредственной близости от фрагмента лекарственного средства, также обозначают как (Ь1)ш, где т равно целому числу, выбранному из 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Если присутствует несколько спейсеров Ь1, могут применяться одинаковые или разные спейсеры. Ь1 может представлять собой любую саморазрушающуюся группу.
Ь4 представляет собой линкерный фрагмент, который предпочтительно обеспечивает повышенную растворимость или снижение агрегационных свойств конъюгата, в котором используется линкер, который содержит фрагмент или изменяет скорость гидролиза конъюгата. Линкер Ь4 не должен быть саморазрушающимся. В одном из вариантов фрагмент Ь4 представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный арил, незамещенный арил, замещенный гетероалкил или незамещенный гетероалкил, каждый из которых может быть неразветвленным, разветвленным или циклическим. Заместители могут представлять собой, например, низший (С1-С6)алкил, алкокси, алкилтио, алкиламино или диалкиламино. В некоторых вариантах Ь4 включает нециклический фрагмент. В другом варианте Ь4 включает любой положительно или отрицательно заряженный аминокислотный полимер, такой как полилизин или полиаргинин. Ь4 может включать такой полимер, как фрагмент полиэтиленгликоля. Дополнительно, лин4 кер Ь может включать, например, как компонент полимера, так и низкомолекулярный химический фрагмент.
В предпочтительном варианте Ь4 включает фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Длина фрагмента ПЭГ Ь4 может составлять от 1 до 50 единиц. Предпочтительно длина ПЭГ будет составлять 1-12 повторяющихся единиц, более предпочтительно 3-12 повторяющихся единиц, более предпочтительно 2-6 повторяющихся единиц или даже более предпочтительно 3 -5 повторяющихся единиц, и наиболее предпочтительно 4 повторяющиеся единицы. Ь4 может состоять исключительно из фрагмента ПЭГ, или может также содержать дополнительный замещенный или незамещенный алкил или гетероалкил. Полезно включить ПЭГ как часть фрагмента Ь4, чтобы увеличить растворимость комплекса в воде. Дополнительно, фрагмент ПЭГ уменьшает степень агрегации, которая может возникать в ходе конъюгации лекарственного средства с антителом. В некоторых вариантах Ь4 включает непосредственно присоединенный к Ν-концу (АА')с.
В20 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
Каждый из В25, В25, В26 и В26 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и к и ! независи- 22 019962 мо равны целым числам от 1 до 6. Предпочтительно Я20, Я25, Я25, Я26 и Я26 являются гидрофобными. В некоторых вариантах Я20 представляет собой Н или алкил (предпочтительно незамещенный низший алкил). В некоторых вариантах Я25, Я25, Я26 и Я26 независимо представляют собой Н или алкил (предпочтительно незамещенный С1-С4-алкил). В некоторых вариантах Я25, Я25, Я26 и Я26 все представляют собой Н.
В некоторых вариантах ΐ равно 1 и 5 равно 1 или 2.
Пептидные линкеры (Е).
Как обсуждалось выше, пептидильные линкеры по изобретению могут быть представлены общей формулой: (Е4)р-Е-(Ь1)т, где Е представляет часть линкера, включающую пептидильный фрагмент. В одном из вариантов часть Е необязательно включает дополнительный саморазрушающийся линкер(ы), Ь2, и карбонильную группу. В другом варианте часть Е включает аминогруппу и необязательную спейсерную группу(ы) Ь3.
Соответственно, в одном из вариантов конъюгат включает пептидильный линкер, содержащий структуру формулы (4) (4)
В данном варианте Ь1 представляет собой саморазрушающийся линкер, как изложено выше, и Ь4 является фрагментом, который предпочтительно обеспечивает повышенную растворимость или сниженные агрегационные свойства, или изменяет скорость гидролиза, как изложено выше. Ь2 представляет саморазрушающийся линкер(ы). Кроме того, т равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 и о и р независимо равны 0 или 1. АА1 представляет одну или несколько природных аминокислот и/или неприродные α-аминокислоты; с равно целому числу в интервале от 1 до 20. В некоторых вариантах с равно 2-5 или с равно 2 или 3.
В описанных выше пептидных линкерах по изобретению формулы (4) АА1 связан на аминоконце непосредственно с Ь4 или, если Ь4 отсутствует, непосредственно с группой X4 (т.е. направляющим агентом, определяемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В некоторых вариантах, если Ь4 присутствует, Ь4 не включает карбоксильную группу ацила, непосредственно присоединенную к Ν-концу (АА1)с. Таким образом, в таких вариантах карбоксильный фрагмент ацила не обязательно расположен непосредственно между Ь4 или X4 и АА1, как это необходимо для пептидных линкеров в соответствии с патентом США 6214345.
В другом варианте конъюгат, содержащий пептидильный линкер, включает структуру формулы (5):
В данном варианте Ь4 представляет собой фрагмент, который предпочтительно обеспечивает повышенную растворимость или сниженные агрегационные свойства или изменяет скорость гидролиза, как изложено выше; Ь3 представляет собой спейсерную группу, включающую первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу, и амин Ь3 образует амидную связь с боковой карбоксильной функциональной группой Ό, или карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной группой амина Ό; о и р независимо равны 0 или 1. АА1 представляет одну или несколько природных аминокислот и/или не встречающихся в природе α-аминокислот; с равно целому числу от 1 и 20. В данном варианте Ь1 отсутствует (т.е. т равно 0, представляет собой общую формулу).
В пептидных линкерах по изобретению описанной выше формулы (5) АА1 связан на Ν-конце непосредственно с Ь4 или, если Ь4 отсутствует, непосредственно с группой X4 (т.е. направляющим агентом, определяемой меткой, защищенной реакционноспособной функциональной группой или незащищенной реакционноспособной функциональной группой). В некоторых вариантах, если Ь4 присутствует, Ь4 не включает карбоксильную ацильную группу, непосредственно присоединенную к Ν-концу (АА1)с. Таким образом, в таких вариантах карбоксильный фрагмент ацила не обязательно расположен непосредственно между Е4 или X4 и АА1, как это необходимо для пептидных линкеров в соответствии с патентом США 6214345.
Саморазрушающийся линкер Ь2
Саморазрушающийся линкер Ь2 представляет собой бифункциональный химический фрагмент, способный ковалентно связывать вместе два отстоящих друг от друга химических фрагмента в молекулу из 3 частей с обычной стабильностью, высвобождая один из указанных размещенных химических фрагментов молекулы из 3 частей с помощью ферментного расщепления; причем после указанного ферментного расщепления происходит самопроизвольное отщепление от остальной части молекулы, для высвобождения второго из указанных размещенных химических фрагментов. В соответствии с настоящим изобретением саморазрушающийся спейсер ковалентно присоединен одним своим концом к пептидному
- 23 019962 фрагменту и ковалентно связан другим своим концом с химически реакционноспособным сайтом фрагмента лекарственного средства, дериватизация которого подавляет фармакологическую активность, таким образом, чтобы расположить в пространстве и ковалентно связать вместе пептидный фрагмент и фрагмент лекарственного средства в молекулу из 3 частей, стабильную и фармакологически инертную в отсутствие целевого фермента, но которая расщепляется под действием такого целевого фермента в месте связи, ковалентно связывающей спейсерный фрагмент и пептидный фрагмент, для высвобождения таким образом пептидного фрагмента из молекулы из 3 частей. Такое ферментное расщепление, в свою очередь, активизирует саморазрушающийся элемент спейсерного фрагмента и инициирует самопроизвольное расщепление связи, ковалентно связывающей спейсерный фрагмент с фрагментом лекарственного средства, чтобы таким образом осуществить высвобождение лекарственного средства в фармакологически активной форме.
Саморазрушающийся линкер Ь2 может представлять собой любую саморазрушающуюся группу. Предпочтительно Ь2 представляет собой замещенный алкил, незамещенный алкил, замещенный гетероалкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный гетероциклоалкил, замещенный гетероциклоалкил, замещенный и незамещенный арил, а также замещенный и незамещенный гетероарил.
Один из особенно предпочтительных саморазрушающихся спейсеров Ь2 может быть представлен формулой (6)
(6)
Ароматическое кольцо аминобензильной группы может быть замещено одной или несколькими группами К. Группа К представляет собой заместитель на ароматическом кольце, на который заменен водород, в противном случае присоединенный к одному из 4 незамещенных атомов углерода, которые представляют собой часть структуры кольца. Группа К может представлять собой одинарный атом, такой как галоген, или может представлять собой многоатомную группу, такую как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Каждый К независимо выбирают из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незаме щенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NО2, ΝΚ.21Κ.22, ЯК^СОЯ22, ОСОNЯ21Я22, ОСОЯ21 и ОЯ21, где Я21 и Я22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила и незамещенного гетероциклоалкила. Примеры заместителей К включают, не ограничиваясь ими, Р, С1, Вг, I, NО2, ОН, ОСН3, №НСОСН3, Ν(ΟΉ3);. ΝΗΟΌΟΈ3 и метил. Для Ка а равно целому числу 0, 1, 2, 3 или 4. В одном из предпочтительных вариантов а равно 0.
Эфирный атом кислорода показанной выше структуры соединен с карбонильной группой. Линия между функциональной группой ΝΒ24 и ароматическим кольцом показывает, что аминная функциональная группа может быть связана с любым из 5 атомов углерода, которые формируют кольцо и не замещены группой -СН2-О-. Предпочтительно функциональная группа ΝΒ24 фрагмента X ковалентно связана с ароматическим кольцом в пара-положении по отношению к группе -СН2-О-. Я24 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В конкретном варианте Я24 представляет собой водород.
В одном варианте изобретения предлагается пептидный линкер формулы (4) выше, где Р включает структуру
где Я24 выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, заме щенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила.
Каждый К представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NО2, ΝΒ Я , ΝΒ СОЯ , ОСОИЯ Я , 21 21 21 22
ОСОЯ21 и ОЯ21, где Я21 и Я22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила; а равно целому числу 0, 1, 2, 3 или 4.
- 24 019962
В другом варианте пептидный линкер формулы (4) выше включает -Е-(Ь1)т-, содержащий структу ру
где каждый из В24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила.
В некоторых вариантах саморазрушающийся спейсер Ь1 или Ь2 включает
где каждый из В17, В18 и В19 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила и \ν равно целому числу от 0 до 4.
В некоторых вариантах В17 и В18 независимо представляют собой Н или алкил (предпочтительно незамещенный С1-4 алкил). Предпочтительно В17 и В18 представляют собой С1-4 алкил, такой как метил или этил. В некоторых вариантах ν равно 0. Без желания привязываться к какой-либо конкретной теории, экспериментально было обнаружено, что циклизация такого конкретного саморазрушающегося спейсера происходит относительно быстро.
В некоторых вариантах Ь1 или Ь2 включает
К,
Спейсерная группа Ь3.
Спейсерная группа Ь3 отличается тем, что включает первичный или вторичный амин или карбоксильную функциональную группу, и амин группы Ь3 образует амидную связь с боковой карбоксильной функциональной группой Ό, или карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной аминогруппой Ό. Ь3 выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила или замещенного или незамещенного гетероциклоалкила. В предпочтительном варианте Ь3 включает ароматическую группу. Более предпочтительно Ь3 включает группу бензойной кислоты, анилиновую группу или индольную группу. Не ограничивающие примеры структур, которые могут служить в качестве спейсера -Ρ-ΝΗ- включают следующие структуры:
где Ζ представляет собой группу, выбранную из О, 8 и NΒ23, В23 представляет собой группу, вы- 25 019962 бранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
При расщеплении линкера по изобретению, содержащего Ь3, фрагмент Ь3 остается присоединенным к лекарственному средству Ό. Соответственно, фрагмент Ь3 выбирают таким образом, что его присутствие в присоединенном к Ό виде существенно не изменяет активности Ό. В другом варианте часть лекарственного средства Ό сама по себе функционирует как спейсер Ь3. Например, в одном из вариантов лекарственное средство Ό представляет собой производное дуокармицина, в котором фрагмент лекарственного средства функционирует как спейсер Ь3. Не ограничивающие примеры таких вариантов включают такие, в которых ΝΗ2-(Ε3)-Ό имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из
в которой Ζ представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΕ23, где К23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила; и группа ΝΗ2 на каждой структуре реагирует с (АА1)с с образованием -(ΛΛ'γ-ΝΗ-.
Пептидная последовательность АА1.
Группа АА1 представляет одинарную аминокислоту или несколько аминокислот, соединенных между собой амидными связями. Аминокислоты могут являться природными аминокислотами и/или неприродными α-аминокислотами.
Пептидная последовательность (АА')с с функциональной точки зрения представляет собой остаток амидирования одинарной аминокислоты (если с=1) или нескольких аминокислот, соединенных вместе амидными связями. Пептид по настоящему изобретению выбирают таким образом, чтобы направить катализируемое ферментами расщепление пептида ферментом на целевой участок в биологической системе. Например, для конъюгатов, которые нацеливают на клетку с помощью направляющих средств, и которые затем захватываются клеткой, выбирают пептид, который расщепляется одной или несколькими лизосомальными протеазами таким образом, что пептид расщепляется внутриклеточно в пределах лизосомы. Количество аминокислот в пределах пептида может варьировать от 1 до 20; но более предпочтительно будет составлять 2-8 аминокислот, 2-6 аминокислот или 2, 3 или 4 аминокислоты, включающие (АА')с. Пептидные последовательности, чувствительные к расщеплению конкретными ферментами или классами ферментов, хорошо известны из уровня техники.
Многие пептидные последовательности, которые расщепляются ферментами в сыворотке, печени, кишечнике и т.п., известны из уровня техники. Пример последовательности пептида по изобретению включает пептидную последовательность, которая расщепляется протеазой. Фокус нижеследующего обсуждения применения чувствительной к действию протеаз последовательности предназначен для ясности иллюстрации и не предназначен для ограничения контекста настоящего изобретения.
Если фермент, который расщепляет пептид, представляет собой протеазу, в целом линкер включает пептид, содержащий последовательность распознавания расщепления для протеазы. Последовательность распознавания расщепления для протеазы представляет собой определенную последовательность аминокислот, которая распознается протеазой в ходе протеолитического расщепления. Множество сайтов расщепления протеазой известны из уровня техники, и эти и другие сайты расщепления могут входить в
- 26 019962 линкерный фрагмент. См., например, Ма1ауозЫ е! а1. 8с1епсе 247: 954 (1990); Иипп е! а1. Ме!й. Еп/уто1. 241: 254 (1994); 8е1бай е! а1. Ме!й. Еп7уто1. 244: 175 (1994); ТйотЬепу, Ме!й. Еп7уто1. 244: 615 (1994); ХУеЬег е! а1. Ме!й. Еп7уто1. 244: 595 (1994); 8тйй е! а1. Ме!й. Еп/утоЕ 244: 412 (1994); Воиу1ег е! а1. Ме111. Епхуто1. 248: 614 (1995), Нагбу е! а1., в Ату1о1б Рго!ет Ргесигзог ίη Оеуе1ортеп1, Лдшд, апб АкЬетег'з И1зеазе, еб. Маз!егз е! а1. р. 190-198 (1994).
Аминокислоты пептидной последовательности (АА1)с выбирают на основании их чувствительности к селективному ферментному расщеплению специфическими молекулами, такими как связанная с опухолью протеаза. Используемые аминокислоты могут быть природными или неприродными аминокислотами. Они могут находиться в Ь- или Ό-конфигурации. В одном из вариантов используются как минимум три различные аминокислоты. В другом варианте используются только две аминокислоты.
В предпочтительном варианте пептидную последовательность (АА1)с выбирают на основании ее способности расщепляться лизосомальными протеазами, не ограничивающие примеры которых включают катепсины В, С, И, Н, Ь и 8. Предпочтительно пептидная последовательность (АА1)с способна расщепляться катепсином В ίη У1!го, что может быть проверено с использованием испытаний на расщепление протеазой ίη уйго, известных из уровня техники.
В другом варианте пептидную последовательность (АА1)с выбирают на основании ее способности расщепляться связанной с опухолью протеазой, такой как протеаза, найденная во внеклеточном пространстве в непосредственной близости от опухолевых клеток, не ограничивающие примеры которой включают тимет олигопептидазу (ТОП) и СИ10. Способность пептида расщепляться ТОП или СИ10 можно проверить с помощью испытаний на расщепление протеазой ίη У1!го, известных из уровня техники.
Подходящие, но не ограничивающие, примеры пептидных последовательностей, пригодных для использования в конъюгатах по изобретению включают Уа1-Сй, Сй-Сй, Уа1-Ьуз, Рйе-Ьуз, Еу8-Ьу8, Л1а-Ьу8, Рйе-Сй, Ьеи-Сй, 11е-Сй, Тгр, Сй, Рйе-А1а, Рйе-№-тозил-Лгд, Рйе-№-нитро-Агд, Рйе-Рйе-Ьуз, Ό-Рйе-Рйе-Еуз, 61у-Рйе-Еуз, Ееи-Л1а-Ееи, 11е-Л1а-Ьеи, Уа1-Л1а-Уа1, Л1а-Ееи-Л1а-Ееи (8Е6 Ш NО: 1), в-А1а-Ееи-А1а-Ьеи (8ЕО Ш ΝΘ: 2), 61у-Рйе-Ьеи-61у (8ЕО Ш ΝΘ: 3), Уа1-Л1а, Ееи-Ееи-61у-Ьеи (8ЕО Ш NО: 14), Ееи-Азг1-А1а и Ьуз-Ееи-Уак Предпочтительные пептидные последовательности - Уа1-Сй и Уа1-Ьуз.
В другом варианте аминокислоту, расположенную непосредственно около фрагмента лекарственного средства, выбирают из группы, состоящей из А1а, Азп, Азр, Сй, Суз, 61η, 61и, 61у, Не, Ьеи, Ьуз, Ме!, Рйе, Рго, 8ег, Тйг, Тгр, Туг и Уа1. Еще в одном варианте аминокислоту, расположенную непосредственно около фрагмента лекарственного средства, выбирают из группы, состоящей из: А1а, Азп, Азр, Суз, 61η, 61и, 61у, Не, Ьеи, Ме!, Рйе, Рго, 8ег, Тйг, Тгр, Туг и Уа1.
Протеазы принимают участие в образовании метастазов рака. Увеличенный синтез протеазы урокиназы коррелировал с увеличенной способностью к образованию метастазов при многих видах рака. Урокиназа активизирует плазмин из плазминогена, который находится повсеместно во внеклеточном пространстве, и его активация может вызвать разложение белков во внеклеточном матриксе, через которые происходит инвазия опухолевых клеток. Плазмин может также активизировать коллагеназу, таким образом способствуя разложению коллагена в базальной мембране, окружающей капилляры и лимфатическую систему, таким образом позволяя инвазию клеток опухоли в ткани-мишени (Иано, е! а1. Абу. Саг1сег. Яез., 44: 139 (1985)). Таким образом, в пределах контекста настоящего изобретения находится использование в качестве линкера пептидной последовательности, которая расщепляется урокиназой.
В изобретении также предлагается использование пептидных последовательностей, чувствительных к расщеплению триптазами. Тучные клетки человека экспрессируют как минимум четыре различных триптазы, обозначенные α, βΙ, βΙΙ и βΙΙΙ. Эти ферменты не контролируются ингибиторами протеиназы плазмы крови и расщепляют только несколько физиологических субстратов ίη уйго. Триптазное семейство сериновых протеаз принимает участие в различных аллергических и воспалительных заболеваниях, вовлекающих тучные клетки вследствие повышенных уровней триптаз, найденных в биологических жидкостях больных такими расстройствами. Однако точная роль триптазы в патофизиологии заболеваний нуждается в прояснении. Контекст биологических функций и соответствующих физиологических последствий триптазы в существенной мере определяется их специфичностью в отношении субстрата.
Триптаза представляет собой мощный активатор проурокиназного активатора плазминогена (иРА), проферментной формы протеазы, связанной с метастазированием и инвазией опухолей. Активация каскада плазминогена, приводящая к уничтожению внеклеточной матрицы для экстравазации и миграции клеток может быть функцией активации триптазой проурокиназного активатора плазминогена в последовательности Р4-Р1 Рго-Агд-Рйе-Еуз (8Е6 ΙΌ NО: 4) (8!аск, е! а1., 1оита1 оГ Вю1одюа1 Сйет1з1гу 269 (13): 9416-9419 (1994)). Вазоактивный кишечный пептид, нейропептид, который принимает участие в регулировании проницаемости сосудов, также расщепляется триптазой, прежде всего в последовательности Тйг-Агд-Ееи-Агд (8Е6 ΙΌ NО: 5) (Тат, е! а1., Ат. 1. Яезрй. Се11 Мо1. Вю1. 3: 27-32 (1990)). Связанный с 6-протеином рецептор РАЯ-2 может расщепляться и активизироваться триптазой в последова
- 27 019962 тельности 8ег-Ьук-С1у-Агд (8ЕО ГО NО: 6), чтобы управлять размножением фибробластов, тогда как активизированный тромбином рецептор РАВ-1 инактивируется триптазой в последовательности Рго-Акп-Акр-Ьук (8Е0 ГО NО: 7) (Μοίίηο е! а1., 1оигпа1 οί В1о1од1са1 СйетйРу, 272(7): 4043-4049 (1997)). Взятые вместе, эти доказательства наводят на предположение о центральной роли триптазы в ремоделировании тканей как последствии заболевания. Это согласуется с глубокими изменениями, наблюдаемыми при нескольких расстройствах, опосредованных тучными клетками. Одним из отличительных признаков хронической астмы и других дыхательных болезней длительного течения является фиброз и утолщение базальных тканей, которые могут быть результатом активации триптазой ее физиологических мишеней. Подобным образом, серия отчетов продемонстрировала связь ангиогенеза с плотностью тучных клеток, активностью триптазы и неблагоприятным прогнозом при различных видах рака (Соиккепк е! а1., Сепек апб ^еνе1οртеη!, 13(11): 1382-97 (1999)); Такапат1 е! а1., Сапсег, 88(12): 2686-92 (2000); То!Н1акабск е! а1., Нитап Ра1йо1оду, 31(8): 955-960 (2000); ВЬа!б е! а1., 1п!егпа!юпа1 1оита1 οί Сапсег, 85(2): 171-5 (2000)).
Из уровня техники известны методы оценки того, расщепляет ли конкретная протеаза выбранную пептидную последовательность. Например, использование флюорогенных пептидных субстратов 7-амино-4-метилкумарина (АМК) представляет собой широко распространенный метод определения специфичности протеаз (Уиптегтап, Μ., е! а1. (1977), Апа1убса1 В1осйет1к1гу, 78:47-51). Специфическое расщепление анилидной связи высвобождает уходящую флюорогенную группу АМК, что позволяет несложно определить скорость расщепления для индивидуальных субстратов. Позже массивы (Ьее, Ό., е! а1. (1999), Вюогдашс апб Меб1с1па1 СНетМгу Ье!!егк, 9: 1667-72) и библиотеки позиционного сканирования (Вапо, Т.А., е! а1. (1997), СНешМгу апб Вю1оду, 4: 149-55) библиотек пептидного субстрата АМК использовали для быстрого построения профиля Ν-концевой специфичности протеаз путем отбора образцов широкого спектра субстратов в единичном эксперименте. Таким образом, специалист в данной области может легко оценить массив пептидных последовательностей с целью определения их пригодности для настоящего изобретения без излишнего экспериментирования.
Конъюгат лекарственное средство-лиганд по настоящему изобретению может необязательно содержать два или несколько линкеров. Такие линкеры могут быть одинаковыми или разными. Например, пептидильный линкер может использоваться для соединения лекарственного средства с лигандом, и второй пептидильный линкер может присоединить диагностическое средство к комплексу. Другие виды применения дополнительных линкеров включают присоединение аналитических средств, биомолекул, направляющих агентов и определяемых меток к комплексу лекарственное средство-лиганд.
Также в пределах контекста настоящего изобретения находятся соединения по изобретению, которые являются разновидностями поли- или мультивалентных молекул, в том числе, например, таких молекул, как димеры, тримеры, тетрамеры и высшие гомологи соединений по изобретению или их реакционноспособных аналогов. Поли- и мультивалентные формы могут быть собраны из одинарных молекул или нескольких видов молекул по изобретению. Например, димерная конструкция может быть гомодимерной или гетеродимерной. Кроме того, поли- и мультивалентные конструкции, в которых соединение по изобретению или его реакционноспособный аналог присоединен к олигомерной или полимерной структуре (например, полилизин, декстран, гидроксиэтилкрахмал и т.п.) находятся в пределах контекста настоящего изобретения. Структура предпочтительно является полифункциональной (т.е. содержит массив реакционноспособных сайтов для присоединения соединений по изобретению). Кроме того, могут быть образованы производные структуры с одинарными молекулами по изобретению или нескольких видов молекул по изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение включает соединения, в которые введены функциональные группы, с образованием соединений, обладающих повышенной растворимостью в воде по сравнению с аналогичными соединениями, которые не содержат таких функциональных групп. Таким образом, любой из заместителей, описанных в данном описании, может быть заменен аналогичным радикалом, который повышает растворимость в воде. Например, в пределах контекста изобретения находится замена гидроксильной группы на диол, амина на четверичный амин, гидроксиамин или подобный фрагмент с большей растворимостью в воде. В предпочтительном варианте дополнительная растворимость в воде обеспечивается заменой на сайте, несущественном для активности по направлению к каналу ионов соединений, описанных в данном изобретении, фрагментом, который увеличивает растворимость в воде исходных соединений. Способы повышения растворимости в воде органических соединений известны из уровня техники. Такие методы включают, не ограничиваясь ими, введение функциональных групп в органическое ядро с постоянно заряженным фрагментом, например четвертичного аммония, или группа, которая является заряженной при физиологически уместных значениях рН, например карбоновая кислота, амин. Другие способы включают присоединение к органическому ядру гидроксил- или аминосодержащих групп, таких как спирты, полиолы, полиэфиры и т.п. Характерные примеры включают, не ограничиваясь ими, полилизин, полиэтиленимин, поли(этиленгликоль) и поли(пропиленгликоль). Подходящие химические методы введения функциональных групп и стратегии для таких соединений известны из уровня техники. См., например, Иипп, В.Ь., е! а1., Ебк. Ро1утепс Игидк апб Эгид ОеГОегу 8ук!етк, АС8 8утрокшт 8епек. Уо1. 469, Атепсап СНет1са1 8ос1е!у, ХУакЫпдЮп, Э.С. 1991.
- 28 019962
Гидразиновые линкеры (Н).
Во втором варианте конъюгат по изобретению включает гидразиновый саморазрушающийся линкер, где структура конъюгата является следующей:
где Ό, Ь1, Ь4 и X4 являются такими, как определено выше и дополнительно описано в данном документе; и
Н представляет собой линкер, содержащий структуру
С(П24)Э
где η1 равно целому числу от 1 до 10;
η2 равно 0, 1 или 2;
каждый из Я24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, заме щенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила; и
I представляет собой связь (т.е., связь между атомом углерода скелета и смежным атомом азота), или:
где η3 равно 0 или 1, при условии что, если η3 равно 0, η2 не равно 0; η4 равно 1, 2 или 3, где, если I представляет собой связь, щ=3 и η2=1, Ό не может являться
где Я представляет собой Ме или СН2-СН2-ММе2.
В одном из вариантов замещение в фенильном кольце представляет собой пара-замещение. В предпочтительных вариантах щ равно 2, 3 или 4 или ηι=3. В предпочтительных вариантах η2=1. В предпочтительных вариантах I представляет собой связь (т.е. связь между атомом углерода скелета и смежным атомом азота). В одном аспекте гидразиновый линкер, Н, при расщеплении может образовывать 6-членный саморазрушающийся линкер, например, если η3=0 и η4=2. В другом аспекте гидразиновый линкер, Н, при расщеплении может образовывать два 5-членных саморазрушающихся линкера. В других аспектах Н образует 5-членный саморазрушающийся линкер, Н образует 7-членный саморазрушающийся линкер, или Н при расщеплении образует 5-членный саморазрушающийся линкер и 6-членный саморазрушающийся линкер. На скорость расщепления влияет размер кольца, образованного при расщеплении. Таким образом, в зависимости от желательной скорости расщепления, может быть выбран подходящий размер кольца, которое будет образовываться при расщеплении.
5-Членные гидразиновые линкеры.
В одном из вариантов гидразиновый линкер включает 5-членный гидразиновый линкер, где Н включает структуру:
В предпочтительном варианте щ равно 2, 3 или 4. В другом предпочтительном варианте ηι=3.
В описанной выше структуре каждый из Я24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В одном из вариантов каждый из Я24 независимо представляет собой Н или С1-С6 алкил. В другом варианте каждый из Я24 независимо представляет собой Н или С1-С3 алкил, более предпочтительно Н или СН3. В другом варианте как минимум один Я24 представляет собой метильную группу. В другом варианте каждый из Я24 представляет собой Н. Каждый Я24 выбирают таким образом, чтобы адаптировать стерические эффекты соединения, а также для изменения растворимости.
- 29 019962
5-Членные гидразиновые линкеры могут претерпевать одну или несколько реакций циклизации, в ходе которых лекарственное средство отделяется от линкера и которые могут быть описаны, например, схемой:
Пример синтетического пути для получения 5-членного линкера по изобретению:
а Ь с
Н
Вос^ ,,ΝΕ
ЭДК + N а
е
Защищенный СЬх ДМДА Ь реагирует с 2,2-диметилмалоновой кислотой а в растворе с тионилхлоридом с образованием СЬх-ДМДА-2.2-диметилмалоновой кислоты с. Соединение с реагирует с Βοс-N-метилгидразином ά в присутствии ЭДК с образованием ДМДА-2,2-диметилмалонил-Вос-№ метилгидразина е.
6-Членные гидразиновые линкеры.
В другом варианте гидразиновый линкер включает 6-членный гидразиновый линкер, где Н включает структуру:
В предпочтительном варианте щ равно 3. В описанной выше структуре каждый из В24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. В одном из вариантов каждый из В24 независимо представляет собой Н или С1-С6-алкил. В другом варианте каждый из В24 независимо представляет собой Н или С1-С3-алкил, более предпочтительно Н или СН3. В другом варианте как минимум один В24 представляет собой метильную группу. В другом варианте каждый из В24 представляет собой Н. Каждый В24 выбирают таким образом, чтобы адаптировать стерические эффекты соединения, а также для изменения растворимости. В предпочтительном варианте Н включает структуру
В одном из вариантов Н включает геминальное диметилзамещение. В одном из вариантов описанной выше структуры каждый из В24 независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил.
6-Членные гидразиновые линкеры будут претерпевать реакцию циклизации, в ходе которой лекарственное средство отделяется от линкера и которая может быть описана следующей схемой:
- 30 019962
Пример синтетического пути для получения 6-членного линкера по изобретению:
Защищенный СЬх диметилаланин а в растворе с дихлорметаном реагирует с Η0Ά1 и СР1 с образованием СЬх-защищенного диметилаланингидразина Ь. Защиту с гидразина Ь снимают с помощью обработки метанолом, с образованием соединения с.
Другие гидразиновые линкеры.
Предусматривается, что изобретение включает 7-членный линкер. Такой линкер, вероятно, не будет циклизоваться так же быстро, как 5- или 6-членные линкеры, что может быть предпочтительным для некоторых конъюгатов лекарственное средство-лиганд. Подобным образом, гидразиновый линкер может включать два 6-членных кольца или гидразиновый линкер, содержащий один 6- и один 5-членный продукты циклизации. Также предусматриваются 5- и 7-членные линкеры, а также 6- и 7-членные линкеры.
Другая гидразиновая структура, Н, представлена следующей формулой:
где с.| представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
каждый из К24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. Такая гидразиновая структура также может образовывать 5-, 6-или 7-членные кольца, и дополнительные элементы могут быть добавлены для образования множественных колец.
Дисульфидные линкеры (1).
В другом варианте линкер содержит ферментно расщепляемую дисульфидную группу. В одном из вариантов изобретения предлагается соединение цитотоксическое лекарственное средство-лиганд, структура которого соответствует формуле (3) ϋ
(3) где Ό, Ь1, Ь4 и X4 являются такими, как определено выше и дополнительно описано в данном доку
менте;
представляет собой дисульфидный линкер, включающий группу, которая содержит структуру
где каждый из К24 представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила; каждый К представляет собой член, независимо выбранный из группы, состоящей из замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетеЭ1 22 21 22 21 22 роциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, Ν02, ΝΒ К , ΝΗ С0К , 0С0МК. К , 21 21 21 22
0С0К21 и 0К21, где К21 и К22 независимо выбирают из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероцик
- 31 019962 лоалкила и незамещенного гетероциклоалкила;
а равно целому числу 0, 1, 2, 3 или 4;
б равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Ароматическое кольцо дисульфидного линкера может быть замещено одной или несколькими группами К. Группа К представляет собой заместитель на ароматическом кольце, который заменяет водород, в противоположном случае присоединенный к одному из четырех незамещенных атомов углерода, которые являются частью структуры кольца. Группа К может представлять собой одинарный атом, такой как галоген, или может быть многоатомной группой, такой как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и циано. Примеры заместителей К независимо включают, не ограничиваясь ими, Е, С1, Вг, I, ΝΟ2, ОН, ОСН3, ΝΗίΌί'Ή3. Ы(СН3)2, ΝΗίΌί.Έ3 и метил. Для Ка, а равно целому числу 0, 1, 2, 3 или 4. В конкретном варианте а=0.
В предпочтительном варианте линкер включает ферментно расщепляемую дисульфидную группу следующей формулы:
В данном варианте Ь4, X4, р и В24 являются такими, как описано выше, и б равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В конкретном варианте б равно 1 или 2.
Формула более конкретного дисульфидного линкера показана ниже:
ка
Конкретный пример данного варианта:
Другой дисульфидный линкер показан формулой ниже:
Конкретный пример данного варианта:
Предпочтительно б равно 1 или 2.
В различных вариантах дисульфидные группы расположены в орто-положении по отношению к амину. В другом конкретном варианте а равно 0. В предпочтительном варианте В24 независимо выбирают из Н и СН3.
Пример синтетического пути для получения дисульфидного линкера по изобретению приведен на следующей схеме:
- 32 019962
Раствор 3-меркаптопропионовой кислоты а реагирует с алдритиолом-2 с образованием 3-метилбензотиазолия йодида Ь. 3-Метилбензотиазолия йодид с реагирует с натрия гидроксидом с образованием соединения 6. Раствор соединения 6 с метанолом дополнительно реагирует с соединением Ь с образованием соединения е. С соединения е снимают защиту с помощью обработки хлорангидридом уксусной кислоты и метанолом с образованием соединения £.
Конъюгаты лекарственное средство-расщепляемый субстрат.
Лекарства, обозначенные в данном описании как Ό, могут предлагаться в настоящем изобретении как часть конъюгата лекарственное средство-расщепляемый субстрат, где лекарственное средство связано с расщепляемым субстратом, X2, необязательно посредством саморазрушающегося линкера, Ь1. Такой конъюгат может представлять собой пролекарство. Лекарственное средство обычно обладает желательной биологической активностью и содержит реакционноспособную функциональную группу для присоединения к расщепляемому субстрату. Желательная биологическая активность включает диагностику, излечение, облегчение, лечение или предотвращение заболевания у животного, такого как человек. Предпочтительные реакционноспособные функциональные группы включают первичные или вторичные амины, гидроксильные, сульфгидрильные, карбоксильные группы, альдегиды и кетоны. Более предпочтительные реакционноспособные функциональные группы включают гидроксильные группы, первичные или вторичные амины, сульфгидрильные группы и карбоксильные функциональные группы. Даже более предпочтительные реакционноспособные функциональные группы включают гидроксильные группы, первичные и вторичные амины и карбоксильные функциональные группы. Лекарственное средство обычно содержит как минимум 1, но может содержать 2, 3, 4, 5, 6 или несколько реакционноспособных функциональных групп.
Конъюгат лекарственное средство-расщепляемый субстрат эффективен для обыкновенных целей, для которых эффективны соответствующие лекарственные средства, но может обладать превосходящей эффективностью из-за способности переносить лекарственное средство к клетке-мишени (например, опухолевой клетке), где оно особенно необходимо. Например, лекарственное средство может быть выбрано таким образом, чтобы оно активизировалось в месте расположения клеток опухоли конъюгацией со специфическим в отношении опухоли расщепляемым субстратом. Такие специфические в отношении опухоли конъюгаты лекарственное средство-расщепляемый субстрат обладают специфичностью в отношении опухоли, которая является результатом специфичности расщепляемого субстрата. Специфичность может возникнуть, если расщепляемый субстрат предпочтительно расщепляется в непосредственной близости или вокруг клеток опухоли. Примеры включают конъюгаты, представляющие собой высокоселективные субстраты для специфических для опухоли ферментов или ферментов, которые связаны, природным или искусственным способом, с опухолью. Такие ферменты присутствуют в непосредственной близости опухоли в достаточных количествах, чтобы генерировать цитотоксические уровни свободного лекарства в непосредственной близости опухоли.
В другом подходе, который называют направленной антителами ферментной терапией пролекарствами (НАФТП), фермент присоединен к специфичному в отношении опухолевого антигена антителу, чтобы таким образом направить фермент к местоположению клеток опухоли. Затем лекарственное средство конъюгируют с субстратом, который расщепляется ферментом, присоединенным к специфичному в отношении опухоли антителу. Таким образом, указанные конъюгаты лекарственное средстворасщепляемый субстрат обладают специфичностью в отношении опухоли, которая является результатом локализации фермента в местоположении клеток опухоли посредством прикрепления фермента к специфичному в отношении опухоли антителу.
Одно из преимуществ комплекса лекарственное средство-расщепляемый субстрат состоит в том, что он может быть менее токсичен, чем соответствующее свободное лекарственное средство; дополнительно, специфичность комплекса может позволять применение более низких общих концентраций, чем
- 33 019962 применяемые в случае свободного лекарственного средства, поскольку повышенная специфичность будет приводить к наличию в месте расположения опухоли более высокого процента комплекса.
В одном из вариантов изобретения предлагается соединение цитотоксическое лекарственное средство-расщепляемый субстрат, структура которого соответствует формуле (2)
Символ Ь1 представляет саморазрушающийся спейсер, где т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Предпочтительно М представляет собой 0, 1 или 2.
Символ X2 представляет расщепляемый субстрат, предпочтительно ферментно расщепляемый субстрат.
Лекарственные средства.
Лекарственные средства, обозначенные в данном описании как Ό, предлагаются в настоящем изобретении как часть конъюгата лекарственное средство-лиганд, где лекарственное средство связано с лигандом посредством пептидильного или другого линкера, или в виде конъюгата с расщепляемым субстратом. Лекарственное средство должно обладать целевой биологической активностью и содержать реакционноспособную функциональную группу для присоединения к лиганду. Целевая биологическая активность включает диагностику, излечение, облегчение, лечение или предотвращение заболевания у животного, такого как человек. Таким образом, при условии наличия необходимой реакционноспособной функциональной группы, термин лекарственное средство обозначает химические вещества, признанные лекарственными средствами в официальной Фармакопее США, официальной Гомеопатической Фармакопее США или официальном Национальном Формуляре или любом их дополнении. Примеры лекарственных средств приведены в Настольном справочнике врача (РОК) и в Оранжевой Книге (Огапде Воок), которую ведет Управление по продовольствию и лекарствам (РОА) США. Новые лекарственные средства беспрерывно открываются и создаются, и настоящее изобретение предполагает, что такие новые лекарственные средства также могут быть включены в комплекс лекарственное средство-лиганд по настоящему изобретению.
Предпочтительные функциональные группы включают первичные или вторичные амины, гидроксильные, сульфгидрильные, карбоксильные группы, альдегиды и кетоны. Более предпочтительные функциональные группы включают гидроксильные группы, первичные или вторичные амины, сульфгидрильные группы и карбоксильные функциональные группы. Даже более предпочтительные функциональные группы включают гидроксильные группы, первичные и вторичные амины и карбоксильные функциональные группы. Лекарственное средство должно содержать как минимум одну, но может содержать 2, 3, 4, 5, 6 или несколько реакционноспособных функциональных групп. Дополнительно, саморазрушающийся спейсер Ь1 может быть введен между реакционноспособной функциональной группой лекарственного средства и пептидом или другим линкером или расщепляемым субстратом.
Конъюгат лекарственное средство-лиганд эффективен для обыкновенных целей, для которых эффективны соответствующие лекарственные средства, но обладает превосходящей эффективностью благодаря способности, свойственной как минимум некоторым лигандам, переносить лекарственное средство к клетке-мишени, где оно особенно необходимо.
Примеры лекарственных средств включают белки, пептиды и низкомолекулярные лекарственные средства, содержащие функциональную группу для присоединения к лиганду. Более конкретно, такие лекарственные средства включают, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы, ингибиторы тимидилатсинтетазы, интеркалаторы ДНК, средства для расщепления ДНК, ингибиторы топоизомеразы, антрациклиновое семейство лекарственных средств, лекарственные средства из барвинка, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, птеридиновое семейство лекарственных средств, диинены, подофиллотоксины, индукторы дифференциации и таксолы.
Предпочтительные лекарственные средства по настоящему изобретению включают цитотоксические лекарственные средства, пригодные для лечения рака, и другие низкомолекулярные средства, белки или полипептиды с желательной биологической активностью, такие как токсин. Лекарственное средство может быть выбрано таким образом, чтобы оно активизировалось в месте расположения клеток опухоли конъюгацией со специфическим в отношении опухоли расщепляемым лигандом. Такие специфические в отношении опухоли конъюгаты лекарственное средство-расщепляемый лиганд обладают специфичностью в отношении опухоли, которая является результатом специфичности лиганда. Примеры конъюгатов лекарственное средство-лиганд представляют собой высокоселективные субстраты для специфических для опухоли ферментов, где такие ферменты присутствуют в непосредственной близости опухоли в достаточных количествах, чтобы генерировать цитотоксические уровни свободного лекарства в непосредственной близости опухоли. Одно из преимуществ таких специфических в отношении опухоли комплексов лекарственное средство-лиганд состоит в их устойчивости к действию адвентивных протеаз в сыворотке крови человека. Другое преимущество комплекса лекарственное средство-лиганд состоит в его меньшей токсичности по сравнению с соответствующим свободным лекарственным средством; дополнительно, специфичность комплекса может позволить применение более низких общих концентраций по сравнению со свободным лекарственным средством, поскольку повышенная специфичность будет при
- 34 019962 водить к увеличению процента комплекса, который присутствует в месте расположения опухоли.
Цитотоксины.
Цитотоксические лекарственные средства, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, дуокармицины и СС-1065, а также их аналоги, в том числе аналоги дуокармицинов и СС-1065 на основе СВ1 (1,2,9,9а-тетрагидроциклопропа [с]бенз[е]индол-4-она), МСВ1 (7-метокси1,2,9,9а-тетрагидроциклопропа[с]бенз[е]индол-4-он) и ССВ1 (7-циано-1,2,9,9а-тетрагидроциклопропа[с]бенз[е]-индол-4-она), доксорубицин и конъюгаты доксорубицина, такие как морфолинодоксорубицин и цианоморфолино-доксорубицин, доластатины, такие как доластатин-10, комбретастатин, калихеамицин, мейтанзин, аналоги мейтанзина, ΌΜ-1, ауристатин Е, ауристатин ЕВ (АЕВ), ауристатин ЕРР (АЕРР), монометилауристатин Е (ММАЕ), эфир 5-бензоилвалериановой кислоты-АЕ (АЕУВ), тубулизины, дизоразол, эпотилоны, паклитаксел, доцетаксел, 8Ν-38, топотекан, ризоксин, эхиномицин, колхицин, винбластин, виндезин, эстрамустин, цемадотин, элеутеробин, метотрексат, метоптерин, дихлорметотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, арабинозид цитозин, мелфалан, лейрозин, лейрозидеин, актиномицин, даунорубицин и конъюгаты даунорубицина, митомицин С, митомицин А, карминомицин, аминоптерин, таллизомицин, подофиллотоксин и производные подофиллотоксина, такие как этопозид или этопозида фосфат, винкристин, таксол, таксотер, ретиноевая кислота, масляная кислота, ^-ацетилспермидин, камптотецин и их аналоги. Другие известные лекарственные средства могут быть модифицированы таким образом, чтобы обеспечить функциональную группу для присоединения к линкеру, описанному в данном документе. Такая химическая модификация известна из уровня техники.
Предпочтительные цитотоксины для использования в настоящем изобретении включают дуокармицины, а также их аналоги на основе СС-1065, ССВ1 и МСВ1, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, доластатин-10, комбретастатин, калихеамицин, мейтанзин, ЭМ-1, ауристатин Е, АЕВ, АЕРР, ММАЕ, тубулизин А, дизоразол, эпотилон А и эпотилон В.
Особенно предпочтительные цитотоксины по настоящему изобретению представляют собой активные мощные производные дуокармицина и СС-1065. Исходные средства представляют собой исключительно мощные противоопухолевые антибиотики, которые оказывают биологическое действие посредством обратимой, стереоэлектронно контролируемой последовательности селективного алкилирования ДНК (Водег е! а1. 1. Огд. СНет. 55: 4499 (1990); Водег е! а1. 1. Ат. СНет. 8ос. 112: 8961 (1990); Водег е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос. 113: 6645 (1991); Водег е! а1. 1. Ат. СНет. 8ос. 115: 9872 (1993); Водег е! а1., Вюогд. Меб. СНет. Ьей. 2: 759 (1992)). После начального раскрытия дуокармицинов обширные усилия были предприняты для прояснения природы селективности алкилирования ДНК под действием дуокармицинов и ее структурного происхождения.
В особенно предпочтительном аспекте настоящего изобретения предлагается цитотоксическое со-
где система колец А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп.
Примеры систем колец включают фенил и пиррол.
Символы Е и С независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи или Е и С необязательно соединены с образованием системы колец, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила.
Символ X представляет группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23. К23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
Символ К3 представляет группу, выбранную из (=О), 8К11, КЙК1 и ОК11, где К11 представляет собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, монофосфаты, дифосфаты, трифосфаты, сульфонаты, ацил, С(О)К12К13, С(О)ОК12, С(Ο)NК12К13, Р(О)(Ок12)2, С(О)СНК12К13, 8К12 или 81К12К13К14. Символы К12, К13 и К14 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и замещенный или незамещенный арил, где К12 и К13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов. Один или не
- 35 019962 сколько из Я12, Я13 или Я14 могут включать расщепляемую группу в пределах своей структуры.
Я4, Я4', Я5 и Я5' представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NΟ2, ΝΚ.1^16, NС(Ο)Я15, ОС(О)NΚ15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ15=NΚ16 и О(СН2)^(СН3)2, где п равно целому числу от 1 до 20, или члены любой смежной пары, состоящей из Я4, Я4', Я5 и Я5', вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп. Я15 и Я16 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов. Одним из примеров структуры является анилин.
Я4, Я4', Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15 и Я16 необязательно содержат одну или несколько расщепляемых групп в пределах своей структуры, такую как расщепляемый линкер или расщепляемый субстрат. Примеры расщепляемых групп включают, не ограничиваясь ими, пептиды, аминокислоты, гидразины, дисульфиды и производные цефалоспорина.
В некоторых вариантах как минимум один из Я4, Я4', Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15 и Я16 используют для присоединения лекарственного средства к линкеру или ферментно расщепляемому субстрату по данному изобретению, как описано в данном документе, например к Ь1, если он присутствует, или к Р, Н, 1 или X2.
В дополнительном иллюстративном варианте как минимум один из Я4, Я4', Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15 и Я16 содержит реакционноспособную группу, пригодную для конъюгации соединения. В дополнительном иллюстративном варианте Я4, Я4', Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15 и Я16 независимо выбраны из Н, замещенного алкила и замещенного гетероалкила и содержат реакционноспособную функциональную группу на свободном конце алкильного или гетероалкильного фрагмента. Один или несколько из Я4, Я4', Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15 и Я16 может быть конъюгирован с другой молекулой, например, направляющим агентом, определяемой меткой, твердой подложкой и т.д.
Я6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует. Если Я6 присутствует, Я6 и Я7 соединены с образованием циклопропильного кольца. Я7 представляет собой СН2-Х1 или СН2-. Если Я7 представляет собой -СН2-, он является компонентом циклопропанового кольца. Символ X1 представляет уходящую группу, такую как галоген, например С1, Вг или Р. Комбинации Я6 и Я7 интерпретируются таким образом, чтобы не нарушать принципов химической валентности.
X1 может быть любой уходящей группой. Полезные уходящие группы включают, не ограничиваясь ими, галогены, азиды, эфиры сульфоновых кислот (например, алкилсульфонил, арилсульфонил), ионы оксония, алкилперхлораты, аммониоалкансульфонатные эфиры, алкилфторсульфонаты и фторированные соединения (например, трифлаты, нонафлаты, трезилаты) и т.п. Конкретные галогены, пригодные в качестве уходящей группы представляют собой Р, С1 и Вг. Выбор указанных и других уходящих групп, пригодных для конкретного набора условий реакции, находится в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, МагсЬ 1., Абνаηсеб Огдашс Сйетщйу, 2пб Ебйюп, 1ойп Рбеу & 8оп§, 1992; 8апб1ег 8.Я., Каго Р., Огдашс Рипс!юпа1 Сгоир Ргерагабопк, 2пб Ебйюп, Асабетю Ргекк, 1пс., 1983 и Рабе Ь.С., Сотрепбшт о! Огдашс 8уп!йебс МеШобк, 1ойп Рбеу & 8оп§, 1980).
Кривая линия в пределах 6-членного кольца показывает, что кольцо может содержать одну или несколько ненасыщенных связей, а также может быть ароматическим. Таким образом, кольцевые структуры, такие как показаны ниже, и родственные структуры, находятся в пределах формулы (8)
В некоторых вариантах как минимум один из Я4, Я4, Я5 и средство с Ь1, если он присутствует, или с Р, Н, 1 или X2 и включает
Я5 связывает указанное лекарственное
где ν равно целому числу от 1 до 6;
27' 28 28' каждый из Я , Я , Я и Я независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила,
- 36 019962 замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила. В некоторых
27' 28 28' вариантах К , К , К и К , все, представляют собой Н. В некоторых вариантах ν равно целому числу от 1 до 3 (предпочтительно 1). Данный фрагмент может быть использован для отделения арильных заместителей от лекарственного средства, и, таким образом, сопротивления или устранения возможности генерации соединений, которые являются субстратами для развития резистентности ко многим лекарственным средствам.
В одном из вариантов К11 включает фрагмент X5, который не циклизуется самостоятельно и связывает лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Р, Η, 1 или X2. Фрагмент X5 предпочтительно расщепляется с использованием фермента и при расщеплении обеспечивает активное лекарственное средство. В качестве примера структура К11 может быть следующей (где правая сторона обозначает соединение с остальной частью лекарственного средства):
О
О
В иллюстративном варианте система колец А формулы (7) представляет собой замещенное или незамещенное фенильное кольцо. Система колец А может быть замещена одной или несколькими арильными группами, как указано в разделе Определения данного описания. В некоторых вариантах фенильное кольцо замещено ΟΝ или метоксильным фрагментом.
В некоторых вариантах как минимум один из К4, К4, К5 и К5 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Р, Η, 1 или X2 и К3 выбирают из 8К11, ΝΗΡ.11 и ОК11. К11 выби
- 37 019962 и фармацевтически приемлемой их соли, где η равно целому числу в интервале от 1 до 10;
т равно целому числу в интервале от 1 до 4;
р равно целому числу в интервале от 1 до 6 и
АА представляет собой природную или не встречающуюся в природе аминокислоту.
В некоторых вариантах ΑΑη или ААт выбирают из таких же последовательностей аминокислот, как описаны выше для пептидных линкеров (Е), и они необязательно является таким же, как последовательность аминокислот, используемая в части линкера В4, В4, В5 или В5. Как минимум, в некоторых вариантах В3 расщепляется ίη νίνο с получением соединения активного лекарственного средства. Как минимум, в некоторых вариантах В3 увеличивает растворимость соединения ίη νίνο. В некоторых вариантах скорость снижения концентрации активного лекарственного средства в крови в значительной мере превышает скорость расщепления В3 с образованием активного лекарственного средства. Это может быть особенно полезным, если токсичность активного лекарственного средства в значительной мере превышает токсичность пролекарственной формы. В других вариантах скорость расщепления В3 с образованием активного лекарственного средства выше скорости снижения концентрации активного лекарственного средства в крови.
В другом иллюстративном варианте изобретения предлагается соединение, структура которого соответствует формуле (9)
как описано выше для формулы (7), а также предпочтений для конкретных вариантов.
Символ Ζ представляет собой член, независимо выбранный из О, 8 и NВ23.
Символ В23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила. Каждый В23 выбирают независимо.
Символ В1 представляет Н, замещенный или незамещенный низший алкил или С(О)В8 или СО2В8, В8 представляет собой группу, выбранную из замещенного алкила, незамещенного алкила, ΝΕ^'Κ.10, ΝΗΝΉΗ и ОВ9. В9 и В10 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В2 представляет собой Н или замещенный или незамещенный низший алкил.
В целом, В2 предпочтительно представляет собой замещенный алкил, который не является перфторалкилом, например СЕ3. В одном из вариантов В2 представляет собой замещенный алкил, где заместитель не является галогеном. В другом варианте В2 представляет собой незамещенный алкил.
В некоторых вариантах В1 представляет собой эфирный фрагмент, такой как СО2СН3. В некоторых вариантах В2 представляет собой низшую алкильную группу, которая может быть замещенной или незамещенной. Предпочтительная на данный момент низшая алкильная группа представляет собой СН3. В некоторых предпочтительных вариантах В1 представляет собой СО2СН3, и В2 представляет собой СН3.
В некоторых вариантах В4, В4, В5 и В5 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, галогена, ΝΗ2, ОМе, О(СН2)^(В29)2 и NО2. Каждый В29 независимо представляет собой Н или низший алкил (например, метил).
В некоторых вариантах лекарственное средство выбирают таким образом, что уходящая группа X1 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из галогена, алкилсульфонила, арилсульфонила и азида. В некоторых вариантах X1 представляет собой Е, С1 или Вг.
В некоторых вариантах Ζ представляет собой О или ΝΗ. В некоторых вариантах X представляет собой О.
В другом иллюстративном варианте изобретения предлагаются соединения, структура которых соответствует формуле (10) или (11)
- 38 019962
(10) (Η)
Другая предпочтительная структура аналога дуокармицина формулы (7) представляет собой структуру, где кольцевая система А представляет собой незамещенное или замещенное фенильное кольцо. Предпочтительные заместители в молекуле лекарственного средства, описанные выше в данном описании для структуры формулы (7), если кольцевая система А представляет собой пиррол, также являются предпочтительными заместителями в случаях, где кольцевая система А представляет собой незамещенное или замещенное фенильное кольцо.
Например, в предпочтительном варианте лекарственное средство (Ό) включает структуру (12):
где В3, В6, В7, X являются такими, как описано выше для формулы (7). Кроме того, Ζ представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ИВ23, где В23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещен ного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
В1 представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил, С(О)В8 или СО2В8, где В8 представляет собой группу, выбранную из ХВ9В10 и ОВ9, где В9 и В10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
В1 представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил или С(О)В8, где В8 представляет собой группу, выбранную из NВ9В10 и ОВ9, где В9 и В10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетеро алкила;
В2 представляет собой Н или замещенный или незамещенный низший алкил или незамещенный гетероалкил или циано или алкокси; и В2 представляет собой Н или замещенный или незамещенный низший алкил или незамещенный гетероалкил.
Как минимум один из В4, В4', В5, В5', В11, В12, В13, В15 или В16 связывает лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е, Н, 1 или X2.
Другой вариант лекарственного средства (Ό) включает структуру (13), где В4 и В4 соединены с образованием гетероциклоалкила:
где В3, В5, В5', В6, В7,
X являются такими, как описано выше для формулы (7). Кроме того, Ζ представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23, где В23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
В32 выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного ари ла, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, N0, ЯВ15В16, ^(О)В15, ОС(О)1МВ15В16, ОС(О)ОВ15, С(О)В15, 8В15, ОВ15, СВ15=ЯВ16 и О(СН2)^(СН3)2, где η равно целому числу от 1 до 20; В15 и В16 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где В15 и В16 вместе с атомом азота, к которому они присое
- 39 019962 динены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов. Я32 необязательно содержит в пределах своей структуры одну или несколько расщепляемых групп, таких как расщепляемый линкер или расщепляемый субстрат.
Примеры расщепляемых групп включают, не ограничиваясь ими, пептиды, аминокислоты, гидразины, дисульфиды и производные цефалоспорина. Кроме того, любой выбор заместителей, описанных в данном описании для Я4, Я4, Я5, Я5, Я15 и Я16 также применим к Я32.
Как минимум один из Я5, Я5', Я11, Я12, Я13, Я15, Я16 или Я32 связывает лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е, Η, I или X2. Как минимум, в некоторых вариантах, Я32 связывает лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е, Η, I или X2.
Один из предпочтительных вариантов данного соединения представляет собой
Я1 представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил, С(О)Я8 или СО2Я8, где Я8 представляет собой группу, выбранную из ΝΚ.9'Κ.10 и ОЯ9, где Я9 и Я10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
Я1' представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил или С(О)Я8, где Я8 представляет собой группу, выбранную из NЯ9Я10 и ОЯ9, где Я9 и Я10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
Я2 представляет собой Н, или замещенный или незамещенный низший алкил или незамещенный гетероалкил, или циано, или алкокси;
Я2' представляет собой Н, или замещенный или незамещенный низший алкил или незамещенный гетероалкил.
Дополнительный вариант имеет формулу
где А, Я6, Я7, X, Я4, Я4, Я5 и Я5 являются такими, как описано выше для формулы (7). Кроме того, Ζ представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23, где Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я33 выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного ари ла, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, \О;, ΝΙΓΚ', \С(О)Я’, ОС(О)1УК,15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ \Я и О(СН2)^(СН3)2, где η равно целому числу от 1 до 20, Я15 и Я16 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов. Я33 связывает лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е, Η, I или X2.
Предпочтительно А представляет собой замещенный или незамещенный фенил или замещенный или незамещенный пиррол. Кроме того, любой выбор заместителей, описанный в данном документе для Я11, также применим к Я33.
Лиганды.
X4 представляет лиганд, выбранный из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов. Предпочтительные лиганды представляют собой направляющие агенты,
- 40 019962 такие как антитела и их фрагменты.
29 29
В некоторых вариантах группа X может быть описана как группа, выбранная из К , С00К , С(0)ИК и С(0)И№ , где К представляет собой группу, выбранную из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного гетероарила. В другом иллюстративном варианте К29 представляет собой группу, выбранную из Н; ОН; ΝΗΝΗ2;
где К30 представляет замещенный или незамещенный алкил, заканчивающийся реакционноспособной функциональной группой, замещенный или незамещенный гетероарил, заканчивающийся функциональной группой.
Описанные выше структуры функционируют как реакционноспособные защитные группы, которые могут реагировать, например, с боковой цепью аминокислоты направляющего агента, такого как антитело, таким образом, чтобы обеспечить присоединение направляющего агента к фрагменту линкерлекарственное средство.
Нацеливающие агенты.
Плечи линкера и цитотоксины по изобретению могут быть присоединены к направляющим средствам, которые выборочно доставляют полезную нагрузку к клетке, органу или участку тела. Примеры направляющих агентов, такие как антитела (например, химерные, гуманизированные и человеческие), лиганды для рецепторов, лектины, сахариды, антитела и т.п., известны из уровня техники и без ограничений являются пригодными в практике настоящего изобретения. Другие направляющие агенты включают класс соединений, которые не включают специфических молекулярных мотивов распознавания, в том числе макромолекулы, такие как поли(этиленгликоль), полисахарид, полиаминокислоты и т.п., которые добавляют молекулярную массу к цитотоксину. Добавочная молекулярная масса влияет на фармакокинетику цитотоксина, например, на период полувыведения из сыворотки.
В иллюстративном варианте изобретения предлагается цитотоксин, линкер или конъюгат цитотоксин-линкер с направляющим агентом, который представляет собой биологическую молекулу, например антитело, рецептор, пептид, лектин, сахарид, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.
Биологические молекулы, пригодные для практики настоящего изобретения, могут происходить из любого источника. Биологические молекулы могут быть выделены из природных источников или могут быть получены синтетическими методами. Белки могут быть природными белками или модифицированными белками. Мутации могут производиться химическим мутагенезом, сайт-направленным мутагенезом или другими средствами индукции мутаций, известными специалистам в данной области. Белки, пригодные для практики настоящего изобретения, включают, например, ферменты, антигены, антитела и рецепторы. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, но наиболее предпочтительны моноклональные. Пептиды и нуклеиновые кислоты могут быть выделены из природных источников или могут быть полностью или частично синтетическими по своему происхождению.
В предпочтительном варианте направляющий агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, выбранный на основании его специфичности в отношении антигена, экспрессирующегося на клетке-мишени, или на целевом участке. Идентифицирован широкий спектр специфических для опухоли или других специфических для заболевания антигенов, и антитела к таким антигенам применяли или предлагали для применения в лечении таких опухолей или других заболеваний. Антитела, которые известны из уровня техники, могут применяться в конъюгатах по изобретению, в частности, для лечения заболевания, с которым связан целевой антиген. Не ограничивающие примеры целевых антигенов (и связанных с ними заболеваний), на которые может быть нацелен конъюгат антитело-линкер-лекарственное средство по изобретению, включают Нег2 (рак молочной железы), СИ20 (лимфомы), ЕСБК (солидные опухоли), СИ22 (лимфомы, в том числе неходжкинская лимфома), СИ52 (хронический лимоцитарный лейкоз), СИ33 (острый миелогенный лейкоз), СИ4 (лимфомы, аутоиммунные заболевания, в том числе ревматоидный артрит), СИ30 (лимфомы, в том числе неходжкинская лимфома), Мис18 (меланома), интегрины (твердые опухоли), Р8МА (рак предстательной железы, доброкачественная гиперплазия предстательной железы), СЕА (рак ободочной и прямой кишки), СЭ11а (псориаз), СИ80 (псориаз), СИ23 (астма), СИ40Ь (иммунная тромбоцитопеническая пурпура), СТБА4 (Т-клеточные лимфомы) и ВЬук (аутоиммунные заболевания, в том числе системная красная волчанка).
В тех вариантах, где фрагмент распознавания представляет собой белок или антитело, белок может быть присоединен к поверхности или компоненту самообразующегося монослоя (СОМ) или присоединен через плечо спейсера любым реакционноспособным остатком пептида, доступным на поверхности белка. В предпочтительных вариантах реакционноспособные группы представляют собой амины или карбоксилаты. В особенно предпочтительных вариантах реакционноспособные группы представляют собой α-аминные группы остатков лизина. Кроме того, такие молекулы могут быть адсорбированы на поверхности субстрата или СОМ посредством неспецифических взаимодействий (например, хемосорб
- 41 019962 ция, физическая адсорбция).
Фрагменты распознавания, которые представляют собой антитела, могут использоваться для распознавания анализируемых веществ, которые являются белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами, сахаридами или молекулами небольшого размера, такими как лекарственные средства, гербициды, пестициды, промышленные химикаты и боевые вещества. Методы получения антител против конкретных молекул известны специалистам в данной области. См. патенты США 5/147786, выданный Реид с1 а1. 15 сентября 1992 г.; 5/334528, выданный 8Чапкег е1 а1. 2 августа 1994 г.; 5/686237, выданный Л1-ВауаЧЧ, М.А.8. 11 ноября 1997 г.; и 5/573922, выданный Ноебб е1 а1. 12 ноября 1996 г. Методы присоединения антител к поверхностям также известны из уровня техники. См. Ое1атагсЬе еЧ а1. Ьаидтшг 12: 1944-1946 (1996).
Нацеливающие агенты могут быть присоединены к линкерам по изобретению с помощью любой доступной реакционноспособной группы. Например, пептиды могут быть присоединены через аминную, карбоксильную, сульфгидрильную или гидроксильную группу. Такая группа может быть расположена на конце пептида или на внутреннем сайте пептидной цепи. Нуклеиновые кислоты могут быть присоединены через реакционноспособную группу на основе (например, экзоциклический амин) или доступную гидроксильную группу на сахарном фрагменте (например, 3'- или 5'-гидроксил). Пептидные цепи и цепи нуклеиновых кислот могут быть дополнительно дериватизированы на одном или нескольких сайтах, чтобы позволить присоединение подходящих реакционноспособных групп к цепи. См. СЬпбеу еЧ а1. №с1еЧс АсЧбб Кез. 24: 3031-3039 (1996).
Если пептид или нуклеиновая кислота представляет собой полностью или частично синтетическую молекулу, реакционноспособная группа или замаскированная реакционноспособная группа может быть введена в ходе процесса синтеза. Многие дериватизированные мономеры, подходящие для введения реакционноспособной группы, как в пептиды, так и в нуклеиновые кислоты, известны специалисту в данной области из уровня техники. См., например, ТЬе РерЧЧбез: Апа1убЧб, 8упЧЬебЧб, ВЧо1оду, νοί. 2: 8ресЧа1 МеЧЬобб ίη РерЧЧбе 8упЧЬебЧб, Сгобб, Е. аиб Ме1еп1юГег. 1., Ебб., Лсабетк Ргебб, №\ν Уотк (1980). Многие полезные мономеры коммерчески доступны (ВасЬет, 8Чдта и т.д.). После синтеза с такой замаскированной группы может быть снята маскировка, и в этой точке она становится доступной для реакции с компонентом соединения по изобретению.
Примеры направляющих агентов-нуклеиновых кислот включают аптамеры, антисмысловые соединения и нуклеиновые кислоты, которые формируют тройные спирали. Обычно гидроксильная группа сахарного остатка, аминогруппа основного остатка или фосфатный кислород нуклеотида используется как необходимая химическая функциональная группа для сочетания направляющего агента на основе нуклеотида с цитотоксином. Однако специалисту в данной области будет понятно, что другие неприродные реакционноспособные функциональные группы могут быть присоединены к нуклеиновой кислоте обычными методами. Например, гидроксильная группа сахарного остатка может быть превращена в меркапто- или аминогруппу с использованием методов, хорошо известных из уровня техники.
Аптамеры (или антитело к нуклеиновой кислоте) представляют собой молекулы одно- или двухцепочечной ДНК или одно- или двухцепочечной РНК, которые связываются со специфическими молекулярными мишенями. В целом, аптамеры функционируют, ингибируя действие молекулярной мишени, например белков, путем связывания с пулом мишени, циркулирующей в крови. Аптамеры содержат химическую функциональную группу и таким образом, могут ковалентно связываться с цитотоксинами, как описано в данном документе.
Хотя широкий спектр молекулярных мишеней способен к формированию нековалентных, но специфических ассоциатов с аптамерами, в том числе низкомолекулярные лекарственные средства, метаболиты, кофакторы, токсины, лекарственные средства на основе сахаридов, лекарственные средства на основе нуклеотидов, гликопротеины и т.п., в целом молекулярная мишень будет включать белок или пептид, в том числе белки сыворотки, кинины, эйкозаноиды, молекулы на поверхности клетки и т.п. Примеры аптамеров включают ингибитор антитромбина Галаада 68 522 и его производные (6Ч1еаб 8сЧепсе, РобЧег СЧЧу, Са1ЧГ). См. также Масауа еЧ а1. Ргос. №Ч1. Лсаб. 8сЧ. И8Л, 90: 3745-9 (1993); Воск еЧ а1. №11иге (Ьопбоп), 355: 564-566 (1992) и \\ апд еЧ а1. ВюсЬет. 32: 1899-904 (1993).
Аптамеры, специфические для данной биологической молекулы, могут быть идентифицированы с помощью методов, известных из уровня техники. См., например, Тоо1е еЧ а1. (1992), публикация РСТ \УО 92/14843; Тиегк и 6о1б (1991), публикация РСТ \УО 91/19813; ^ешЧтаиЬ и НиЧсЬЧпбоп (1992), публикация РСТ 92/05285 и ЕШпдЧоп и 8хоб1ак, АШие, 346:818 (1990). Если коротко, в таких методах обычно происходит комплексообразование молекулярной мишени со случайной смесью олигонуклеотидов. Аптамер-молекулярный целевой комплекс отделяют от олигонуклеотидов, не образовавших комплексы. Аптамер выделяют из отделенного комплекса и амплифицируют. Такой цикл повторяют для идентификации последовательностей аптамера с самым высоким сродством к молекулярной мишени.
При заболеваниях, которые являются результатом ненадлежащей экспрессии генов, специфическое предотвращение или уменьшение экспрессии таких генов представляет собой идеальную терапию. В принципе, выработку специфического генного продукта можно ингибировать, снижать или устранять гибридизацией одноцепочечного дезоксинуклеотида или рибодезоксинуклотиды, комплементарного к
- 42 019962 доступной последовательности в мРНК, или последовательности в пределах транскрипта, которая является существенной для пре-мРНК обработки, или для последовательности непосредственно в пределах гена. Такую парадигму генетического контроля часто называют антисмысловым или антигенным подавлением. Дополнительная эффективность обеспечивается конъюгацией с нуклеиновой кислотой алкилирующего средства, такого как средства по настоящему изобретению.
Антисмысловые соединения представляют собой нуклеиновые кислоты, предназначенные для связывания и блокирования или предупреждения выработки мРНК, ответственной за генерацию конкретного белка. Антисмысловые соединения включают антисмысловую РНК или ДНК, одно- или двухцепочечную, олигонуклеотиды или их аналоги, которые могут специфично гибридизоваться с индивидуальным разновидностями мРНК и предупреждать транскрипцию и/или обработку РНК разновидностей мРНК и/или трансляцию кодируемого полипептида, и таким образом, приводить к уменьшению количества соответствующего кодируемого полипептида. СЫид е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.Л. 86: 10006-10010 (1989); Вгобег е! а1. Αηη. Ιη!. Меб. 113:604-618 (1990); Ьогеаи е! а1. ЕЕВ8 Ьейегк, 274:53-56 (1990); Но1сеиЬегд е! а1. А'0 91/11535; \\'0 91/09865; \\'0 91/04753; \\'0 90/13641; \\'0 91/13080, \\'0 91/06629 и ЕР 386563). За счет их исключительной чувствительности к мишени и селективности антисмысловые олигонуклеотиды полезны для доставки терапевтических средств, таких как цитотоксины по изобретению, к целевой молекулярной мишени.
Другие авторы сообщали, что нуклеиновые кислоты могут связываться с двухцепочечной ДНК посредством образования тройной спирали и подавлять транскрипцию и/или синтез ДНК. Соединения в форме тройной спирали (которые также называют трехцепочечными лекарственными средствами) представляют собой олигонуклеотиды, которые связываются с последовательностями двухцепочечной ДНК и предназначены для выборочного подавления транскрипции вызывающих заболевание генов, таких как вирусные гены, например ВИЧ и вирус простого герпеса, и онкогены, т.е. они прекращают выработку белка в ядре клетки. Такие лекарственные средства связываются непосредственно с двухцепочечной ДНК в геноме клетки, для образования тройной спирали и предупреждения выработки целевого белка в клетке. См., например, РСТ публикации \У0 92/10590, \У0 92/09705, \У0 91/06626 и патент США 5176996. Таким образом, цитотоксины по настоящему изобретению также конъюгируются с последовательностями нуклеиновых кислот, которые образуют тройные спирали.
Сайт-специфичность нуклеиновых кислот (например, антисмысловых соединений и лекарственных средств в форме тройной спирали) в существенной мере не затрагивается модификацией фосфодиэфирной связи или химической модификацией конца олигонуклеотида. Таким образом, эти нуклеиновые кислоты могут быть химически модифицированы; увеличение общей стабильности связывания, увеличение стабильности относительно химического разложения, увеличение скорости, с которой олигонуклеотиды транспортируются в клетки, и обеспечение химической реакционной способности молекул. Обзор общего подхода к конструированию различных нуклеиновых кислот, пригодных для антисмысловой терапии, проведен уаи бег Кго1 е! а1., Вю!есйтдиек, 6:958-976 (1988) и 8!ет е! а1. Сапсег Яек. 48:2659-2668 (1988). Таким образом, в иллюстративном варианте цитотоксины по изобретению конъюгируются с нуклеиновой кислотой модификацией фосфодиэфирного соединения.
Кроме того, аптамеры, антисмысловые соединения и лекарственные средства в форме тройной спирали, несущие цитотоксины по изобретению, могут также включать замены, вставки, делеции или перестановки нуклеотидов, до тех пор, пока специфическая гибридизация или ассоциация с соответствующей целевой последовательностью сохраняется как функциональное свойство олигонуклеотида. Например, в некоторых вариантах будут использоваться фосфоротиоатные аналоги, более устойчивые к разложению нуклеазами, чем их природные фосфатдизфирные двойники, и, таким образом, ожидается, что они будут демонстрировать большее постоянство и большую активность ίη у1уо (см., например, СатрЬе11 е! а1., ί. Вюсйет. Вюрйук. Ме!йобк 20:259-267(1990)). Также известно, что фосфорамидатные производные олигонуклеотидов связываются с комплементарными полинуклеотидами, обладают дополнительной способностью приспосабливать присоединенные ковалентными связями молекулы лиганда и будут соответствовать способам по настоящему изобретению. См., например, ЕгоеЫег е! а1., №1с1ею Ас1бк Яек. 16(11):4831 (1988).
В некоторых вариантах аптамеры, антисмысловые соединения и лекарственные средства в форме тройной спирали включают 0-метилрибонуклеотиды (публикация ЕР № 360609). Химерные олигонуклеотиды также могут использоваться (Иад1е е! а1., №1с1ею Ас1бк Яек. 18: 4751 (1990)). Для некоторых приложений антисмысловые олигонуклеотиды и тройная спираль могут включать полиамиднуклеиновые кислоты (№е18еи е! а1., 8с1еисе 254: 1497 (1991) и публикация РСТ \У0 90/15065) или другие катионные производные (Ье!ктдег е! а1., Е Ат. Сйет. 8ос. 110: 4470-4471 (1988)). В других приложениях могут использоваться олигонуклеотиды, где одно или несколько фосфодиэфирных соединений замещены изостерической группой, такой как межнуклеозидный мостик длиной 2-4 атома, как описано в РСТ публикациях XV0 92/05186 и 91/06556, или формацетальной группой (Майеиса е! а1., б. Ат. Сйет. 8ос. 113: 77677768 (1991)) или амидной группой (N^е1κеη е! а1., 8^1^, 254: 1497-1500 (1991)).
Кроме того, нуклеотидные аналоги, например, такие, в которых сахар или основание химически модифицированы, могут использоваться в настоящем изобретении. Аналоговые формы пуринов и пи
- 43 019962 римидинов общеизвестны из уровня техники, многие из них применяются в качестве химиотерапевтических средств. Иллюстративный, но не исчерпывающий список включает 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, ^-изопентениладенин,
1- метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин,
2- метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, ^-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, β-Ό-маннозилхеозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-Ы6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусной кислоты метиловый эфир, урацил-5-оксиуксусная кислота (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, хеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, №урацил-5оксиуксусной кислоты метиловый эфир, урацил-5-оксиуксусная кислота (ν), псевдоурацил, хеозин, 2тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Кроме того, обычные основания галогенированными основаниями. Дополнительно, в положение 2'-фуранозы на основании может присутствовать замещение незаряженной объемной группой. Примеры незаряженных объемных групп включают разветвленные алкилы, сахара и разветвленные сахара.
Концевая модификация также представляет собой подходящую методику конъюгации цитотоксинов с нуклеиновой кислотой, модификации специфичности в отношении типа клеток, фармакокинетики, проницаемости ядра и абсолютной скорости захвата клеткой для олигонуклеотидных фармацевтических средств. Например, известен массив замен на концах 5' и 3' для включения реакционноспособных групп, которые позволяют ковалентное присоединение цитотоксинов. См., например, О1^дο6еοxуηис1еοΐ^6е8: АпЛепхе ΙηΙιίΛίοΐΈ οί Севе Εχρκδδίοη (1989), Сокен, Е6., СЯС Ргекк; Ргокресй кэг АпЛепке Шс1е1С Ас16 Ткегареи11С8 Юг Сапсег апб АШ8 (1991), ХУюЫгот, Ε6., ^кеу-Ызз; Сепе Яеди1аΐ^οη: Βίο1ο§ν οί АпЛепзе ЯNΑ апб ЭКА (1992), ΕΓχ1<δοη апб ΙζοπΙ, Ε6δ., Яаνеη Рге§8; и АпЛепзе ЯЫА апб ЭКА (1992), Миггау, Ε6., ^11еу-Ь188. Общие методы в отношении антисмысловых соединений см. в ΑNТI8ΕN8Ε ЯЫА АНЭ ЭНА (1988), ΌΑ. Ме1Юп, Ε6., Со16 8ргшд На^г ^аЬο^аΐο^у, Со16 8ргшд Ηа^Ьο^, Ν.Υ.).
Как минимум в одном варианте С-конец антитела модифицируют введением остатка цистеина, как описано во временной заявке США, серийный номер 60/957271, которая, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте. Такие модификации включают, не ограничиваясь ими, замещение существующего остатка аминокислоты на С-конце или около него полноразмерной последовательности тяжелой цепи, а также введение цистеинсодержащего удлинения на С-конце полноразмерной последовательности тяжелой цепи. В одном из вариантов цистеинсодержащее удлинение включает последовательность аланин-аланин-цистеин (от Ν-конца к С-концу).
Как минимум, в некоторых вариантах присутствие таких С-концевых модификаций с помощью остатка цистеина обеспечивает местоположение для конъюгации соединения, такого как терапевтическое средство или молекула маркера. В частности, присутствие реакционноспособной тиольной группы, за счет С-концевой модификации с помощью остатка цистеина, может использоваться для конъюгации соединения с применением линкеров, подробно описанных выше. Конъюгация антитела с молекулой партнера в такой форме позволяет усилить контроль над конкретным местоположением присоединения. К тому же, путем введения сайта прикрепления на С-конце или около него, конъюгация может быть оптимизирована таким образом, что она уменьшает или исключает вмешательство в функциональные свойства антитела и позволяет упрощенный анализ и контроль качества препаратов в форме конъюгата.
Поддающиеся обнаружению метки.
Конкретная метка или определяемая группа, используемая в соединении с соединениями и способами по изобретению, в целом не является критическим аспектом изобретения, до тех пор, пока она не мешает в существенной степени активности или пригодности соединения по изобретению. Поддающаяся обнаружению группа может быть каким-либо материалом, проявляющим определяемое физическое или химическое свойство. Такие определяемые метки хорошо известны в сфере иммуноанализов и, в целом, большинство меток, пригодных для таких методов, могут применяться в настоящем изобретении. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, определяемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Пригодные метки по настоящему изобретению включают магнитные гранулы (например, ^ΥNΑΒΕΑ^8™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцианат, Техасский крас3 125 35 14 32 ный, родамин и т.п.), радиоактивные метки (например, Н, I, 8, С или Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно используемые в анализах БЕЛА), и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или гранулы из пластического материала (например, полистирола, полипропилена, латекса и т.п.).
Метка может быть присоединена непосредственно или косвенно к соединению по изобретения способами, хорошо известными из уровня техники. Как указано выше, широкий спектр меток может использоваться; метку выбирают в зависимости от необходимой чувствительности, легкости конъюгирования с соединением, требований к стабильности, доступного оборудования и требований к уничтожению.
- 44 019962
Если соединение по изобретению конъюгируют с определяемой меткой, метка предпочтительно представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из радиоактивных изотопов, флуоресцентных средств, прекурсоров флуоресцентных средств, хромофоров, ферментов и их комбинаций. Способы конъюгации различных групп с антителами хорошо известны из уровня техники. Например, определяемая метка, которую часто конъюгируют с антителом, представляет собой фермент, такой как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, и глюкозооксидаза.
Не радиоактивные метки часто присоединяют косвенными средствами. В целом, молекула лиганда (например, биотин) ковалентно связывается с компонентом конъюгата. Затем лиганд связывается с молекулой другого вещества (например, стрептавидина), которая поддается обнаружению сама по себе или ковалентно связывается с сигнальной системой, такой как обнаружимый фермент, флуоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение.
Компоненты конъюгатов по изобретению могут также непосредственно конъюгироваться с соединениями, генерирующими сигнал, например конъюгация с ферментом или флуорофором. Целевыми ферментами в качестве меток, прежде всего, будут гидролазы, особенно фосфатазы, эстеразы и гликозидазы, или оксидотазы, особенно пероксидазы. Флуоресцентные соединения включают флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и т.п. Хемилюминесцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол. Обзор различных меток или систем генерации сигнала, которые могут применяться, см. в патенте США 4391904.
Средства для обнаружения меток хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, средства для обнаружения включают сцитилляционный счетчик или фотопленку, как в ауторадиографии. Если метка представляет собой флуоресцентную метку, она может быть обнаружена путем возбуждения флуорохрома на подходящей длине волны света, с обнаружением последующей флуоресценции. Флуоресценция может быть обнаружена визуально, с помощью фотопленки, с помощью электронных детекторов, таких как устройства с зарядовой связью (ССР) или фотоумножители и т.п. Подобным образом, ферментные метки могут быть обнаружены с помощью подходящих субстратов для фермента, с обнаружением продукта последующей реакции. Наконец, простые колориметрические метки могут быть обнаружены простым наблюдением цвета, связанного с меткой. Таким образом, в различных испытаниях с использованием тест-полосок, спрягаемое золото часто проявляется розовым цветом, в то время как различные конъюгированные гранулы проявляются цветом гранул.
Флуоресцентные метки на данный момент предпочтительны, поскольку они обладают преимуществом некоторых необходимых предосторожностей при обращении, и соответствуют высокопроизводительным методам визуализации (оптический анализ, в том числе преобразование изображения в цифровую форму для анализа в интегрированной системе, включающей компьютер). Предпочтительные метки обычно характеризуются одним или более из следующего: высокая чувствительность, высокая стабильность, низкий фон, низкая чувствительность к условиям окружающей среды и высокая специфичность в процессе введения метки. Многие флуоресцентные метки коммерчески доступны от химической компании 8ΙΟΜΑ (8ηίηΙ Εοπίκ, МО), ΜοΒα-ΐΠπ· РгоЬек (Енгене, ОВ), В&Э кук!етк (Μιμ^-ροΗ^ ΜΝ), РИагтааа ЬКВ Βίο^ΗηοΙο^ (Р1кса!а^ау, ΝΡ), СЬОЭТЕСН ^аЬο^а!ο^^еκ, 1пс. (РаЦ Α1!ο, СА), СНет Сенек Соф., АНпсН СНеш1са1 Сотраю- (МПтаикее, VI), С1ег1 ВекеагсН, 1пс., ΟΙΒί,Ό ΒΒΕ Ы£е ΤесНηο1οβ^еκ. 1пс. (СайЕегкЬигд, ΜΌ), Е1ика СНеписа - Β^οсНеш^ка Аиа1у!1ка (Е1ика СИепие АС, Βικί^, 8МРег1аЫ) и Αρρ^ά Β^οκуκ!етκ (Εο^γ С'11у, СА), в также из множества других коммерческих источников, известных специалисту. Кроме того, специалистам в данной области будет понятно, каким образом выбрать подходящий флуорофор для конкретного применения и, если он не является коммерчески доступным, они смогут синтезировать необходимый флуорофор άе ηονο или синтетически модифицировать коммерчески доступные флуоресцентные соединения для получения желательной флуоресцентной метки.
В дополнение к низкомолекулярным флуорофорам, природные флуоресцентные белки и сконструированные аналоги таких белков пригодны для настоящего изобретения. Такие белки включают, например, зеленые флуоресцентные белки книдарий (\νΗΓά е! а1., Р^ШсНет. РНο(οЬ^ο1. 35: 803-808 (1982); Ьесте е! а1., ί,’οπιρ. Β^οсНет. РНуκ^ο1.. 72Β:77-85 (1982)), желтый флуоресцентный белок штамма ΥΦπο ПксНеп (ЛаИзст е! а1., Β^οсНеш^κι^у. 29: 5509-15 (1990)), перидинин-хлорофилл панцирно-жгутикового вида 8утЬ^1шит (Μοι™ е! а1., Р1аи! ΜοΚα-ΐΕ-π Βίο1ο§\·, 24:673: 77 (1994)), фикобилипротеины морских цианобактерий, таких как Зу^сЮ^сс^, например фикоэритрин и фикоцианин ^ПЬанкк е! а1., 1. Βίο1. СНет. 268: 1226-35 (1993)) и т.п.
В целом, до формирования связи между цитотоксином и направляющим (или другим) агентом и, необязательно, спейсерной группой как минимум одна из химических функциональных групп будет активизирована. Специалисту в данной области будет понятно, что разнообразные химические функциональные группы, в том числе гидрокси, амино и карбоксильные группы, могут быть активизированы с помощью разнообразных стандартных методов и условий. Например, гидроксильная группа цитотоксина или направляющего агента может быть активизирована обработкой фосгеном для образования соответственно хлорформиата или п-нитрофенилхлорформиата, чтобы получить соответствующий карбонат.
- 45 019962
В иллюстративном варианте изобретения применяются направляющие средства, которые включают карбоксильную функциональную группу. Карбоксильные группы могут быть активизированы, например, превращением в соответствующий хлорангидрид кислоты или в активный эфир. Такая реакция может быть проведена в разнообразных условиях, как проиллюстрировано в МагсН, р. 388-89, выше. В иллюстративном варианте хлорангидрид кислоты получают реакцией карбоксилсодержащей группы с оксалилхлоридом. Активизированное соединение реагирует с цитотоксином или комбинацией цитотоксинплечо линкера с образованием конъюгата по изобретению. Специалистам в данной области будет понятно, что применение карбоксилсодержащих направляющих агентов является исключительно иллюстративным, и что средства, содержащие многие другие функциональные группы, могут конъюгироваться с линкерами по изобретению.
Реакционноспособные функциональные группы.
Для ясности иллюстрации последующее обсуждение сосредоточивается на конъюгации цитотоксина по изобретению с направляющим агентом. Фокус показывает пример одного из вариантов изобретения, из которого другие будут легко выведены специалистом в данной области. Фокусирование обсуждения на одном варианте никоим образом не ограничивает изобретения.
Примеры соединений по изобретению содержат реакционноспособную функциональную группу, которая в целом размещается на замещенной или незамещенной алкильной или гетероалкильной цепи, позволяя легкое присоединение к другому соединению. Подходящее местоположение для реакционноспособной группы - это концевое положение цепи.
Реакционноспособные группы и классы реакций, пригодных для практики настоящего изобретения, в общем представляют собой такие, которые хорошо известны из уровня техники в области химии биоконъюгатов. Реакционноспособная функциональная группа может быть защищенной или незащищенной, и природа защитной группы может быть изменена методами, известными из уровня техники в области органического синтеза. Классы реакций, предпочтительные на данный момент, доступные для реакционноспособных аналогов цитотоксина, представляют собой такие, которые проходят в относительно мягких условиях. Они включают, не ограничиваясь ими, нуклеофильное замещение (например, реакции аминов и спиртов с галогенангидридами кислот, активными эфирами), электрофильное замещение (например, реакции енамина) и гетероприсоединение к кратным связям углерод-углерод и углеродгетероатом (например, реакция Михаэля, гетероприсоединение Дильса-Альдера). Эти и другие подходящие реакции обсуждаются, например, в МагсН, Абνаηсеб Огдашс СНет1к!гу, 3гб Еб., 1оНп νίΕ.ν & 8опк, №\ν Уогк, 1985; Негтапкоп, Вюсоп)ида!е ТесНп1циек, Асабеиис Ргекк, 8ап Э1едо, 1996 и Реепеу е! а1., Моб1йса!юп о£ РгсИетк; Абνаηсек т СНетЫгу 8епек, νο1. 198, Атепсап СНетка1 8ос1е1у, ’№акНшд!оп, Э.С., 1982.
Иллюстративные типы реакций включают реакцию карбоксильных групп и их различных производных, в том числе, не ограничиваясь ими, эфиров Ν-гидроксисукцинимида, эфиров Ν-гидроксибензтриазола, хлорангидридов кислот, ацилимидазолов, тиоэфиров, п-нитрофенильных эфиров, алкильных, алкенильных, алкинильных и ароматических эфиров. Гидроксильные группы могут быть превращены в сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и т.п. Галогеналкильные группы превращаются в новые соединения реакцией, например, с амином, карбоксилат-анионом, тиол-анионом, карбанионом или алкоксид-ионом. Диенофильные группы (например, малеимид) вступают в реакции ДильсаАльдера. Альдегидные или кетонные группы могут быть превращены в имины, гидразоны, семикарбазоны или оксимы, или посредством таких механизмов, как гетероприсоединение Гриньяра или гетероприсоединение алкиллития. Сульфонилгалогениды легко реагируют с аминами, например, с образованием сульфонамидов. Аминные или сульфгидрильные группы, например, ацилируют, алкилируют или окисляют. Алкены могут быть превращены в массив новых соединений с помощью циклоприсоединения, ацилирования, гетероприсоединения Михаэля и т.п. Эпоксиды легко реагируют с аминами и гидроксильными соединениями.
Специалисту в данной области будет понятно, что многие из указанных соединений могут быть получены разнообразными путями, с использованием различных условий. Получение эфиров см., например, в МагсН выше, 1157; тиоэфиров, см., МагсН, выше, 362-363, 491, 720-722, 829, 941 и 1172; карбонатов, см., МагсН, выше, 346-347; карбаматов, см., МагсН, выше, 1156-57; амидов, см., МагсН выше, 1152; производных мочевины и тиомочевины, см., МагсН выше, 1174; ацеталей и кеталей, см., Сгеепе е! а1. выше 178-210 и МагсН выше, 1146; ацилоксиалкильных производных, см., Ргобгидк: Торюа1 апб Оси1аг Эгид ОеНуегу, К. В. 81оап, еб., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1992; енольных сложных эфиров, см., МагсН выше, 1160; Ν-сульфонилимидатов, см., Випбдаагб е! а1., 1. Меб. СНет., 31:2066 (1988); ангидридов, см., МагсН выше, 355-56, 636-37, 990-91 и 1154; Ν-ациламидов, см., МагсН выше, 379; Ν-оснований Манниха, см., МагсН выше, 800-02 и 828; гидроксиметилкетоновых сложных эфиров, см., Ре!гасек е! а1. Аппа1к ΝΥ Асаб. 8ск, 507:353-54 (1987); дисульфидов, см., МагсН выше, 1160; а также фосфонатных сложных эфиров и фосфонамидатов.
Реакционноспособные функциональные группы могут быть незащищенными и выбираются таким образом, что они не участвуют в реакциях или не мешают им. Альтернативно, реакционноспособная функциональная группа может быть защищена от участия в реакции присутствием защитной группы.
- 46 019962
Специалистам в данной области будет понятно, как защитить конкретную функциональную группу от воздействия выбранного набора условий реакции. Примеры подходящих защитных групп см. в Сгсспс е! а1., РгоЮсНус Сгоирк ίη Огдашс 8уп111С818, ίοΐιη \УПеу & 8οηκ, Νο\ν Уогк, 1991.
Обычно направляющий агент ковалентно присоединяют к цитотоксину с использованием стандартных химических методов через их соответствующие химические функциональные группы. Необязательно, линкер или средство присоединяют к агенту через одну или несколько спейсерных групп. Если используют комбинацию спейсерных групп, они могут быть одинаковыми или различными.
В целом, до образования связи между цитотоксином и реакционноспособной функциональной группой, и необязательно, спейсерной группой, будет активизирована как минимум одна из химических функциональных групп. Специалисту в данной области будет понятно, что разнообразные химические функциональные группы, в том числе гидрокси, амино и карбоксильные группы могут быть активизированы с использованием разнообразных стандартных методов и условий. В иллюстративном варианте изобретение включает карбоксильную функциональную группу как реакционноспособную функциональную группу. Карбоксильные группы могут быть активизированы, как описано выше.
Расщепляемый субстрат.
Расщепляемые субстраты по настоящему изобретению обозначаются как X2. Предпочтительно расщепляемый субстрат представляет собой субстрат, который может расщепляться ферментом. Предпочтительно фермент связан, непосредственно или косвенно, с опухолевыми или другими клеткамимишенями, на которые направлено лечение. Фермент может генерироваться опухолевыми или другими клетками-мишенями, на которые направлено лечение. Например, расщепляемый субстрат может представлять собой пептид, который предпочтительно расщепляется ферментом, найденным в непосредственной близости или в опухолевой или другой клетке-мишени. Дополнительно или альтернативно, фермент может быть присоединен к направляющему агенту, который специфично связан с клетками опухоли, такому как антитело, специфичное в отношении опухолевого антигена.
В качестве примеров расщепляемых ферментами субстратов, подходящих для присоединения к лекарственным средствам, описанным выше, публикации Патентных заявок РСТ \УО 00/33888, \УО 01/95943, \УО 01/95945, \УО 02/00263 и \УО 02/100353, все из которого включены в данное описание путем ссылки, раскрывают прикрепление расщепляемого пептида к лекарственному средству. Пептид расщепляется ферментом, таким как троуаза (такая как тимет олигопептидаза), СЭ10 (неприлизин), матричная металлопротеаза (такая как ММР2 или ММР9), трансмембранная серинпротеаза II типа (такая как Неркш, тестизин, ТМРВ884 или матриптаза/МТ-8Р1), или катепсин, связанный с опухолью. В этом варианте пролекарство включает лекарственное средство, как изложено выше, пептид, стабилизирующую группу и, необязательно, связывающую группу между лекарственным средством и пептидом. Стабилизирующую группу присоединяют к концу пептида, чтобы защитить пролекарство от разложения до прибытия к месту расположения опухолевой или другой клетки-мишени. Примеры подходящих стабилизирующих групп включают кислоты, не являющиеся аминокислотами, такие как янтарная кислота, дигликолевая кислота, малеиновая кислота, полиэтиленгликоль, пироглутаминовая кислота, уксусная кислота, нафтилкарбоновая кислота, терефталевая кислота и производные глутаровой кислоты; а также не кодируемые генетически аминокислоты или аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту, присоединенную к Ν-концу пептида в β-карбоксигруппе аспарагиновой кислоты или γ-карбоксильной группе глутаминовой кислоты.
Пептид обычно содержит 3-12 (или более) аминокислот. Выбор конкретных аминокислот будет зависеть, как минимум частично, от фермента, который используется для расщепления пептида, а также от стабильности пептида ίη νίνο. Один из примеров подходящего расщепляемого пептида представляет собой в-А1аЕеиА1аЕеи (8ЕО Ш ЫО. 2). Он может быть объединен со стабилизирующей группой для формирования сукцинил-в-А1аЕеиА1аЕеи (8ЕО Ш МО: 2). Другие примеры подходящих расщепляемых пептидов приведены в ссылках, процитированных выше.
В качестве иллюстративного примера, СЭ10, также известный как неприлизин, нейтральная эндопептидаза (ΝΕΡ) и общий антиген острого лимфобластного лейкоза (САЕЕА), представляет собой цинкзависимую металлопротеазу типа II на поверхности клетки. Расщепляемые субстраты, подходящие для использования с СЭ10, включают ЬеиА1аЕеи и ПеА1аЕеи. Другие известные субстраты для СЭ10 включают пептиды длиной до 50 аминокислот, хотя каталитическая эффективность часто снижается по мере увеличения размера субстрата.
Другой иллюстративный пример основан на матричных металлопротеазах (ММР). Вероятно, лучше всего описанные протеолитические ферменты, связанные с опухолями, демонстрируют очевидную корреляцию активации ММР в пределах микроокружения опухоли. В частности, растворимые матричные ферменты ММР2 (желатиназа А) и ММР9 (желатиназа В) подробно изучены и показано, что они выборочно активизируются в ходе ремоделирования ткани, включая рост опухоли. Пептидные последовательности, сконструированные для расщепления ММР2 и ММР9, созданы и исследованы для конъюгатов декстрана и метотрексата (СБаи е! а1., В^οсοη^идаΐе Сйет. 15: 931-941 (2004)); ПЭГ (полиэтиленгликоля) и доксорубицина (Вае е! а1., Эгидк Ехр. С1т. Век. 29: 15-23 (2004)); а также альбумина и доксорубицина
- 47 019962 (1<га1х е! а1., Вюогд. Меб. СЬет. Ьей. 11: 2001-2006 (2001)). Примеры подходящих последовательностей для применения с ММР включают, не ограничиваясь ими, РгоУаЮ1уЬеи11е61у (8ЕЦ ГО NΟ: 8), 61уРгоЕеи61уУа1 (81Г) ГО 9), 61уРгоЕеи61у11еА1а61у61п (81Г) ГО 10), РгоЕеи61уЕеи (81У) ГО 11), 61уРгоЕеи61уМе!Ееи8ег61п (81Г) ГО 12) и 61уРгоЕеи61уЕеиТгрА1а61п (8ЕС) ГО NΟ: 13). (См., например, процитированные выше ссылки, а также К1те е! а1., Мо1. РЬагтасеи!. 1: 9-22 (2004) и Ыи е! а1., Сапсег Кек. 60:6061-6067 (2000)) Другие расщепляемые субстраты также могут использоваться.
Другой пример представляет собой трансмембранные серинпротеазы II типа. Эта группа ферментов включает, например, гепсин, тестизин и ТМРК884. С1пА1аАгд представляет собой одну из последовательностей субстрата, подходящую в случае матриптазы/МТ-8Р1 (которая чрезмерно экспрессируется при раке молочной железы и яичника), и Ееи8егАгд, подходящий в случае гепсина (чрезмерно экспрессируется при опухолях предстательной железы и некоторых других видах опухолей). (См., например, Бее е!.а1., 1. Вю1. СЬет. 275: 36720-36725 и КигасЫ апй УататоЮ, НапбЬоок о! Ргоео1у!ю Εиζуте5. Уо1. 2, 2пб ебйюп (Ваггей А.1., КаМтдк Ν.Ό. & ^оеккпег 1.Р., ебк), р. 1699-1702 (2004)). Другие расщепляемые субстраты также могут использоваться.
Другой вид размещения расщепляемого субстрата включает получение отдельного фермента, способного к расщеплению расщепляемого субстрата, который связывают с опухолью или клетками. Например, фермент может быть связан со специфическим в отношении опухоли антителом (или другой молекулой, которая предпочтительно привлекается к опухолевой или другой клетки-мишени, такой как лиганд рецептора), после чего конъюгат фермент-антитело может быть введен больному. Конъюгат фермент-антитело направлен на и связывается с антигеном, связанным с опухолью. Впоследствии, конъюгат лекарственное средство-расщепляемый субстрат вводят больному как пролекарство. Лекарственное средство высвобождается только в непосредственной близости от опухоли при взаимодействии конъюгат лекарственное средство-расщепляемый субстрат с ферментом, который стал связанным с опухолью таким образом, что расщепляемый субстрат расщепляется и лекарственное средство высвобождается. Например, в патентах США 4975278; 5587161; 5660829; 5773435; и 6132722, все из которых включены в данное описание путем ссылки, раскрыто такое размещение. Примеры подходящих ферментов и субстратов включают, не ограничиваясь ими, β-лактамазу и производные цефалоспорина, карбоксипептидазу С2 и фолатные производные глутаминовой и аспарагиновой кислоты. В одном из вариантов конъюгат фермент-антитело включает антитело или фрагмент антитела, выбранный на основании его специфичности в отношении антигена, экспрессирующегося на клетке-мишени или на целевом участке. Обсуждение антител приведено выше. Один из примеров подходящего цефалоспорин-расщепляемого субстрата:
соон
Примеры конъюгатов.
Линкеры и расщепляемые субстраты по изобретению могут применяться в конъюгатах, содержащих дуокармицин или аналоги СВ1 в качестве цитотоксических агентов. Примеры конъюгатов по изобретению описаны более подробно ниже. Если не указано иное, заместители являются такими, как определено выше в разделе, посвященном цитотоксинам, линкерам и расщепляемым субстратам.
А. Линкерные конъюгаты.
Один из примеров подходящего конъюгата представляет собой соединение формулы
где Б1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Р представляет собой линкер, содержащий структуру:
где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Б2 представляет собой самоуничтожающийся линкер и содержит
- 48 019962
где каждый из Я17, Я18 и Я19 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила;
\ν равно целому числу от 0 до 4;
о равно 1;
Ь4 представляет собой линкерную группу;
р представляет собой 0 или 1;
X4 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов;
Ό содержит структуру
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23;
Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я3 представляет собой ОЯ11, где Я11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)Я Я , С(О)ОЯ , Ο’(Ό)ΝΡ Я , Р(О)(ОЯ12)2, С(О)СНЯ12Я13, 8Я12 и 81Я12Я13Я14;
Я4, Я4', Я5 и Я5' представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΟ-, \ЯЯ, \С(О)Я\ ОС(О)1ХК15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ ' \Я'6 и О(СН2)пХ(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из Я4, Я4, Я5 и Я5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп;
η равно целому числу от 1 до 20;
Я15 и Я16 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, Я6 и Я7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
Я7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к Я6, где X1 представляет собой уходящую группу, где Я11 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Е.
В одном из вариантов структура лекарственного средства соответствует (9) или (12) выше. Один из конкретных примеров соединения, подходящего для использования в качестве конъюгата, представляет собой
- 49 019962
Другой пример типа конъюгата представляет собой соединение формулы
в которой Ь1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Р представляет собой линкер, содержащий структуру
где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь2 представляет собой самоуничтожающийся линкер;
о равно 0 или 1;
Ь4 представляет собой линкерную группу;
р представляет собой 0 или 1;
X4 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов;
Ό содержит структуру
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΚ23;
Я23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
Я3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=0), 8Я11, ΝΗΚ11 и ОЯ11, где Я11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)Я12Я13, С(О)ОЯ12, С(О)1МЯ12Я13, Р(О)(ОЯ12)2, С(О)СНЯ12Я13, 8Я12 и 81Я12Я13Я14, где Я12, Я13 и Я14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где Я12 и Я13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
Я4, Я4, Я5 и Я5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΌ, Ν'Ι/Π, М'(О)Я'. ОС(О)1МЯ15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ МЯ и О(СН2)^(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из Я4, Я4, Я5 и Я5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, п равно целому числу от 1 до 20;
- 50 019962
Я15 и Я16 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
как минимум один из Я4, Я4, Я5 и Я5 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Р и содержит
где ν равно целому числу от 1 до 6;
27' 28 28' каждый из Я27, Я27', Я28 и Я28' независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
Я6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, Я6 и Я7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
Я7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к Я6, где X1 представляет собой уходящую группу.
В одном из вариантов структура лекарственного средства соответствует (9) или (12) выше. В конкретном примере соединение, подходящее для использования в качестве конъюгата, представляет собой
где г равно целому числу в интервале от 0 до 24.
Другой пример подходящего конъюгата представляет собой соединение формулы
где Ь1 представляет собой самоуничтожающийся линкер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
Р представляет собой линкер, содержащий структуру:
где АА1 представляет одну или несколько групп, независимо выбранных из группы, состоящей из природных аминокислот и неприродных α-аминокислот;
с равно целому числу от 1 до 20;
Ь3 представляет собой спейсерную группу, включающую первичный или вторичный амин, или функциональную карбоксильную группу; где, если Ь3 присутствует, т равно 0, и амин Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной карбоксильной группой Ό или карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной аминогруппой Ό;
о равно 0 или 1;
Ь представляет собой линкерную группу, где Ь4 включает
непосредственно присоединенный к Ν-концу (АА1)с, где
Я20 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
каждый из Я25, Я25', Я26 и Я26' независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
и ! независимо равны целым числам от 1 до 6;
р представляет собой 1;
- 51 019962
X4 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из защищенных реакционноспособных функциональных групп, незащищенных реакционноспособных функциональных групп, определяемых меток и направляющих агентов;
Ό содержит структуру:
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетеро циклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенно го арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероцикло алкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и №В23;
В23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, заме щенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
В3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=О), 8В11, NΗΒ11 и ОВ11, где В11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(О)В12В13, С(О)ОВ12, С(О)1МВ12В13, Р(О)(ОВ12)2, С(О)СНВ12В13, 8В12 и 81В12В13В14, где В12, В13 и В14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где В12 и В13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
В4, В4', В5 и В5' представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, за мещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гете роарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ΝΌ, ЯВ15В16, М'(О)В \ ОС(О)1МВ15В16, ОС(О)ОВ15, С(О)В15, 8В15, ОВ15, СВ15=№16 и О(СН2)У(СН3)2, или члены любой смежной пары, состоящей из В4, В4, В5 и В5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, п равно целому числу от 1 до 20;
В15 и В16 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или не замещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где В15 и В16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
В6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, В6 и В7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
В7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к В6, где X1 представляет собой уходящую группу;
как минимум один из В4, В4, В5, В5, В15 или В16 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с Р.
В одном из вариантов структура лекарственного средства соответствует (9) или (12) выше. Конкретный пример соединения, подходящего для использования в качестве конъюгата, представляет собой
где г равно целому числу в интервале от 0 до 24.
- 52 019962
Другие примеры соединений, подходящего для использования в качестве конъюгатов, включают
- 53 019962 или
где К представляет собой
О и г равно целому числу от 0 до 24.
- 54 019962
Конъюгаты также могут быть образованы с использованием лекарственных средств структуры (13), таких как следующие соединения:
где г равно целому числу от 0 до 24.
А. Конъюгаты расщепляемого линкера.
Один из примеров подходящего конъюгата представляет собой соединение, имеющее следующую структуру:
где Ь1 представляет собой самоуничтожающийся спейсер; т равно целому числу 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
- 55 019962
X2 представляет собой расщепляемый субстрат; Ό содержит структуру
где кольцевая система А представляет собой группу, выбранную из замещенных или незамещенных арильных, замещенных или незамещенных гетероарильных и замещенных или незамещенных гетероциклоалкильных групп;
Е и С представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, гетероатома, одинарной связи; или
Е и С соединены с образованием кольцевой системы, выбранной из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
X представляет собой группу, выбранную из О, 8 и ΝΒ23;
К23 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
К3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=0), 8К11, ЫНК11 и 0К11, где К11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(0)К12К13, С(0)0К12, С(0)1МК12К13, Р(0)(0К12)2, С(0)СНК12К13, 8К12 и 81К12К13К14, где К12, К13 и К14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где К12 и К13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, К6 и К7 соединены с образованием циклопропильного кольца; и
К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к К6, где X1 представляет собой уходящую группу;
К4, К4, К5 и К5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, Ν02, МК15К16, ЫС(0)К15, ОС(О)1МК15К16, 0С(0)0К15, С(0)К15, 8К15, 0К15, СК15=ЫК16 и О(СН2)пЫ(СНз)2, или члены любой смежной пары, состоящей из К4, К4, К5 и К5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, где η равно целому числу от 1 до 20;
К15 и К16 независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила, где К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
как минимум один из К4, К4, К5 и К5 связывает указанное лекарственное средство с Ь1, если он присутствует, или с X2 и выбирают из группы, состоящей из
30' 31 31' где К , К , К и К независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила, заме щенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или
- 56 019962 незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила; ν равно целому числу от 1 до 6.
Примеры подходящих расщепляемых линкеров включают в-А1аЬеиА1аЬеи и
соон
В одном из вариантов структура лекарственного средства соответствует (9) или (12) выше. Примеры соединения такого типа включают
где Я представляет собой Е, С1, Вг или Ι.
Фармацевтические препараты и введение.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения предлагается фармацевтический препарат, содержащий соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Соединения, описанные в данном документе, в том числе фармацевтически приемлемые носители, такие как аддитивные соли или их гидраты, могут быть введены больному с использованием широкого спектра способов или путей введения. Подходящие способы введения включают, не ограничиваясь ими, ингаляционное, трансдермальное, пероральное, ректальное, через слизистую оболочку, энтеральное и парентеральное введение, в том числе внутримышечные, подкожные и внутривенные инъекции.
Предпочтительно конъюгаты по изобретению вводят парентерально, более предпочтительно внутривенно.
В данном описании термины вводить или введение предназначены включать все средства прямой и косвенной доставки соединения до предполагаемого места его действия.
Соединения, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты можно вводить отдельно, в комбинации с другими соединениями по изобретению и/или в виде коктейлей с другими терапевтическими средствами. Конечно, выбор терапевтических средств, которые можно вводить совместно с соединениями по изобретению, будет зависеть, отчасти, от состояния, подлежащего лечению.
Например, при введении больному, страдающему от патологического состояния, вызванного микроорганизмом, который зависит от аутоиндуктора, соединения по изобретению можно вводить в коктейлях, содержащих средства, применяемые для лечения боли, инфекции и других симптомов и нежелательных эффектов, обычно сопровождающих заболевание. Такие средства включают, например, болеутоляющие средства, антибиотики и т.п.
При введении для лечения рака у пациента соединения можно вводить в коктейлях, содержащих противораковые средства и/или дополнительные потенцирующие средства. Соединения можно также вводить в коктейлях, содержащих средства для лечения побочных эффектов радиационной терапии, такие как противорвотные, радиопротекторные средства и т.п.
Дополнительные потенцирующие средства, которые могут вводиться совместно с соединениями по изобретению, включают, например, трициклические антидепрессанты (например, имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и
- 57 019962 мапротилин); антидепрессанты, не относящиеся к трициклическим (например, сертралин, тразодон и циталопрам); антагонисты Са+2 (например, верапамил, нифедипин, нитрендипин и кароверин); амфотерицин; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); противоаритмические лекарственные средства (например, хинидин); антигипертензивные лекарственные средства (например, резерпин); средства для истощения тиольных групп (например, бутионин и сульфоксимин) и лейковорин кальций.
Активное соединение(я) по изобретению вводят в существующем виде или в форме фармацевтической композиции, где активное соединение(я) находится в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательных веществ или разбавителей. Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением обычно получают в обычной форме, с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и адъюванты, которые облегчают введение активных соединений в препараты, которые могут применяться в фармации. Соответствующий препарат будет зависеть от выбранного способа введения.
Для введения через слизистую оболочку в препарате используют усиливающие проникновение вещества (пенетранты), соответствующие барьеру, сквозь который необходимо обеспечить проникновение. Такие пенетранты общеизвестны из уровня техники.
Для перорального введения соединения могут быть легко введены в препараты путем объединения активного соединения(й) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными из уровня техники. Такие носители предоставляют возможность вводить соединения по изобретению в таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкие формы, гели, сиропы, суспензии и т.п., для перорального приема больным, которые нуждаются в лечении. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены с использованием твердого вспомогательного вещества, необязательно с размалыванием полученной смеси и обработкой смеси гранулированием, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно получить таблетки или ядра драже. Подходящими вспомогательными веществами, в частности, являются наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). При желании, могут быть добавлены улучшающие расщепление вещества, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как натрия альгинат.
На ядра драже наносят подходящее покрытие. Для этой цели могут использоваться концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или титана диоксид, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены в таблетки или покрытия драже с целью идентификации или характеристики различных комбинаций доз активных соединений.
Фармацевтические препараты, которые могут применяться для приема внутрь, включают твердые желатиновые капсулы, а также мягкие капсулы, изготовленные из желатина и пластификаторов, таких как глицерин или сорбит. Твердые желатиновые капсулы могут содержать активные ингредиенты в примеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как различные виды крахмала, и/или смазывающие вещества, такие как тальк или магния стеарат и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все препараты для перорального введения должны содержать дозы, подходящие для такого введения.
Для буккального введения композиции могут принимать форму таблеток или леденцов, изготовленных обычным способом.
Для ингаляционного введения соединения для использования по настоящему изобретению подходящим образом можно вводить в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или небулайзера, с применением подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единица лекарственной формы может быть определена с помощью клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть изготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или аппарате для вдувания, содержащие порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть введены в препараты для парентерального введения инъекцией, например инъекцией болюса или непрерывной инфузией. Инъекция представляет собой предпочтительный метод введения для композиций по настоящему изобретению. Препараты для инъекций могут быть представлены в дозированной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозовых емкостях, с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляном или водном носителе и могут содержать вспомогательные вещества, например суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства, такие как поперечно сшитый поливинил
- 58 019962 пирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как натрия альгинат.
Фармацевтические препараты для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Дополнительно, суспензии активных соединений могут быть получены в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые увеличивают растворимость соединений, чтобы позволить получение высоко концентрированных растворов. Для инъекций средства по изобретению могут быть введены в водные растворы, предпочтительно в физиологически совместимые буферные растворы, такие как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буферный раствор.
Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для разбавления подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.
Соединения также могут быть введены в композиции для ректального применения, такие как суппозитории или клизмы для удерживания, например, содержащие обычные суппозиторные основы, такие как масло какао или другие глицериды.
В дополнение к препаратам, описанным выше, соединения могут также быть введены в препараты с пролонгированным высвобождением. Такие препараты длительного действия можно вводить имплантацией или трансдермальной доставкой (например, подкожно или внутримышечно), внутримышечной инъекцией или в виде трансдермального пластыря. Таким образом, например, соединения могут быть введены в препараты с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, как эмульсия в приемлемом масле) или ионообменными смолами или как малорастворимые производные, например как малорастворимая соль.
Фармацевтические композиции также могут содержать подходящие твердофазные или гелеобразные носители или вспомогательные вещества. Примеры таких носителей или вспомогательных веществ включают, не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, различные виды крахмала, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Предпочтительная фармацевтическая композиция представляет собой композицию, предназначенную для инъекции, такой как внутривенная инъекция, и содержит от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мас.% конъюгата лекарственного средства, где общая масса фармацевтической композиции принята за 100%. Конъюгат лекарственного средства может быть конъюгатом антитело-цитотоксин, где выбирают антитело, нацеленной на конкретный вид рака.
Библиотеки.
Также в пределах контекста настоящего изобретения находятся библиотеки цитотоксинов, конъюгатов цитотоксин-линкер и агент-линкер цитотоксинов, линкеров по изобретению и конъюгатов цитоктоксин-расщепляемый субстрат по изобретению. Примеры библиотек включают как минимум 10 соединений, более предпочтительно как минимум 100 соединений, даже более предпочтительно как минимум 1000 соединений, и все еще более предпочтительно как минимум 100000 соединений. Библиотеки находятся в такой форме, которая позволяет легко осуществлять поиск на предмет конкретных свойств, например цитотоксичности, расщепления линкера или субстрата ферментом, или другим реактивом для расщепления. Примеры форм включают форматы микрочипа, микромассивы и т.п.
Основная цель параллельного или комбинаторного синтеза состоит в генерации библиотеки различных молекул, которые разделяют общую особенность, в данном описании обозначенную как платформа. Путем замены различных фрагментов в каждой из вариабельных частей молекулы платформы увеличивают охваченное библиотекой пространство. Теории и современная химия лекарственных средств отстаивают концепцию занятого пространства как ключевого фактора в определении эффективности конкретного соединения против конкретной биологической мишени. При создании библиотеки различных молекул, в которой исследуется большой процент целевого пространства, шансы создания высоко эффективного соединения резко возрастают.
Параллельный синтез в целом проводится на твердой подложке, такой как полимерная смола. Платформа или другое подходящее промежуточное соединение присоединены к смоле расщепляемым химическим линкером. Осуществляют реакции для изменения платформы, когда она присоединена к частице. Вариации реагентов и/или условий реакции обеспечивают структурное разнообразие, которое является отличительным признаком каждой библиотеки.
Попытки параллельного синтеза молекул небольшого размера (не олигомеров, с молекулярной массой 200-1000) редко производились до 1990 г. См., например, Сатрк, с1 а1., Лппакк йс Оштка, 70: 848 (1990). Недавно Е11тапп был раскрыт параллельный синтез на твердофазной подложке (также обозначается как комбинаторный) 11 аналогов бензодиазепина наряду с некоторыми простагландинами и бетаобращенными миметиками. Примеры такого раскрытия приведены в патенте США 5288514. Другое имеющее отношение к данной теме раскрытие параллельного синтеза молекул небольшого размера можно найти в патенте США 5324483. В данном патенте раскрыт параллельный синтез от 4 до 40 соединений
- 59 019962 на каждой из 16 различных платформ. СНен е! а1. также применяли стратегии органического синтеза для создания не пептидных библиотек, синтезированных с использованием многостадийных способов на полимерной подложке. (СНеи е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос, 116: 2661-2662 (1994)).
Как только библиотека уникальных соединений получена, подготовка библиотеки иммуноконъюгатов или антител может быть осуществлена с использованием библиотеки аутоиндукторов, как исходной точки, с использованием описанных здесь способов.
Наборы.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются наборы, включающие одно или несколько соединений или композиций по изобретению и инструкция по применению соединения или композиции. В иллюстративном варианте в изобретении предлагается набор для конъюгации плеча линкера по изобретению с другой молекулой. Набор включает линкер и инструкции по присоединению линкера к конкретной функциональной группе. Набор может дополнительно или альтернативно включать одно или несколько цитотоксических лекарственных средств, направляющих средств, определяемых меток, расщепляемых субстратов, фармацевтических солей или буферов. Набор также может включать емкость и необязательно один или несколько флаконов, пробирок, колб, бутылей или шприцев. Другие форматы набора будут очевидны для специалиста в данной области, и находятся в пределах контекста настоящего изобретения.
Очистка.
В другом иллюстративном варианте в настоящем изобретении предлагается способ выделения молекулярной мишени для конъюгата лиганд-цитотоксин или расщепляемый субстрат-цитотоксин по изобретению, которая связывается с расщепляемым субстратом X2 или лигандом X4. Способ предпочтительно включает контакт клеточного препарата, содержащего мишень, с иммобилизированным соединением, с формированием таким образом комплекса между рецептором и иммобилизированным соединением.
Цитотоксин по изобретению может быть иммобилизирован на аффинной подложке любыми способами из уровня техники. Альтернативно, цитотоксин может быть иммобилизирован с использованием одного или нескольких расщепляемых субстратов или линкеров по изобретению.
В другом иллюстративном варианте изобретения предлагается матрица для аффинной очистки.
В способе выделения мишени по изобретению обычно будет применяться один или несколько методов аффинной хроматографии. Аффинная хроматография позволяет определить эффективное выделение различных молекул, такие как биологические молекулы или биополимеры, с использованием их сайтов распознавания для некоторых химических структур не подложке, с высшей степенью селективности. В литературе опубликовано множество статей, монографий и книг на тему аффинной хроматографии, в том числе на такие темы, как подложки для аффинной хроматографии, поперечно сшитые члены, лиганды, их приготовление и применение. Примеры таких ссылок включают О^гоуе, МеШойк Εηζутο1. 182: 357-71 (1990); ЕегтеШ, Вюе^. 70: 199-209 (1990). Ниалд е! а1., 1. СНгота!одг. 492: 431-69 (1989); РипПсаНои ой еихутех Ьу Ьерагт-8ерЬаго5е аШиИу сНгота!одгарНу, 1. СЬгота!одг., 184: 335-45 (1980); Еагооц1, Εиζуте Εη§., 4: 441-2 (1978); №51пка\\а, Снет. ΤесЬηο1., 5(9): 564-71 (1975); Сшйогй е! а1., ίη, Ргас!. Н1дН Рег1огт. Ыс.|. СНгота!одг., 8ипр5оп (ей.), 193-206 (1976); №51ика\уа, Ргос. Ιη!. ^огкзНор Тес1то1. Рго!ет 8ер. 1тргоу. В1оой Р1а§та ЕтсИот!^, 8аг1йЬегд (ей.), 422-35; (1977) АЕТтНу сНгота!одгарНу о1 еиζуте8, АйтНу СНгота!одг., Ргос. Ιη!. 8утр. 25-38, (1977) (РиЬ. 1978) и АйшНу сНгота!одгарНу: А ргасйса1 арргоасН, Оеам е! а1. (ей.), ШЬ Рге55 Ытйей, Охйогй, Е^Ций (1985). Специалисты в данной области получат достаточное руководство в разработке конкретных методов аффинной хроматографии с использованием материалов изобретения.
В представленном способе среды аффинной хроматографии различной химической структуры могут использоваться в качестве подложек. Например, агарозные гели и поперечно сшитые агарозные гели пригодны в качестве материалов подложки, поскольку их гидрофильность делает их относительно свободными от неспецифического связывания. Другие пригодные подложки включают, например, стеклянные бусины с контролируемым размером пор (СРС), целлюлозные частицы, гранулы полиакриламидного геля и гранулы геля 8ерНайех™, сделанные из декстрана и эпихлоргидрина.
Способы применения конъюгатов лекарственных средств.
В дополнение к композициям и конструкциям, описанным выше, в настоящем изобретении также предлагается целый ряд методов, которые могут практиковаться с использованием соединений и конъюгатов по изобретению. Способы применения конъюгата лекарственное средство-лиганд и конъюгата лекарственное средство-расщепляемый субстрат по настоящему изобретению включают уничтожение или подавление роста или репликации опухолевой клетки или раковой клетки, лечение рака, лечение предракового состояния, уничтожения или подавление роста или репликации клетки, которая экспрессирует аутоиммунное антитело, лечение автоиммунного заболевания, лечение инфекционного заболевания, предупреждение размножения опухолевой клетки или раковой клетки, предупреждение рака, предупреждение размножения клетки, которая экспрессирует аутоиммунное антитело, предупреждение аутоиммунного заболевания и предупреждение инфекционного заболевания. Такие способы применения включают введение животному, такому как млекопитающее или человек, нуждающемуся в этом, эффективно
- 60 019962 го количество конъюгата лекарственное средство-лиганд или конъюгата лекарственное средстворасщепляемый субстрат. В некоторых вариантах фермент вводят отдельно, таким образом, что он становится связанным с опухолью или клеткой-мишенью.
Конъюгат лекарственное средство-лиганд или комплекс лекарственное средство-расщепляемый субстрат по настоящему изобретению пригоден для лечения, например, рака, аутоиммунного заболевания или инфекционного заболевания у животного. Предлагаются композиции и способы лечения опухолей путем обеспечения композиции в фармацевтически приемлемой форме пациенту, в фармацевтически эффективном количестве композиции по настоящего изобретения.
Данное изобретение особенно пригодно для лечения рака и для подавления размножения опухолевой клетки или раковой клетки у животного. Рак или предраковое состояние включает, не ограничиваясь ими, опухоль, метастаз или любое заболевание или расстройство, которое характеризуется бесконтрольным ростом клеток, которое можно лечить или предупреждать введением комплексов лекарственное средство-лиганд или лекарственное средство-расщепляемый субстрат по настоящему изобретению. Комплекс доставляет лекарственное средство к опухолевой клетке или раковой клетке.
В одном из вариантов с использованием комплекса лекарственное средство-лиганд лиганд специфично связывается или присоединяется к раковой клетке или связанному с опухолевой клеткой антигену. Из-за тесной близости к лиганду лекарственное средство может захватываться опухолевой клеткой или раковой клеткой посредством, например, опосредованного рецептором эндоцитоза. Антиген может быть присоединен к опухолевой клетке или раковой клетке или может представлять собой белок внеклеточного матрикса, связанный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. После попадания в клетку, линкер гидролитически расщепляется опухолевой клеткой или связанными с раковой клеткой протеазами, таким образом высвобождая лекарственное средство. Высвобожденное лекарственное средство далее свободно диффундирует и индуцирует цитотоксическую активность. В альтернативном варианте лекарственное средство отщепляется от комплекса лекарственное средство-лиганд за пределами опухолевой клетки или раковой клетки, и лекарственное средство впоследствии проникает в клетку.
Лиганд может связываться, например, с опухолевой клеткой или раковой клеткой, антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который находится на поверхности опухолевой клетки или раковой клетки, или антигеном опухолевой клетки или раковой клетки, который представляет собой белок внеклеточного матрикса, связанный с опухолевой клеткой или раковой клеткой. Лиганд может быть сконструирован специально для конкретного вида опухолевой клетки или раковой клетки. Таким образом, вид опухоли или рака, которые можно эффективно лечить, можно изменять путем выбора лиганда.
В одном из вариантов с применением комплекса лекарственное средство-расщепляемый субстрат, расщепляемый субстрат расщепляется ферментом (или другой молекулой, которая может расщеплять субстрат), который связан с опухолью или другой клеткой-мишенью. После контакта с ферментом расщепляемый субстрат расщепляется ферментом, таким образом высвобождая лекарственное средство. Высвобожденное лекарственное средство далее свободно диффундирует и индуцирует цитотоксическую активность. Расщепляемый субстрат может расщепляться внутри или за пределами опухолевой клетки или мишени. Вид опухоли или рака, которые можно эффективно лечить, можно изменять путем выбора расщепляемого субстрата и связанного фермента.
Характерные примеры предраковых состояний, которые могут быть мишенью конъюгатов, включают, не ограничиваясь ими: метаплазию, гиперплазию, дисплазию, полипы ободочной и прямой кишки, актинический кератоз, актинический хейлит, вирусы папилломы человека, лейкоплакию, красный плоский лишай и болезнь Боуэна.
Характерные примеры видов рака или опухолей, которые могут быть мишенью конъюгата, включают, не ограничиваясь ими: рак легкого, рак ободочной и прямой кишки, рак предстательной железы, лимфому, меланому, рак молочной железы, рак яичника, рак яичка, рак ЦНС, рак почки, рак почечной лоханки, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак ротовой полости, рак носа, рак затылка и лейкоцитоз. Для среднего специалиста в данной области будет очевидно, что конкретный лиганд или расщепляемый субстрат, используемый в конъюгате, можно выбирать таким образом, чтобы он нацеливал лекарственное средство на ткань опухоли, которую необходимо лечить с помощью лекарственного средства.
В одном их вариантов настоящего изобретения предлагается способ уничтожения клетки. Способ включает доставку к клетке количества соединения по изобретению, достаточного для уничтожения указанной клетки. В иллюстративном варианте соединение вводят субъекту, несущему клетку. В дополнительном иллюстративном варианте введение служит цели замедления или остановки роста опухоли, которая включает клетку (например, клетка может быть опухолевой клеткой). Для введения с целью задержки роста скорость роста клетки должна быть как минимум на 10% меньше скорости роста перед введением. Предпочтительно скорость роста будет замедлена как минимум на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, или рост будет остановлен полностью.
Эффективные дозы.
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают композиции, содержащие активный ингредиент в терапевтически эффективном количестве, т.е. в коли- 61 019962 честве, эффективном для достижения предусмотренной цели. Фактическое количество, эффективное для конкретного применения, будет зависеть, среди прочего, от состояния, подлежащего лечению. Определение эффективного количества находится в пределах квалификации специалистов в данной области, особенно в свете детального раскрытия в данном описании.
Для любого соединения, описанного в данном описании, терапевтически эффективное количество может быть изначально определено в результате анализов с использованием культуры клеток. Целевые значения концентрации в плазме будут представлять собой такие концентрации активного соединения(й), которые способны подавлять рост или деление клеток. В предпочтительных вариантах клеточная активность подавляется как минимум на 25%. Целевые значения концентрации в плазме активного соединения^), которые способны индуцировать подавление как минимум приблизительно 50, 75 или даже 90% или выше клеточной активности, являются предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением. Процент подавления клеточной активности у больного можно контролировать для оценки достижения надлежащей концентрации лекарственного средства в плазме, и дозы можно корректировать в сторону увеличения или уменьшения для достижения желательного процента подавления.
Как хорошо известно из уровня техники, терапевтически эффективные количества для использования у человека также могут быть определены с использованием моделей на животных. Например, доза для человека может быть установлена таким образом, чтобы достичь концентрации в кровотоке, которая признана эффективной у животных. Дозы для человека можно корректировать с помощью контроля подавления клеток и осуществлять коррекцию доз в сторону увеличения или уменьшения, как изложено выше.
Терапевтически эффективная доза также может быть определена на основании данных для человека, касающихся соединений, которые доказанно проявляют подобную фармакологическую активность. Доза для применения может быть скорректирована на основе относительной биодоступности и активности вводимого соединения по сравнению с известным соединением.
Коррекция дозы для достижения максимальной эффективности у человека базируется на методах, описанных выше, и других методах, известных из уровня техники, которые находятся в пределах возможностей среднего специалиста.
В случае местного применения системная концентрация вводимого соединения в кровотоке не будет особенно важной. В таких случаях соединение применяют таким образом, чтобы обеспечить на местном участке концентрацию, эффективную для достижения предусмотренного результата.
Для применения в профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с аномальным размножением клеток, предпочтительной является концентрация вводимого соединения в кровотоке приблизительно от 0,001 до 20 мкМ, предпочтительно от приблизительно 0,01 до 5 мкМ.
Дозы соединений, описанных в данном описании, для перорального введения пациентам, обычно варьируют в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 10000 мг/сутки, более типично от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мг/сутки и наиболее типично от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг/сутки. В терминах массы тела пациента интервал типичных доз составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 150 мг/кг/сутки, более типично от приблизительно 0,1 до приблизительно 15 мг/кг/сутки и наиболее типично от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг/сутки, например 5 или 3 мг/кг/сутки.
Как минимум, в некоторых вариантах, дозы для введения пациенту, которые замедляют или подавляют рост опухоли, могут составлять 1 мкмоль/кг/сутки или меньше. Например, дозы для введения пациенту могут составлять 0,9, 0,6, 0,5, 0,45, 0,3, 0,2, 0,15 или 0,1 мкмоль/кг/сутки или меньше (ссылка на моли лекарственного средства) лекарственного средства или конъюгата лекарственного средства, такого как конъюгат антитело-лекарственное средство. Предпочтительно лекарственное средство или конъюгат лекарственного средства подавляет рост опухоли при ежедневном введении доз на протяжении периода как минимум 5 дней. Как минимум, в некоторых вариантах, опухоль представляет собой опухоль человеческого типа у мышей 8СШ. В качестве примера, мышь 8СШ может быть мышью СВ17.8СШ (доступны от Тасошс, бегтайота, ΝΥ).
Для других способов введения доза и интервал могут быть скорректированы индивидуально, чтобы обеспечить уровни вводимого соединения в плазме, эффективные при конкретном клиническом состоянии, подлежащем лечению. Например, в одном из вариантов соединение по изобретению можно вводить в относительно высоких концентрациях несколько раз в сутки. Альтернативно, может быть более желательным вводить соединение по изобретению в минимальных эффективных концентрациях, применяя схему менее частого введения. Это обеспечит схему лечения, соответствующую тяжести заболевания у индивидуума.
С использованием приведенных в данном описании указаний может быть разработана эффективная схема лечения, которая не ведет к существенной токсичности и по-прежнему сохраняет полную эффективность с точки зрения лечения клинических симптомов, продемонстрированных конкретным больным. Такое планирование должно включать тщательный выбор активного соединения, с учетом таких факторов, как активность соединения, относительная биодоступности, масса тела пациента и тяжесть неблагоприятных побочных эффектов, предпочтительный способ введения и профиль токсичности выбранного
- 62 019962 средства.
Соединения, композиции и способы по настоящему изобретению дополнительно проиллюстрированы примерами ниже. Приведенные примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.
Примеры
Материалы и методы.
В приведенных ниже примерах, если не указано иное, температура предоставлена в градусах Цельсия (°С); операции осуществляют при комнатной температуре или температуре окружающей среды (обычно интервал приблизительно 18-25°С; испарение растворителя осуществляют с помощью роторного испарителя при пониженном давлении (обычно, 4,5-30 мм рт.ст) при температуре бани до 60°С; протекание реакций обычно контролируют методом ТСХ, и время реакции приведено только с целью иллюстрации; значения температуры плавления приведены без коррекции; продукты демонстрируют удовлетворительные данные Н-ЯМР и/или микроанализа; значения выхода приведены только для иллюстрации; также используются следующие обычные сокращения: Тпл. (температура плавления), л (литр[ы]), мл (миллилитры), ммоль (миллимоли), г (граммы), мг (миллиграммы), мин (минуты), ЖХ-МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) и ч (часы).
Спектры 'Н-ЯМР были измерены на спектрометре Уапап Мегсигу 300 МГц и соответствовали предполагаемой структуре. Химические сдвиги зарегистрированы в частях на миллион (промилле) по отношению к тетраметилсилану. Масс-спектры с ионизацией электрораспылением зарегистрированы на масс-спектрометре Регкш Е1тег 8с1ех АР1 365. Элементный анализ выполнялся ВоЬейкоп Мюго1й ЬаЬога!опек, Мабйоп, ΝΓ Использовали силикагель для флэш-хроматографии категории Е. Мегск (230400 меш). Обращенно-фазовую аналитическую ВЭЖХ выполняли на приборе НР 1100 или Уапап Ргок!аг 210 с колонкой РНепотепех Ьипа 5 мкм С-18 (2) 150x4,6 мм или колонкой Уапап М1сгокогЬ-МУ 0,1 мкм
С-18 150x4,6 мм. Скорость потока составляла 1 мл/мин с градиентом 0-50% буферного раствора В на протяжении 15 мин или 10-100% буферного раствора В на протяжении 10 мин с УФ-детектором на длине волны 254 нм. Буферный раствор А: 20 мМ аммония формиата + 20% ацетонитрила или 0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле; буферный раствор В: 20 мМ аммония формиата + 80% ацетонитрила или 0,1% водной трифторуксусной кислоты. Обращенно-фазовую препаративную ВЭЖХ выполняли на приборе Уапап Ргок!аг 215 с колонкой ^а!егк Эе11а Рак 15 мкм С-18 300x7,8 мм.
Пример 1.
НС1. Н-УаЮШи,
О ДМФА, ΚΙ, КаСО3! 100С, θΑ^--^.βΓ на протяжении ночи
«9%
О и О ί
0-%--·- УЛ и г
Бензилхлорформиат
Вг ТГФ, ДИЭА
ΗΒγ,Η2Ν^ ..... г
6*7.
н фосген в толуоле
- 63 019962
Синтез соединения 1.
К раствору 2-бромэтиламинбромида (5 г, 24,4 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют диизопропилэтиламин (8,5 мл, 48,8 ммоль) и бензилхлорформиат (3,48 мл, 24,4 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом смеси этилацетат/гексан (3/7) с получением соединения 1 в виде масла (4 г, 64%).
Ή ЯМР (СБС13): δ 3,54 (ушир.с, 2Н), 3,61 (ушир.с, 2Н), 5,12 (с, 2Н), 7,36 (м, 5Н).
Синтез соединения 2.
К раствору соединения 1 (3,34 г, 12,99 ммоль) и валин-трет-бутилового эфира (3,27 г, 15,59 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют калия карбонат (5,39 г, 38,97 ммоль) и калия йодид (2,59 г, 15,59 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при 100°С, выдерживая при этой температуре в течение ночи. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом смеси этилацетат/гексан (2/8) с получением соединения 2 в виде масла (3,12 г, 69%).
Ή ЯМР (СБС13): δ 0,92 (м, 6Н), 1,46 (с, 9Н), 1,86 (м, 1Н), 2,53 (м, 1Н), 2,80 (м, 2Н), 3,18 (м, 1Н), 3,31 (м, 1Н), 5,10 (с, 2Н), 5,25 (ушир.с, 1Н), 7,36 (м, 5Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 296 (М+Н-трет-бутил+), 352 (М+Н+).
Синтез соединения 3.
Раствор соединения 2 (3,4 г, 9,72 ммоль) и палладий на угле (200 мг) в метаноле (30 мл) помещают в атмосферу водорода с давлением 1 атм при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Палладий отфильтровывают и реакционную смесь упаривают до сухого состояния с получением соединения 3 в виде масла (2,1 г, 98%).
Ή ЯМР (СО30П): δ 0,94 (м, 6Н), 1,47 (с, 9Н), 1,63 (ушир.с, 2Н), 1,90 (м, 1Н), 2,47 (м, 1Н), 2,73 (м, 2Н).
Синтез соединения 4.
К раствору соединения 3 (2,1 г, 9,72 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляют Етос08и (К-(9-флуоренилметоксикарбонилокси)сукцинимид (3,28 г, 9,72 ммоль) при 0°С. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч при 0°С. Смесь упаривают до сухого состояния, после чего остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с использованием градиента от 100% дихлорметана до 0,5% метанола в дихлорметане и в конце 1% метанола в дихлорметане, с получением соединения 4 в виде бесцветного масла (2,55 г, 60%).
Ή-ЯМР (СБС13): δ 1,03 (д, 3Н), 1,14 (д, 3Н), 1,52 (с, 9Н), 2,28 (м, 1Н), 3,14 (м, 2Н), 3,46 (м, 2Н), 3,89 (д, 1Н), 4,24 (м, 1Н), 4,44 (м, 2Н), 7,29 (м, 2Н), 7,40 (м, 2Н), 7,64 (м, 2Н), 7,80 (д, 2Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 383 (М+Н-трет-бутил+), 440 (М+Н+), 462 (М+№Г), 478 (М+К+).
Синтез соединения 5.
Через раствор соединения 4 (177 мг, 0,4 ммоль) в смеси тетрагидрофуран/вода (3/1, 8 мл) пропускают газообразный НС1 на протяжении 5 мин. Реакционную смесь перемешивают при 37°С, выдерживая при этой температуре в течение ночи, после чего смесь упаривают до сухого состояния с получением соединения 5 в виде твердого вещества (168 мг, 98%) которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
Ή-ЯМР (СБС13): δ 1,04 (д, 3Н), 1,14 (д, 3Н), 2,32 (м, 1Н), 3,18 (м, 2Н), 3,46 (м, 2Н), 3,95 (д, 1Н), 4,22 (м, 1Н), 4,42 (м, 2Н), 7,29 (м, 2Н), 7,39 (м, 2Н), 7,64 (м, 2Н), 7,79 (д, 2Н);
- 64 019962
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 383 (М+Н+), 405 (М+№1').
Синтез соединения 6.
К раствору №метил-1,2-фенилендиамина (2 мл, 17,6 ммоль) в ТГФ (15 мл) добавляют ди-третбутилдикарбонат (3,32 г, 15,2 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле, используя градиент 30% этилацетата в гексане, с получением соединения 6 в виде бесцветного масла (1,12 г, 32%).
'|| ЯМР (СБС13): δ 1,46 (ушир.с, 9Н), 3,15 (с, 3Η), 3,73 (ушир.с, 2Н), 6,75 (д, 2Н), 7,06 (м, 2Н).
Синтез соединения 7.
К раствору соединения 6 (777 мг, 3,05 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляют 2-нитробензолсульфонилхлорид (811 мг, 3,66 ммоль) и диизопропилэтиламин (796 мкл, 4,57 ммоль) при 0°С. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 10% этилацетата в гексане с получением соединения 7 в виде твердого вещества желтого цвета (1,17 г, 94%).
'|| ЯМР (СОС13): δ 1,49 (ушир.с, 9Н), 2,47 и 2,61 (2 ушир.с, 3Η), 7,05 (ушир.д, 1Н), 7,27 (м, 2Н), 7, 56-7, 92 (м, 5Н).
Синтез соединения 8.
К раствору соединения 7 (326 мг, 0,8 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляют карбонат калия (164 мг, 1,19 ммоль) и метилйодид (148 мкл, 2,39 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 10% этилацетата в гексане с получением соединения 8 в виде твердого вещества желтого цвета (370 мг, 65%).
'|| ЯМР (СОзОО): δ 1,35 и 1,52 (2с, 9Н), 3,16 и 3,21 (2с, 3Η), 3,26 и 3,29 (2с, 3Η), 6,93 (д, 1Н), 7,20 (м, 1Н), 7,6 (м, 2Н), 7,68-7,80 (м, 4Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 444 (Μ+Ν;ί), 460 (М+К+).
Синтез соединения 9.
К раствору соединения 8 (355 мг, 0,85 ммоль) в дихлорметане (5 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (5 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин, затем распределяют между этилацетатом (100 мл) и насыщенным раствором натрия аммония бикарбоната (200 мл). Органическую фракцию промывают солевым раствором (100 мл), сушат над №ь8О4 и упаривают с получением свободного амина (соединение 9) в виде твердого вещества белого цвета (270 мг, 98%).
'|| ЯМР (СБС13): δ 2,68 (с, 3Η), 3,30 (с, 3Η), 6,56 (м, 2Н), 6,88 (м, 1Н), 7,20 (м, 1Н), 7,48 (м, 1Н), 7,57 (м, 1Н), 7,65 (м, 2Н).
Синтез соединения 10.
К раствору соединения 9 (270 мг, 0,84 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляют 2н. фосген в толуоле (440 мкл, 2,5 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивают в течение 30 мин и упаривают до сухого состояния с получением соединения 10 в виде твердого вещества белого цвета (297, 92%) которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
'|| ЯМР (СБС13): δ 3,25 и 3,30 (2с, 3Η), 3,34 и 3,44 (2с, 3Η), 6,98 (м, 1Н), 7,25-7,40 (м, 2Н), 7,45 (м, 1Н), 7,55-7,80 (м, 4Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 384 (М+Н+), 407 (М+№1'), 422 (М+К+).
Синтез соединения 11.
К раствору соединения 10 (120 мг, 0,31 ммоль) в растворе 10% ДМФА в ТГФ (3 мл) добавляют Вос-С1Ч-РАВОН [(8)-трет-бутил-1-(4-(гидроксиметил)фениламино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-илкарбамат, 238 мг, 0,62 ммоль], Ν,Ν-диметиламинопиридин (76 мг, 0,62 ммоль) и диизопропилэтиламин (55 мкл, 0,31 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при 65°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 дней. Растворитель удаляют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 5% метанола в дихлорметане, с получением соединения 11 в виде твердого вещества (90 мг, 40%).
'|| ЯМР (СО3ОП): δ 1,43 (ушир.с, 9Н), 1,56-1,70 (м, 3Η), 1,79 (м, 1Н), 3,06-3,27 (м, 8Н), 4,17 (2м, 1Н), 5,04 и 5,17 (2 ушир.с, 2Н), 6,89 и 6,95 (2д, 1Н), 7,15-7,26 (м, 2Н), 7,37-7,72 (м, 8Н), 7,80 (м, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 729 (М+Н+), 751 (М+№1'), 767 (М+К+).
Синтез соединения 12.
К раствору соединения 11 (84 мг, 0,11 ммоль) в ДМФА (2 мл) добавляют калия карбонат (48 мг, 0,33 ммоль) и тиофенол (60 мкл, 0,55 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель удаляют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 5% метанола в дихлорметане, с получением соединения 12 в виде твердого вещества (55 мг, 87%).
'|| ЯМР (СО3ОП): δ 1,44 (ушир.с, 9Н), 1,56-1,70 (м, 3Η), 1,78 (м, 1Н), 2,76 (ушир.с, 3Η), 3,05-3,20 (м,
5Н), 4,17 (ушир.с, 1Н), 4,99 (ушир.с, 2Н), 6,62 (м, 2Н), 6,93 (м, 1Н), 7,15 (м, 2Н), 7,40-7,60 (м, 3Н);
- 65 019962
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 566 (М+№1'), 581 (М+К+).
Синтез соединения 13.
К раствору соединения 12 (65 мг, 0,12 ммоль) в дихлорметане (3 мл) добавляют 2н. фосген в толуоле (180 мкл, 0,36 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1 ч. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла (72 мг, 100%), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла (72 мг, 0,12 ммоль) в 5% Ν-метилпирролидоне в дихлорметане (1 мл) добавляют соединение 18 (см. пример 2 ниже) (25 мг, 0,06 ммоль) и Ν,Ν-диметиламинопиридин (22 мг, 0,18 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 13 в виде масла (15 мг, 35%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,42 (ушир.с, 9Н), 1,45-1,80 (м, 4Н), 2,97 (ушир.с, 6Н), 3,10-3,36 (м, 7Н), 3,57 (ушир.с, 3Н), 3,98 (ушир.с, 1Н), 4,10-4,35 (м, 4Н), 4,50-4,75 (м, 3Н), 5,15 (ушир.с, 2Н), 7,16-7,95 (м, 16Н), 8,2 (д, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1034 (М+Н+), 1056 (М+№1'), 1073 (М+К+).
Синтез соединения 14.
К раствору соединения 13 (13 мг, 0,011 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (0,5 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору соли ТФУ и амина в дихлорметане (0,5 мл) добавляют соединение 5 (5 мг, 0,012 ммоль), бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфония гексафторфосфат (ВОР) (6 мг, 0,013 ммоль) и диизопропилэтиламин (8 мкл, 0,044 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 14 в виде масла (9 мг, 50%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,03 и 1,10 (2 м, 6Н), 1,60 (м, 2Н), 1,80 (м, 2Н), 2,20 (м, 1Н), 2,99 (с, 6Н), 3,043,50 (м, 11Н), 3,60 (ушир.с, 3Н), 3,8 (ушир.с, 1Н), 4,00 (ушир.с, 1Н), 4,20-4,45 (м, 6Н), 4,50-4,75 (м, 4Н), 5,15 (ушир.с, 2Н), 7,20-7,70 (м, 22Н), 7,77 (д, 2Н), 7,90 (ушир.с, 2Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1300 (М+Н+).
Синтез соединения 15.
К раствору соединения 14 (9 мг, 0,006 ммоль) в ДМФА (0,5 мл) добавляют пиперидин (6 мкл, 0,06 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в растворе 10% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют №{у-малеимидобутирилокси}сукцинимидный эфир (ГМБС) (3,5 мг, 0,012 ммоль) и диизопропилэтиламин (2 мкл, 0,012 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 15 в виде масла (6,5 мг, 75%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,04-1,13 (м, 6Н), 1,65 (м, 2Н), 1,75 (м, 1Н), 1,90 (м, 3Н), 2,23 (м, 3Н), 2,98 и 3,01 (2 с, 6Н), 3,05-3,25 (м, 6Н), 3,60 (м, 2Н), 3,45-3,55 (м, 6Н), 3,64 (т, 2Н), 3,80 (м, 2Н), 4,05 (м, 1Н), 4,35 (ушир.с, 1Н), 4,41 (м, 2Н), 4,55 (м, 2Н), 4,80 (м, 1Н), 5,15 (ушир.с, 2Н), 6,78 (с, 2Н), 7,22 (дд, 2Н), 7,357,65 (м, 11Н), 7,90-8,00 (м, 3Н), 7,77 (д, 2Н), 7,90 (ушир.с, 2Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1243 (М+Н+).
- 66 019962
Пример 2.
69%
64%
НС1, Η-νβ]·Οΐ-Βυ, о ДМФА, К), КэСОз, I оос.
Вг на протяжении ночи и н
Семилклорформиат,
ΗΒΓ.Η,Ν'^ ТГФ'ЛИЭА -
70%
1) 10% пиперидин в ДМФА 2} 5, ГА ТУ, ДИЭА
ΡΝΡσ(θ}α, СН1СМ>ЛММР, ДИЭА. ДМ АП
ЦТФУ/СН^Ь: 2> 17, ДИЭА, ДМФА
СНгСЬ, ТГФ, Εΐ,Ν
2) Вос-пиперазин ЕЬЫ, СН2С11
1) пиперидин (5 экв) в ДМФА
2) ΜΑΕ’ΡΕΟ4 ΝΗ сложный эфир нлй6МВ5, ДИЭА, 10% ДМФА а СНзСЬ
Синтез соединения 16.
К раствору Εтοс-С^ΐ-ΡАВΟН (2 г, 3,98 ммоль) в ДМФА (45 мл) добавляют пиперидин (5 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь упаривают до сухого состояния, после чего остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом от 100% дихлорметана до 10% метанола в дихлорметане и в конце 30% метанола в дихлорметане, с получением Н-Сй-РАВОН в виде бесцветного масла (1 г, 90%).
К раствору Н-Сй-РАВОН (80 мг, 0,28 ммоль) в ДМФА (4 мл) добавляют соединение 5 (100 мг, 0,24 ммоль) (см. получение в примере 1), ГАТУ (100 мг, 0,26 ммоль) и диизопропилэтиламин (125 мкл, 0,84 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 16 в виде масла (119 мг, 66%).
'|| ЯМР (СО3ОП): δ 1,03-1,11 (2д, 6Н), 1,58 (м, 2Н), 1,77 (м, 1Н), 1,88 (м, 1Н), 2,23 (м, 1Н), 3,05-3,20 (м, 4Н), 3,44 (м, 2Н), 3,83 (д, 1Н), 4,21 (м, 1Н), 4,39 (м, 2Н), 4,54 (ушир.с, 2Н), 4,60 (м, 1Н), 7,30 (м, 4Н), 7,37 (м, 2Н), 7,51 (м, 2Н), 7,62 (м, 2Н), 7,77 (м, 2Н), 8,80 (д, 1Н), 10,05 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 646 (М+Н+), 668 (М+№1'), 684 (М+К+).
Синтез соединения 17.
К раствору соединения 16 (190 мг, 0,25 ммоль) в 10% ММР в дихлорметане (4 мл) добавляют диизопропилэтиламин (131 мкл, 0,75 ммоль), Ν,Ν-диметиламинопиридин (15 мг, 0,12 ммоль) и 4-нитрофенилхлорформиат (101 мг, 0,5 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 17 в виде масла (151 мг, 65%).
'|| ЯМР (СО3ОП): δ 1,04-1,11 (2д, 6Н), 1,59 (м, 2Н), 1,79 (м, 1Н), 1,89 (м, 1Н), 2,24 (м, 1Н), 3,05-3,20
- 67 019962 (м, 4Н), 3,44 (м, 2Н), 3,83 (д, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,39 (м, 2Н), 4,60 (м, 1Н), 5,22 (ушир.с, 1Н), 7,29 (м, 2Н), 7,39 (м, 4Н), 7,60 (м, 4Н), 7,75 (д, 2Н), 8,81 (д, 1Н), 10,05 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 811 (М+Н+), 833 (Μ+Ν;·Γ), 848 (М+К+).
Синтез соединения 19.
К раствору соединения 18 (50 мг, 0,11 ммоль) в 40% ТГФ в дихлорметане (8 мл) добавляют 4-нитрофенилхлорформиат (87 мг, 0,43 ммоль) и триэтиламин (88 мкл, 0,64 ммоль) при 0°С. Полученной таким образом смеси дают нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель испаряют и остаток отделяют осаждением из эфира с последующим фильтрованием с получением Р№С-18 в виде твердого вещества желтого цвета (60 мг, 90%).
К раствору Р№С-18 (60 мг, 0,095 ммоль) в дихлорметане (5 мл) добавляют соединение Вос-пиперазин (71 мг, 0,38 ммоль) и триэтиламин (53 мкл, 0,38 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 18 в виде масла (77 мг, 90%).
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 678 (М+Н+), 700 (Μ+Ν;·Γ), 716 (М+К+).
Синтез соединения 20.
К раствору соединения 19 (28 мг, 0,035 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (0,5 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в ДМФА (1 мл) добавляют соединение 17 (28 мг, 0,035 ммоль) и диизопропилэтиламин (18 мкл, 0,105 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 20 в виде масла (36 мг, 70%).
Ή ЯМР (СОзОО): δ 1,03-1,10 (2д, 6Н), 1,58 (м, 2Н), 1,77 (м, 1Н), 1,87 (м, 1Н), 2,23 (м, 1Н), 2,97 (ушир.с, 6Н), 3,05-3,20 (м, 4Н), 3,30-3,85 (м, 14Н), 3,97 (м, 1Н), 4,19-4,41 (м, 6Н), 4,60 (м, 2Н), 4,69 (м, 1Н), 5,11 (ушир.с, 2Н), 7,16 (дд, 1Н), 7,27-7,38 (м, 7Н), 7,45 (м, 1Н), 7,51-7,63 (м, 7Н), 7,76 (д, 2Н), 7,85 (д, 2Н), 8,24 (ушир.с, 1Н), 8,79 (д, 1Н), 10,00 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1248 (М+Н+).
Синтез соединения 21.
К раствору соединения 20 (36 мг, 0,024 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляют пиперидин (12 мкл, 0,12 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в 10% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют Ма1-ПЭГ4-МН эфир (19 мг, 0,037 ммоль) и диизопропилэтиламин (8,5 мкл, 0,048 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 21 в виде масла (25 мг, 62%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,06-1,12 (2д, 6Н), 1,59 (м, 2Н), 1,78 (м, 1Н), 1,89 (м, 1Н), 2,24 (м, 1Н), 2,44 (т, 2Н), 2,50 (т, 2Н), 2,99 (ушир.с, 6Н), 3,05-3,20 (м, 4Н), 3,46-3,85 (м, 34Н), 3,99 (м, 1Н), 4,25 (м, 1Н), 4,35 (м, 2Н), 4,59-4,73 (м, 3Н), 5,13 (ушир.с, 2Н), 6,79 (с, 2Н), 7,18 (дд, 1Н), 7,31 (д, 1Н), 7,36 (м, 2Н), 7,47 (м, 1Н), 7,58 (м, 5Н), 7,89 (м, 2Н), 8,24 (ушир.с, 1Н), 8,79 (д, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1423 (М+Н+).
Синтез соединения 22.
К раствору соединения 20 (26 мг, 0,017 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляют пиперидин (9 мкл, 0,088 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в 10% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют ГМБС (7,5 мг, 0,025 ммоль) и диизопропилэтиламин (6 мкл, 0,034 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 22 в виде масла (13 мг, 52%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,07-1,13 (2д, 6Н), 1,60 (м, 2Н), 1,78 (м, 1Н), 1,90 (м, 3Н), 2,24 (м, 3Н), 3,00 (ушир.с, 6Н), 3,05-3,24 (м, 4Н), 3,42-3,74 (м, 16Н), 3,78-3,90 (м, 4Н), 4,00 (м, 1Н), 4,34 (м, 1Н), 4,39 (м, 2Н), 4,60 (м, 1Н), 4,80 (м, 2Н), 5,14 (ушир.с, 2Н), 6,81 (с, 2Н), 7,22 (дд, 1Н), 7,37 (м, 3Н), 7,50 (м, 1Н), 7,60 (м, 5Н), 7,92 (м, 2Н), 8,24 (ушир.с, 1Н), 8,79 (д, 1Н), 10,05 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 1191 (М+Н+).
- 68 019962
Пример 3.
Бензил хлорформи ат, ТГФ, ДИЭА
О
Н'---Вг н
НС1 Н-Уа!-ОьВи,
ДМФА, ΚΙ. Κ,^Οι, 100С, на протяжении ночи
69%
<яр^«-Бутил-4аминобензоат ЭДК, ΗΟΒΐ, СоСЬ, ДМФА, СН,СЬ в ДМФА
2) 5, ГАТУ, ДИЭА, ДМФА
62%
1) 10% пиперидин в ДМФА
2) МАЬ-РЕбд-ΝΗ сложный
1) ТфУ,СНгСЬ, анизол
2) ГАТУ, ДМФА, ДИЭА. 29
Синтез соединения 23.
Раствор этил-5-нитроиндол-2 карбоксилата (2 г, 8,5 ммоль) и палладий на угле (200 мг) в 50% метанола в дихлорметане (100 мл) помещают в атмосферу водорода с давлением 1 атм при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Палладий отфильтровывают и реакционную смесь упаривают до сухого состояния с получением соединения 23 в виде бесцветного масла (1,68 г, 97%).
1Н ЯМР (СО30О): δ 1,38 (т, 3Н), 4,34 (к, 2Н), 6,86 (дд, 1Н), 6,95 (д, 1Н), 6,98 (д, 1Н), 7,25 (д, 1Н).
Синтез соединения 24.
К раствору соединения 23 (300 мг, 1,47 ммоль) в дихлорметане (5 мл) добавляют Вос20 (385 мг, 1,76 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 10% этилацетата в гексане с получением соединения 24 в виде твердого вещества белого цвета (272 мг, 61%).
- 69 019962
Ή ЯМР (СРзОР): δ 1,39 (т, 3Н), 1,52 (с, 9Н), 4,37 (к, 2Н), 7,07 (с, 1Н), 7,23 (дд, 1Н), 7,34 (д, 1Н), 7,68 (ушир.с, 1Н).
Синтез соединения 25.
К раствору соединения 24 (100 мг, 0,33 ммоль) в этаноле (3 мл) добавляют раствор ЫОН (12 мг, 0,49 ммоль) в воде (1 мл). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч при температуре 50°С. Реакционную смесь упаривают до сухого состояния с получением масла. Остаток растворяют в воде и подкисляют до рН 3 с помощью 10% НС1 с последующей экстракцией Е!ОАс. Органический раствор сушат над №28О4, фильтруют и упаривают до сухого состояния с получением соединения 25 в виде бесцветного масла (85 мг, 92%).
Ή ЯМР (СР3ОР): δ 1,51 (с, 9Н), 7,07 (д, 1Н), 7,23 (дд, 1Н), 7,33 (д, 1Н), 7,68 (ушир.с, 1Н).
Синтез соединения 26.
К раствору Ептос-СН-ОН (206 мг, 0,52 ммоль) в растворе 30% ДМФА в дихлорметане (3 мл) добавляют ЭДК (120 мг, 0,62 ммоль), ΗОΒ! (84 мг, 0,62 ммоль) и трет-бутил-4-аминобензоат (120 мг, 0,62 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 10 мин, затем к смеси добавляют хлорид меди (84 мг, 0,62 ммоль). Смесь перемешивают в течение ночи. Смесь упаривают до сухого состояния, после чего остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с градиентом 5% метанола в дихлорметане, с получением соединения 26 в виде бесцветного масла (184 мг, 62%).
Ή ЯМР (СР3ОР): δ 1,53-1,58 (м, 2Н), 1,57 (с, 9Н), 1,71 (м, 1Н), 1,82 (м, 1Н), 3,08 (м, 1Н), 3,19 (м, 1Н), 4,21 (м, 1Н), 4,28 (м, 1Н), 4,38 (м, 2Н), 7,28-7,39 (м, 3Н), 7,49 (м, 2Н), 7,56-7,86 (м, 5Н), 7,89 (м, 2Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 573 (М+Н+), 595 (Μ+Ν;·Γ), 611 (Μ+Κ+).
Синтез соединения 27.
К раствору соединения 26 (1 г, 1,75 ммоль) в ДМФА (18 мл) добавляют пиперидин (2 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь упаривают до сухого состояния, после чего остаток очищают флэш-хроматографией с градиентом от 100% дихлорметана до 5% метанола в дихлорметане и в конце 20% метанола в дихлорметане с получением бесцветного масла (561 мг, 92%).
К раствору масла (561 мг, 1,6 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляют диизопропилэтиламин (67 9 мкл, 3,9 ммоль), соединение 5 (509 мг, 1,3 ммоль) (см. получение в примере 1) и ГАТУ (494 мг, 1,3 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь упаривают до сухого состояния, после чего остаток очищают флэшхроматографией на силикагеле с градиентом 5% метанола в дихлорметане с получением соединения 27 в виде бесцветного масла (691 мг, 65%).
Ή ЯМР (СР3ОР): δ 1,36 (дд, 6Н), 1,58-1,62 (м, 2Н), 1,6 (с, 9Н), 1,71 (м, 1Н), 1,82 (м, 1Н), 2,00 (м, 1Н), 2,65 (м, 2Н), 3,2-3,3 (м, 4Н), 3,70 (м, 1Н), 4,21 (м, 1Н), 4,28 (м, 2Н), 4,38 (м, 2Н), 4,60 (м, 1Н), 7,287,39 (м, 4Н), 7,60-7,70 (м, 4Н), 7,8 (д, 2Н), 7,89 (д, 2Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 716 (М+Н+), 737 (Μ+Ν;·Γ), 753 (Μ+Κ+).
Синтез соединения 28.
К раствору соединения 27 (300 мг, 0,45 ммоль) в ДМФА (9 мл) добавляют пиперидин (1 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое растирают с эфиром (20 мл). Материал отфильтровывают с получением твердого вещества белого цвета (186 мг, 84%).
К раствору свободного амина (32 мг, 0,065 ммоль) в дихлорметане (1 мл) добавляют Μа1-ПЭГ4-NΗ эфир (50 мг, 0,097 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 28 в виде масла (47 мг, 95%).
Ή ЯМР (СР3ОР): δ 1,10 и 1,15 (2д, 6Н), 1,58-1,62 (м, 2Н), 1,6 (с, 9Н), 1,75 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,45 (т, 2Н), 2,5 (т, 2Н), 3,10-3,25 (м, 4Н), 3,30 (м, 2Н), 3,45-3,65 (м, 16Н), 3,75 (м, 4Н), 3,85 (д, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 6,80 (с, 2Н), 7,67 (д, 2Н), 7,90 (д, 2Н), 8,80 (д, 1Н), 10,20 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением), 891 (М+Н+), 913 (Μ+Ν;·Γ), 929 (Μ+К).
Синтез соединения 29.
К раствору соединения 28 (47 мг, 0,062 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (0,5 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением соединения 29 в виде масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки (40 мг, 92%).
Ή ЯМР (СР3ОР): δ 1,10 и 1,15 (2д, 6Н), 1,60 (м, 2Н), 1,80 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,45 (т, 2Н), 2,5 (т, 2Н), 3,10-3,25 (м, 4Н), 3,30 (м, 2Н), 3,45-3,65 (м, 16Н), 3,75 (м, 4Н), 3,85 (д, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 6,80 (с, 2Н), 7,67 (д, 2Н), 7,95 (д, 2Н), 8,80 (д, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 836 (М+Н+), 858 (Μ+Ν;·Γ), 874 (Μ+К).
- 70 019962
Синтез соединения 31.
К раствору 30 (100 мг, 0,2 ммоль) в Е!ОАс (2 мл) добавляют концентрированный раствор НВг в Е!ОАс (3 мл) при комнатной температуре. Снятие защиты с Вос заканчивается через 1 ч. Осажденный материал отфильтровывают (количественный выход). Затем соль ТФУ и амина растворяют в ДМФА (3 мл). К полученному раствору добавляют соединение 25 (55 мг, 0,2 ммоль), диизопропилэтиламин (173 мкл, 1 ммоль) и ГАТУ (79 мг, 0,2 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 31 в виде твердого вещества белого цвета (86 мг, 57%).
1Н ЯМР (СО3ОП): δ 1,54 (с, 9Н), 2,91 (с, 3Н), 3,10-3,60 (м, 8Н), 3,72 (м, 1Н), 3,97 (м, 1Н), 4,30-4,60 (м, 3Н), 6,94 (ушир.с, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 7,12 (д, 1Н), 7,45 (м, 2Н), 7,68 (д, 1Н), 7,75 (ушир.с, 1Н), 7,86 (д, 1Н), 8,23 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 562 (М+Н-100+), 606 (М+Н-56+), 662 (М+Н+), 685 (М+№1'), 701 (М+К+).
Синтез соединения 32.
К раствору соединения 31 (30 мг, 0,039 ммоль) в дихлорметане (0,5 мл) добавляют анизол (100 мкл) и трифторуксусную кислоту (0,4 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем смесь упаривают до сухого состояния с получением масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
К раствору масла в ДМФА (1 мл) добавляют соединение 29 (36 мг, 0,039 ммоль), диизопропилэтиламин (40 мкл, 0,23 ммоль) и ГАТУ (15 мг, 0,039 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 32 в виде масла (36 мг, 60%).
1Н ЯМР (СО3ОП): δ 1,09 и 1,15 (2д, 6Н), 1,62 (м, 2Н), 1,81 (м, 1Н), 1,93 (м, 1Н), 2,27 (м, 1Н), 2,45 (т, 2Н), 2,51 (т, 2Н), 2,98 (с, 3Н), 3,13-3,25 (м, 4Н), 3,47-3,62 (м, 24Н), 3,76 (м, 4Н), 3,82 (м, 1Н), 3,85 (д, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,55-4,70 (м, 4Н), 6,79 (с, 2Н), 7,06 (с, 1Н), 7,36 (ушир.с, 1Н), 7,43-7,54 (м, 2Н), 7,72-7,81 (м, 3Н), 7,91 (м, 3Н), 8,05 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н), 8,82 (д, 1Н), 10,25 (с, 1Н);
ЖХ-МС (ионизация электрораспылением): 691 (М+2Н+)/2, 1381 (М+Н+), 1419 (М+К+).
Пример 4.
3
Синтез соединения 3.
Хлорангидрид бромуксусной кислоты 2 (240 мкл, 2,86 ммоль) добавляют по каплям к раствору бензил-2-аминоэтилкарбамата 1 (500 мг, 2,6 ммоль) и ТЕА (800 мкл, 5,7 ммоль) в 10 мл дихлорметана при 0°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч, и температура постепенно растет до комнатной температуры. Растворители испаряют с последующей обработкой водой и экстракцией этилацетатом. Органическую фракцию промывают 10% раствором лимонной кислоты, водой, насыщенным раствором натрия бикарбоната и солевым раствором и сушат над безводным натрия сульфатом, с получением соединения 3 (260 мг, выход 32%).
МС: М+1 = 315,3.
Ή ЯМР (СБС13): δ ррт 7,37 (5Н), 5,11 (2Н), 3,83 (2Н), 3,40 (4Н).
Синтез соединения 6.
1,5 г Ртос-цитрулина 5 (0,0038 моль), 0,88 г трет-бутил-4-аминобензоата 4 (0,0045 моль), 0,6 г НОВ! (0,0045 моль), 0,68 г ЭДК (0,0043 моль) и каталитическое количество меди хлорида перемешивают в течение ночи в смеси ДХМ/ДМФА (2:1) 9 мл. Растворитель удаляют и продукт очищают флэшколоночной хроматографией на силикагеле с использованием 5-10% МеОН в ДХМ с получением соединения 6 (1,54 г, выход 71%).
МС: М+1 = 573,9.
- 71 019962
Синтез соединения 8.
Снятие защиты защитной группы Ртос с соединения 6 (300 мг, 0,66 ммоль) осуществляют с использованием 5% пиперидина в ДМФА на протяжении 20 мин. Растворитель испаряют и неочищенное твердое вещество промывают диэтиловым эфиром с получением 230 мг соединения 7 (выход 99%).
МС: М41 = 352.
Осуществляют реакцию 230 мг соединения 7 (0,65 ммоль) с Ртос-валином 333 мг (0,98 ммоль) и 188 мг ЭДК (0,98 ммоль) в ДМФА и ДХМ с получением 240 мг соединения 8 (выход 55%) после очистки на силикагеле 5-10% МеОН в ДХМ.
МС: М41 = 673.
Синтез соединения 10.
Снимают защиту с 500 мг соединения 8 (0,75 ммоль) с использованием пиперидина в ДМФА с получением соединения 9, которое промывают диэтиловым эфиром после удаления растворителей. Осуществляют реакцию соединения 9 без дополнительной очистки с 235 мг соединения 3 (0,75 ммоль) в присутствии 125 мг ΚΙ (0,75 ммоль) и 313 мкл триэтиламина при температуре 40°С, выдерживая при этой температуре в течение 2 ч. Неочищенную реакционную смесь упаривают и очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 300 мг соединения 10 с выходом 55,8%.
Синтез соединения 11.
Снимают защиту с соединения 10 (300 мг) с помощью НСЬ-ЕЛ на протяжении 3 ч. Растворитель испаряют и продукт сушат под глубоким вакуумом с получением соединения 11.
МС: М[+1] = 628.
1Н ЯМР (ДМСО): δ ррт 10,45 (1Н), 8,8 (1Н), 8,5 (1Н), 7,88 (2Н), 7,75 (2Н), 7,3 (5Н), 6,1 (1Н), 5,5 (2Н), 4,99 (2Н), 4,5 (1Н), 3,7-3,4 (3Н), 3,2-2,9 (5Н), 2,16 (1Н), 1,45 (2Н). 1,1 (3Н), 0,92 (3Н).
Синтез соединения 14.
Раствор соединения 12 (42 мг, 0,09 ммоль) в 4н. НВг в ЕЮЛс (5 мл) перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 45 мин. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 4 ч. Κ остатку в ДМФА (2 мл) добавляют 5-(амино-третбутоксикарбонил)индон-2-карбоновую кислоту (39,2 мг, 0,14 ммоль) и ВОР (71 мг, 0,16 ммоль) с последующим добавлением ДИПЭА (83 мкл, 0,48 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 20 мин, и пропускают сквозь короткую колонку с силикагелем. Растворитель удаляют и неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 20% ЕЮЛс в гексане с получением соединения 14 (49 мг, 88%).
1Н ЯМР (ДМСО-й6): δ 11,63 (с, 1Н), 9,18 (ушир.с, 1Н), 8,19 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 8,09 (ушир.с, 1Н), 7,90 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,79 (ушир.с, 1Н), 7,53-7,58 (м, 3Н), 7,39-7,43 (м, 3Н), 7,28-7,35 (м, 3Н), 7,11 (с, 1Н), 5,29 (с, 2Н), 4,80 (т, 1Н, 11,2 Гц), 4,54 (дд, 1Н, 8,8 Гц), 4,31 (м, 1Н), 3,92 (дд, 1Н, 1=10,2 Гц), 3,82 (дд, 1Н, 1=10,7 Гц), 1,47 (с, 9Н).
- 72 019962
Синтез соединения 15.
Смесь соединения 14 (49 мг, 0,08 ммоль) и 10% Рб-С (35 мг) в Ме0Н/СН2С12 (1/2, 10 мл) дегазируют под вакуумом на протяжении 40 с. Полученную смесь помещают в атмосферу водорода и перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 7 ч. Реакционную смесь фильтруют сквозь целит (промывая смесью Ме0Н-СН2С12). Растворитель удаляют под вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием 2% МеОН в ДХМ с получением соединения 15 (40,6 мг, 97%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6 δ 11,59 (с, 1Н), 10,43 (с, 1Н), 9,18 (ушир.с, 1Н), 8,09 (д, 1Н, 6=8,2 Гц), 7,93 (ушир.с, 1Н), 7,81 (д, 1Н, 6=8,2 Гц), 7,78 (ушир.с, 1Н), 7,49 (т, 1Н, 6=8,4 Гц), 7,27-7,35 (м, 3Н), 7,08 (с, 1Н), 4,80 (т, 1Н, 11,2 Гц), 4,54 (дд, 1Н, 8,8 Гц), 4,31 (м, 1Н), 3,92 (дд, 1Н, 6=10,2 Гц), 3,82 (дд, 1Н, 6=10,7 Гц), 1,47 (с, 9Н).
Синтез соединения 16.
Раствор смеси соединения 15 (36 мг, 0,07 ммоль), 4-метил-1-пиперазинкарбонилхлорида гидрохлорида (20 мг, 0,10 ммоль), аллилового спирта (0,1 мл) и безводного пиридина (63 мкл) в СН2С12 (7 мл) перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре. Без удаления растворителя, неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 2-10% МеОН в СН2С12 с получением соединения 16 (32,4 мг, 73%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,59 (с, 1Н), 9,18 (ушир.с, 1Н), 8,09 (д, 1Н, 6=8,2 Гц), 7,93 (ушир.с, 1Н), 7,81 (д, 1Н, 6=8,2 Гц), 7,78 (ушир.с, 1Н), 7,49 (т, 1Н, 6=8,4 Гц), 7,27-7,35 (м, 3Н), 7,08 (с, 1Н), 4,80 (т, 1Н, 11,2 Гц), 4,54 (дд, 1Н, 8,8 Гц), 4,31 (м, 1Н), 3,92 (дд, 1Н, 6=10,2 Гц), 3,82 (дд, 1Н, 6=10,7 Гц), 3,77 (ушир.с, 2Н), 3,47 (ушир.с, 2Н), 3,37 (ушир.с, 2Н), 2,63 (с, 3Н), 2,38 (ушир.с, 2Н), 1,47 (с, 9Н).
Синтез соединения 17.
Раствор соединения 16 (32 мг, 0,05 ммоль) в 4н НВг в Е!0Ас (4 мл) перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 45 мин. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 4 ч. К остатку в ДМФА (2 мл) добавляют соединение 11 (48,2 мг, 0,07 ммоль) и бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфония гексафторфосфат (ВОР) (34,5 мг, 0,08 ммоль) с последующим добавлением ДИПЭА (68 мкл) и реакционную смесь перемешивают в течение 25 мин при температуре 25°С. Растворитель удаляют под вакуумом и продукт очищают препаративной ВЭЖХ (8утте!гРгер С18, 7 мкм, колонка 19x150 мм), элюируя со скоростью 10 мл/мин (0,01% ТФУ в смеси вода/ацетонитрил) с градиентом: 10% ацетонитрила (5 мин), 10-50% ацетонитрила в точке (15 мин), удерживают 50% ацетонитрил (5 мин), 50-100% ацетонитрила (5 мин), с получением соединения 17 (42,1 мг, 64%).
МС: вычислено для С58Н67Вг№2010 (М+Н) соотношение массы и заряда 1171,43, найдено 1172,40.
- 73 019962
Синтез соединения 18.
К раствору соединения 17 (33,6 мг, 0,025 ммоль) в МеОН (5 мл) добавляют 10% Рб-С (28 мг) и смесь дегазируют Ν2. Реакционную смесь продувают Н2, после чего перемешивают в атмосфере Н2. После завершения реакции (40 мин) реакционную смесь фильтруют и упаривают с получением соединения 18 (31,5 мг, 96%).
МС: рассчитано для С51Н61ВгН;О8 (М+Н) соотношение массы и заряда 1037,39, найдено 1038,20.
о
Синтез соединения 19.
К раствору соединения 18 (31,5 мг, 0,024 ммоль) в ДМФА (2 мл) добавляют Ма1-ПЭГ4-ИН8 эфир (42 мг, 0,08 ммоль) в ДХМ (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при температуре
25°С. Конечный продукт очищают препаративной ВЭЖХ (8утте!гРгер С18, 7 мкм, колонка 19x150 мм), элюируя со скоростью 10 мл/мин (0,01% ТФУ в смеси вода/ацетонитрил) с градиентом: 10% ацетонитрила (5 мин), 10-50% ацетонитрила (15 мин), 50% ацетонитрила (5 мин), 50-100% ацетонитрила (5 мин), с получением соединения 19 (29,7 мг, 77%).
МС: рассчитано для С68Н87Вг^4О16 (М+Н) соотношение массы и заряда 1435,56, найдено 1437,00.
Пример 5.
мг (0,107 ммоль) соединения А перемешивают в смеси НВг-этилацетат на протяжении 30 мин и растворитель испаряют с получением соединения В, которое сушат под глубоким вакуумом. Осуществляют реакцию 33,3 мг (0,053 ммоль) соединения В 5-Вос-амино индол-2-карбоновой кислотой 29,6 мг (0,107 ммоль) в присутствии ЭДК 22,6 мг (0,118 ммоль) в 1,5 мл ДМФА на протяжении 2 ч с получением соединения С. Соединение С очищают колоночной хроматографией на силикагеле 5-10% МеОН/ДХМ с получением 21 мг (выход 60%) соединения С.
МС М[+1] = 662, М ': = 685, М[+К] = 701.
- 74 019962
мг (0,032 ммоль) соединения С обрабатывают раствором НВг-этилацетат на протяжении 30 мин; растворитель испаряют и остаток сушат под глубоким вакуумом, и дополнительно осуществляют реакцию с 11,4 мг (0,032 ммоль) Вос-4-аминобензойной кислоты в присутствии 18,3 мг (0,053 ммоль) ГАТУ, 10 мкл триэтиламина (0,63 ммоль) в 2 мл безводного ДМФА на протяжении 4 ч при комнатной температуре. Растворитель испаряют и остаток очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 14 мг (0,018 ммоль) с выходом 56% соединения Е.
М[+1] = 782.
Снятие защиты Вос с соединения Е осуществляют в раствор НВг-этилацетат, и очистка обращеннофазовой ВЭЖХ дает 12 мг соединения Р. выход 98%. М[+1] = 681,8
Пример 6.
СНО
М3СНгСОгМе
МаОМе, МеОН
Соединение 2.
К раствору индол-4-карбоксальдегида (1,583 мг, 4 ммоль) и метилазидоацетата (460 мг, 40 ммоль) в сухом метаноле (20 мл) добавляют натрия метоксид в метаноле по каплям (6,9 мл 25% №1ОМе, 32 ммоль) при -25°С (сухой лед/СС14) в атмосфере Ν2. Реакционную смесь нагревают до 0°С и перемешивают 3,5 ч. Реакционную смесь выливают в воду (120 мл) и экстрагируют ЕЮАс (2x60 мл). Объединенные экстракты промывают насыщенным водным раствором №1С1 (60 мл) и сушат (Мд8О4). Растворитель удаляют под вакуумом с получением 2 (890 мг, 91%).
1Н ЯМР (СОС13): δ 8,28 (ушир.с, 1Н), 8,06 (д, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,45 (с, 1Н), 7,42 (д, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,30 (т, 1Н, 1=3,2 Гц), 7,26 (с, 1Н), 6,73 (ушир.с, 1Н), 3,96 (с, 3Н).
Соединение 3.
Суспензию метил 2-азидо-3-(1Н-индол-4-ил)акрилата (2, 890 мг, 3,68 ммоль) в сухом ксилене (100 мл) кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота Ν2 на протяжении 1 ч. Растворитель удаляют под вакуумом и остаток пропускают сквозь колонку с силикагелем (30% ЕЮАс-гексан) с получением 3 (663 мг, 85%).
1Н ЯМР (СОС13): δ 8,97 (ушир.с, 1Н), 8,36 (ушир.с, 1Н), 7,47 (д, 1Н, 1=2 Гц), 7,40 (д, 1Н, 1=9,2 Гц), 7,26 (т, 1Н, 1=2,8 Гц), 7,22 (д, 1Н, 1=9,2 Гц), 6,82 (т, 1Н, 1=2, 4 Гц), 3, 95 (с, 3Н).
Соединение 4.
Раствор метилпиррол[3,2-е]индол-2-карбоксилата (3, 663 мг, 3,1 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (9 мл) в атмосфере Ν2 при температуре 15°С добавляют натрия цианоборгидрид (600 мг, 9,5 ммоль) и
- 75 019962 реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч (13-18°С). Реакционную смесь выливают в воду (60 мл) и доводят рН до 8-9 осторожным добавлением твердого натрия карбоната. Водную смесь экстрагируют Е!ОАс (3x60 мл) и объединенные экстракты сушат (Мд8О4). Растворитель удаляют под вакуумом. Флэш-хроматография (силикагель, 20% Е!ОАс-гексан) дает соединение 4 (562 мг, 84%).
Ή ЯМР (СИС13): δ 8,85 (ушир.с, 1Н), 7,15 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,04 (с, 1Н), 6,89 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 3,94 (с, 3Н), 3,68 (т, 2Н, 1=8,4 Гц), 3,24 (т, 2Н, 1=8,4 Гц).
Соединение 5.
Раствор метил-1,2-дигидро-3Н-пирроло[3,2-е] индол-7-карбоксилата (4, 450 мг, 1,42 ммоль) в сухом ТГФ (8 мл) обрабатывают ди-трет-бутилдикарбонат (621 г, 2,8 ммоль) при температуре 25°С в атмосфере Ν2. Реакционную смесь перемешивают на протяжении 16 ч, затем растворитель удаляют под вакуумом. Флэш-хроматография (силикагель, 30% Е!ОАс-гексан) дает соединение 5 (551 мг, 84%).
Ή ЯМР (СИС13): δ 8,78 (ушир.с, 1Н), 7,26 (с, 1Н), 7,25 (д, 1Н, 1=8,5 Гц), 7,07 (с, 1Н), 4,12 (ушир.с, 2Н), 3,94 (с, 3Н), 3,27 (т, 2Н, 1=8,8 Гц), 1,57 (с, 9Н).
Соединение 6.
Водный раствор ЫОН (2,2 мл 4,0 М раствора, 8,7 ммоль) добавляют к суспензии метил-3-(третбутидоксикарбонил)-1,2-дигидро-3Н-пирроло[3,2-е]индол-7-карбоксилата (5, 551 мг, 1,74 ммоль) в 60 мл смеси ТГФ/МеОН/Н2О (3:2:1) и реакционную смесь перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь разбавляют водой (30 мл) и затем доводят рН до 4 с помощью 2н. НС1 с образованием белого осадка. Твердое вещество отделяют фильтрацией и промывают водой (10 мл). Сушка твердого вещества под глубоким вакуумом дает соединение 6 (524 мг, 99%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 12,93 (ушир.с, 1Н), 11,69 (с, 1Н), 7,80 (ушир.с, 1Н), 7,20 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 6,91 (с, 1Н), 3,96 (т, 2Н, 1=8,8 Гц), 3,18 (т, 2Н, 1=8,8 Гц), 1,48 (с, 9Н).
Соединение 9.
Раствор 7 (48 мг, 0,1 ммоль) в 4н. НВг в Е!ОАс (5 мл) перемешивают при 25°С в атмосфере азота на протяжении 45 мин. Растворитель удаляют и остаток дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 4 ч. К остатку добавляют 3-(трет-бутилоксикарбонил)-1,2-дигидро-3Н-пирроло[3,2-е]индол7-карбоновую кислоту (6, 36,24 мг, 0,12 ммоль). Добавляют раствор ЭДК (22,9 мг, 0,12 ммоль) в ДМФА (3 мл) и реакционную смесь перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 6 ч. Растворитель удаляют. Неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 3-10% МеОН в СН2С12, с получением соединения 9 (26 мг, 40%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,69 (с, 1Н), 8,17 (с, 1Н), 8,01 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,81 (д, 2Н, 1=8,8 Гц), 7,59 (т, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,49 (т, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,29 (д, 1Н, 1=9,2 Гц), 7,07 (с, 1Н), 4,87 (т, 1Н, 1=10 Гц), 4,54 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 4,43 (ушир.с, 1Н), 3,89-4,03 (м, 4Н), 3,76 (ушир.с, 2Н), 3,46 (ушир.с, 2Н). 3,26 (м, 2Н), 2,46 (ушир.с, 2Н), 2,38 (ушир.с, 2Н), 2,24 (с, 3Н), 1,49 (с, 9Н).
Соединение 10.
Раствор 9 (26 мг, 0,04 ммоль) в 4н. НВг в Е!ОАс (5 мл) перемешивают при 25°С в атмосфере азота на протяжении 45 мин. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под вакуумом в течение 14 ч с получением 10 (27,7 мг, 98%).
- 76 019962 1Н ЯМР (ДМСО-б6): δ 12,09 (с, 1Н), 8,25 (с, 1Н), 8,03 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,92 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,63 (т, 1Н, 1=7,6 Гц), 7,49-7,55 (м, 2Н), 7,34 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,32 (с, 1Н), 4,91 (т, 1Н, 10,8 Гц), 4,54 (д, 1Н, 10,8 Гц), 4,47 (ушир.с, 1Н), 3,84-3,99 (м, 4Н), 3,27-3,50 (м, 10Н), 2,88 (с, 3Н).
Соединение 12.
Раствор 11 (20 мг, 0,05 ммоль) и 10% Рб-С (15 мг) в МеОН/СН2С12 (1/2, 10 мл) дегазируют под вакуумом в течение 40 с. Полученную смесь помещают в атмосферу водорода и перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 7 ч. Реакционную смесь фильтруют, сквозь целит (промывают СН2С12). Растворитель удаляют под вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием смесью Е!ОАс/гексан (2/8) дает соединение 12 (15,4 мг, 98%).
1Н ЯМР (ДМСО-б6): δ 10,36 (с, 1Н), 8,04 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,72 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,61 (ушир.с, 1Н),
7,45 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,261 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 4,06 (м, 4Н), 3,73 (ушир.с, 1Н), 1,52 (с, 9Н).
Соединение 13.
Раствор 12 (14 мг, 0,04 ммоль) в 4н. НС1 в Е!ОАс (3 мл) перемешивают при 25°С в атмосфере азота на протяжении 30-45 мин. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 14 ч. К остатку добавляют 3-(трет-бутилоксикарбонил)-1,2-дигидро-3Н-пирроло[3,2е]индол-7-карбоновую кислоту (6, 15,1 мг, 0,05 ммоль). Добавляют раствор ЭДК (9,6 мг, 0,05 ммоль) в ДМФА (2 мл) и реакционную смесь перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 15 ч. Растворитель удаляют. Неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 3-10% МеОН в СН2С12 с получением 13 (18,6 мг, 86%).
'Н ЯМР (СБС13): δ 9,45 (с, 1Н), 8,31 (с, 1Н), 8,29 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 8,02 (с, 2Н), 7,63 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,54 (т, 1Н, 1=6,8 Гц), 7,43 (т, 1Н, 1=6,8 Гц), 7,29 (д, 1Н, 1=8,0 Гц), 6,89 (с, 1Н), 4,75 (д, 1Н, 10,8 Гц), 4,64 (т, 1Н, 8,8 Гц), 4,12 (ушир.с, 2Н), 4,03 (т, 1Н, 1=8,8 Гц), 3,93 (дд, 1Н, 1=11,2 Гц), 3,42 (т, 1Н, 1=10,8 Гц), 3,22-3,31 (м, 2Н), 1,61 (с, 9Н).
Соединение 14.
К раствору 13 (19 мг, 0,04 ммоль) в ДМФА (3 мл) добавляют натрия метоксид (0,5 М в МеОН, 79 мкл, 0,04 ммоль) при 0-5°С и перемешивают в течение 5 мин. К реакционной смеси добавляют воду (20 мл), и водную смесь экстрагируют Е!ОАс (2x10 мл). Объединенные экстракты сушат (Мд8О4). Растворитель удаляют под вакуумом и неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 10% МеОН в СН2С12 с получением 14 (15,3 мг, 87%).
'Н ЯМР (СБС1з): δ 9,24 (ушир.с, 1Н), 8,25 (дд, 1Н, 1=9,2, 1,6 Гц), 8,02 (с, 1Н), 7,54 (тт, 1Н, 1=7,6, 1,6 Гц), 7,43 (тт, 1Н, 1=7,6, 1,6 Гц), 7,28 (д, 1Н, 1=9,2 Гц), 7,20 (с, 1Н), 6,94 (д, 1Н, 1=7,6 Гц), 6,88 (с, 1Н), 4,49 (м, 2Н), 4,12 (ушир.с, 2Н), 3,26 (м, 2Н), 2,92 (м, 1Н), 1,76 (дд, 2Н, 1=7,6 Гц), 1,61 (с, 9Н).
Соединение 15.
Раствор 14 (6,4 мг, 0,013 ммоль) в 4н. НВг в Е!ОАс (3 мл) перемешивают при 25°С в атмосфере азота на протяжении 30 мин. Растворитель удаляют под вакуумом и дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 14 ч с получением 15 (7,1 мг, 99%).
'Н ЯМР (ДМСО-б6): δ 12,16 (с, 1Н), 10,45 (с, 1Н), 8,11 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,94 (ушир.с, 1Н), 7,83 (д, 1Н, 1=8,0 Гц), 7,51 (м, 2Н), 7,34 (м, 2Н), 7,27 (с, 1Н), 4,81 (т, 1Н, 10,8 Гц), 4,48 (д, 1Н, 10,8 Гц), 4,28 (ушир.с, 1Н), 3,77-3,91 (м, 4Н), 3,41-3,48 (м, 2Н).
- 77 019962
| 29 (из Примера 3)
Соединение 16.
Осуществляют реакцию соединения 10 (0,033 ммоль, 2НВг соль) с соединением 29 из примера 3 (45 мг, 0,054 ммоль) в 2,5 мл ДМФА в присутствии ГАТУ (20 мг, 0,054 ммоль) и ТЕА (15-20 мкл) в течение 50 мин. Растворитель испаряют и неочищенный остаток очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 10 мг соединения 16 (выход 21%).
МС: 1405,6, 1427,8 и 1444,6.
Соединение 19.
Осуществляют реакцию соединения 10 (25 мг, 0,033 ммоль, соль 2НВг) с соединением Ό из примера 5 (21,5 мг, 0,043 ммоль) в 2,5 мл ДМФА в присутствии ГАТУ (16,5 мг, 0,0433 ммоль) и ТЕА (10-15 мкл) на протяжении 45 мин. Растворитель испаряют и неочищенный остаток очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 25 мг соединения 17 (выход 71%).
МС: 1067,0.
Снимают защиту с соединения 17 (0,0187 ммоль) с помощью 5% пиперидина в ДМФА (3 мл) на протяжении 45 мин. Растворитель испаряют и остаток промывают диэтиловым эфиром с получением 18 (МС: 845,2). К раствору 0,00935 ммоль соединения 18 в 3 мл ДМФА добавляют Ма1-б-ПЭГ4-Ж8 эфир (10 мг, 0,019 ммоль) в ДХМ (1 мл), с последующим добавлением ТЕА (5 мкл). После прохождения 30 мин растворитель испаряют и неочищенный остаток очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 5,2 мг чистого соединения 19 (МС: 1243,2, 1266,8 и 1281,2).
- 78 019962
Пример 7.
и 80С1,, СН;С1а 100% Ь ТФУ, СН;С13 100% с ,пиридин, СНгС1) 67% 0 ТФУ, анизол, СН,С1; 100% е ГАТУ, ДМФА, ДИЭА м% Г пиперидин, ДМФА 98% в г0% ДМФА в ΟΗ,ΟΙι. ДИЭА, Н-сукиинимиднл-4-малсинимило6>пират 53%
Соединение 11.
К раствору соединения 3 (236 мг, 0,86 ммоль) в растворе толуола (10 мл) добавляют 1-метил-2пирролидон (502 мкл, 5,13 ммоль). Полученную таким образом смесь охлаждают до 0°С. Затем добавляют тионилхлорид (502 мкл, 2,58 ммоль) в толуоле (4 мл) и полученный раствор перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 10 мин. Растворитель удаляют и продукт используют немедленно, без дополнительной очистки, для следующей стадии (252 мг, 100%).
Соединение 13.
К раствору соединения 12 (137 мг, 0,27 ммоль) в дихлорметане (3 мл) добавляют ТФУ (6 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель дважды испаряют совместно с толуолом под вакуумом. Остаток (171 мг, 100%) используют немедленно, без дополнительной очистки на следующей стадии.
Соединение 14.
К раствору соединения 13 (171 мг, 0,27 ммоль) в дихлорметане (6 мл) добавляют пиридин (0,6 мл) и соединение 11 (159 мг, 0,54 ммоль) при 0°С. Полученную таким образом смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 14 в виде твердого вещества белого цвета (152 мг, 72%).
'|| ЯМР (СЭ3ОЭ): δ 1,54 (с, 9Н), 2,91 (с, 3Η), 3,00-3,60 (м, 8Н), 3,72 (м, 1Н), 3,99 (м, 1Н), 4,31-4,50 (м, 3Η), 6,94 (с, 1Н), 7,05 (м, 1Н), 7,13 (д, 1Н), 7,45 (м, 2Н), 7,68 (д, 1Н), 7,75 (с, 1Н), 7,86 (д, 1Н), 8,23 (с, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 563 (М+Н-Вос)+, 607 (М+Н-56)+, 663 (М+Н)+, 686 (М+№)+, 701 (М+К)+.
Соединение 15.
К раствору 14 (198 мг, 0,25 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляют анизол (0,2 мл) и ТФУ (0,8 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель испаряют под вакуумом. Остаток (201 мг, 100%) используют без дополнительной очистки на следующей стадии.
Соединение 16.
К раствору соединения 15 (143 мг, 0,25 ммоль) в ДМФА (3 мл) добавляют соединение 10 (197 мг, 0,25 ммоль), диизопропилэтиламин (218 мкл, 1,25 ммоль) и ГАТУ (95 мг, 0,25 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 16 в виде твердого вещества белого цвета (252 мг, 69%).
'|| ЯМР (СЭ3ОЭ): δ 1,06 (д, 3Η), 1,14 (д, 3Η), 1,60 (м, 2Н), 1,81 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,91 (с, 3Η), 3,05-3,25 (м, 6Н), 3,40-3,70 (м, 8Н), 3,70 (д, 1Н), 3,85 (д, 1Н), 4,00 (м, 1Н), 4,19 (т, 1Н), 4,30
- 79 019962
4,50 (м, 5Н), 4,65 (м, 1Н), 7,02 (с, 1Н), 7,28-7,50 (м, 8Н), 7,60 (м, 2Н), 7,70 (д, 2Н), 7,76 (д, 2Н), 7,87 (м, 3Н), 8,03 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 1203 (М+Н)+, 1227 (М+№)+, 1243 (Μ+Κ)+.
Соединение 17.
См. получение соединения 28 в примере 3 относительно общей методики снятия защиты Ртос. Снятие защиты с соединения 16 (235 мг, 0,16 ммоль) дает 161 мг 17 (98%). Остаток используют на следующей стадии без дополнительной очистки.
ЖХ-МС (Е8+): 983 (М+Н)+, 1005 (М+№)+, 1021 (Μ+Κ)+.
Соединение 18.
Κ раствору соединения 17 (48 мг, 0,049 ммоль) в 20% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют диизопропилэтиламин (34 мкл, 0,19 ммоль) и №сукцинимидил-4-малеимидобутират (21 мг, 0,073 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 18 в виде твердого вещества белого цвета (36 мг, 53%).
Ή ЯМР (СОзОО): δ 1,10 (д, 3Н), 1,15 (д, 3Н), 1,61 (м, 2Н), 1,80 (м, 1Н), 1,91 (м, 3Н), 2,25 (м, 3Н), 3,01 (с, 3Н), 3,12-3,24 (м, 6Н), 3,47-3,65 (м, 10Н), 3,84 (д, 1Н), 3,90 (дд, 1Н), 4,34 (м, 1Н), 4,62-4,80 (м, 4Н),
6,82 (с, 2Н), 7,17 (с, 1Н), 7,46 (д, 2Н), 7,50 (м, 1Н), 7,60 (м, 1Н), 7,76 (д, 2Н), 7,93 (м, 4Н), 8,07 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 574 (М+2Н/2)+, 1148 (М+Н)+, 1168 (М+№)+, 1186 (Μ+Κ)+.
Пример 8.
я Нг, Рс1/С, мепанол, СН2С12 98% Ь аллиловый спирт, пиридин, СН2С12,4-метнлпиперазин-1-карбонилхлорид 72%с 5ОС12, СН3С1г 100% 4 ТФУ, СНгС12100% е 11, пиридин, СНгС12 67% ί ТФУ, анизол, СНгС12100% 8 10, ГАТУ, ДМФА, ДИЭА 69% к пиперидин, ДМФА 98% ί 20% ДМФА в СН2С12, ДИЭА, ΜΑΕ-4ΡΕϋ4-ΝΗ8 сложный эфир (28,60%) или М*су|щинимидил-4-малеимидобутират (29, 51%)
Соединение 21.
Раствор 20 (520 мг, 1,22 ммоль) и палладий на угле (100 мг) в метаноле и дихлорметане (2 и 4 мл) помещают в атмосферу водорода с давлением 1 атм при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Палладий отфильтровывают и полученный раствор упаривают до сухого состояния с получением серого твердого вещества (400 мг, 98%).
- 80 019962
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,59 (ушир.с, 9Н), 3,52 (м, 1Н), 3,89-4,00 (м, 2Н), 4,07 (м, 1Н), 4,18 (м, 1Н), 7,26 (м, 1Н), 7,45 (м, 1Н), 7,55 (ушир.с, 1Н), 7,65 (д, 1Н), 8,13 (д, 1Н).
Соединение 22.
К раствору соединения 21 (4 00 мг, 1,20 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляют аллиловый спирт (1 мл), пиридин (1 мл, 1,2 ммоль) и 4-метил-1-пиперазинкарбонилхлорид (364 мг, 1,8 ммоль). Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 22 в виде твердого вещества белого цвета (509 мг, 72%).
Ή ЯМР (ДМСО-66): δ 1,50 (с, 9Н), 2,21 (с, 3Н), 2,36 (с, 2Н), 2,42 (с, 2Н), 3,42 (с, 2Н), 3,78 (с, 2Н), 3,90 (м, 1Н), 3,98 (м, 1Н), 4,08 (м, 2Н), 4,14 (м, 1Н), 4,22 (м, 1Н), 7,42 (т, 1Н), 7,58 (т, 1Н), 7,82 (д, 1Н), 7,88 (м, 1Н), 7,92 (д, 1Н);
ЖХ-МС (Εδ+): 460 (М+Н)+, 483 (М+Ыа)+, 499 (М+К)+.
Соединение 23.
К раствору 22 (250 мг, 0,43 ммоль) в дихлорметане (3 мл) добавляют ТФУ (6 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель дважды испаряют под вакуумом совместно с толуолом. Остаток (256 мг, 100%) используют немедленно, без дополнительной очистки на следующей стадии.
ЖХ-МС (Εδ+): 360 (М+Н)+, 383 (М+Ыа)+, 399 (М+К)+.
Соединение 24.
К раствору 23 (256 мг, 0,43 ммоль) в дихлорметане (8 мл) добавляют пиридин (1,6 мл) и 11 (252 мг, 0,86 ммоль) (см. пример 7) при 0°С. Полученную таким образом смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 24 в виде твердого вещества белого цвета (213 мг, 67%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,54 (с, 9Н), 2,87 (с, 3Н), 3,00-3,60 (м, 8Н), 3,79 (м, 1Н), 3,89 (м, 1Н), 4,31-4,48 (м, 3Н), 6,91 (с, 1Н), 7,08 (м, 2Н), 7,43 (м, 2Н), 7,65 (д, 1Н), 7,74 (с, 1Н), 7,84 (д, 1Н), 8,23 (с, 1Н);
ЖХ-МС (Εδ+): 518 (М+Н-Вос)+, 562 (М+Н-56)+, 619 (М+Н)+, 641 (М+Ыа)+, 657 (М+К)+.
Соединение 25.
К раствору соединения 24 (50 мг, 0,08 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляют анизол (0,2 мл) и ТФУ (0,8 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель испаряют под вакуумом. Остаток (60 мг, 100%) используют без дополнительной очистки на следующей стадии.
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 3,01 (с, 3Н), 3,40-3,60 (ушир.с, 4Н), 3,79 (м, 2Н), 4,02 (м, 2Н), 4,32 (м, 2Н), 4,734,90 (м, 3Н), 7,26 (м, 2Н), 7,51 (м, 1Н), 7,63 (м, 2Н), 7,77 (д, 1Н), 7,94 (д, 1Н), 8,30 (с, 1Н).
Соединение 26.
К раствору 25 (60 мг, 0,08 ммоль) в ДМФА (2 мл) добавляют 10 (53 мг, 0,08 ммоль), диизопропилэтиламин (59 мкл, 0,4 ммоль) и ГАТУ (26 мг, 0,08 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 26 в виде твердого вещества белого цвета (66 мг, 69%).
Ή ЯМР (СО3ОЭ): δ 1,06 (д, 3Н), 1,14 (д, 3Н), 1,60 (м, 2Н), 1,82 (м, 1Н), 1,95 (м, 1Н), 2,25 (м, 1Н), 2,95 (с, 3Н), 3,05-3,25 (м, 6Н), 3,40-3,70 (м, 8Н), 3,85 (д, 1Н), 3,90 (м, 1Н), 4,06 (м, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,304,70 (м, 6Н), 7,02 (с, 1Н), 7,28-7,50 (м, 8Н), 7,60 (м, 2Н), 7,70 (д, 2Н), 7,76 (м, 2Н), 7,87 (м, 3Н), 8,03 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Εδ+): 580 (М+2Н/2)+, 1159 (М+Н)+.
Соединение 27.
См. получение соединения 28 в примере 3 относительно общей методики снятия защиты Ртοс. Снятие защиты с 26 (66 мг, 0,05 ммоль) дает 44 мг 27 (98%). Остаток используют без дополнительной очистки на следующей стадии.
ЖХ-МС (Εδ+): 937 (М+Н)+, 959 (М+Ыа)+.
Соединение 28.
К раствору 27 (23 мг, 0,024 ммоль) в 20% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют диизопропилэтиламин (16 мкл, 0,09 ммоль) и Ма1-6-ПЭГ4-МН§ эфир (18 мг, 0,036 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 28 в виде твердого вещества белого цвета (23 мг, 60%).
Ή ЯМР (СО3ОП): δ 1,09 (д, 3Н), 1,15 (д, 3Н), 1,60 (м, 2Н), 1,82 (м, 1Н), 1,95 (м, 1Н), 2,30 (м, 1Н),
2,45 (т, 2Н), 2,51 (т, 2Н), 2,97 (с, 3Н), 3,10-3,25 (м, 6Н), 3,46-3,70 (м, 24Н), 3,75 (т, 4Н), 3,85 (д, 1Н), 3,90 (м, 1Н), 4,10 (м, 1Н), 4,50-4,70 (м, 4Н), 6,78 (с, 2Н), 7,04 (с, 1Н), 7,34 (м, 2Н), 7,45 (м, 1Н), 7,50 (м, 1Н), 7,71-7,79 (м, 2Н), 7,90 (м, 3Н), 8,04 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Εδ+): 668 (М+2Н/2)+.
- 81 019962
Соединение 29.
К раствору соединения 27 (31 мг, 0,033 ммоль) в 20% ДМФА в дихлорметане (1 мл) добавляют диизопропилэтиламин (22 мкл, 0,13 ммоль) и К-сукцинимидил-4-малеимидобутират (14 мг, 0,049 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 29 в виде твердого вещества белого цвета (32 мг, 51).
Ή ЯМР (С1);01)): δ 1,09 (д, 3Н), 1,15 (д, 3Н), 1,62 (м, 2Н), 1,84 (м, 1Н), 1,92 (м, 3Н), 2,25 (м, 3Н), 2,97 (с, 3Н), 3,12-3,25 (м, 6Н), 3,39-3,68 (м, 10Н), 3,85 (д, 1Н), 3,93 (дд, 1Н), 4,08 (м, 1Н), 4,50-4,67 (м, 4Н), 6,80 (с, 2Н), 7,03 (с, 1Н), 7,34 (м, 2Н), 7,44 (м, 1Н), 7,50 (м, 1Н), 7,72 (д, 2Н), 7,77 (д, 1Н), 7,90 (м, 3Н), 8,04 (с, 1Н), 8,25 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 552 (М+2Н/2).
Пример 9.
2 3 трет-Бутил-5-(4-ацетилбензамидо)-1Н-индол-2-карбоксилат (2).
Раствор трет-бутил 5-амино-1Н-индол-2-карбоксилата (220 мг, 0,94 ммоль), 4-ацетилбензойной кислоты (155 мг, 0,94 ммоль) и ТБТУ (303 мг, 0,94 ммоль) в ДМФА (6 мл) при 4°С обрабатывают диизопропилэтиламином (329 мкл, 1,89 ммоль) и перемешивают в течение 40 мин при 0~5°С. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 1% МеОН в СН2С12 с получением 2 (350 мг, 98%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,66 (ушир.с, 1Н), 10,34 (с, 1Н), 8,09 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 8,07 (с, 4Н), 7,55 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,41 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,03 (с, 1Н), 2,63 (с, 3Н), 1,56 (с, 9Н).
5-(4-Ацетилбензамидо)-1Н-индол-2-карбоновая кислота (3).
Раствор 2 (350 мг, 0,92 ммоль) в метиленхлориде (4 мл) обрабатывают ТФУ (4 мл) и перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель удаляют и остаток дополнительно сушат под глубоким вакуумом с получением соединения 3 практически с количественным выходом.
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 12,92 (ушир.с, 1Н), 11,74 (ушир.с, 1Н), 10,33 (с, 1Н), 8,04 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 8,06 (с, 4Н), 7,52 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,38 (д, 1Н, 1=8,8 Гц), 7,06 (с, 1Н), 2,63 (с, 3Н).
5 6
секо-СВ1-Вос (5).
Раствор 4 (100 мг, 0,24 ммоль) и 10% Рб-С (35 мг) в Ме0Н/СН2С12 (1/2, 10 мл) дегазируют под вакуумом в течение 40 с. Полученную смесь помещают в атмосферу водорода и перемешивают при 25°С, выдерживая при этой температуре в течение 7 ч. Реакционную смесь фильтруют сквозь целит (промывают СН2С12). Растворитель удаляют под вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием смесью Е!0Ас/гексан (2/8) дает соединение 5 (77 мг, 98%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 10,36 (с, 1Н), 8,04 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,72 (д, 1Н, 1=8,2 Гц), 7,61 (ушир.с, 1Н),
7,45 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,261 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 4,06 (м, 4Н), 3,73 (м, 1Н), 1,52 (с, 9Н).
- 82 019962 секо-СВ1 (С1)-Индол (6).
Раствор 5 (35 мг, 0,1 ммоль) в 4н. НС1 в Е!ОАс (5 мл) перемешивают при 25°С в атмосфере азота в течение 30-45 мин. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под глубоким вакуумом на протяжении 4 ч. К остатку добавляют 5-(4-ацетилбензаминдо)-1Н-индол-2-карбоновую кислоту (3, 117 мг, 0,44 ммоль) и ЭДК в ДМФА (5 мл) и реакционную смесь перемешивают 5 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляют под глубоким вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием 2-8% МеОН-СН2С12 дает соединение 6 (118,3 мг, 50%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,73 (с, 1Н), 10,43 (с, 1Н), 10,36 (с, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 8,08 (с, 5Н), 7,92 (с, 1Н),
7,83 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,55 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,51 (т, 1=8,4 Гц, 1Н), 7. 45 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,19 (с, 1Н), 4,80 (т, 1=10,8 Гц, 1Н), 4,55 (д, 1Н, 1=10,8 Гц), 4,22 (м, 1Н), 4,0 (дд, 1Н, 1=10,8 Гц), 3,86 (дд, 1=11 Гц, 1Н), 2,63 (с, 3Н).
секо-СВ1 (Вг)-Индол (7).
К раствору соединения 6 (35,5 мг, 0,066 ммоль) в безводном ДМФА (1 мл) добавляют 60% NаН (5,3 мг, 0,13 ммоль) при 0°С и перемешивают в течение 15-30 мин. Растворитель удаляют под глубоким вакуумом. Неочищенный продукт хроматографируют на силикагеле, элюируя 3% МеОН в СН2С12, с получением циклопропана (31 мг, 94%). Полученный циклопропан обрабатывают 4н. НВг в этилацетате (3 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение 15 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием 2-8% МеОН-СН2С12 с получением 7 (34,5 мг, 96%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,73 (с, 1Н), 10,43 (с, 1Н), 10,36 (с, 1Н), 8,18 (с, 1Н), 8,08 (с, 5Н), 7,92 (с, 1Н),
7,83 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,55 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,51 (т, 1=8,4 Гц, 1Н), 7. 45 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,19 (с, 1Н), 4,80 (т, 1=10,8 Гц, 1Н), 4,55 (д, 1Н, 1=10,8 Гц), 4,26 (м, 1Н), 4,0 (дд, 1Н, 1=10,8 Гц), 3,86 (дд, 1=11 Гц, 1Н), 2,63 (с, 3Н).
Карбамат (8).
Раствор соединения 7 (34 мг, 0,06 ммоль), 4-метил-1-пиперазин-карбонилхлорида гидрохлорида (15,9 мг, 0,08 ммоль), аллилового спирта (80 мкл) и безводного пиридина (80 мкл) в СН2С12 (5 мл) перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре. Очистку неочищенного продукта осуществляют на силикагеле, элюируя 2-10% МеОН в СН2С12, с получением соединения 8 (41,3 мг, 78%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,73 (с, 1Н), 10,38 (с, 1Н), 8,18 (ушир.с, 2Н), 8,08 (с, 4Н), 8,02 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,83 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,60 (т, 1Н, 1=8,4 Гц), 7. 56 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,50 (т, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,47 (д, 1Н, 1=8,4 Гц), 7,24 (с, 1Н), 4,89 (т, 1=10,8 Гц, 1Н), 4,58 (д, 1Н, 1=10,8 Гц), 4,45 (м, 1Н), 3,97 (дд, 1Н, 1=10,8 Гц), 3,91 (дд, 1=11 Гц, 1Н), 3,77 (ушир.с, 2Н), 3,47 (ушир.с, 2Н), 2,63 (с, 3Н), 2,47 (ушир.с, 2Н), 2,40 (ушир.с, 2Н), 2,25 (с, 3Н).
Соединение 10.
Раствор соединения 8 (11,35 мг, 0,016 ммоль) и 9 (17 мг, 0,032 ммоль) в 5% уксусной кислоте в сухом метиленхлориде (2 мл, предварительно высушенный над молекулярными ситами) перемешивают 1015 мин при 25°С. Растворитель удаляют и дополнительно сушат под глубоким вакуумом в течение ночи. Образование гидразона подтверждают аналитической ВЭЖХ2) (колонка Нога Рак С18, 5 мкм, 3,9x150 мм), элюируя со скоростью 1 мл/мин (ацетонитрил/20 мМ аммония формиата, рН 7) с градиентом 10-100% аммония формиат на протяжении 10 мин (время удерживания: 6,93 мин). Гидразон 10 в конце очищают препаративной ВЭЖХ (колонка 8утте!гРгер С18, 7 мкм, 19x150 мм), элюируя со скоростью 10 мл/мин (ацетонитрил/20 мМ аммония формиата, рН 7) с градиентом 10-70% ацетонитрила в течение 20 мин, 70% ацетонитрила (3 мин), 70-100% ацетонитрила (7 мин) (время удерживания: 26,1 мин), с получением соединения 10 (14,7 мг, 82%).
МС: рассчитано для С^Н^Вг^О^ (М+Н) соотношение массы и заряда 1121,04, найдено 1121,1.
- 83 019962
Пример 10.
Соединение (3).
Раствор НВг соли соединения 1 (12 мг, 0,016 ммоль) (см. соединение 10 из примера 6) и соединения 2 (25 мг, 0,032 ммоль) в ДМФА (1,5 мл) обрабатывают диизопропилэтиламином (11 мкл, 0,064 ммоль) и перемешивают при 25°С в атмосфере азота на протяжении 48 ч. Растворитель удаляют и неочищенный продукт очищают препаративной ВЭЖХ с получением соединения 3 (6,4 мг, 30%).
МС: рассчитано для С64Н67Вг^0О10 (М+Н) соотношение массы и заряда 1216,18, найдено 1216,40. Соединение (4).
К раствору ТФУ соли соединения 3 (6,4 мг, 4,9 мкмоль) в ДМФА (1 мл) добавляют пиперидин (50 мкл) и реакционную смесь перемешивают при 25°С в атмосфере азота в течение 15 мин. Растворитель удаляют и неочищенный продукт очищают препаративной ВЭЖХ с получением соединения 4 (3,8 мг, 66%).
МС: рассчитано для С64Н67ВгРоОю (М+Н) соотношение массы и заряда 994,94, найдено 994,80. Соединение (6).
Раствор ТФУ соли 4 (3,8 мг, 3,2 мкмоль) в ДМФА (1 мл) добавляют соединение 5 (3,3 мг,
6,4 мкмоль) и пиперидин (10 мкл) и реакционную смесь перемешивают при 25°С в атмосфере азота в течение 30 мин. Растворитель удаляют и неочищенный продукт очищают препаративной ВЭЖХ с получением соединения 6 (3,4 мг, 71%).
МС: рассчитано для С6-Н83ВгЦ3О16 (М+Н) соотношение массы и заряда 1393,35, найдено 1393,60.
- 84 019962
Осуществляют реакцию соединения А (0,033 ммоль, 2НВг соль) (см. соединение 10 из примера 6) с соединением В (45 мг, 0,054 ммоль) в 2,5 мл ДМФА в присутствии ГАТУ (20 мг, 0,054 ммоль) и ТЕА (15-20 мкл) в течение 50 мин. Растворитель испаряют и неочищенный остаток очищают обращеннофазовой ВЭЖХ с получением 10 мг соединения С (выход 21%).
МС: 1405,6, 1427,8 и 1444,6.
Пример 12.
реагент
„ пм Ртос-О8и -СГНзИ '··'·'04 --------- ЕтоСч Хч .ОН Десс-Мартина Ртос' м-^ '><Н N ------ N у
2 3
Синтез 2.
1,44 г (0,015 моль) соли 2-аминоэтанола НС1 (1), 5,0 г (0,018 моль) Етос-сукцинимида (2) растворяют в 20 мл ацетонитрила и 20 мл 10% водного раствора калия карбоната в круглодонной колбе и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию гасят 10% раствором лимонной кислоты и упаривают для удаления ацетонитрила. Водную фракцию экстрагируют трижды по 30 мл этилацетата и органическую фракцию дважды промывают по 20 мл солевого раствора. Хотя соединение было достаточно чистым, его очищают на силикагеле с использованием 2-5% МеОН в ДХМ, с получением
2,5 г соединения 2 (выход 64%).
Синтез 3.
1,3 г (4,58 ммоль) соединения 2 перемешивают в 50 мл дихлорметана в присутствии 2,5 г (5,6 ммоль) реагента Десс-Мартина в круглодонной колбе в течение 2 ч. Неочищенную реакционную смесь очищают на силикагеле, элюируя 20-50% этилацетата. Получают 1,06 г альдегида 3 с выходом 82%.
МС+1 = 281,8.
Синтез 4.
1,5 г (3,77 ммоль) Етос-цитрулина растворяют в 3 мл ДМФА в круглодонной колбе, в которую добавляют 0,87 г (4,5 ммоль) ЭДК, 0,61 г (4,5 ммоль) НОВ!. Далее добавляют 6 мл ДХМ с последующим добавлением 0,88 г (4,5 ммоль) трет-бутил-4-аминобензоата и каталитическое количество хлорида меди. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Растворитель испаряют и неочищенный продукт очищают на силикагеле с использованием 5-10% МеОН в ДХМ, с получением 2 г соединения 4 (выход 92%).
М41 = 574.
- 85 019962
Ргпос
Синтез 5 и 6.
205 мг (0,36 ммоль) соединения 4 обрабатывают 3 мл раствора 2,5% пиперидина в ДМФА в течение 30 мин. Реакционную смесь упаривают до сухого состояния и дважды промывают гексаном (20-30 мл), после чего дважды промывают диэтиловым эфиром (20-30 мл). Свободный амин 5 сушат под глубоким вакуумом и вводят в реакцию на следующей стадии без дополнительной очистки.
М41 = 352,2.
167 мг (0,42 ммоль) Ртос-цитрулина растворяют в 6 мл ДМФА. Добавляют 160 мг (0,42 ммоль) ГАТУ. Соединение 5 (0,35 ммоль), полученное выше, растворяют в 2 мл ДМФА и добавляют к вышеописанному раствору Ртос-цитрулина и ГАТУ. 146 мкл (1,05 ммоль) триэтиламина добавляют к реакционной смеси и перемешивают в течение 1,5 ч. Растворитель испаряют и неочищенный остаток очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 199 мг соединения 6 с выходом 78%.
М41 = 731,2, \1': = 753,4 и М+К = 769,0.
Синтез 7 и 8.
Снимают защиту с 280 мг (0,38 ммоль) соединения 6 в 3 мл 2,5% пиперидина подобно синтезу соединения 5 с получением 7.
М41 = 509.
Соединение 8 синтезируют восстановительным аминированием соединения 3 с использованием полученного выше соединения 7. 0,38 ммоль соединения 7 растворяют в 6 мл метанола в круглодонной колбе и охлаждают до 0°С на ледяной бане с последующим добавлением 250 мг (3,0 ммоль) натрия ацетата. Соединение 3 120 мг (0,43 ммоль) добавляют в описанную выше колбу и полученную реакционную смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 30 мин. Далее добавляют 68 мг (1,0 ммоль) натрия цианоборгидрида. Реакционную смесь перемешивают при температуре ледяной бани в течение 20 мин, после чего при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь упаривают и очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 150 мг целевого продукта 8 с выходом 51%.
М41 = 774,4.
Синтез кислоты 9.
мг (0,045 ммоль) соединения 8 обрабатывают 3 мл смеси ДХМ/ТФУ (2:1) в течение 25 мин. Растворитель испаряют и остаток дважды титруют диэтиловым эфиром, водную фракцию отбрасывают. Полученную кислоту 9 сушат под глубоким вакуумом в течение нескольких часов и переносят на следую щую стадию.
МС+1 = 718.
- 86 019962
11:2ТФУ
Синтез 11.
мг соединения 10 (0,032 ммоль) обрабатывают 3 мл смеси ДХМ/ТФУ (2:1) в течение 5 мин. Растворитель испаряют, остаток дважды титруют диэтиловым эфиром, и эфирную фракцию отбрасывают. Полученную ТФУ соль амина 11 сушат под глубоким вакуумом в течение нескольких часов и переносят на следующую стадию.
МС+1 = 519.
Синтез 12.
Амин 11:2ТФУ, полученный выше, растворяют в 3 мл ДМФА и переносят в колбу содержащую кислоту 9, с последующим добавлением 20 мг (0,045 ммоль) ВОР, 100 мкл диизопропиламина и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Неочищенную реакционную смесь упаривают и очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 35 мг целевого соединения 12 с выходом 89%.
МС+1 = 1217,6, масса/ (2 * заряд) = 609,2.
Синтез соединения 13 и конечного соединения 14.
мг (0,029 ммоль) соединения 12 обрабатывают 4 мл ДМФА, содержащего 100 мкл пиперидина в течение 15 мин. Растворитель испаряют, и полученный амин 13 титруют 10 мл гексана и затем 10 мл диэтилового эфира (2х), сушат под глубоким вакуумом и переносят на следующую стадию с любой дополнительной очисткой.
М'1 = 996,0, масса/(2 * заряд) = 498.
- 87 019962
0,029 ммоль соединения 13, полученного выше, растворяют в 2 мл ДМФА с последующим добавлением 17 мг (0,06 ммоль) коммерчески доступного соединения 15 и 32 мкл диизопропиламина. Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и неочищенную реакционную смесь очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием ацетонитрила и воды (0,1% ТФУ) с получением 21 мг соединения 14 (МЕИ-2500) в виде соли ТФУ с выходом 52%.
МС: М+1 = 1159,47, масса/(2 * заряд) = 580,2.
Пример 13.
г 3
ТФУ/ДХМ
Синтез соединения 2.
К раствору соединения 1 (350 мг, 0,82 ммоль) в дихлорметане (3 мл) добавляют ТФУ (6 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель испаряют совместно с толуолом (дважды) под вакуумом. Остаток используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору полученного материала с удаленной группой Вос (0,82 ммоль) в дихлорметане (8 мл) добавляют пиридин (2 мл) и соединение 10 (0,98 ммоль, см. ниже) при 0°С. Полученную таким образом смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1 ч. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане, с получением соединения 2 в виде белой пены (417 мг, 90%).
Ή ЯМР (СИ3ОИ): δ 1,55 (с, 9Н), 3,46 (т, 1Н), 3,90 (дд, 1Н), 4,15 (т, 1Н), 4,65 (т, 1Н), 4,8 (д, 1Н), 5,27 (м, 2Н), 6,55 (ушир.с, 1Н), 7,03 (д, 1Н), 7,18 (дд, 1Н), 7,34-7,41 (м, 5Н), 7,43-7,56 (м, 3Н), 7,70 (д, 1Н), 7,85 (ушир.с, 1Н), 8,20 (с, 1Н), 8,34 (д, 2Н), 9,65 (ушир.с, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 582 (М+Н)+; 604 (\Г\а)'.
Синтез соединения 3.
Раствор соединения 2 (315 мг, 0,6 ммоль) и палладий на угле (100 мг) в смеси метанол/дихлорметан (6 мл) помещают в атмосферу водорода с давлением 1 атм при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Палладий отфильтровывают и реакционную смесь упаривают до сухого состояния с получением соединения 3 в виде белой пены (175 мг, 66%).
Ή ЯМР (СИ3ОИ): δ 1,52 (с, 9Н), 3,46 (т, 1Н), 3,90 (дд, 1Н), 4,00 (т, 1Н), 4,50-4,60 (м, 2Н), 6,98 (с, 1Н), 7,20 (д, 1Н), 7,30-7,45 (м, 4Н), 7,60 (д, 1Н), 7,70 (д, 1Н), 7,85 (ушир.с, 1Н), 8,20 (д, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 436 (М+Н-56)+; 493 (М+Н)+.
Синтез соединения 4.
К раствору 3 (350 мг) в дихлорметане (3 мл) добавляют ТФУ (3 мл). Полученный раствор перемешивают в течение 20 мин. Растворитель испаряют совместно с толуолом (дважды) под вакуумом с получением соединения 4. Твердое вещество используют без дополнительной очистки на следующей стадии.
Синтез соединения 5.
К суспензии соединения 4 (300 мг, 0,59 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляют ДБУ (440 мкл, 2,96 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют под вакуумом. Реакционную смесь растворяют в дихлорметане (50 мл) и промывают насыщенным раствором натрия бикарбоната. Органическую фракцию промывают солевым раствором и сушат над безводным №28О4, фильтруют и упаривают при пониженном давлении с получением соединения 5 в виде твердого вещества желтого цвета (200 мг, 90%).
Ή ЯМР (СИ3ОИ): δ 3,55 (м, 1Н), 3,75 (м, 2Н), 4,45 (м, 2Н), 5,49 (с, 1Н), 6,85 (дд, 1Н), 6,97-7,01 (м, 2Н), 7,15 (д, 1Н), 7,25 (д, 1Н), 7,40 (т, 1Н), 7,60 (т, 1Н), 8,10 (д, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 356 (М+Н)+; 379 (\Г\а)'; 394 (М+К)+.
- 88 019962
Синтез соединения 10.
К суспензии этил 5-нитроиндол-2-карбоксилата (Асгок, 10 г, 42,7 ммоль), ди-третбутилдикарбоната (10,24 г, 46,97 ммоль) в безводном метаноле (Асгок, 100 мл) добавляют палладий (АНпсН, 10% на активированном угле, 400 мг). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере Н2 из баллона в течение 3 ч. Реакция завершается, когда Н2 больше не расходуется. Реакционную смесь фильтруют, фильтрат упаривают и сушат под глубоким вакуумом с получением желтого остатка 8 без дополнительной очистки. К раствору желтого остатка 8 в метаноле (150 мл) добавляют раствор ЫОН в воде (150 мл, 0,57 М). Реакционную смесь нагревают до 60°С, выдерживая при этой температуре в течение ночи. Завершение гидролиза подтверждают методом ВЭЖХ. Реакционную смесь разбавляют водой (300 мл) и упаривают под вакуумом для удаления метанола. Полученный раствор экс трагируют Е!ОАс (2x150 мл). Водную фракцию подкисляют до рН 4 добавлением раствора КН8О4. Полученную смесь снова экстрагируют Е!ОАс (3x150 мл). Органические фракции объединяют, сушат над безводным Μд8О4 и упаривают под вакуумом с получением коричневого твердого вещества 9 (9,7 г, 82%). Соединение 9 используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору 9 (2,16 г,
7,84 ммоль) в безводном ДХМ (Асгок, 60 мл) и 1-метил-2-пирролидоне (Е1ика, 5,03 мл, 52,32 ммоль) добавляют 8ОС12 (АНпсН, 1,9 мл, 26,16 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 0,5 ч, и при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Реакционную смесь упаривают и сушат под глубоким вакуумом в течение ночи с получением соединения 10. Небольшое количество соединения 10 обрабатывают метанолом и триэтиламином с образованием метилового эфира, который использовали для анализа методом ВЭЖХ с целью подтверждения завершения образования хлорангидрида уксусной кислоты.
реагент
Н2И^0Н ^ос-ОВи _ РтосНМ^^°Н ДеСС~МарТИНа- ЕтосНМ^‘уН
НС1 Ма2СО3 о
14
Синтез соединения 14.
К суспензии 2-аминоэтанола гидрохлорида (АНпсН, 5 г, 51,25 ммоль) в ацетонитриле (80 мл) и №ьСО3 (АНпсН, 10%, 80 мл) добавляют Етοс-О8и (ΒаСНеш, 17,28 г, 51,25 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, и анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь разбавляют водой (500 мл) и неочищенный продукт отделяют фильтрованием. Твердое вещество растворяют в Е!ОАс (500 мл) и полученную органическую фракцию промывают раствором НС1 (1%, 2x150 мл), насыщенным раствором NаΗСО3 (2x150 мл) и солевым раствором (1x150 мл). Органическую фракцию упаривают с получением твердого вещества белого цвета 13 (13,9 г, 95%), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору 13 (13,9 г, 49,12 ммоль) в безводном ДХМ (АСВО8, 150 мл) добавляют перйодинан Десс-Мартина (27,08 г, 63,85 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь загружают на колонку флэшхроматографии и очищают с использованием 10-50% Е!ОАс в гексане, с получением твердого вещества белого цвета 14 (12,1 г).
- 89 019962
Синтез соединения 22.
К раствору Nα-Εтοс-^-цитрулина (Ника, 10 г, 25,16 ммоль), трет-бутил-4-аминобензоата (Ника,
5,84 г, 30,2 ммоль), N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилκарбодиимида гидрохлорида (Ника, 5,79 г, 30,2 ммоль), 1-гидроксибензотриазола (Сйет-Ипрех, 4,08 г, 30,2 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 100 мл) добавляют СиС12 (А1бпс11, 4,05 г, 30,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь упаривают и обрабатывают ЕЮАс и водой. Органическую фракцию промывают солевым раствором и упаривают с получением коричневого остатка 15 в виде неочищенного продукта. К указанному выше раствору неочищенного продукта добавляют соединение 15 в безводном ДМФА (Асгок, 140 мл) и пиперидин (А1бпс11, 7 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают на колонке ^тЫКакИ 120 г с использованием 0-20% метанола в ДХМ. Целевой продукт элюируют 14% метанола в ДХМ. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают под глубоким вакуумом с получением коричневого твердого вещества 16 (7,34 г, 83,3%). К раствору 16 (6,6 г, 18,86 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 100 мл) и 1-метил-2-пирролидоне (Ника, 25 мл, 188,6 ммоль) добавляют Εтοс-Vа1-Ο8и (ВаСИет, 8,23 г, 18,86 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. К реакционной смеси добавляют пиперидин (А1бпс11, 7 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает полное удаление защитной группы Εтοс. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают на колонке ^тЫКакИ 120 г с использованием 0-20% метанола в ДХМ. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают под глубоким вакуумом с получением желтого твердого вещества 18 (7,4 г, 87%). К раствору 18 (7,4 г, 16,48 ммоль) и 14 (4,63 г, 16,48 ммоль) в безводном метаноле (А1бпс11, 175 ммоль) добавляют натрия ацетат (А1бпс11, 20 г). Реакционную смесь перемешивают при 0°С, выдерживая при этой температуре в течение 1,5 ч. К полученной реакционной смеси добавляют НаВНЮН (А1бпс11, 1,55 г, 24,72 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение
- 90 019962 реакции. Реакционную смесь упаривают, после чего обрабатывают ЕЮАс и водой. Органические фракции объединяют, промывают солевым раствором и упаривают. Остаток очищают на колонке СотЫР1а8Й 120 г с использованием 0-10% метанола в ДХМ. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают под глубоким вакуумом с получением коричневого твердого вещества 19 (7, 1 г, 60%).
К раствору 19 (6,7 г, 9,38 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 120 мл) добавляют пиперидин (А1бпс11, 6 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь упаривают и остаток лиофилизируют с ацетонитрилом и водой, с получением желтого твердого вещества 20 без очистки.
К раствору соединения 20 (предположительно 8,40 ммоль), малимидомасляной кислоты (А1бг1сН,
1,85 г, 10,08 ммоль), О-(7-азабензотриазо-1-ил)-НР,№,№-тетраметилурония (А1бпс11, 3,83 г, 10,08 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 50 мл) добавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (А1бпс11) до рН реакционной смеси выше 8. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь упаривают и остаток очищают на колонке СотЫР1а8Й 120 г с использованием 10-20% метанола в ДХМ. Целевой продукт элюируют 14-16% метанола в ДХМ. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают под глубоким вакуумом с получением твердого вещества белого цвета 21 (4,7 г, 85%). К раствору 21 (4,7 г, 7,17 ммоль) в безводном ДХМ (Асгок, 30 мл) добавляют ТФУ (Р18Йег, 30 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Реакционную смесь упаривают и лиофилизируют с ацетонитрилом и водой с получением твердого вещества белого цвета 22 (4,9 г, соль ТФУ).
Синтез соединения 24.
К раствору 22 (50 мг, 0,083 ммоль) в безводном ДМФА (Асгок, 1 мл) добавляют О-(7-азабензотриазо-1-ил)-НР,№,№-тетраметилуроний (А1бг1сН, 28,4 мг, 0,075 ммоль). Значение рН реакционной смеси доводят до >8 добавлением ДИЭА (А1бпс11). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 0,5 ч, когда анализ методом ВЭЖХ показывает завершение реакции. Добавляют соединение 4 (68,2 мг, 0,14 ммоль) и значение рН реакционной смеси снова доводят до >8 добавлением ДИЭА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре еще в течение 0,5 ч, когда анализ методом ВЭЖХ показывает завершения сочетания. Реакционную смесь упаривают под глубоким вакуумом и остаток перемешивают с фосфатным буферным раствором (РВ8, Меб1а1есН, 1пс, рН 7,4, 10 мл) в течение 0,5 ч. Суспензию отфильтровывают и собранное твердое вещество растворяют в метаноле. Полученный раствор упаривают с силикагелем, и суспензию очищают на колонке С'отЫНакЬ 4 г с использованием 10-20% метанола в ДХМ. Необходимые фракции упаривают и лиофилизируют с ацетонитрилом и водой, с получением соединения 24 в виде белого порошка (45 мг, 45%).
Ή ЯМР (СИ3ОО): δ 1,10 (д, 3Н), 1,15 (д, 3Н), 1,62 (м, 2Н), 1,89-1,94 (м, 4Н), 2,25 (м, 3Н), 3,80 (м, 2Н), 3,50 (т, 2Н), 3,60 (м, 3Н), 3,84 (д, 1Н), 4,00 (дд, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,65 (м, 1Н), 4,72 (м, 2Н), 6,83 (с, 2Н), 7,18 (с, 1Н), 7,37 (т, 2Н), 7,50 (м, 3Н), 7,75-7,81 (м, 3Н), 7,97 (д, 2Н), 8,06 (с, 1Н), 8,20 (д, 1Н), 8,83 (д, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 976 (М+Н)+, 999 (М+№)+.
Синтез соединения 23.
К раствору 22 (500 мг, 0,7 ммоль) в ДМФА (6 мл) добавляют диизопропилэтиламин (250 мкл, 1,4 ммоль) и ГАТУ (279 мг, 0,73 ммоль) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя 15% метанолом в дихлорметане, с получением целевого соединения. Полученное твердое вещество (81 мг) медленно добавляют к раствору 5 (40 мг, 0,11 ммоль) в 20% 1-метил-2пирролидона в дихлорметане (2 мл) при комнатной температуре. Полученную таким образом смесь пе
- 91 019962 ремешивают в течение 2 ч. Целевое соединение осаждают добавлением 6 мл дихлорметана. Твердое вещество желтого цвета отфильтровывают, сушат, и его можно использовать без дополнительной очистки на следующей стадии (86 мг, 82%). Альтернативно, остаток очищают полупрепаративной ВЭЖХ (6уферный раствор, содержащий 20 мМ аммония формиата (рН 7) и ацетонитрил) с получением соединения 23 в виде твердого вещества белого цвета.
'Н ЯМР (СОзОО): δ 1,02 (д, 6Н), 1,62 (м, 2Н), 1,70 (т, 1Н), 1,75-1,95 (м, 5Н), 2,05 (м, 1Н), 2,25 (т, 3Н), 3,80 (м, 2Н), 3,10-3,30 (м, 4Н), 3,35 (м, 2Н), 3,55 (т, 2Н), 4,55 (2 с, 1Н), 4,60-4,70 (м, 2Н), 6,77 (с, 2Н), 7,07 (с, 1Н), 7,15-7,20 (м, 2Н), 7,40-7,50 (м, 3Н), 7,60 (м, 1Н), 7,75 (д, 2Н), 7,95 (д, 1Н), 8,10 (с, 1Н), 8,15 (д, 1Н);
ЖХ-МС (Е8+): 940 (М+Н)+, 962 (М+№)+.
Пример 14.
Синтез соединения 3.
Раствор 4-метокси-2-нафтиламина (230 мг, 1,33 ммоль) в ледяной уксусной кислоту (9,6 мл) и бромоводородной кислоте в воде (16 мл, 48%) кипятят с обратным холодильником в атмосфере Ν2 в течение 4 ч. Небольшое количество образца (0,1 мл) разбавляют этилацетатом (0,5 мл), после чего добавляют воду (0,5 мл) и триэтиламин (0,1 мл). ТСХ (ДХМ/метанол, 20:1) органической фракции показывает отсутствие исходного материала, и новое пятно, расположенное намного ниже (В(=0,1). Растворитель удаляют при пониженном давлении и продукт сушат под вакуумом с получением полупродукта 4-гидрокси2-нафтиламина, который использовали на следующей стадии без какой-либо очистки. К раствору 4-гидрокси-2-нафтиламина в диоксане (10 мл) добавляют ТЕА (1 мл) и ди-трет-бутилдикарбонат (1,149 г, 5,27 ммоль). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в атмосфере Ν2 в течение 4 ч. ТСХ (гексан/этилацетат, 4:1) показывает отсутствие исходного материала и новое пятно, расположенное выше (В(=0,55). Реакционную смесь разбавляют этилацетатом (50 мл) и промывают водой. Водную фракцию экстрагируют этилацетатом (2x50 мл), органические фракции объединяют и промывают солевым раствором. Органические фракции сушат над безводным №28О4, фильтруют и упаривают при пониженном давлении с получением №(трет-бутилоксикарнонил)-4-О-(трет-бутилоксикарбонил)-2-нафтиламина (2, выход 80%) в виде масла. К раствору соединения 2 в ацетоне (10 мл) добавляют раствор №1ОН в воде (10 мл, 1 М). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ (гексан/этилацетат, 4:1) показывает отсутствие исходного материала и новое пятно, расположенное ниже. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (50 мл) и промывают водой. Водную фракцию экстрагируют этилацетатом (2x50 мл), органические фракции промывают солевым раствором, сушат над безводный №ь8О4 и упаривают. Остаток очищают на колонке силикагеля 10 г с использованием 10-20% этилацетата в гексане, с получением соединения 3 (181 мг, 53%) в виде масла.
Синтез соединения 4.
Раствор соединения 3 (5 г, 19,3 ммоль) в безводном ДМФА (50 мл) в атмосфере азота обрабатывают бензилбромидом (4 г, 23,1 моль), калия карбонатом (3,7 г, 27 моль) и тетрабутиламмония йодидом (70 мг, 0,01 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч. Реакционную смесь упаривают при пониженном давлении. Хроматографическое разделение (4x10 см 81О2, элюирование с градиентом 10-20% Е!ОАс в гексане) дает чистое соединение 4 (5,48 г, 83%) в виде порошка кремового цвета.
'Н ЯМР (СПС13, 400 МГц, ррт): δ 8,22 (д, 1Н, 1=8,1 Гц, С5-Н), 7,68 (д, 1Н, 1=8,2 Гц, С8-Н), 7,3-7,5 (м, 8Н, С1-Н, С6-Н, С7-Н, СН2С6Н5), 7,06 (д, 1Н, 1=1,1 Гц, С3-Н), 6,62 (ушир.с, 1Н, ЫН), 5,23 (8, 2Н, ОСЩС'Щ), 1,55 (с, 9Н, ОССОД^).
- 92 019962
Синтез соединения 5.
В круглодонную колбу объемом 1000 мл, оборудованную механической мешалкой и резиновой пробкой, помещают соединение 4 (13 г, 0,0372 моль) и ТГФ (300 мл). Прозрачный желтый раствор охлаждают до -20°С на бане с сухим льдом в атмосфере азота. п-Толуолсульфоновую кислоту (0,10 г, 0,0005 моль) добавляют к реакционной смеси и раствор перемешивают в течение 10 мин. Ν-Йодсукцинимид (10 г, 0,0446 моль) растворяют в ТГФ (50 мл) и добавляют к реакционной смеси с помощью канюли (приблизительно 1 ч). Раствор перемешивают на ледяной бане в течение 2 ч, и он приобретает коричневатую окраску. Ледяную баню удаляют и реакционную смесь нагревают до комнатной температуры в атмосфере азота в течение 1,5 ч. ТСХ (гексан/ДХМ, 2:1) показывает отсутствие исходного материала и новое пятно, расположенное выше. Реакцию гасят насыщенным раствором ЫаНС03 (200 мл), и образуется твердое вещество белого цвета. После перемешивания раствора в течение 10 мин к реакционной смеси добавляют ЕЮАс (200 мл) и воду (100 мл). Водную фракцию экстрагируют ЕЮАс (2х100 мл), органические фракции объединяют и экстрагируют солевым раствором (100 мл). Органические фракции сушат над Мд804, фильтруют и упаривают под вакуумом с образованием твердого вещества темно-красно-коричневого цвета. Твердое вещество очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента смеси гексан/ДХМ (2:1), с получением соединения 5 (14 г, 79%) в виде коричневого твердого вещества.
Синтез соединения 6.
В круглодонную колбу объемом 250 мл, оборудованную механической мешалкой и входным отверстием для азота, помещают соединение 5 (8,4 г, 0,0177 моль) и безводный ДМФА (125 мл). Раствор желто-оранжевого цвета охлаждают до 0°С с помощью бани, содержащей лед и соль, в атмосфере азота. ЫаН (60%, 2,22 г, 0,0554 моль) добавляют к реакционной смеси в виде одной порции. Раствор становится мутным, и выделяется газ. Реакционную смесь перемешивают на ледяной бане в течение 15 мин, после чего ледяную баню удаляют, и раствор перемешивают еще в течение 15 мин, цис/транс-1,3Дихлорпропен (5,3 мл, 0,0571 моль) добавляют к реакционной смеси с помощью шприца. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 3 ч, и смесь становится мутно-коричневой. ТСХ (смесь гексан/ЕЮАс, 4:1) показывает отсутствие исходного материала и новое пятно, расположенное ниже. Реакцию гасят водой (250 мл). Водную фракцию экстрагируют этилацетатом (3х100 мл), и органические фракции промывают солевым раствором (2х50 мл). Органические фракции сушат над Мд804, фильтруют и упаривают под вакуумом с получением коричневого масла. Продукт очищают колоночной хроматографией с использованием смеси ДХМ/гексан (1:1) в качестве элюента, с получением (Е/2)-трет-бутил 4-(6ензилокси)-1-йоднафтален-2-ил(3-хлораллил)карбамата (6) (9 г, 93%) в виде желтого масла.
Синтез соединения 7.
В 3-горлую круглодонную колбу объемом 500 мл, оборудованную механической мешалкой, температурным зондом, обратным холодильником и входным отверстием для азота, помещают соединение 6 (9 г, 0,0164 моль), толуол (200 мл), 2,2'-азо-бис-(2-метилпропионитрил) (0,15 г, 0,0009 моль) и трибутилолова гидрид (1,5 мл, 0,0056 моль) (с помощью шприца). Азот пропускают сквозь раствор в течение 15 мин, после чего реакционную смесь нагревают до 80°С в атмосфере азота. После нагревания до 80°С и выдерживания при этой температуре в течение 15 мин, трибутилолова гидрид (1,5 мл, 0,0056 моль) добавляют к реакционной смеси с помощью шприца. После нагревания еще в течение 15 мин, трибутилолова гидрид (1,5 мл, 0,0056 моль) добавляют к реакционной смеси с помощью шприца. После прохождения еще 15 мин, трибутилолова гидрид (1,0 мл, 0,0037 моль) добавляют к реакционной смеси с помощью шприца. Общее количество добавленного трибутилолова гидрида составляет 5,5 мл, 0,0204 моль. Реакционную смесь нагревают до 80°С, выдерживая при этой температуре в течение 30 мин, после чего дают остыть до комнатной температуры. ТСХ (10% ЕЮАс/гексан) показывает отсутствие исходного материала и новое пятно, расположенное выше. Раствор упаривают под вакуумом с получением желтого масла. Масло очищают колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента градиента от 100% гексана до 5% ЕЮАс в гексане и до 10% ЕЮАс в гексане с получением твердого вещества бледножелтого цвета. Твердое вещество перекристаллизуют из гексана (100 мл, 45°С в течение 30 мин, охлаждают в холодильнике в течение 2 ч, отделяют фильтрацией, сушат под вакуумом) с получением соединения 7 (4,16 г, выход 60%) в виде твердого вещества белого цвета.
- 93 019962
Рацемическое соединение 7 растворяют в ДХМ (50 мг, 1 мл). Раствор далее разбавляют гексаном (9 мл). Затем раствор загружают на препаративную колонку СЫга1се1 ОЭ (10 мкм, 20x250 мм) и разделяют с использованием смеси гексан/изопропанол (99:1, 15 мл/мин). Аналитическая колонка (СЬ1га1се1 ОЭ, 0,46x25 см, 20 мкм) дает время удерживания 10, 6 мин для соединения 1 (99:1 гексан/ИПА, 1 мл/мин, длительность регистрации хроматограммы 15 мин).
1Н ЯМР (СПС13, 400 МГц): δ 1,61 (9Н, с, С-(СН3)3), 3,44 (1Н, т, 1=25 Гц, СН-СН2-Ы), 3,9-4,0 (2Н, м, С1-СН2-СН), 4,12 (1Н, т, 1=26 Гц, СН-СН2-Ы), 4,25 (1Н, м, СН2-СН-СН2), 5,26 (2Н, с, О-СН2-С6Н5), 7,2-7,5 (8Н, м, О-СН2-С6Н5, С10Н5), 7,63 (1Н, д, 1=21 Гц, С10Н5), 8,3 (1Н, д, 1=21 Гц, С10Н5)
Пример 15.
Синтез соединения 2.
К раствору Ртос-Уа1-ОН (200 мг, 0,59 ммоль) и трет-бутил-4-аминобензоата (114 мг, 0,59 ммоль) в растворе 5% ДМФА в ДХМ (5 мл) добавляют ГАТУ (224 мг, 0,59 ммоль) с последующим добавлением диизопропилэтиламина (410 мкл, 2,36 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане. Полученный продукт растворяют в 5% пиперидина в ДМФА и перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 2 (149 мг, 87%).
1Н ЯМР (ДМСО-б6): δ 8,2 (ушир.с, 1Н), 7,91(д, 2Н), 7,75 (д, 2Н), 3,54 (м, 1Н), 2,33 (м, 1Н), 2,12 (ш, 2Н), 1,47 (с, 9Н), 1,10 (м, 3Н), 0,94 (м, 3Н).
С16Н24Ы2О3 (МС: 292,18), найдено М+1 = 293,31.
Синтез соединения 3.
Раствор 2 (149 мг, 0,51 ммоль), Ртос-А1а-ОН (159 мг, 0,51 ммоль), ГАТУ (194 мг, 0,51 ммоль) и диизопропилэтиламина (355 мкл, 2,04 ммоль) в растворе 5% ДМФА в ДХМ (4 мл) перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют под вакуумом и остаток очищают флэш-колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане. Полученный продукт непосредственно обрабатывают для удаления защитной группы Ртос в 5% пиперидине в ДМФА при комнатной температуре в течение 10 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 3 (146 мг, 79%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 8,2 (ушир.с, 1Н), 8,09 (ушир., 1Н), 7,91(д, 2Н), 7,75 (д, 2Н), 3,75 (м, 1Н), 3,54 (м, 1Н), 2,33 (м, 1Н), 2,25 (ушир., 2Н), 1,47 (с, 9Н), 1,29 (д, 3Н), 1,12 (м, 3Н), 0,96 (м, 3Н).
С19Н29Ы3О4 (МС: 363,22), найдено М+1 = 264,01.
5
Синтез соединения 5.
К раствору соединения 3 (146 мг, 0,4 ммоль) и натрия ацетата (98,4 мг, 1,2 ммоль) в сухом метаноле (5 мл) добавляют соединение 4 (135 мг, 0,48 ммоль) при 0-5°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 мин. Натрия цианоборгидрид (76 мг, 1,2 ммоль) добавляют к описанному выше раствору. Полученную реакционную смесь перемешивают еще в течение 10 мин и дают нагреться до комнатной температуры в течение 1 ч. Реакционный раствор затем упаривают и очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 5 (230 мг, 77%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 8,2 (ушир.с, 1Н), 8,09 (ушир., 1Н), 7,91 (д, 2Н), 7,84 (д, 2Н), 7,75 (д, 2Н), 7,55 (д, 2Н), 7,38 (м, 2Н), 7,28 (м, 2Н), 4,73 (д, 2Н), 4,45 (м, 1Н), 3,75 (м, 1Н), 3,54 (м, 1Н), 3,08 (т, 2Н), 2,81 (т, 2Н), 2,33 (м, 1Н), 2,20-2,25 (ш, 2Н), 1,47 (с, 9Н), 1,29 (д, 3Н), 1,13 (м, 3Н), 0,92 (м, 3Н).
- 94 019962
С36Н44К406 (МС: 628,33), найдено М+1 = 629,45.
' ) ТФУ/ДХМ
Синтез соединения 5.
Раствор 5 (72 мг, 0,11 ммоль) объединяют со смесью ТФУ/ДХМ (1:2, 2 мл) в течение 15 мин. Растворитель испаряют под вакуумом, дополнительно сушат под глубоким вакуумом и остаток используют в следующей реакции (76,8 мг, 98,4%).
Ή ЯМР (ДМСО-б6): δ 11,55 (ушир.с, 1Н), 8,2 (ушир.с, 1Н), 8,09 (ушир., 1Н), 7,91 (д, 2Н), 7,84 (д, 2Н), 7,75 (д, 2Н), 7,55 (д, 2Н), 7,38 (м, 2Н), 7,28 (м, 2Н), 4,73 (д, 2Н), 4,45 (м, 1Н), 3,75 (м, 1Н), 3,54 (м, 1Н), 3,08 (т, 2Н), 2,81 (т, 2Н), 2,33 (м, 1Н), 2,20-2,25 (ушир., 2Н), 1,29 (д, 3Н), 1,11 (м, 3Н), 0,95 (м, 3Н).
С;;Н;..\406 (МС: 572,26), найдено М+1 = 573,38.
Синтез соединения 8.
К раствору соединения 7 (25 мг, 0,033 ммоль), 5 и ГАТУ (13 мг, 0,033 ммоль) в ДМФА (1,5 мл) добавляют диизопропилэтиламин (23 мкл, 0,13 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт непосредственно подвергают очистке полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 8 (33,3 мг, 76%).
С60Н62СШ908 (МС: 1077,44), найдено М+1 = 1078,31.
Синтез соединения 10.
Снимают защиту с соединения 8 (33 мг, 0,025 ммоль) с использованием 5% пиперидина в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь упаривают под вакуумом и неочищенный продукт промывают эфиром (25 мл) без дополнительной очистки. Осуществляют реакцию полученного продукта с соединением 9 (11 мг, 0,038 ммоль) в присутствии диизопропилэтиламина (6,6 мкл, 0,038 ммоль) и ДМФА (1 мл) в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривают и очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением 10 (24 мг, 75%).
С53Н59С1К1009 (МС: 1014,42), найдено М+1 = 1015,02.
Пример 16.
Синтез соединения 2.
г (2,66 ммоль) соединения метил 1,2,3,4-тетра-0-ацетил-в-0-глюкуронат (1) растворяют в 1 мл ДМФА и 4 мл ТГФ в круглодонной колбе. 400 мкл бензиламина добавляют в колбу и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Растворитель испаряют и продукт очищают на силикагеле с использованием 10-50% этилацетата в гексане. Это дает 600 мг соединения (2) в виде светло-зеленого масла, выход 67%.
Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6): δ 7,5 (д, 1Н), 5,3 (м, 1Н), 5,28 (м, 1Н), 4,9 (т, 1Н), 4,74 (м, 1Н), 4,38 (д, 1Н), 3,6 (с, 3Н), 1,99-1,96 (3с, 9Н).
- 95 019962
Синтез соединения 3.
600 мг (1,79 ммоль) соединения (2) растворяют в сухом дихлорметане в круглодонной колбе. Добавляют 6 6,5 мкл (0,45 ммоль) ДБУ с последующим добавлением 1,26 мл (12,7 ммоль) трихлорацетонитрила. Реакционную смесь перемешивают в течение 1-2 ч. Реакцию контролируют с помощью ТСХ с использованием реагента для окрашивания фосфомолибденовой кислотой. После завершения реакции растворитель испаряют и продукт очищают на силикагеле. Колонку с кремния диоксидом наполняют 0,1% ТЕА в гексане. Продукт элюируют с градиентом 5-50% этилацетата в гексане с получением 600 мг (выход 70%) соединения (3).
'|| ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6): δ 10,08 (с, 1Н), 6,48 (ушир., 1Н), 5,43 (т, 1Н), 5,20 (м, 2Н), 4,32 (д, 1Н), 3,63 (с, 3Н, Ме), 1,98-1,96 (9Н, 3хАсО).
13С ЯМР (100 МГц, ДМСО-б6): δ 170,2, 170,1, 169,8, 167,4, 158,2, 92,3, 90,5, 70,5, 69,5, 68,9, 53,48, 21,0, 20,8, 20,8.
М+1 = 477,0 М4^ = 499,0.
Синтез соединения 5.
344 мг (0,72 ммоль) соединения 3 и 200 мг (0,6 ммоль) соединения 4 растворяют в безводном ДХМ в круглодонной колбе, содержащей сухие молекулярные сита. Колбу помещают над баней, содержащей №1С1/лед при -10°С. 30 мкл (0,24 ммоль) бора трифтордиэтилэфирата добавляют к реакционной смеси при -10°С. Дают смеси постепенно нагреться до -5°С и перемешивают при этой температуре в течение 1 ч, после чего перемешивают при 0°С в течение 0,5 ч. 3 экв. 226 мкл (1,8 ммоль) бора трифторэфирата добавляют при 0°С и дают смеси нагреться до комнатной температуры. Перемешивание продолжают в течение 2 ч. Растворитель испаряют и продукт очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 250 мг (0,45 ммоль) соединения (5) (выход 75% по отношению к количеству соединения 4).
М+1 = 550,0.
Синтез соединения 7.
К раствору 20 мг (0,07 ммоль) соединения 6 в 2 мл безводного ДХМ при 0°С добавляют раствор 32 мг (0,048 ммоль) соединения 5 в 2 мл безводного ДХМ с последующим добавлением 400 мкл пиридина при 0°С. Реакционную смесь перемешивают при этой температуре в течение 15 мин. Продукт очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 33 мг соединения 7 (выход 84%).
М+1 = 808 и М^ = 830.
Синтез соединения 8.
Соединение 8 получают в виде НС1 соли с использованием 4н. раствора НС1 в диоксане, или в виде соли ТФУ с использованием 33% раствора ТФУ в ДХМ. Протекание реакции контролируют с помощью ВЭЖХ до завершения. Растворитель испаряют, продукт сушат в течение ночи под глубоким вакуумом и используют на следующей стадии неочищенным.
М+1 = 708,2.
- 96 019962
Синтез соединения 10.
мг (0,04 ммоль) соединения 9 в 2 мл ДМФА предварительно активируют с помощью 15,5 мг (0,04 ммоль) ГАТУ и ДИПЭА (достаточное количество, чтобы обеспечить рН 7,0, 21 мкл, 0,12 ммоль) в течение 20 мин в круглодонной колбе. Затем раствор 30 мг (0,036 ммоль) ТФУ соли соединения 8 в 1 мл ДМФА добавляют в описанную выше колбу с последующим добавлением 14 мкл (0,08 ммоль) ДИПЭА. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч с последующим испарением растворителя и очисткой обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 31 мг ТФУ соли целевого соединения 10 с выходом 59%.
М41 = 1348,8.
Синтез соединения 11.
Снимают защиту с 30 мг соединения 10 (0,02 ммоль), перемешивая его в 2,5 мл МеОН и 4 мкл 2н. раствора №ОН в течение 5 ч. Реакционную смесь нейтрализуют уксусной кислотой и обрабатывают обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением 17 мг (0,014 ммоль) двойной ТФУ соли соединения 11.
М41 = 986,6.
Синтез соединения 12.
Осуществляют реакцию 17 мг двойной ТФУ соли соединения 11 (0,014 ммоль) с 5,1 мг (0,018 ммоль) коммерчески доступного Х-сукцинимидил-4-малеимидобутирата в 3 мл ДМФА и 12,2 мкл (0,07 ммоль) ДИПЭА в течение 1 ч. Растворитель испаряют и 14 мг (0,011 ммоль) ТФУ соли целевого соединения 12 получают после очистки обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ (выход 76%).
М41 = 1151,8.
- 97 019962
К раствору Ртос-Ьеи-А1а-Ьеи-ОН (200 мг, 0,37 ммоль) и трет-бутил-4-аминобензоата (114 мг, 0,59 ммоль) в 5% растворе ДМФА в ДХМ (5 мл) добавляют ГАТУ (224 мг, 0,59 ммоль) с последующим добавлением диизопропилэтиламина (410 мкл, 2,36 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане. Полученный продукт растворяют в смеси ЭМС/ТФУ (1:1, 10 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт осаждают эфиром с получением соединения 2 (206 мг, 80%).
Синтез соединения 4.
К раствору соединения 2 (20,6 мг) в ДМФА добавляют ГАТУ (10,3 мг) и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим добавлением соединения 3 (20 мг) и диизопропилэтиламина (23 мкл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 60 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт непосредственно подвергают очистке полупрепаративной ВЭЖХ с получением 4 (28 мг, 76%).
Синтез соединения 5.
Снимают защиту с соединения 4 (28 мг) с использованием 5% пиперидина в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь упаривают под вакуумом и неочищенный продукт промывают эфиром (5 мл х2) без дополнительной очистки. Осуществляют реакцию полученного продукта с N-сукцинимидил-6-малеимидогексаноатом (10 мг) в присутствии диизопропилэтиламина (12 мкл) и ДМФА (1 мл) в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривают и очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 5 (17 мг).
(МС: 1100), найдено М+1 = 1101.
Пример 18.
(Пептиды в примере 8 охватываются 8ЕО ΙΌ NΟ: 15).
- 98 019962
Синтез соединения 2.
Κ раствору Ртос-Рго-Ьеи-С1у-Ьеи-Ьеи-ОН (8ЕЦ ΙΌ NО: 15) (200 мг, 0,27 ммоль) и трет-бутил-4аминобензоата (114 мг, 0,59 ммоль) в растворе 5% ДМФА в ДХМ (5 мл) добавляют ГАТУ (224 мг, 0,59 ммоль) с последующим добавлением диизопропилэтиламина (410 мкл, 2,36 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане. Полученный продукт растворяют в ЭМС/ТФУ (1:1, 10 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Растворитель удаляют под вакуумом и неочищенный продукт осаждают эфиром с получением 2 (190 мг).
Синтез соединения 4.
Κ раствору соединения 2(42 мг, 0,049 ммоль) в ДМФА добавляют ГАТУ (20 мг) и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим добавлением соединения 3 (40 мг) и диизопропилэтиламина (35 мкл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 60 мин. Растворитель удаляют под вакуумом и неочищенный продукт непосредственно подвергают очистке полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 4 (33 мг).
Синтез соединения 5.
Снимают защиту с соединения 4 (33 мг) с использованием 5% пиперидина в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь упаривают под вакуумом и неочищенный продукт промывают эфиром (2x5 мл) без дополнительной очистки. Осуществляют реакцию полученного продукта с №сукцинимидил-6-малеимидогексаноатам (10 мг) в присутствии диизопропилэтиламина (12 мкл) и ДМФА (1 мл) в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривают и очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 5 (15 мг).
(МС: 1296), найдено М+1 = 1297.
Пример 19.
Синтез соединения 2.
Κ раствору Ртос-А1а-Акп-Ееи-ОН (200 мг, 0,37 ммоль) и трет-бутил-4-аминобензоата (114 мг, 0,59 ммоль) в растворе 5% ДМФА в ДХМ (5 мл) добавляют ГАТУ (224 мг, 0,59 ммоль) с последующим добавлением диизопропилэтиламина (410 мкл, 2,36 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. Растворитель испаряют и остаток очищают флэш-колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя 5% метанола в дихлорметане. Полученный продукт растворяют в смеси ЭМСУТФУ (1:1, 10 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт осаждают эфиром с получением соединения 2 (190 мг, 72%).
Синтез соединения 4.
Κ раствору соединения 2 (20 мг) в ДМФА добавляют ГАТУ (13 мг) и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, с последующим добавлением соединения 3 (25 мг) и диизопропилэтиламина (22 мкл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 60 мин. Растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт непосредственно подвергают очистке полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 4 (21 мг, 60%).
- 99 019962
Синтез соединения 5.
Снимают защиту с соединения 4 (23 мг) с использованием 5% пиперидина в ДМФА (1 мл) при комнатной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь упаривают под вакуумом и неочищенный продукт промывают эфиром (2x5 мл) без дополнительной очистки. Осуществляют реакцию полученного продукта с Ы-сукцинимидил-6-малеимидогексаноатом (8 мг) в присутствии диизопропилэтиламина (12 мкл) и ДМФА (1 мл) в течение 3 ч. Реакционную смесь упаривают и очищают полупрепаративной ВЭЖХ с получением соединения 5 (10 мг).
(МС: 1101), найдено М+1 = 1102.
Пример 20. Конъюгация молекул лекарственное средство-линкер с антителом.
Для гидразоновых линкеров. В данном примере описаны условия реакции и методологии конъюгации молекулы лекарственное средство-линкер по изобретению (необязательно содержащей другие группы, такие как спейсеры, реакционноспособные функциональные группы и т.п.) с антителом как направляющим агентом, X4. Условия и методологии приведены только в качестве примера и не являются ограничивающими. Другие подходы к конъюгации молекул лекарственное средство-линкер с антителами известны в данной области.
Способ конъюгации, описанный в данном документе, основан на введении свободных тиольных групп в антитело посредством реакцию остатков лизина в антителе с 2-иминотиоланом, с последующей реакцией молекулы лекарственное средство-линкер с активной малеимидной группой. Сначала для антитела, подлежащего конъюгации, осуществляют обмен буфера в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 8,0), содержащем 50 мМ №1С1, 2 мМ ИТРА (рН 8,0) и концентрируют до концентрации 5-10 мг/мл. Тиолирование обеспечивают посредством добавления 2-иминотиолана к антителу. Количество 2-иминотиолана для добавления определяют в предварительных экспериментах, и оно варьирует от антитела к антителу. В предварительных экспериментах титруют вверх количество 2-иминотиолана, добавленное к антителу, и после инкубации с антителом в течение 1 ч при комнатной температуре антитело обессоливают в 50 мМ буферном растворе НЕРЕ8 (рН 6,0) с помощью колонки 8ерйабех 6-25, и количество введенных тиольных групп быстро определяют реакцией с дитиопиридином (ИТИР). Реакция тиольных групп с ИТИР приводит к высвобождению тиопиридина, которое контролируют на длине волны 324 нм. Используют образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Оптическую плотность на длине волны 280 нм используют для точного определения концентрации белка в образцах, после чего аликвоту каждого образца (0,9 мл) инкубируют с 0,1 мл ИТИР (5 мМ запасной раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Холостые образцы буферного раствора отдельно плюс ИТИР инкубируют вместе с экспериментальными образцами. После прохождения 10 мин определяют оптическую плотность на длине волны 324 нм и количество присутствующих тиольных групп количественно определяют, используя коэффициент гашения для тиопиридина 19800 М-1.
Обычно желательным является уровень тиолирования, соответствующий трем тиольным группам на антитело. Например, для одного конкретного антитела это было достигнуто добавлением 15-кратного молярного избытка 2-иминотиолана с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Таким образом, антитело, которое подлежит конъюгации, инкубируют с 2-иминотиоланом в желательном молярном соотношении, после чего обессоливают в буфере конъюгации (50 мМ буфер НЕРЕ8, рН 6,0, содержащий 5 мМ глицина, 3% глицерина и 2 мМ ИТРА). Тиолированный материал хранят на льду до количественного определения количества введенных тиольных групп, как изложено выше.
После проверки количества введенных тиольных групп молекулу лекарственное средство-линкер, содержащую активную малеимидную группу, добавляют в 3-кратном молярном избытке на тиол. Реакцию конъюгации осуществляют в буфере конъюгации, также содержащем конечную концентрацию 5% диметилового эфира этиленгликоля (или подходящий альтернативный растворитель). Обычно запасной раствор лекарственного средства-линкера растворяют в смеси 90% диметилового эфира этиленгликоля и 10% диметилсульфоксида. Для добавления к антителу, запасной раствор добавляют непосредственно к тиолированному антителу, к которому добавлено достаточное количество диметилового эфира этиленгликоля до конечной концентрации 5%, или которое предварительно разбавлено буфером конъюгации, содержащим конечную концентрацию 10% диметилового эфира этиленгликоля, с последующим добавлением к равному объему тиолированного антитела.
Реакционную смесь для конъюгации инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь центрифугируют при скорости 14000 об/мин в течение 15 мин и рН доводят до 7,2, если очистка не проводится немедленно. Очистку конъюгата проводят хроматографически, с использованием целого ряда методов. Конъюгат может быть очищен с использованием эксклюзионной хроматографии на колонке 8ерйасгу1 8200, предварительно уравновешенной 50 мМ буфером НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащим 5 мМ глицина, 50 мМ ЫаС1 и 3% глицерина. Хроматографирование осуществляют при линейной скорости потока 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат, собирают, объединяют в пул и концентрируют. Альтернативно, очистка может осуществляться посредством ионообменной хроматографии. Условия варьируют от одного антитела к другому, и их следует оптимизировать в каждом случае. Например, реакционную смесь конъюгата лекарственное средство-антитело наносят на колонку 8Р-сефарозы, предварительно уравновешенную в буферном растворе, содержащей
- 100 019962 мМ НЕРЕ8, 5 мМ глицина, 3% глицерина (рН 6,0). Конъюгированное антитело элюируют с использованием градиента 0-1 М №1С1 в буфере для уравновешивания. Фракции, содержащие конъюгат, объединяют в пул, рН доводят до 7,2 и образец при необходимости концентрируют.
Для пептидных линкеров. В данном примере описаны условия реакции и методология конъюгации молекулы лекарственное средство-линкер по изобретению (необязательно содержащей другие группы, такие как спейсеры, реакционноспособные функциональные группы и т.п.) с антителом как направляющим агентом, X4. Условия и методологии только приведены в качестве примера и не являются ограничивающими. Другие подходы к конъюгации молекул лекарственное средство-линкер с антителами известны в данной области.
Способ конъюгации, описанный в данном документе, основан на введении свободных тиольных групп в антитело посредством реакцию остатков лизина в антителе с 2-иминотиоланом, с последующей реакцией молекулы лекарственное средство-линкер с активной малеимидной группой. Сначала для антитела, подлежащего конъюгации, осуществляют обмен буфера в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 8,0), содержащем 50 мМ №1С1, 2 мМ ЭТРА (рН 8,0) и концентрируют до концентрации 5-10 мг/мл. Тиолирование обеспечивают посредством добавления 2-иминотиолана к антителу. Количество 2-иминотиолана для добавления определяют в предварительных экспериментах, и оно варьирует от антитела к антителу. В предварительных экспериментах титруют вверх количество 2-иминотиолана, добавленное к антителу, и после инкубации с антителом в течение 1 ч при комнатной температуре антитело обессоливают в 50 мМ буферном растворе НЕРЕ8 (рН 6,0) с помощью колонки 8ерНайех С-25, количество введенных тиольных групп быстро определяют реакцией с дитиопиридином (ВТОР). Реакция тиольных групп с ВТОР приводит к высвобождению тиопиридина, которое контролируют на длине волны 324 нм. Используют образцы с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл. Оптическую плотность на длине волны 280 нм используют для точного определения концентрации белка в образцах, после чего аликвоту каждого образца (0,9 мл) инкубируют с 0,1 мл БТБР (5 мМ запасной раствор в этаноле) в течение 10 мин при комнатной температуре. Холостые образцы буферного раствора отдельно плюс БТБР, инкубируют вместе с экспериментальными образцами. После прохождения 10 мин, определяют оптическую плотность на длине волны 324 нм и количество присутствующих тиольных групп количественно определяют, используя коэффициент гашения для тиопиридина 19800 М-1.
Обычно желательным является уровень тиолирования, соответствующий 3 тиольным группам на антитело. Например, для одного конкретного антитела это было достигнуто добавлением 15-кратного молярного избытка 2-иминотиолана с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Таким образом, антитело, которое подлежит конъюгации, инкубируют с 2-иминотиоланом в желательном молярном соотношении, после чего обессоливают в буфере конъюгации (50 мМ буфер НЕРЕ8, рН 6,0, содержащий 5 мМ глицина, 0,5% повидона [10к] и 2 мМ БТРА). Тиолированный материал хранят на льду до количественного определения количества введенных тиольных групп, как изложено выше.
После проверки количества введенных тиольных групп молекулу лекарственное средство-линкер, содержащую активную малеимидную группу, добавляют в 3-кратном молярном избытке на тиол. Реакцию конъюгации осуществляют в буфере конъюгации, также содержащем конечную концентрацию 5% ДМСО (или подходящий альтернативный растворитель). Обычно запасной раствор лекарственного средства-линкера растворяют в смеси 100% ДМСО. Для добавления к антителу запасной раствор добавляют непосредственно к тиолированному антителу, к которому добавлено достаточное количество ДМСО до конечной концентрации 10% или которое предварительно разбавлено буфером конъюгации, содержащим конечную концентрацию 10% ДМСО, с последующим добавлением к равному объему тиолированного антитела.
Реакционную смесь для конъюгации инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь центрифугируют и фильтруют сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Очистку конъюгата проводят хроматографически, с использованием целого ряда методов. Конъюгат может быть очищен с использованием эксклюзионной хроматографии на колонке 8ерНасгу1 8200, предварительно уравновешенной 50 мМ буфером НЕРЕ8 (рН 7,2), содержащим 5 мМ глицина, 50 мМ №1С1 и 0,5% повидона (10к). Хроматографирование осуществляют при линейной скорости потока 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат, собирают, объединяют в пул и концентрируют. Альтернативно, очистка может осуществляться посредством ионообменной хроматографии. Условия варьируют от одного антитела к другому, и их следует оптимизировать в каждом случае. Например, реакционную смесь конъюгата лекарственное средство-антитело наносят на колонку 8Р-сефарозы, предварительно уравновешенную в буферном растворе, содержащей 50 мМ НЕРЕ8, 5 мМ глицина, 0,5% повидона (10к), рН 5,5. Конъюгированное антитело элюируют с использованием градиента 0-1 М №1С1 в буфере для уравновешивания при рН 5,5. Соответствующие фракции, содержащие конъюгат, объединяют в пул, и осуществляют диализ против буфера препарата (с использованием 50 мМ буфера НЕРЕ8, рН 7,2, содержащего 5 мМ глицина, 100 мМ №1С1 и 0,5% повидона [10к]).
- 101 019962
Пример 21. Исследования ίη νίνο.
А. Соединения А-С.
Клетки 786-О (инвентарный номер АТСС СКЕ-1932) культивируют ίη νίίτο с использованием стандартных лабораторных методик. Мышам-самцам СВ17.8СШ (Та^шс, Ниб^т ΝΥ) в возрасте 6-8 недель подкожно имплантируют в правый бок 2,5 млн 786-О в 0,2 мл ФБР/МАТШСЕЬ (1:1) на мышь. Мышей взвешивают и измеряют размер опухолей в 3 измерениях с помощью электронного штангенциркуля 2 раза в неделю после имплантации. Объем опухоли вычисляют как длинахширинухвысоту.
Мыши с опухолями со средним размером 200 мм3 случайным образом распределяют в группы для лечения. Мышам вводят интраперитонеально фосфатный буферный раствор в качестве носителя, конъю гированное с цитотоксином антитело контрольного изотипа или конъюгированное с цитотоксином антиСЭ70 НиМАЬ 2Н5 в 0-й день. В каждой группе было 7 мышей.
Исследовали следующие цитотоксины:
Соединение В.
Соединение С.
Соединение Ό.
Соединение Е.
- 102 019962
Соединение Р.
Ο ί^ο
Соединение С.
В табл. 1 приведено краткое описание групп эксперимента на основе мкмоль токсина (соединения А-С).
Таблица 1
Краткое описание исследования
Группа Доза (мкмоль токсина)
1 Носитель интраперитонеально ЗЭ Эквивалент 0,1 об.
2 СО70,1 0,1 интраперитонеально 50 0,1
3 С070,1-Соединение А интраперитонеально 3ϋ 0,1
4 СО70,1- Соединение А интраперитонеально 3ϋ 0,01
5 С070,1- Соединение В интраперитонеально 50 0,1
6 СО70,1- Соединение С интраперитонеально Ξϋ 0, 1
7 0ϋ70,1- Соединение С интраперитонеально 50 0,01
8 С070,1- Соединение 0 интраперитонеально 50 0,1
9 СО70,1- Соединение б интраперитонеально 30 0,01
10 СО70,1™ Соединение Е интраперитонеально 3ϋ 0, 1
11 СБ70,1- Соединение Е интраперитонеально 50 0,1
12 0070,1- Соединение С интраперитонеально 50 0,1
На фиг. 1 показан средний объем опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы, и на фиг. 2 показан медианный объем опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы. По-видимому, эффективность на основе данных экспериментов убывает в следующем порядке:
Соединение Ό > Соединение А > Соединение Р > Соединение В > Соединение С > Соединение Е >
неконъюгированное СО70,1/Соединение С.
На фиг. 3 показан % изменения массы тела по отношению к показателям дней после введения дозы.
В. Соединения А, Р, Н-Е
Клетки 786-О (инвентарный номер АТСС СЯЕ-1932) культивируют ίη νίίτο с использованием стандартных лабораторных методик. Мышам-самцам СВ17.8СГО (Та^шс, Нибюп, ΝΥ) в возрасте 6-8 недель
- 103 019962 подкожно имплантируют в правый бок 2,5 млн 786-О в 0,2 мл ФБР/МАТКЮЕЬ (1:1) на мышь. Мышей взвешивают и измеряют размер опухолей в 3 измерениях с помощью электронного штангенциркуля 2 раза в неделю после имплантации. Объем опухоли вычисляют как длинахширинухвысоту.
Мыши с опухолями со средним размером 200 мм3 случайным образом распределяют в группы для лечения. Мышам вводят интраперитонеально фосфатный буферный раствор в качестве носителя, конъю гированное с цитотоксином антитело контрольного изотипа или конъюгированное с цитотоксином анти0Ό70 НиМАЬ 2Н5 в 0-й день. В каждой группе было 8 мышей.
Исследовали следующие цитотоксины:
Соединение А.
Соединение Р.
Соединение Н.
ΟγΝΗ2
Соединение I.
Соединение 1.
В табл. 2 приведено краткое описание групп эксперимента на основе мкмоль цитотоксина (соединения А, Р, Н-Ι).
- 104 019962
Таблица 2
Краткое описание исследования
Группа Доза (мкмоль токсина)
13 Носитель интраперитонеально ЗЭ
14 СР70,1 0,1 интраперитонеально ЗЦ 0, 03
15 СЦ70,1-Соединение А интраперитонеально ЗЦ 0, 005
16 СО70,1- Соединение А интраперитонеально 30 0,01
17 С070,1- Соединение А интраперитонеально 50 0, 03
18 С070,1- Соединение Н интраперитонеально СЕ· 0,005
19 СЦ70,1- Соединение Н интраперитонеально 33 0, 01
20 СЦ70,1- Соединение Н интраперитонеально ЗЦ 0, 03
21 СЦ70,1- Соединение I интраперитонеально 3ϋ 0,01
22 С070,1- Соединение Г интраперитонеально 30 0,01
23 С070,1- Соединение 0 интраперитонеально 3ϋ 0,005
24 СО70,1- Соединение 0 интраперитонеально 3ϋ 0,01
25 0070,1- Соединение 0 интраперитонеально 30 0,03
На фиг. 4 показан средний объем опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы, и на фиг. 5 показан медианный объем опухоли по отношению к показателям дней после введения дозы. По-видимому, эффективность на основе данных экспериментов убывает в следующем порядке:
Соединение Ι/Соединение С > Соединение Н > Соединение С/Соединение I > неконъюгированное СИ70,1.
На фиг. 6 показан % изменения массы тела по отношению к показателям дней после введения дозы. Пример 22. Активирующий опухоль эффект в отношении клеток ЕНСаР и 786-О.
Прикрепленные клетки, ЕНСаР (карцинома предстательной железы) и 786-О (почечно-клеточная карцинома), полученные от АТСС, культивируют в среде КРМ1, содержащей 10% инактивированной нагреванием сыворотку телячьего эмбриона (СТЭ) согласно инструкциям АТСС. В день эксперимента клетки отсоединяют от планшета с помощью раствора трипсина. Собранные клетки промывают и ресуспендируют в концентрации 0,25 или 0,1 х106 клеток/мл в среде КРМ1, содержащей 10% СТЭ, для клеток ЕНСаР и 786-О соответственно. 100 мкл суспензии клеток помещают на 96-луночные планшеты, и планшеты инкубируют в течение 3 ч, чтобы дать клеткам возможность прикрепиться. После такой инкубации, серийные разведения 1:3 конкретных конъюгатов антитело-цитотоксин, начиная от 300 нМ цитотоксина (соединение 1 из примера 21) добавляют в отдельные лунки. Затем планшеты инкубируют в течение 48 ч, подавая импульсы по 10 мкл раствора, содержащего 100 мкКи/мл 3Н-тимидина, и инкубируют еще в течение 72 ч. Клетки с планшетов собирают, используя устройство для сбора клеток с 96-луночных планшетов (Нагуеб1ег, Раскагб 1п8ЧгцтепЧб) и считывают с помощью счетчика Раскагб Тор СоипЧ. Четыре параметрические логистические кривые аппроксимируют, чтобы включить инкорпорацию 3Н-тимидина как функцию молярности лекарственного средства, с использованием программного обеспечения Рпбш, для определения значения ЕС50. Логистические кривые, аппроксимированные для различных конъюгатов цитотоксин-антитело и полученные значения ЕС50, в клетках БНСаР и 786-О соответственно показаны на фиг. 7.
Эффективность против совместной культуры опухолей ЕНСаР/стромы предстательной железы у мышей 8СГО.
Исследование ксенотрансплантата БНСаР выполняли, как указано ниже. Каждой мыши
120 СВ17.8СГО подкожно вводят инъекционным способом 2 млн клеток БНСаР и 1 млн клеток
- 105 019962 (кат. № СС-2508, СатЬгех Βίο 8аег1се Vа1ке^κν^11е, 1пс, ’^аШегкуШе, ΜΌ) стромы предстательной железы, ресуспендированных в 0,2 мл ФБР/ΜΑΤВIСΕ^ (1:1) (ΒΌ Βιο^ιομο) в область бока. Мышей взвешивают и измеряют размеры опухолей (3 измерения) с помощью электронного штангенциркуля 1 раз в неделю после имплантации. Объем опухоли вычисляют как ширинаx высоту xдлину/2.
Мышей со средним объемом опухолей 50 мм3 случайным образом распределяют на 16 групп лечения по 7 мышей в 1-й день, и мыши получают внутривенно носитель, антитело или конъюгат антителоцитотоксин согласно схеме введения, представленной в табл. 1 в 0-й день. Исследование прекращают на 62-й день.
Таблица 3
Схема введения мышам 8СШ
Доза (мкыоль токсина, мг антитела /кг)
Носитель интраперитонеально 5Р
анти-РЗМА интраперитонеально 30 30
анти-КС-1 интраперитонеально 3Ω 30
анти-ΕϋΒ интраперитонеально 30 30
анти-СО70-токсин интраперитонеально 50 0,03, 0,1, 0,3
Αηί.1-РЗМА-токсин интраперитонеально ВО 0,03, 0,1, 0,3
анти-КС-1-токсин интраперитонеально 30 0,03, 0,1, 0,3
анти-ЕОВ-токсин интраперитонеально 30 0,03, 0,1, 0,3
На фиг. 8 показана медиана увеличения объема опухоли для 7 мышей в каждой из 16 различных групп исследования. Как показано на верхнем левом графике, неконъюгированные анти-ВС-1 и анти-ЕИΒ антитела не оказывали подавляющего воздействия на рост опухоли. Неконъюгированное анти-Р8ΜΑ антитело оказывало некоторое противоопухолевое воздействие на рост. Однако такое противоопухолевое воздействие значительно усиливалось при конъюгации цитотоксина с анти-Р8ΜΑ антителом. Противоопухолевая активность, сходная с активностью конъюгированного антитела по отношению к интернализированному антигену, наблюдалась, если ранее неэффективные антитела к не интернализированным антигенам конъюгируют с цитотоксином. Полученные результаты демонстрируют, что противоопухолевая активность цитотоксинов может быть опосредована антителами к не интернализированным антигенам, а также к интернализированным антигенам, таким как Р8ΜΑ.
На фиг. 9 показана медиана изменения массы тела для 7 мышей в каждой из 16 различных групп исследования. Поскольку опухоли ^NСаР вызывают кахексию у мышей, ожидается, что неэффективное лечение (результатом которого является бесконтрольный рост опухоли) будет сопровождаться снижением массы тела. Такой результат наблюдали у мышей, получавших носитель или неконъюгированные антитела, по-видимому, в результате роста опухоли. Поскольку в данном эксперименте используют мышей с ослабленной иммунной системой, не следует ожидать, что они смогут контролировать рост опухоли посредством мощного ответа в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности (АИСС), как это происходит в ответ на введение неконъюгированного анти-Р8ΜΑ антитела. В противоположность этому, мыши, получавшие конъюгаты лекарственное средство-антитело, демонстрировали самую низкую массу тела сразу после введения дозы; это показывает, что все исследуемые дозы (0,03-0,3) хорошо переносились. Тот факт, что мыши в группах конъюгата набирали массу тела, указывает на уменьшение выраженности кахексии в результате контроля роста опухоли. Эффективность против опухолей ^NСаР у мышей 8СШ Исследование ксенотрансплантата ^NСаР выполняли, как указано ниже. Каждой мыши 120 ί.'Β17.8ί.ΊΡ подкожно вводят инъекционным способом 2,5 млн клеток Б-Ж/аР, ресуспендированных в 0,2 мл ФБР/ΜΑΤВIСΕ^ (1:1) (ΒΌ Βιο^ιομο) в область бока. Мышей взвешивают и измеряют размеры опухолей (3 измерения) с помощью электронного штангенциркуля 1 раз в неделю после имплантации. Объем опухоли вычисляют как ширинаxвысотуxдлину/2.
Мышей со средним объемом опухолей 80 мм случайным образом распределяют на 13 групп лечения по 7 мышей в 1-й день, и мыши получают внутривенно носитель, антитело или конъюгат антителоцитотоксин согласно схеме введения, представленной в табл. 2 в 0-й день. Исследование прекращают на 55-й день.
- 106 019962
Таблица 4
Схема введения мышам 8СГО
Доза (мкмоль токсина, мг антитела /кг}
Носитель интраперитонеально 30
анти~СО70 интраперитонеально 30
анти-Р5МА интраперитонеально 50 30
анти-Ч'З-1 интраперитонеально 30
анти-С070-токсин интраперитонеально 50 0,03, 0,1, 0,3
анти-РЗМА-токсин интраперитонеально 50 0,03, 0,1, 0,3
анти-Р.СЗ-1-токсин интраперитонеально 5Ώ 0,03, 0,1, 0,3
На фиг. 10 показана медиана увеличения объема опухоли для 8 мышей в каждой из 13 различных групп исследования. Подобно модели ^NСаР/стромы неконъюгированное анти-ВС-1 антитело не оказывало ингибирующего воздействия на рост опухоли. Неконъюгированное анти-Р8МА антитело оказывало некоторое противоопухолевое воздействие на рост. Противоопухолевое воздействие анти-Р8МА антитела значительно усиливалось при конъюгации с цитотоксином. Подобным, но неожиданным образом, противоопухолевая активность наблюдалась при конъюгации не интернализированного анти-ВС-1 антитела с цитотоксином. Полученные результаты дополнительно подтверждают, что противоопухолевая активность цитотоксинов может быть опосредована антителами к не интернализированным антигенам.
На фиг. 11 показана медиана изменения массы тела для 7 мышей в каждой из 16 различных групп исследования. Как было указано выше, опухоли ΕΝΟηΓ вызывают кахексию у мышей. Как было указано, такая кахексия ведет к снижению массы тела у мышей, получающих носитель или неконъюгированные антитела, предположительно в результате усиленного роста опухоли и неспособности обеспечить надежный ответ в виде антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС) на интернализированные антитела. В противоположность этому, мыши, получавшие конъюгаты лекарственное средство-антитело, демонстрировали самую низкую массу тела сразу после введения дозы; это показывает, что все исследуемые дозы (0,03-0,3) хорошо переносились. Тот факт, что мыши в группах конъюгата набирали массу тела, указывает на уменьшение выраженности кахексии в результате контроля роста опухоли.
Эффективность против больших опухолей ЬЕСаР у мышей 8СГО.
Активность анти-Р8МА-цитотоксина была дополнительно продемонстрирована у мышей 8СГО, несущих очень большие ксенотрансплантаты опухоли клеток ЬЕСаР. Клетки Е-Ж'.'аР (2,5 млн в 0,1 мл ФБР + 0,1 мл Ма!пде1/мышь) имплантируют подкожно мышам-самцам 8СГО, и когда средний размер опухоли достигает 310 мм3, группам по 8 мышей вводят интраперитонеально инъекционным способом одну дозу анти-Р8МА-цитотоксина в дозе 0,1 или 0,3 мкмоль/кг. Кроме того, контрольной группе вводят инъекционным способом только носитель. Объем опухоли и массу тела мышей регистрируют в ходе исследования, которое продолжали на протяжении приблизительно 60 дней после введения дозы. Результаты, проиллюстрированные на фиг. 12, продемонстрировали, что однократная доза конъюгата анти-Р8МА-2460 была эффективной у мышей даже при очень большом начальном размере опухоли.
Пример 23. Ингибирование роста опухоли ш νίνο анти-СП70-цитотоксином.
Данный пример демонстрирует эффективность анти-СП70-цитотоксина на двух моделях ксенотрансплантата рака почки. Конъюгат цитотоксина состоит из антитела 0Ό70, связанного со следующим цитотоксическим соединением:
Активность анти-СП70-цитотоксина была продемонстрирована у мышей 8СГО, несущих ксенотрансплантаты опухоли А498. Клетки А498 (5 млн в 0,1 мл фосфатного буферного раствора и 0,1 мл Ма!пде1™/мышь) имплантируют подкожно мышам 8СГО, и когда средний размер опухоли достигает 110 мм3, группам по 8 мышей вводят инъекционно интраперитонеально однократную дозу анти-СЭ70цитотоксина в дозе 0,1 мкмоль/кг массы тела. Кроме того, контрольной группе вводят инъекционно только носитель. Объем (Ь^Н/2) опухоли и массу тела мышей регистрируют на протяжении эксперимента, который продолжали в течение приблизительно 60 дней после введения дозы. Результаты показаны на фиг. 13. Полученные результаты показывают, что конъюгат анти-СП70-цитотоксин эффективен
- 107 019962 против рака почки.
Чтобы продемонстрировать активность анти-СО70-цитотоксина на ксенотрансплантатах клеток Сак1-1, 2,5 млн клеток Сак1-1 в 0,1 мл фосфатного буферного раствора и 0,1 мл Ма!пде1™ на мышь вводят подкожно мышам 8СШ и, когда средний размер опухоли достигает 130 мм3, группам по 8 мышей вводят инъекционно интраперитонеально однократную дозу анти-СО70-цитотоксина 0,03, 0,1 или 0,3 мкмоль/кг массы тела. Кроме того, контрольные группы получают инъекционно только носитель или антитело контрольного изотипа, связанное с цитотоксином, в дозах 0,1 и 0,3 мкмоль/кг. Объем (ΕνΚ/2) опухоли и массу тела мышей регистрируют на протяжении эксперимента, который продолжается в течение 61 дня после введения дозы. Результаты показаны на фиг. 14. Полученные результаты демонстрируют, что анти-СЭ70 антитело отдельно и конъюгаты контрольного изотипа оказывают незначительное влияние на рост опухолей в данном эксперименте, тогда как у мышей, получавших анти-СО70цитотоксин, продемонстрированная очевидно дозозависимая противоопухолевая эффективность.
Пример 24. Подавление опухоли ίη у1уо анти-СО70-цитотоксином.
Данный пример демонстрирует эффективность анти-СО70 цитотоксина на двух моделях ксенотрансплантата рака почки, клетках 786-0 у мышей 8СШ и клетках Сак1-1 у голых крыс. Конъюгат цитотоксина состоит из антитела ί.Ό70, связанного со следующим цитотоксическим соединением:
Активность анти-СО70-цитотоксина была продемонстрирована у мышей 8СШ, несущих ксенотрансплантаты опухоли 786-0. Клетки 786-0 (2,5 млн в 0,1 мл фосфатного буферного раствора и 0,1 мл Ма!пде1™/мышь) имплантируют подкожно мышам 8СШ, и когда средний размер опухоли достигает 170 мм3, группам по 6 мышей вводят инъекционно интраперитонеально однократную дозу анти-СО70цитотоксина в дозе 0,005 мкмоль/кг массы тела. Кроме того, контрольной группе вводят инъекционно только носитель. Объем (ΕνΉ72) опухоли и массу тела мышей регистрируют на протяжении эксперимента. Результаты показаны на фиг. 15. Полученные результаты показывают, что конъюгат анти-СЭ70цитотоксин эффективен против рака почки.
Чтобы продемонстрировать, что эффективность может наблюдаться у различных видов, было проведено исследование на модели ксенотрансплатата у голых крыс. В данной модели голым крысам имплантируют подкожно клетки Сак1-1 (10 млн в 0,2 мл ЯРМ1-1640/крысу) и, когда средний размер опухоли достигает 100 мм3, группам крыс вводят инъекционно интраперитонеально однократную дозу антиСО70-цитотоксина 0,3 мкмоль/кг массы тела. Кроме того, контрольные группы получают инъекционно только носитель, только анти-СЭ70 антитело или конъюгат цитотоксина с антителом контрольного изотипа в дозе 0,3 мкмоль/кг массы тела в виде однократной дозы. Объем опухоли (Εν2/2) и массу тела мышей регистрируют на протяжении эксперимента. Результаты показаны на фиг. 16. Полученные результаты демонстрируют, что анти-СЭ70 антитело отдельно оказывает незначительное влияние на рост опухолей, и конъюгат антитела контрольного изотипа не оказывает влияния на рост опухолей. Однако конъюгат анти-СО70-цитотоксин демонстрирует выраженный противоопухолевый эффект. Достигается регресс опухоли. Таким образом, конъюгат анти-СП70-цитотоксин демонстрирует противоопухолевое влияние у различных видов.
Каждая из патентных заявок, патентов, публикаций и других опубликованных документов, указанных или приведенных в данном описании, включена в данное описании путем ссылкой во все ее полноте, в такой же степени как если бы каждая отдельная патентная заявка, патент, публикация и другой опубликованный документ были конкретно и отдельно указаны, как включенные путем ссылки. В данное описание также включена путем ссылки временная патентная заявка США, серийный номер 60/882461.
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на его конкретные варианты, специалист в данной области должен понимать, что различные изменения могут быть внесены и эквиваленты могут быть заменены без выхода за пределы духа и контекста изобретения и приложенной формулы изобретения. Кроме того, многочисленные модификаций могут быть осуществлены для адаптации конкретной ситуации, материала, композиции вещества, способа, стадии или стадий способа, к задаче, духу и контексту настоящего изобретения. Все такие модификации находятся в пределах контекста приложенной формулы изобретения.
- 108 019962
Список последовательностей <110> Ме^агех, 1пс.
5и£1, ВИа1
0иег1ауаЬз, УЬпсепЬ
СЬеп, Ыапд
Сапднаг, Бап^ееу
2.Ьапд, О1ап Раазтоге, Пау1с1 В.
<120> ХИМИЧЕСКИЕ ЛИНКЕРЫ И РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ СУБСТРАТЫ, А ТАКЖЕ ИХ КОНЪЮГАТЫ <130> 22С3238-ИОО <150> 60/991,300 <151> 2007-11-30 <150> 60/332,461 <151> 2006-12-28 <160> 15 <170> РаъепЪТп версия 3.3 <210> 1 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 1
А1а Ьеи А1а Ьеи <210> 2 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> МОО_КЕ5 <222> II) <223> Бета-А1а <400> 2
А1а Ьеи А1а Ьеи <210> 3 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 3
- 109 019962
С1у Рке Ьец (31у <210> 4 <2П> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 4
Рго Агд РЬе Ьуз 1
<210> 5
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 5
Т1тг Агд Ьей Агд
<210> 6
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 6
Зег Ьуз С1у Агд 1
<210> 7
<211 > 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 7
Рго Азп Азр Ьуз 1
<210> 8
<211 > 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 110 019962 <400> 8
Рго Уа1 С1у Ьеи Не 01у
5 <210> 9 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 9
С1у Рго Ьеи О1у Уа1
5 <210> 10 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 10
С1у Рго Ьеи 01у Пе А1а С1у С1п
5 <210> 11 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 11
Рго Ьеи 31у Ьеи <210> 12 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400> 12
С1у Рго Ьеи С1у МеГ Ьеи Бег С1п
5 <210> 13 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 111 019962
<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 13
С1у Рго Ьей С1у Беи Тгр А1а 1 С1п
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> Бедок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 14
Ьей Беи С1у Беи 1
<2Ю> 15
<211> 5
<212> Белок
<2 13> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид
<400> 15

Claims (6)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение формулы в которой т равно 0;
    Р представляет собой линкер, содержащий структуру где (АА1 )с представляет собой пептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Уа1-Сй, Уа1-Ьук, РНе-Ьук, Ьук-Еук, А1а-Ьук, РНе-Сй, Ьеи-Сй, 11е-Сй, Тгр, Сй, РНе-А1а, РНе-№-тозил-Агд, РНе-№-нитро-Агд, РНе-РНе-Ьук, Ό-РНе-РНе-Ьук, С1у-РНе-Ьук, Ееи-А1а-Ьеи, 11е-А1а-Ьеи, Уа1-А1а-Уа1, А1а-Ееи-А1а-Ьеи (81У) ΙΌ ЫО: 1), в-А1а-Ееи-А1а-Ьеи (81У) ΙΌ ΝΌ: 2) и С1у-РНе-Ьеи-С1у (81 У) ΙΌ ΝΌ: 3);
    Ь3 представляет собой спейсерную группу формулы карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь с боковой функциональной аминогруппой Ό; о равно 1;
    Ь4 представляет собой линкерную группу, где Ь4 содержит непосредственно присоединенный к Ν-концу (АА1)с, где К20 представляет собой группу, выбранную из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
    каждый из К25, К25, К26 и К26 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила;
    к и ! независимо равны целым числам от 1 до 6;
    р представляет собой 1;
    X4 представляет собой группу, выбранную из К29, СООК29, С(О)ИК29 и С(О)№№К29, где К29 представляет собой группу, выбранную из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного эфиров, малеимидов;
    Ό содержит структуру или незамещенного гетероарила, Ν -гидроксисукцинимидных где X представляет собой О;
    Ζ представляет собой ΝΚ23;
    К23 представляет собой группу, выбранную из Н, щенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
    К1 представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил, С(О)К8 или СО2К8, где К8 представляет собой группу, выбранную из ΝΚ9Κ10 и ОК9, где К9 и К10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
    К1 представляет собой Н, замещенный или незамещенный низший алкил или С(О)К8, где К8 представляет собой группу, выбранную из ΝΚ9Κ10 и ОК9, где К9 и К10 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
    замещенного или незамещенного алкила, заме- 113 019962
    К2 представляет собой Н, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил, или циано- или алкоксигруппу;
    К2 представляет собой Н, или замещенный или незамещенный низший алкил, или незамещенный гетероалкил;
    К3 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из (=0), 8К11, ЫНК11 и 0К11, где К11 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила, незамещенного гетероалкила, монофосфатов, дифосфатов, трифосфатов, сульфонатов, ацила, С(0)К12К13, С(0)0К12, С(0)1МК12К13, Р(0)(0К12)2, С(0)СНК12К13, 8К12 и 81К12К13К14, где К12, К13 и К14 представляют собой группы, независимо выбранные из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и замещенного или незамещенного арила, где К12 и К13, вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
    К4, К4, К5 и К5 представляют собой группы, независимо выбранные из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, Ν02, ΝΒ15К16, ЯНС(0)К15, ОС(О)ЫК15К16, ОС(О)0К15, С(0)К15, 8К15, 0К15, СК15=ЫК16 и О(СН2)пЫ(СНз)2, или члены любой смежной пары, состоящей из К4, К4, К5 и К5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединены с образованием замещенной или незамещенной циклоалкильной или гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп;
    η равно целому числу от 1 до 20;
    К15 и К16 независимо выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила и замещенного или незамещенного пептидила;
    К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно соединены с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, содержащей от 4 до 6 групп, необязательно содержащей два или несколько гетероатомов;
    К6 представляет собой одинарную связь, которая присутствует или отсутствует, и, если она присутствует, К6 и К7 соединены с образованием циклопропильного кольца;
    К7 представляет собой СН2-Х1 или -СН2-, присоединенные в указанном циклопропильном кольце к К6, где X1 представляет собой уходящую группу;
    по меньшей мере один из К4, К4, К5, К5, К15 или К16 связывает указанное лекарственное средство с Р;
    или его фармацевтически приемлемая соль, где алкил обозначает углеводородный радикал с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 10 атомов углерода;
    низший алкил обозначает углеводородный радикал с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 6 атомов углерода;
    гетероалкил обозначает углеводородный радикал с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 10 атомов углерода и как минимум один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, где атомы азота, углерода и серы необязательно могут быть окисленными и гетероатом азота необязательно может быть четвертичным;
    ацил обозначает группу, присоединенную к и занимающую валентность карбонильного атома углерода, которая прямо или косвенно присоединена к полициклическому ядру;
    арил обозначает замещенный или незамещенный полиненасыщенный, ароматический, углеводородный заместитель, который может представлять собой одинарное кольцо или несколько колец, конденсированных или связанных ковалентной связью;
    гетероарил обозначает арильную группу, которая содержит от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из Ν, О и 8, где атомы азота, углерода и серы необязательно окислены и атом(ы) азота необязательно являет(ют)ся четвертичным(и);
    гетероциклоалкил обозначает циклические версии замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила;
    заместитель представляет собой одну или несколько разнообразных групп, выбранных из 0К', =0, =ΝΚ, =Ы-0К', -ИКК, -8К', -галогена, -81К'КК', -0С(0)К', -С(0)К', -С02К', -С0ПК'К, -0С(0)1ХК'К, -ХКС(0)К', -ПК'-С(0)ЙКиКи', -ХКС(0)2К', -ХК-С(ХК'КК')==ΝΚ, -ХК-С(МК'К)=ХК', -8(0)К', -8(0)2К', -8(0)2ХК'К, -ХК802К', -0Ν и -Ν02, где каждый из К', К, К' и К независимо обозначает водород, замещенные или незамещенные гетероалкильные, замещенные или незамещенные арильные, замещенные или незамещенные алкильные, алкокси или тиоалкокси или арилалкильные группы.
  2. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что (АА1)с представляет собой Уа1-С11 или Уа1-Ьу8.
  3. 3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К25, К25, К26 и К26 независимо представляют собой Н или низший алкил.
    - 114 019962
  4. 4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что к и ΐ независимо представляют собой 1 или 2.
  5. 5. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Я20 представляет собой Н или низший алкил.
  6. 6. Соединение по п.1, выбранное из
EA200970648A 2006-12-28 2007-12-28 Конъюгаты цитотоксинов EA019962B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88246106P 2006-12-28 2006-12-28
US99130007P 2007-11-30 2007-11-30
PCT/US2007/089100 WO2008083312A2 (en) 2006-12-28 2007-12-28 Chemical linkers and cleavable substrates and conjugates thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970648A1 EA200970648A1 (ru) 2010-04-30
EA019962B1 true EA019962B1 (ru) 2014-07-30

Family

ID=39589219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970648A EA019962B1 (ru) 2006-12-28 2007-12-28 Конъюгаты цитотоксинов

Country Status (18)

Country Link
US (1) US8461117B2 (ru)
EP (1) EP2114454A2 (ru)
JP (1) JP2010522693A (ru)
KR (1) KR20090098901A (ru)
CN (1) CN101795711A (ru)
AR (1) AR067837A1 (ru)
AU (1) AU2007342052A1 (ru)
BR (1) BRPI0719626A2 (ru)
CA (1) CA2674055C (ru)
CL (1) CL2007003849A1 (ru)
EA (1) EA019962B1 (ru)
IL (1) IL199416A0 (ru)
MX (1) MX2009007147A (ru)
NO (1) NO20092733L (ru)
NZ (1) NZ578324A (ru)
SG (1) SG170070A1 (ru)
TW (1) TWI412367B (ru)
WO (1) WO2008083312A2 (ru)

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2630483C (en) 2005-12-08 2015-05-19 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to o8e
TW200900059A (en) * 2007-02-21 2009-01-01 Medarex Inc Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
WO2009026274A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
MX2010003581A (es) 2007-10-01 2010-08-02 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos humanos que se adhieren a mesotelina, y usos de los mismos.
AR069747A1 (es) * 2007-11-30 2010-02-17 Medarex Inc Conjugado anticuerpo monoclonal anti-b7h4- farmaco y metodos de utilizacion
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010062171A2 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Syntarga B.V. Novel cc-1065 analogs and their conjugates
CN102341412B (zh) 2009-03-05 2018-01-05 梅达雷克斯有限责任公司 特异于cadm1 的全人抗体
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
JP5352742B2 (ja) 2009-08-07 2013-11-27 オームクス コーポレーション 酵素による酸化還元変化化学的脱離（ｅ−ｔｒａｃｅ）免疫学的検定法
US9250234B2 (en) 2011-01-19 2016-02-02 Ohmx Corporation Enzyme triggered redox altering chemical elimination (E-TRACE) immunoassay
DK2528625T3 (da) * 2010-04-15 2013-10-14 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepiner og konjugater deraf
LT2560645T (lt) 2010-04-21 2016-10-10 Syntarga B.V. Cc-1065 analogų ir bifunkcinių linkerių konjugatai
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
US8501930B2 (en) * 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
US8852599B2 (en) * 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2013059293A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Ohmx Corporation Single, direct detection of hemoglobin a1c percentage using enzyme triggered redox altering chemical elimination (e-trace) immunoassay
US9340567B2 (en) 2011-11-04 2016-05-17 Ohmx Corporation Chemistry used in biosensors
CA2860739A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 Ohmx Corporation Enzyme cascade methods for e-trace assay signal amplification
SMT201700137T1 (it) 2012-02-13 2017-05-08 Bristol Myers Squibb Co Composti di endiini, loro coniugati, e loro usi e metodi
CN104519897A (zh) 2012-06-08 2015-04-15 比奥根艾迪克Ma公司 促凝血化合物
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc CHIMERIC COAGULATION FACTORS
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
JP2015529809A (ja) 2012-07-27 2015-10-08 オームクス コーポレイション 酵素及び他の標的分析物の存在及び活性の切断前検出後の単分子層の電気測定
EP2877592B1 (en) 2012-07-27 2016-09-21 Ohmx Corporation Electronic measurements of monolayers following homogeneous reactions of their components
US9943610B2 (en) 2012-12-21 2018-04-17 Bioalliance C.V. Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
JP6302490B2 (ja) 2013-02-14 2018-03-28 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ ツブリシン化合物、その製造および使用方法
TR201911139T4 (tr) 2013-03-15 2019-08-21 Zymeworks Inc Sitotoksik ve anti-mitotik bileşikler ve bunları kullanmanın yöntemleri.
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
WO2015023355A1 (en) * 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
MX2016007578A (es) * 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
KR102384740B1 (ko) 2013-12-27 2022-04-07 자임워크스 인코포레이티드 약물 접합체를 위한 설폰아마이드-함유 연결 시스템
ES2687225T3 (es) 2014-01-10 2018-10-24 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Método de purificación de conjugados anticuerpo-fármaco unidos a Cys
EP3647322B1 (en) 2014-03-20 2021-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Stabilized fibronectin based scaffold molecules
SG10201810507WA (en) 2014-06-06 2018-12-28 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
MX2016016490A (es) 2014-06-20 2017-07-28 Bioalliance Cv Conjugados de farmaco-anticuerpo anti-receptor de folato alfa (fra) y metodos de uso de los mismos.
US10973920B2 (en) 2014-06-30 2021-04-13 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
US20160041118A1 (en) 2014-08-11 2016-02-11 Ohmx Corporation Enzyme triggered redox altering chemical elimination (e-trace) assay with multiplexing capabilities
ES2886884T3 (es) * 2014-09-11 2021-12-21 Seagen Inc Suministro dirigido de sustancias farmacéuticas que contienen amina terciaria
CN113416229B (zh) 2014-09-17 2024-12-13 酵活英属哥伦比亚有限公司 细胞毒性和抗有丝分裂化合物、及其使用方法
CN104356048B (zh) * 2014-11-02 2016-08-24 浙江医药高等专科学校 环己烷羧酸酰胺类衍生物、其制备方法和用途
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
SI3221363T1 (sl) 2014-11-21 2020-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Protitelesa proti CD73 in njihova uporaba
CN107250157B (zh) 2014-11-21 2021-06-29 百时美施贵宝公司 包含修饰的重链恒定区的抗体
CN107207379B (zh) 2014-11-25 2021-08-10 百时美施贵宝公司 用于生物制品的18f-放射性标记的方法和组合物
KR102632418B1 (ko) 2014-11-25 2024-01-31 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 영상화를 위한 신규 pd-l1 결합 폴리펩티드
WO2016097865A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regenesance B.V. Antibodies that bind human c6 and uses thereof
US20160178562A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Ohmx Corporation Competitive enzymatic assay
US9526801B2 (en) 2015-01-14 2016-12-27 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
EP3268048B1 (en) 2015-03-10 2019-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies conjugatable by transglutaminase and conjugates made therefrom
JP6797137B2 (ja) 2015-05-29 2020-12-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用
WO2017048728A1 (en) * 2015-09-14 2017-03-23 Rutgers, The State University Of New Jersey Targeted conjugates
WO2017053619A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Bristrol-Myers Squibb Company Glypican-3binding fibronectin based scafflold molecules
US10618935B2 (en) 2015-11-03 2020-04-14 Industrial Technology Research Institute Antibody-drug conjugate (ADC) and method for forming the same
ES2926969T3 (es) 2015-11-19 2022-10-31 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra el receptor de factor de necrosis de tumor inducido por glucocorticoides (gitr) y usos de los mismos
GB2545169B (en) * 2015-12-01 2019-10-09 Ellipses Pharma Ltd Taxane Prodrug Comprising A Membrane Type Matrix Metalloproteinase Cleavage Site
ES2919323T3 (es) 2015-12-04 2022-07-26 Seagen Inc Conjugados de compuestos de tubulisina cuaternizados
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
WO2017112624A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
RU2766000C2 (ru) 2016-01-08 2022-02-07 АльтруБио Инк. Четырехвалентные антитела к psgl-1 и их применения
KR20220033522A (ko) 2016-03-04 2022-03-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
IL262396B2 (en) 2016-04-15 2023-09-01 Macrogenics Inc New b7-h3 binding molecules, drug-antibody conjugates and their uses
WO2017210335A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics
KR102397783B1 (ko) 2016-06-01 2022-05-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Pd-l1 결합 폴리펩티드에 의한 pet 영상화
ES3005961T3 (en) 2016-07-14 2025-03-17 Bristol Myers Squibb Company Antibodies against tim3 and uses thereof
WO2018035391A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
US20190218294A1 (en) 2016-09-09 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
WO2018064094A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Bristol-Myers Squibb Company Enantioselective synthesis of pyrroloindole compounds
BR112019007760A2 (pt) * 2016-10-17 2019-09-03 Pfizer anticorpos anti-edb e conjugados de anticorpo-fármaco
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
WO2018208868A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Smet Pharmaceutical Inc Human monoclonal antibodies against lag3 and uses thereof
WO2018218004A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Linkers for antibody drug conjugates
MX2019013132A (es) 2017-05-25 2020-01-27 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas.
IL308744A (en) 2017-06-20 2024-01-01 Imbria Pharmaceuticals Inc Compositions for use in increasing efficiency of cardiac metabolism
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US11230601B2 (en) 2017-10-10 2022-01-25 Tilos Therapeutics, Inc. Methods of using anti-lap antibodies
JP7358361B2 (ja) 2018-01-12 2023-10-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
CA3093407A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
KR20200139219A (ko) 2018-04-02 2020-12-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-trem-1 항체 및 이의 용도
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
WO2019246445A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Triazamacrocycle-derived chelator compositions for coordination of imaging and therapy metal ions and methods of using same
WO2020003210A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation Anti-l1cam antibodies and uses thereof
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
WO2020053255A1 (en) * 2018-09-12 2020-03-19 Technische Universität München Therapeutic and diagnostic agents for cancer
EP3849997B1 (en) 2018-09-12 2024-05-01 Technische Universität München Cxcr4-targeted diagnostic and therapeutic agents with reduced species selectivity
CN113164780A (zh) 2018-10-10 2021-07-23 泰洛斯治疗公司 抗lap抗体变体及其用途
EP3866794B1 (en) 2018-10-17 2024-12-04 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating rheumatic diseases using trimetazidine-based compounds
BR112021008293A2 (pt) 2018-11-09 2021-08-03 Byondis B.V. composição, método, e, método para liberar/aprovar um lote de conjugado de anticorpo-fármaco
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
SMT202300159T1 (it) 2018-11-30 2023-07-20 Bristol Myers Squibb Co Anticorpo comprendente un’estensione carbossiterminale della catena leggera contenente glutammina, suoi coniugati e metodi ed usi
WO2020117627A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ido antibody and uses thereof
CA3121902A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 Der-Yang Tien Stereocomplexes for the delivery of anti-cancer agents
US12049505B2 (en) 2018-12-06 2024-07-30 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
US20220031860A1 (en) 2018-12-12 2022-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
CN109762067B (zh) 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
KR102570405B1 (ko) 2019-01-22 2023-08-25 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-7r 알파 서브유닛에 대한 항체 및 이의 용도
CA3133311A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for vaccine delivery
US20240108747A1 (en) 2019-03-21 2024-04-04 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle conjugates and uses thereof
JP2022531095A (ja) 2019-04-17 2022-07-06 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド エキソソーム及びａａｖの組成物
EP3963085A4 (en) * 2019-05-01 2022-09-14 The University of North Carolina at Chapel Hill Inhibitors of rna-binding proteins, compositions thereof, and therapeutic uses thereof
EP3994158A1 (en) 2019-07-03 2022-05-11 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
US20220332817A1 (en) 2019-07-15 2022-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against human trem-1 and uses thereof
WO2021011678A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Bristol-Myers Squibb Company Anti-trem-1 antibodies and uses thereof
JP2022544289A (ja) 2019-08-14 2022-10-17 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｓｔａｔ６を標的とする細胞外小胞－ａｓｏ構築物
US20230132093A1 (en) 2019-08-14 2023-04-27 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
MX2022001769A (es) 2019-08-14 2022-06-09 Codiak Biosciences Inc Construcciones de vesícula extracelular-oligonucleótido antisentido (aso) que se dirigen a la proteína beta de unión al potenciador ccaat (cebp)/beta.
CN114641570A (zh) 2019-08-14 2022-06-17 科迪亚克生物科学公司 具有靶向kras的反义寡核苷酸的细胞外囊泡
BR112022002599A2 (pt) 2019-08-14 2022-07-19 Codiak Biosciences Inc Vesícula extracelular ligada a moléculas e usos da mesma
WO2021030768A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
EP4026911A4 (en) * 2019-09-05 2023-12-13 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture and Technology Tryptase activity measurement substrate
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
US20230057939A1 (en) 2020-01-13 2023-02-23 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of il-7 protein and a bispecific antibody
JP2021120367A (ja) 2020-01-30 2021-08-19 エイムドバイオ株式会社 ベンゾセレノフェン系化合物、これを含む薬学的組成物及び抗体−薬物複合体
BR112022017174A2 (pt) 2020-02-27 2022-10-18 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, nucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica e métodos de tratamento de uma doença alérgica e de um tumor
EP4132971A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Merck Sharp & Dohme LLC Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
US11780811B2 (en) 2020-06-30 2023-10-10 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Methods of synthesizing 2-[4-[(2,3,4-trimethoxyphenyl)methyl]piperazin-1-yl]ethyl pyridine-3-carboxylate
US11530184B2 (en) 2020-06-30 2022-12-20 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Crystal forms of 2-[4-[(2,3,4-trimethoxyphenyl)methyl]piperazin-1-yl]ethyl pyridine-3-carboxylate
CN112255908B (zh) * 2020-11-16 2024-12-03 西安轻工业钟表研究所有限公司 一种指针式卫星光伏时钟
CN112553274B (zh) * 2020-12-02 2023-06-13 江南大学 大豆提取物Bowman-Birk inhibitor切割DNA的方法
CN114685669A (zh) 2020-12-30 2022-07-01 和铂医药(苏州)有限公司 结合trop2的抗体及其用途
CA3207947A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Aaron Noyes Extracellular vesicle linked to a biologically active molecule via an optimized linker and an anchoring moiety
WO2022198231A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 Seagen Inc. Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds
US20240376224A1 (en) 2021-04-02 2024-11-14 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
US11883396B2 (en) 2021-05-03 2024-01-30 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating kidney conditions using modified forms of trimetazidine
CA3234995A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Latticon (Suzhou) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Novel antibody-cytokine fusion protein, preparation method therefor and use thereof
CN114181216A (zh) * 2021-12-27 2022-03-15 苏州新药篮生物医药科技有限公司 一种3,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-2-甲酸甲酯的制备方法
WO2023173393A1 (zh) 2022-03-18 2023-09-21 北京天广实生物技术股份有限公司 结合b7-h3的抗体及其用途
CN116727114B (zh) * 2023-07-19 2024-07-09 昆明理工大学 一种短流程浮选回收锂云母的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002096910A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-05 Medarex, Inc. Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
WO2005112919A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Medarex, Inc. Self-immolative linkers and drug conjugates
WO2006110476A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates comprising duocarmycins with cleavable substrates
WO2007038658A2 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007059404A2 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
WO2008103693A2 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Medarex, Inc. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4978757A (en) 1984-02-21 1990-12-18 The Upjohn Company 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa (C) pyrrolo [3,2-e)]-indol-4(5H)-ones and related compounds
US4912227A (en) 1984-02-21 1990-03-27 The Upjohn Company 1,2,8,8A-tetrahydrocyclopropa(c)pyrrolo(3,2-e)-indol-4-(5H)-ones and related compounds
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0271581B1 (en) 1986-04-17 1993-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US5332837A (en) 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5773435A (en) 1987-08-04 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs for β-lactamase and uses thereof
US4952394A (en) 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US4994578A (en) 1987-11-27 1991-02-19 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Certain anti-tumor duocarmycin antibiotics from streptomyces
US5147786A (en) 1988-04-22 1992-09-15 Monsanto Company Immunoassay for the detection of α-haloacetamides
JP2642165B2 (ja) 1988-07-22 1997-08-20 協和醗酵工業株式会社 新規ｄｃ−８９化合物およびその製造法
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5495009A (en) 1989-10-24 1996-02-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs containing thioformacetal linkages
US5334528A (en) 1989-10-30 1994-08-02 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies to cyclodiene insecticides and method for detecting the same
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
JPH05508394A (ja) 1990-04-25 1993-11-25 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 新規なｃｃ―１０６５アナログ
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP0468400B1 (en) 1990-07-26 1996-08-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DC-89 derivatives as antitumoral agents
GB9017024D0 (en) 1990-08-03 1990-09-19 Erba Carlo Spa New linker for bioactive agents
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
GB9314960D0 (en) 1992-07-23 1993-09-01 Zeneca Ltd Chemical compounds
JP3514490B2 (ja) 1992-08-21 2004-03-31 杏林製薬株式会社 トリフルオロメチルピロロインドールカルボン酸エステル誘導体及びその製造方法
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5324483B1 (en) 1992-10-08 1996-09-24 Warner Lambert Co Apparatus for multiple simultaneous synthesis
DE4314091A1 (de) 1993-04-29 1994-11-03 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologisches Nachweisverfahren für Triazine
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5786377A (en) 1993-11-19 1998-07-28 Universidad De Santiago De Compostela Pyrrolo 3,2-E!indol derivatives, process for the preparation thereof and applications
ATE271557T1 (de) 1994-04-22 2004-08-15 Kyowa Hakko Kogyo Kk Dc-89 derivat
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
PT769967E (pt) 1994-08-19 2008-02-18 Univ Catholique Louvain Conjugados que compreendem um agente antitumoral e a sua utilização
WO1996010405A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antitumor agent
HUT77654A (hu) 1994-11-29 1998-07-28 Kyorin Pharmaceutical Co.,Ltd. Bisz[(1,2,3,6-tetrahidro-pirrolo[3,2-e]indol-3-il)-akrilamid]-származékok és eljárás előállításukra
ES2299177T3 (es) 1995-05-10 2008-05-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Conjugados de citotoxinas que contienen dipeptidos.
US5686237A (en) 1995-06-05 1997-11-11 Al-Bayati; Mohammed A. S. Use of biomarkers in saliva to evaluate the toxicity of agents and the function of tissues in both biomedical and environmental applications
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
JPH11513391A (ja) 1995-10-03 1999-11-16 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５ 及びズオカーマイシンのｃｂｉ 類縁体
DE69632989T2 (de) 1995-10-17 2005-08-25 Combichem, Inc., San Diego Matrize für die Synthese kombinatorischer Bibliotheken in Lösung
WO1997023243A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
US6143901A (en) 1996-07-31 2000-11-07 Genesoft, Inc. Complex formation between dsDNA and pyrrole imidazole polyamides
AU711974B2 (en) 1996-03-08 1999-10-28 Scripps Research Institute, The MCBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
US6060608A (en) 1996-05-31 2000-05-09 The Scripps Research Institute Analogs of CC-1065 and the duocarmycins
NZ334344A (en) 1996-09-12 2000-08-25 Cancer Res Campaign Tech benzo[e]indole and pyrrolo[3,2-e]indole compounds and their use as prodrugs
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
JPH1087666A (ja) 1996-09-18 1998-04-07 Kyorin Pharmaceut Co Ltd デュオカルマイシンｓａ及びその誘導体の製造中間体と製造方法
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
WO1998025900A1 (fr) 1996-12-13 1998-06-18 Shionogi & Co., Ltd. Composes presentant une activite antitumorale
EP0996458A4 (en) 1997-03-28 2001-05-02 Scripps Research Inst SANDRAMYCIN ANALOG
JP2002510968A (ja) 1997-05-07 2002-04-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 組換え抗体−酵素融合タンパク質
EP0983248B1 (en) 1997-05-22 2004-07-14 The Scripps Research Institute Analogs of duocarmycin and cc-1065
NZ503966A (en) 1997-10-14 2002-10-25 Scripps Research Inst iso -CBI and iso -CI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
WO1999029642A1 (en) 1997-12-08 1999-06-17 The Scripps Research Institute Synthesis of cc-1065/duocarmycin analogs
JP3045706B1 (ja) 1998-09-14 2000-05-29 科学技術振興事業団 Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する化合物及びその合成法
WO2000033888A2 (en) 1998-12-11 2000-06-15 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
US6909006B1 (en) 1999-08-27 2005-06-21 Spirogen Limited Cyclopropylindole derivatives
EP1242438B1 (en) 1999-12-29 2006-11-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
ATE362940T1 (de) 2000-03-16 2007-06-15 Genesoft Inc Geladene verbindungen mit einer nukleinsäure- bindenden einheit sowie deren verwendungen
AU2001262974A1 (en) 2000-05-03 2001-11-12 The Scripps Research Institute Dna alkylating agent and activation thereof
JP4061819B2 (ja) 2000-05-12 2008-03-19 独立行政法人科学技術振興機構 インターストランドクロスリンク剤の合成方法
AU6685301A (en) 2000-06-14 2001-12-24 Corixa Corp Prodrug compounds with isoleucine
JP2004501875A (ja) 2000-06-14 2004-01-22 メダレックス，インコーポレイティド トリペプチドプロドラッグ化合物
AU2001286727A1 (en) 2000-08-24 2002-03-04 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
JP2002308898A (ja) * 2001-04-06 2002-10-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 蛋白質受容体結合性環状ペプチドおよびその製造法
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6762179B2 (en) 2001-05-31 2004-07-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Thiazole compounds useful as inhibitors of protein kinase
ES2364452T3 (es) 2001-06-11 2011-09-02 Medarex, Inc. Método para diseñar compuestos profármacos activados por cd10.
EP1423110A4 (en) 2001-09-07 2005-04-27 Scripps Research Inst CBI ANALOGUE OF CC-1065 AND DUOCARMYCINES
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US7776814B2 (en) 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
AU2003266233A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Morphochem Aktiengesellschaft Fur Kombinatorische Chemie Novel tubulysin analogues
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
CA2512867C (en) * 2003-01-27 2014-08-26 Endocyte, Inc. Vitamin receptor binding drug delivery conjugates
WO2004101767A2 (en) 2003-05-13 2004-11-25 The Scripps Research Institute Cbi analogues of the duocarmycins and cc-1065
EP1789391B1 (en) * 2004-07-23 2017-06-28 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
JP5346589B2 (ja) 2006-02-02 2013-11-20 シンタルガ・ビーブイ 水溶性ｃｃ−１０６５類似体及びその接合体
IN2009KN02404A (ru) 2006-12-14 2015-08-07 Medarex Inc

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002096910A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-05 Medarex, Inc. Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
WO2005112919A2 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Medarex, Inc. Self-immolative linkers and drug conjugates
WO2006110476A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates comprising duocarmycins with cleavable substrates
WO2007038658A2 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007059404A2 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
WO2008103693A2 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Medarex, Inc. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMISHIRO, N. ET AL.: "Synth2000:141730 HCAPLUS DN -132:334367, Synthesis and antitumor activity of duocarmycin derivatives: modification at C-8 position of A-ring pyrrole compounds bearing the simplified DNA-binding groups". BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, 8(2), 381-391 CODEN: BMECEP; ISSN: 0968-0896, 2000, XP002546602, page 383; compound 10 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100145036A1 (en) 2010-06-10
CA2674055C (en) 2016-02-23
US8461117B2 (en) 2013-06-11
AR067837A1 (es) 2009-10-28
EA200970648A1 (ru) 2010-04-30
IL199416A0 (en) 2011-08-01
TW200833683A (en) 2008-08-16
BRPI0719626A2 (pt) 2014-06-24
WO2008083312A3 (en) 2010-01-14
EP2114454A2 (en) 2009-11-11
CA2674055A1 (en) 2008-07-10
JP2010522693A (ja) 2010-07-08
MX2009007147A (es) 2009-08-25
CL2007003849A1 (es) 2008-07-04
WO2008083312A2 (en) 2008-07-10
KR20090098901A (ko) 2009-09-17
NO20092733L (no) 2009-07-20
TWI412367B (zh) 2013-10-21
AU2007342052A1 (en) 2008-07-10
CN101795711A (zh) 2010-08-04
SG170070A1 (en) 2011-04-29
NZ578324A (en) 2012-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA019962B1 (ru) Конъюгаты цитотоксинов
US7968586B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates
US8664407B2 (en) Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
RU2402548C2 (ru) Химические линкеры и их конъюгаты
JP5290756B2 (ja) 抗体−薬剤コンジュゲート及びその使用
US7714016B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
US7517903B2 (en) Cytotoxic compounds and conjugates
CN1997402A (zh) 化学连接基团及其缀合物
AU2006315252A1 (en) Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU