[go: up one dir, main page]

EA018301B1 - Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение - Google Patents

Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA018301B1
EA018301B1 EA200802135A EA200802135A EA018301B1 EA 018301 B1 EA018301 B1 EA 018301B1 EA 200802135 A EA200802135 A EA 200802135A EA 200802135 A EA200802135 A EA 200802135A EA 018301 B1 EA018301 B1 EA 018301B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
concentration
composition
monoclonal antibody
cell
Prior art date
Application number
EA200802135A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200802135A1 (ru
Inventor
Сяофэн Лю
Баолю Чэнь
Кидисти Арая
Огастус Окхамафе
Original Assignee
Новартис Аг
Ксома Текнолоджи Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38556677&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA018301(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг, Ксома Текнолоджи Лтд. filed Critical Новартис Аг
Publication of EA200802135A1 publication Critical patent/EA200802135A1/ru
Publication of EA018301B1 publication Critical patent/EA018301B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

В патенте описаны стабильные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к CD40 в качестве обладающего терапевтической или профилактической активностью компонента, и способы, которые можно применять для их получения. Эти композиции содержат антагонистическое антитело к CD40, забуферивающий агент для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, аргинин-HCl в количестве, достаточном для того, чтобы сделать жидкую композицию практически изотонической. Предлагаемые в изобретении стабильные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к CD40, можно применять в способах лечения пролиферативных заболеваний и заболеваний, которые имеют аутоиммунный и/или воспалительный компонент.

Description

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаративным формам, более конкретно к стабильным жидким фармацевтическим композициям, содержащим антагонистические антитела к ί.Ό40. которые предназначены для пролиферативных заболеваний и заболеваний, имеющих аутоиммунный или воспалительный компонент.
Предпосылки создания изобретения
Благодаря достигнутым в настоящее время успехам в разработке технологии генной инженерии созданы различные биологически активные полипептиды в количествах, достаточно больших для их применения в качестве лекарственных средств. Однако полипептиды могут терять биологическую активность из-за физической нестабильности, в том числе из-за денатурации и образования растворимых и нерастворимых агрегатов, и из-за различных видов химической нестабильности, таких как гидролиз, окисление и деамидирование. На стабильность полипептидов в жидких фармацевтических препаративных формах могут оказывать воздействие, например, такие факторы, как значение рН, ионная сила, температура, повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания и механические сдвиговые усилия, возникающие, например, в процессе обработки. Образование агрегатов и потеря биологической активности могут являться также результатом физического перемешивания и взаимодействий молекул полипептидов в растворе и на поверхностях раздела жидкость-воздух в сосудах для хранения. Другие конформационные изменения могут происходить в полипептидах, адсорбированных на поверхностях раздела воздухжидкость и поверхностях раздела твердое вещество-жидкость в процессе сокращения-удлинения поверхностей раздела в результате перемешивания в процессе транспортировки или других процессов. Такое перемешивание может приводить к запутыванию, агрегации, образованию частиц белка и, в конце концов, к его осаждению с другими адсорбированными белками. Общий обзор данных о стабильности белковых фармацевтических агентов приведен, например, у Маишид и др., Рйагт. Кек. 6, 1989, сс. 903918, и у ^аид и Наикои, 1. Рагеи1ега1 8ск ТесК 42, 1988, с. 14.
Нестабильность содержащих полипептиды жидких фармацевтических препаративных форм привела к тому, что эти препаративные формы упаковывают в лиофилизированном виде вместе с жидкой средой, пригодной для восстановления. Хотя лиофилизация повышает стабильность при хранении композиции, у многих полипептидов обнаружена пониженная активность либо в процессе их хранения в высушенном состоянии (Р1ка1, Вюрйагт. 27, 1990, сс. 26-30), либо из-за образования агрегатов или потери каталитической активности при восстановлении в жидкую форму (см., например, Сагреи1ег и др., Эеуе1ор. Вю1. 81аибагб 74, 1991, сс. 225-239; Вгоабйеаб и др., Эгид Эеуе1. 1иб. Рйагш. 18, 1992, сс. 1169-1206; Митеи1йа1ег и др., Рйагт. Кек. 11, 1994, сс. 12-20; Сагрейег и Сго^е, СгуоЫо1оду 25, 1988, сс. 459-470; и Кокег, Вюрйагт. 4, 1991, сс. 47-53). Хотя применение аддитивов повышает стабильность высушенных белков, многие повторно гидратированные препаративные формы все еще включают неприемлемые или нежелательные количества неактивного агрегированного белка (см., например, То\\пкепб и ПеЬиса, 1. Рйагт. 8ск 80, 1983, сс. 63-66; Нога и др., Рйагт. Кек. 9, 1992, сс. 33-36; УокЫака и др., Рйагт. Кек, 10, 1993, сс. 687-691). Кроме того, необходимость в восстановлении является неудобной, и она сопряжена с возможностью неправильной дозировки.
К фармацевтически приемлемым полипептидам относятся полученные рекомбинантно моноклональные антитела. Среди этого класса терапевтических агентов антагонистические антитела к СЭ40, мишенью для которых служит представитель семейства ΤΝΡ-рецепторов СЭ40, являются наиболее перспективными для лечения связанных с В-клетками злокачественных заболеваний и негематологических злокачественных заболеваний, а также болезней, которые имеют аутоиммунный и/или воспалительный компонент. Рецептор СЭ40 представляет собой расположенный на клеточной поверхности антиген с молекулярной массой 50-55 кДа, который присутствует на поверхности как здоровых, так и неопластических человеческих В-клеток, дендритных клеток, моноцитов, макрофагов, СЭ8+-Т-клеток, эндотелиальных клеток, моноцитов и эпителиальных клеток, некоторых эпителиальных карцином и многих плотных опухолей, включая рак легкого, молочной железы, яичника, мочевого пузыря и ободочной кишки. Антиген СЭ40 экспрессируется также на активированных Т-клетках, активированных тромбоцитах, воспаленных клетках гладких мышц сосудов, эозинофилах, синовиальных мембранах при ревматоидном артрите, кожных фибробластах и других нелимфоидных типах клеток. В зависимости от типа клеток, экспресирующих СЭ40, лигирование может индуцировать внутриклеточную адгезию, дифференцировку, активацию и пролиферацию.
Например, связывание СЭ40 с родственным лигандом, т.е. СО40Ь (который обозначают также как СО154), стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток в плазматические клетки, производство антител, переключение изотипа и создание В-клеточной памяти. В процессе В-клеточной дифференцировки СЭ40 экспрессируется на пре-В-клетках, но отсутствует после диффренцировки в плазматические клетки. Экспрессия СЭ40 на антигенпрезентирующих клетках (АПК) играет важную костимулирующую роль в активации этих клеток. Например, установлено, что агонистические моноклональные антитела к СЭ40 (МАт) имитируют воздействия Т-клеток-хелперов при В-клеточной активации. В случае присутствия на прикрепленных клетках, экспрессирующих РсуКП, эти антитела индуцируют Вклеточную пролиферацию (Ваисйегеаи и др., 8с1еисе 251, 1989, с. 70). Кроме того, агонистические МАт к
- 1 018301
СЭ40 могут заменять сигнал Т-клеток-хелперов, который приводит к секреции 1дМ, 1дС и 1дЕ в присутствии 1Ь-4 (Саксап и др., 1. 1ттипо1. 147, 1991, с. 8). Кроме того, агонистические МАт к СЭ40 могут предупреждать запрограммированную гибель клеток (апоптоз) В-клеток, выделенных из лимфатических узлов.
Эти и другие данные подтверждают современную теорию о том, что взаимодействие СЭ40 и СЭ40Б играет основную роль в регуляции как гуморальных, так и клеточно-опосредованных иммунных ответов. В проведенных в последние годы исследованиях выявлена более широкая роль взаимодействия СЭ40/СЭ40Б в разнообразных физиологических и патологических процессах.
Так, связывание СЭ40 с СЭ40Б и последующая активация передачи сигнала СЭ40 представляют собой необходимые стадии иммунных ответов; однако нарушение регуляции передачи сигнала СЭ40 может приводить к заболеванию. Установлено, что путь передачи сигнала СЭ40 принимает участие в аутоиммунном заболевании (1ск1ка^а и др., 1. 1ттипо1. 169, 2002, сс. 2781-2787 и Мооге и др., 1. Аи1о1ттип. 19, 2002, сс. 139-145). Кроме того, взаимодействие СЭ40/СЭ40Б играет важную роль в воспалительных процессах. Например, обнаружена сверхэкспрессия как СЭ40. так и СЭ40Б в повреждениях при атеросклерозе в организме человека и при вызванном экспериментальным путем атеросклерозе. Стимуляция СЭ40 индуцирует экспрессию разрушающих матрикс ферментов и экспрессию тканевых факторов в ассоциированных с атеросклеротической бляшкой типах клеток, таких как эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и макрофаги. Кроме того, стимуляция СЭ40 индуцирует производство провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-1, 1Ь-6 и 1Ь-8, и адгезионных молекул, таких как 1САМ-1 (фактор межклеточной адгезии-1), Е-селектин и УСАМ (молекулы адгезии сосудистого эндотелия). Ингибирование взаимодействия СЭ40/СЭ40Б предупреждает атерогенез на созданных с использованием животных моделях. На моделях, созданных с использованием трансплантатов, установлено, что блокирование взаимодействия СЭ40/СЭ40Б предупреждает воспаление. Было установлено, что связывание СЭ40/СЭ40Б обладает синергетическим действием с пептидом амилоида-бета при болезни Альцгеймера, усиливая активацию микроглии, что приводит к нейротоксичности. У пациентов, страдающих ревматоидным артритом (РА), уровень экспрессии СЭ40 повышается в хондроцитах суставов, таким образом, передача сигнала СЭ40, по-видимому, принимает участие в производстве вызывающих повреждение цитокинов и матриксных металлопротеиназ (см., Со1ок и др., 1. Вкеита!о1. 31, 2004, сс. 1506-1512).
Аналогично этому злокачественные В-клетки из опухолевых типов В-клеточной зародышевой линии экспрессируют СЭ40 и, вероятно, их выживание и пролиферация зависят от передачи сигнала СЭ40. Трансформированные клетки пациентов, страдающих В-клеточными лимфомами с низкой степенью злокачественности и высокозлокачественными В-клеточными лимфомами, острым В-клеточным лимфобластным лейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфоцитарным лейкозом, макроглобулинемией Вальденстрема и болезнью Ходжкина, экспрессируют СЭ40. Экспрессия СЭ40 обнаружена также в 2/3 случаев острого миелобластного лейкоза и в 50% случаев связанных со СПИДом лимфом.
Для целого ряда карцином и сарком также характерны высокие уровни экспрессии СЭ40, хотя роль передачи сигнала СЭ40 в сочетании с экспрессией СЭ40 на этих типах раковых клеток менее хорошо изучена. К экспрессирующим СЭ40 карциномам относится карцинома мочевого пузыря (Ранке и др., 1. 1ттипо1. 142, 1989, сс. 590-595; Вгаекск-Апбегкеп и др., 1. 1ттипо1. 142, 1989, сс. 562-567), карцинома молочной железы (Нйапо и др., В1ооб 93, 1999, сс. 2999-3007; Ашдей и др., Вгеак! Сапсег Век. Тгеа!. 50, 1998, сс. 27-36); рак предстательной железы (ВокЫш и др., Сапсег Век. 57, 1997, сс. 1758-1768), почечноклеточная карцинома (КкПк и др., Сапсег Век. 57, 1997, сс. 891-899), недифференцированная носоглоточная карцинома (ИИРС) (Ада!капдде1ои и др., Ат. 1. Ра1ко1. 147, 1995, сс. 1152-1160), плоскоклеточная карцинома (8СС) (Ато и др., Еиг. 1. Эегта1о1. 10, 2000, сс. 438-442; Рокпег и др., С1ш. Сапсег Век. 5, 1999, сс. 2261-2270), папиллярная карцинома щитовидной железы (8тйк и др., Ткуго1б 9, 1999, сс. 749-755), кожная злокачественная меланома (уап беп Оогб и др., Ат. 1. Ра!ко1. 149, 1996, сс. 1953-1961), карцинома желудка (УатадисЫ и др. 1п1. 1. Опсо1. 23(6), 2003, сс. 1697-1702) и карцинома печени (см., например, 8ищто1о и др., Нера!о1оду 30(4), 1999, сс. 920-926, в указанной публикации обсуждается человеческая печеночно-клеточная карцинома). Данные о экспрессирующих СЭ40 саркомах представлены, например, у ЬоШш и др., С1ш. Сапсег Век. 4(8), 1998, сс. 1843-849, в указанной публикации обсуждается человеческая остеосаркома и саркома Юинга.
С учетом потенциальных терапевтических благоприятных воздействий антагонистических антител к СЭ40 на регуляцию опосредуемой СЭ40Б передачи сигнала СЭ40 при различных видах рака и аутоиммунных/воспалительных заболеваниях и недостатков препаративных форм этих полипептидов существует необходимость в создании стабильных фармацевтических композиций, содержащих эти антитела.
Краткое изложение сущности изобретения
Предложены стабильные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к СЭ40 в качестве обладающего терапевтической или профилактической активностью компонента, и способы, пригодные для их получения. Указанные композиции содержат антагонистическое антитело к СЭ40, забуферивающий агент для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0 и аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической. В некоторых вариантах осуществления изобретения забуферивающий
- 2 018301 агент представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, антагонистическое антитело к СЭ40 представляет собой антагонистическое антитело к СИ40 СН1К-12.12 или СН1К-5.9 или его антигенсвязывающий фрагмент, композиция содержит аргинин-НС1 в качестве придающего изотоничность агента и композиция содержит также неионогенное поверхностно-активное вещество и/или Ь-метионин в качестве дополнительного стабилизатора. Стабильные жидкие содержащие антагонистическое антитело к СЭ40 фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, находят применение в способах лечения пролиферативных заболеваний и заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент.
Краткое описание некоторых аспектов, представленных на чертеже(ах)
На чертежах показано:
на фиг. 1 - воздействие различных буферов на чистоту МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые хранили при 25°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 2 - воздействие различных буферов на образование агрегатов в различных препаративных формах МАт СН1К-12.12, которые хранили при 25°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 3 - воздействие различных буферов на фрагментацию в различных препаративных формах МАт СН1К-12.12, которые хранили при 25°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 4 - воздействие различных буферов на чистоту МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые хранили при 40°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 5 - воздействие различных буферов на образование агрегатов в различных препаративных формах МАт СН1К-12.12, которые хранили при 40°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 6 - воздействие различных буферов на фрагментацию в различных препаративных формах МАт СН1К-12.12, которые хранили при 40°С в течение 3 месяцев или 5 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 7 - полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии термограммы МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, содержащих либо ЫаС1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности;
на фиг. 8 - содержание (в %) мономерной формы МАт СН1К-12.12, сохранившейся в препаративных формах, которые содержали либо №1С1. либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 9 - количество агрегатов (в %) МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 10 - количество фрагментов (в %) МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 11 - содержание (в %) мономерной формы МАт СН1К-12.12, сохранившейся в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 40°С в течение 2 или 4 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВРанализа;
на фиг. 12 - количество агрегатов (в %) МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 40°С в течение 2 или 4 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 13 - количество фрагментов (в %) МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 40°С в течение 2 или 4 месяцев, оцененное с помощью ГФ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 14 - чистота (в %) МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью С1ЕХ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 15 - содержание (в %) кислотных вариантов МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью СШХ-ЖХВР-анализа;
на фиг. 16 - содержание (в %) основных вариантов МАт СН1К-12.12 в препаративных формах, которые содержали либо №1С1, либо Ь-аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности, при их хранении при 25°С в течение 2, 4 или 6 месяцев, оцененное с помощью СШХ-ЖХВР-анализа.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых представлены некоторые, но не все варианты осуществления изобретения. Естественно, что заявляемые признаки могут иметь различные формы, а изобретение не ограничено представленными вариантами осуществления изобретения; указанные варианты осуществления изобретения представлены таким
- 3 018301 образом, чтобы настоящее описание удовлетворяло принятым юридическим требованиям.
Многие модификации и другие варианты осуществления изобретения, представленные в настоящем изобретении, как должно быть очевидно специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение, обладают ценными свойствами, которые представлены в приведенном ниже описании и прилагаемых чертежах. Таким образом, следует понимать, что объем изобретения не ограничен конкретными описанными вариантами осуществления изобретения, и подразумевается, что модификации и другие варианты осуществления изобретения подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Хотя в настоящем описании применяют специфические понятия, их используют только в обычном и соответствующем смысле, а не с целью ограничения.
Настоящее изобретение относится к стабильным жидким фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве обладающего терапевтической или профилактической активностью компонента, и к способам, пригодным для их получения. Для целей настоящего изобретения подразумевается, что понятие жидкий касательно фармацевтических композиций или препаративных форм включает понятие водный. Под понятием обладающий терапевтической или профилактической активностью компонент подразумевается, что антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент специально включены в композицию для получения требуемого терапевтического или профилактического ответа при осуществлении лечения, предупреждения или диагностики заболевания или состояния у индивидуума, когда фармацевтическую композицию вводят этому индивидууму.
Под понятием стабильные понимают, что фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, обеспечивают физическую и/или химическую стабильность антагонистическому антителу к СЭ40 или его антигенсвязывающему фрагменту. Это означает, что антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент практически сохраняет физическую и/или химическую стабильность и обладает требуемой биологической активностью, т.е. одним или несколькими видами антагонистической активности, указанной в настоящем описании, включая (но, не ограничиваясь только ими): ингибирование секреции иммуноглобулина здоровыми человеческими периферическими В-клетками, стимулированными Т-клетками; ингибирование выживания и/или пролиферации здоровых человеческих периферических В-клеток, стимулированных Т-клетками линии 1итка1; ингибирование выживания и/или пролиферации здоровых человеческих периферических В-клеток, стимулированных экспрессирующими СП40Ь клетками или растворимым лигандом СЭ40 (8СП40Ь); ингибирование антиапоптозных внутриклеточных сигналов выживания в любых клетках, стимулированных 5СЭ40Р или твердофазным СП40Ь; ингибирование трансдукции сигнала СЭ40 в любой клетке при лигировании с 8СП40Ь или твердофазным СП40Ь; ингибирование пролиферации человеческих злокачественных В-клеток; снижение чувствительности, придание нечувствительности (анергии) и/или переносимости индукции несущим СЭ40 клеткам-мишеням или клеткам, несущим родственные лиганды СЭ40. включая (но, не ограничиваясь только ими) Т-клетки и В-клетки; индукция экспансии или активации СО4+СО25+-регуляторных Тклеток (см., например, данные об отторжении донорской аллоантигенспецифической ткани при взаимодействии СП40-СП40Ь, уап Маштк и др., 1. 1ттипо1. 169, 2002, сс. 5401-5404); цитотоксичность посредством любого механизма (включая (но, не ограничиваясь только ими) антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ЛЭСС), комплементзависимую цитотоксичность (СЭС), понижающую регуляцию пролиферации и/или апоптоз клеток-мишеней); модуляцию секреции цитокинов клеткоймишенью и/или экспрессии молекулы на клеточной поверхности; и их комбинации.
Методы мониторинга стабильности белков хорошо известны в данной области (см., например, 1опе8, Αάν. Эгид ЭсПусгу Кеу. 10, 1993, сс. 29-90; РерИбе апб Рго1еш Эгид ОеНуегу, под ред. Ьее, изд-во Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уотк, Ыете Уотк, 1991; и анализы стабильности, приведенные в настоящем описании). В целом, стабильность белков оценивают при выбранной температуре в течение определенного периода времени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения стабильная содержащая антитело фармацевтическая композиция обеспечивается стабильность антагонистического антитела к СЭ40 или его антигенсвязывающего фрагмента при хранении при комнатной температуре (примерно 25°С) в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 3 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев, и/или стабильность при хранении примерно при 2-8°С в течение по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяца.
Считается, что белок, такой как антитело, при приготовлении на его основе фармацевтической композиции сохраняет физическую стабильность в данный момент времени, если не обнаружено визуальных признаков (т.е. изменения цвета или потери прозрачности) или измеряемых признаков (например, при использовании гель-фильтрации (ГФ) или рассеяния в УФ-лучах) осаждения, агрегации и/или денатурации в указанной фармацевтической композиции. Касательно химической стабильности считается, что белок, такой как антитело, при приготовлении на его основе фармацевтической композиции, сохраняет химическую стабильность в данный момент времени, если оценка химической стабильности свидетельствует о том, что белок (т.е. антитело) сохраняет представляющую интерес биологическую активность в указанной фармацевтической композиции. Методы мониторинга изменений химической стабильности хорошо известны в данной области и включают (но, не ограничиваясь только ими) методы выявления
- 4 018301 химически измененных форм белка в результате расщепления, например, с помощью ДСН-ПААГ, ГФ и/или времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; и расщепления, ассоциированного с изменениями молекулярного заряда (например, ассоциированного с деамидированием), с использованием, например, ионообменной хроматографии (см., например, методы, приведенные ниже в настоящем описании).
Считается, что антагонистическое антитело к ί.Ό40 или его антигенсвязывающий фрагмент при приготовлении на его основе фармацевтической композиции сохраняет в данный момент времени требуемую биологическую активность, если отклонение требуемой биологической активности в данный момент от требуемой биологической активности в момент приготовления фармацевтической композиции составляет примерно 30%, предпочтительно примерно 20% по результатам пригодного анализа для определения требуемой биологической активности. Методы анализа для оценки требуемой биологической активности антагонистических антител к ί.Ό40 представлены в настоящем описании, а анализы активности их антигенсвязывающих фрагментов можно осуществлять согласно методам, описанным в предварительных заявках, которые озаглавлены Аи1адошк1 ΛπΙί-ί.Ό40 Мопос1опа1 АпйЬоб1ек аиб МеФобк £ог Т11СЙ Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданных 4 ноября 2003 г., 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., и переуступленных заявок на патент США 60/517337 (досье у патентного поверенного № РР20107.001 (035784/258442)), 60/525579 (досье у патентного поверенного № РР20107.002 (035784/271525)) и 60/565710 (досье у патентного поверенного № РР20107.003 (035784/277214)) соответственно; и международной заявке на патент РСТ/и82004/037152 (досье у патентного поверенного № РР20107.004 (035784/282916)), которая озаглавлена также Ап!адоπίκΐ Ап11-СЭ40 Моиос1оиа1 АпйЬоб1ек аиб МеЛобк £ог ТНей Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданной 4 ноября 2004 г. и опубликованной как АО 2005/044854; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также анализы, описанные в предварительной заявке, озаглавленной МеОюбк £ог О1адпок1к аиб Тгеа1теи1 о£ РгоШегаДуе Ойогбегк Меб1а1еб Ьу СЭ40 81дпа1шд, Способы диагностики и лечения пролиферативных заболеваний, опосредуемых передачей сигнала ί.Ό40. поданной 9 декабря 2005 г., и переуступленной заявке на патент США 60/749285 (досье у патентного поверенного №. РР028035.0002 (035784/304312)) и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И82006/ 019414 (досье у патентного поверенного № РР028035.0003 (035784/311611)), поданной 18 мая 2006 г. и опубликованной как АО 2006/125143; и в предварительной заявке, озаглавленной МеЙюбк £ог П1адпок1к аиб Тгеа1теи1 о£ Όίκеакек Наушд ап Аи1о1ттипе апб/ог 1пПатта1огу Сотропеп!, (Способы диагностики и лечения заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент), поданной 9 декабря 2005 г., переуступленной заявке на патент США 60/749336 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0002 (035784/304311)), и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И82006/019325 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0003 (035784/311608)), поданной 18 мая 2006 г., и опубликованной как АО 2006/125117; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Анализы описаны также у 8с1ш11хе и др., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 92, 1998, сс. 82008204; ОегИоп и др., Реб1а1г. Тгапкр1ап!. 2, 1998, сс. 6-15; Еуаик и др., 1. 1ттипо1. 164, 2000, сс. 688-697; Ыое11е, Адеп!к Асйопк 8ирр1. 49, 1998, сс.17-22; Ьебегтаи и др., Сигг. Орш. Нета!о1. 3, 1996, сс. 77-86; Сойдап и др., Сиггеп! Рго1осо1к ш 1ттипо1оду 13, 1991, с 12; КлгеккеЬоот и др., 1ттипо1оду 79, 1993, сс. 439-444; и И8 5674492 и 5847082; содержание которых включено в качестве ссылки.
Антагонистическое антитело к ί.Ό40 или его антигенсвязывающий фрагмент, на основе которых приготавливают препаративную форму с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно получать с помощью любого метода, известного в данной области, включая методы, представленные в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонистическое антитело к ί.Ό40, например моноклональное антитело СН1Р-12.12 или СН1К.-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент получают рекомбинантно в линии клеток СНО согласно описанному ниже методу.
После получения и очистки антагонистическое антитело к ί.Ό40 или его антигенсвязывающий фрагмент можно включать в препаративную форму в виде жидкой фармацевтической композиции с помощью описанного ниже способа. Если антагонистическое антитело к ί.Ό40 или его антигенсвязывающий фрагмент следует хранить до приготовления на его основе препаративой формы, его можно замораживать, например, при температуре <-20°С, а затем подвергать оттаиванию при комнатной температуре для дальнейшего приготовления препаративной формы на его основе.
Жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержат антагонистическое антитело к ί.Ό40 или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически или профилактически эффективном количестве. Количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, присутствующее в прерпаративной форме, зависит от пути введения и требуемого объема дозы.
Таким образом, в состав фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, антагонистическое антитело к СЭ40, например, антитело СН1Р-12.12 или СН1К.-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент входят в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 40,0 мг/мл, от примерно 1,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, от примерно 1,0 мг/мл до примерно 30,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 25,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до при
- 5 018301 мерно 20,0 мг/мл, от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 15,0 мг/мл до примерно 25,0 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения в состав жидких фармацевтических композиций антагонистическое антитело к СБ40 или его антигенсвязывающий фрагмент входят в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл, от примерно 10,0 мг/мл до примерно 15,0 мг/мл, от примерно 15,0 мг/мл до примерно 20,0 мг/мл, от примерно 20,0 мг/мл до примерно 25,0 мг/мл, от примерно 25,0 мг/мл до примерно 30,0 мг/мл, от примерно 30,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, от примерно 35,0 мг/мл до примерно 40,0 мг/мл, примерно от 40,0 мг/мл до примерно 45,0 мг/мл или от примерно 45,0 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл. В других вариантах осуществления изобретения в состав жидких фармацевтических композиций антагонистическое антитело к СБ40 или его антигенсвязывающий фрагмент входят в концентрации примерно 15,0 мг/мл, примерно 16,0 мг/мл, примерно 17,0 мг/мл, примерно 18,0 мг/мл, примерно 19,0 мг/мл, примерно 20,0 мг/мл, примерно 21,0 мг/мл, примерно 22,0 мг/мл, примерно 23,0 мг/мл, примерно 24,0 мг/мл, примерно 25,0 мг/мл, примерно 26,0 мг/мл, примерно 27,0 мг/мл, примерно 28,0 мг/мл, примерно 29,0 мг/мл, примерно 30,0 мг/мл, примерно 31,0 мг/мл, примерно 32,0 мг/мл, примерно 33,0 мг/мл, примерно 34.0 мг/мл или примерно 35,0 мг/мл.
Согласно настоящему изобретению на основе антагонистического антитела к СБ40. например моноклонального антитела СН1В-12.12 или СН1В-5.9, или его антигенсвязывающего фрагмента приготавливают препаративную форму с добавлением буфера, который поддерживает значение рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, и аргинин в кислотной форме, обозначенный в контексте настоящего описания как аргинин-НС1, в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической. Под понятием практически изотоническая подразумевают, что водная препаративная форма имеет осмоляльность от примерно 240 ммолей/кг до примерно 360 ммолей/кг, предпочтительно от примерно 240 до примерно 340 ммолей/кг, более предпочтительно от примерно 250 до примерно 330 ммолей/кг, еще более предпочтительно от примерно 260 до примерно 320 ммолей/кг, еще более предпочтительно от примерно 270 до примерно 310 ммолей/кг. В некоторых вариантах осуществления изобретения осмоляльность жидкой фармацевтической композиции составляет примерно 295 ммолей/кг. Методы определения изотоничности раствора известны специалистам в данной области (см., например, 8е1шкат и др., 1. Ат. Рйатт. Аккос. 48, 1959, с. 628).
Аргинин-НС1 служит не только в качестве агента для придания изотоничности, но также служит для стабилизации антитела от конформационных изменений, образования агрегатов, фрагментации и/или деамидирования в процессе хранения жидких фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении. Под понятием в процессе хранения подразумевают, что жидкую фармацевтическую композицию или препаративную форму после приготовления не сразу вводят индивидууму. Вместо этого после приготовления ее упаковывают для хранения либо в жидкой форме, либо в замороженном состоянии, либо в высушенной форме для последующего восстановления с получением жидкой формы или другой формы, пригодной для введения индивидууму. Под понятием высушенная форма подразумевают, что жидкую фармацевтическую композицию или препаративную форму сушат либо сушкой вымораживанием (т.е. подвергают лиофилизации; см., например, ЭДббатк и РоШ, 1. Ратеп1ета1 8ск Тесйпок 38, 1984, сс. 48-59), распылительной сушкой (см. Майетк, в: 8ртау-Бгутд НапбЬоок, 5-ое изд., изд-во Ьопдтап 8с1еиййс апб Тескшсак Еккех, и.К., 1991, сс. 491-676; Вгоабйеаб и др., Бтид Беуе1. 1пб. Рйатт. 18, 1992, сс. 1169-1206; и Митеп1йа1ег и др., Р1агт. Век. 11, 1994, сс. 12-20), либо сушкой на воздухе (Сагрейег и Сто^е, СтуоЫо1оду 25, 1988, сс. 459-470; и Вокег, Вюрйатт. 4, 1991. сс. 47-53). Конформационные изменения, образование агрегатов, фрагментация и/или деамидирование антитела в процессе хранения жидких фармацевтических композиций может оказывать неблагоприятное воздействие на биологическую активность антитела, приводя к снижению терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может вызывать другие проблемы, такие как блокада трубок, мембран или насосов, когда содержащую антитело фармацевтическую композицию вводят с помощью системы для инфузии.
Любой стереоизомер (т.е., Ь-, Б- или БЬ-изомер) аргинина или комбинации стереоизомеров могут присутствовать в фармацевтических композициях, предлагаемых к изобретении, если аргинин находится в кислотой форме, т.е. в виде аргинина-НС1. Предпочтительно применяют Ь-стереоизомер. В состав композиций, предлагаемых в изобретении, могут входить также аналоги этой аминокислоты. Под понятием аналог аминокислоты подразумевают производное встречающейся в естественных условиях аминокислоты, которое обладает примерно аналогичным требуемым действием в том плане, что делает композицию практически изотонической, а также снижает образование агрегатов, фрагментацию и/или деамидирование полипептида в процессе хранения жидких фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении. Приемлемыми аналогами аргинина являются, например, аминогуанидин и Ν-моноэтил-Ьаргинин. Также как и аргинин, аминокислотные аналоги включают в композиции в кислой форме.
Концентрация аргинина-НС1 в фармацевтической композиции должна зависеть от вклада в создание тоничности других компонентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация аргинина-НС1 составляет от примерно 50 мМ до примерно 300 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 250 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 200 мМ, от примерно 50 мМ до примерно 175 мМ, от примерно 50
- 6 018301 мМ до примерно 150 мМ, от примерно 75 мМ до примерно 175 мМ, от примерно 75 мМ до примерно 150 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 175 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 150 мМ, от примерно 125 мМ до примерно 175 мМ, от примерно 125 мМ до примерно 150 мМ, от примерно 130 мМ до примерно 170 мМ, от примерно 130 мМ до примерно 160 мМ, от примерно 135 мМ до примерно 155 мМ, от примерно 140 мМ до примерно 155 мМ или от примерно 145 мМ до примерно 155 мМ. В одном из таких вариантов осуществления изобретения концентрация аргинина-НО составляет примерно 125 мМ, примерно 150 мМ или примерно 175 мМ.
Значение рН жидкой содержащей антитело фармацевтической композиции влияет на стабильность входящего в ее состав антитела, прежде всего, оказывая воздействие на образование агрегатов. Таким образом, количество забуферивающего агента, присутствующего в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, должно варьироваться в зависимости от значения рН, оптимального для стабильности конкретного представляющего интерес антагонистического антитела к СИ40. Определение оптимального значения рН можно осуществлять с помощью методов, общепринятых для данной области, включая, например, дифференциальную сканирующую калориметрию (И8С), которую применяют для оценки конформационной стабильности; ДСН-ПААГ и гель фильтрацию (ГФ-ЖХВР), которую применяют для оценки агрегации и фрагментации; и анализы с использованием катионообменной ЖХВР (С1ЕХ-ЖХВР), которые применяют для оценки расщепления, связанного с изменением заряда. Предпочтительными значениями рН жидких фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, являются значения рН, составляющие примерно 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 и другие значения в диапазоне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения забуферивающий агент поддерживает значение рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,5, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 5,5, от примерно рН 5,5 до примерно 7,0, от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,5 или от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0.
Любой приемлемый забуферивающий агент, который поддерживает значение рН жидкой фармацевтической композиции, содержащей антагонистическое антитело к СИ40, на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, можно применять в препаративной форме, если при этом сохраняются указанные выше физико-химическая стабильность и требуемая биологическая активность антитела. Приемлемыми забуферивающими агентами являются (но, не ограничиваясь только ими) общепринятые кислоты и их соли, в которых противоион может представлять собой, например, натрий, калий, аммоний, кальций или магний. Примерами общепринятых кислот и их солей, которые можно применять для забуферивания жидкой фармацевтической композиции являются (но, не ограничиваясь только ими) лимонная кислота или цитрат, янтарная кислота или сукцинат, уксусная кислота или ацетат, винная кислота или тартрат, фосфорная кислота или фосфат, глюконовая кислота или глюконат, глутаминовая кислота или глутамат, аспарагиновая кислота или аспартат, малеиновая кислота или малеат и яблочная кислота или малеат и буферы на основе яблочной кислоты или малата. Известно, что забуферивающий агент может представлять собой смесь кислоты и соли кислоты, например, смесь лимонной кислоты и цитрата (обозначена в контексте настоящего описания как буфер на основе цитрата/лимонной кислоты), смесь янтарной кислоты и сукциата (обозначена в контексте настоящего описания как буфер на основе сукцината/янтарной кислоты), смесь уксусной кислоты и ацетата (обозначена в контексте настоящего описания как буфер на основе ацетата/уксусной кислоты), и т.п. для каждой из вышеуказанных пар кислота/соль кислоты. Концентрация забуферивающего агента может составлять от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ, в том числе примерно 1 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ или иметь другие такие значения в диапазоне от примерно 1мМ до примерно 50мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, в том числе примерно 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ, 15 мМ или иметь другие значения в диапазоне от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит в требуемой концентрации (т.е., от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, как указано выше) антагонистическое антитело к СИ40, предлагаемое в изобретении, например, моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1Р-5.9. или его антигенсвязывающий фрагмент, аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической, и забуферивающий агент, представляющий собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, при этом концентрация забуферивающего агента является такой, что забуферивающий агент поддерживает значение рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, предпочтительно от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,5, в том числе примерно рН 5,0, 5,5, 6,0, и 6,5. Под цитратным буфером подразумевают буфер, содержащий соль лимонной кислоты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения противоион цитрата представляет собой катион натрия, и таким образом, компонентом цитратного буфера является цитрат натрия. Однако ожидается, что эффективным может быть любой катион. Другими возможными катионами цитрата являются (но, не ограничиваясь только ими) калий, аммоний, кальций и магний. Как указано выше, буфер на основе цитрата/лимонной кислоты содержит смесь кислоты (т.е. лимонной кислоты) и солевой формы кислоты (т.е. цитрат), при этом противоион солевой формы кисло
- 7 018301 ты может представлять собой любой приемлемый катион. В одном из вариантов осуществления изобретения противоион солевой формы кислоты представляет собой катион натрия и поэтому забуферивающий агент представляет собой смесь лимонной кислоты и цитрата натрия. Как указано выше, концентрация буфера на основе цитрата/лимонной кислоты может составлять от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ, в том числе примерно 1 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 8 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ или иметь другие значения в диапазоне от примерно 1мМ до примерно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация буфера на основе цитрата/лимонной кислоты составляет от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, в том числе 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ или примерно 15 мМ.
В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к ί.Ό40. например, моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 20,0 мг/мл; аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической, и забуферивающий агент, представляющий собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 20 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, предпочтительно примерно 10 мМ. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например, моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 20,0 мг/мл; аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотоничной, и забуферивающий агент, представляющий собой буфер на основе цитрата натрия /лимонной кислоты, в концентрации от примерно 1мМ до примерно 20 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, предпочтительно примерно 10 мМ.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например, моноклональное антитело СН1К12.12 или СН1К.-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент; забуферивающий агент для поддержания значения рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7.0; и аргинин-НС1 в концентрации от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ. В некоторых из этих вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5мМ до примерно 15 мМ, жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например, моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент, и значение рН фармацевтической композиции составляет от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,5 или от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например, моноклональное антитело СНГК.-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, в той числе примерно 10,0 мг/мл, примерно 15,0 мг/мл, примерно 20,0 мг/мл, примерно 25,0 мг/мл, примерно 30,0 мг/мл или примерно 35,0 мг/мл; примерно 150 мМ аргинин-НС1; и забуферивающий агент представляет собой примерно 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты; при этом значение рН препаративной формы составляет примерно 5,5.
Расщепление белка из-за замораживания-оттаивания или механических сдвиговых воздействий при приготовлении жидких фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, можно ингибировать путем включения поверхностно-активных веществ в препаративную форму для уменьшения поверхностного натяжения на поверхности раздела раствор-воздух. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент; забуферивающий агент для поддержания значения рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0; аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической; а также содержит поверхностно-активное вещество. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент; забуферивающий агент для поддержания значения рН фармацевтической композиции на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0; аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 300 мМ, или от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ; а также содержит поверхностно-активное вещество.
Типичные применяемые поверхностно-активные вещества представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, в том числе сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитола, такие как полисорбат 80 (Твин 80) и полисорбат 20 (Твин 20); сложные эфиры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, такие как Р1игоше Р68; полиоксиэтиленовые спирты, такие как Вту 35; симетикон; полиэтиленгликоль,
- 8 018301 такой как ПЭГ400; лизофосфатидилхолин; и полиоксиэтилен-пара-трет-октилфенол, такой как Ттйоп Х100. Классическая стабилизация фармацевтических средств поверхностно-активными веществами или эмульгаторами описана, например, у Ьеуте и др., 1. Ратеп1ета1 8οί. Тесйпо1. 45(3), 1991, сс. 160-165, публикация включена в настоящее описания в качестве ссылки. Предпочтительным поверхностно-активным веществом, применяемым при воплощении на практике настоящего изобретения, является полисорбат 20 или полисорбат 80. Когда в композицию включают поверхностно-активное вещество, то его, как правило, добавляют в количестве от примерно 0,001% до примерно 1,0%, от примерно 0,001% до примерно 0,5%, от примерно 0,001% до примерно 0,4%, от примерно 0,001% до примерно 0,3%, от примерно 0,001% до примерно 0,2%, от примерно 0,005% до примерно 0,5%, от примерно 0,005% до примерно 0,2%, от примерно 0,01% до примерно 0,5%, от примерно 0,01% до примерно 0,2%, от примерно 0,03% до примерно 0,5%, от примерно 0,03% до примерно 0,3%, от примерно 0,05% до примерно 0,5% или от примерно 0,05% до примерно 0,2%, при этом проценты представляют собой массовые/объемные проценты (мас./об.)
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к ί.Ό40. например моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент; забуривающий агент, который представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, например, буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ или от примерно 5мМ до примерно 15 мМ; значение рН композиции находится на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,5 или от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0; аргинин-НС1 присутствует в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 300 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ или от примерно 50 мМ до примерно 150 мМ; и фармацевтическая композиция содержит также поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 20, в количестве от примерно 0,001% до примерно 1,0% (мас./об.) или от примерно 0,001% до примерно 0,5% (мас./об.). В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1К.-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, в том числе примерно 10,0 мг/мл, примерно 15,0 мг/мл, примерно 20,0 мг/мл, примерно 25,0 мг/мл, примерно 30,0 мг/мл или примерно 35,0 мг/мл; аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 200 мМ, включая примерно 150 мМ аргинин-НС1; забуферивающий агент, представляющий собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ, в том числе примерно 10 мМ; и фармацевтическая композиция необязательно содержит поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 20, в количестве от примерно 0,001% до примерно 1,0% (мас./об.), в том числе от примерно 0,001% до примерно 0,5% (мас./об.), от примерно 0,01% до примерно 0,25% (мас./об.), от примерно 0,025% до примерно 0,2% (мас./об.), от примерно 0,025% до примерно 0,1% (мас./об.) или от примерно 0,05% до примерно 0,2% (мас./об.); при этом значение рН жидкой фармацевтической композиции находится на уровне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 5,5, от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,5, от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0 или примерно рН 5,5.
Жидкая фармацевтическая композиция может практически не содержать любые консерванты и другие носители, эксципиенты или стабилизаторы. В другом варианте фармацевтическая композиция необязательно может включать один или несколько консервантов, например антибактериальных агентов, фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или стабилизаторов, представленных в настоящем описании, при условии, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на физико-химическую стабильность антитела к ί.Ό40 или его антигенсвязывающего фрагмента. Примерами приемлемых носителей, эксципиентов и стабилизаторов являются (но, не ограничиваясь только ими) дополнительные забуферивающие агенты, сорастворители, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, хелатирующие агенты, такие как ЭДТК, комплексы с металлами (например, комплексы Ζη-белок) и биоразложимые полимеры, такие как сложные полиэфиры. Обсуждение составов и выбор фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и агентов для придания изотоничности можно почерпнуть в справочнике Вепипфоп'х Рйагтасеийса1 8с1епсе§, 18-е изд., изд-во Маск РиЫкЫпд Сотрапу, Еа1оп, Реппкукаша, 1990, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения содержащие антагонистические антитела к СЭ40 жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержат также аминокислоту метионин для ингибирования окисления окисляемых аминокислотных остатков в полипептидных цепях антител. Под понятием ингибирование подразумевают минимальное накопление окисленных видов в течение времени. Ингибирование окисления приводит к более длительному сохранению антагонистического антитела к ί.Ό40 в соответствующей молекулярной форме. Можно использовать любой стереоизомер метионина (Ь-, Ό- или ОЬ-изомер) или их комбинации.
Добавляемое количество должно представлять собой количество, достаточное для ингибирования окисления окисляемых аминокислотных остатков, в результате которого количество окисленных видов
- 9 018301 должно соответствовать количеству, установленному регулирующими органами. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем от примерно 10% до примерно 30% продуктов окисления. Обычно для достижения указанной цели добавляют метионин в таком количестве, чтобы соотношение добавленного метионина и остатков метионина составляло от примерно 1:1 до примерно 1000:1, наиболее предпочтительно от 10:1 до примерно 100:1.
Предпочтительное добавляемое количество метионина можно легко определять эмпирически при приготовлении композиции, содержащей представляющее интерес антагонистическое антитело к ΟΌ40 или его антигенсвязывающий фрагмент, используя различные концентрации метионина и определяя относительное воздействие на образование окисленных видов полипептида с помощью, например, хроматографического разделения видов молекул и идентификации с использованием стандартов молекулярной массы полипептидов, например, с помощью ОФ-ЖХВР или хроматографии, основанной на гидрофобном взаимодействии (Н1С), которая описана в примере 1. Концентрация метионина, при использовании которой достигается максимальное ингибирование окисления окисляемых аминокислотных остатков, не оказывающая при этом неблагоприятного воздействия на связанное с аминокислотой ингибирование агрегации антитела, может представлять собой предпочтительное количество метионина, которое следует добавлять в композицию для дополнительного повышения стабильности антитела.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к ί.Ό40. например моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент; забуферивающий агент, представляющий собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, например, буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ или от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ; значение рН фармацевтической композиции составляет от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,5 или от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0; аргинин-НС1 присутствует в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 300 мМ, от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ или от примерно 50 мМ до примерно 150 мМ; в ней присутствует поверхностно-активное вещество, например полисорбат 20 или полисорбат 80, в количестве от примерно 0,001% до примерно 1,0% (мас./об.) или от примерно 0.001% до примерно 0,5% (мас./об.); и фармацевтическая композиция дополнительно содержит метионин в концентрации от примерно 0,5 мМ до примерно 20,0 мМ, от примерно 0,5 мМ до примерно 10,0 мМ, от примерно 1,0 мМ до примерно 20,0 мМ, от примерно 1,0 мМ до примерно 10,0 мМ, от примерно 1,0 мМ до примерно 7,0 мМ, от примерно 2,0 мМ до примерно 6,0 мМ или от примерно 2,5 мМ до примерно 5,0 мМ. В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит антагонистическое антитело к СЭ40, например моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9 или его антигенсвязывающий фрагмент, в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл, в том числе примерно 10,0 мг/мл, примерно 15,0 мг/мл, примерно 20,0 мг/мл, примерно 25,0 мг/мл, примерно 30,0 мг/мл или примерно 35,0 мг/мл; аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 200 мМ, в том числе примерно 150мМ аргинин-НС1; буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ, в том числе примерно 10 мМ; необязательно поверхностно-активное вещество, например, полисорбат 20, в количестве от примерно 0,001% до примерно 1,0% (мас./об.), в том числе от примерно 0,001% до примерно 0,5% (мас./об.), от примерно 0,01% до примерно 0,25% (мас./об.), от примерно 0,025% до примерно 0,2% (мас./об.), от примерно 0,025% до примерно 0,1% (мас./об.) или от примерно 0,05% до примерно 0,2% (мас./об.); и необязательно метионин, например, в концентрации от примерно 0,5 мМ до примерно 10,0 мМ, от примерно 1,0 мМ до примерно 7,0 мМ, от примерно 2,0 мМ до примерно 6,0 мМ или от примерно 2,5 мМ до примерно 5,0 мМ, в том числе примерно 2,0 мМ, примерно 2,5 мМ, примерно 3,0 мМ, примерно 3,5 мМ, примерно 4,0 мМ, примерно 4,5 мМ, примерно 5,0 мМ или примерно 5,5 мМ; при этом значение рН жидкой фармацевтической композиции составляет от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,0, от примерно рН 5,0 до примерно рН
5.5, от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,5, от примерно рН 5,5 до примерно рН 6,0 или примерно рН
5.5.
В следующих вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50,0 мг/мл, от примерно 5,0 мг/мл до примерно 35,0 мг/мл или от примерно 10,0 мг/мл до примерно 35.0 мг/мл, в том числе примерно 10,0 мг/мл, примерно 15,0 мг/мл, примерно 20,0 мг/мл, примерно 25,0 мг/мл, примерно 30,0 мг/мл или примерно 35,0 мг/мл; аргинин-НС1 в концентрации от примерно 100 мМ до примерно 200 мМ, в том числе примерно 150 мМ аргинин-НС1; буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 20 мМ, в том числе примерно 10 мМ; необязательно поверхностно-активное вещество, например полисорбат 20, в количестве от примерно 0,025% до примерно 0,1% (мас./об.); и необязательно метионин, например, в концентрации от примерно 2,0 мМ до примерно 5,5 мМ, в том числе примерно 5,0 мМ; при этом значение рН жидкой фармацевтической композиции составляет от примерно рН 5,0 до примерно рН 6,0, в том числе примерно рН 5,5.
- 10 018301
Помимо указанных выше агентов, другие стабилизаторы, такие как альбумин, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК) или одну из ее солей, например динатрий-ЭДТК, необязательно можно добавлять для дополнительного повышения стабильности жидких фармацевтических композиций. При необходимости можно добавлять альбумин в концентрации примерно 1,0% (мас./об.) или менее. ЭДТК действует в качестве поглотителя ионов металлов, которые, как известно, катализируют многие реакции окисления, представляя собой дополнительный стабилизирующий агент. При необходимости ЭДТК можно добавлять в концентрациях от примерно 0,1 до примерно 5,0 мМ.
При необходимости в стабилизированные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к СЭ40. предлагаемые в настоящем изобретении, можно добавлять сахара или сахарные спирты. Можно использовать любой сахар, такой как моно-, ди- или олисахариды, или водорастворимые гликаны, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы. Сахароза является наиболее предпочтительной добавкой, представляющей собой сахар. К сахарным спиртам относятся соединения, состоящие С4С8углеводорода с -ОН-группой, и к ним относятся, например, маннит, сорбит, инозит, галактит, дульцит, ксилит и арабитолм, при этом маннит является наиболее предпочтительным в качестве представляющей собой сахарный спирт добавки. Указанные выше сахара или сахарные спирты можно применять индивидуально или в комбинации. Не существует фиксированного предела применяемого количества, если сахар или сахарный спирт растворим в жидком препарате и не оказывает неблагоприятного воздействия на стабилизирующее действие, достигаемое с помощью способов, предлагаемых в изобретении. Предпочтительно сахар или сахарный спирт применяют в концентрации от примерно 1,0% до примерно 15,0% (мас./об.), более предпочтительно от примерно 2,0% до примерно 10,0% (мас./об.).
После получения жидкой фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, ее можно лиофилизировать для предупреждения расщепления. Методы лиофилизации жидких композиций известны обычным специалистам в данной области. Непосредственно перед применением композицию можно восстанавливать стерильным разбавителем (например, раствором Рингера, дистиллированной водой или стерильным физиологическим раствором), который может содержать дополнительные ингредиенты. После восстановления композицию предпочтительно вводят индивидууму с помощью методов, известных специалистам в данной области.
Жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к СЭ40, предлагаемые в изобретении, являются стабильными и поэтому обладают повышенной стабильностью при хранении по сравнению с содержащими антагонистическое антитело к СЭ40 композициями, которые приготовлены в забуференных растворах, содержащих хлорид натрия в качестве придающего изотоничность агента. Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что указанная повышенная стабильность при хранении будет присутствовать у жидкой препаративной формы, вне зависимости от того, хранится ли она в форме, непосредственно предназначенной для последующего применения, хранится ли она в замороженном состоянии и подлежит оттаиванию перед применением, или ее получают в высушенной форме, такой как лиофилизированная, высушенная на воздухе или высушенная распылением форма, предназначенная для последующего восстановления в жидкую форму или другую форму перед применением. Предпочтительно композиции, предлагаемые в изобретении, хранят непосредственно в виде жидкой формы, полностью реализуя преимущество, связанное с удобством наличия жидкой формы с повышенной стабильностью при хранении, простотой введения без восстановления и возможностью поставлять препаративную форму в предварительно заполненных готовых к употреблению шприцах или в виде содержащих несколько доз препаратов, если препаративная форма совместима с бактериостическими агентами.
При создании изобретения установлено, что композиции, предлагаемые в изобретении, в которых применяют аргинин-НС1 в качестве агента для придания изотоничности и смесь кислотной и солевой формы, такую как цитрат натрия/лимонная кислота, в качестве забуферивающего агента, представляют собой жидкую фармацевтическую композицию, содержащую антагонистическое антитело к СЭ40, которая обладает повышенной стабильностью при хранении относительно жидкой фармацевтической композиции, содержащей антагонистическое антитело к СЭ40, которую приготавливают с использованием хлорида натрия и соответствующего забуферивающего агента. Повышенная стабильность при хранении композиции достигается благодаря влиянию кислотной формы аргинина на стабильность обладающего терапевтической активностью антагонистического антитела к СЭ40, более конкретно влиянию на агрегацию, фрагментацию и деамидирование полипептида в процессе хранения жидких препаративных форм. Кроме того, включение аргинина-НС1 в качестве придающего изотоничность агента в жидкую композицию, содержащую антагонистическое антитело к СЭ40, которая забуферена указанным образом, позволяет получать практически изотонические жидкие фармацевтические композиции без добавления дополнительных придающих изотоничность агентов, таких как хлорид натрия.
Кислотная форма аргинина, включенная в стабильные жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, защищает обладающее терапевтической активностью антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент от физических и химических изменений, по
- 11 018301 вышая тем самым стабильность антитела в процессе хранения композиции. Под повышением стабильности подразумевают, что один или несколько таких показателей, как образование агрегатов, фрагментация и деамидирование антитела, в процессе хранения жидкой фармацевтической композиции снижаются относительно показателей, обнаруженных при хранении жидкой фармацевтической композиции, которая содержит антагонистическое антитело к СЭ40 и аналогичные компоненты препаративной формы, за исключением отсутствия указанного конкретного придающего изотоничность и стабилизирующего агента. Воздействие аргинина-НС1 на агрегацию антагонистического антитела к СЭ40 в процессе хранения жидкой композиции легко можно определять, оценивая изменение количества растворимого антитела к ί.Ό40 в растворе с течением времени. Уровень растворимого антитела к СЭ40 в растворе можно оценивать количественно с помощью ряда аналитических анализов, адаптированных к определению представляющего интерес антитела, такие анализы представляют собой, например, ЖХВР с обращенной фазой (ОФ)-ЖХВР гель-фильтрацию (ГФ)-ЖХВР и УФ-абсорбцию. Агрегацию можно оценивать также с помощью ДСН-ПААГ (см. также приведенные ниже примеры).
Касательно агрегации эффективное количество аргинина-НС1 для включения в предлагаемую в изобретении жидкую фармацевтическую композицию, содержащую антагонистическое антитело к ί.Ό40. для получения стабильных фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, следует рассматривать как количество, которое приводит к снижению образования агрегатов в течение времени и, как следствие, повышает сохранение в растворе растворимого антагонистического антитела к ί.Ό40 в его неагрегированной биологически активной молекулярной форме. Так, например, если антагонистическое антитело к СЭ40 представляет собой моноклональное антитело СЭ40 СН1К.-12.12, описанное ниже в примерах, эффективное количество аргинина-НС1, предназначенное для получения стабильной композиции, предлагаемой в изобретении, должно представлять собой количество, которое приводит к повышению сохранения антитела СН1К.-12.12 в его мономерной молекулярной форме.
Не вдаваясь в теорию, повышенная стабильность при хранении предлагаемой в изобретении стабильной жидкой композиции, содержащей антагонистическое антитело к СЭ40, может также быть связана с ингибирующим воздействием аргинина-НС1 на фрагментацию и/или деамидирования в антителе остатков глутамина и/или аспарагина в процессе хранения обладающего терапевтической активностью антитела. Воздействие аргинина-НС1 на фрагментацию антитела легко можно определять, оценивая изменения молекулярных видов в препаративной форме в течение времени, например, с помощью анализов на основе ДСН-ПААГ и/или ГФ-ЖХВР; см. ниже примеры. Воздействие аргинина-НС1 на деамидирование полипептида антитела к ί.Ό40 в процессе хранения в жидкой композиции легко можно определять, оценивая в течение времени количество антагонистического антитела к СЭ40, присутствующего в его деамидированной форме. Методы оценки молекулярных видов, т.е. нативного или деамидированного вида, полипептида, присутствующих в фазе раствора, хорошо известны в данной области. Такие методы включают хроматографическое разделение молекулярных видов и их идентификацию на основе стандартов молекулярной массы полипептидов, например, с помощью ОФ-ЖХВР или катионообменной хроматографии (С1ЕХ-ЖХВР), которые описаны ниже в примерах.
Предлагаемые в изобретении стабильные жидкие фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое антитело к СЭ40, могут содержать другие соединения, которые повышают эффективность или усиливают требуемое качество представляющего интерес антагонистического антитела к СЭ40, которое служит в качестве терапевтически активного компонента, если они не оказывают неблагоприятное воздействие на первичное стабилизирующее действие, достигаемое с помощью аргининаНС1. Композиция должна быть безопасной при выбранном пути введения, она должна быть стерильной и должна сохранять требуемую терапевтическую активность.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать, например, путем предварительного смешения стабилизирующего и забуферивающего агентов и любых других эксципиентов до включения представляющего интерес антагонистического антитела к ί.Ό40. Любые дополнительные эксципиенты, которые можно вводить для дополнительной стабилизации композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, не должны оказывать неблагоприятное воздействие на стабилизирующие эффекты первичного придающего изотоничность и стабилизирующего агента, т.е. аргининаНС1, также в сочетании с забуферивающим агентом, которые применяют для получения новых представленных в настоящем описании композиций. После добавления аргинина-НС1 для придания практической изотоничности и достижения повышенной стабильности представляющего интерес антагонистического антитела к СЭ40, значение рН жидкой композиции регулируют с помощью забуферивающего агента, предпочтительно в указанном выше диапазоне, более предпочтительно до достижения оптимального для представляющего интерес антагонистического антитела к ί.Ό40 значения рН, например, до достижения значения рН, составляющего примерно от рН 5,0 до рН 7,0, предпочтительно до достижения значения рН, составляющего примерно 5,5, в случае моноклонального антитела СН1К.-12.12. Хотя значение рН можно регулировать после добавления в композицию антагонистического антитела к СЭ40, предпочтительно его регулировать до введения указанного полипептида, поскольку это снижает риск денатурации полипептида. Затем для достижения соответствующего смешения компонентов применяют приемлемые механические устройства.
- 12 018301
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности антагонистического антитела к СЭ40 или его антигенсвязывающего фрагмента в жидкой фармацевтической композиции. Способ заключается в том, что объединяют антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент с забуферивающим агентом, который поддерживает значение рН фармацевтической композиции на уровне примерно от рН 5,0 до рН 7,0, и аргинин-НС1 в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической. В некоторых вариантах осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 мМ до примерно 50 мМ, а количество аргинина-НС1 обеспечивает концентрацию этого придающего изотоничность агента аргинина-НС1 в композиции от примерно 50 мМ до примерно 300 мМ. В других вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело к СЭ40 представляет собой антитело СН1К.-12.12 или СН1К.-5.9 или его антигенсвязывающий фрагмент; забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ; концентрация аргининаНС1 в композиции составляет примерно 150 мМ, и значение рН композиции составляет примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0 или примерно 6,5.
Стабилизированную жидкую фармацевтическую композицию, содержащую представляющее интерес антагонистическое антитело к СЭ40, такое как моноклональное антитело СН1К.-12.12 или СН1К.-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент, можно приготавливать в виде стандартной дозы, и она может иметь предназначенную для инъекции или инфузии форму, такую как раствор, суспензия или эмульсия. Как отмечалось ранее, ее можно хранить в замороженной или высушенной форме, такой как лиофилизированный порошок, который можно восстанавливать с получением жидкого раствора, суспензии или эмульсии перед введением с помощью любого из различных методов, включая оральные или парентеральные пути введения. Предпочтительно ее хранят в виде жидкой препаративной формы, реализуя преимущество, связанное с повышенной стабильностью при хранении, для достижения которой используют описанные ниже способы, предлагаемые в настоящем изобретении. Стабилизированную фармацевтическую композицию предпочтительно стерилизуют фильтрацией через мембрану и хранят в контейнерах для стандартной дозы или нескольких доз, таких как закрытые пузырьки или ампулы. Дополнительные методы приготовления фармацевтической композиции, которые, как правило, известны в данной области, можно применять для дополнительного повышения стабильности жидких фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании, если они не оказывают отрицательного влияния на благоприятные воздействия описанных выше предпочтительных стабилизирующих и забуферивающих агентов. Подробное обсуждение составов и выбора фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и т.д. можно почерпнуть в справочнике КепйпдЮп'х Рйагтасеийса1 Заепсек, 18-е изд., изд-во Маск РиЫщЫпд Сотрапу, Еа1оп, Репп§у1уаша, 1990, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к изделию, представляющему собой контейнер, содержащий предлагаемую стабильную жидкую фармацевтическую композицию антагонистического антитела к СЭ40, и необязательно инструкцию по ее применению. Приемлемыми контейнерами являются, например, пузырьки, бутылки и шприцы. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как пластик или стекло. В одном из вариантов осуществления изобретения контейнер представляет собой стеклянный одноразовый пузырек вместимостью 3-50 см3. В другом варианте в случае готовой к применению препаративной формы контейнер может представлять собой, например, стеклянный пузырек вместимостью 3-100 см3. Контейнер содержит препаративную форму и этикетку, нанесенную на него или прилагаемую к нему, контейнер может содержать указания по применению. Изделие может включать также другие материалы, необходимые с точки зрения производителя и потребителя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листовку-вкладыш в упаковке с инструкциями по применению.
Антитела к СБ40, применяемые в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат антитела к СЭ40, прежде всего антагонистические антитела к СЭ40 или их антигенсвязывающие фрагменты, мишенью которых является СЭ40-рецептор, модулирующий ЛИСС, взаимодействуют с путями передачи сигнала СЭ40, прежде всего путями передачи сигнала СЭ40, которые опосредуются взаимодействием СЭ40 с лигандом СЭ40 (СЭ40Е), или обоими. Под антигеном СЭ40, находящемся на клеточной поверхности антигеном СИ40, СЭ40-рецептором или СЭ40 подразумевают трансмембранный гликопротеин, который принадлежит к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (ΤΝΡ) (см., например, И8 5674492 и 4708871; 81атепкоую и др., ЕМВО 8, 1989, сс. 1403; С1агк, Тщзие ЛпНдепх 36, 1990, с. 33; Вагс1ау и др., Тке кепсосу1е ЛпЦдеп Рас18 Воок, 1997, 2-е изд.; изд-во Лсабеппс Рге88, 8ап О1едо). Идентифицированы два изоформы человеческого СЭ40, кодируемые вариантами транскрипта этого гена, полученными в результате альтернативного сплайсинга. Первая изоформа (которую называют также длинной изоформой или изоформой 1) экспрессируется в виде состоящего из 277 аминокислот полипептидапредшственника (8ЕО Ш N0:12 (впервые описана в ОепВапк под регистрационным номером САА43045 и идентифицирована как изоформа 1 в ОепВапк под регистрационным номером ΝΓ001241), кодируемая 8ЕО Ш N0:11 (см.е ОепВапк, регистрационные номера Х60592 и ΝΜ_001250)), которая несет сигналь
- 13 018301 ную последовательность, состоящую из первых 19 остатков. Вторая изоформа (которую называют также короткой изоформой или изоформой 2) экспрессируется в виде состоящего из 203 аминокислот полипептида-предшественника (8ЕЦ ГО N0:10 (ОеиВаик, регистрационный номер ΝΡ690593), кодируемого 8Е0 ГО N0:9 (ОепВапк, регистрационный номер. ΝΜ152854)), которая также имеет сигнальную последовательность, представленную первыми 19 остатками. Полипептиды-предшественники этих двух изоформ человеческого ΟΌ40 характеризуются наличием общих первых 165 остатков (т.е. остатков 1-165 8Е0 ГО N0:10 и 8ЕЦ ГО N0:12). Полипептид-предшественник короткой изоформы (представлен в 8ЕЦ ГО N0:10) кодируется вариантом транскрипта (8Е0 ГО N0:9), у которого отсутствует кодирующей сегмент, который приводит к сдвигу трансляции рамки считывания; образовавшаяся изоформа ΟΌ40 содержит более короткий С-конец (остатки 166-203 8Е0 ГО N0:10), отличающийся от С-конца в длинной изоформе ΟΌ40 (С-конец представлен остатками 166-277 8ЕЦ ГО N0:12). Для целей настоящего изобретения понятие антиген ΟΌ40, находящийся на клеточной поверхности антиген ΟΌ40, СО40-рецептор или ΟΌ40 относится как короткой, так и к длинной изоформам ΟΌ40.
Антиген ΟΌ40 презентуется на поверхности различных типов клеток, что будет описано ниже. Под понятием презентуется на поверхности и экспрессируется на поверхности подразумевают, что весь или часть антигена ΟΌ40 находится снаружи клетки. Презентуемый или экспрессируемый антиген ΟΌ40 может быть полностью или частично гликозилированным.
Понятие агонистическая активность относится к субстанции, которая функционирует в качестве агониста. Агонист связывается с рецептором на клетке и инициирует реакцию или активность, аналогичную или такую же как реакция или активность, инициируемая встречающимся в естественных условиях лигандом рецептора. Агонист ΟΌ40 индуцирует любой или все (но, не ограничиваясь только ими) следующие ответы: В-клеточную пролиферацию и дифференцировку, производство антител, межклеточную адгезию, создание В-клеток памяти, переключение изотипа, повышающую регуляцию экспрессии находящихся на клеточной поверхности молекул ГКГ класса II и СИ80/86 и секрецию провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-8, 1Ь-12 и ТНЕ. Под антагонистической активностью подразумевают, что субстанция функционирует в качестве антагониста. Антагонист ΟΌ40 препятствует или снижает индукцию любых ответов, которые индуцируются связыванием СО40-рецептора с лигандом-агонистом, прежде всего СО40Б. Антагонист может снижать индукцию любого или всех ответов, обусловленных связыванием агониста, на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35%, предпочтительно на 40, 45, 50, 55, 60%, более предпочтительно на 70, 80, 85% и наиболее предпочтительно на 90, 95, 99 или 100%. Методы оценки специфичности связывания лиганда СИ40 и антагонистической активности терапевтических агентов, направленных против СИ40, например, антитела к СЭ40. известны в данной области и включают (но, не ограничиваясь только ими) стандартные анализы конкурентного связывания, анализы, предназначенные для мониторинга секреции иммуноглобулинов В-клетками, анализы В-клеточной пролиферации, анализы Вклеточной пролиферации, подобные разработанным ВапсНегеаи, анализы активности Т-клеток-хелперов в отношении производства антител, анализы костимуляции В-клеточной пролиферации и анализы повышающей регуляции маркеров В-клеточной активации (см., например, анализы, описанные в \У0 00/75348 и И8 6087329, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Указанные анализы описаны в также в заявках, озаглавленных Айадошк! ΛπΙί-ί.Ό40 Мопос1опа1 ЛпНЬоб1ек апб Мебюбк Гог ТНей Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СИ40 и способы их применения), поданных 4 ноября 2003 г., 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., и переуступленных заявках на патент США 60/517337 (досье у патентного поверенного №. РР20107.001 (035784/258442)), 60/525579 (досье у патентного поверенного № РР20107.002 (035784/271525)) и 60/565710 (досье у патентного поверенного № РР20107.003 (035784/277214)) соответственно и в международной заявке на патент РСТ/И82004/ 037152 (досье у патентного поверенного № РР20107.004 (035784/282916)), которая озаглавлена Айадоπϊκΐ ΛπΙί-ί.Ό40 Мопос1опа1 Ай1Ьоб1ек апб МеИобк Еот ТНей Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СИ40 и способы их применения), поданной 4 ноября 2004 г., и опубликованной как \У0 2005/044854); содержание каждого из перечисленных документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Под существенной агонистической активностью подразумевают агонистическую активность, которая по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% выше, чем агонистическая активность, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем, при оценке В-клеточной реакции. Предпочтительно существенная агонистическая активность представляет собой агонистическую активность, которая по меньшей мере в 2 выше или по меньшей мере в 3 раза выше, чем агонистическая активность, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем, при оценке В-клеточной реакции. Так, например, если рассматриваемая В-клеточная реакция представляет собой В-клеточную пролиферацию, то существенная агонистическая активность должна индуцировать уровень В-клеточной пролиферации, который по меньшей мере в 2 раза выше или по меньшей мере в 3 раза выше, чем уровень В-клеточной пролиферации, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем. В одном из вариантов осуществления изобретения неспецифический иммуноглобулин, например, 1дО1, который не связывается с СИ40, служит в качестве отрицательного контроля. Субстанция не обладающая существенной агонистической активностью должна
- 14 018301 обладать агонистической активностью не более чем примерно на 25% более высокой по сравнению с агонистической активностью, индуцируемой нейтральной субстанцией или отрицательным контролем, предпочтительно не более чем примерно на 20% более высокой, на 15% более высокой, на 10% более высокой, на 5% более высокой, на 1% более высокой, на 0,5% более высокой или даже не более чем примерно на 0,1% более высокой, чем агонистическая активность, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем, при оценке В-клеточной реакции.
В некоторых вариантах осуществления изобретения стабильные жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержат антагонистическое антитело к ί.Ό40. Такие антитела не обладают существенной агонистической активностью, как она определена выше, при связывании с антигеном ί.Ό40 на человеческой клетке. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонистическое антитело к СЭ40 не обладают существенной агонистической активностью при оценке одного из клеточных ответов. В другом варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело к ί.Ό40 не обладают существенной агонистической активностью при оценке более одного из клеточных ответов (например, пролиферация и дифференцировка, или пролиферация, дифференцировка и, в случае Вклеток, производство антител). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело к ί.Ό40 представляет собой, например, полностью человеческое моноклональное антитело СН1К-12.12 или СН1К-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные ниже.
Любой из известных в данной области анализов можно применять для решения вопроса о том, действует ли антитело к СЭ40 как антагонист одного или нескольких В-клеточных ответов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к ί.Ό40 действует в качестве антагониста по меньшей мере одного В-клеточного ответа, выбранного из группы, включающей В-клеточную пролиферацию, Вклеточную дифференцировку, производство антител, межклеточную адгезию, создание В-клеток памяти, переключение изотипа, повышающую регуляцию экспрессии находящихся на клеточной поверхности молекул ГКГ класса II и СЭ80/86 и секрецию провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-8, 1Ь-12 и ΤΝΕ. Наибольший интерес представляют собой антагонистические антитела к СЭ40, которые не обладают существенной агонистической активностью в отношении В-клеточной пролиферации при связывании с человеческим антигеном ί.Ό40 на поверхности человеческой В-клетки.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к ί.Ό40 обладает антагонистической активностью в отношении В-клеточной пролиферации, которую оценивают с помощью анализа Вклеточной пролиферации, например, описанного в примере 4, ниже, и антагонистическое антитело к ί.Ό40 стимулирует В-клеточную пролиферацию на уровне, который не более чем примерно на 25% выше, чем В-клеточная пролиферация, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем предпочтительно не более чем примерно на 20% выше, на 15% выше, на 10% выше, на 5% выше, на 1% выше, на 0,5% выше или даже не более чем примерно на 0,1% выше, чем В-клеточная пролиферация, которая индуцируется нейтральной субстанцией или отрицательным контролем.
В других вариантах антитело к СЭ40 обладает антагонистической активностью в отношении Вклеточной пролиферации, которая индуцируется другим антителом к СЭ40, например, антителом 82С6 к СЭ40, которую оценивают с помощью анализа В-клеточной пролиферации, например, описанного в примере 4, ниже, и уровень В-клеточной пролиферации, стимулируемый другим антителом к ί.Ό40 в присутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 составляет не более чем примерно 25% от уровня Вклеточной пролиферации, которая индуцируется другим антителом к СЭ40 в отсутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 (т.е. по меньшей мере 75%-ное ингибирование), предпочтительно не более чем примерно 20, 15, 10, 5, 1, 0,5%, или даже не более чем примерно 0,1% от уровня В-клеточной пролиферации, которая индуцируется другим антителом к ί.Ό40 в отсутствии антагонистического антитела к ΟΌ40.
В следующих вариантах осуществления изобретения антитело к ί.Ό40 обладает антагонистической активностью в отношении В-клеточной пролиферации, которая индуцируется клеточной линией ЕЬ4В5, которую оценивают в с помощью анализа В-клеточной пролиферации, например, описанного в примере 4, ниже, и уровень В-клеточной пролиферации, стимулированный клеточной линией ЕЬ4В5 в присутствии в присутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 составляет не более чем примерно 25% от уровня В-клеточной пролиферации, которая индуцируется этой клеточной линией в отсутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 (т.е. по меньшей мере 75%-ное ингибирование), предпочтительно не более чем примерно 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, или даже не более чем примерно 0,1% от уровня В-клеточной пролиферации, которая индуцируется клетками линии ЕЬ4В5 в отсутствии антагонистического антитела к С1)40.
В следующих вариантах осуществления изобретения антитело к ί.Ό40 является антагонистом индуцированного человеческими Т-клетками производства антител человеческими В-клетками, которое оценивают с помощью анализа активности человеческих Т-клеток-хелперов в отношении производства антител В-клетками, который описан ниже в примере 4. В этом анализе уровень производства антитела изотипа 1дС, антитела изотипа 1дМ или производство антитела и изотипа 1дС, и изотипа 1дМ В-клетками, стимулированными Т-клетками, в присутствии антагонистического антитела к СЭ40 составляет не более чем примерно 50% от производства соответствующего антитела В-клетками, стимулированными Т
- 15 018301 клетками, в отсутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 (т.е. по меньшей мере 75%-ное ингибирование), предпочтительно не более чем примерно 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5%, или даже не более чем примерно 0,1% от уровня производства соответствующего антитела В-клетками, стимулированными Тклетками, в отсутствии антагонистического антитела к ί.Ό40.
Под лигандом ί.Ό40 подразумевают любой пептид, полипептид или белок, который связывается с ί.Ό40 и активирует один или несколько путей передачи сигнала СЭ40. Таким образом, лиганды СЭ40 включают (но, не ограничиваясь только ими) полноразмерные белки-лигады СЭ40 и их варианты и фрагменты, которые сохраняют существенную функциональную активность в отношении связывания и стимуляции передачи сигнала ί.Ό40 на экспрессирующих СЭ40 клетках. Модификации нативного лиганда СЭ40, например, человеческого лиганда СЭ40 (СИ40Ь; который обозначают также как СО 154), включают (но, не ограничиваясь только ими) замены, делеции, укорочения, удлинения, образование слитых белков, фрагментов, пептидомиметиков и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ или оценка биологической активности антагонистического антитела к ί.Ό40 включает применение растворимого СО40Б, например, растворимого рекомбинантного человеческого СИ40Ь (фирма А1ех1к Согрогайоп, Бингем, Ноттингемшир, Великобритания), для стимуляции передачи сигнала СЭ40 на экспрессирующих ί.Ό40 клетках.
Под опосредуемой СО40Б передачей сигнала СЭ40 подразумевают любой из видов биологической активности, которая является результатом взаимодействия находящего на клеточной поверхности рецептора СЭ40 с лигандом СЭ40. Примерами сигналов СЭ40 являются сигналы, которые приводят к пролиферации и выживанию экспрессирующих ί.Ό40 клеток и стимуляции одного или нескольких путей передачи сигнала ί.Ό40 в экспрессирующих СЭ40 клетках. Понятия передача сигнала или путь трансдукции сигнала ί.Ό40 относятся по меньшей мере к одной из биохимических реакций или группе биохимических реакций, которые являются результатом взаимодействия СО40-рецептора с лигандом СЭ40, например СО40Б, и которые генерируют сигнал, который, когда он передается через путь передачи сигнала, приводит к активации одной или нескольких молекул расположенных ниже по ходу каскада сигнала. Пути трансдукции сигнала включают ряд молекул трансдукции сигнала, которые обеспечивают передачу сигнала от находящегося на клеточной поверхности СЭ40-рецептора через плазматическую мембрану клетки и через одну или несколько молекул в серии молекул трансдукции сигнала, через цитоплазму и в некоторых случаях в ядро клетки. Пути трансдукции сигнала СЭ40 включают, например, путь передачи сигнала АКТ, который приводит к активации АКТ и в конце концов к активации ΝΡ-кВ через путь передачи сигнала ΝΡ-кВ; и пути передачи сигнала активируемой митогеном протеинкиназы (МАРК), включая путь передачи сигнала МЕК/ЕКК и путь передачи сигнала МЕК/р38, которые приводят к активации ЕКК и р38 соответственно. Определенный баланс между активацией и блокадой этих путей передачи создает предпочтение либо для выживания, либо для апоптоза клеток.
В некоторых вариантах осуществления изобретения стабильные фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, содержат антагонистические антитела к ί.Ό40, которые блокируют опосредуемую СО40Б передачу сигнала СЭ40. Более подробное описание роли антагонистических антител к ί.Ό40 в блокаде опосредуемой СО40Б передаче сигнала СЭ40 см., например, в предварительных заявках на патент, озаглавленных Ап1адошк1 ΛπΙί-ί.Ό40 Мопос1опа1 АпйЬоб1ек апб Мебюбк £ог ТЬеп Ике (Антагонистические моноклональные антитела к ί.Ό40 и способы их применения), поданных 4 ноября 2003 г., 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., и переуступленных заявках на патент США 60/517337 (досье у патентного поверенного №. РР20107.001 (035784/258442)), 60/525579 (досье у патентного поверенного № РР20107.002 (035784/271525)) и 60/565710 (досье у патентного поверенного № РР20107.003 (035784/277214)) соответственно и в международной заявке на патент РСТ/И82004/037152 (досье у патентного поверенного № РР20107.004 (035784/282916)), которая озаглавлена Ап1адошк1 ΛπΙί-ί.Ό40 Мопос1опа1 АибЬоб1ек апб МеЛобк £ог ТЬеп Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданной 4 ноября 2004 г., и опубликованной как \УО 2005/044854); содержание каждого из перечисленных документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Их роль описана также в предварительной заявке, озаглавленной Мебюбк £ог О|адиок1к апб Тгеа1шеп1 о£ РгоНГегаЦуе И1когбегк Меб1а1еб Ьу СЭ40 81дпа1тд (Методы диагностики пролиферативных нарушений, опосредуемых передачей сигнала СИ40), поданной 9 декабря 2005 г., и в переуступленной заявке на патент США № 60/749285 ((досье у патентного поверенного № РР028035.0002 (035784/304312)), и в соответствующей в международной заявке на патент РСТ/И82006/019414 (досье у патентного поверенного № РР028035.0003 (035784/311611)), которая подана 18 мая 2006 г. и опубликована как \УО 2006/125143; и в предварительной заявке на патент, озаглавленной как Мебюбк £ог О|адиоκίκ апб Тгеа1шеп1 о£ И1кеакек Наутд ап АиЮиппшпе апб/ог 1пПаттаЮгу СотропепГ (Методы диагностики и лечения заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент), которая подана 9 декабря 2005 г., и в переуступленной заявке на патент США 60/749336 (досье у патентного поверенного № РР028062.0002 (035784/304311)), и в соответствующей в международной заявке на патент РСТ/И82006/019325 (досье у патентного поверенного № РР028062.0003 (035784/311608)), которая подана 18 мая, 2006 г. и опубликована как \УО 2006/125117; содержание каждого из перечисленных докумен
- 16 018301 тов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Стабильные жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат антагонистические антитела к ί.Ό40, в частности, антагонистические антитела к СЭ40 и/или их антигенсвязывающие фрагменты. При описании указанных антител применяют следующие понятия и определения.
Антитело и иммуноглобулины (1д) означают гликопротеины, обладающие одинаковыми структурными характеристиками. Понятия являются синонимами. В некоторых случаях специфичность в отношении антигена иммуноглобулина может быть известна.
Понятие антитело применяют в его наиболее широком смысле, и оно относится к полностью собранным антителам, фрагментам антител, которые могут связывать антиген (например, ЕаЬ, Е(аЬ')2, Εν, одноцепочечные антитела, двойные антитела, химеры антител, гибридные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела и т.п.) и рекомбинантым пептидам, содержащим вышеуказанные субстанции.
Понятия моноклональное антитело и МАт в контексте настоящего описания относятся к антителу, полученному из практически гомогенной популяции антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах.
Нативные антитела и нативные иммуноглобулины, как правило, представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (Ь) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь сцеплена с тяжелой цепью с помощью одной ковалентной дисульфидной связи, при этом количество дисульфидных мостиков варьируется в тяжелых цепях различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также имеющие регулярное пространственное расположение дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельную область (Ун), за которой следует несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельную область (Уь) и константную область на ее другом конце; константная область легкой цепи соответствует первой константной области тяжелой цепи, а вариабельная область легкой цепи соответствует вариабельной области тяжелой цепи. Вероятно, конкретные аминокислотные остатки формируют поверхность раздела между вариабельными областями легкой и тяжелой цепи.
Понятие вариабельная относится к тому факту, что среди антител последовательности определенных участков вариабельных областей значительно различаются между собой. Вариабельные области обусловливают специфичность в отношении связывания с антигеном. Однако вариабельность не равномерно распределена в вариабельных областях антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, которые называют определяющими комплементарность участками (СОЕ) или гипервариабельными участками, в вариабельных областях, как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Наиболее консервативные участки вариабельных областей расположены в каркасных (ЕЕ) участках. Каждая из вариабельных областей нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре ЕЕ-участка, главным образом, адоптированных к β-складчатой конфигурации, которые связаны тремя СОЕ, которые образуют петли, связывающие, а в некоторых случаях образующие часть β-складчатой структуры. СОЕ в каждой цепи поддерживаются в тесной близости ЕЕ-участками и вместе с СОЕ другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего центра антитела (см. КаЬа! и др., ΝΙΗ РиЬ1. Ыо. 91-3242, том I, 1991, сс. 647-669). Константные области не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как связывание Ес-рецептора (ЕсЕ), участие антитела в антитело-обусловленной клеточной токсичности, инициации комплементзависимой цитотоксичности и дегрануляции тучных клеток.
Понятие гипервариабельный участок в контексте настоящего описания относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из определяющего комплементарность участка или СОЕ (т.е. остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Η1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; КаЬа! и др., 8ес.|иепсе5 о£ РгсЛеиъ о£ 1ттипо1од1са1 1п1еге81, 5-е изд., изд-во РиЬЕс НеаНй §егуюе, Ыайопа1 1п8Ши1е о£ НеаНЬ, ВеШекба, ΜΌ, 1991) и/или остатки из гипервариабельной петли (т.е. остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельной области легкой цепи (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; СЬо1Ыа и Ьекк, 1. Мо1. Вю1, 196, 1987, ее. 901-917). В контексте настоящего описания подразумевается, что остатки каркасного участка или ЕЕ представляют собой остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельного участка.
Фрагменты антитела содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примерами фрагментов антитела являются ЕаЬ-, ЕаЬ-, Е(аЬ')2- и Εν-фрагменты; двойные антитела; линейные антитела (2ара!а и др., Рто1ет Епд. 10, 1995, сс. 1057-1062); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют ЕаЬ-фрагментами, каждый из которых несет один анти
- 17 018301 генсвязывающий центр, а название оставшегося Ес-фрагмента отражает его способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином получают Е(аЬ)2-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающихся центра и обладает способностью к перекрестному связыванию с антигеном.
ру-фрагмент представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный распознающий антиген и связывающийся с антигеном сайт. Эта область состоит из димера одной вариабельной области тяжелой и одой вариабельной области легкой цепи, находящихся в тесной нековалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три СЭВ каждой вариабельной области взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего центра на поверхности УН-Уъ-димера. В целом, шесть СЭВ придают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако даже одна вариабельная область (или половина Εν, содержащая только три СЭВ, специфических для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания.
ЕаЬ-фрагмент также содержит константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи. ЕаЬ-фрагмент отличается от ЕаЬ'-фрагментов тем, что содержит несколько дополнительных остатков на С-конце СН1-области тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. В контексте настоящего описания ЕаЬ'-8Н обозначает ЕаЬ'-фрагмент, в котором остаток(и) цистеина константных областей несет(ут) свободную тиольную группу. ЕаЬ'фрагменты получают восстановлением дисульфидного мостика тяжелой цепи Е(аЬ')2-фрагмента. Известны другие варианты химических сочетаний фрагментов антител.
Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) различных видов позвоночных можно отнести к одному из двух четко различимых типов, которые обозначают как каппа (к) и лямбда λ, на основе аминокислотных последовательностей их константных областей.
В зависимости от аминокислотной последовательности константных областей их тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Известно пять основных классов человеческих иммуноглобулинов: 1дА, 1дЭ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и 1дА2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции. Например, человеческие изотипы 1дС1 и 1дС3 обладают АЭСС-активностью (антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью).
Понятие метка в контексте настоящего описания относится к выявляемому соединению или композиции, которые конъюгируют прямо или косвенно с антителом с получением меченого антитела. Метка может представлять собой выявляемую саму по себе метку (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение соединения- или композиции-субстрата, которые становятся выявляемыми.
Клетка-хозяин в контексте настоящего описания относится к микроорганизму или эукариотической клетке или линии клеток, культивируемой в виде состоящей из однородных клеток материи, которую можно применять или которую применяли в качестве реципиента для рекомбинантного вектора или других переносимых полинуклеотидов, и она включает потомство исходной клетки, которое было трансфектировано. Следует понимать, что потомство индивидуальной клетки не обязательно может быть полностью идентичным по морфологии или по комплементу геномной или общей ДНК исходной родительской клетке из-за встречающейся в естественных условиях, случайной или преднамеренной мутации.
Человеческие эффекторные клетки представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько ЕсВ и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере Ес уВШ и обладают такой эффекторной функцией, как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (АЭСС). Примерами человеческих лейкоцитов, которые опосредуют АЭСС, являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные клетки-киллеры (ΝΚ), моноциты, макрофаги, эозинофилы и нейтрофилы, при этом предпочтительными являются РВМС и ΝΚклетки. Антитела, которые обладают АЭСС-активностью, как правило, относятся к изотипу 1дС1 или 1дС3. Следует отметить, что помимо выделения антител изотипа 1дС1 и 1дС3, такие опосредующие АЭСС антитела можно получать путем создания конструкции, содержащей вариабельную область из не обладающего АЭСС антитела или фрагмента вариабельной области и константную область изотипа 1дС1 или 1дС3.
Понятия Ес-рецептор или ЕсВ применяют для описания рецептора, который связывается с Есобластью антитела. Предпочтительным ЕсВ является ЕсВ с нативной человеческой последовательностью. Кроме того, предпочтительным является ЕсВ, который связывается с антителом типа 1дС (гаммарецептор), и включает рецепторы подклассов Ес уВ1, Ес уВП и Ес уВШ, в том числе аллельные варианты и полученные в результате альтернативного сплайсинга формы этих рецепторов. Ес уВ11-рецепторы включают Ес уВ11А (активирующий рецептор) и Ес уВ11В (ингибирующий рецептор), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются прежде всего своими цитоплазмати
- 18 018301 ческими доменами. Активирующий рецептор Ес уКИА содержит иммунорецепторный несущий тирозин активирующий мотив (ΙΤΑΜ) в цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Ес уКЛВ содержит иммунорецепторный несущий тирозин ингибирующий мотив (ΙΤΙΜ) в цитоплазматическом домене (см., Эаегоп, Алии. Ису. 1ттипо1. 15, 1997, сс. 203-234). Данные о ЕсВ обобщены у Рауе1сН и Кте1, Аппи. Ису. 1ттипо1. 9, 1991, сс. 457-492; Саре1 и др., [ттипотебюбк 4, 1994. сс. 25-34; и бе Наак и др., 1. ЬаЬ. С11п. Меб. 126, 1995, сс. 330-341. Другие ЕсВ, включая те, которые могут быть идентифицированы в будущем, подпадают под понятие ЕсВ, приведенное в настоящем описании. Под понятие подпадает также неонатальный рецептор, ЕсВп, который ответствен за перенос материнских 1§С плоду (Снуег и др., 1. 1ттипо1. 117, 1976, с. 587, и К1т и др., 1. 1ттипо1. 24, 1994, с. 249).
Известны различные пути создания человеческих антител. Например, секретирующие клетки можно иммортализировать путем заражения вирусом Эпштейна-Барра (ЕВУ). Однако зараженные ЕВУ клетки трудно клонировать, и при их применении обычно получают относительно невысокий выход иммуноглобулина (батек и Ве11, 1. 1ттипо1. Мебюбк 100, 1987, сс. 5-40). В будущем для иммортализации человеческих В-клеток можно будет использовать интродукцию определенной комбинации трансформирующих генов. Такая возможность убедительно продемонстрирована современными данными о том, что экспрессия каталитической субъединицы теломеразы в сочетании с большим онкопротеином 8У40 и онкогенным аллелем Н-гак приводила к онкогенной конверсии здоровых человеческих эпителиальных клеток и фибробластов (На1п и др., Ыа1иге 400, 1999, сс. 464-468). В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации могут продуцировать спектр человеческих антител в отсутствии эндогенного производства иммуноглобулинов (бакоЬоубк и др., №1(нге 362, 1993, сс. 255-258; ЬопЬегд и Ннкхаг, 1пк Ксу. 1ттипо1. 13, 1995, сс. 65-93; ЕЫиубб и др., ΝιΙ. Вю1ссЬпо1. 14, 1996, сс. 845-851; Мепбех и др., ΝιΙ. СепеЕ 15, 1997, сс. 146-156; Сгееп, 1. 1ттипо1. Ме111обк 231, 1999, сс. 11-23; Тонйхика и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А 97, 2000, сс. 722-727; обзор, приведенный у ЫШе и др., 1ттипо1. Тобау 21, 2000, сс. 364-370). Например, было установлено, что гомозиготная делеция гена в области стыка тяжелой цепи (1Н) в химерных мышах и несущих мутант в зародышевой линии мышах приводит к полному ингибированию производства эндогенных антител (бакоЬоуйк и др., Ргос. Νι11. Асаб. 8ск И8А 90, 1993, сс. 2551-2555). Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (бакоЬоубк и др., Ыа1иге 362, 1993, сс. 255258). Мепбех с соавторами (ЫаШге Сепебск 15, 1997, сс. 146-156) создали линию трансгенных мышей, у которой после контрольного заражения антигеном образовывались обладающие высокой аффинностью полностью человеческие антитела. Для этой цели можно использовать введение (интеграцию) локусов размером порядка миллиона оснований человеческой зародышевой линии тяжелой цепи и легкой цепи в мышей с делецией в эндогенном / ι-сегменте, которые описаны выше. Такие мыши (полученные согласно технологии ХепоМоике ® II (фирма АЬдеш.х; Фремонт, шт. Калифорния)) несут локус размером 1,020 т.п.н. человеческой тяжелой цепи, содержащий примерно 66 УН-генов, полные ЭН- и 1Н-области и три различные константные области, а также несут локус размером 800 т.п.н. человеческой к-цепи, содержащий 32 Ук-гена, Ικ-сегменты и Ск-гены. Антитела, которые образуются в таких мышах, очень сходны с человеческими во всех аспектах, включая перегруппировку, сборку и спектр генов. Уровень экспрессии человеческих антител превышает уровень экспрессии эндогенных антител из-за делеции в эндогенном сегменте, которая препятствует перегруппировке генов в мышином локусе. Таких мышей можно иммунизировать представляющим наибольший интерес антигеном.
Сыворотку из таких иммунизированных животных можно подвергать скринингу в отношении реактивности антитела на исходный антиген. Лимфоциты можно выделять из лимфатических узлов или спленоцитов и можно дополнительно разделять В-клетки на СЭ138-негативные и СЭ19-позитивные клетки. Согласно одному из объектов такие В-клеточные культуры (ВСС) можно сливать с клетками миеломы с получением подробно описанных выше гибридом.
Согласно другому объекту указанные В-клеточные культуры можно дополнительно подвергать скринингу предпочтительно в отношении реактивности на начальный антиген. Для скрининга используют иммуноферментный твердофазный анализ (ЕБ18А) с белком мишенью/антигеном, конкурентный анализ с известными антителами, которые связываются с представляющим интерес антигеном, и анализ связывания 1п убго с кратковременно трансфектированными СНО или другими клетками, экспрессирующими антиген-мишень.
Моноклональные антитела к СЭ40 известны в данной области (см., например, разделы, относящиеся к В-клеточному антигену в: Беикосу1е Туртд III апб IV, под ред. МсМюНаеЕ изд-во ОхГогб итуегкйу Ргекк, Хем Уогк, 1987; 1989, И8 5674492; 5874082; 5677165; 6056959; \\'О 00/63395; опубликованные международные заявки на патент \УО 02/28905 и \УО 02/28904; Согбоп и др., 1. Iттиηо1. 140, 1988, с. 1425; Уа11е и др., Еиг. 1. Iттиηо1. 19, 1989, с. 1463; С1агк и др., РЫА8 83, 1986, с. 4494; Раи11е и др., 1. Иптипо1. 142, 1989, с. 590; Согбоп и др., Еиг. 1. Iттиηо1. 17, 1987, с. 1535; 1аЬага и др., 1. Ехр. Меб. 172, 1990, с. 1861; ΖΙΐΗΠβ и др., 1. Iттиηо1. 146, 1991, с. 1836; Саксап и др., 1. Iттиηо1. 147, 1991, с. 8; Вапсйегеаи и др., С1т. Iттиηо1. 8рес1гит 3, 1991, с. 8; и Вапсйегеаи и др., 8с1епсе 251, 1991, с. 70; все
- 19 018301 публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Другие моноклональные антитела к ί.Ό40 представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) гуманизированные антитела к СЭ40, такие как 86Ν-40 (Та1 и др., Сапсег Кек. 64, 2004, с.с. 2846-52; И8 6838261), которое представляет собой гуманизированную форму мышиного антитела к ί.Ό40 86Ν-14 (Ргапсксо и др., Сапсег Кек. 60, 2000, сс. 32253231), и агонистические и антагонистические антитела, описанные в опубликованной заявке на патент США №2004/0120948; которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Представляющими наибольший интерес в контексте настоящего изобретения являются антагонистические антитела к СЭ40 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые служат для блокады опосредуемой СО40Б передачи сигнала СЭ40 и которые могут также модулировать АЭСС, что, например, характерно для антитела СН1К-12.12, описанного ниже.
Антагонистические антитела к ί.Ό40, предназначенные для применения в стабильных жидких фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, представляют собой моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают способностью специфически связываться с человеческим антигеном ί.Ό40, который экспрессируется на поверхности человеческой клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистические антитела к ί.Ό40, входящие в стабильные жидкие фармацевтические композиции, обладают сильной аффинностью к связыванию с одним сайтом находящегося на поверхности клеток антигена ί.Ό40. Для таких моноклональных антител характерно значение константы равновесия диссоциации (Кс) для СЭ40, составляющее по меньшей мере 10-5 М, по меньшей мере 3х10-5 М, предпочтительно по меньшей мере от 10-6М до 10-7 М, более предпочтительно по меньшей мере от 10-8 М до примерно 10-12 М, которое оценивают с помощью стандартного анализа, такого как В1асоге™. В1асоге-анализ известен в данной области и его подробное описание приведено в В1Аарр1юайопк БапбЬоок. Методы, описанные в \У0 01/27160, можно применять для модуляции аффинности к связыванию.
Наибольший интерес представляют собой антагонистические антитела к ί.Ό40, которые не обладают существенной агонистической активностью, как описано выше, но обладают антагонистической активностью при связывании с антигеном ί.Ό40 на человеческих клетках, прежде всего при связывании с антигеном ί.Ό40 на неопластических человеческих В-клетках. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонистическое антитело к ί.Ό40 не обладает существенной агонистической активностью в отношении одного из В-клеточных ответов. В другом варианте осуществления изобретения антагонистическое антитело к ί.Ό40 не обладает существенной агонистической активностью в отношении более одного из В-клеточных ответов (таких, например, как пролиферация и дифференцировка или пролиферация, дифференцировка и производство антител). Приемлемые моноклональные антитела к ί.Ό40 имеют человеческие константные области; предпочтительно они могут также иметь частично или полностью гуманизированные каркасные участки; и наиболее предпочтительно представляют собой полностью человеческие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Примерами указанных моноклональных антител являются антитела, обозначенные в контексте настоящего описания как СН1К-5.9 и СН1К-12.12.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело, присутствующее в стабильных жидких композициях, предлагаемых в изобретении, представляет собой моноклональное антитело СН1К-5.9 или СН1К-12.12. Антитела СН1К-5.9 и СН1К-12.12 представляют собой полностью человеческие моноклональные антитела к ί.Ό40 изотипа ΙβΟ1, которые продуцируются линиями клеток гибридом 131.2Р8.5.9 (обозначена в контексте настоящего описания как линия клеток 5.9) и 153.8Ε2.Ό10.Ό6.12.12 (обозначена в контексте настоящего описания как линия клеток 12.12). Эти линии клеток создавали с помощью спленоцитов из иммунизированных ксенотипических мышей, несущих локус тяжелой цепи человеческого 1дС1 и локус человеческой κ-цепи (получены на основе ХепоМоике-технологии; фирма АЬдешх; Фремонт, шт. Калифорния). Спленоциты сливали с клетками мышиной миеломы 8Р2/0 (фирма 81егга ВюЗоигсе). Полученные гибридомы субклонировали несколько раз для создания стабильных моноклональных клеточных линий 5.9 и 12.12. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать аналогично, используя мышей, трансгенных по локусам человеческого иммуноглобулина, или с помощью других методов, известных в данной области и/или представленных в настоящем описании.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела СН1К-12.12 и аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела СН1К-5.9 представлены в настоящем описании. Более конкретно, аминокислотные последовательности лидерной, вариабельной и константной областей легкой цепи и тяжелой цепи МАт СН1К-12.12 приведены в 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (полная последовательность легкой цепи МАт СН1К-12.12), 8ЕЦ ΙΌ N0:4 (полная последовательность тяжелой цепи МАт СН1К-12.12) и 8ЕЦ ΙΌ N0:5 (полная последовательность варианта тяжелой цепи МАт СН1К12.12, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:4, где вариант содержит замену серина на остаток аланина в положении 153 8Ε0 ΙΌ N0:4). Нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь МАт СШК-12.12, представлены в 8ЕЦ ΙΌ N0:1 (кодирующая последовательность легкой цепи МАт СШК-12.12) и 8Ε0 ΙΌ N0:3 (кодирующая последовательность тяжелой цепи МАт СШК-12.12). Аминокислотные последовательности лидерной, вариабельной и константной областей легкой цепи и тяжелой
- 20 018301 цепи МАт СН1В-5.9 представлены в 8Е0 ГО N0:6 (полная последовательность легкой цепи МАт СН1В5.9), 8Е0 ГО N0:7 (полная последовательность тяжелой цепи МАт СН1В-5.9) и 8Е0 ГО N0:8 (полная последовательность варианта тяжелой цепи МАт СН1В-5.9, представленной в 8Е0 ГО N0:7, где вариант содержит замену серина на остаток аланина в положении 158 8Е0 ГО N0:7). Кроме того, гибридомы, экспрессирующие антитела СН1В-5.9 (линия мышиной гибридомы 131.2Р8.5.9 (СМСС№ 12047) и СН1В12.12 (линия мышиной гибридомы 153.8Е2ГО10ГО6.12.12 (СМСС№12056), депонированы в АТСС (Американская коллекция типовых культур; 10801 Ишуегкйу Β1ν6., Мапаккак, Уйщша 20110-2209 (США)) 17 сентября 2003 г., депозиты для целей патентования обозначены как РТА-5542 и РТА-5543 соответственно.
Помимо антагонистической активности антитела к СБ40, входящие в стабильные жидкие фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут обладать другим механизмом действия в отношении опухолевых клеток. Например, нативные антитела СН1В-5.9 и СН1В-12.12 обладают АЭСС-активностью. В другом варианте вариабельные области антител СН1В-5.9 и СН1В-12.12 можно экспрессировать в антителе другого изотипа, который обладает АЭСС-активностью. Можно также конъюгировать нативные формы, рекомбинантные формы или антигенсвязывающие фрагменты СН1В-5.9 или СН1В-12.12 с цитотоксином, терапевтическим агентом или радиоактивным металлом или радиоизотопом, которые будут указаны ниже.
Моноклональные антитела СН1В-5.9 и СН1В-12.12 связывают растворимый СГО40 в анализах типа ЕБ18А, предупреждают связывание лиганда СГО40 с расположенным на клеточной поверхности СГО40 и замещают ранее связанный лиганд СБ40, что установлено с помощью анализов, основанных на использовании метода проточной цитометрии. Антитела СН1В-5.9 и СН1В-12.12 конкурируют друг с другом за связывание с СБ40, но не конкурируют с 15В8, моноклональным антителом к СБ40, которое описано в предварительной заявке на патент США, сер. №. 60/237556, озаглавленной Нитап АпН-СБ40 АпйЬоб1ек (Человеческие антитела к СБ40), поданной 2 октября 2000 г. и международной заявкой РСТ РСТ/И801/30857, также озаглавленной Нитап АпН-СБ40 АпНЬоб1ек (Человеческие антитела к СБ40), поданной 2 октября 2001 (досье у патентного поверенного №. РР 16092.003), обе полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. При оценке ш νίΙΐΌ воздействия на пролиферацию В-клеток здоровых людей СН1В-5.9 и СН1В-12.12 действуют в качестве антагонистических антител к СБ40. Кроме того, СН1В-5.9 и СН1В-12.12 не индуцируют сильную пролиферацию человеческих лимфоцитов здоровых индивидуумов. Эти антитела обладают способностью уничтожать экспрессирующие СБ40 клеткимишени посредством антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (АЭСС). По данным В1асоге™-анализа аффинность к связыванию СН1В-5.9 с человеческим СБ40 характеризуется значением 1,2х 10-8 М, аффинность к связыванию СН1В-12.12 характеризуется значением 5х 10-10 М.
Другие антагонистические антитела к СБ40, которые имеют характеристики связывания, аналогичные характеристикам описанных выше моноклональных антител СН1В-5.9 и СН1В-12.12, включают (но, не ограничиваясь только ими) следующие антитела: (1) моноклональные антитела, которые продуцируются линиями клеток гибридом, обозначенных как 131.2Р8.5.9 (в контексте настоящего описания обозначена как линия клеток 5.9) и 153.8Е2ГО10ГО6.12.12 (в контексте настоящего описания обозначена как линия клеток 12.12), которые депонированы в АТСС для целей патентования под номерами № РТА-5542 и № РТА-5543 соответственно; (2) моноклональное антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, выбранную и группы, включающей последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:2, последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:4, последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:5, последовательности, которые представлены и в 8Е0 ГО N0:2 и в 8Е0 ГО N0:4, и последовательности, которые представлены и в 8Е0 ГО N0:2 и в 8Е0 ГО N0:5; (3) моноклональное антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:6, последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:7, последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:8, последовательности, которые представлены и в 8Е0 ГО N0:6 и в 8Е0 ГО N0:7, и последовательности, которые представлены и в 8Е0 ГО N0:6 и в 8Е0 ГО N0:8; (4) моноклональное антитело, аминокислотная последовательность которого кодируется нуклеотидной последовательностью, которая выбрана из группы, включающей нуклеотидную последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:1, нуклеотидную последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0:3, и обеими последовательностями, которые представлены и в 8Е0 ГО N0:1 и 8Е0 ГО N0:3; (5) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, который обладает способностью связываться с моноклональным антителом, которое продуцируется линией клеток гибридомы 5.9 или линией клеток гидридомы 12.12; (6) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 82-87 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:10 или 8Е0 ГО N0:12; (7) моноклональное антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом СН1В-5.9 или СН1В-12.12 при анализе конкурентного связывания; и (8) моноклональное антитело, которое представляет собой антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела СН1В-12.12 или СН1В-5.9 или указанных выше в подпунктах (1)-(7) моноклональных антител, где фрагмент сохраняет способность специфически связываться с человеческим антигеном СГО40.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что антитела и антигенсвязывающие фраг
- 21 018301 менты указанных антител, приведенные в настоящем описании, включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые получают рекоминантно с помощью методов, хорошо известных в данной области и представленных ниже в настоящем описании, и включают, например, моноклональные антитела СН1К-5.9 и СН1К-12.12, полученные рекомбинантно.
Дополнительные антагонистические антитела к СЭ40 включают моноклональные антитела, обозначенные как 5Ό12, 3А8 и 3С6, которые секретируются гибридомами, депонированными в АТСС под регистрационными номерами НВ 11339, НВ 12024 и НВ 11340 соответственно (см., например, И8 6315998, который полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки).
Другие антагонистические антитела к СЭ40 известны в данной области. К ним относятся человеческое антитело к ί.Ό40, которое продуцируется гибридомой, обозначенной как Ρ4-465, что описано в опубликованных заявках на патент США 20020142358 и 20030059427; которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Ρ4-465 получали из организма мыши линии НАС (Китотта и др., №11игс Вю1сс11. 10, 2000, с. 1086), и она экспрессирует человеческую легкую лямбда-цепь.
Производство антител для фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении
Антитела, предназначенные для применения в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, например, представленные в описании антагонистические антитела к ί.Ό40, можно получать с помощью метода производства антител, известного специалистам в данной области. Так, поликлональную сыворотку можно получать с помощью общепринятых методов. В целом, раствор, содержащий представляющий интерес антиген, т.е. антиген СЭ40, сначала используют для иммунизации приемлемого животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики или козы являются предпочтительными для получения поликлональной сыворотки из-за объема получаемой сыворотки и доступности меченых антикроличьих и антикозьих антител.
Поликлональную сыворотку можно получать в трансгенном животном, предпочтительно мыши, которая несет локусы человеческого иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения 8Г9-клетки, экспрессирующие представляющий интерес белок, например СЭ40, применяют в качестве иммуногена. Иммунизацию можно осуществлять также путем смешения или эмульгирования содержащего антиген раствора в физиологическом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и инъецировать смесь или эмульсию парентрально (как правило, подкожно или внутримышечно). Обычно достаточно использовать дозу 50-200 мкг/инъекцию. Как правило, через 2-6 недель осуществляют вторичную иммунизацию с использованием одной или нескольких инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно в неполном адъюванте Фрейнда. Альтернативно этому можно получать антитела путем иммунизации ίη νίΐτο с использованием методов, известных в данной области, которую для целей настоящего изобретения можно считать эквивалентной иммунизации ίη νίνο. Поликлональную антисыворотку получают путем взятия крови иммунизированного животного в стеклянный или пластиковый контейнер, инкубирования крови при 25°С в течение 1 ч с последующим инкубированием при 4°С в течение 2-18 ч. Сыворотку выделяют центрифугированием (например, при 1000/д в течение 10 мин). Из кроликов можно получать образец крови объемом примерно 20-50 мл.
Получение клеток 8Г 9 (8робор1ега Ггидрегбб) описано в И8 6004552, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В случае СЭ40, метод в целом состоит в следующем: последовательности, кодирующие человеческий СЭ40 получали рекомбинантно в бакуловирусе с помощью вектора для переноса. Плазмидами совместно с ДНК дикого типа бакуловируса трансфектировали клетки 8Г 9. Инфицированные рекомбинантным бакуловирусом клетки 8Г 9 идентифицировали и клонально очищали.
Предпочтительно антитело является моноклональным по своей природе. Под моноклональным антителом подразумевают антитело, полученное из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Понятие не ограничено видами или источниками антитела. Под понятие подпадают полные иммуноглобулины, а также их фрагменты, такие как РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν и другие, сохраняющие антигенсвязывающую функцию антитела. Моноклональные антитела являются высоко специфическими, направлены против одного антигенного сайта; например, в случае антител к СЭ40, к находящемуся на клеточной поверхности антигену СЭ40. Кроме того, в отличие от общепринятых (поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Прилагательное моноклональное свидетельствует о том, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, а не сконструировано, как это принято при получении антитела, с помощью любого конкретного метода. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью метода гибридом, который описан у КоЫет и др., №11иге 256, 1975, с. 495, или можно получать методами рекомбинантной ДНК (см., например, ϋδ 4816567). Моноклональные антитела можно выделять также из фаговых библиотек антител с помощью методов, описанных, например, у С1аск§оп и др., ИаШте 352, 1991, сс. 624-628; Маткк и др., 1. Мо1. Βίο1. 222, 1991, сс. 581-597; и И8 5514548.
Под эпитопом подразумевают часть антигенной молекулы, к которой вырабатывается антитело и
- 22 018301 с которой антитело связывается. Эпитопы могут содержать линейные аминокислотные остатки (т.е. остатки в эпитопе расположены последовательно друг за другом линейным образом), нелинейные аминокислотные остатки (обозначены в контексте настоящего описания как нелинейные эпитопы; в этих эпитопах остатки не расположены последовательно), или и линейные, и нелинейные аминокислотные остатки.
Моноклональные антитела можно получать с помощью метода, описанного у КоЫет и др. №11игс 256, 1975, сс. 495-49, или с помощью его модификации. Как правило, мышь иммунизируют раствором, содержащим антиген. Иммунизацию можно осуществлять также путем смешения или эмульгирования содержащего антиген раствора в физиологическом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и инъецировать смесь или эмульсию парентрально. Любой метод иммунизации, известный в данной области, можно применять для получения моноклональных антител, предлагаемых в изобретении. После иммунизации животного у него удаляют селезенку (и необязательно несколько крупных лимфатических узлов) и расщепляют с получением индивидуальных клеток. Спленоциты можно подвергать скринингу, нанося клеточную суспензию на планшет или лунку, сенсибилизированную представляющим интерес антигеном. В-клетки, экспрессирующие связанный с мембраной специфический для антигена иммуноглобулин, связываются с планшетом и не отмываются. Полученные в результате В-клетки или все расщепленные спленоциты затем индуцируют к слиянию с клетками миеломы с получением гибридом и культивируют в селективной среде. Образовавшиеся клетки высевают путем серийного разведения и анализируют в отношении производства антител, которые специфически связываются с представляющим интерес антигеном (и которые не связываются с неродственными антигенами). Отобранные секретирующие моноклональное антитело (МАт) гибридомы затем культивируют либо ίη νίίτο (например, во флаконах для культуры ткани, либо в реакторах с полым волокном), либо ίη νίνο (в виде асцитов в мышах).
Если антагонистические антитела к СЭ40 получают с помощью метода рекомбинантной ДНК, то ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, которые могут специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Представленные в настоящем описании клетки гибридом служат в качестве предпочтительного источника указанной ДНК. После выделения ДНК можно переносить в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. со11, обезьяньи СО8-клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без указанной трансфекции не продуцируют белок иммуноглобулина, в результате происходит синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи, касающиеся рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитела, включают публикации 8кетга и др., Сигг. Ορίηίοη ίη 1ттипо1. 5, 1993, с. 256, и РЫскШии, 1ттипо1. Рсу5. 130, 1992, с. 151. В альтернативном варианте антитело можно получать в линии клеток, такой как линия СНО-клеток, согласно методу, описанному в И8 5545403; 5545405; и 5998144; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. В целом, метод состоит в следующем: линию клеток трансфектируют векторами, которые могут экспрессировать легкую цепь и тяжелую цепь соответственно. Путем трансфекции двумя белками, находящимися в разных векторах, можно получать химерные антитела. Другим преимуществом является правильное гликозилирование антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело к СЭ40, например антитело СН1В-12.12 или СН1В-5.9, или его антигенсвязывающий фрагмент получают в СНО-клетках с помощью системы экспрессии гена 68 (фирма Бои/а Вю1од1е8, Портсмут, шт. Нью-Гемпшир), в которой используют глутаминсинтетазу в качестве маркера (см. также И8 5122464; 5591639; 5658759; 5770359; 5827739; 5879936; 5891693 и 5981216; содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки).
Кроме того, антитела, предназначенные для применения в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, могут представлять собой химерные антитела, которые обладают требуемыми характеристиками связывания. Так, например, химерные антитела к СЭ40, предназначенные для применения в способах, предлагаемых в изобретении, могут обладать характеристиками связывания моноклональных антител СН1В-5.9 и СН1В-12.12, представленных в настоящем описании. Под химерными антителами подразумевают антитела, которые наиболее предпочтительно получены с помощью технологии рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты и которые содержат как человеческие (включая полученные из иммунологически родственных видов, например шимпанзе), так и полученные из организма, кроме человека, компоненты. Так, константная область химерного антитела наиболее предпочтительно практически идентична константной области встречающегося в естественных условиях человеческого антитела; вариабельная область химерного антитела наиболее предпочтительно выведена из источника, кроме человека, и обладает требуемой антигенной специфичностью в отношении представляющего интерес антигена, т.е. антигена СЭ40. Источник, кроме человека, может представлять собой взятое в качестве источника любое позвоночное животное, которое можно использовать для получения антител к человеческому антигену или материалу, содержащему человеческий антиген СЭ40. Такие источники, кроме человека, включают (но, не ограничиваясь только ими) грызунов (таких, например, как кролик,
- 23 018301 крыса, мышь и т.д.; см., например, И8 4816567, который включен в настоящее описание в качестве ссылки) и приматов кроме человека (таких, например, как узконосые обезьяны, высшие приматы; см., например, И8 5750105 и 5756096; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). В контексте настоящего описания понятие иммунологически активный касательно, например, химерных антител к СЭ40, означает, что химерное антитело связывается с человеческим СЭ40.
Под понятием гуманизированные подразумевают формы антител, которые содержат минимальную последовательность, выведенную из последовательностей иммуноглобулинов из организма кроме человека. В основном гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельных участков (которые называют также определяющими комплементарность участками или СОЯ) реципиента заменены остатками из гипервариабельного участка видов, кроме человека, (антитело-донор), таких как мышь, крыса, кролик или примат кроме человека, которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и потенциалом. Понятие гипервариабельный участок относится к аминокислотным последовательностям, которые в совокупности определяют аффинность и специфичность связывания встречающегося в естественных условиях Ενфрагмента сайта связывания нативного иммуноглобулина (см., например, С1ю11ла и др., 1. Мо1. Вю1. 196, 1987, сс. 901-917; КаЬа! и др., Ы1Н РиЫюаЬои Νο. 91-3242, изд-во и. 8. Эер1. о£ НеаЬЬ апб Нитап 8ег\зсс5, 1991). Понятие константная область относится к области молекулы антитела, которая обусловливает эффекторные функции. В проведенном ранее исследовании, касающемся получения неиммуногенных антител, предназначенных для лечения заболевания человека, мышиные константные области заменяли человеческими константными областями. Константные области подлежащих гуманизации антител получали из человеческих иммуноглобулинов. Однако указанные гуманизированные антитела все еще вызывали нежелательный и потенциально опасный иммунный ответ у людей и характеризовались снижением аффинности. Гуманизированные антитела, например гуманизированные антитела к СЭ40, предназначенные для применения в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, имеют характеристики, аналогичные характеристикам представляющего интерес родительского антитела, например, описанных выше моноклональных антител СН1Я-5.9 и СН1Я-12.12.
Гуманизацию можно осуществлять практически в соответствии с методом, описанным АйНег с соавторами (1опе8 и др., №-11иге 321, 1986, с.с. 522-525; КтесЬтапп и др., №-11иге 332, 1988, сс. 323-327; УетЬоеуеп и др., 8с1епсе 239, 1988, сс. 1534-1536), путем замены СОЯ или последовательностей СОЯ грызунов или мутантных СОЯ или последовательностей СОЯ грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела (см. также И8 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). В некоторых случаях остатки в каркасных участках одной или нескольких вариабельных областей человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие нечеловеческие остатки (см., например, И8 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370). Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации осуществляют для дополнительного усовершенствования характеристики антитела (например, для получения требуемой аффинности). В целом, гуманизированное антитело должно содержать практически полностью по меньшей мере одну и, как правило, две вариабельные области, в которых все или практически все гипервариабельные участки соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина, а все или практически все каркасные участки имеют последовательность человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно должно содержать также по меньшей мере часть константной области (Ес) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Дополнительные детали см. у 1опе§ и др., №-11иге 331, 1986, сс. 522-525; Я1есЬтапп и др., №-11иге 332, 1988, сс. 323-329; и у Ртейа, Сигг. Ор. 8!тис!. Вю1. 2, 1992, сс. 593-596; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Таким образом, указанные гуманизированные антитела могут представлять собой антитела, в которых существенно меньшая область, чем интактная человеческая вариабельная область, заменена на соответствующую последовательность из видов, кроме человека. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки СЭЯ и возможно некоторые остатки каркасного участка заменены на остатки из аналогичных сайтов антител грызунов (см., например, И8 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205. Кроме того, в И8 6180370 и опубликованной международной заявке АО 01/27160 описаны гуманизированные антитела и методики, предназначенные для получения гуманизированных антител с улучшенной аффинностью в отношении предварительно отобранного антигена.
Настоящее изобретение можно также воплощать на практике, используя ксеногенные или модифицированные антитела, которые продуцируются в хозяине-млекопитающем кроме человека, более конкретно в трансгенной мыши, которые отличаются инактивированными эндогенными локусами иммуноглобулина (1д). В таких трансгенных животных компетентные эндогенные гены, экспрессирующие субъединицы легкой и тяжелой цепи иммуноглобулинов хозяина, делают нефункциональными и заменяют на аналогичные локусы человеческого иммуноглобулина. Такие трансгенные животные продуцируют человеческие антитела, которые в значительной степени лишены субъединицы легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина хозяина (см., например, И8 5877397 и 5939598, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки).
- 24 018301
В некоторых вариантах осуществления изобретения полностью человеческие антитела к ί.Ό40, например, получают путем иммунизации трансгенных мышей. В частности, указанных мышей получают с помощью ХепоМоиее®-технологии (фирма ЛЬдешх; Фремонт, шт. Калифорния), и она описана в И8 6075181, 6091001 и 6114598, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для получения представленных в описании антител мышей, трансгенных по локусу тяжелой цепи человеческого 1§С| и локусу человеческой легкой к-цепи, иммунизировали клетками 8£ 9, экспрессирующими человеческий ί.Ό40. Мыши могут быть также трансгенными по другим изотипам. Полностью человеческие антитела к ί.Ό40, которые можно применять в стабильных жидких фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, отличаются способностью к связыванию, аналогичной способностью к связыванию, присущей представленным в настоящем описании моноклональным антителам к СН1В-5.9 и СНШ-12.12.
Фрагменты конкретного представляющего интерес антитела, например, антитела к СЭ40, включая антагонистическое антитело к ί.Ό40, можно применять в стабильных жидких фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, если они сохраняют требуемую аффинность полноразмерного антитела. Так, например, фрагмент антитела к ί.Ό40 должен сохранять способность связываться с поверхностным антигеном ί.Ό40 В-клеток. Для таких фрагментов характерны свойства, аналогичные свойствам соответствующего полноразмерного антитела. Так, например, фрагмент полноразмерного антагонистического антитела к СЭ40 должен специфически связываться с человеческим антигеном СЭ40, который экспрессируется на поверхности человеческой клетки, и не обладать существенной агонистической активностью, но проявлять антагонистическую активность при связывании с антигеном ί.Ό40 на человеческой клетке, экспрессирующей СЭ40. Указанные фрагменты обозначают как антигенсвязывающие фрагменты.
Приемлемые антигенсвязывающие фрагменты антитела содержат часть полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) ЕаЬ-, Е(аЬ')2- и Εν-фрагменты и одноцепочечные молекулы антител. Под ЕаЬ-фрагментом подразумевают одновалентный антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина, который состоит из легкой цепи и части тяжелой цепи. Под Е(аЬ')2-фрагментом подразумевают двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент иммуноглобулина, который содержит как обе легкие цепи, так и часть обеих тяжелых цепей. Под одноцепочечными Εν-фрагментами или &Εν антитела подразумевают фрагменты, которые содержат УН- и Уъ-области антитела, причем эти области присутствуют в одноцепочечном полипептиде (см., например, И8 4946778, 5260203, 5455030 и 5856456, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Как правило, полипептид Εν содержит также полипептидный линкер между УН - И Уъ-областями, который позволяет &Εν образовывать структуру, требуемую для связывания антигена. Обзор работ, посвященных &Εν, см. у Р1иск11шп, в: Т1е Рйаттасо1оду о£ Мопос1опа1 АпйЬой1ее, т. 113, под ред. ВоеепЬитд и Мооге, изд-во 8ртшдег-Уег1ад, №\ν Уотк, 1994, сс. 269-315. Антигенсвязывающие фрагменты антагонистических антител к ί.Ό40, представленных в настоящем описании, можно конъюгировать также с цитотоксином для уничтожения раковых клетокмишеней, что будет описано ниже.
Антитела или фрагменты антител можно выделять также из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методик, которые описаны, например, у МсСайейу и др., №11иге 348, 1990, сс. 552-554 и в И8 5514548. С1аскеоп и др., ХаИие 352, 1991, сс. 624-628 и Матке и др., 1. Мо1. Бю1. 222, 1991, сс. 581-597 описали выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител путем перестановки цепей (Матке и др., Вю/Тесйпо1оду 10, 1992, сс. 779-783), а также посредством комбинаторного заражения и рекомбинации ш νί\Ό в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (^а1етйоиее и др., №.1с1ею. Лайе Вее. 21, 1993, сс. 2265-2266). Таким образом, указанные методики представляют собой важные альтернативы получения моноклональных антител традиционным методам получения моноклональных антител с помощью гибридом.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методики. Традиционно эти фрагменты получают посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, МоптоЮ и др., 1оитпа1 о£ Вюсйетка1 апй Вюрйуеюа1 МеЛойе 24, 1992, сс. 107-117 и Вгеппап и др., 8аепсе 229, 1985, с. 81). Однако эти фрагменты в настоящее время можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антитела можно выделять из фаговых библиотек антител, описанных выше. В альтернативном варианте ЕаЬ'-8Н-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. сой и химически сшивать с получением Е(аЬ')2-фрагментов (Сайет и др., Вю/Тесйпо1оду 10, 1992, сс. 163-167). Согласно другому подходу Е(аЬ')2-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны специалисту в данной области.
Антагонистистические антитела к СЭ40, предназначенные для применения в стабильных жидких фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, представляют собой описанные выше моноклональные антитела СН1В-5.9 и СН1В-12.12, а также антитела, отличающиеся от указанных антител, но сохранившие их СЭВ; и антитела с одним или несколькими аминокислотным(и) добав
- 25 018301 лением(ями), делецией(ями) или заменой(ами), где антагонистическую активность оценивают по ингиброванию В-клеточной пролиферации и/или дифференцировке. Изобретение относится также к деиммунизированным антителам, прежде всего деиммунизированным антагонистическим антителам к СЭ40, которые можно получать согласно методу, описанному, например, в международных заявках на патент АО 98/52976 и АО 0034317; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. При использовании этого метода остатки в антагонистических антителах к СЭ40, предлагаемых в изобретении, модифицируют так, чтобы сделать антитела неиммуногенными или менее иммуногенными для людей, при этом они сохраняют свою антагонистическую активность в отношении человеческих клеток, экспрессирующих СЭ40, при этом указанную активность оценивают с помощью анализов, приведенных в настоящем описании. Также под объем настоящего изобретения подпадают слитые белки, содержащие представляющее интерес антитело, например, антагонистическое антитело к СЭ40 или его фрагмент, указанные слитые белки можно синтезировать или экспрессировать из соответствующих полинуклеотидных векторов, известных в данной области. Указанные слитые белки описаны в разделе настоящего описания, касающемся конъюгации антител.
Любое известное антитело, которое имеет представляющую интерес специфичность связывания, может иметь вариации последовательности, полученные с помощью методов, описанных, например, в опубликованных патентах ЕР 0983303 А1, АО 00/34317 и АО 98/52976, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Например, было установлено, что последовательности в СИВ могут обусловливать связывание антитела с молекулами ГКГ класса II и запускать нежелательный ответ Т-клетокхелперов. Консервативная замена может способствовать сохранению антителом биологической активности, но утрате его способности запускать нежелательный Т-клеточный ответ. Любые указанные консервативные или неконсервативные замены можно осуществлять с помощью методов, известных в данной области, таких как указаны в настоящем описании, и получать антитела, которые можно использовать в стабильных жидких фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении. Варианты антител, как правило, можно тестировать в отношении конкретного вида активности, например, антагонистической активности, аффинности и специфичности, с использованием представленных в настоящем описании методов.
Антагонистическое антитело к СЭ40, полученное с помощью любых описанных выше методов или любого другого метода, представленного в настоящем описании, или любого другого метода, не представленного в настоящем описании, можно использовать аналогично антителу СН1В-12.12 или СН1В-5.9, если оно обладает по меньшей мере одним из указанных видов биологической активности: ингибирует секрецию иммуноглобулинов здоровыми человеческими В-клетками периферической крови, стимулированными Т-клетками; ингибирует выживание и/или пролиферацию здоровых человеческих В-клеток периферической крови, стимулированных Т-клетками линии 1игка1; ингибирует выживание и/или пролиферацию здоровых человеческих В-клеток периферической крови, стимулированных клетками, экспрессирующими СИ40Ь или растворимый лиганд СЭ40 (кСИ40Ь); ингибирует выживание антиапоптозных внутриклеточных сигналов в любых клетках, стимулированных кСИ40Ь или твердофазным СИ40Ь; ингибирует трансдукцию сигнала СЭ40 в любой клетке после лигирования с кСИ40Ь или твердофазным СИ40Ь; ингибирует пролиферацию человеческих злокачественных В-клеток; снижает чувствительность, делает нечувствительным (анергия) и/или обусловливает толерантность к индукции несущих СЭ40 клеток-мишеней или клеток, несущих родственные лиганды СЭ40, включая (но, не ограничиваясь только ими) Т-клетки и В-клетки; индуцирует экспансию или активацию регуляторных СО4'СЭ25'-Т-клеток (см., например, данные об отторжении донорской аллоантигенспецфической ткани в результате взаимодействия С040-СП40Ь у Маштк и др., I. 1ттипо1. 169, 2002. сс. 5401-5404); обусловливает цитотоксичность посредством любого механизма, включая (но, не ограничиваясь только ими) антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ЛИСС), комплементзависимую цитотоксичность (СЭС), понижающую регуляцию пролиферации и/или апоптоз клеток-мишеней); модулирует секрецию цитокинов и/или экспрессию находящихся на клеточной поверхности молекул клетками-мишениями; и их комбинациями. Анализы, предназначенные для оценки требуемой биологической активности антагонистических антител к СЭ40, представленных в настоящем описании, и их антигенсвязывающих фрагментов можно осуществлять с помощью методов, описанных в предварительных заявках на патент, озаглавленных Айадошк! Лиΐ^-С^40 Мопос1опа1 АпИЬоб1ек аиб МеЛобк £ог ТНей Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), которые поданы 4 ноября 2003 г. 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., и переуступленных заявок на патент США 60/517337 (досье у патентного поверенного № РР20107.001 (035784/258442)), 60/525579 (досье у патентного поверенного № РР20107.002 (035784/271525)) и 60/565710 (досье у патентного поверенного № РР20107.003 (035784/277214)) соответственно; и международной заявке на патент РСТ/И82004/037152 (досье у патентного поверенного № РР20107.004 (035784/282916)), которая озаглавлена также Айадошк! АпИСЭ40 Мопос1опа1 АиНЬобхек аиб МеЙюбк £ог ТНей Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданной 4 ноября 2004 г. и опубликованной как АО 2005/044854; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также анализы, описанные в предварительной заявке, озаглавленной Мейюбк £ог П1адиок1к аиб Тгеа1теи1
- 26 018301 оГ РгоНГега11уе Эйогбегк Меб1а1еб Ьу СЭ40 81дпа1тд, Способы диагностики и лечения пролиферативных заболеваний, опосредуемых передачей сигнала СЭ40, поданной 9 декабря 2005 г., и переуступленной заявке на патент США 60/749285 (досье у патентного поверенного №. РР028035.0002 (035784/304312)) и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И82006/019414 (досье у патентного поверенного № РР028035.0003 (035784/311611)), поданной 18 мая 2006 г. и опубликованной как \У0 2006/125143; и в предварительной заявке, озаглавленной Мебюбк Гог Э1адпок1к апб Тгеа1тей оГ Όίκеакек Наушд ап ЛШоиптипе апб/ог 1пПатта1огу Сотропей, (Способы диагностики и лечения заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент), поданной 9 декабря 2005 г., и в переуступленной заявке на патент США 60/749336 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0002 (035784/304311)), и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И82006/019325 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0003 (035784/311608)), поданной 18 мая 2006 г., и опубликованной как \У0 2006/125117; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Анализы описаны также у 8с1и.111хе и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 92, 1998, сс. 82008204; Эейоп и др., Реб1а(г. Тгапкр1ай. 2, 1998, сс. 6-15; Еуапк и др., I. 1ттипо1. 164, 2000, сс. 688-697; №е11е, Адейк Асйопк 8ирр1. 49, 1998, сс. 17-22; Ьебегтап и др., Сигг. 0рт. Нета1о1. 3, 1996, сс. 77-86; СоПдап и др., Сиггей Рго1осо1к ш 1ттипо1оду 13, 1991, с 12; КлтеккеЬоот и др., 1ттипо1оду 79, 1993, с.с. 439-444; и И8 5674492 и 5847082; содержание которых включено в качестве ссылки.
Репрезентативный анализ, позволяющий выявлять антагонистические антитела к СЭ40, специфические для эпитопов антигена СЭ40, который применяют в настоящем описании, представляет собой анализ конкурентного связывания. Анализы конкурентного связывания представляют собой серологические анализы, в которых неизвестные субстанции выявляют и количественно оценивают по их способность ингибировать связывание меченого известно лиганда со специфическим для него антителом. Это относится также к конкурентным анализам ингибирования. В репрезентативном конкурентном анализе связывания меченый полипептид СЭ40 осаждают антителами-кандидатами в образце, например, в сочетании с моноклональными антителами к одному или нескольким эпитопам моноклональных антител, предлагаемых в изобретении. Антитела к СЭ40, которые специфически взаимодействуют с представляющим интерес эпитопом, можно идентифицировать путем скрининга серий антител, образовавшихся к белку СЭ40 или фрагменту белка, содержащему конкретный представляющий интерес эпитоп белка СЭ40. Например, представляющие интерес эпитопы человеческого СЭ40 представляют собой эпитопы, содержащие линейные и/или нелинейные аминокислотные остатки короткой изоформы человеческого СЭ40 (см., СепВапк, регистрационный №. №_690593), последовательность которой представлена в 8ЕЦ ГО N0:10, кодируемая последовательностью, представленной в 8ЕЦ ГО N0:9; см. также СепВапк, регистрационный №. НМ_152854), или длинной изоформы человеческого СЭ40 (см., СепВапк, регистрационные № САА43045 и №_001241, последовательность которой представлена в 8ЕЦ ГО N0:12, кодируемая последовательностью, представленной в 8ЕЦ ГО N0:11; см.е СепВапк, регистрационные №№. Х60592 и №М_001250). В альтернативном варианте конкурентные анализы связывания с использованием ранее идентифицированных приемлемых антагонистических антител к СЭ40 можно применять для отбора моноклональных антител, сопоставимых по активности с ранее идентифицированными антителами.
Антитела, применяемые в указанных иммуноанализах, могут быть мечеными или немечеными. Немеченые антитела можно применять при агглютинации; меченые антитела можно применять в широком разнообразии анализов, используя широкое разнообразие меток. Выявление образования комплекса антитело-антиген между антителом к СЭ40 и представляющим интерес эпитопом можно облегчать, присоединяя выявляемую субстанцию к антителу. Приемлемые пути выявления включают применение меток, таких как радионуклиды, ферменты, коферменты, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, хромогены, субстраты ферментов или кофакторов, ингибиторы ферментов, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и т.п.. Примерами приемлемых ферментов являются пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; примерами приемлемых комплексов простетических групп являются комплексы стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примерами приемлемых флуоресцентных материалов являются умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеина, дансилхлорид или фикоэритин; примером люминесцентного материала является луминол; примерами биолюминисцентных материалов являются люцифераза, люциферин и экворин; и примерами приемлемых радиоактивных материалов являются I, 1, 8 или Н. Указанные меченые реагенты можно применять в широком разнообразии анализов, таких как радиоиммуноанализы, ферментные анализы, например, ЕЫ8А, флуоресцентные иммуноанализы и т.п. (см., например, И8 3766162; 3791932; 3817837 и 4233402).
Любые ранее описанные антагонистические антитела к СЭ40 или их антигенсвязывающие фрагменты можно конъюгировать перед применением в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении. Методы получения конъюгированных антител известны в данной области. Так, антитело можно метить путем непрямого мечения или подхода, основанного на непрямом мечении. Под непрямым мечением или подходом, основанном на непрямом мечении подразумевают, что хелатирующий агент ковалентно присоединяют к антителу и по меньшей мере один представляющий интерес радионуклид встраивают в хелатирующий агент (см., например, хелатирующие агенты и радионуклиды,
- 27 018301 описанные у 8пуад1ага и Меаке, Νϋθ1. Меб. Вю. 18, 1991, сс. 589-603, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки). Приемлемые метки представляют собой флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (прежде всего 32Р и 1251), агенты, реагирующие на электронную плотность, ферменты и лиганды, которые имеют партнеров для специфического связывания. Ферменты, как правило, выявляют по их активности. Например, пероксидазу из хрена обычно выявляют по ее способности превращать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) с образованием голубого пигмента, который можно оценивать количественно спектрофотометрическим методом. Понятие партнер для специфического связывания относится к белку, обладающему способностью связываться с молекулой-лигандом с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и специфического для него моноклонального антитела. Другие партнеры для специфического связывания представляют собой биотин и авидин или стрептавидин, 1дС и протеин А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Следует понимать, что в изложенном выше описании не ставится задача разделить различные метки на конкретные классы, поскольку некоторые метки могут выполнять свою функцию посредством нескольких различных механизмов. Например, I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве агента, реагирующего на электронную плотность. НКР может служить в качестве фермента или в качестве антигена для МАт. Кроме того, можно комбинировать различные метки для достижения требуемого эффекта. Например, МАт и авидин также требуется метить при воплощении на практике настоящего изобретения: так можно метить МАт биотином и выявлять его присутствие с помощью авидина, меченного I, или МАт к биотину, меченному с помощью НКР. Другие перестановки и возможности должны быть очевидны обычным специалистам в данной области, и они рассматриваются в качестве эквивалентов в контексте настоящего изобретения.
В альтернативном варианте представляющее интерес антагонистическое антитело к ί.Ό40 можно метить путем прямого мечения или подхода, основанного на прямом мечении, при этом радионуклид ковалентно присоединяют к антителу (как правило, через аминокислотный остаток). Предпочтительные радионуклиды представлены у 8пуад1ага и Меаке, 1991, выше. Подход, основанный на непрямом мечении, является наиболее предпочтительным (см. также, например, опубликованные международные заявки на патент \У0 00/52031 и \У0 00/52473, в которых для присоединения радиоактивной метки к антителам используют линкер; и меченые формы антител к СЭ40, описанные в И8 6015542; которые включены в настоящее описание в качестве ссылки).
Варианты антител
Для приготовления фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, можно использовать варианты антагонистического антитела к ί.Ό40, известные в данной области. Такие варианты должны сохранять требуемую способность к связыванию родительского антитела. Так, например, когда подлежащее к включению в препаративную форму антагонистическое антитело к СЭ40 представляет собой вариант родительского антитела СН1К-12.12 или СН1К-5.9, то антитело-вариант должно сохранять способность к связыванию, характерную для родительского антитела СН1К-12.12 или СН1К5.9. Методы создания вариантов антител в целом, являются доступными в данной области. Например, аминокислотную последовательность вариантов антагонистического антитела к СЭ40, например, моноклонального антитела СН1К-5.9 или СН1К-12.12, представленного в настоящем описании, можно получать с помощью мутаций в клонируемой последовательности ДНК, которая кодирует представляющее интерес антитело. Методы мутагенеза и изменения нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области (см., например, Тес11пк.|иек ш Мо1еси1аг Вю1оду под ред. \Уа1кег и Саакба, изд-во МасМШап РиЫЫппд Сотрапу, №\ν Уогк, 1983; Кипке1, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 82, 1985, сс. 488-492; Кипке1 и др., Мебюбк Епхуто1. 154, 1987, сс. 367-382; 8атЬгоок и др., Мо1еси1аг С1оптд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог, №\ν Уогк, 1989; И8 4873192; и процитированные в указанных публикациях ссылки; указанные публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Руководство по осуществлению соответствующих аминокислотных замен, которые не должны влиять на биологическую активность представляющего интерес полипептида, можно почерпнуть из модели, представленной у ЭауйоГГ и др., Абак оГ Рго1еш 8ес.|иепсе апб 81гис1иге, изд-во №111. Вютеб. Кек. Роипб., ХУакЫпдЮп, Э.С., 1978, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительными могут быть консервативные замены, при которых заменяют одну аминокислоту другой с аналогичными свойствами. Примерами консервативных замен являются (но, не ограничиваясь только ими) 01νθ А1а, Уа1 θΙ4 ^Ьеи, Акр θΟ1ιι, Ьук ^Агд, Акп θΟ1ιι и РЬе θΤιρ θ Туг.
При конструировании вариантов полипептида представляющего интерес антагонистического антитела к ί.Ό40, например, антитела СН1К-12.12 или СН1К-5.9, осуществляют такие модификации, что полученные в результате варианты продолжают обладать требуемой активностью, т.е. аналогичной аффинностью к связыванию, и в случае антагонистических антител к ί.Ό40, обладают способностью к специфическому связыванию с человеческим антигеном ί.Ό40, экспрессируемым на поверхности человеческой клетки, и не обладают существенной агонистической активностью, но проявляют антагонистическую активность при связывании с антигеном СЭ40 на человеческой экспрессирующей СЭ40 клетке. Очевидно, что любые мутации в ДНК, которая кодирует вариант полипептида, не должны затрагивать
- 28 018301 последовательность вне рамки считывания и предпочтительно не должны приводить к созданию комплементарных областей, которые могут приводить к образованию вторичной структуры мРНК (см. опубликованную заявку на европейский патент ЕР 75444).
Кроме того, константную область антагонистического антитела к ί.Ό40 можно разнообразными путями подвергать мутации для изменения эффекторной функции. Например, см. И8 6737056В1 и опубликованную заявку на патент США № 2004/0132101А1, в которых описаны мутации Ес, которые оптимизируют связывание антитела с Ес-рецепторами.
Предпочтительно варианты антагонистического референс-антитела к ί.Ό40 имеют аминокислотные последовательности, которые идентичны по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно идентичны по меньшей мере на 80% или 85% более предпочтительно идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94 или 95% аминокислотной последовательности референс-антитела, например, представленного в настоящем описании моноклонального антитела СН1К-5.9 или СН1К-12.12, или укороченного фрагмента молекулы референс-антитела. Более предпочтительно последовательность молекул идентична по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99%. Для целей настоящего изобретения процент идентичности последовательности определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, используя для поиска аффинной бреши штраф за открытие бреши 12 и штраф за удлинение бреши 2, матрицу ВЬО8ИМ 62. Алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана изложен у 8ιηί11ι и ^а!егтаи, Αάν. Арр1. МаШ 2, 1981, сс. 482-489. Вариант может, например, отличаться от антагонистического референс-антитела к ί.Ό40 примерно 1-15 аминокислотными остатками, примерно 1-10 аминокислотными остатками, например, 6-10, примерно 5, примерно 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.
Для оптимального сравнительного анализа двух аминокислотных последовательностей непрерывный сегмент варианта аминокислотной последовательности может иметь дополнительные аминокислотные остатки или удаленные в результате делеции аминокислотные остатки относительно аминокислотной референс-последовательности. Непрерывный сегмент, применяемый для сравнения с аминокислотной референс-последовательностью, может включать по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, и может состоять из 30, 40, 50 или большего количества аминокислотных остатков. Можно осуществлять коррекции идентичности последовательностей, ассоциированные с консервативными заменами остатков или брешами (см. алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана).
Методы лечения с помощью фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, находят применение при лечении индивидуума, страдающего раком или предраковым состоянием, ассоциированным с экспрессирующими ί.Ό40 клетками, или при лечении воспалительного заболевания и/или аутоиммунного заболевания, ассоциированного с экспрессирующими ί.Ό40 клетками. Понятие лечение в контексте настоящего описания относится к нанесению или введению фармацевтической композиции, которая содержит антагонистическое антитело к СЭ40, индивидууму, или к нанесению или введению фармацевтической композиции, которая содержит антагонистическое антитело к СЭ40, в выделенную ткань или линию клеток из организма индивидуума, где индивидуум имеет заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, при этом целью является излечивание, заживление, облегчение, ослабление, изменение, лечение, уменьшение интенсивности, улучшение состояния или воздействие на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.
Под индивидуумом подразумевают любое животное. Предпочтительно индивидуум представляет собой млекопитающее, наиболее предпочтительно индивидуум представляет собой человека. Другие важные помимо человека млекопитающие представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) собак, кошек, коров, лошадей, овец и свиней.
Когда введение осуществляют с целью лечения, то оно может быть проведено с целью профилактики или терапии. В случае профилактического применения фармацевтическая композиция приводит к улучшению любого симптома. Профилактическое применение фармацевтической композиции служит для предупреждения или ослабления любого возникающего в последствии симптома. В случае терапевтического применения фармацевтическую композицию используют сразу (или вскоре после) проявления симптома. Терапевтическое применение фармацевтической композиции служит для ослабления любого уже имеющегося симптома.
Типичные пути введения включают (но, не ограничиваясь только ими) оральное введение и парентеральное введение, в том числе внутривенную, внутримышечную, подоболочечную, интраназальную, подъязычную, внутриартериальную и внутрибрюшинную инъекцию или инфузию, и подкожную инъекцию. Методы осуществления такого введения известны обычному специалисту в данной области.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, вводят внутривенно. Внутривенное введение осуществляют предпочтительно путем инфузии в течение периода времени, составляющего от примерно 1 до примерно 10 ч, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 8 ч, еще более предпочтительно от примерно 2 до примерно 7 ч, еще более предпочтительно от примерно 4 до примерно 6 ч, в зависимости от подлежащего введению антагонистического антитела к СЭ40. Первоначальную инфузию фармацевтической композицией можно осуществлять в течение периода времени, составляющего от примерно 4 до примерно 6 ч, с последую
- 29 018301 щими более быстрыми инфузиями. Последующие инфузии можно осуществлять в течение периода времени, составляющего от примерно 1 до примерно 6 ч, в том числе, например, от примерно 1 до примерно 4 ч, от примерно 1 до примерно 3 ч или от примерно 1 до примерно 2 ч.
Индивидууму вводят фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, в фармацевтически эффективном количестве. Под фармацевтически эффективным количеством подразумевают количество, которое применяют для лечения заболевания или состояния, при этом обработку можно осуществлять в профилактических или терапевтических целях, как указано выше. Причем, при введении фармацевтически эффективного количества композиции индивидууму, который нуждается в лечении, вводят антагонистическое антитело к СЭ40 в терапевтически эффективной дозе или количестве. Под терапевтически эффективной дозой или количеством или эффективном количеством подразумевают количество антагонистического антитела к СЭ40, которое при его введении приводит к получению терапевтического ответа, близкого к позитивному, в отношении лечения пациента, который страдает заболеванием, ассоциированным с экспрессирующими СЭ40 клетками. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективная доза антагонистического антитела к СЭ40, например, моноклонального антитела СН1В-12.12 или СН1В-5.9, или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от примерно 0,01 мг/кг до примерно 40 мг/кг, от примерно 0,01 мг/кг до примерно 30 мг/кг, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 мг/кг до примерно 30 мг/кг, от примерно 3 мг/кг до примерно 30 мг/кг, от примерно 3 мг/кг до примерно 25 мг/кг, от примерно 3 мг/кг до примерно 20 мг/кг, от примерно 5 мг/кг до примерно 15 мг/кг или от примерно 7 мг/кг до примерно 12 мг/кг. Установлено, что метод лечения может предусматривать одно введение в терапевтически эффективной дозе или несколько введений в терапевтически эффективной дозе антагонистического антитела к СЭ40 или его антигенсвязывающего фрагмента.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, находят применение при лечении любого индивидуума, имеющего рак или предраковое состояние, который реагирует на лечение с использованием анти-СЭ40 терапевтического агента, более конкретно антагонистического антитела к СЭ40. Методы определения чувствительности рака или предракового состояния на лечение антителом к СЭ40 включают диагностические и прогностические анализы, например анализы, описанные в находящейся в одновременном рассмотрении и являющейся совместной собственностью предварительной заявке на патент, озаглавленной Мебюбк £ог Э1адпок1к апб Тгеа!теп! о£ РгоШегаШе Э1когбегк Меб1а!еб Ьу СЭ40 81дпа1тд (Способы диагностики и лечения пролиферативных нарушений, опосредуемых передачей сигналов СЭ40), поданной 9 декабря 2005 г., и в переуступленной заявке на патент США № 60/749285 (досье у патентного поверенного № РР028035.0002 (035784/304312), и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И82006/019414 (досье у патентного поверенного № РР028035.0003 (035784/311611)), поданной 18 мая 2006 г., и в опубликованной АО 2006/125143; содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Аналогично этому фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, находит применение при лечении любого индивидуума, имеющего воспалительное и/или аутоиммунное заболевание, который реагирует на лечение с использованием анти-СЭ40 терапевтического агента, более конкретно антагонистического антитела к СЭ40. Методы определения чувствительности воспалительного и/или аутоиммунного заболевания на лечение антителом к СЭ40 включают диагностические и прогностические анализы, например, анализы, описанные в находящейся в одновременном рассмотрении и являющейся совместной собственностью предварительной заявке на патент, озаглавленной Мебюбк £ог Э1адпок1к апб Тгеа!теп! о£ Э1кеакек Наутд ап ЛиЮ1ттипе апб/ог 1пПатта1огу Сотропеп! (Способы диагностики и лечения заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент), поданную 9 декабря 2005 г., и в переуступленной заявке на патент США № 60/749336 (досье у патентного поверенного № РР028062.0002 (035784/304311), и соответствующей международной заявке на патент. РСТ/И82006/019325 (досье у патентного поверенного № РР028062.0003 (035784/311608)), поданной 18 мая 2006 г., и в опубликованной АО 2005/125117; содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Понятие опухоль в контексте настоящего описания относится к любому неопластическому клеточному росту и пролиферации, как злокачественному, так и доброкачественному, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Понятие неопластический в контексте настоящего описания относится к любой форме нарушенной регуляции или отсутствию регуляции клеточного роста как злокачественного, так и доброкачественного, что приводит к аномальному росту ткани. Таким образом, к неопластическим клеткам относятся как злокачественные, так и доброкачественные клетки, у которых нарушена регуляция или отсутствует регуляция клеточного роста.
Под противоопухолевой активностью подразумевают снижение скорости пролиферации или накопления злокачественных экспрессирующих СЭ40 клеток, и, как следствие, снижение скорости роста существующей опухоли или опухоли, которая возникает в процессе терапии, и/или деструкцию существующих неопластических (опухолевых) клеток или вновь образовавшихся неопластических клеток, и, как следствие, снижение общего размера опухоли в процессе терапии. Терапия с использованием содержащих антагонистическое антитело к СЭ40 фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, вызывает физиологический ответ, благоприятный с позиций лечения различных видов рака и пред
- 30 018301 раковых состояний, ассоциированных со стимуляцией передачи сигнала ί.Ό40 на экспрессирующих СЭ40 клетках у человека.
Понятия рак и раковый относятся или служат для описания физиологического состояния у млекопитающих, которые, как правило, характеризуются нерегулируемым клеточным ростом. Примерами рака являются (но, не ограничиваясь только ими) лимфома и лейкоз, и плотные опухоли. Под связанным с В-клеткой раком или раком В-клеточной зародышей линии подразумевают любой тип рака, при котором нарушение регуляции или отсутствие регуляция клеточного роста ассоциировано с В-клетками.
Понятие невосприимчивый касательно рака относится к конкретному раку, устойчивому или нереагирующему на терапию конкретным терапевтическим агентом, например, представляющим интерес антагонистическим антителом к СЭ40. Рак может быть невосприимчивым к терапии конкретным терапевтическим агентом либо с начала лечения конкретным терапевтическим агентом (т.е. не реагировать на начальную обработку терапевтическим агентом), либо в результате развития устойчивости к терапевтическому агенту, либо в процессе начального периода лечения терапевтическим агентом, либо в процессе последующего периода лечения терапевтическим агентом.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, находят применение при лечении индивидуума, который нуждается в терапевтическом вмешательстве в раковое или предраковое состояние, которое опосредуется стимуляцией передачи сигнала ί.Ό40 на экспрессирующих СЭ40 клетках, или в любое воспалительное или аутоиммунное заболевание, которое опосредуется передачей сигнала ί.Ό40 на экспрессирующих СЭ40 клетках. Под экспрессирующими СЭ40 клетками понимают здоровые, предраковые и злокачественные клетки, экспрессирующие антиген СЭ40. В некоторых вариантах осуществления изобретения экспрессирующая ί.Ό40 клетка представляет собой злокачественную В-клетку. Под злокачественной В-клеткой подразумевают любую неопластическую В-клетку, включая (но, не ограничиваясь только ими) В-клетки, полученные из лимфом, включая лимфомы с низкой, средней степенью злокачественности и высокозлокачественные В-клеточные лимфомы, иммунобластные лимфомы, не-ходжкинские лимфомы, болезнь Ходжкина, индуцируемые вирусом Эпштейна-Барра (ЕВУ) лимфомы и связанные со СПИДом лимфомы, а также острый В-клеточный лимфобластный лейкоз, миеломы, хронический лимфоцитарный лейкоз и т.п. В других вариантах осуществления изобретения экспрессирующая СЭ40 клетка представляет собой клетку карциномы или саркомы. Под экспрессирующей СЭ40 клеткой карциномы или экспрессирующей СЭ40 клеткой саркомы подразумевают любую злокачественную (т.е. неопластическую) или предраковую клетку карциномы или саркомы плотной опухоли, которая экспрессирует поверхностный антиген СЭ40. Для целей настоящего изобретения раковые и предопухолевые и предраковые клетки, которые экспрессируют антиген СЭ40, обозначают как экспрессирующие СЭ40 неопластические клетки. Методы выявления экспрессии СЭ40 в клетках хорошо известны в данной области и включают (но, не ограничиваясь только ими) методы ПЦР, иммуногистохимии, проточной цитометрии, Вестерн-блоттинга, ЕЫ8Л, и т.п. Если лечение антагонистическим антителом к СЭ40 или его антигенсвязывающим фрагментом оправдано, то фармацевтическую композицию, содержащую антагонистическое антитело к СЭ40 или его антигенсвязывающий фрагмент, можно применять с помощью любого приемлемого пути введения.
Индивидуум, который нуждается в терапевтическом вмешательстве с использованием фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, может быть поражен или иметь риск развития или рецидива любого ракового или предракового состояния, которое опосредуется передачей сигнала СЭ40 на экспрессирующих СЭ40 неопластических клетках. Примерами таких раковых и предраковых состояний являются (но, не ограничиваясь только ими) любые вида рака В-клеточной зародышевой линии, не связанные с В-клетками гематологические злокачественные заболевания и плотные опухоли, для которых известно, что они опосредуются передачей сигнала СЭ40 на экспрессирующих СЭ40 неопластических клетках.
Примерами видов рака В-клеточной зародышевой линии, которая содержит экспрессирующие СЭ40 неопластические клетки, являются острый лимфобластный лейкоз (АБЬ), хронический лимфобластный лейкоз (СЬЬ), пролимфоцитарный лейкоз (РЬЬ), лейкемический ретикулёз, болезнь Ходжкина, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрома, болезни тяжелых цепей, и лимфомы, включая (но, не ограничиваясь только ими) диффузную мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, фолликулярную лимфому, ОБВСЬ (диффузную В-клеточная лимфома с расщепленными ядрами), лимфому лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, моноцитоидную В-клеточную лимфому, лимфому селезенки, лимфоматоидный гранулематоз, интраваскулярный лимфоматоз, иммунобластную лимфому, СПИД-связанную лимфому и т.п.
Таким образом, фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, находят применение при лечении индивидуумов, страдающих неходжкинской лимфомой, которая связана с аномальной неконтролируемой пролиферацией или накоплением В-клеток. Для целей настоящего изобретения такие лимфомы можно отнести согласно схеме Рабочей классификации (Аогктд Еогти1айоп) к В-клеточным лимфомам, которые подразделяют на В-клеточную лимфому низкой степени злокачественности, Вклеточную лимфому промежуточной степени злокачественности, высокозлокачественную В-клеточную лимфому (см. ТЬе Ыоп-Нобдкт'к ЬутрЬота Ра1Ьо1одю С1а55|Пса1юп Рго)ес1, Сапсег 49, 1982, сс. 2112
- 31 018301
2135). Так, В-клеточные лимфомы низкой степени злокачественности включают фолликулярную мелкоклеточную лимфому с расщепленными ядрами и фолликулярную лимфому смешанного типа с расщепленными ядрами и крупноклеточную лимфому; лимфомы промежуточной степени злокачественности включают фолликулярную крупноклеточную лимфому, диффузную мелкоклеточную лимфому с расщепленными ядрами, диффузную смешанную мелкоклеточную и крупноклеточную лимфому и диффузную крупноклеточную лимфому; а высокозлокачественные лимфомы включают крупноклеточные иммунобластные, лимфобластные лимфомы и мелкоклеточную лимфому с расщепленными ядрами Беркитта и неберкиттовского типа.
Установлено, что фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять для терапевтического лечения В-клеточных лимфом, которые классифицируют согласно пересмотренной европейской и американской системе классификации лимфом (Веуйеб Еи^ορеаη аиб Атенсам Ьутрйота С1а88^йсаί^οη, ВЕДЬ). Такие В-клеточные лимфомы включают (но, не ограничиваясь только ими) лимфомы, которые относят к предшественникам В-клеточных неоплазм, такие как В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома; неоплазмы периферических В-клеток, включая В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфоплазмацитоидную лимфому/иммуноцитому, лимфому из клеток мантии (МСЬ), фолликулярную центральную лимфому (фолликулярная лимфома) (включая диффузную мелкоклеточную лимфому, диффузную лимфому смешанного типа (мелкоклеточную и крупноклеточную) и диффузные крупноклеточные лимфомы), В-клеточную лимфому маргинальной зоны (включая лимфомы экстранодального, нодального и селезеночного типов), плазмоцитому/миелому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому первично медиастинального подтипа (тимусная), лимфому Беркитта и высокозлокачественную лимфому беркиттовского типа; и неклассифицируемые низкой степени злокачественности или высокозлокачественные В-клеточные лимфомы.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также для лечения индивидуумов, которые имеют предраковое состояние, такое как МСИ8 (моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии). Примерно у 25% пациентов с МСИ8 в конце концов развивается множественная миелома (ММ) или родственное нарушение плазматических клеток (Ку1е, Мауо С11шс. Ргос. 68, 1993, сс. 26-36). Пролиферация злокачественных плазматических клеток в костном мозге, обнаружение моноклонального белка (М-белок) в сыворотке или моче, анемия, гиперкальцемия, почечная недостаточность и литические повреждения кости представляют собой клинические проявления ММ, в то время как МСИ8 распознается клинически по присутствию М-белка в сыворотке или моче без других клинических особенностей ММ (см., например, Ку1е и БиЛ, 8етт. НетаЮ1. 26, 1989, сс. 176-200; 6ге1рр и БиЛ, 81ет Се11§, 13, 1995, сс. 10-21). Имеющие М6И8 пациенты являются бессимптомными и у них стабильно обнаруживается М-белок (Ку1е, Мауо Сйшс. Ргос. 68, 1993, сс. 26-36). Когда М6И8 идентифицирована у индивидуума, то поддерживающая терапия с помощью соответствующей фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, например, композиции, которая содержит антагонистическое антитело к СЭ40, представленное в настоящем описании, может блокировать развитие множественной миеломы у этих индивидуумов.
В частности, фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, применяют для лечения В-клеточных лимфом, включая перечисленные выше лимфомы, которые являются нечувствительными (т.е. устойчивыми или имеют приобретенную устойчивость) к основному онкотерапевтическому лечению. Под понятием онкотерпевтическое подразумевают лечение рака, такое как химиотерапия, хирургическое вмешательство, лучевая терапия, терапия с применением одного противоракового антитела и их комбинации. Для субпопуляций пациентов желательно использовать терапевтическое вмешательство с использованием одного или нескольких антител к СЭ40, которые модулируют опосредуемую СО40Б передачу сигнала ί.Ό40, модулируют ЛЭСС или обладают обоими видами активности.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также для лечения не связанных с В-клетками гематологических злокачественных заболеваний. Такие злокачественные заболевания включают (но, не ограничиваясь только ими) острые лейкозы, миелобластные лейкозы; острый миелоцитарный лейкоз; промиелоцитарный лейкоз; миеломоноцитарный лейкоз; моноцитарный лейкоз; эритролейкоз; гранулоцитарный лейкоз (хронический миелоцитарный лейкоз); истинную полицитемию и т.п.
Плотные опухоли, которые содержат экспрессирующие ί.Ό40 неопластические клетки, и поэтому должны область высокой чувствительностью к лечению с использованием фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, включают (но, не ограничиваясь только ими), карциному яичника, легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома), молочной железы, ободочной кишки, почки (включая, например, почечно-клеточную карциному), карциному мочевого пузыря, печени (включая, например, печеночноклеточные карциномы), желудка, шейки матки, предстательной железы, носоглоточную карциному, карциномы щитовидной железы (например, папиллярную карциному щитовидной железы), различные виды рака кожи, такие как меланома и саркомы, включая, например, остеосаркомы и саркомы Юинга.
Благоприятные результаты, которые можно получать при введении фармацевтической композиции,
- 32 018301 предлагаемой в изобретении, индивидууму, страдающему раковым или предраковым состоянием, представляют собой любой положительный терапевтический ответ, касающийся этого типа рака или состояния опухоли. Под положительным терапевтическим ответом в контексте лечения рака подразумевают улучшение заболевания, ассоциированного с противоопухолевой активностью анти-СО40 терапевтического агента, и /или улучшение симптомов, ассоциированных с представляющим интерес заболеванием. Это относится к антипролиферативному действию, предупреждению дальнейшего разрастания опухоли, снижению размера опухоли, снижению количества раковых клеток и/или снижению одного или нескольких симптомов, опосредуемых стимуляцией экспрессирующих ί.Ό40 клеток. Так, например, положительный терапевтический ответ может характеризоваться одним или несколькими признаками улучшения состояния болезни: (1) снижение размера опухоли; (2) снижение количества раковых (т.е. неопластических) клеток; (3) повышение уровня гибели неопластических клеток; (4) ингибирование выживаемости неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановка) роста опухоли; (6) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановка) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; (7) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановка) метастазов опухоли; (8) предупреждение дальнейшего избыточного роста опухоли; (9) повышение коэффициента выживаемости пациентов; и (10) некоторое облегчение одного или нескольких симптомов, ассоциированных с раком. Положительные терапевтические ответы при любом конкретном злокачественном заболевании можно определять на основе стандартизованных критериев ответа, специфических для данного злокачественного заболевания. Ответ опухоли можно оценивать по изменениям морфологии опухоли (т.е. общего состояния опухоли, размера опухоли и т.п.), используя методы скрининга, такие как визуализация, методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР-томография), радиографическая визуализация в рентгеновских лучах, компьютерная томография (КТ), сканирование кости, эндоскопия и взятие образцов опухоли для биопсии, включая аспирацию костного мозга (ВМА), и подсчет опухолевых клеток в кровотоке. Помимо указанных положительных терапевтических ответов, у пациента, подвергающегося терапии с использованием содержащей антагонистическое антитело к СЭ40 фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, может быть обнаружено благоприятное действие, связанное с улучшением симптомов, которые ассоциированы с заболеванием. Так, при В-клеточных опухолях у индивидуума может снижаться уровень так называемых В-симптомов, т.е. ночная потливость, лихорадка потеря веса и/или крапивница. При предраковых состояниях терапия с использованием анти-СО40 терапевтического агента может блокировать и/или пролонгировать период времени, предшествующий развитию соответствующего злокачественного состояния, например, развитие множественной миеломы у пациентов, страдающих моноклональной гаммапатией неустановленной этиологии (МСИ8).
Под противовоспалительной активностью подразумевают снижение или предупреждение воспаления. Терапия с использованием содержащей антагонистическое антитело к ί.Ό40 жидкой фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, вызывает физиологический ответ, благоприятный с позиций лечения аутоиммунного заболевания и /или воспалительного заболевания, где заболевание связано с клетками, экспрессирующими антиген СЭ40. Установлено, что композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять для предупреждения изменения фенотипа клеток, такого как пролиферация, активация и т.п.
Индивидуум, которого подвергают терапевтическому вмешательству с использованием содержащей антагонистическое антитело к ί.Ό40 жидкой фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, может быть поражен или иметь риск развития или рецидива любого воспалительного или аутоиммунного заболевания, которое опосредуется передачей сигнала СЭ40 на экспрессирующих СЭ40 клетках. Воспалительные заболевания отличаются воспалением и деструкцией ткани или их комбинацией. Воспалительное заболевание включает любой воспалительный опосредуемый иммунной системой процесс, при котором инициация или запуск иммунного ответа зависит от чужого(их) антигена(ов), в том числе, например, аллоантигенов, ксеноантигенов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов, неизвестных антигенов или аллергенов.
Кроме того, для целей настоящего изобретения под понятие воспалительное(ые) заболевание(я) подпадает(ют) аутоиммунное(ые) заболевание(я). В контексте настоящего описания понятие аутоиммунитет, как правило, относится к воспалительным опосредуемым иммунной системой процессам, включающим свои антигены. При аутоиммунных заболеваниях свой(и) антиген(ы) запускают иммунные ответы в организме-хозяине.
Кроме того, фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения воспаления, ассоциированного с отторжением трансплантата ткани. Отторжение трансплантата или отторжение имплантата относится к любому поддерживаемому иммунной системой хозяина ответу на трансплантат, включая (но, не ограничиваясь только ими) НЬЛ-антигены, антигены группы крови и т.п.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять также для лечения болезни трансплантат против хозяина, например, ассоциированной с трансплантацией костного мозга. При болезни трансплантат против хозяина донорский костный мозг включает лимфоциты и клетки, из
- 33 018301 которых в результате созревания образуются лимфоциты. Лимфоциты донора распознают лимфоциты реципиента как чужие и поддерживают воспалительный иммунный ответ. Таким образом, в контексте настоящего описания понятие болезнь трансплантат против хозяина или реакция трансплантат против хозяина относится к любому опосредуемомому Т-клетками иммунному ответу, при котором лимфоциты донора взаимодействуют с антигенами хозяина.
Примеры аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний включают (но, не ограничиваясь только ими) системную красную волчанку (СКВ), дискоидную волчанку, люпус-нефрит, саркоидоз, воспалительный артрит, включая юношеский артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит и подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, сверхострое, острое или хроническое отторжение и/или болезнь трансплантат против хозяина, рассеянный склероз, синдром гипер-1дЕ, нодозный полиартериит, первичный билиарный цирроз, воспалительное заболевание кишечники, болезнь Крона, глютеновую болезнь (глютен-чувствительная энтеропатия), аутоиммунный гепатит, пернициозную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродерму, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тироидит, болезнь Грейвса, тироидит Хашимото, болезнь иммунного комплекса, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (СРГО8), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболиз, кардиомиопатию, пузырчатку обыкновенную, легочный интерстициальный фиброз, сахарный диабет типа I и типа II, гиперчувствительность типа 1, 2, 3 и замедленного типа 4, аллергию или аллергические нарушения, нежелательные/непреднамеренные иммунные ответы на терапевтические белки (см., например, заявку на патент США 2002/0119151 и Когеп, и др., Сигг. РЬагт. Вю1есЬпо1. 3, 2002, сс. 349-360), астму, синдром Черджа-Штросса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и воспалительный контактный дерматит, крапивницу, 1дЕ-опосредуемую аллергию, атеросклероз, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическое заболевание, болезнь Альцгеймера, хроническую воспалительную демиелизирующую полиневропатию и т.п. В некоторых других вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения у пациентов легочного воспаления, включая (но, не ограничиваясь только ими) отторжение трансплантата легкого, астму, саркоидоз, эмфизему, муковисцидоз, идиопатический фиброз легкого, хронический бронхит, аллергический ринит и аллергические заболевания легкого, такие как аллергические пневмониты, эозинофильные пневмонии, облитерирующий бронхиолит, связанный с трансплантацией костного мозга и/или легкого или другими причинами, атеросклероз трансплантата/флебосклероз трансплантата, а также фиброзы легкого, являющиеся результатом заболеваний, связанных с коллагеном, сосудистых заболеваний и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и системная красная волчанка.
В других вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний, которые с самого начала являются устойчивыми и у которых развилась устойчивость к другим известным терапевтическим агентам, механизм действия которых отличается от модуляции опосредуемой СЭ40Ь передачи сигнала СЭ40, модуляции АЭСС или от обоих этих видов модуляции. Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения субпопуляций пациентов, для которых может оказаться желательным терапевтическое вмешательство с использованием одного или нескольких антагонистических антител к ί.Ό40, которые модулируют опосредуемую СЭ40Ь передачу сигнала СЭ40, модулируют АЭСС или модулируют оба вида активности.
Благоприятные действия, которые могут быть получены при введении фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, индивидууму с воспалительным заболеванием или аутоиммунным заболеванием, включают любой положительный терапевтический ответ, касающийся заболевания. Под положительным терапевтическим ответом в контексте аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания подразумевают улучшение состояния заболевания, обусловленное противовоспалительной активностью указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, и/или улучшение симптомов заболевания. Это означает наличие антипролиферативного действия, предупреждение дальнейшей пролиферации экспрессирующей СЭ40 клетки, уменьшение воспалительного ответа, который включает (но, не ограничиваясь только ими) пониженную секрецию воспалительных цитокинов, молекул адгезии, протеаз, иммуноглобулинов (например, в случае, когда несущая СЭ40 клетка представляет собой В-клетку), их комбинацию и т.п., повышение производства противовоспалительных белков, снижение количества аутореактивных клеток, повышение иммунной толерантности, ингибирование выживания аутореактивных клеток и/или снижение одного или нескольких симптомов, опосредуемых стимуляцией экспрессирующих СЭ40 клеток. Указанные положительные терапевтически ответы не зависят от пути введения и могут предусматривать введение донору, в ткань донора (например, путем перфузии органа), хозяину, любую их комбинацию и т.п.
Клинический ответ можно оценивать с помощью таких методов скрининга, как визуализация методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР-томография), радиографическая визуализация в рентгеновских лучах, компьютерная томография (КТ), проточная цитометрия или применение клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8), гистологические анализы, оценка макроскопической патологи и
- 34 018301 химический анализ крови, включая (но, не ограничиваясь только ими) анализы, предназначенные для оценки изменений, которые можно выявлять с помощью ЕЫ8А, РИА, хроматогрфии и т.п. Помимо указанных положительных терапевтических ответов, у пациента, подвергающегося терапии с использованием содержащей антагонистическое антитело к СЭ40 фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, может быть обнаружено благоприятное действие, связанное с улучшением симптомов, которые ассоциированы с заболеванием.
Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения и не направлены на его ограничение.
Экспериментальный раздел
СШК-12.12 представляет собой полностью гуманизированное человеческое моноклональное антитело к СЭ40 изотипа ΙβΟ1, которое получают в клетках СНО с помощью процесса культивирования. Молекула имеет молекулярную массу 150 кДа, и ее молекулярная структура включает две тяжелые цепи и две легкие цепи, сцепленные друг с другом с помощью дисульфидных мостиков. Мишенью СШК-12.12 является человеческий рецепторный белок СЭ40, находящийся на поверхности клеток. Оно является сильным антагонистом и ингибирует ш уйго опосредуемую лигандом СЭ40 пролиферацию здоровых Вклеток, а также ингибирует ш уйго опосредуемую лигандом СЭ40 пролиферацию раковых клеток, пациентов, страдающих NН^ и СЬЬ. Линия гибридомы 153.8Ε2.Ό10.Ό6.12.12 (СМСС №12056), экспрессирующая антитело СШК-12.12, была депонирована в Американской коллекции типовых культур [АТСС; 10801 ЬпАегкЦу ВЬб., Мапаккак, Ундина 20110-2209 (США)] 17 сентября 2003 под регистрационным номером для целей патентования РТА-5543.
Не вдаваясь в теорию, можно считать, что антитело СШК-12.12 представляет собой обладающее двойной активностью антагонистическое моноклональное антитело к СЭ40, которое имеет уникальную комбинацию характеристик. Это полностью человеческое моноклональное антитело блокирует опосредуемые СЬ40Ь пути передачи сигналов СЭ40, с которыми связаны выживание и пролиферация В-клеток; указанный антагонизм приводит в конце концов к гибели клетки. СШК-12.12 опосредует также распознавание и связывание эффекторными клетками, инициируя антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (АЭСС). После того как СШК-12.12 связывается с эффекторными клетками, высвобождаются цитолитические ферменты, что приводит к апоптозу В-клеток и их лизису.
Более подробное описание видов биологической активности СШК-12.12 и анализов, применяемых для их оценки, см. в предварительных заявках, которые озаглавлены Айадошк! Апб-СИ40 Мопос1опа1 АпбЬоб1ек апб Мебюбк £ог ТНеп Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданных 4 ноября 2003 г., 26 ноября 2003 г. и 27 апреля 2004 г., и переуступленных заявок на патент США 60/517337 (досье у патентного поверенного № РР20107.001 (035784/258442)), 60/525579 (досье у патентного поверенного № РР20107.002 (035784/271525)) и 60/565710 (досье у патентного поверенного № РР 20107.003 (035784/277214)) соответственно; и международной заявке на патент РСТ/И8 2004/037152 (досье у патентного поверенного № РР20107.004 (035784/282916)), которая озаглавлена также Айадошк! Апб-СП40 Мопос1опа1 АпбЬоб1ек апб Мебюбк £ог ТНен Ике (Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 и способы их применения), поданной 4 ноября 2004 г. и опубликованной как \У0 2005/044854; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Они описаны также в опубликованных международных заявках на патент \У0 2005/044304, \У0 2005/044305, \У0 2005/044306, \У0 2005/044855, \У0 2005/044307 и \У0 2005/044294; содержание каждой из которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Указанные анализы описаны также в описанные в предварительной заявке, озаглавленной Мебюбк £ог П1адпок1к апб Тгеа1теп1 о£ РгоНГегабуе Ькогбегк Меб1а1еб Ьу СЭ40 ЗщпаПпд, Способы диагностики и лечения пролиферативных заболеваний, опосредуемых передачей сигнала СИ40, поданной 9 декабря 2005 г., и переуступленной заявке на патент США 60/749285 (досье у патентного поверенного № РР028035.0002 (035784/304312)) и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И8 2006/019414 (досье у патентного поверенного № РР028035.0003 (035784/311611)), поданной 18 мая 2006 г. и опубликованной как \У0 2006/125143; и в предварительной заявке, озаглавленной Мебюбк £ог О|адпок1к апб Тгеа1шеп1 о£ Экеакек Наутд ап Аи1о1ттипе апб/ог [пПаттаЮгу СотропепГ, (Способы диагностики и лечения заболеваний, имеющих аутоиммунный и/или воспалительный компонент), поданной 9 декабря 2005 г., переуступленной заявке на патент США 60/749336 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0002 (035784/304311)), и соответствующей международной заявке на патент РСТ/И8 2006/019325 (досье у патентного поверенного №. РР028062.0003 (035784/311608)), поданной 18 мая 2006 г., и опубликованной как \У0 2006/125117; содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Основные клинические показания для применения СШК-12.12 включают лечение связанных с Вклетками злокачественных заболеваний, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ), множественную миелому (ММ) и не-ходжкинскую лимфому ЩНЬ), и аутоиммунные и/или воспалительные заболевания, ассоциированные с экспрессирующими СЭ40 клетками. Лекарственное средство на основе СШК-12.12, предназначенное для клинических исследований, представляет собой жидкую препаративную форму, содержащую 20 мг/мл антитела СШК-12.12. Приведенные ниже исследования проводили с
- 35 018301 целью определения оптимального буфера, придающего изотоничность агента и различных эксципиентов для стабилизации антитела в жидкой препаративной форме.
Пример 1. Влияние различных видов буферов и метионина на стабилизацию СН1Я-12.12.
Характеристики раствора (например, значение рН, виды буферов и ионная сила) и эксципиенты (например, поверхностно-активные вещества и стабилизаторы) представляют собой имеющие решающее значение факторы для стабильности белка в жидкой препаративной форме. Физико-химическая стабильность СН1Я-12.12 является оптимальной при рН 5,5. Однако белок СН1Я-12.12 может расщепляться в результате агрегации и фрагментации, если раствор имеет неоптимальные характеристики; он может также окисляться прежде всего в присутствии пероксидных примесей и/или следовых количеств металлов, введенных с неочищенными эксципиентами, такими как Твин. Описанные ниже эксперименты осуществляли для идентификации оптимальных видов буферов и соответствующих эксципиентов, предназначенных для стабилизации моноклонального антитела СН1Я-12.12, включенного в препаративную форму, с целью защиты от агрегации, фрагментации и окисления при оптимальном значении рН, составляющем 5,5.
Материалы
Партии содержащей СН1Я-12.12 лекарственной субстанции (Ό8) для опыта представляли собой полученные из СНО очищенные партии исходного продукта № СЭ021105Л и № ΡΌ010705Α. Партии Ό8 получали от фирмы Хота, Ь!б (Беркли, шт. Калифорния). Образцы препаративных форм для этого опыта получали путем диализа Ό8 в противотоке соответствующих буферных растворов с последующим введением требуемого количества Твин. Концентрация белка СН1Я-12.12 во всех образцах составляла примерно 20 мг/мл.
Аналитические методы
Гель-фильтрация (ГФ).
ГФ-ЖХВР позволяет выделять молекулы в порядке убывания молекулярной массы. Поэтому агрегаты СН1Я-12.12 должны элюироваться из ЖХВР-колонки первыми, затем должны элюироваться мономеры, а последними - фрагменты. Чистоту, агрегацию и фрагментацию СН1Я-12.12 анализировали с помощью ЖХВР-системы фирмы Аа!ет8 АШапсе на колонке типа ТокоЬаак Т8К-СЕБ 30008АХ1, используя 50 мМ фосфат натрия, 200 мМ №С1, рН 7,0 в качестве подвижной фазы при скорости потока 0,7 мл/мин.
Хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии (Н1С).
Окисление СН1Я-12.12 оценивали с помощью ЖХВР-системы фирмы Аа!ет8 АШапсе на колонке типа ТокоЬ Т8К СЕЬ бутил-№Я, используя 2М сульфат аммония/20мМ Трис, рН 7,0 в качестве подвижной фазы А и 20мМ Трис, рН 7,0 в качестве подвижной фазы Б при скорости потока 1,0 мл/мин. Антитело СН1Я-12.12 расщепляли папаином с получением ЕаЬ- и Ес-фрагментов. Продукты окисления СН1Я-
12.12 представляют собой окисленные Ес-фрагменты (те!8О), являющиеся пре-Ес-видами, которые элюиируются из ЖХВР-колонки между основными видами ЕаЬ и основными видами Ес.
Эксперименты и результаты
Стабилизирующее действие нитратного буфера в отношении агрегации и фрагментации.
На основе СН1Я-12.12 из партии Ό8 № ΡΌ010705Α приготавливали препаративную форму с концентрацией 20 мг/мл в 10 мМ цитратном, ацетатном, сукцинатном или фосфатном буферном растворе с добавлением 150 мМ №С1, 0,1% (мас./об.) Твин 80 и при рН 5,5. Образцы препаративных форм вносили в виде аликвот по 1,2 мл раствора в стеклянные пузырьки объемом 3 см3 и хранили при 5, 25 и 40°С. Стабильность в образцах СН1Я-12.12 анализировали в определенные моменты времени с помощью ГФ.
На фиг. 1-3 показы результаты ГФ-анализа чистоты, количества агрегатов и фрагментов соответственно в образцах, которые хранили при 25°С. На фиг. 4-6 обобщены результаты ГФ-анализа чистоты, количества агрегатов и фрагментов соответственно в образцах, которые хранили при 40°С. Все результаты свидетельствуют о том, что образцы препаративных форм на основе цитратного буфера сохранили наибольшую чистоту, и в них обнаружены самые низкие уровни агрегации и фрагментации среди всех 4 изученных препаративных форм. Хотя было выявлено небольшое изменение в образцах, которые хранились при 5°С в течение 5 месяцев (данные не представлены), результаты, полученные с помощью ГФанализа в условиях ускоренного хранения, позволяют сделать заключение о том, что цитратный буфер, по-видимому, превосходит три остальных обычно применяемых вида буферов с точки зрения удлинения стабильности в реальном времени СН1Я-12.12 в отношении агрегации и фрагментации.
Ингибирование нитратным буфером окисления СН1К-12.12
Для оценки стабильности СН1Я-12.12 приготавливали образцы в цитратном, ацетатном и сукцинатном буферах с добавлением 0,1 и 0,2% (мас./об.) Твин 80. Образцы хранили при 5, 25 и 40°С и анализировали с помощью хроматографии, основанной на гидрофобном взаимодействии (Н1С), в отношении окисления в предварительно определенные моменты времени. Количество окисленных продуктов СН1Я-
12.12 определяли в виде процента суммы пиков, выходящих перед пиками Ес, т.е. Пре-Ес%. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что в препаративной форме на основе цитратного буфера, образовывалось меньше продуктов окисления по сравнению с препаративными формами, в которые входили сукцинатный и ацетатные буферы, что свидетельствует о том, что цитратный буфер минимизирует окисление СН1Я-12.12. Эти результаты позволяют предположить, что цитратный буфер, веро
- 36 018301 ятно, служит к качестве хелатирующего агента, ингибируя индуцированное следовыми количествами металлов окисление белка СН1В-12.12.
Результаты ГФ- и Н1С-анализов свидетельствуют о том, что цитратный буфер превосходит сукцинатный, ацетатный и фосфатный буфер с позиций защиты СН1В-12.12 от агрегации и фрагментации. Цитратный буфер также превосходит сукцинатный и ацетатный буферы с позиций минимизации окисления белка СН1В-12.12.
Таблица 1. Воздействие видов буферов на окисление СН1В-12.12 (20 мг/мл) при оценке с помощью Н1С-анализа
Входящий в препаративную форму буфер с добавлением Твин 80 ЮмМ цитратный, 150мМ КаС!, рН 5,5 ЮмМ ацетатный, 150мМ №01, рН 5,5 ЮмМ сукцинатный, 150мМНаС1, рН 5,5
Концентрация Твин 80 Хранение Пре-Рс% Прс-Рс% Пре-Рс%
0,1% (мас./об.) 5&С, 5 мес. 0,0 0,0 0,0
25°С, 5 мес. 2,6 7,1 9,4
40°С, 3 мес. 5,6 Н/о * 13,5
0,2% (мас./об.) 5°С, 5 мес. 0,0 0,0 Н/о
5°С, 8 мес. 2,0 2,0 2,2
25°С, 5 мес. 3,0 10,7 11,5
25°С, 8 то 4,8 18,1 19,4
40°С, 3 то 7,7 Н/о 16,0
*н/о - не определяли.
Ингибирующее действие Ь-метионина на окисление СН1В-12.12.
Партию Ό8 № СЭ021105А включали в препаративную форму в концентрации 20 мг/мл в 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ ЫаС1, 0,1% Твин 80 или Твин 20, а также содержащую различные количества (0-5 мМ) Ь-метионина. Образцы препаративных форм вносили по 2,5 мл в пузырьки объемом 3 см3 и хранили при 40°С. В табл. 2 показаны результаты Н1С для образцов в начальный момент времени и после хранения при 40°С в течение 3 месяцев. В начальный момент времени окисление СН1В-12.12 во всех препаративных формах было сопоставимо с окислением в исходной партии лекарственной субстанции (Ό8) № СО 021105А. Степень окисления в препаративных формах без Ь-метионина повышались более чем в 2 раза после хранения при 40°С в течение 3 месяцев. Однако степень окисления в препаративных формах, содержащих Ь-метионин, практически не изменилась после хранения в течение 3 месяцев при 40°С.
Эти результаты свидетельствуют о том, что 5 мМ Ь-метионин обладал достаточной эффективностью в отношении предупреждения окисления СН1В-12.12 при хранении в условиях высокого стресса. Ингибирующее действие Ь-метионина в отношении окисления СН1В-12.12 подтверждали с помощью Ьус-пептидного картирования.
Таблица 2. Ингибирующее действие Ь-метионина в отношении окисления СН1В-12.12
Препаративные формы, содержащие 20 мг/мл СН1К12.12 Пре-Рс%
Время 0 3 мес. при 40°С
Исходная партия Э8 СН1К-12.12 № СО 021105А 1,7 н/о*
ЮмМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ ИаС1, 0,1% Твин-80, рН 5,5 1,6 4,2
ЮмМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ ИаС1, 0,1% Твин-80, 2мМ Еметионин, рН 5,5 1,6 1,6
ЮмМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ №С1, 0,1% Твин-20, рН 5,5 1,7 3,9
ЮмМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМКаС1, 0,1% Твин-20, 2мМ Ьметионин, рН 5,5 1,5 1,1
ЮмМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150μΜΝ8Ο1, 0,1% Твин-20, 5мМ Еметионин, рН 5,5 1,5 Ь2
*н/о - не определяли
- 37 018301
В целом, цитратный буфер минимизирует агрегацию, фрагментацию и окисление СН1К-12.12 и поэтому представляет собой оптимальный буфер для жидкой препаративной формы СН1К-12.12. Ьметионин эффективно ингибирует окисление СН1К-12.12, при этом 5 мМ Ь-метионин является предпочтительным.
Пример 2. Стабилизирующее действие аргинина-НС1 в отношении СН1К-12.12.
Целью приведенного ниже опыта был отбор придающего изотоничность агента и стабилизатора, способствующего стабильности при продолжительном хранении СН1К-12.12, включенного в жидкую фармацевтическую композицию, которая предназначена для введения путем внутривенной инфузии. Хотя №-1С1 наиболее широко применяют в качестве придающего изотоничность агента в белковых продуктах, предназначенных для парентерального введения, он может представлять собой не оптимальный агент для стабилизации терапевтических антител. В этом опыте получены данные о сравнительном стабилизирующем действии хлорида натрия и кислотной формы аргинина (аргинин-НС1) в отношении СН1К-12.12 в водной препаративной форме.
На основе антитела СН1К-12.12, используемого в качестве исходной лекарственной субстанции, приготавливали препаративную форму, содержащую цитратный буфер, рН 5,5, с добавление либо 150 мМ №С1, либо 150 мМ Ь-аргинин-НС1 для достижения требуемой осмоляльности 295 мОсм/кг в жидкой препаративной форме СН1К-12.12. Для оценки биофизической и/или биохимической стабильности антитела СН1К-12.12 применяли дифференциальную сканирующую калориметрию (И8С), гель-фильтрацию (ГФ-ЖХВР), ДСН-ПААГ и катионообменную ЖХВР (С1ЕХ-ЖХВР). В исследовании установлено, что 150 мМ Ь-аргинин-НС1 не только придавал изотоничность водной препаративной форме СН1К-12.12, но также повышал конформационную стабильность СН1К-12.12 в отношении агрегации, фрагментации и деамидирования. Установлено, что Ь-аргинин-НС1 превосходил по эффективности №-1С1 при определении стабильности в ускоренных условиях хранения. Кроме того, данные о стабильности в ускоренных условиях хранения позволяют предположить более длительный срок годности препаративной формы СН1К-12.12, содержащей Ь-аргинин-НС1.
Материалы
Исходная партия содержащей СН1К-12.12 лекарственной субстанции (Ό8), применяемая для опыта, представляла собой полученную из СНО очищенную партию № СЭ021105А. Партию Ό8 получали от фирмы Хота, Ь1б (Беркли, шт. Калифорния).
СН1К-12.12 из партии Ό8 применяли в виде следующих препаративных форм:
препаративная форма 1: 20 мг/мл СН1К-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ №С1, 0,1% Твин 80 и рН 5,5;
препаративная форма 2: 20 мг/мл СН1К-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150мМ Ь-аргинин-НС1, 0,1% Твин 80 и рН 5,5.
Аналитические методы
Дифференциальная сканирующая калориметрия (Э8С).
Конформационную стабильность образцов препаративных форм СН1К-12.12 оценивали с помощью М1сгоСа1 УР-Э8С при нагревании с 15°С до 90°С со скоростью 1°С/мин.
Гель-фильтрация (ТФ-ЖХВР).
Чистоту, агрегацию и фрагментацию СН1К-12.12 анализировали с помощью ЖХВР-системы фирмы \Уа1егк АШаисе на колонке типа ТокоНаак Т8К-6ЕЬ 30008^Х1, используя 50 мМ фосфат натрия, 200 мМ №С1, рН 7,0 в качестве подвижной фазы при скорости потока 0,7 мл/мин.
ДСН-ПААГ (в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях).
Чистоту СН1К-12.12 оценивали с использованием 12% Трис-глициновых гелей в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях. Белок выявляли окрашиванием кумассии бриллиантовым голубым.
Катионобменная хроматография (С1ЕХ-ЖХВР).
Связанное с изменением заряда деамидирование СН1К-12.12 оценивали с помощью ЖХВР-системы фирмы \Уа1егк АШаисе на колонке типа Июиех Ргорас ^СХ-10, используя 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,3 в качестве подвижной фазы А и 50 мМ НЕРЕ8, содержащий 500 мМ №С1, рН 7,3, в качестве подвижной фазы Б при скорости потока 0,8 мл/мин.
Ниже представлена расшифровка основных сокращений, используемых на чертежах и при описании приведенных ниже результатов:
сукцинат, №С1, 0,1% Тв80 = 10 мМ буфер на основе сукцината натрия/янтарной кислоты, 150 мМ №С1, 0,1% Твин 80, рН 5,5;
цитрат, №С1, 0,1% Тв80 = 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ №С1, 0,1% Твин 80, рН 5,5;
ацетат, №С1, 0,1% Тв80 = 10 мМ буфер на основе ацетата натрия/уксусной кислоты, 150 мМ №С1, 0,1% Твин 80, рН 5.5;
Фос, №С1, 0,1% Тв80 = 10 мМ буфер на основе вторичного кислого фосфата натрия/первичного кислого фосфата натрия, 150 мМ №С1, 0,1% Твин 80, рН 5,5;
цитрат, Агд, 0,1% Тв80 = 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ Ь
- 38 018301 аргинин-НС1, 0,1% Твин 80, рН 5,5.
Результаты
Дифференциальная сканирующая калориметрия (Ό8Ο).
На фиг. 7 показаны О8С-термограммы двух препаративных форм СНТВ 12.12, описанных выше в разделе Материалы. Терморазворачивание СШВ-12.12 характеризуется наличием по меньшей мере двух термопереходов, по-видимому, обусловленных разворачиванием/плавлением ЕаЬ- и Ес-фрагментов соответственно. При более высокой температуре белки преимущественно находятся в агрегированном состоянии, что приводит к снижению О8С-сигнала. В этом исследовании наименьшую температуру термоперехода определяли как температуру плавления, Тт. Препаративная форма, содержащая Ь-аргининНС1, обладала более высокой Тт, чем препаративная форма, содержащая ЫаС1, это позволяет предположить, что Ь-аргинин-НС1 придает СШВ-12.12 более высокую конформационную стабильность, чем ЫаС1.
Г Ф-ЖХВР-анализ.
После инкубации при 5°С в течение 6 месяцев с использованием ГФ-ЖХВР обнаружены незначительные количества агрегатов и фрагментов белка (< 0,5%) в препаративных формах, содержащих Ьаргинин-НС1, и в препаративных формах, содержащих ЫаС1, и не обнаружено существенных различий в стабильности между двумя препаративными формами (данные не представлены). При оценке стабильности в ускоренных условиях хранения, т.е. при 25°С в течение 6 месяцев, в содержащей Ь-аргинин-НС1 препаративной форме, обнаружено более высокое процентное содержание мономеров, что видно из фиг. 8. Благодаря высокому содержанию мономеров количество как агрегатов, так и фрагментов увеличивалось в процессе хранения медленно. Однако в содержащей Ь-аргинин-НС1 препаративной форме в целом образовывалось меньше агрегатов и фрагментов, чем в содержащей ЫаС1 препаративной форме, что видно из фиг. 9 и 10 соответственно. Аналогично этому при хранении при 40°С в содержащей Ь-аргининНС1 препаративной форме обнаружено более высокое процентное содержание мономеров и более низкое процентное содержание агрегатов и фрагментов по сравнению с содержащей ЫаС1 препаративной формой, что видно из фиг. 11, 12 и 13 соответственно. При хранении при 40°С в течение 4 месяцев в содержащей Ь-аргинин-НС1 препаративной форме сохранилось 91,8% мономеров и было обнаружено 1,7% агрегатов и 6,5% фрагментов, в то время как в содержащей ЫаС1 препаративной форме обнаружено 87,9% мономеров, 2,2% агрегатов и 9,9% фрагментов. Полученные с помощью ГФ-ЖХВР результаты демонстрируют, что Ь-аргинин-НС1 повышает стабильность белка СНШ-12.12 по сравнению с ЫаС1.
ДСН-ПААГ (в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях)
В табл. 3 представлены результаты, полученные с помощью ДСН-ПААГ-анализа препаративной формы, содержащей Ь-аргинин-НС1, и препаративной формы, содержащей ЫаС1, в невосстанавливающих (ΝΒ) и восстанавливающих (В) условиях. Чистоту СНГВ-12.12 оценивали по процентному содержанию основной полосы в невосстанавливающих условиях или проценту суммы полос, соответствующих тяжелым и легким цепям, в восстанавливающих условиях. За исключением момента времени 0, чистота содержащей Ь-аргинин-НС1 препаративной формы оказалось более высокой по сравнению с чистотой содержащей ЫаС1 препаративной формы как в невосстанавливающих, так и в восстанавливающих условиях. Полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты согласуются с полученными с помощью ГФЖХВР результатами, которые свидетельствуют о том, что Ь-аргинин-НС1 повышает стабильность СНГВ-
12.12 по сравнению с ЫаС1.
Таблица 3. Сравнение Ь-аргинин-НС1 и ЫаС1 с помощью ДСН-ПААГ-анализа
Препаративная форма, содержащая 20 мг/мл С НГК- 12.12 т=о 4 мес. при 25°С 4 мес. при 40°С 6 мес. при 25°С
к ΝΚ К ΝΚ К ΝΚ К ΝΚ
% н+ь % ОСНОВНОЙ полосы % Н+Ь % основной полосы % Н+Ь % ОСНОВНОЙ полосы % Н+Ь % основной полосы
Цитратный, ЦаС1, 0,1% Твин «0, рН 5,5 98,6 85,0 97,2 82,5 91,1 72,1 96,6 76,2
Цитратный, Ь-аг§НС1, 0,1% Твин 80, рН 5,5 98,8 85,0 97,4 83,1 91,3 76,2 97,6 78,9
СШХ-ЖХВР-анализ.
СГЕХ-ЖХВР позволяет разделять молекулы на основе заряда, в результате кислотные варианты элюируются перед основными пиками, а основные варианты элюируются после основных пиков. Чистоту СНГВ-12.12 и содержание продуктов его деамидирования оценивали в виде процента основного пика и процента кислотных вариантов соответственно.
На фиг. 14-16 показана чистота, содержание продуктов деамидирования и содержание основных вариантов соответственно для двух препаративных форм. В момент времени 0 чистота обеих препаративных форм составляла 68,6%, а содержание деамидированных продуктов - 15,5%, и содержание основ
- 39 018301 ных вариантов - 15,9%. При хранении при 25°С содержащая Ь-аргинин-НС1 препаративая форма сохранила более высокую чистоту и более высокое содержание основных вариантов, и она содержала меньший процент продуктов деамидирования по сравнению с содержащей №1С1 препаративной формой. При хранении при 25°С в течение 6 месяцев содержащая Ь-аргинин-НС1 препаративная форма имела чистоту 47,3%, содержала 12,5% основных вариантов и в ней образовалось 40,0% продуктов деамидирования, в то время как содержащая №С1 препаративная форма имела чистоту 45,6%, содержала 11,7% основных вариантов и 42,7% продуктов деамидирования. Хотя и в содержащей Ь-аргинин-НС1, и в содержащей №1С1 препаративных формах обнаружены небольшие изменения при хранении в течение 6 месяцев при 5°С, результаты, полученные с помощью С1ЕХ-ЖХВР, при ускоренных условиях хранения (25°С), позволяют предположить, что Ь-аргинин-НС1, вероятно, превосходит ЫаС1 с позиций более продолжительной стабильности в реальном времени СН1В-12.12, обеспечивая защиту от деамидирования.
В целом это исследование демонстрирует, что 150 мМ Ь-аргинин-НС1 не только придает изотоничность жидкой препаративной форме СН1В-12.12, но повышает также конформационную стабильность СН1В-12.12, защищая от агрегации, фрагментации и деамидирования. Ь-аргинин-НС1 превосходит ЫаС1 при оценке стабильности в ускоренных условиях хранения, и данные о стабильности в ускоренных условиях хранения позволяют предположить также, что он позволяет удлинять срок годности препаративной формы СН1В-12.12, содержащей Ь-аргинин-НС1.
Пример 3. Воздействие Твин 80 и Твин 20 на минимизацию агрегации исходной лекарственной субстанции СН1В-12.12 при хранении в замороженном состоянии.
Хранение исходной лекарственной субстанции СН1В-12.12 в замороженном состоянии является предпочтительным по сравнению с хранением в жидком состоянии по некоторым причинам, таким как более высокая стабильность и срок годности продукта, пониженный рост микроорганизмов, а также устранение пенообразования в процессе транспортировки. Однако замораживание и последующее оттаивание может индуцировать стресс в белковом растворе в результате интродукции поверхностей раздела лед-жидкость и градиента концентрации растворенных веществ. Стресс может вызывать денатурацию и приводить к агрегации и в наихудших случаях к образованию или осаждению видимых частиц. Поскольку образование агрегатов белка часто ассоциировано с пониженной эффективностью лекарственного средства и повышенной иммуногенностью, то минимизация агрегации путем оптимизации компонентов белковой препаративной формы и условий замораживания-оттаивания является очень важной.
Состав эксципиентов, таких как сахара, многоатомные спирты, аминокислоты и поверхностноактивные вещества, может стабилизировать белки и антитела, защищая их от агрегации. В одном из исследований моноклонального антитела было установлено, что некоторые общепринятые сахара, многоатомные спирты и аминокислоты являются более эффективными, чем поверхностно-активные вещества с позиций запускаемой процессом замораживания-оттаивания агрегации. Однако в проведенных ранее исследованиях с использованием СН1В-12.12 установлено, что применение только сахара (например, трегалозы), многоатомного спирта (например, сорбита) или аминокислоты (например, глицина) не снижало существенно агрегацию СН1В-12.12 в процессе замораживания и оттаивания.
Настоящее исследование сфокусировано на создании составов, предназначенных для минимизации агрегации СН1В-12.12 в процессе замораживания и оттаивания. При этом оценивали различные поверхностно-активные вещества в отношении их способности минимизировать индуцируемую замораживанием-оттаиванием агрегацию СН1В-12.12. Хотя маловероятно, что после быстрого замораживания лекарственной субстанции СН1В-12.12 она должна подвергаться нескольким циклам замораживания-оттаивания, что было изучено в этом опыте, обширные исследования стресса, связанного с замораживаниемоттаиванием, представляют собой модель наихудшего варианта, которую применяют для предсказания способности входящей в препаративную форму исходной лекарственной субстанции образовывать агрегаты при нескольких циклах замораживания и оттаивания, что может непреднамеренно происходить при длительном хранении и транспортировке.
Материалы
В этом опыте использовали следующие партии исходной Ό8 СН1В-12.12: № ИЛ7870, № ТС23-2, № ИВ 1291, № Р0010705А и № С0083005А. Твин 80, Твин 20, Вту 35 и Р1итошс Ε68 получали от фирм 81дта, 1Т. Вакег, Л1£а Аееаг и МеШаТесН Се11дго соответственно. Поликарбонатные (ПК) флаконы для хранения в замороженном состоянии лекарственной субстанции СН1В-12.12 покупали у фирмы Ыа1депе.
Методы
За исключение контрольных образцов все другие образцы подвергали нескольким циклам полного замораживания при температуре -20°С или -60°С с последующим полным оттаиванием при температуре окружающей среды.
Применяли три аналитических метода для выявления белка СН1В-12.12 в состоянии от мономерного до образования видимых агрегатов. Визуальную оценку поводили с использованием световой технологии Тупйа1 (фирма М.\У. Тес11по1ощее, 1пс.) для выявления видимых частиц. Жидкостную систему для подсчета частиц (Ыс.|шй РагЦс1е Соипйпд 8уе1ет) (Н1АС/Воусо) использовали для подсчета агрегатов, не видимых невооруженным глазом, >10 мкм и >25 мкм. Анализатор динамического рассеяния света (фирма Макет Ыапо 8епее) применяли для определения гидродинамических диаметров мономеров и агрега
- 40 018301 тов и распределения размера частиц.
Оценка видимых частиц
Образцы для опыта по замораживанию-оттаиванию приготавливали с использованием партий лекарственной субстанции СН1В-12.12 №ИА7870 и № ТС23-2. Все образцы приготавливали в 10 мМ буфере на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ №С1, и использовали буферный раствор со значением рН 5,5 для диализа, после чего добавляли в различных количествах (0-0,5% (мас./об.)) одно из следующих неионогенных поверхностно-активных веществ: Твин 80, Твин 20, Вту 35 и Р1игошс Р68. Аликвоты каждого образца по 2,5 мл вносили в стеклянные пузырьки и подвергали вплоть до 8 циклов замораживания в течение ночи при -60°С и полного оттаивания при температуре окружающей среды. Образцы в начальный момент времени (момент времени 0) и после каждого цикла замораживанияоттаивания визуально обследовали в отношении прозрачности и наличия видимого осадка/агрегатов.
Подсчет не видимых невооруженным глазом частиц
Партии лекарственной субстанции СН1В-12.12 № ИВ 1291 и №РБ010705А приготавливали в растворе (20 мг/мл СН1В-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ №С1, рН 5,5), затем добавляли 0-0,5% (мас./об.) Твин 80 или Твин 20. Аликвоты образцов препаративных форм по 20 мл вносили в поликарбонатные флаконы объемом 125 см3 и подвергали замораживанию при -60°С и оттаиванию при температуре окружающей среды. После 5 циклов замораживания-оттаивания в образцах выявляли агрегаты, не видимые невооруженным глазом, размером >10 мкм и >25 мкм, с помощью жидкостной системы для подсчета частиц типа Н1АС-Воусо.
Анализ методом динамического рассеяния света
До и после 5 циклов замораживания-оттаивания в препаративных формах (20 мг/мл СН1В-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ Ь-аргинин-НС1, 5 мМ Ь-метионин, 00,2% Твин 20, рН 5.5) оценивали образование агрегатов с помощью анализатора динамического рассеяния света.
Динамическая спектроскопия рассеяния света (БЬ8) позволяет рассчитывать гидродинамический диаметр частиц, в том числе мономеров и агрегатов, на основе рассчитанного коэффициента диффузии частиц с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна и предположения, что частицы являются сферическими. С помощью БЬ8 определяли также количество агрегатов различных видов и полидисперсность.
Результаты
Оценка видимых частиц
В табл. 4 обобщены результаты визуального обследования. В момент времени 0, т.е. до начала циклов замораживания-оттаивания, во всех образцах обнаружена легкая опалесценция без видимых агрегатов/осадка. После одного цикла замораживания-оттаивания образовалось некоторое количество видимых агрегатов/осадка во всех препаративных формах, в которые не добавляли поверхностно-активное вещество, в препаративных формах, содержащих 0-0,05% (мас./об.) Твин 80, и в препаративных формах, содержащих 0-0,1% (мас./об.) Вту 35, а также в образцах, содержащих 0-0,5% (мас./об.) Р1итошс Р68. В образцах, содержащих 0,05%-0,5% (мас./об.) Твин 20 не обнаружено ни агрегатов, ни осадка в течение 8 циклов замораживания-оттаивания. Это позволяет предположить, что Твин 20 более эффективен, чем Твин 80 в отношении предупреждения образования крупных нерастворимых агрегатов в процессе нескольких циклов замораживания-оттаивания. Вту 35 и Р1игошс Р68 обладали более низкой эффективностью, чем Твин 80 и Твин 20.
Таблица 4. Визуальная оценка СН1В-12.12 в забуференных цитратом препаративных формах с различными концентрациями поверхностно-активного вещества
Препаративная форма, содержащая 20 мг/мл СН1К-12.12, ЮмМ буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, 150мМ МаС1, Твин 80, рН 5,5
Конц. Твин 80 (мас./об.) Т=0 1ХРТ* 2ХРТ 4ХРТ 5ХРТ 6ХРТ 8ХРТ
0% 80 80, несколько рр( 80, ρρί 80, ρρί 80, ρρί 80, ρρί 80, ρρί
0,05% 80 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, ρρί 80, РР* 80, ρρί 80, ρρί
0,10% 80 80 80 50, несколько 80, несколько ЕЕ! 80, несколько ЕЕ! 80, несколько РР*
- 41 018301
0,20% 80 80 80 80 80, несколько РР» 80, несколько РР» 50, несколько РР»
0,50% 50 50 50 50 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР»
Препаративная форма, содержащая 20 мг/мл СН1К-12.12, ЮмМ буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, 150мМ ΝβΟ, Твин 20, рН 5,5
Конц. Твин 20. (мас./об.) Т=0 1ХГТ 2ХГТ 4ХЕТ 5ХГТ 6ХЕТ 8ХЕТ
0% 80 80, несколько РР» 50, несколько РР» 50, ρρΐ 80. ,ρρΐ 80, ρρΐ 80, ρρΐ
0,01% 80 50 50 50 50, несколько РР» 80, несколько РР» 50, рр»
0,05% 80 80 50 80 80 80 80
0,10% 80 80 80 50 80 80 80
0,20% 80 80 50 50 50 80 50
0,50% 50 80 50 80 50 80 80
Препаративная форма, содержащая 20 мг/мл СН1К.-12.12, ЮмМ буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, 150мМ ЦаС1, Вп| 35, рН 5,5
Конц. Вгу 35 (мас./об.) Т=0 1ХЕТ 2ХЕТ 4ХГТ 5 ХЕТ 6ХГТ 8ХГТ
0% 80 80, ррС 80, рр» 80, рр» 80, рр» 80, рр» 80, рр!
0,01% 50 80, несколько РР» 80, несколько РР» 50, несколько РР» 50, несколько РР» 80, несколько рр» 80, несколько РР»
0,10% 50 50, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР»
0,20% 80 50 50 50 80 80, несколько РР» 80, несколько РР»
0,50% 80 80 80 80 80 80, несколько .ГР» . 80, несколько РР»
Препаративная форма, содержащая 20 мг/мл СН1К-12Л2, ЮмМ буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, 150мМ ИаС1, РЬготс Р68, рН 5,5
Конц.. Е68. (мас./об.) Т=0 1ХРТ 2ХЕТ 4ХЕТ 5ХГТ 6ХГТ 8ХЕТ
0% 80 80, рр! £0, ρρΐ 80, ρρΐ 50, рр» 80, ρρΐ 80, рр(
0,01% 80 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР»
0,10% 80 50, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР»
0,20% 50 50, несколько РР» 50, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР»
0,50% 80 80, несколько РР» 80, несколько РР» 80, несколько РР» 50, несколько РР» 50, несколько -ЕР-».. 50, несколько РР»
Обозначения: ХРТ= количество циклов замораживания-оттаивания;
= легкая опалесценция;
рр( = осадок/агрегат.
Подсчет не видимых невооруженным глазом частиц
В табл. 5 представлены данные о количестве не видимых невооруженным глазом агрегатов на мл забуференных цитратом/лимонной кислотой препаративных форм, содержащих различные концентрации Твин 80. Понижательная тенденция касательно количества не видимых невооруженным глазом частиц была обнаружена при возрастании концентрации Твин 80; снижение количества не видимых невооруженным глазом частиц было умеренным при концентрации Твин 80, превышающей 0,1% (мас./об.), что позволяет предположить, что приемлемая концентрация, в которой следует применять Твин 80, составляет 0,1-0,2% (мас./об.).
- 42 018301
Таблица 5. Количество не видимых невооруженным глазом частиц в композициях, содержащих 20 мг/мл СН1К-12.12, 10мМ буфер на основе цитрата натрия /лимонной кислоты, 150 мМ ЫаС1 и различные концентрации (0-0,2% (мас./об.)) Твин 80, рН 5,5.
Концентрация Твин 80, % (мас./об.) Количество не видимых невооруженным глазом частиц/мл после 5 циклов замораживания-оттаивания
> 10 мкм > 25 мкм
0% Твин 80 1439 23
0,05% Твин 80 148 3
0,10% Твин 80 44 1
0,20% Твин 80 39 1
В табл. 6 представлены данные о количестве не видимых невооруженным глазом агрегатов на мл забуференных цитратом/лимонной кислотой препаративных форм, содержащих Твин 20 или без него. Количество агрегатов резко снижалось при добавлении Твин 20 в препаративную форму. Когда концентрация Твин 20 составляла 0,05% (мас./об.) и выше, снижение количества не видимых невооруженным глазом агрегатов практически достигало плато, что позволяет предположить, что приемлемая концентрация, в которой следует применять Твин 20, составляла 0,05-0,2% (мас./об.).
Таблица 6. Количество не видимых невооруженным глазом частиц в композициях, содержащих 20 мг/мл СН1К-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ ЫаС1 и различные концентрации (0-0,2% (мае/об.)) Твин 20, рН 5,5
Концентрация Твин 20, % (мас./об. Количество не видимых невооруженным глазом частиц/мл после 5 циклов замораживания-оттаивания
> 10 мкм > 10 мкм
0% Твин 20 1671 41
0,01% Твин 20 46 2
0,05% Твин 20 32 3
0,1% Твин 20 И 1
0,2% Твин 20 25 1
Кроме того, из табл. 5 и 6 видно, что в препаративных формах, содержащих как Твин 80, так и Твин 20, образуется очень немного агрегатов размером >25 мкм, в содержащей Твин 20 препаративной форме образуется меньше агрегатов размером >10 мкм, чем в препаративной форме, содержащей Твин 80, после 5 циклов замораживания-оттаивания. Этот результат свидетельствует о том, что Твин 20 является более эффективным, чем Твин 80, в отношении минимизации образования не видимых невооруженным глазом агрегатов в забуференной цитратом/лимонной кислотой препаративной формы СН1К-12.12.
На основе результатов, представленных в табл.4-6, можно сделать заключение, что Твин-20 представляет собой более предпочтительный по сравнению с Твин 80 эксципиент с позиций минимизации образования агрегатов в препаративных формах СН1К-12.12. Поэтому были проведены дополнительные исследования с целью дальнейшей оптимизации концентраций Твин-20, необходимых для предотвращения образования агрегатов в препаративных формах СН1Р-12.12. Препаративные формы (20 мг/мл СН1К12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ Ь-аргинин-НС1, 5 мМ Ьметионин, 0-0,2% Твин 20, рН 5,5) получали из партии лекарственной субстанции СН1К-12.12 № СЭ083005А. Образцы препаративных форм по 20 мл вносили в поликарбонатные флаконы объемом 125 см3 и подвергали замораживанию при -20°С и оттаиванию при температуре окружающей среды. До и после пяти циклов замораживания-оттаивания в образцах препаративных форм определяли количество не видимых невооруженным глазом частиц с помощью жидкостного счетчика частиц типа Н1АС-Яоусо. Результаты обобщены в табл. 7.
Табл. 7. Количество не видимых невооруженным глазом частиц в композициях, содержащих 20 мг/мл СН1К-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ Ь-аргинин-НС1, 5 мМ Ь-метионин, 0-0,2% Твин 20, рН 5,5.
Концентрация Твин 20 (мас./об.) Количество частиц размером >10 мкм/мл Количество частиц размером >25 мкм/мл
ДоРТ После 5хГТ* ДоРТ После 5хрТ
0% Твин 20 23 169 7 5
0,005% Твин 20 4 24 0 2
0,025% Твин 20 5 6 1 1
0,05% Твин 20 2 9 0 1
0,1% Твин 20 6 7 1 1
0,2% Твин 20 10 64 1 5
* Обозначения: ХРТ= количество циклов замораживания-оттаивания
После 5 циклов замораживания-оттаивания в образцах, содержащих Ь-аргинин-НС1 и Ь-метионин, образовывалось существенно меньше агрегатов, чем в препаративной форме без Ь-аргинина-НС1 и Ь- 43 018301 метионина, т.е. 169 частиц/мл размером > 10 мкм относительно 1439 частиц/мл или 1671 частиц/мл размером > 10 мкм в отсутствии Твин 20 (см. табл. 6 и 7). Однако до введения Твин 20 присутствие Ьаргинина-НС1 и Ь-метионина не снижало существенно до минимального уровня индуцированное замораживанием-оттаиванием образование агрегатов. Это позволяет предположить, что Ь-аргинин-НС1 и Ьметионин не обладают достаточной эффективностью в отношении минимизации индуцированного замораживанием-оттаиванием образования агрегатов СН1К-12.12.
Из данных, приведенных в таблицах 5-7, видно, что количество не видимых невооруженным глазом агрегатов в подвергнутых замораживанию-оттаиванию образцах, которые содержат 0,025-0,1% (мас./об.) Твин 20, оставалось на уровне, сопоставимом с уровнем в соответствующих образцах до циклов замораживания-оттаивания. Эти результаты свидетельствуют о том, что в препаративных формах, которые содержат Твин 20 в сочетании с Ь-аргинином-НС1 и Ь-метионином, образуется минимальное количество не видимых невооруженным глазом агрегатов. Таким образом, Твин 20 представляет собой эксципиент в препаративной форме, который эффективно минимизирует образование не видимых невооруженным глазом агрегатов СН1К-12.12 в процессе замораживания и оттаивания. Установлено, что эффективная концентрация Твин 20 составляла 0,025-0,1% (мас./об.).
Анализ методом динамического рассеяния света
В табл. 8 представлен средний гидродинамический диаметр частиц, полидисперсность и интенсивность (в %) мономерных видов СН1К-12.12. Анализ динамического рассеяния света позволяет выявить только мономерные виды среди всех других видов до и после 5 циклов замораживания-оттаивания, о чем свидетельствует интенсивность мономерных видов на уровне 100%. Это позволяет предположить, что все образцы состояли в основном из мономеров. После 5 циклов замораживания-оттаивания установлено, что небольшое количество агрегатов (вероятно димеров или тримеров) может находиться в сочетании с мономерами в образцах, не содержащих Твин 20, и содержащих 0,005% (мас./об.) Твин 20, о чем свидетельствует увеличение гидродинамического диаметра и полидисперсности. В образах, содержащих 0,025-0,1% (мас./об.) Твин 20 обнаружено небольшое изменение гидродинамического диаметра и уровня полидисперсности, что свидетельствует о сохранении в них первоначальных уровней мономеров без существенного образования агрегатов.
Таблица 8. Анализ динамического рассеяния света СН1К-12.12 до и после 5 циклов замораживанияоттаивания препаративной формы, содержащей 20 мг/мл СН1К-12.12, 10 мМ буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты, 150 мМ Ь-аргинин-НС1, 5 мМ Ь-метионин и различные концентрации (00,2%) Твин 20, рН 5,5
Концентрация Твин 20, % (мас./об.) Средний гидродинамический диаметр (мм) Полидисперсность Интенсивность (В %) мономерных видов
До ГТ* После 5*ГТ * До ГТ После 5*ГТ До ГТ После 5*ГТ
0% Твин 20 12,2 12,4 0,047 0,055 100,0 100,0
0,005% Твин 20 12,2 12,4 0,045 0,045 100,0 100,0
0,025% Твин 20 12,3 12,4 0,035 0,034 100,0 100,0
0,05% Твин 20 12,3 12,2 0,035 0,031 100,0 100,0
0,1% Твин 20 12,4 12,4 0,035 0,039 100,0 100,0
0,2% Твин 20 12,3 12,2 0,036 0,043 100,0 100,0
Обозначения: ЕТ = замораживание-оттаивание; ХЕТ= количество циклов замораживания-оттаивания.
На основе данных, полученных при визуальном обследовании, оценке количества не видимых невооруженным глазом частиц и результатов анализа динамического рассеяния света, установлено, что оптимальная концентрация Твин 20 для минимизации индуцированной замораживанием-оттаиванием агрегации СН1К-12.12 составляет 0,025-0,1% (мас./об).
В целом установлено, что и Твин 20, и Твин 80 минимизирует агрегацию СН1К-12.12 в процессе замораживания и оттаивания. Оптимальные концентрации Твин 20 и Твин 80 составляют 0,025-0,1% (мас./об.) и 0,1-0,2 (мас./об. %) соответственно. Твин 20 является более эффективным, чем Твин 80, поскольку более низкая концентрация Твин 20 снижает количество и степень образования агрегатов до более низкого уровня. В этом исследовании продемонстрировано, что добавление Твин в оптимальной концентрации, предпочтительно в сочетании с Ь-аргинином-НС1 и Ь-метионином, позволяет хранить забуференную цитратом/уксусной кислотой исходную лекарственную субстанцию СН1К-12.12 при -20°С или при более низких температурах без образования существенного количество агрегатов.
Пример 4. Анализ антагонистической активности антител к СИ40.
Следующие анализы можно применять для оценки антагонистической активности антитела к СИ40. Для этих анализов человеческие В-клетки можно получать, например, путем выделения из миндалин
- 44 018301 после тонзиллэктомии индивидуума, следуя в целом, согласно методу, описанному у Эе Сгоо! и др., ЬутрЬокте ЕекеагсЬ, 9, 1991, с. 321. В целом метод состоит в следующем: ткань измельчают с помощью скальпель-бритвы, уменьшают количество фагоцитов и ΝΚ-клеток обработкой 5мМ метиловым эфиром Ь-лейцина и Т-клетки удаляют путем одного цикла образования розеток с бараньими эритроцитами (8ЕВС), обработанными бромидом 2-аминоэтилизотиоурония. Чистоту полученных препаратов Влимфоцитов можно оценивать путем непрямого иммунофлуоресцентного мечения с использованием МАт к СЭ20 В1 (фирма СоиНег С1опе, Хиале, шт. Флорида) или МАт к СЭ3 ОКТ3 (фирма ОпНо, Раритан, шт. Нью-Джерси) и конъюгированного с ФИТЦ Е(аЬ')2-фрагмента кроличьего антитела к мышиному 1д (фирма 2утеб, Сан-Франциско, шт. Калифорния) и ЕАС8-анализа.
Анализ В-клеточной пролиферации.
В-клетки (4х104 на лунку) культивировали в 200 мкл среды ΙΜΌΜ, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки в плоскодонных 96-луночных титрационных микропланшетах. В-клетки стимулировали, добавляя иммобилизованные антитела к 1дМ (1ттипоЬеаб8; 5 мкг/мл; фирма ВюЕаб, Ричмонд, шт. Калифорния). При необходимости добавляли 100 ед./мл рекомбинантного 1Ь-2. Добавляли различные концентрации тестируемых моноклональных антител (МАт) к исходным микрокультурам и оценивали пролиферацию в день 3 путем измерения включения (3Н)-тимидина после 18-часовой обработки.
Антагонистическое антитело к ί.Ό40 не должно существенно костимулировать В-клеточную пролиферацию в присутствии иммобилизованного антитела к 1дМ или в присутствии иммобилизованного антитела к 1дМ и 1Ь-2.
Анализ В-клеточной пролиферации с помощью анализа, аналогичного предложенному ВапсЬегеаи.
Для оценки способности моноклональных антител к ί.Ό40 стимулировать В-клеточную пролиферацию в культуральной системе, аналогичной описанной у ВапсЬегеаи и др., 8с1епсе, 251, 1991, с. 70, использовали мышиные трансфектированные 3Т6-клетки, экспрессирующие аллельную форму НЕ человеческого Ес уЕП- В-клетки (2 х 104 на лунку) культивировали в плоскодонных микролуночных планшетах в присутствии 1 х 104 трансфектированных клеток (облученных 5000 рад) в 200 мкл среды 1М0М, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 100 ед./мл рекомбинантного 1Ь-4. Перед добавлением В-клеток 3Т6-клеткам давали прикрепиться к пластику культурального планшета по меньшей мере в течение 5 ч. Добавляли МАт к ί.Ό40 в концентрациях от 15 нг/мл до 2000 нг/мл и В-клеточную пролиферацию оценивали, измеряя включение тимидина в день 7 после 18-часовой обработки [3Н]-тимидином.
Ингибирование стимулированной 82С6 В-клеточной пролиферации с использованием антагонистических МАт к СЭ40.
Антагонистические моноклональные антитела к СЭ40 (МАт) можно характеризовать также по их способности ингибировать стимуляцию В-клеточной пролиферации антителом к ί.Ό40, таким как 82С6 (которое называют также 8ΟΝ-14, которое, как известно, является агонистом стимуляции СЭ40 пролиферации здоровых В-клеток; Егапсщсо и др., Сапсег Ее§. 60, 2000, сс. 3225-3231), что установлено с помощью описанного выше анализа В-клеточной пролиферации. Человеческие В-клетки из миндалин (4 х 104 на лунку) культивировали в 200 мкл среды в микролунках в присутствии антитела к 1дМ, сшитого с сефарозными гранулами (5 мкг/мл), и МАт к ί.Ό40 82С6 (1,25 мкг/мл). Добавляли различные концентрации представляющего интерес МАт к ί.Ό40 и оценивали включение [3Н]-тимидина через 3 дня. В качестве контроля можно добавлять МАт к глюкоцереброзидазе 8Е4 в аналогичных концентрациях (Вагпеуе1б и др., Еиг. 1. ВюсНет. 134, 1983, с. 585). Антагонистическое антитело к СЭ40 может ингибировать костимуляцию МАт 82С6 индуцированной антителом к 1дМ пролиферации человеческих В-клеток, например, по меньшей мере на 75% или более (т.е. стимулируемая 82С6 пролиферация в присутствии антагонистического антитела к ί.Ό40 составляет не более 25% от пролиферации в отсутствии антагонистического антитела к ί.Ό40). В противоположность этому никакого существенного ингибирования не обнаружено при использовании эквивалентных количеств неспецифического МАт 8Е4, мишенью которого является β-глюкоцереброзидаза (Вагпеуе1б и др., выше). Такие результаты могут свидетельствовать о том, что МАт к ί.Ό40 не могут передавать сигналы, симулирующие пролиферацию человеческих Вклеток, а, наоборот, могут ингибировать стимулирующие сигналы, вызываемые стимуляцией СЭ40 другими МАт.
Анализ В-клеточной активации с помощью ЕЬ4В5-клеток 2иЬ1ег с соавторами (1. 1ттипо1. 134, 1985, с. 3662) установили, что мутантный субклон линии мышиной тимомы ЕЬ-4, обозначенный как ЕЬ4В5, может оказывать сильное стимулирующее действие на В-клетки как мышиного, так и человеческого происхождения, в отношении их пролиферации и дифференцировки в секретирующие иммуноглобулины плазматические клетки ш у11го. Установлено, что эта активация не зависит от антигена и не ограничена ГКГ. Для оптимальной стимуляции человеческих В-клеток необходимо присутствии супернатанта активированных человеческих Т-клеток, но В-клеточный ответ может происходить также, когда ЕЬ4В5-клетки предварительно активировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) или 1Ь-1 ЩиЫег и др., 1ттипо1одюа1 Ееу1ете 99, 1987, с. 281; и Ζΐιηπβ и др., 1. 1ттипо1. 144, 1990, с. 2955). В-клеточная активация в этой культуральной системе является эффективной - эксперименты с использованием ограниченного разведения продемонстрировали, что основная часть В-клеток оказалась активированной в
- 45 018301 отношении пролиферации и дифференцировки в секретирующие иммуноглобулины плазматические клетки (Аеп и др., Еиг. 1. 1ттипо1. 17, 1987, сс. 887).
В-клетки (1000 клеток на лунку) культивировали вместе с облученными (5000 рад) ЕЬ4В5-клетками (5х104 на лунку) в плоскодонных титрационных микропланшетах в 200 мкл среды, дополненной 10% инактивированной тепловой обработкой фетальной телячьей сывороткой, 5 нг/мл форбол-12-миристат13-ацетата (фирма 81дта) и 5%-ным супернатантом человеческих Т-клеток. Добавляли МАт в различных концентрациях в начале культивирования и включение тимидина оценивали в день 6 после 18-часовой обработки [3Н]-тимидином. Для получения Т-клеточного супернатанта очищенные Т-клетки культивировали при плотности 106/мл в течение 36 ч в присутствии 1 мкг/мл ФГА (фитогемагглютинин) 10 нг/мл ФМА (Аеп и др., Еиг. 1. 1ттипо1., 17, 1987, с. 887). Т-клеточный супернатант получали путем центрифугирования клеток и хранили при -20°С. Оценивали эффективность Т-клеточного супернатанта в отношении усиления пролиферации человеческих В-клеток в культурах ЕЬ4В5-В-клеток и наиболее эффективные супернатанты объединяли для использования в экспериментах. При оценке воздействия антитела к СЭ40 на индуцированную ЕЬ4В5 пролиферацию человеческих В-клеток, можно добавлять моноклональное антитело, такое как МОРС-141 (1дС2Ь), в качестве контроля.
Антагонистическое антитело к СЭ40 может ингибировать В-клеточную пролиферацию, стимулированную линией клеток ЕЬ4В5, например, по меньшей мере на 75% или более (т.е. индуцируемая ЕЬ4В5 В-клеточная пролиферация в присутствии антагонистического антитела к СЭ40 составляет не более 25% от пролиферации в отсутствии антагонистического антитела к СЭ40). В противоположность этому, контрольное антитело, такое как МОРС-141, не оказывало никакого существенного воздействия на индуцируемую ЕБ4В5 В-клеточную пролиферацию.
Анализ с использованием человеческих Т-клеток-хелперов производства антител В-клетками.
Антагонистическое антитело к СЭ40 может функционировать в качестве антагониста производства иммуноглобулинов В-клетками. Антитело к СЭ40 можно оценивать в отношении этого типа антагонистической активности, определяя способность антитела ингибировать производство иммуноглобулинов В-клетками, стимулированными зависимым от контакта образом активированными Т-клетками, используя анализ Т-клеток-хелперов. В таком анализе 96-луночные планшеты для культуры ткани сенсибилизировали, используя разбавление 1:500, асцитной жидкостью МАт к СЭ3 СБВ-Т3/3 (фирма СЬВ, Амстердам, Нидерланды). В качестве индикаторов добавляли следующие костимулирующие МАт: МАт к СЭ2 СБВ-Т11.1/1 и СБВ-Т11.2/1 (фирма СЬВ, Амстердам, Нидерланды), оба в виде асцитов в разведении 1:1000, и МАт к СЭ28 СЬВ-28/1 (фирма СЬВ, Амстердам, Нидерланды). Затем добавляли полученные из миндалин Т-клетки (облученные, 3000 рад; 105 на лунку), полученные из миндалин В-клетки (104 на лунку) и г1Ь-2 (20 ед./мл). Конечный объем каждой клеточной культуры составлял 200 мкл. Через 8 дней клетки центрифугировали и собирали бесклеточный супернатант. Концентрации человеческих 1дМ и 1дС в (разведенных) образцах оценивали с помощью ЕЫ8А, как описано ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретения человеческие полученные из миндалин В-клетки (104 /лунку) культивировали вместе с облученными очищенными Т-клетками (3000 рад, 105 /лунку) в 96луночных планшетах, сенсибилизированных МАт к СЭ3 с добавлением различных МАт для стимуляции Т-клеток или без них. После культивирования в течение 8 дней супернатанты собирали для определения производства иммуноглобулинов В-клетками. Производство иммуноглобулинов В-клетками оценивали с помощью описанного ниже анализа ЕЫ8А. Представляющее интерес антитело к СЭ40 добавляли в различных концентрациях в начале культивирования. В качестве контроля можно добавлять МАт МОРС141.
Антагонистическое антитело к СЭ40 обладало способностью ингибировать производство 1дС и 1дМ В-клетками, стимулированными человеческими Т-клетками, по меньшей мере на 50% или более (т.е. индуцированное Т-клетками производство антител В-клетками в присутствии антагонистического антитела к СЭ40 составляет не более 50% от производства антител В-клетками в отсутствии антагонистического антитела к СЭ40). В противоположность этому, контрольное антитело, такое как МОРС-141, не оказывало никакого существенного воздействия на индуцируемое Т-клетками производство антител Вклетками.
Количественный анализ иммуноглобулинов с помощью ЕЫ8А.
Концентрации человеческих 1дМ и 1дС оценивали с помощью ЕЫ8А. 96-луночные планшеты для ЕЫ8А сенсибилизировали 4 мкг/мл мышиного МАт к человеческому 1дС МН 16-01 (фирма СЬВ, Амстердам, Нидерланды) или 1,2 мкг/мл мышиного МАт к человеческому 1дМ 4102 (фирма Тадо, Берлингейм, шт. Калифорния) в 0,05М карбонатном буфере (рН 9,6) путем инкубации в течение 16 ч при 4°С. Планшеты отмывали трижды ЗФР-0,05% Твин-20 (ЗФР-Твин) и насыщенным БСА в течение 1 ч. После двух отмывок планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С с различными разведениями тестируемых образцов. После трех отмывок связанный 1д выявляли путем инкубации в течение 1 ч при 37°С с использованием 1 мкг/мл меченного пероксидазой мышиного МАт к человеческому 1дС МН 16-01 (фирма СЬВ) или мышиного МАт к человеческому 1дМ МН 15-01 (фирма СЬВ). Планшеты отмывали четыре раза и связанную пероксидазную активность оценивали, добавляя О-фенилендиамин в качестве субстрата. Человеческую стандартную сыворотку (Н00, фирма СЬВ) использовали для построения стандартной кри
- 46 018301 вой в каждом анализе.
В контексте настоящего описания употребление любого понятия в единственной числе относится к одному или нескольким (т.е. по меньшей мере к одному) рассматриваемому объекту. Например, элемент может означать один или несколько элементов.
Все публикации и заявки на патент, приведенные в описании, рассчитаны на уровень знаний специалистов в области, к которой относится изобретение. Все публикации и заявки на патент, включены в настоящее описание в качестве ссылки в той степени, как если бы было указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специально и индивидуально включена в качестве ссылки.
Хотя представленное выше изобретение для его более полного понимания было описано с помощью иллюстраций и примеров, очевидно, что можно осуществлять на практике определенные изменения и модификации, подпадающие под объем прилагаемой формулы изобретения.
Перечень последовательностей <110> ΙΛ1, Ххао£епд
СЪеп, Вао-Ъи Агауа, кхсИвЫ ОкЬата£е, Аидизгиз <120> Фармацевтические композиции антагонистического антитела к СЪ40 <130> РР028228,0002 (325023) <150> 60/794,011 <151> 2006-04-21 <160> 12 <170> РазЬЗЕО для Μίηάοντε, версия 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Кодирующая последовательность легкой цепи человеческого антитела к СП40 12.12 <221> сиз <222> (1)...(720) <400> 1
аЬд МеГ 1 дед А1а сСс Ъеи ССЪ Рго дсь А1а 5 сад С1п сгс Ъеи сед Ъеи ддд С1у с£д Ъеи 10 сСа Ъеи аЪд Мег сгс Ъеи едд Тгр дгс Уа1 15 гсг Зег 48
дда Ссс адь ддд да£ аСС д*д аЪд асЪ сад Ъсь сса сйс Осс егд асе 96
С1у Зег Зег С1у Азр Не Уа1 МеЪ ТЪг С1п Зег Рго Ъеи Зег Ъеи Ткг
20 25 30
дгс асе ссе дда дад сед дес Ъсс аЬс Ьсс Ьдс адд Ьсс адг сад аде 144
ν&ι ТЪг Рго <Э1у С1и Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег
35 40 45
сес сЬд ЬаР адг аай дда Сае аас га£ да С Рдд Сае егд сад аад 192
Ъеи Ъеи Туг Зег Азп О1у Туг Азл Туг Ъеи А5р Тгр Туг Ъеи αΐη Ъуз
50 55 60
сса ддд сад ЪсС сса сад дгс е£д аге есъ ьгд дде гсъ аае едд дсс 240
Рго 65 С1у <31п Зег Рго <31п ν&1 Ьеи 70 11е Зег Ьеи 75 С1у Зег Азп Агд А1а 80
кос ддд дес осе дас адд еес аде ддс адС дда Сса ддс аса дае еее 288
Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег 01у Зег- С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе
85 90 95
аса сед ааа аес аде ада дед дад дсе дад дае дее ддд дее СаС еас 336
ТЬг Ьеи Ьуз 11е Зег Агд Уа1 61и А1а О1и Азр Уа1 <31у Уа1 туг туг
100 105 но
еде аед саа дсе ода саа асе сса еес асе еес ддс ссе ддд аес ааа 384
Суз Мее <31п А1а Агд С1п ТЬг Рго РЬе ТЬг РЬе □ 1у Рго 61у ТЬг Ьуз
115 120 125
дед дае аес ада еда асС дед дсе дса сса есе дес еес аес СЬс сед 432
Уа1 Аар Не Агд Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго
130 135 140
сса СсС дае дад сад еед ааа есе дда асе дсс СсС дее дед Сдс сед 480
Рго Зег Азр С1и □ 1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи
145 150 155 160
сед ааС аас еес еае ссс ада дад дсс ааа дСа сад едд аад дед дас 528
Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд <31и А1а Ьуз Уа1 <31п Тгр Ьуз νβΐ Азр
165 17 0 175
аас дес сес саа есд дде аас Ьсс сад дад аде дес аса дад сад дас 576
Азп. А1а Ьеи 61п Зег <31у Азп Зег С1п <31и Зег Уа1 ТЬг СЯи αΐη Азр
160 185 190
аде аад дас аде асе 1ас аде сес аде аде асе сед асд сед аде ааа 624
Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг 8ег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз
195 200 205
дса дао Сас дад ааа сас ааа дес Сас дсс еде даа дСс асе еас сад 672
А1а Азр Туг С1и Ьуз ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 Ткг Н13 <31п
210 215 220
ддс сед аде есд ссс дес аса аад аде еес аас адд дда дад еде Сад 720
□ 1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТИг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у <31и Суз ♦
225 230 235
<210> 2 <211> 239
- 48 018301 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь человеческого антитела к СС40 12.12 <400> 2
меъ А1а Деи Рго А1а С1п Деи Деи С1у Деи Деи МеЬ Деи тгр Уа1 Зег
1 5 10 15
61у Зег Зег С1у Авр Не Уа1 МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Деи Зег Деи ТЬг
20 25 30
Уа1 ТЬг Рго С1у С1и Рго А1а Зег Не Зег Сув Агд Зег Зег <31п Зег
35 40 45
Деи Деи Туг зег Аяп О1у Туг АВП Туг Деи АЯр тгр Туг Деи <31п Дув
50 55 60
Рго С1у С1п Зег Рго С1п Уа1 Деи Не Зег Деи С1у Зег Аяп Агд А1а
65 70 75 80
Зег С1у Уа1 Рго Авр Агд РЬе Зег <31у Зег <Э1у Зег <Э1у ТЬг Аяр РЬе
85 90 95
ТЬг Деи Дув Не Зег Агд ναΐ <31и А1а <31и Авр Уа1 <31у 1Га1 Туг Туг
100 105 110
Суя МеЬ С1п А1а Агд С1п ТЬг Рго РЬе ТЬг РЬе С1у Рго 01у ТЬг Дуя
115 120 125
Уа1 Аяр Не Агд Агд ТЬг νβΐ А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго
130 135 140
Рго зег Авр С1и С1П Деи Дув Зег С1у ТЬг А1а Зег νβΐ Уа1 суя Деи
145 150 155 160
Деи АЯП Аяп рье Туг Рго Агд О1и А1а Дув ν*1 <31п тгр Дув Уа1 Аяр
165 170 175
Аяп А1а Деи С1П Зег С1у Аяп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и <31п Аяр
180 185 190
Зег дув Авр Зег ТЬг Туг Зег Деи Зег Зег ТЬг Деи ТЬг Деи зег Дуя
195 200 205
А1а Авр Туг С1и Дув ΗΪΒ Дув Уа1 Тух А1а Суз <31и Уа1 ТЬг ΗΪ8 С1п
210 215 220
С1у Деи Зег Зег Рго Ца1 ТЬг Дув Зег РЬе Аяп Агд С1у С1и Су в
225 230 235
<210> 3 <211> 2016 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Кодирующая последовательность тяжелой цепи человеческого антитела к СД40 12.12 (с интронами)
- 49 018301 <400> 3
аСд дад еее ддд сСд аде едд дее еес СЕЕ дЕЕ дее аЕЕ ееа ада ддс 48
дес сад еде сад дСд сад сед дед дад ЕСЕ ддд дда ддс дед дЕс сад 96
ссС ддд адд есс сед ада сес есс еде дса дее есе дда еес асе еес 144
аде аде СаС ддс аед сас едд дСс еде сад дее сса ддс аад ддд сед 192
дад Сдд дед дса дес аЕа Сса еае дад даа адЕ аае ада еас саЕ дса 240
дас есс дСд аад ддс еда еес асе аес Есс ада дас ааЕ есс аад аес 288
асд сед ЕаЕ сед саа аЕд аас аде сес ада асЕ дад дас асд дсЕ дед 336
Сае еас ЕдЕ дед ада даЕ ддд дде аеа дса дса ссе ддд ссе дас еас 384
ддс сад дда асе сЕд дес асе дес ЕСС Еса дса адЕ асе аад ддс 432
сса есс дЕс еес ссс сЕд д=д ссс дее аде аад аде асе есе ддд ддс 480
аса дед дес сед ддс Еде сед дес аад дас Еас еес ссс даа еед дед 528
асд дьд Есд ьдд аас Еса ддс дее сед асе аде ддс дед сас асе еес 576
ссд дес дЕс сеа сад Есс Сса дда сес Еас Есс сес аде аде дьд дед 624
асе дед ссс есс аде аде еед ддс асе сад асе еас аСс еде аас дед 672
ааЕ сас аад есс аде аас асе аад дед дас аад ада дье дде дад адд 720
сса дса сад дда ддд адд дед есе дее дда аде сад дее сад еде есс 768
Еде сЕд дас дса есс едд сеа еде аде ссс адЕ сса ддд сад саа ддс 816
адд ссс сдЕ сед ссе сЕЕ сас сед дад дее ЕсЕ дее еде ссс асЕ сае 864
дсЕ сад дда дад дде сЕЕ сед дее еес ЕСС сеа ддс есе ддд сад дса 912
сад дсЕ адд еде ссс Еаа ссс адд ссс Еде аса саа адд ддс адд еде 960
Едд дсЕ сад асе еде саа дад сса еае сед дда дда ссс еде сес еда 1008
ССЕ аад ссс асе сса аад дес ааа есе Есс асЕ ссс еса дее едд аса 1056
ССЕ ЕсЕ сЕс сес сса даЕ есс аде аас Есс саа есе есе сСс Еде ада 1104
дес саа аЕс еед еда саа аас еса сас аЕд ссс асе дед ссс адд еаа 1152
дес аде сса ддс сес дес сес сад сСс аад дед дда сад дед ссс еад 1200
адЕ аде сЕд сае сса ддд аса ддс ссс аде едд дед сед аса сдЕ сса 1248
ССЕ сса ЕсЕ еес ссе сад сас сед аас Есс едд ддд дас еде сад есе 1296
Есе ЕсЕ Есс ССС саа аас сса адд аса ссс еса Еда есе ссс дда ссс 1344
сЕд адд Еса сае дед Едд едд едд асд Еда дее асд аад асе сЕд адд 1392
Еса адЕ Еса асе дде асд едд асд дед £дд адд Еде аеа аед сса ада 1440
саа аде еде ддд адд аде аде аса аса дса еде асе дед едд Еса дед 1488
Есе Еса сед есс еде асе адд асе ддс Еда аед дса адд аде аса аде 1536
дса адд ЕсЕ сса аса аад ссс есс сад ссс сса Есд ада ааа сса есе 1584
сса аад сса аад дед дда ссс дед ддд Еде дад ддс сас аСд дас ада 1632
ддс едд сЕс ддс сса ссс есе дее сед ада дед асе дее деа сса асе 1680
ЕсЕ дЕс ссЕ аса ддд сад ссс еда даа сса сад дед еас асе сЕд ссс 1728
сса Есс едд дад дад аЕд асе аад аас сад дес аде сед асе Еде сед 1776
дЕс ааа еес ЕаЕ ссс аде дас аес дес дед дад едд дад аде аае 1824
ддд сад сед дад аас аас еас аад асе асд ссе ссс дед сед дас есс 1872
дас аде Есс еес ЕЕс сЕс еае аде аад СЕС асе дед дас аад аде адд 1920
Ьдд сад сад ддд аас дЕс еес Еса еде Есс дед аед сае дад дсЕ сед 1968
сас аас сас еас асд сад аад аде сес Есе сед есе сед ддс ааа еда 2016
<210> 4
- 50 018301 <211> 469 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь человеческого антитела к СО40 12.12 с400> 4
МеЕ <31и РЬе С1у ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 А1а Не Ьеи Агд С1у
1 5 10 15
Уа1 С1п Сув <31п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег <31у <31у <31у Уа1 Уа1 σΐη
20 25 30
Рго <31у Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Туг С1у МеЕ ΗΪ8 Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
<31и Тгр Уа1 А1а Уа1 11е Зег Туг С1и С1и Зег Азп Агд Туг ΗΪ3 А1а
65 70 75 80
Авр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Не
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи е1п МеЕ Азп Зег ьеи Агд ТЬг С1и Азр тЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Сув А1а Агд Азр С1у б!у Не А1а А1а Рго <31у РГО Авр туг
115 120 125
Тгр 61у 61п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго А1а Зег Ьуз Зег ТЬг Зег <31у <31у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Суз Ьеи Уа1 Ьув Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Авп Зег <31у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег <31 у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЕ г Уа1 Рго Зег Зег Зег ьеи С1у ТЬг <31 п ТЬг Туг Не Суз Авп Уа1
210 215 220
Азп ΗΪ8 Ьув Рго Зег Азп ТЬг Ьув Уа1 Авр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Авр Ьуз ТЬг ΗίΒ ТЬг Суз Рго Рго Сув Рго А1а Рго <31и Ьеи
245 250 255
ьеи <31у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЕ Не Зег Агд ТЬг Рго (31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
Зег Н1з С1и Авр Рго С1и Уа1 ьуз РЬе АЗП Тгр Туг Уа1 Авр С1у Уа1
290 295 300
С1и Уа1 Н1з Азп А1а ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и <31и С1п Туг АВП Зег
- 51 018301
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 325 Бег Уа1 Ьеи ТЬГ Уа1 330 Ьеи ΗΪ3 <31п Азр Тгр 335 Ьеи
Азп <31у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго Не О1и ьуз ТЬг Не Зег Ьув А1а Ьуз Й1у <31п Рго Агд <31и Рго
355 360 365
<31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд <31и <31и меъ ТЬг Ьуз Азп <31п
370 375 380
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьув <31у РЬе Туг РГО Зег Авр Не А1а
385 390 395 400
Уа1 С1и Тгр <31и Зег Азп С1у <31п Рго <31и АВП АЗП Туг ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Авр Зег Азр <Э1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Авр Ьуз бег Агд Тгр <31п <31п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Бег
435 440 445
Уа1 меь Н13 С1и А1а Ьеи Ηΐε АЗП Н13 Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Бег Рго С1у Ьуз
465 <210> 5 <211> 469 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь варианта человеческого антитела к СЬ40 12.12 <400> 5
МеЬ <31и РЬе <31у Ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 А1а Не Ьеи Агд <31у
1 5 10 15
Уа1 <31п Суз <31п Уа1 <31п Ьеи Уа1 <3111 Зег <31у <31у О1у Уа1 νβΐ <31п
20 25 30
Рго <31у Агд зег ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Бег <31у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Бег Туг <31у МеЬ ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд <31 п А1а Рго <31у Ьув С1у Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 А1а Уа1 Не Зег Туг <Э1и <31и Зег АЗП Агд Туг Н18 А1а
65 70 75 80
Азр Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Авп Зег Ьуз Не
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи <31п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд ТЬг <31и Азр ТЬг А1а Уа1
100 105 110
- 52 018301
Туг Туг Суз 115 А1а Агд Азр <31у С1у 120 11е А1а А1а Рго (31у 125 Рго Азр Туг
Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг ьув О1у
130 135 140
РГО Зег Уа1 РЬе РГО ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег О1у С1у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи <31у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг 17а 1 Зег Тгр АЗП Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 ΗΪ3 ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег (31у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг <Э1п ТЬг Туг 11е Су в Азп 17а 1
210 215 220
Азп Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьув
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Су в Рго А1а Рго С1и Ьеи
245 250 255
Ьеи <31у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьув Рго Ьув Авр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеЪ 11е Зег Агд ТЬг Рго <31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 17а 1 17а 1 Авр Уа1
275 280 285
Зег Н1э С1и Азр Рго <31и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1
290 295 300
С1и Уа1 Н18 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 01и <31п Туг Азп Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд 17а 1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪΒ <31п Авр Тгр Ьеи
325 330 335
Агп <31у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз νβ! Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго Не <31и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у Й1п Рго Агд <31и Рго
355 360 365
<31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и <31и Мее ТЬг Ьуз Азп <31п
370 375 380
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Авр Не А1а
385 390 395 400
Уа1 О1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Авп Авп Туг Ьув ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 31у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Авр Ьуз Зег Агд Тгр С1п <31п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
Уа1 МеЬ Н13 С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Н1з Туг ТЬг <31п Ьув Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
465
- 53 018301 <210> 6 <211> 239 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь человеческого антитела к СО40 5.9 <400> 6
МеЬ А1а Беи Беи А1а <Э1п Беи Беи □1у Беи Беи Мее Беи Тгр Уа1 Рго
1 5 10 15
С1у Зег Зег <Э1у А1а Не Уа1 МеЬ ТЬг С1п Рго Рго Беи Зег Зег Рго
20 25 30
Уа1 ТЬг Беи 61у С1п Рго А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег <31п Зег
35 40 45
Беи Уа1 κίε Зег Азр С1у Азп ТЬг Туг Беи Азп Тгр Беи С1п 01п Агд
50 55 60
Рго <31у С1п Рго Рго Агд Беи Беи Не Туг Буз РЬе РЬе Агд Агд Беи
65 70 75 80
Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег О1у Зег С1у А1а <31у ТЬг Авр РЬе
85 90 95
ТЬг Беи Буе Не Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 01у Уа1 туг Туг
100 105 110
Сув Меб С1п Уа1 ТЬг С1п РЬе Рго Шз ТЬг РЬе С1у Э1п С1у ТЬг Агд
115 120 125
Беи С1и Не Буз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго
130 135 140
Рго Зег Азр □ 1и <Э1п Беи Буз Зег 01у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Беи
145 150 155 160
Беи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд 31и А1а Буз Уа1 С1п Тгр Буз Уа1 Азр
165 170 175
АЗП А1а Беи С1п Зег С1у Абп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг □1и С1п Азр
180 185 190
Зег Буз Азр Зег ТЬг Туг Зег Беи Зег Зег ТЬг Беи ТЬг Беи Зег Буз
195 200 205
А1а Азр Туг <31и Буз ΗΪ8 Буз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Ηί3 С1п
210 215 220
С1у Беи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Буз Зег РЬе Азп Агд <31у О1и Суз
225 230 235
<210> 7 <211> 474 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность
- 54 018301 <220>
<223> Тяжелая цепь человеческого антитела к СБ40 5.9 <400> 7
меб С1у Зег тЬг А1а 11е Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи А1а 17а 1 Ьеи 61п 61у
1 5 10 15
Уа1 Суз А1а 61и Уа1 С1п Ьеи Уа1 61п Зег <31у А1а 61и Уа1 Ьуз Ьуз
20 25 30
Рго <31у <31и Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз Ьуз С1у Зег 61у туг Зег РЬе
35 40 45
ТЬг Зег Туг Тгр 11е С1у Тгр Уа1 Агд <31п МеС Рго 61у ьув 61у Ьеи
50 55 60
<31и Тгр МеЬ <Э1у 11е 11е Туг РГО 61у Азр Зег Азр ТЬг Агд Туг Зег
65 70 75 80
Рго Зег РЬе <31п <31у (31п 17а 1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е Зег
85 90 95
ТЬг А1а Туг Ьеи 61п Тгр Зег Зег Ьеи Ьув А1а Зег Авр ТЬг А1а мее
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд <Э1у ТЬг А1а А1а 61у Агд Азр Туг Туг Туг Туг
115 120 125
Туг С1у НеЬ Авр Уа1 Тгр С1у 61п С1у ТЬг ТЬг 17а 1 ТЬг Уа1 Зег Зег
130 135 140
А1а Зег ТЬг Ьуз <Э1у Рго Зег 17а 1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго А1а Зег Ьув
145 150 155 160
Зег ТЬг Зег <31у С1у ТЬг А1а А1а Ьеи б1у Суя ьеи 17а 1 Ьуз Авр Туг
165 170 175
РЬе Рго б1и Рго Уа1 ТЬг 17а 1 Зег Тгр Азп Зег 61у А1а Ьеи ТЬг Зег
180 185 190
61у Уа1 Η1Ξ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег 61у Ьеи Туг Зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег νβΐ νΗ1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг
210 215 220
Туг Не Суз Азп νβΐ Азп ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьув νβΐ Авр Ьуз
225 230 235 240
Агд Уа1 61и Рго Ьув Зег Сув Абр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз РГО Рго Суз
245 250 255
Рго А1а Рго <31и Ьеи Ьеи <31у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго
260 265 270
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мее 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и νβΐ ТЬг Суз
275 280 285
Уа1 Уа1 νβΐ Азр Уа1 Зег Н13 С1и АЗр Рго 61и 17а1 Ьуз РЬе Азп Тгр
290 295 300
Туг Уа1 Азр 01У Уа1 С1и 17а 1 Ηίε Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 61и
305 310 315 320
<31и Θΐη Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 УЯ1 Зег 17а1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
325 330 335
Н1Э <31п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп
340 345 350
- 55 018301
ьуз АЬа Ьеи 355 Рго АЬа РГО ХЬе СЬи 360 ьуз ТЬг 1Ье Зег Ьуз 365 АЬа Ьуз СЬу
СЬп Рго Агд СЬи Рго <31п ν»1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи
370 375 380
МеС ТЬг ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг
385 390 3 95 400
Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп С1у СЬп Рго СЬи Азп
405 410 415
Азп. Туг Ьуз тЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе
420 425 430
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп
435 440 445
УаЬ РЬе Зег Суз Зег уаь Мер ΗΪ3 СЬи АЬа Ьеи Н13 Азп Н1з Туг ТЬг
450 455 460
СЬп ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго ОЬу Ьуз
465 470
<210> 8 <211> 474 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цеяь варианта человеческого антитела к СВ40 5.9 <400> 8
МеЬ С1у Зег ТЬг АЬа 1Ье Ьеи АЬа Ьеи Ьеи Ьеи АЬа УаЬ Ьеи СЬп СЬу
1 5 10 15
УаЬ Суз АЬа СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ ьуз Ьуз
20 25 30
Рго СЬу СЬи зег Ьеи ьуз 11е Зег суз ьуз СЬу Зег СЬу Туг Зег РЬе
35 40 45
ТЬг Зег Туг Тгр Не СЬу Тгр УаЬ Агд С1п Мее Рго СЬу Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
СЬи Тгр мее 01у ХЬе ХЬе Туг РГО СЬу Азр Зег Авр ТЬг Агд Туг Зег
65 70 75 80
Рго Зег РЬе СЬп СЬу СЬп УаЬ ТЬг 1Ье Зег АЬа Азр Ьуз Зег Не Зег
85 90 95
ТЬг АЬа Туг Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа Зег Азр ТЬг АЬа Мее
100 105 110
Туг Туг Суз АЬа Агд СЬу ТЬг АЬа АЬа СЬу Агд Азр Туг Туг Туг Туг
115 120 125
Туг СЬу мее Азр УаЬ тгр С1у СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
130 135 140
АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе РГО Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз
145 150 155 160
- 56 018301
Зег ТЬг Зег С1у С1у ТЬг 165 А1а А1а Ьеи 51у 170 Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр 175 Туг
РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег □1у А1а Ьеи ТЬг Зег
180 185 190
С1у Уа1 Н±в ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи <31у ТЬг С1п ТЬг
210 215 220
Туг Не Суз АЗП Уа1 АЗП Н13 ьуз Рго Зег Азп ТЬг ьуз Уа1 Азр Ьуз
225 230 235 240
Агд Уа1 <31и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н18 ТЫ Суз Рго Рго Суз
245 250 255
Рго А1а Рго <Э1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго
260 265 270
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз
275 280 285
Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго <31и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр
290 295 300
Туг Уа1 Азр <31у Уа1 61и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд <31и
305 310 315 320
<31и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг νβΐ Ьеи
325 330 335
ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп е1у Ьуз С1и Туг Ьуз Сув Ьуз Уа1 Зег Авп
340 345 350
Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не <31и ьуз ТЫ Не Зег ьуз А1а Ьув С1у
355 360 365
С1п Рго Агд <31и Рго С1п Уа1 туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и
370 375 380
МеЬ ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 ьув 61у РЬе Туг
385 390 395 400
Рго Зег Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр С1и Зег Азп С1у С1П Рго <31и АВП
405 410 415
АЗП Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Авр Зег Авр <31у Зег РЬе РЬе
420 425 430
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьув Зег Агд Тгр <31п С1п С1у Авп
435 440 445
Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Ηίβ АВП Н13 Туг ТЬг
450 455 460
С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго (31у Ьуз
465 470
<210> 9
<211=. 612
<212> днк
<213> ногао вархепз
- 57 018301 <220>
<221> СОБ <222> (1) . . .(612) <221> т1зс_£еабиге <222> (0)...(0} <223> Кодирующая последовательность короткой изоформы человеческого
СБ40 <400> 9
абд Мес. 1 дес Уа1 едб Агд ебд Ьеи ссб Рго 5 ебд Ьеи сад С1п бде Суз дбе Уа1 сбс Ьеи 10 бдд Тгр ддс С1у Сдс Суз ббд Ьеи ебд Ьеи 15 асе ТЬг 48
дес дбе саС сса даа сса ссс асб дса бде ада даа ааа сад бас сба 96
А1а Уа1 Н1з Рго <31и Рго Рго ТЬг А1а Суз Агд (31и Ьуз (31п Туг Ьеи
20 25 30
аба аас адб сад бде бдб бсб ббд бде сад сса дда сад ааа ебд д^д 144
Т1е Азп Бег <31п Суз Суз Бег Ьеи Суз С1п Рго С1у С1п Ьуз Ьеи Уа1
35 40 45
адС дас Сдс аса дад ббс асб даа асд даа бде ебб ССС Сдс ддь даа 192
Бег Азр Суз ТЬг С1и РЬе ТЬг <31и ТЬг С1и Суз Ьеи Рго Суз <31у С1и
50 55 60
аде даа Обе сба дас асе бдд аас ада дад аса сас Сдс сас сад сас 240
Бег 61и РЬе Ьеи Азр ТЬг Тгр Азп Агд С1и ТЬг ΗΪ3 Суз Н13 С1п ΗΪ3
65 70 75 80
ааа Сае бде дас ссс аас оба ддд ссс едд дбе сад сад аад ддс асе 288
Ьуз Туг Суз Азр Рго Азп Ьеи С1у Ьеи Агд Уа1 С1п С1п Ьуз С1у ТЬг
85 90 95
Сса даа аса дас асе асе бде асе бдб даа даа ддс бдд сас сдс асд 336
Зег <31и ТЬг Азр ТЬг Не Суз ТЬг Суз С1и С1и С1у Тгр ΗΪ3 Суз ТЬг
100 105 но
аде дад дес бдб дад аде бдб дбе ебд сас сдс Сса бде бед ссс ддс 384
Бег С1и А1а Суз (31и Бег Суз Уа1 Ьеи ΗΪ8 Агд Бег Суз Бег Рго <31у
115 120 125
бсс ддд дбе аад сад абб дсб аса ддд дбб бсб даС асе абс бде дад 432
РЬе <31у Уа1 Ьуз С1п 11е А1а ТЬг в1у Уа1 Бег Азр ТЬг Не Суз <31и
130 135 140
ссс Сдс сса дбе ддс ббс ббс бсс аас дед Сса ссс дсб ббс даа ааа 480
- 58 018301
Рго 145 Суе Рго Уа1 С1у РЬе 150 РЬе Зег Азп Уа1 Зег 155 Зег А1а РЬе С1и ьуз 160
СдС сас ссС Сдд аса адд ЁСС сса дда Сед дсС дад аде ССС ддС ддс
Суз Ηίθ Рго Тгр ТЬг Агд Зег Рго С1у Зег А1а С1и Зег Рго С1у <Э1у
165 170 175
даС ссс саС саС ССС сдд даЬ ссь дьь Сдс саС ссС сСС ддС до С ддС
Азр Рго Н1з Н1э Ьеи Агд Азр Рго Уа1 Суз Н13 Рго Ьеи <Э1у А1а <31у
160 185 190
ссс СаС саа ааа ддс ддс саа даа дес аас саа Саа
Ьеи Туг С1п Ьуз С1у С1у С1п <31и А1а Азп βΐη *
195 200 <210> 10 <211> 203 <212> РРТ с213> Ното зар!епв <400> 10
МеС Уа1 Агд Ьеи Рго Ьеи С1п Суз Уа1 Ьеи Тгр С1у Суз Ьеи Ьеи ТЬг
1 5 10 15
А1а Уа1 Нхз Рго С1и Рго Рго ТЬг А1а Суз Агд С1и Ьуз С1п Тух Ьеи
20 25 30
Не Азп Зег <Э1п Суз Суз Зег Ьеи Суз С1п Рго С1у С1п Ьуз Ьеи Уа1
35 40 45
Зег Азр Суз ТЬг <31и РЬе ТЬг С1и ТЬг О1и Суз Ьеи Рго Суз С1у С31и
50 55 60
Зег С1и РЬе Ьеи Азр ТЬг Тгр Азп Агд С1и ТЬг Н1з Суз Н1з С1п ΗίΞ
65 70 75 80
Ьуз Туг Суз Азр Рго Азп Ьеи С1у ьеи Агд Уа1 С1п С1П Ьуз <31у ТЬг
85 90 95
Зег С1и ТЬг Азр ТЬг 11е Суз ТЬг Суз <31и С1и <31у Тгр ΗΪ3 Суз ТЬг
100 105 но
Зег <Э1и А1а Суз 61и Зег Суз Уа1 Ьеи ΗΪΒ Агд Зег Суз Зег Рго С1у
115 120 125
РЬе С1у Уа1 Ьуз С1п Не А1а ТЬг <31у Уа1 Зег Азр ТЬг Не Суз <31и
130 135 140
Рго Суз Рго Уа1 С1у РЬе РЬе Зег Азп Уа1 5ег Зег А1а РЬе (31и Ьуз
145 150 155 160
Суз ΗΪ8 Рго Тгр ТЬг Агд Зег Рго (31у Зег А1а □1и Зег Рго О1у <31у
165 170 175
Азр Рго Н1з Н1з Ьеи Агд Азр Рго νβΐ Суз ΗΪ8 Рго ьеи С1у А1а С1у
180 185 190
Ьеи Туг С1п Ьуз 01у С1у С1п С1и А1а Азп 61п
<210> 11 <211> 834 <212? ДНК <213? Ното зархепз <220?
<221> СПЗ <222? (1) . , .(834) <221> т1зс_£еаеиге <222> (0)...(0) <223> Кодирующая последовательность длинной иэоформы человеческого
СД4 0 <400? 11
а£д мее 1 дее Уа1 еде Агд сед ъеи ссе Рго 5 сед Ъеи сад С1п еде Суз дес Уа1 сес Ъеи 10 едд тгр ддс С1у еде Суз еед Ъеи сед Ъеи 15 асе Ткг 48
дсе дес сае сса даа сса еес асе дса еде ада даа ааа сад еас сеа 96
А1а νβΐ Ηίε РГО С1и Рго Рго ткг А1а Суз Агд <31и Ъуз <31п Туг Ъеи
20 25 30
аеа аас аде сад еде еде есе еед еде сад сса дда сад ааа сед дед 144
Не Азп Зег С1п Суз Суз Зег Ъеи Суз С1п Рго С1у <31п Ъуз Ъеи Уа1
35 40 45
аде дас еде аса дад еес асе даа асд даа еде сее ссе еде дде даа 192
Зег Азр Суз Ткг С1и Рке Ткг С1и Ткг <31и Суз Ъеи Рго Суз <31у С1и
50 55 30
аде даа еес сеа дас асе едд аас ада дад аса сае еде еас сад сае 240
Зег <31и РЪе Ъеи Азр Ткг Тгр Азп Агд С1и Ткг Н13 Суз ΗΪ3 О1п Ηίε
65 70 75 80
ааа еас еде дас есс аас сеа ддд сее едд дес сад сад аад ддс асе 288
Ъуз Туг Суз Азр рго Азп Ъеи С1у Ъеи Агд Уа1 С1п С1п Ъуз Э1у Ткг
85 90 95
еса даа аса дас асе аес еде асе еде даа даа ддс ьдд сае сдс асд 336
Зег О1и Ткг Азр Ткг 11е Суз Ткг Суз С1и С1и С1у Тгр ΗΪ3 Суз Ткг
100 105 110
аде дад дес еде дад аде еде дес сед сае еде еса еде еед ссе ддс 384
Зег (31ц А1а Суз <31и Зег Суз Уа1 Ъеи Н1з Агд Бег Суз Зег Рго С1у
- 60 018301
ЕСЕ РЬе ддд С1у 130 дЕс Уа1 аад Ьуз сад С1п аЕЕ Не дсЕ А1а 13 5 аса ТЬг ддд 61у дЕЕ Уа1 ЕсЕ Зег даЕ Авр 140 асе ТЬг аСс 11е Сдс Суз дад <31и 432
ссс Еде сса дЕс ддс ЕЕс ЕЕс Ссс ааЕ дЕд Еса ЕсЕ дсЕ ССС даа ааа 480
Рго Сув РГО Уа1 С1у РЬе РЬе Зег Азп Уа1 Зег Зег А1а РЬе С1и Ьув
14 5 150 155 160
СдС сас СОЕ Едд аса аде ЕдС дад асе ааа дас сед дсс дед саа сад 528
Суз Н15 Рго Тгр ТЬг Зег Суз С1и ТЬг Ьуз Азр Ьеи Уа1 Уа1 С1п С1п
165 170 175
дса ддс аса аас аад асЕ даЕ дСЕ дсс СдЕ ддс ссс сад да С едд сЕд 576
А1а С1у ТЬг Азп Ьуз ТЬг Азр йа1 Уа1 Суз О1у Рго <31п Азр Агд Ьеи
180 185 190
ада дсс сЕд дЕд дЕд аЕс ссс аЕс аЕс ЕЕс ддд аЕс сСд ЕСЕ дсс аСс 624
Агд А1а Ьеи Уа1 Уа1 11е Рго 11е Т1е РЬе С1у 11е Ьеи РЬе А1а 11е
195 200 205
сЕс СЕд дЕд сЕд дЕс ЕСС аЕс ааа аад дЕд дсс аад аад сса асе ааЕ 672
Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 РЬе 11е Ьуз Ьуз Уа1 А1а Ьув Ьув Рго ТЬг Авп
210 215 220
аад дсс ссс сас ссс аад сад даа ссс сад дад аСс ааЕ ЕЕС ссс дас 720
Ьуз А1а Рго ΗΪ3 Рго Ьуз Θΐη 31и Рго (31п О1и 11е Азп РЬе Рго Азр
225 230 235 240
дас сЕЕ ССЕ ддс ЕСС аас асе дсс дсс сса дед сад дад асе сса саЕ 768
Авр Ьеи Рго <31у Зег Азп ТЬг А1а А1а Рго Уа1 <31п С1и ТЬг Ьеи ΗΪ3
245 250 255
дда Еде саа сед дЕс асе сад дад даЕ ддс ааа дад аде сдс аЕс Сса 816
<31у Сув αΐη Рго Уа1 ТЬг С1п <31и Авр (31у Ьув О1и Зег Агд 11е Зег
260 265 270
дед сад дад ада сад Еда 834
Уа1 О1п С1и Агд ΰΐη *
275
<210> 12
<211> 277
< 212 > РКТ
<213> Ното заргепз
- 61 018301 <400> 12
Мес Уа1 Агд Ьеи Рго Ьеи <31п Суз Уа1 Ьеи Тгр <Э1у Суз Ьеи Ьеи ТЬг
1 5 10 15
А1а Уа1 Ηίβ Рго С1и Рго Рго ТЬг А1а Суз Агд С1и Ьуз С1п Туг Ьеи
20 25 30
11е Азп Зег 01п Суз Суз Зег Ьеи Суз <31п Рго С1у <31п Ьуз Ьеи Уа1
35 40 45
Зег Азр Суз ТЬг С1и РЬе ТЬг С1и ТЬг С1и Суз Ьеи Рго Суз С1у С1и
50 55 60
Зег <31 и РЬе Ьеи Азр ТЬг Тгр Азп Агд С1и тЬг Н1з Суз ΗΪ3 С1п Н1з
65 70 75 30
Ьуз Туг Суз Азр Рго Азп Ьеи С1у Ьеи Агд Уа1 С1п <31п Ьуз С1у ТЬг
05 90 95
Зег С1и ТЬг Азр ТЬг 11е Суз ТЬг Суз О1и 31и <31у Тгр Ηίε Суз ТЬг
100 105 110
Зег 01и А1а Суз С1и Зег Суз Уа1 Ьеи Н1з Агд Зег Суз Зег Рго <31у
115 120 125
РЬе С1у Уа1 Ьуз <31п Х1е А1а ТЬг <31у Уа1 Зег Азр ТЬг Х1е Суз <31и
130 135 140
РГО Суз Рго Уа1 С1у РЬе РЬе Зег Азп Уа1 Зег Зег А1а РЬе <31и Ьуз
145 150 155 160
Суз Н13 Рго Тгр ТЬг Зег Суз (31и ТЬг Ьуз Азр Ьеи ν»ι νβΐ С1п С1п
165 170 175
А1а <31у ТЬг Азп Ьуз ТЬг Азр Уа1 7а1 Суз С1у Рго (31п Азр Агд Ьеи
180 185 190
Агд А1а Ьеи Уа1 Уа1 Х1е Рго 11е 11е РЬе С1у 11е Ьеи РЬе А1а 11е
195 200 205
Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 РЬе Х1е Ьуз Ьуз νβΐ А1а Ьуз ьуз Рго ТЬг Азп
210 215 220
Ьуз А1а РГО Н1з Рго ьуз 61п С1и Рго <31п 01и 11е АЗП РЬе Рго Азр
225 230 235 240
Азр Ьеи Рго 61у Зег Азп ТЬг А1а А1а Рго Уа1 <31п С1и ТЬг Ьеи Нгз
245 250 255
б1у Суз С1п Рго Уа1 ТЬг С31п С1и Азр <31у Ьуз С1и Зег Агд 11е Зег
260 265 270
ναΐ 61η. 61и Агд αΐη

Claims (51)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция, содержащая антагонистическое моноклональное антитело к СЭ40 в качестве обладающего терапевтической или профилактической активностью компонента, где моноклональное антитело обладает способностью специфически связываться с человеческим антигеном СЭ40, экспрессируемым на поверхности человеческой В-клетки, и не обладает значительной агонистической активностью при связывании с антигеном СЭ40, экспрессируемым на поверхности В-клетки;
    аргинин в его кислотной форме (аргинин-НС1) в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотонической; и забуферивающий агент для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, где моноклональное антитело к СЭ40 выбрано из группы, включающей
    а) моноклональное антитело СН1К-12.12, полученное из линии клеток гибридомы АТСС Ж. РТА5543;
    б) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:2 и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:4 или 8ЕЦ ΙΌ N0:5;
    в) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь вклю
    - 62 018301 чает вариабельную и константную области легкой цепи, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:2, и где указанная тяжелая цепь включает вариабельную и константную области тяжелой цепи, представленные в 8Е0 ΙΌ N0:4 или в 8ЕО ΙΌ N0:5;
    г) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1, и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:3; и
    д) моноклональное антитело по любому из пп. а), б), в) и г), где указанное антитело получено рекомбинантным путем в линии клеток СНО, где концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 до примерно 100 мМ и где композиция содержит аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ.
  2. 2. Композиция по п.1, осмоляльность которой составляет от примерно 240 до примерно 360 ммолей/кг.
  3. 3. Композиция по п.1, в которой концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 до примерно 20 мМ.
  4. 4. Композиция по п.3, в которой концентрация забуферивающего агента составляет примерно 10 мМ.
  5. 5. Композиция по одному из пп.1-4, в которой забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты.
  6. 6. Композиция по п.5, которая имеет значение рН, составляющее примерно 5,5.
  7. 7. Композиция по п.1, содержащая аргинин-НС1 в концентрации от примерно 100 до примерно 175 мМ.
  8. 8. Композиция по п.7, содержащая аргинин-НС1 в концентрации примерно 150 мМ.
  9. 9. Композиция по п.3, в которой концентрация забуферивающего агента составляет примерно 10 мМ и которая имеет значение рН примерно 5,5.
  10. 10. Композиция по п.9, содержащая аргинин-НС1 в концентрации примерно 150 мМ.
  11. 11. Композиция по п.1, которая дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
  12. 12. Композиция по п.11, в которой поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.
  13. 13. Композиция по п.12, в которой концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,001 до примерно 1,0% (мас./об.).
  14. 14. Композиция по п.13, где концентрация полисорбата 20 составляет от примерно 0,025 до примерно 0,1% (мас./об.).
  15. 15. Композиция по п.1 или 11, дополнительно содержащая метионин в концентрации от примерно 0,5 до примерно 20,0 мМ.
  16. 16. Композиция по п.15, где концентрация метионина составляет от примерно 1,0 до примерно 20,0 мМ.
  17. 17. Композиция по п.16, где концентрация метионина составляет примерно 5,0 мМ.
  18. 18. Композиция по любому из пп.1-17, в которой антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в концентрации от примерно 0,1 до примерно 50,0 мг/мл.
  19. 19. Композиция по п.18, в которой антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в концентрации от примерно 1,0 до примерно 35,0 мг/мл.
  20. 20. Композиция по п.19, в которой антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в концентрации от примерно 10,0 до примерно 35,0 мг/мл.
  21. 21. Композиция по п.1, которая является стабильной при хранении при температуре от примерно 2°С до примерно 8°С в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 18 месяцев.
  22. 22. Композиция по п.1, которая является стабильной при хранении при температуре 25°С в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 3 месяца.
  23. 23. Композиция по п.2, которая содержит аргинин-НС1 в концентрации примерно 150 мМ и забуферивающий агент в концентрации от примерно 5 до примерно 20 мМ, где композиция имеет значение рН от примерно 5,0 до примерно 6,0 и осмоляльность от примерно 250 до примерно 330 ммолей/кг.
  24. 24. Композиция по п.1, которая дополнительно содержит метионин или полисорбат 20, или метионин и полисорбат 20, где метионин, когда содержится в композиции, имеет концентрацию от примерно 0,5 до примерно 20,0 мМ, и где полисорбат 20, когда он содержится в композиции, имеет концентрацию от примерно 0,025 до примерно 0,1% (мас./об.).
  25. 25. Композиция по п.23 или 24, в которой антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в концентрации от примерно 10,0 до примерно 35,0 мг/мл.
  26. 26. Композиция по п.25, в которой антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 представляет собой моноклональное антитело СН[В-12.12, полученное из линии клеток гибридомы АТСС №. РТА-5543.
  27. 27. Способ лечения индивидуума, имеющего раковое или предраковое состояние, ассоциированное с клетками, экспрессирующими ί.Ό40, который заключается во введении указанному индивидууму тера- 63 018301 певтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-26.
  28. 28. Способ по п.27, согласно которому рак характеризуется неопластическим ростом В-клеток.
  29. 29. Способ по п.28, согласно которому рак выбран из группы, включающей неходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз, множественную миелому, В-клеточную лимфому, высокозлокачественную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфому промежуточной степени злокачественности, В-клеточную лимфому низкой степени злокачественности, острый лимфобластный В-клеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, плазмацитому, фолликулярную лимфому, фолликулярную мелкоклеточную лимфому с расщепленными ядрами, фолликулярную крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому смешанного типа с расщепленными ядрами, диффузную мелкоклеточную лимфому с расщепленными ядрами, диффузную мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны, лимфому лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, моноцитоидную В-клеточную лимфому, лимфому селезенки, лейкемический ретикулёз, диффузную крупноклеточную лимфому, медиастинальную крупноклеточную Вклеточную лимфому, лимфоматоидный гранулематоз, интраваскулярный лимфоматоз, диффузную смешанно-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную лимфому, иммунобластную лимфому, лимфому Беркитта, СПИД-связанную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрома, лимфому из клеток мантии и болезнь тяжелых цепей.
  30. 30. Способ по п.27, согласно которому рак представляет собой гематологическое злокачественное заболевание не-В-клеточной природы.
  31. 31. Способ по п.30, согласно которому злокачественное заболевание выбрано из группы, включающей острые лейкозы, миелобластные лейкозы, острые миелоцитарные лейкозы, промиелоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, моноцитарный лейкоз, эритролейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз и истинную полицитенемию.
  32. 32. Способ по п.27, согласно которому рак представляет собой солидную опухоль, которая содержит неопластические клетки, экспрессирующие антиген СЭ40.
  33. 33. Способ по п.32, согласно которому солидная опухоль выбрана из группы, включающей карциному легкого, карциному молочной железы, карциному яичника, карциному кожи, карциному ободочной кишки, карциному мочевого пузыря, карциному печени, карциному желудка, карциному предстательной железы, почечно-клеточную карциному, носоглоточную карциному, плоскоклеточную карциному, папиллярную карциному щитовидной железы, карциному шейки матки и различные типы саркомы.
  34. 34. Способ по п.27, согласно которому предзлокачественное состояние представляет собой моноклональную гаммапатию неопределенного значения (МГНЗ).
  35. 35. Способ лечения индивидуума, имеющего воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание, которое ассоциировано с клетками, экспрессирующими ί.Ό40, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-26.
  36. 36. Способ по п.35, согласно которому воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание выбрано из группы, включающей системную красную волчанку (СКВ), дискоидную волчанку, люпуснефрит, саркоидоз, юношеский артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит, подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, заболевание трансплантат против хозяина, рассеянный склероз, синдром гипер-1дЕ, нодозный полиартериит, первичный билиарный цирроз, воспалительное заболевание кишечники, болезнь Крона, глютеновую болезнь (глютен-чувствительная энтеропатия), аутоиммунный гепатит, пернициозную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродерму, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тироидит, болезнь Грейвса, тироидит Хашимото, болезнь иммунного комплекса, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (СЕШ8), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболиз, кардиомиопатию, пузырчатку обыкновенную, легочный интерстициальный фиброз, сахарный диабет типа I и типа II, гиперчувствительность типа 1, 2, 3 и замедленного типа 4, аллергию или аллергические нарушения, астму, синдром Черджа-Штросса (аллергический гранулёматоз), атопический дерматит, аллергический и воспалительный контактный дерматит, крапивницу, ^Е-опосредуемую аллергию, атеросклероз, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитические заболевания, болезнь Альцгеймера и хроническую воспалительную демиелизирующую полиневропатию.
  37. 37. Способ повышения стабильности антагонистического моноклонального антитела к ί.Ό40 в жидкой фармацевтической композиции, включающий приготовление композиции путем объединения указанного моноклонального антитела к СЭ40, аргинина в его кислой форме (аргинин-НС1) в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотоничной, и забуферивающего агента для поддержания значения рН композиция на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, причем указанное моноклональное антитело к СЭ40 выбрано из группы, включающей:
    а) моноклональное антитело СШЕ-12.12, полученное из линии клеток гибридомы АТСС Ыо. РТА5543;
    б) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь вклю
    - 64 018301 чает аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2 и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:4 или в 8ЕЦ Ш N0:5;
    в) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает вариабельную и константную области легкой цепи, представленные в 8ЕЦ Ш N0:2, и где указанная тяжелая цепь включает вариабельную и константную области тяжелой цепи 8ЕЦ Ш N0:4 или 8ЕЦ Ш N0:5;
    г) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ Ш N0:1, и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ Ш N0:3; и
    д) моноклональное антитело по любому из пп. а), б), в) и г), где указанное антитело получено рекомбинантным путем в линии клеток СНО, где концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 до примерно 100 мМ и где композиция содержит аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ.
  38. 38. Способ получения жидкой фармацевтической композиции, которая содержит антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40, включающий объединение указанного моноклонального антитела к ί.Ό40, аргинина в его кислотной форме (аргинин-НС1) в количестве, достаточном для того, чтобы сделать композицию практически изотоничной, и забуферивающего агента для поддержания значения рН композиция на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата/лимонной кислоты, причем указанное моноклональное антитело к ί.Ό40 выбрано из группы, включающей:
    а) моноклональное антитело СН1К-12.12, полученное из линии клеток гибридомы АТСС№. РТА5543;
    б) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0:2 и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:4 или 8ЕЦ Ш N0:5;
    в) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает вариабельную и константную области легкой цепи, представленные в 8ЕЦ Ш N0:2, и где указанная тяжелая цепь включает вариабельные и константные области тяжелой цепи последовательность 8ЕЦ Ш N0:4 или 8ЕО ГО N0:5;
    г) моноклональное антитело, содержащее легкую и тяжелую цепи, где указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ Ш N0:1, и где указанная тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е^I^N0:3; и
    д) моноклональное антитело по любому из пп. а), б), в) и г), где указанное антитело получено рекомбинантным путем в линии клеток СНО, где концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 до примерно 100 мМ и где композиция содержит аргинин-НС1 в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ.
  39. 39. Способ по п.37 или 38, согласно которому композиция имеет осмоляльность от примерно 240 до примерно 360 ммолей/кг.
  40. 40. Способ по п.37 или 38, согласно которому концентрация забуферивающего агента составляет от примерно 5 до примерно 20 мМ, а концентрация аргинина-НС1 составляет примерно 100 до примерно 175 мМ.
  41. 41. Способ по п.40, согласно которому концентрация забуферивающего агента составляет примерно 10 мМ, а концентрация аргинина-НС1 составляет примерно 150 мМ.
  42. 42. Способ по любому из пп.37-41, в котором забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия.
  43. 43. Способ по п.42, согласно которому композиция имеет значение рН примерно 5.5.
  44. 44. Способ по п.37 или 38, согласно которому приготавливают композицию, которая дополнительно содержит метионин или полисорбат 20 или и метионин, и полисорбат 20, где метионин, когда он содержится в композиции, имеет концентрацию от примерно 0,5 до примерно 20,0 мМ, и где полисорбат 20, когда он содержится в композиции, находится в концентрации от примерно 0,025 до примерно 0,1% (мас./об.).
  45. 45. Способ по любому из пп.37-44, согласно которому антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в композиции в концентрации от примерно 0,1 до примерно 50,0 мг/мл.
  46. 46. Способ по п.45, согласно которому антагонистическое моноклональное антитело к ί.Ό40 содержится в композиции в концентрации от примерно 10,0 до примерно 35,0 мг/мл.
  47. 47. Стабильная жидкая фармацевтическая композиция, содержащая антагонистическое моноклональное антитело СН1К-12.12 к СО 40, полученное из линии клеток гибридомы АТСС №. РТА-5543, в качестве обладающего терапевтической или профилактической активностью компонента, аргинин в его кислотной форме (аргинин-НС1) в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ, и забуферивающий агент для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где
    - 65 018301 забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 до примерно 20 мМ.
  48. 48. Способ лечения индивидуума, имеющего раковое или предраковое состояние, которое ассоциировано с клетками, экспрессирующими СЭ40, заключающийся в том, что указанному индивидууму вводят терапевтически эффективное количество композиции по п.47.
  49. 49. Способ лечения индивидуума, имеющего воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание, которое ассоциировано с клетками, экспрессирующими ί.Ό40, заключающийся в том, что указанному индивидууму вводят терапевтически эффективное количество композиции по п.47.
  50. 50. Способ повышения стабильности антагонистического моноклонального антитела СН1Я-12.12 к ί.Ό40, полученного из линии клеток гибридомы АТСС №. РТА-5543, в жидкой фармацевтической композиции, включающий приготовление композиции путем объединения указанного моноклонального антитела с аргинином в его кислотной форме (аргинин-НС1) в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ, и забуферивающим агентом для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 до примерно 20 мМ.
  51. 51. Способ получения жидкой фармацевтической композиции, содержащей антагонистическое моноклональное антитело СН1Я-12.12 к СЭ40, полученное из линии клеток гибридомы АТСС №. РТА5543, включающий объединение указанного моноклонального антитела с аргинином в его кислотной форме (аргинин-НС1) в концентрации от примерно 50 до примерно 200 мМ, и забуферивающим агентом для поддержания значения рН композиции на уровне от примерно 5,0 до примерно 7,0, где забуферивающий агент представляет собой буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты в концентрации от примерно 5 до примерно 20 мМ.
EA200802135A 2006-04-21 2007-04-17 Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение EA018301B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79401106P 2006-04-21 2006-04-21
PCT/US2007/066757 WO2007124299A2 (en) 2006-04-21 2007-04-17 Antagonist anti-cd40 antibody pharmaceutical compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200802135A1 EA200802135A1 (ru) 2009-04-28
EA018301B1 true EA018301B1 (ru) 2013-07-30

Family

ID=38556677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802135A EA018301B1 (ru) 2006-04-21 2007-04-17 Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение

Country Status (30)

Country Link
US (2) US8945564B2 (ru)
EP (1) EP2019841A2 (ru)
JP (2) JP5290152B2 (ru)
KR (1) KR101317235B1 (ru)
CN (1) CN101426817B (ru)
AR (1) AR060487A1 (ru)
AU (1) AU2007240507B2 (ru)
BR (1) BRPI0710826A2 (ru)
CA (1) CA2649907A1 (ru)
CR (1) CR10379A (ru)
CU (1) CU23856A3 (ru)
EA (1) EA018301B1 (ru)
EC (1) ECSP088903A (ru)
GE (1) GEP20125628B (ru)
GT (1) GT200700034A (ru)
HN (1) HN2008001572A (ru)
IL (1) IL194642A0 (ru)
MA (1) MA30470B1 (ru)
ME (1) MEP39508A (ru)
MX (1) MX2008013508A (ru)
NI (1) NI200800284A (ru)
NO (1) NO20084796L (ru)
NZ (1) NZ571757A (ru)
SA (1) SA07280191B1 (ru)
SM (1) SMP200800064B (ru)
SV (1) SV2008003071A (ru)
TN (1) TNSN08412A1 (ru)
TW (1) TW200808349A (ru)
UA (1) UA94264C2 (ru)
WO (1) WO2007124299A2 (ru)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
WO2006138181A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
AR060487A1 (es) * 2006-04-21 2008-06-18 Xoma Technology Ltd Composiciones farmaceuticas de antagonistas del anticuerpo anti- cd40
AU2007261315B2 (en) 2006-06-21 2012-10-25 Musc Foundation For Research Development Targeting complement factor H for treatment of diseases
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
DK2285409T3 (en) * 2008-05-30 2016-08-01 Xbiotech Inc IL-1alpha antibodies
BRPI0913366A8 (pt) 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
JP2011523853A (ja) 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
SG192489A1 (en) 2008-07-08 2013-08-30 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP3235509A1 (en) 2009-03-05 2017-10-25 AbbVie Inc. Il-17 binding proteins
RS20120461A1 (en) 2009-07-02 2013-06-28 Musc Foundation For Research Development METHODS FOR STIMULATION OF LIVER REGENERATION
RU2012112550A (ru) 2009-09-01 2013-10-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
UY32948A (es) 2009-10-15 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
NZ600393A (en) 2009-11-05 2014-08-29 Alexion Cambridge Corp Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hemolytic anemias and disease states involving intravascular and extravascular hemolysis
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
AU2010339770B2 (en) * 2009-12-21 2015-02-12 Genentech, Inc. Antibody formulation
AU2013202276B2 (en) * 2009-12-21 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulation
EA031872B1 (ru) 2010-03-31 2019-03-29 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Гуманизированное антитело к cd40, его применение, фармацевтическая композиция, содержащая это антитело, и выделенный полинуклеотид, кодирующий его
CN104804089A (zh) 2010-05-14 2015-07-29 Abbvie公司 Il-1结合蛋白
JP5986990B2 (ja) 2010-05-14 2016-09-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレート 改善された補体レセプター２（ｃｒ２）ターゲティング基
US9815890B2 (en) 2010-06-22 2017-11-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Antibodies to the C3d fragment of complement component 3
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
PE20131412A1 (es) 2010-08-03 2014-01-19 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CN103260639A (zh) 2010-08-26 2013-08-21 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2012048113A2 (en) 2010-10-07 2012-04-12 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
WO2012075111A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies in combination therapy for b cell-related cancers
WO2012121775A2 (en) 2010-12-21 2012-09-13 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9125893B2 (en) 2011-02-17 2015-09-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-CD40 antibody pharmaceutical preparation
DK3556774T3 (da) 2011-03-11 2024-03-25 Univ Emory Anti-CD40-antistoffer og anvendelser deraf
PE20141188A1 (es) 2011-04-21 2014-09-22 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos anticuerpos que antagonizan cd40
PH12018502221B1 (en) 2011-05-02 2023-05-10 Millennium Pharm Inc FORMULATION FOR ANTI-a4ß7 ANTIBODY
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
ES2704038T3 (es) 2011-05-24 2019-03-13 Zyngenia Inc Complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos
JP2014533659A (ja) 2011-10-24 2014-12-15 アッヴィ・インコーポレイテッド スクレロスチンに対するイムノバインダー
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
ES2702246T3 (es) * 2012-03-26 2019-02-28 Sanofi Sa Formulaciones de agente de unión IgG4 estables
WO2013148686A2 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 Sanofi Stable igg4 binding agent formulations
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
HUE043552T2 (hu) 2012-06-08 2019-09-30 Sutro Biopharma Inc Antitestek, amelyek tartalmaznak helyspecifikus nem természetes aminosav maradékokat, eljárások elõállításukra és eljárások használatukra
WO2014011955A2 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Abbvie, Inc. Il-1 binding proteins
JP2015535212A (ja) 2012-08-17 2015-12-10 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・コロラド、ア・ボデイー・コーポレイト 補体活性化を検出するための組成物および方法
US10413620B2 (en) 2012-08-17 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Light-emitting versions of the monoclonal antibody to C3D (MAB 3D29) for imaging
ES2907763T3 (es) 2012-08-31 2022-04-26 Sutro Biopharma Inc Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido
AR093311A1 (es) 2012-11-01 2015-05-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual contra el factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y el ligando involucrado en la señalizacion celula a celula a traves del receptor notch (dll4)
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
EA038918B1 (ru) 2013-03-15 2021-11-09 Зинджения, Инк. Пептид, связывающий рецептор эпидермального фактора роста, мультиспецифические комплексы, содержащие пептид и антитела, и их применение
US20160075766A1 (en) 2013-05-21 2016-03-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method for producing antibodies using ovine b-cells and uses thereof
EA201592285A1 (ru) 2013-05-30 2016-05-31 Байоджен Ма Инк. Антигенсвязывающие белки к рецептору онкостатина м
WO2015006555A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
RU2763787C2 (ru) * 2013-10-24 2022-01-11 Астразенека Аб Стабильные водные составы на основе антител
EP3113796A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
JP6568207B2 (ja) * 2014-05-19 2019-08-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒツジｂ細胞を用いて抗体を産生するための方法およびその使用
EP3760208B1 (en) 2014-06-25 2024-05-29 The General Hospital Corporation Targeting human satellite ii (hsatii)
US20170233485A1 (en) * 2014-08-18 2017-08-17 Biogen Ma Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
CA2969847A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
US20180264112A1 (en) * 2015-01-18 2018-09-20 Biogen Ma Inc. Anti-CD40 Antibody Formulations
PL3297653T3 (pl) 2015-05-22 2022-01-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Leczenie hipoglikemii po operacji bariatrycznej antagonistami GLP-1
ES2774016T3 (es) * 2015-05-29 2020-07-16 Abbvie Inc Anticuerpos anti-cd40 y usos de los mismos
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
SG10201913748QA (en) 2015-08-11 2020-03-30 Univ Osaka Antibody
WO2017040566A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of anti-cd40 antibodies for treatment of lupus nephritis
BR112018004296B1 (pt) 2015-09-04 2020-05-05 Primatope Therapeutics Inc anticorpos anti-cd40 humanizados e usos dos mesmos
CN109069622A (zh) * 2015-09-30 2018-12-21 詹森生物科技公司 特异性结合人cd40的拮抗性抗体和使用方法
EA039944B1 (ru) * 2016-01-27 2022-03-30 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Применение антител к cd40 для лечения волчаночного нефрита
KR102429230B1 (ko) * 2016-02-20 2022-08-05 삼성전자주식회사 안테나 장치 및 안테나 장치를 포함하는 전자 장치
JP7178906B2 (ja) 2016-05-19 2022-11-28 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ナチュラルキラー細胞および制御性Ｔ細胞の活性を強化するためのプラットフォームである、その受容体ＩＬ－２Ｒβに繋ぎ止められたインターロイキン－２
TWI826351B (zh) * 2016-05-31 2023-12-21 大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司 Ｒ抗體,其藥物組合物及其應用
EP3472197A1 (en) 2016-06-15 2019-04-24 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same
BR112018076281A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited imunocitocina, uso de uma imunocitocina, método, composição farmacêutica, método para tratar uma doença proliferativa em um animal, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e anticorpo ou fragmento do mesmo
KR102413592B1 (ko) 2016-10-21 2022-06-27 암젠 인크 약학적 제형 및 그의 제조 방법
WO2018089688A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Jinjun Shi Restoration of tumor suppression using mrna-based delivery system
CA3043899A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Buffered formulations of exendin (9-39)
CN110662761B (zh) * 2017-04-11 2024-06-21 基尼克萨制药有限公司 稳定的抗osmr抗体制剂
EP3618871A4 (en) 2017-05-02 2021-01-06 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-LAG3 ANTIBODIES ETCO-FORMULATIONS ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
EP3672632A1 (en) * 2017-08-22 2020-07-01 Biogen MA Inc. Pharmaceutical compositions and dosage regimens containing anti-alpha(v)beta(6) antibodies
GB201717966D0 (en) * 2017-10-31 2017-12-13 Xenikos Bv Immunotoxins, formulations thereof and their use in medicine
CN112533613A (zh) 2018-02-06 2021-03-19 通用医疗公司 作为肿瘤免疫应答的生物标志物的重复rna
CN112119092A (zh) * 2018-02-12 2020-12-22 无糖尿病公司 改进的拮抗性抗人cd40单克隆抗体
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
SG11202103907PA (en) * 2018-10-18 2021-05-28 Merck Sharp & Dohme Formulations of anti-rsv antibodies and methods of use thereof
JPWO2020213568A1 (ru) * 2019-04-18 2020-10-22
WO2020227159A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
JP2023510784A (ja) 2020-01-10 2023-03-15 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 脳腫瘍を処置するための血液脳関門を横断する免疫療法剤を送達するための方法および組成物
AU2021227871A1 (en) * 2020-02-24 2022-09-15 Medimmune, Llc Formulations of anti-endothelial lipase antibodies
US20230095053A1 (en) 2020-03-03 2023-03-30 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
MX2023008949A (es) 2021-01-28 2023-10-23 Regeneron Pharma Composiciones y metodos para tratar el sindrome de liberacion de citocinas.
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2023278641A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US12234294B2 (en) * 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
KR20240095255A (ko) * 2021-11-05 2024-06-25 키닉사 파마슈티컬스, 게엠베하 인간화 항-cd40 항체의 약학적 조성물
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
US12150991B2 (en) 2022-11-07 2024-11-26 Upstream Bio, Inc. Pharmaceutical compositions comprising anti-human TSLP receptor antibodies and methods of using the same
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037329A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Astrazeneca Ab Pharmaceutical formulation comprising an antibody and a citrate buffer
WO2005044854A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
US20050175611A1 (en) * 2003-11-26 2005-08-11 Hanns-Christian Mahler Pharmaceutical preparation comprising an antibody against the EGF receptor
WO2006020935A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Wyeth Stabilizing formulations
WO2006125207A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Amgen Inc. Compositions and methods for increasing the stability of antibodies
WO2007092772A2 (en) * 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Inc. Protein formulations

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3766162A (en) 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US4233402A (en) 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
AU686230B2 (en) 1993-10-01 1998-02-05 Immunex Corporation Antibodies to CD40
PT751781E (pt) 1993-12-23 2004-09-30 Nat Inst Of Health As Repr By Utilizacao de anticorpos monoclonais ou ligandos oligomericos soluveis no fabrico de um medicamento para a prevencao ou tratamento de desordens neoplasicas
WO1995023512A1 (en) 1994-03-03 1995-09-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Terminal complement inhibitor fusion genes and proteins
GB9425060D0 (en) 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
SK285962B6 (sk) 1997-06-20 2007-12-06 Biogen Idec Ma Inc. Použitie činidla rušiaceho väzbu CD40:CD154 na zmiernenie závažnosti syndrómu inhibície exogénneho proteínu
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
ES2278463T3 (es) 1998-12-08 2007-08-01 Biovation Limited Metodo para reducir la inmunogenicidad de proteinas.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
MY133346A (en) 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1173589A1 (en) 1999-04-16 2002-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
IL149008A0 (en) * 1999-10-04 2002-11-10 Chiron Corp Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
WO2001034649A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
AU2001259215A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
CN1446104A (zh) 2000-07-12 2003-10-01 Idec药物公司 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用
KR20040023565A (ko) 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
CA2424749A1 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Chiron Corporation Methods of therapy for b-cell malignancies using antagonist anti-cd40 antibodies
CA2436180C (en) 2001-01-31 2011-11-08 Idec Pharmaceutical Corporation Immunoregulatory antibodies and uses thereof
AU2002250352C1 (en) 2001-04-02 2009-04-30 Genentech, Inc. Combination therapy
EP2009027B1 (en) 2001-04-27 2014-05-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-CD40 monoclonal antibody
WO2003029296A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
NZ532896A (en) 2001-11-08 2007-08-31 Pdl Biopharma Inc Stable liquid pharmaceutical formulation of IGG antibodies including daclizumab and fontolizumab
WO2003045978A2 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibody therapy for multiple sclerosis treatment
JP4583762B2 (ja) 2002-02-27 2010-11-17 イミュネックス・コーポレーション ポリペプチド製剤
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040022792A1 (en) 2002-06-17 2004-02-05 Ralph Klinke Method of stabilizing proteins at low pH
JP2006515882A (ja) 2003-01-08 2006-06-08 カイロン コーポレイション 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）または組織因子経路インヒビター改変体を含有する安定化水性組成物
DK2335725T3 (en) * 2003-04-04 2017-01-23 Genentech Inc Highly concentrated antibody and protein formulations
EP2281577B1 (en) 2003-05-14 2016-11-16 ImmunoGen, Inc. Drug conjugate composition
WO2005033143A1 (ja) 2003-10-01 2005-04-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体の安定化方法及び安定化された溶液状抗体製剤
US20070110754A1 (en) 2003-11-04 2007-05-17 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of chronic lymphocytic leukemia
EP2236172A1 (en) 2003-11-04 2010-10-06 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
WO2005044855A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies for treatment of multiple myeloma
ATE476991T1 (de) 2003-11-04 2010-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur behandlung von soliden tumoren mit expression des cd40-zelloberflächen-antigens
US20070184050A1 (en) 2003-12-25 2007-08-09 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Stable water-based medicinal preparation containing antibody
MXPA06014079A (es) 2004-06-01 2007-02-15 Ares Trading Sa Metodo para estabilizar proteinas.
DE102004028815A1 (de) 2004-06-15 2006-01-12 Siemens Ag Verfahren zur Ressourcen-Reservierung für ein Inter-Domain-Routing mit Dienstgütemerkmalen
US20080057070A1 (en) 2004-11-04 2008-03-06 Chiron Corporation Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
EP2312315A1 (en) 2005-05-18 2011-04-20 Novartis AG Methods for diagnosis and treatment of diseases having an autoimmune and/or inflammatory component
JP5208730B2 (ja) 2005-05-18 2013-06-12 ノバルティス アーゲー Ｃｄ４０シグナル伝達によって媒介される増殖性障害の診断および治療のための方法
AR060487A1 (es) * 2006-04-21 2008-06-18 Xoma Technology Ltd Composiciones farmaceuticas de antagonistas del anticuerpo anti- cd40

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037329A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Astrazeneca Ab Pharmaceutical formulation comprising an antibody and a citrate buffer
WO2005044854A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
US20050175611A1 (en) * 2003-11-26 2005-08-11 Hanns-Christian Mahler Pharmaceutical preparation comprising an antibody against the EGF receptor
WO2006020935A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Wyeth Stabilizing formulations
WO2006125207A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Amgen Inc. Compositions and methods for increasing the stability of antibodies
WO2007092772A2 (en) * 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Inc. Protein formulations

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIBASHI M. ET AL.: "Is arginine a protein-denaturant?" PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA, US, vol. 42, no. 1, July 2005 (2005-07), pages 1-6, XP004918440 ISSN: 1046-5928 the whole document *
MAHLER H-C ET AL.: "Induction and analysis of aggregates in a liquid IgG1-antibody formulation" EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V., AMSTERDAM, NL, vol. 59, no. 3, April 2005 (2005-04), pages 407-417, XP004780138 ISSN: 0939-6411 the whole document *
MATHEUS SUSANNE ET AL.: "A critical evaluation of T-m(FTIR) measurements of high-concentration IgG(1) antibody formulations as a formulation development tool" PHARMACEUTICAL RESEARCH (DORDRECHT), vol. 23, no. 7, July 2006 (2006-07), pages 1617-1627, XP002454792 ISSN: 0724-8741 the whole document *
TSUMOTO KOUHEI ET AL.: "Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification" BIOTECHNOLOGY PROGRESS, XX, XX, vol. 20, no. 5, September 2004 (2004-09), pages 1301-1308, XP002383385 ISSN: 8756-7938 the whole document *
WANG WEI: "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein Pharmaceuticals" INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, AMSTERDAM, NL, vol. 185, no. 2, 20 August 1999 (1999-08-20), pages 129-188, XP002323952 ISSN: 0378-5173 the whole document *
ZHENG ET AL.: "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298" INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, AMSTERDAM, NL, vol. 308, no. 1-2, 3 February 2006 (2006-02-03), pages 46-51, XP005249234 ISSN: 0378-5173 abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
TNSN08412A1 (en) 2010-04-14
SV2008003071A (es) 2010-02-01
HN2008001572A (es) 2011-06-08
CA2649907A1 (en) 2007-11-01
NO20084796L (no) 2008-11-21
SMP200800064B (it) 2009-11-06
AU2007240507B2 (en) 2013-07-18
MEP39508A (en) 2011-02-10
CU23856A3 (es) 2012-12-17
WO2007124299A3 (en) 2008-01-03
CR10379A (es) 2009-01-07
JP2013129673A (ja) 2013-07-04
NZ571757A (en) 2012-01-12
IL194642A0 (en) 2011-08-01
KR20090009204A (ko) 2009-01-22
UA94264C2 (ru) 2011-04-26
JP5290152B2 (ja) 2013-09-18
KR101317235B1 (ko) 2013-10-15
WO2007124299A2 (en) 2007-11-01
SA07280191B1 (ar) 2010-06-22
MX2008013508A (es) 2008-10-31
WO2007124299A8 (en) 2008-11-06
NI200800284A (es) 2011-08-05
MA30470B1 (fr) 2009-06-01
ECSP088903A (es) 2009-02-27
AU2007240507A1 (en) 2007-11-01
CN101426817A (zh) 2009-05-06
US20090304706A1 (en) 2009-12-10
GT200700034A (es) 2008-01-25
US20150110783A1 (en) 2015-04-23
EA200802135A1 (ru) 2009-04-28
SMAP200800064A (it) 2008-11-26
EP2019841A2 (en) 2009-02-04
BRPI0710826A2 (pt) 2011-08-23
CN101426817B (zh) 2013-07-10
JP2009534401A (ja) 2009-09-24
GEP20125628B (en) 2012-09-10
AR060487A1 (es) 2008-06-18
TW200808349A (en) 2008-02-16
US8945564B2 (en) 2015-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018301B1 (ru) Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение
KR101960004B1 (ko) Cldn6 생체내 표적-지향된 항체를 이용하는 암 치료법
US20180273632A1 (en) Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
ES2758126T3 (es) Composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad
RU2429014C2 (ru) Лечение опухолей, экспрессирующих мутантные рецепторы egf
KR101960509B1 (ko) 클라우딘 6 특이적 항체
ES2602263T5 (es) Anticuerpo monoclonal humano para CD134 (OX40) humana y procedimientos de preparación y utilización del mismo
ES2428089T3 (es) Usos de anticuerpos anti-cd40
JP6277127B2 (ja) インスリン様成長因子１による細胞の活性化を阻害するための方法
UA128387C2 (uk) Антитіло до lag3
ES2880731T3 (es) Anticuerpos anti-PSGL-1 tetravalentes y usos de los mismos
AU2018241099A1 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
EA027499B1 (ru) Антитела к cd37
EA017812B1 (ru) Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
EA030313B1 (ru) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ IgM, IgG И IgA У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА
EA016186B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
UA123111C2 (uk) Антитіло до cd40 та його застосування
EA019344B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
EA014226B1 (ru) Антитела к cd154, их фрагменты и способы применения антител и фрагментов
EA015584B1 (ru) Антитело к cd38 человека и его применение
EA025962B1 (ru) АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
CA2597717A1 (en) Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
CN117447599A (zh) 对muc18特异性的抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU