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CN112119092A - 改进的拮抗性抗人cd40单克隆抗体 - Google Patents

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CN112119092A
CN112119092A CN201980025343.4A CN201980025343A CN112119092A CN 112119092 A CN112119092 A CN 112119092A CN 201980025343 A CN201980025343 A CN 201980025343A CN 112119092 A CN112119092 A CN 112119092A
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CN
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antibody
cell
sequence
antigen
chain variable
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安东·埃格伯特·彼得·阿当
马克·德波尔
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Diabetes Free Co
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Abstract

本公开内容涉及结合和拮抗CD40的抗体。这些抗体对于抑制免疫应答和治疗自身免疫性疾病特别有用。

Description

改进的拮抗性抗人CD40单克隆抗体
发明领域
本公开内容涉及结合和拮抗CD40的抗体。这些抗体对于抑制免疫应答和治疗自身免疫性疾病特别有用。
发明背景
CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白。该蛋白主要在包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞(DC)在内的抗原呈递细胞的表面表达，并且还可见于许多其他类型的细胞，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞和角质形成细胞。CD40受体的配体是CD40L，也称为CD154。该32kDa蛋白是II型整合膜糖蛋白，并且在活化的CD4+T细胞和少量的活化CD8+T细胞上瞬时表达。此外，已经在许多其他免疫细胞和其他类型的细胞上发现CD40L。CD40及其配体(CD40L)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。
CD40与CD40L的相互作用诱导了多种下游效应。与CD40L连接后，CD40被激活并进入细胞以刺激许多促炎和凝血酶原基因的表达。CD40-CD40L相互作用与细胞和体液免疫应答均有关。一些研究已经清楚地证明，多种慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病涉及CD40-CD40L相互作用。因此，对CD40-CD40L相互作用的干预是调节免疫应答以治疗免疫相关疾病的潜在目标。
鼠模型研究表明，CD40/CD40L在多种疾病中具有功能性作用。例如，CD40L转基因小鼠患得致死性炎症性肠病。在另一方面，在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的炎症性肠病模型中，发现从T细胞重建之日起用抗CD40L抗体治疗可完全预防实验性结肠炎的临床和组织学表现。
克罗恩病患者患有胃肠道的衰弱性炎症性疾病。该疾病的特征在于活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞流入病变粘膜。粘膜免疫细胞在克罗恩病中对引发炎症回路起着核心作用。先前有关克罗恩病中CD40/CD40L表达的研究表明，CD40L对活化的CD4+T细胞起主导作用。Mab 5D12抗体被开发作为非刺激性拮抗性CD40抗体。使用5D12抗体进行免疫组织化学分析，发现克罗恩病患者的病变粘膜与未病变粘膜相比，CD40表达水平升高。此外，用5D12处理源自患者的T细胞导致由共培养单核细胞产生的IL-12和TNF-α的减少。这些研究结果表明，CD40拮抗性抗体5D12潜在地抑制克罗恩病中的免疫应答。本公开内容提供了用于拮抗CD40的改善的抗体。
发明内容
本公开内容的一方面提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含具有序列RSSQSLAZ6SZ7GNTYLH的CDR1，其中Z6是S并且Z7是S或Q；具有序列KVSNRFS的CDR2；以及具有序列SQSTHVPWT的CDR3，并且其中所述重链可变区包含具有序列GFSX11SRY的CDR1，其中X11是I、L或V，优选地其中X11是L；具有序列WGGGSTD的CDR2；以及具有序列TDGDY的CDR3。
优选地，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段具有包含以下序列的重链可变区：
QVX1LX2ESGX3GLVKPX4X5X6LX7X8X9CX10VSGFSX11SRYSVYWX12RQX13PGKGX14EWX15GMMWGGGSTDYX16X17SX18KX19RX20TISKDX21X22KX23X24VX25LX26X27X28SLX29X30X31DTAX32YYCVRTDGDYWGQGTX33VTVSS；其中：
X1是Q；X2是Q或V；X3是P或G；X4是S或G；X5是E、Q或G；X6是T或S；X7是S或R；X8是I或L；X9是T或S；X10是T或A；X11是I、L或V；优选地，其中X11是L；X12是I、L或V；优选地，其中X12是I或V；X13是P或A；X14是P或L；X15是M或I；X16和X17是ST或NP；X18是L或V；X19是S或G；X20是L或F；X21是T或N；X22是S或A；X23是S或T；X24是Q或S；X25是S或Y；X26是K或Q；X27是M或L；X28是S；X29是R或T；X30是A；X31是A或E；X32是V并且X33是L。
优选地，其中：
X2是Q；X3是P；X4是S；X5是E或Q；X6是T；X7是S；X9是T；X10是T；X13是P；X18是L；X19是S；X20是L；X21是T；X22是S；X23是S；X24是Q；X25是S；X26是K；X29是T；并且X31是A。
优选地，其中：
X2是V；X3是G；X4是G；X5是G；X6是S；X7是R；X8是L；X9是S；X10是A；X13是A；X14是L；X15是M；X16和X17是ST；X18是V；X19是G；X20是F；X21是N；X22是A；X23是T；X24是S；X25是Y；X26是Q；X27是M；X29是R；并且X31是E。
优选地，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段具有包含以下序列的轻链可变区：
Z1Z2Z3Z4TQSPLSLPVTZ5GQPASISCRSSQSLAZ6SZ7GNTYLHWYLQZ8PGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR；其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是ELQL或DIVM；Z5是L或P；Z6是S或D；Z7是S或Q；并且Z8是R或K。
优选地，其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是ELQL；Z5是L；并且Z8是R。
优选地，其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是DIVM；Z5是P；Z6是S；Z7是Q；并且Z8是K。优选地，所述抗体或其抗原结合片段是拮抗性抗人CD40单克隆抗体。优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含人抗体的恒定区，优选IgG恒定区，优选地其中所述恒定区是补体活化不足的区域，优选人IgG4恒定区或突变的人IgG1恒定区。本公开内容还提供了一种核酸，所述核酸编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的任一种。
本公开内容还提供了一种细胞，所述细胞包含和/或产生本文公开的抗体或其抗原结合片段，并且/或者包含本文公开的核酸，优选地其中所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞、NS0细胞或PER-C6TM细胞。本公开内容还提供了一种细胞培养物，所述细胞培养物包含本文公开的细胞。
本公开内容的一方面涉及一种用于产生和/或纯化所述抗体或抗原结合片段中的任一种的方法，优选地其中所述抗体的产生包括培养如前所述的细胞并从所述培养物中收获所述抗体。
本公开内容的一方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所公开的抗体或其抗原结合片段、核酸和/或细胞。优选地，如本文所公开的组合物或者抗体或其抗原结合片段用于制造药剂。优选地，所述药剂用于改善自身免疫性疾病和/或炎症性疾病的症状，和/或降低移植排斥，和/或治疗CD40阳性癌症，优选地其中所述自身免疫性和/或炎症性疾病选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病、大疱性类天疱疮和/或特应性皮炎。优选地，其中所述自身免疫和/或炎症性疾病包括炎症性肠病，优选地包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。
附图说明
图1.可变域的氨基酸序列比对
轻链和重链的可变区与PG102抗体可变区的氨基酸序列比对。根据氨基酸水平下变化的程度，氨基酸序列的差异以灰色或白色突出显示。相同的序列以黑色突出显示。根据Chothia的定义在图中指出CDR。
图2.PG102变体对CD40的结合亲和力
A.测试PG102野生型(wt)(亲本)和工程化变体对CD40的结合亲和力。将结合亲和力显示为相比于PG102野生型的百分比。
B.测试PG102野生型(亲本)和工程化变体的滴度改善倍数。将滴度改善倍数显示为相比于设定为1的PG102。
图3.用单克隆抗体治疗抑制TNF分泌
抗CD40的单克隆抗体抑制CD40L诱导的TNF分泌。在来自四个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)上以1ng/ml或10ng/ml的浓度测试PG102野生型和新抗体变体(以数据点表示)。图像示出了TNF分泌的抑制百分比。
图4.在来自4个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)上测试单克隆抗CD40抗体治疗对TNF分泌的抑制。在四个不同的供体上测试在使用CD40的配体CD40L诱导之后，不同抗体变体降低TNF分泌的能力。将细胞暴露于1ng/mL至1000ng/mL范围内的4个不同浓度下。在最高浓度下，所有的抗体变体均显示出对TNF分泌的强烈抑制。
具体实施方式
本公开内容涉及结合和拮抗CD40的抗体。这些抗体对于抑制免疫应答和治疗自身免疫性疾病特别有用。
Mab 5D12抗体被开发作为非刺激性拮抗性CD40抗体。WO2007/129895描述了嵌合抗体(ch5D12)的产生，其具有Mab 5D12的可变重链和轻链以及人IgG恒定域。WO2007/129895进一步描述了5D12抗体的去免疫化形式。WO2007/129895中描述的抗体之一是PG102。
本公开内容提供了工程化可变区以及包含所述工程化可变区的抗体和抗原结合片段，其具有用于表达和制造抗CD40抗体的良好特征。这样的特征可以包括例如蛋白稳定性、产量、CD40结合亲和力、生产细胞活力和降低的免疫原性。当大规模地制造所述抗体或其抗原结合片段时，这样的特征是有用的。优选地，这些特征中的至少一个比PG102抗体有所改善。
如本文所用的术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链组成的免疫球蛋白分子，每对链由一条“重”链和一条“轻”链组成。人轻链分为κ和λ。重链包括不同的种类，即：μ、δ、γ、α和ε。这些种类分别定义了抗体的同型，诸如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些种类对于抗体的功能是重要的并且有助于调节免疫应答。重链和轻链均由可变区和恒定区组成。重链的恒定区明显比轻链的恒定区大，这解释了重链和轻链的命名法。每个重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含穿插有构架区(FR)的互补决定区(CDR)。可变区总共包含4个FR和三个CDR。它们从氨基端羧基端的排列如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链和重链的可变区一起形成抗体结合位点并定义表位的特异性。氨基酸在本公开内容的每个区或域的分配依照Chothia的定义。
如本文所用的，抗原结合片段包括Fab、F(ab')、F(ab')2、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、双价单链抗体和其他抗原识别免疫球蛋白片段。在一些情况下，如本文所用的术语“抗体”可以理解为还包括其抗原结合片段。
本公开内容的一方面提供了一种包含轻链可变区的抗体和/或其抗原结合片段。在一些实施方案中，轻链可变区包含VL-CDR1A或VL-CDR1B作为CDR1，VL-CDR2作为CDR2以及VL-CDR3作为CDR3。轻链CDR的定义如下：
Figure BDA0002719664410000061
在PG102和小鼠5D12抗体中，轻链的CDR1均包含三个天冬酰胺残基。在本文所述的轻链CDR1中，这些天冬酰胺残基中的两个被取代。尽管不希望受到理论的束缚，但我们认为该CDR1取代可避免天冬酰胺脱酰胺作用，从而导致蛋白产量增加，同时仍保持CD40结合。
在优选的实施方案中，轻链可变区包含VL-CDR1A作为CDR1，VL-CDR2作为CDR2以及VL-CDR3作为CDR3。在另一优选的实施方案中，轻链可变区包含VL-CDR1B作为CDR1，VL-CDR2作为CDR2以及VL-CDR3作为CDR3。
在一些实施方案中，轻链可变区包含VL-FR1A或VL-FR1B作为构架区1，VL-FR2A或VL-FR2B作为构架区2，VL-FR3作为构架区3以及VL-FR4作为构架区4，如下定义：
Figure BDA0002719664410000071
在优选的实施方案中，轻链可变区包含VL-FR1A作为构架区1，VL-FR2A作为构架区2，VL-FR3作为构架区3以及VL-FR4作为构架区4。在另一优选的实施方案中，轻链可变区包含VL-FR1B作为构架区1，VL-FR2B作为构架区2，VL-FR3作为构架区3以及VL-FR4作为构架区4。
优选地，轻链可变区包含如下氨基酸序列：Z1Z2Z3Z4TQSPLSLPVTZ5GQPASISCRSSQSLAZ6SZ7GNTYLHWYLQZ8PGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR；其中：Z1、Z2、Z3和Z4是ELQL或DIVM；Z5是L或P；Z6是S或D；Z7是S或Q；并且Z8是R或K。轻链可变区的优选实施方案如下：
Figure BDA0002719664410000072
Figure BDA0002719664410000081
图1显示了不同轻链可变区的比对。
本公开内容的一方面提供了一种包含具有如下定义的CDR的重链可变区的抗体和/或其抗原结合片段：
Figure BDA0002719664410000082
如WO2007/129895所述，VH CDR1可以是VH-CDR1A、VH-CDR1B或VH-CDR1C，因为具有这些氨基酸序列的抗体均表现出类似的CD40结合。优选地，VH CDR1是VH-CDR1A或VH-CDR1C。最优选地，VH CDR1是VH-CDR1A。
在一些实施方案中，重链可变区包含VH-FR1A、VH-FR1B或VH-FR1C作为构架区1，VH-FR2A、VH-FR2B、VH-FR2C或VH-FR2D作为构架区2，VH-FR3A、VH-FR3B或VH-FR3C作为构架区3以及VL-FR4作为构架区4，如下定义：
Figure BDA0002719664410000083
Figure BDA0002719664410000091
在PG102和小鼠5D12抗体中，FR1在位置3含有赖氨酸残基。在本文公开的所有工程化重链变体中，该赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。尽管不希望受到理论的束缚，但我们认为将赖氨酸取代为谷氨酸可导致聚集减少和蛋白质表达增加。
在优选的实施方案中，重链可变区包含VH-FR1A作为构架区1，VH-FR2A作为构架区2，VH-FR3A作为构架区3以及VH-FR4作为构架区4。在另一优选的实施方案中，重链可变区包含VH-FR1A作为构架区1，VH-FR2B作为构架区2，VH-FR3A作为构架区3以及VH-FR4作为构架区4。在另一优选的实施方案中，重链可变区包含VH-FR1B作为构架区1，VH-FR2C作为构架区2，VH-FR3B作为构架区3以及VH-FR4作为构架区4。在另一优选的实施方案中，重链可变区包含VH-FR1C作为构架区1，VH-FR2D作为构架区2，VH-FR3C作为构架区3以及VH-FR4作为构架区4。
优选地，重链可变区包含如下氨基酸序列：QVX1LX2ESGX3GLVKPX4X5X6LX7X8X9CX10VSGFSX11SRYSVYWX12RQX13PGKGX14EWX15GMMWGGGSTDYX16X17SX18KX19RX20TISKDX21X22KX23X24VX25LX2 6X27X28SLX29X30X31DTAX32YYCVRTDGDYWGQGTX33VTVSS；其中：
X1是Q；X2是Q或V；X3是P或G；X4是S或G；X5是E、Q或G；X6是T或S；X7是S或R；X8是I或L；X9是T或S；X10是T或A；X11是I、L或V；优选地，其中X11是L；X12是I、L或V；优选地，其中X12是I或V；X13是P或A；X14是P或L；X15是M或I；X16和X17是ST或NP；X18是L或V；X19是S或G；X20是L或F；X21是T或N；X22是S或A；X23是S或T；X24是Q或S；X25是S或Y；X26是K或Q；X27是M或L；X28是S；X29是R或T；X30是A；X31是A或E；X32是V并且X33是L。
重链可变区的优选实施方案如下：
Figure BDA0002719664410000101
图1显示了不同重链可变区的比对。
本公开内容的一方面提供了一种包含如本文所述的轻链可变区和重链可变区的抗体和/或其抗原结合片段。
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-1作为CDR的轻链和包含VH-4作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-1的序列并且重链包含VH4的序列。(变体4(var4))
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-2作为CDR的轻链和包含VH-3作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-2的序列并且重链包含VH3的序列。(变体7)
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-2作为CDR的轻链和包含VH-4作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-2的序列并且重链包含VH4的序列。(变体8)
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-4作为CDR的轻链和包含VH-1作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-4的序列并且重链包含VH1的序列。(变体13)
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-4作为CDR的轻链和包含VH-3作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-4的序列并且重链包含VH3的序列。(变体15)
优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-4作为CDR的轻链和包含VH-4作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-4的序列并且重链包含VH4的序列。(变体16)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-1作为CDR的轻链和包含VH-1作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-1的序列并且重链包含VH1的序列。(变体1)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-1作为CDR的轻链和包含VH-2作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-1的序列并且重链包含VH2的序列。(变体2)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-1作为CDR的轻链和包含VH-3作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-1的序列并且重链包含VH3的序列。(变体3)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-2作为CDR的轻链和包含VH-1作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-2的序列并且重链包含VH1的序列。(变体5)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-2作为CDR的轻链和包含VH-2作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-2的序列并且重链包含VH2的序列。(变体6)
更优选地，抗体和/或其抗原结合片段包含：包含VL-4作为CDR的轻链和包含VH-2作为CDR的重链，优选地，轻链包含VL-4的序列并且重链包含VH2的序列。(变体14)
本公开内容提供了一组具有抗CD40拮抗性质的改进的高度选择性抗体及其抗原结合片段。这些抗体变体经优化以增加表达，同时保持或者甚至增加其对CD40的结合亲和力。作为示例性实施方案，被称为变体1-8和13-16的变体均表现出蛋白质表达和CD40结合亲和力的增加(参见表2)。
优选地，本公开内容的抗体或抗原结合片段由本文公开的轻链可变区中的任何一个结合本文公开的重链可变区中的任何一个或原PG102重链可变区组成；或者由本文公开的轻链可变区中的任何一个或原PG102轻链可变区结合本文公开的重链可变区中的任何一个组成。
本公开内容提供了具有与PG102抗体相比在多个位置有改变的氨基酸序列的可变域。重链和轻链的工程化可变域被设计用于改善抗体的稳定性和/或表达，同时保持和/或改善CD40结合性质。增加的稳定性对于生产过程以及体内和体外稳定性是重要的。
本公开内容的抗体优选是在动物和/或人体内耐受性良好的抗体。本文公开的工程化可变区来源于PG102抗体。PG102是与原小鼠5D12抗体相比在人体内具有降低的免疫原性的去免疫化抗体。如本文所用的术语“去免疫化”定义为在动物和/或人类中的免疫原性低于原抗体。
本公开内容还提供了与所述轻链可变域结合的重链可变域，如本文所公开的，呈抗人CD40的单克隆抗体的形式。可以将抗体可变区并入包含例如人抗体恒定区的较大抗体分子中。根据其重链恒定域的差异，抗体被分成五个种类或同型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些种类或同型包括用相应希腊字母命名的所述重链中的至少一个。在优选的实施方案中，本公开内容提供了根据本公开内容的抗体，其中所述恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定区，更优选地，所述恒定区包含IgG恒定区，更优选IgG1恒定区，优选突变的IgG1恒定区，最优选地，所述恒定区为IgG4恒定区。此外，所述IgG4恒定区优选为人IgG4恒定区。优选地，本公开内容的IgG4恒定区包含重链和轻链氨基酸序列的恒定区。IgG4恒定区中的一些变异自然发生并且/或者允许在不改变所得抗体的免疫学性质的情况下发生。通常在恒定区中允许约1-5个氨基酸取代。具有IgG4恒定区或突变IgG1恒定区的抗体具有抗体的至少大部分药理学性质，但不会结合补体，并且因此不会诱导其在体内结合的细胞的衰竭。优选地，所述恒定区是人抗体的恒定区。
优选地，所述恒定区是补体活化不足的区域，优选人IgG4恒定区或突变的人IgG1恒定区。
可以通过本领域技术人员已知的许多合适的试验来证实本文公开的抗体和抗原结合片段对CD40的结合。这样的试验包括例如亲和力试验，例如蛋白质印迹法(westernblot)、放射免疫测定法和ELISA(酶联免疫吸附试验)。实施例详细描述了可用于测试CD40结合的许多试验之一。在另一方面，本公开内容提供了一种编码所述抗体和抗原结合片段的核酸。本公开内容中使用的核酸通常是但不限于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。基于遗传密码，本领域技术人员可以确定编码本文公开的抗体变体的核酸序列。基于遗传密码的简并性，可以使用六十四个密码子对二十个氨基酸和翻译终止信号进行编码。如本领域技术人员已知的，不同生物的密码子使用偏好会影响基因表达水平。本领域技术人员可以使用多种计算工具，以便根据期望的核酸会在哪些生物中表达来对密码子使用进行优化。
当所述核酸在细胞中表达时，该细胞产生根据本公开内容的抗体。因此，在一个实施方案中，提供了包含根据本公开内容的抗体和/或核酸的细胞。宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物、细菌或酵母细胞。所述细胞优选为动物细胞，优选哺乳动物细胞，最优选人细胞。适合用作宿主细胞的哺乳动物细胞系的示例包括杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞、NSO细胞或ER-C6TM细胞。为了本公开内容的目的，合适的细胞是能够包含并优选地产生所述抗体和/或所述核酸的任何细胞。本公开内容还涵盖了包含所述细胞的细胞培养物。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生本文公开的抗体。在优选的实施方案中，使用细胞产生抗体，优选地其中该细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞、NS0细胞或PER-C6TM细胞。在特别优选的实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞，优选地，所述细胞在无血清培养基中培养。这包括从所述培养物中收获所述抗体。优选地将抗体从培养基中纯化，优选地所述抗体经亲和纯化。或者，所述抗体可以通过合成的方式产生。
各种机构和公司已经开发出用于大规模生产抗体的细胞系，例如供临床使用。这些细胞还用于其他目的，例如蛋白质的生产。为了以工业规模生产蛋白质和抗体而开发的细胞系在本文中进一步称为工业细胞系。因此，本公开内容的优选实施方案提供了被开发用于大规模生产所述抗体的细胞系的使用。
本公开内容的抗人CD40抗体或抗原结合片段优选地包含如本文所述的重链可变域和轻链可变域。这样的抗体具有良好的特征。当然，可以通过修饰其中的一个或多个氨基酸来产生这种原抗体的变体。当与原抗体相比较时，这些变体中的许多将表现或多或少的相似。这样的变体也包括在本公开内容的范围中。这样的修饰的一个非限制性示例是包含焦谷氨酸而不是谷氨酸的抗体。这样的修饰的其他非限制性示例是相比于所述原抗体，一个或多个氨基酸的插入、缺失、倒置和/或取代。
本公开内容还包括一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的抗体或抗原结合片段、或编码如本文所公开的抗体或抗原结合片段的核酸、或包含如本文所公开的抗体或抗原结合片段的细胞、或包含编码如本文所公开的抗体或抗原结合片段的核酸的细胞。这样的组合物尤其适合于用作药剂。组合物可以呈任何适合的形式，诸如液体、半固体和固体剂型。所选制剂的剂量和时间表可以通过本领域技术人员熟知的标准程序来确定。这样的程序涉及从动物模型外推和估计给药时间表，然后在人临床剂量范围研究中确定最佳剂量。药物组合物中的剂量将根据许多因素而变化，诸如所需的释放和药效学特征。
本文公开的抗体和抗原结合片段由于其非刺激性的CD40拮抗性质而特别适用于减轻炎症性疾病的症状。如本文所述的炎症性疾病是指涉及炎症性组分的任何疾病。这特别包括自身免疫性疾病或移植排斥。CD40-CD40L相互作用在免疫应答的起始、扩增和延长中的中心作用使得所述抗体特别适用于自身免疫性疾病中的免疫调节。优选地，本文公开的抗体和抗原结合片段用于改善自身免疫性疾病和/或抗炎疾病的症状和/或用于降低移植排斥和/或用于治疗CD40阳性癌症。在优选的实施方案中，所述自身免疫性和/或炎症性疾病选自炎症性肠病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病、大疱性类天疱疮和特应性皮炎。优选地，其中所述自身免疫和/或炎症性疾病包括炎症性肠病，优选地包括溃疡性结肠炎或克罗恩病。
以下提供关于CD40-CD40L相互作用的信息用于说明CD40及其配体在炎症性疾病中的作用。CD40分子是50kDa的I型膜糖蛋白。该蛋白主要在包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞(DC)在内的抗原呈递细胞的表面表达。然而，CD40还可见于许多其他类型的细胞，包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞和角质形成细胞。CD40受体的配体是CD40L，也称为CD154。该32kDa蛋白是II型整合膜糖蛋白，并且在活化的CD4+T细胞和少量的活化CD8+T细胞上瞬时表达。此外，已经在许多其他免疫细胞和其他类型的细胞上发现CD40L。CD40及其配体(CD40L)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。
CD40与CD40L的相互作用诱导了多种下游效应。与CD40L连接后，CD40被激活并进入细胞以刺激许多促炎和凝血酶原基因的表达。CD40-CD40L相互作用与细胞和体液免疫应答均有关。在B细胞中，CD40活化导致许多生物事件，包括增殖。活化标志物的表达、免疫球蛋白的产生、同型转换、同质性粘附和防止凋亡。单核细胞/巨噬细胞中CD40的活化诱导大量促炎介质(诸如IL-1、TNF-α和IL-12)的分泌，其诱导炎症性反应和肿瘤杀伤活性，并防止其凋亡。CD40活化也导致树突状细胞增强其分化和活化。增强共刺激分子(诸如CD86、CD80和CD58)的表达，增加细胞因子产生，以及抑制细胞凋亡。此外，当在炎症性病况下表达时。CD40信号传导可以诱导细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和内皮细胞上E-选择素的表达。体内研究已表明CD40-CD40L相互作用在以下方面的重要性：体液免疫应答的产生、抗原特异性T细胞的启动和活化、巨噬细胞的暂时性活化以及通过T细胞介导的巨噬细胞活化来抵抗细胞内寄生虫感染(诸如肺孢子虫(Pneumocystis)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和利什曼原虫(Leishmania))的保护性细胞介导免疫应答。
一些研究已经清楚地证明多种慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病涉及到CD40-CD40L相互作用。鼠模型研究表明，CD40/CD40L在多种疾病中具有功能性作用。例如，CD40L转基因小鼠患得致死性炎症性肠病。在另一方面，在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的炎症性肠病模型中，发现从T细胞重建之日起用抗CD40L治疗可完全预防实验性结肠炎的临床和组织学表现。证据表明CD40-CD40L相互作用在包括克罗恩病和溃疡性结肠炎在内的炎症性肠病的发病机制中也起作用。还证明了在移植模型中，CD40-CD40L途径的干预具有强烈的免疫抑制作用。因此，CD40-CD40L相互作用的干预是调节免疫应答以治疗免疫相关疾病的潜在目标。
多发性硬化症是一种中枢神经系统的自身免疫性疾病。在该疾病中，神经纤维周围的白质变硬。术语多发性硬化的字面意思是“许多伤疤”。CD40-CD40L相互作用可能参与疾病的发作和/或进展，暗示这些患者可能受益于CD40拮抗性抗体。
银屑病是一种炎症性皮肤病，困扰着1-2％的人。在该疾病中，病变中的T细胞和角质形成细胞活化并表达活化标志物和共刺激分子。据信，在角质形成细胞和T细胞上表达的一些共刺激分子彼此相互作用，并且这些相互作用有助于疾病活动性。一组这样的分子可以是在活化的角质形成细胞上表达的CD40与在活化的CD4+T细胞上瞬时表达的CD40L。因此，抗CD40抗体可用于治疗银屑病。
本公开内容的另一方面包括用于治疗哺乳动物(优选人类)的癌症的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的如本文所述的抗体或抗原结合片段。在本公开内容的另一优选实施方案中，提供了预防哺乳动物(优选人类)的癌症的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段。术语“预防癌症”或“癌症的预防”是指延缓、抑制或防止哺乳动物(优选人类)的癌症的发作。该术语还包括治疗具有癌前病况的哺乳动物以阻止其发展为恶性肿瘤或诱发消退。癌前病况的示例包括增生、异型增生和化生。本公开内容的另一方面提供了一种用于调节人CD40介导的抗肿瘤免疫应答的方法。
抗体可以作为单一疗法单独施用，或者与一种或多种其他治疗剂或疗法联合施用。可用于联合疗法以治疗癌症的其他治疗剂种类的示例包括(1)化疗剂、(2)免疫治疗剂和(3)激素治疗剂。通常在多个时机施用抗体或组合物。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。
在一个具体的方面，提供了用于在哺乳动物中抑制免疫应答的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本文公开的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。所抑制的免疫应答可以是细胞应答(即，细胞介导的应答)或体液应答(即，抗体介导的应答)。并且可以是初次或再次免疫应答。所抑制的免疫应答的示例包括CD4+辅助T细胞的活性降低和B细胞产生的抗体减少。可以使用本领域技术人员已知的许多体外和体内量度来评估所抑制的免疫应答。包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞试验、细胞因子的释放、肿瘤的消退、荷瘤动物的存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标志物的表达和细胞毒性。
如本文所用的，“包含”及其变形词以其非限制性意义用于意指包括该词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。此外，动词“由……组成”可以由“基本上由……组成”代替，意指本文所定义的化合物或附属化合物可以包含除具体确定的组分之外的附加组分，所述附加组分不改变本发明的独特特征。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。当与数值关联使用时，词语“大约”或“约”(大约10、约10)优选地意指该值可以是给定值10+/-1％范围内的值。
如本文所用的，术语“治疗”是指逆转、减轻、延缓如本文所述的疾病或其一个或多个症状的发作，或者抑制其进展。在一些实施方案中，可以在已发展出一个或多个症状之后施用治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，鉴于症状史和/或鉴于遗传或其他易感因素)。在症状消退之后也可以继续治疗，例如用于防止或延缓其复发。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均通过引用以其全文并入本文。
在以下实施例中进一步说明本发明。这些实施例不限制本发明的范围而仅用于阐述本发明。
实施例
实施例1.PG102抗体的工程化变体的体外表征。
使用小规模瞬时表达在中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SV GS-KO)中表达了野生型重组PG102抗体，以及设计用于改善长期稳定性的16种工程化变体，然后进行蛋白A纯化和产物质量分析。变体的设计详见表1，氨基酸序列详见“附录”节。
建立单基因GS载体(使用Lonza的GS XceedTM基因表达系统)，并在CHOK1SV GS-KO细胞中进行了瞬时转染以表达产物。通过蛋白A亲和层析纯化产物，使用0.22μm滤芯过滤除菌，并通过超滤浓缩大约10倍。以SE-HPLC、SDS-PAGE和CD40结合试验的形式使用1mg/ml的纯化材料进行产物质量分析。
相对于野生型抗体，变体1至16的表达滴度增加了大约3.5至6倍(参见表2)，同时保持极低的聚集材料水平(≤4％)。相对结合值可以通过将来自ELISA的CD40结合除以计算的蛋白质浓度来计算。变体9至变体12显示出对CD40的结合亲和力降低。其余抗体保持相当甚至改善的结合亲和力(参见表2和图2)。
表1：所用重链和轻链的组合
Figure BDA0002719664410000191
表2：PG102变体的产量、滴度和CD40结合
Figure BDA0002719664410000201
材料和方法
基因合成
通过Life Technologies合成重链和轻链可变区，并将其亚克隆到LonzaBiologics GS XceedTM基因表达系统载体pXC-κ和pXC-IgG4pro(δK)中。将20个氨基酸的信号序列添加到轻链序列的N端，并将19个氨基酸的信号序列添加到重链产物序列的N端。在信号序列之前，在N端限制位点之后，有一段Kozak序列(“附录”节)。
单基因载体构建
通过利用5’限制位点HindIII和3’限制位点ApaI将重链可变区亚克隆到载体pXC-IgG4pro(δK)中来构建单基因载体。利用5’限制位点HindIII和3’限制位点BsiWI将轻链可变区克隆到载体pXC-κ中。将限制酶切消化产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，并根据制造商的说明使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，28704)对相关片段进行凝胶提取。将连接的最终体积设置为21μl，并在室温下孵育5分钟。根据制造商的说明使用热休克方法将连接反应的10μl等分试样用于转化One Shot Top 10化学感受态大肠杆菌细胞(LifeTechnologies，C404003)。将细胞铺展到含有氨苄青霉素(50μg/ml)的Luria Bertani琼脂平板(LB Agar，Sigma-Aldrich L7025)上，并在37℃下孵育过夜，直至出现明显细菌菌落。为了筛选重组体，将单个细菌菌落挑入含有50μg/ml氨苄青霉素的5ml Luria Bertani(LB)培养基(LB，Sigma-Aldrich L7275)中，并在37℃下振荡孵育过夜。对于重链载体，使用QIAGEN小规模制备系统(QIAprep spin miniprep kit，27104)分离DNA，并在30μl EB缓冲液中洗脱。用HindIII和EcoRI消化DNA，以验证重链插入段的存在，并在琼脂糖凝胶上进行分析。对于轻链载体，利用在轻链cDNA任一端结合的引物通过PCR筛选菌落。通过对感兴趣基因进行核苷酸测序来验证重链和轻链重组体的阳性克隆。
DNA扩增
对于Giga制剂，使用单细菌培养物接种起子培养物，然后将其用于接种含有50μg氨苄青霉素的1.0L LB培养基，并在37℃振荡孵育过夜。使用QIAGEN Gigaprep系统(Qiagen，12291)分离载体DNA。在所有情况下，使用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo-Scientific)测量DNA浓度，并将其调整为1mg/ml。通过测量260和280nm处的吸光度比值来评估DNA质量。
CHOK1SV GS-KO细胞的常规培养
将CHOK1SV GS-KO细胞在补充有6mM L-谷氨酰胺(Life Technologies，25030-123)的CD-CHO培养基(Life Technologies，10743-029)中培养。将细胞在振荡孵箱中于36.5℃、5％CO2、85％湿度、140rpm下孵育。以0.2x 106个细胞/ml接种，常规地每3-4天对细胞进行传代培养，并进行繁殖以获得可用于转染的足够细胞。在第20代丢弃细胞。
CHOK1SV GS-KO细胞的瞬时转染
使用已经培养至少两周的CHOK1SV GS-KO细胞进行瞬时转染。转染前24小时对细胞进行传代培养。所有转染均使用Gene Pulse Xcell(Bio-Rad)通过电穿孔进行。对于每次转染，将活细胞重悬于预温热的补充有6mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基中，直至2.86x 107个细胞/ml。根据表2中的方案将40μg重链SGV DNA和40μg轻链SGV DNA的组合等分到每个比色皿(Bio-Rad，GenePulser比色皿，0.4cm间隙，165-2091)中，并添加700μl细胞悬液。在300V、900μF下对细胞进行电穿孔。将转染的细胞转移到Erlenmeyer烧瓶中的预温热培养基中，并将用预温热的培养基冲洗两次的比色皿中的内容物也转移到烧瓶中。将转染子培养物在振荡孵箱中于36.5℃、5％CO2、85％湿度、140rpm下孵育6天。在收获时使用CedexHiRes自动细胞计数器(Roche)测量细胞活力。
蛋白A亲和层析
通过离心使培养物上清液澄清，然后通过0.22μm过滤器进行过滤，然后使用预装的5ml HiTrap MabSelect SuRE柱(GE Healthcare，11-0034-94)在AKTA纯化仪(以10ml/分钟运行)上通过蛋白A亲和层析法进行纯化。在所有情况下，用50mM的磷酸钠、125mM的氯化钠(pH 7.0)对柱进行平衡，用50mM的磷酸钠和1M的氯化钠(pH 7.0)洗涤，然后在洗脱之前重新引入平衡。用10mM的甲酸钠(pH 3.5)洗脱分子。通过用2x PBS缓冲液(pH 7.4)中和，立即调节所洗脱部分的pH，并通过添加稀氢氧化钠溶液滴定至pH约7.2。
SE-HPLC
使用Zorbax GF-250 9.4mm ID x 25cm柱(Agilent)，在Agilent 1200系列HPLC系统上通过SE-HPLC分析重复样品。注入1mg/ml样品的80μl等分试样(如果样品<1mg/ml则使用储备浓度)并在50mM磷酸钠、150mM氯化钠、500mM L-精氨酸(pH 6.0)中以1ml/分钟运行15分钟。使用Empower软件分析可溶聚集体的水平。除非另外指明，否则通过空白缓冲液注入来分析由缓冲液成分产生的信号，并在数据分析中将其去除。
SDS-PAGE分析
通过与NuPage 4x LDS样品缓冲剂(Life Technologies，NP0007)和NuPage10x样品还原剂(Life Technologies，NP0009)混合并在70℃下孵育10分钟来制备还原样品以用于分析。对于非还原样品，省略还原剂和热孵育。在变性条件下，将样品在具有NuPage MESSDS电泳缓冲液的1.5mm NuPage 4-12％Bis-Tris Novex预制凝胶(Life Technologies，NP0316)上进行电泳。凝胶上包含SeeBlue Plus 2预染分子量标准品(Life Technologies，LC5925)的10μl等分试样和1mg/ml的对照抗体。取每个样品1.5μg到凝胶上。电泳后，将凝胶在室温下用InstantBlue(TripleRed，ISB01L)染色30分钟。在BioSpectrum成像系统(UVP)上分析染色凝胶的图像。
CD40结合试验
基于UKSL-2057使用基于ELISA的试验来测量抗体变体与CD40的结合。在添加抗体变体之前，用重组CD40包被微量滴定板，并使用碱性磷酸酶缀合的抗人κIgG进行检测。
结果
载体构建
对所有构建体进行亚克隆以生成如第4.2节所述的单基因载体(SGV)并通过EcoRI/HindIII双消化或PCR进行确认。最终的SGV还通过第三方提供者对感兴趣基因编码区的核苷酸测序进行验证。
DNA扩增
按照材料和方法部分所述的方法实现载体扩增。通过测量吸光度比率A260/A280来评估双基因载体的DNA质量。结果发现，该值在1.88至1.92之间。
瞬时转染
使用所产生的SGV建立200ml瞬时转染。按指示孵育培养物。表3显示了收获时的细胞计数。发现所有培养物的细胞生长和活力都在通常观察到的范围内。
表3：收获时小规模转染子的活细胞浓度和活力
Figure BDA0002719664410000241
蛋白A亲和层析
在转染后第6天收获培养物。通过离心和过滤使上清液澄清，将其装载到5mlHiTrap MabSelect SuRE柱上并洗脱。如预期的那样，所有产物(FFP104_野生型和FFP104_变体1至FFP104_变体16)的洗脱曲线在洗脱阶段均显示单个蛋白质种类的峰。这些瞬时培养物获得的产量总结于表2中。
纯化产物的SE-HPLC分析
在Zorbax GF-250 9.4mm ID x 25cm柱(Agilent)上通过SE-HPLC对来自小规模评估转染的纯化产物样品进行分析。对于所有产物，观察到一个主要(>97.6％)的蛋白质峰，保留时间约为8.58分钟，与抗体对照相当(约8.7分钟，数据未在此处显示)。产物在约7.9分钟的较短保留时间处显示出另一个次要峰，表明存在较高分子量的物质，诸如可溶聚集体。
纯化产物的SDS-PAGE分析
对纯化产物的还原和非还原样品进行电泳，并用InstantBlue染色。这证实了PG102_野生型和PG102_变体1至PG102_变体16的所有产物的存在和高纯度水平。产物与对照抗体相当：在非还原条件下，对于产物可见>98kDa的蛋白质带，与在相同条件下进行电泳的对照IgG1抗体相当。在还原条件下观察到两个带，这些带与重链(>49kDa)和轻链(<28kDa)的大小一致，并且与对照抗体所见的带相当。
CD40结合试验
根据蛋白A亲和纯化产物的回收率来估算澄清培养物上清液中的抗体浓度，并将样品稀释至大约100ng/ml以使其在ELISA的范围内。然后制备并分析样品。将结果转化为在澄清上清液中的有效浓度，以便进行比较。该试验评估了抗体变体对CD40的亲和力。数据表明，FFP104_变体1、FFP104_变体2、FFP104_变体5和FFP104_变体6显示的CD40ELISA响应水平高于通过蛋白A衍生的滴度所预期的水平，表明这些变体与CD40的结合亲和力相当或更高(表2和图2)。FFP104_变体9至FFP104_变体12的变体显示响应降低，表明与CD40的结合亲和力降低。该信息表明，含有VL3的变体表现出与CD40的结合降低。
结论
建立了PG102_野生型以及16种变体的小规模瞬时转染，以评估变体的表达水平、蛋白A纯化和产物质量，包括与抗原CD40的结合。发现PG102_野生型的表达滴度为10.2mg/L。所有十六种变体(PG102_变体1至PG102_变体16)均显示出比PG102_野生型高3.5-6倍的改善的表达水平。通过SDS-PAGE和SE-HPLC，这些变体还显示出良好的纯度水平，具有较低水平的较高分子量杂质，诸如可溶聚集体(≤1.08％)，与PG102_野生型亲本分子(0.6％)相当。CD40结合ELISA的结果将受到样品对CD40的亲和力的影响，因为这可能相对于PG102_野生型和用于生成标准结合曲线的PG102参考材料(批号364190ARS)有所不同。可以通过将CD40 ELISA结合数据除以蛋白A纯化后确定的蛋白质浓度来确定相对结合值。后者估计了表达产物可能的上清液浓度，因为在蛋白A纯化、洗脱液中和和缓冲液交换过程中可能会出现少量的产物损失(通常<10％)。对于PG102_野生型抗体，ELISA与蛋白A纯化后得出的浓度之间的相关性为143％，显示两种试验之间的一致性。数据表明，PG102_变体1、PG102_变体2、PG102_变体5和PG102_变体6显示的CD40 ELISA响应水平高于通过蛋白A衍生的滴度所预期的水平，表明这些变体与CD40的结合亲和力相当或更高。PG102_变体9至PG102_变体12的变体显示响应降低，表明与CD40的结合亲和力降低。这表明，含有VL3的变体表现出与CD40的结合降低。
实施例2：7种所选PG102变体的生物活性测试
选择7种PG102变体进行生物活性测试。从健康供体的血液中分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用CD40L(CD40的配体)诱导PBMC细胞分泌TNF。用来自总共四个供体的PBMC测试七种PG102变体。所有测试条件执行两次。添加1、10、100或1000ng/ml单克隆抗体会导致TNF分泌水平降低。该试验表明，与PG102_野生型相比，七分之五的单克隆抗体具有至少相似或略有增加的生物学活性(表4，图3和4)。这涉及以下变体：PG102_变体2、PG102_变体3、PG102_变体5、PG102_变体6和PG102_变体16。在1和10ng/ml的水平下，PG102_变体1和PG102_变体10显示出降低的生物活性，并且可能不如PG102_野生型有效(表4)。对于PG102_变体10，这与CD40结合数据相对应，显示出携带有VL3的抗体变体的结合亲和力降低(表2)。
材料和方法
在1、10、100或1000ng/ml单克隆抗体的存在下，CD40L诱导PBMC分泌的TNF的测定。
所有培养条件进行两次
结果量度：TNF分泌的抑制百分比。
表4：七种PG102变体的生物活性测试
Figure BDA0002719664410000271
实施例3：PG102变体的计算机模拟分析
计算机模拟分析由聚集和PTM潜在风险的可生成性评估组成。
材料和方法
抗体工程化
如下所述执行抗体工程化程序：
1.分析背景信息。
2.将抗体序列与参照序列集进行比对。
3.将Lonza的抗体聚集体平台应用于抗体。
4.识别关键位置。
5.构建抗体的3D结构模型并进行分析。
6.对序列进行PTM筛查。根据可生成性风险对潜在的PTM进行分类。
7.对潜在风险进行分析和描述。
8.根据所收集的数据评估取代每个位置的可能性。将位置分类为中性、有贡献或关键。
9.设计减少聚集和PTM的序列集，并根据它们在降低聚集或PTM风险而不会对结合亲和力产生负面影响的潜力进行排名。必要时进行序列和结构比较。
10.用EpibaseTM对候选序列进行筛选。检查每个剩余的Th表位或表位簇，并通过EpibaseTM评估其中的位置降低预测的免疫原性的能力。
11.在可能的情况下引入去免疫化取代。
12.汇编推荐的工程化变体集。
13.对工程化FFP104变体进行EpibaseTM免疫分析，并与亲本抗体进行比较。
序列注释
更新的Chothia CDR定义(Al-Lazikani等人，1997)将用作参考。该定义与原始的Chothia和Lesk 1987出版物的不同之处在于，在CDR H2定义中包括重链Chothia位置H:57和H:58。除非另有说明，否则位置编号是按顺序的，在这种情况下，将使用Chothia编号(Chothia和Lesk 1987)。
序列比对
生成亲本序列与小鼠和人种系序列的多重比对，并根据与亲本序列的序列同一性(SeqID)对每个比对中的条目进行排序。通过以100％SeqID进行聚类并排除冗余条目，将参考集简化为唯一的序列集。
抗体聚集
本研究中使用的抗体聚集平台是使用基于抗体序列和结构特征的机器学习算法开发的(Obrezanova等人，2015)。在抗体集上训练和测试预测性聚集模型，该模型旨在覆盖广阔的化学空间并包含低表达和高表达以及聚集和非聚集抗体。通过内部实验确定该集中的所有抗体的特征。该算法给出了高或低聚集风险的分类输出；较高类别的抗体在一步蛋白A纯化后聚集风险增加到5％以上。除了高或低聚集风险分类外，抗体聚集平台还产生可用于比较相关抗体的聚集倾向的确定性评分。
关键位置处的残基的识别
抗体可变域(Fv)具有许多关键位表达，这些关键位表达构成VH/VL链间界面或者负责针对5个CDR定义的离散规范结构集(Chothia和Lesk 1987，Al Lazikani等人1997)；在计划取代这些位置之前，应当详细考虑这些位置。下面的表5和表6(分别)显示了VH/VL界面内的保守位置以及决定CDR规范类别的位置，其中根据Chothia定义进行编号。
表5：VH/VL界面内的保守位置
Figure BDA0002719664410000291
表6：决定CDR规范类别的位置
Figure BDA0002719664410000292
3D模型的构建
使用Lonza的建模平台生成抗体PG102及其变体的Fv区域的结构模型。基于与靶标的序列同一性以及模板结构的定性晶体学量度(诸如分辨率(以
Figure BDA0002719664410000293
为单位))，对构架(FR)和CDR的候选结构模板片段以及完整Fv进行评分、排名并从内部抗体数据库中选择出来。
为了将CDR与FR模板在结构上比对，在CDR模板中CDR两侧包括5个残基。基于重叠区段生成片段的比对，并生成结构序列比对。通过MODELLER(Sali等人1993)处理模板片段以及比对。该方案创建衍生在对齐的结构模板集的构象约束。通过共轭梯度和模拟的退火优化程序创建满足约束的结构系综。基于能量分数从该系综中选择一种或多种模型结构，该能量分数是从蛋白质结构的分数和构象约束的满足程度得出的。对模型进行检验，并利用侧链优化算法对靶标与模板之间有差异的位置的侧链进行优化，并使能量最小化。使用一套可视化和计算工具来评估CDR的构象变异性，以及域和区的核心和局部堆积，并进行表面分析以选择一个或多个优选模型。
建模结构的比较
如以上(4.6)所述分别对亲本和工程化Fv区的结构模型进行建模，以确保构建的变体模型不会对亲本模型结构产生任何固有偏差。然而，工程化变体与亲本序列的高度序列同一性常常导致为许多模型选择相同的结构模板。
为了评估不同取代对亲和力和稳定性的影响，使用许多结构标准。溶剂可及性、局部原子堆积和相对于预测的抗原结合界面或Fv二聚体界面的取代位置是关键标准。观察到不良的溶剂化状态、不良的原子间接触或在关键位置上不良地放置不当残基会导致对可能取代的排除。其他标准(诸如静电效应、氢键模式或可能的氢键模式)也用于评估取代的适用性。一些位置比其他位置更适合接受取代，因为一系列关键位置在支持CDR的规范类别、个体域核心或域间界面的堆积方面起作用。
翻译后修饰
PTM在治疗性蛋白质的开发过程中可能引起问题，诸如异质性增加、生物活性降低、稳定性降低、免疫原性、片段化和聚集。PTM的潜在影响取决于其位置，并且在某些情况下取决于溶剂暴露。针对以下可能的PTM对序列进行分析：天冬酰胺脱酰胺作用、天冬氨酸异构化、游离的半胱氨酸巯基、N-和O-糖基化、N-末端环化、氧化和焦谷氨酸形成。在本研究中确定与这两种抗体相关的三种PTM类型将在下面详细介绍。
·天冬酰胺脱酰胺作用
天冬酰胺侧链上酰胺基的水解即脱酰胺作用是非酶促反应，其随着时间在受影响位置处产生天冬酰胺、异天冬氨酸和天冬氨酸的异质混合物。除引起电荷异质性外，如果天冬酰胺脱酰胺作用发生在结合界面如抗体CDR中，也可能影响蛋白质功能(Harris等人，2001)。脱酰胺速度受pH和局部构象，特别是天冬酰胺后面的残基的影响(Robinson和Robinson2004)。
·天冬氨酸异构化
天冬氨酸异构化是天冬氨酸和异天冬氨酸氨基酸残基的非酶促相互转化。除引起电荷异质性外，如果天冬酰胺脱酰胺作用发生在结合界面如抗体CDR中，也可能影响蛋白质功能(Harris等人，2001)。异构化反应通过与天冬酰胺脱酰胺反应类似的中间物进行，通常可通过仔细调整工艺参数和配方将风险降至最低。
·氧化
蛋氨酸和少量色氨酸易受非位点特异性氧化的影响。蛋氨酸主要对游离的活性氧物质敏感，而色氨酸对光诱导的氧化更敏感。敏感性程度在很大程度上取决于侧链的溶剂可及性；被掩盖的残基不太敏感或需要更长的反应时间。氧化损坏可能在生产、纯化、配制或储存期间可能产生，并可能影响稳定性和生物活性。
潜在取代的评估
评估抗体可变域中的所有位置对结合亲和力和稳定性的潜在影响。将每个位置分类为：中性、关键或有贡献。
·中性——在该位置被另一氨基酸取代不影响结合亲和力或稳定性。
·有贡献——可以进行取代，但是该位置可能有助于结合亲和力或稳定性。应该考虑将亲本氨基酸保留在该位置。
·关键——该位置必须保留亲本氨基酸，否则可能降低结合亲和力或降低稳定性。
归因于对亲和力和稳定性的考虑，有许多因素影响该分类。影响该分类的因素是：
·负责抗原结合的位置
·关键位置
οVH/VL界面内的保守残基
ο决定CDR规范类别的位置
·距CDR的距离
·参考比对中该位置的保守或变异
·溶剂可及性
·局部原子堆积
·局部二级结构
·静电作用
·氢键模式
·氢键可能性
·翻译后修饰
关键位置最初在Chothia CDR中定义为以下位置：确定为位于VH/VL界面中的关键位置(表5)；位于有助于确定CDR构象的位置(表6)或者在参考比对中高度保守的位置。
中性取代通常是构架中溶剂暴露的位置，且距任何CDR残基的任何侧链原子均大于
Figure BDA0002719664410000321
该区域内的残基被归类为对亲和力有贡献。有贡献位置可以被取代，并且在许多情况下这样做是为了有效地使抗体人源化、去免疫化或以其他方式工程化。在其他取代情况下，连续地重新评估所有位置的风险类别。
许多位置是保守的，并且仅接受一小部分或仅一种类型的氨基酸。其他位置的可变性更大，如果发现它们暴露于溶剂并且远离CDR，那么它们几乎可以支持任何取代。
表位分析
使用EpibaseTM分析表位或相邻表位簇的取代，该取代将最大程度地去除或减少与HLA同种异型，尤其是HLA-DRB1的结合。在中性位置取代比在有贡献位置更优选，并且关键位置的取代只有经过目视检查并将其重新分类为有贡献位置之后才可以提出。选择尽可能是保守性的取代。人种系序列不被认为是免疫原性的，因为它们在循环抗体库中被发现。识别将会引入新表位或与现有表位的其他同种异型结合的取代，并将其排除在考虑范围之外。
有时需要取代的组合来去除表位，尤其是当存在表位簇或混杂表位时。与单个取代一样，必须监控组合以使它们不会引入与其他HLA同种异型的结合。
免疫分析比较
以与亲本序列相同的方式针对全球集内的85种HLA II类同种异型的工程化抗体变体进行EpibaseTM免疫分析。
仅使用HLA结合预测对抗体变体的免疫原性风险进行比较非常困难。这是因为未考虑几个重要因素：
·结合肽可能无法由加工器产生，因此它将永远不会以肽-HLA复合物的形式被抗原呈递细胞暴露于Th细胞。
·肽-HLA复合物可能无法被Th细胞识别。
鉴于这些考虑，可以在变体序列之间使用EpibaseTM免疫分析进行三种类型的定量比较。首先，可以比较DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP同种异型集中的每一个的关键表位的数量，其中将与同一组的多个同种异型结合的肽视为一种。这样的表位计数显示每个集内独特表位的数量，并且亲本蛋白与工程化蛋白之间的差异表明潜在Th表位的完全去除。
然而，许多表位，特别是结合多种同种异型的混杂表位，难以完全去除。因此，独特Th表位计数的变化可能会掩盖免疫原性潜力的实际降低。因此，第二次定量比较是在所有Th表位上在每个HLA同种异型的水平下进行的，其中连同血清型和种群频率，对亲本和工程化变体的每个同种异型的结合肽的计数允许在血清型或同种异型水平下进行比较。(见结果)。第三，表达最坏情况的免疫原性风险的近似分数可以计算如下：分数＝∑(表位计数x同种异型频率)
根据预测与给定同种异型结合的表位数量和受影响同种异型的等位基因频率，计算出每个受影响异种同型的乘积。将研究中使用的所有DRB1同种异型的乘积相加。应当注意的是，评分不是衡量免疫原性风险的绝对指标，并且建议的取代及其顺序考虑了所有选择的HLA同种异型(DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP)以及取代位置和类别。
PG102的进一步表征表明，在胰蛋白酶消化后在质谱中检测到三个区域，其中胰蛋白酶消化肽段的脱酰胺作用高于相对较低水平(≤4％)。一个是在保守域中的已知脱酰胺位点，两个在可变域中：VH中的胰蛋白酶消化肽段H10(MNSLR)和VL中的胰蛋白酶消化肽段L2(SSQSLANSNGNTYLHWYLQRPGQSPR)。
L2胰蛋白酶消化肽段位于轻链的CDR L1区域，并可能影响分子的结合效率。轻链CDR L1包含三个潜在的脱酰胺基序，其中两个已通过实验验证(L:Asn31和L:Asn33)。然而，稳定性研究表明，CDR L1中的脱酰胺作用对抗原结合的影响相对较小。在+25℃下经过12个月且100％脱酰胺后，与参考相比，产物特异性抗原结合ELISA的活性为95％。
在质谱结果中检测到三种胰蛋白酶消化肽段的低水平的蛋氨酸氧化变体。两个VH位点受到影响，H:Met82和H:Met92，报告指出，当PG102药物产物储存在+25℃时，含有H:Met92的胰蛋白酶消化肽段H1可能更容易受到蛋氨酸氧化的影响。
初步分析显示重链CDR H2中的蛋氨酸是造成聚集问题的潜在原因。稳定性研究结果表明，蛋氨酸的H:Met48、H:Met50和H:Met51均被掩盖在抗体内部，无法接近。
EpibaseTM免疫分析
针对亲本抗体和工程化变体PG102_变体16的序列，对Global集内的85种HLA II类同种异型进行EpibaseTM免疫分析。
翻译后修饰
翻译后修饰(PTM)可能在治疗性蛋白质的开发过程中引起问题，例如增加异质性，并且在某些情况下降低生物活性或降低稳定性。位于CDR中的PTM对于抗体特别重要，因为该修饰可以改变生物活性。表7中描述了几种可能的PTM，它们构成潜在的可生成性风险。
表7：关注的潜在翻译后修饰
Figure BDA0002719664410000341
Figure BDA0002719664410000351
使用Lonza的抗体聚集平台和EpibaseTM来筛选潜在的工程化变体序列。使用Lonza的抗体聚集平台筛选每个位置的所有可能氨基酸取代，并记录结果。随着工作的进展对每个位置的评估进行更新，以基于筛选工具以及序列和结构分析来反映位置对聚集、PTM和免疫原性的影响。已经发现，在轻链的PTM工程化之后，通过在轻链上的取代降低聚合倾向风险从而改良抗体的途径很少。因此，工程化的轻链聚焦在CDR L1PTM上，并且具有附带其他取代的单条工程化链。
通过降低重链中的预测聚集倾向风险来获得改良抗体的空间更大。在三个工程化重链中，已经提出越来越多的去聚集构架取代。此外，已经发现，通过使用来自另一人VH家族的种系(在该情况下为VH3-3-11)作为参考，可以进一步降低聚集风险。该选项已在一个工程化重链FFP_VH_4中进行了探索。
针对轻链和重链的最终提出的取代及其效果如下所述。针对轻链提出了八个取代，针对重链提出了三十个取代，其中的许多来自最后一条工程化重链FFP104_VH_4所采取的途径。图1分别显示了轻链和重链的工程化链。所有工程化链的氨基酸序列可在“具体实施方式”中获得。工程化序列与亲本的比对可以在图1中找到。
在每个候选序列中分析改变预测的免疫原性的取代，并避免那些会增加免疫原性的取代。本研究集中于EpibaseTM中可用的43种DRB1同种异型，因为DRB1同种异型与免疫原性评估最相关。
抗体聚集结果
表8给出了亲本PG102及其工程化变体的抗体聚集预测结果。平台预测抗体处于低聚集风险类别还是高聚集风险类别。聚集分数与类别相关，其中正分数表示高风险类别，负分数表示低风险类别。聚集分数的绝对值表明预测的确定性增加。因此，本项目寻求更负的聚集分数。Δ分数表示相对于亲本抗体的变化，分数越负越优选。
亲本抗体PG102已经被预测为低风险类别，但是分数相对较高，即接近零。有一个工程化重链PG102_VH_2导致四个变体的聚集分数增加。如上所述，设计该链是为了评估最少数量的构架取代。
表8：抗体聚集结果
Figure BDA0002719664410000361
Figure BDA0002719664410000371
EpibaseTM免疫分析比较
对PG102的工程化变体组合(PG102_变体16)进行EpibaseTM免疫分析。由于EpibaseTM配置文件中的详细信息水平太粗略而无法进行详细比较，因此在亲本抗体与工程化变体之间基于三种类型的免疫分析统计信息进行比较。
在工程化变体中，总体预测的免疫原性潜在风险较低；但是它仍然与亲本PG102相当。
实施例4：
本公开内容还提供了轻链可变域的改变(图1)。在轻链中，可变域第31和33位的两个天冬酰胺(N)氨基酸被丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或天冬氨酸(D)取代(图1)。据信这些改变可防止天冬酰胺脱酰胺作用。天冬酰胺侧链中酰胺基的水解即脱酰胺作用是非酶促反应，其随着时间在受影响位置产生天冬酰胺、异天冬氨酸和天冬氨酸的异质混合物。除引起电荷异质性外，天冬酰胺脱酰胺作用如果发生在结合界面如抗体CDR中，还可能影响蛋白质功能。两个天冬酰胺残基均位于轻链的CDR1中，并被取代以防止脱酰胺作用。
本公开内容还提供了在重链可变区中设计的改变(图1)。对于所有新的抗体变体，重链可变区的第三个氨基酸位置由赖氨酸(K)改变为谷氨酰胺(Q)。这种改变提高了抗体的稳定性，并降低了纯化和储存过程中的聚集性质。PG102抗体的构架区3包含序列MNSLR，包括天冬酰胺(N)氨基酸。该氨基酸被丝氨酸(S)取代，以防止抗体的脱酰胺作用。重链可变区中第86、87和88位的氨基酸RTD被苏氨酸(T)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)取代，以减少聚集。重链可变区中第92位的蛋氨酸残基被缬氨酸(V)取代，以防止蛋氨酸氧化。
附录：氨基酸序列
加下划线的是可变区，其两侧是分泌信号序列(N端)和恒定区(C端)。
轻链序列
Figure BDA0002719664410000381
Figure BDA0002719664410000391
重链序列
Figure BDA0002719664410000392
Figure BDA0002719664410000401
Figure BDA0002719664410000411

Claims (15)

1.一种包含重链可变区和轻链可变区的抗CD40抗体或其抗原结合片段，
其中所述轻链可变区包含：
-具有序列RSSQSLAZ6SZ7GNTYLH的CDR1，其中Z6是S，并且Z7是S或Q；
-具有序列KVSNRFS的CDR2；以及
-具有序列SQSTHVPWT的CDR3，
并且其中所述重链可变区包含：
-具有序列GFSX11SRY的CDR1，其中X11是I、L或V，优选地其中X11是L；
-具有序列WGGGSTD的CDR2；以及
-具有序列TDGDY的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，具有包含以下序列的重链可变区：
QVX1LX2ESGX3GLVKPX4X5X6LX7X8X9CX10VSGFSX11SRYSVYWX12RQX13PGKGX14EWX15GMMWGGGSTDYX16X17SX18KX19RX20TISKDX21X22KX23X24VX25LX26X27X28SLX29X30X31DTAX32YYCVRTDGDYWGQGTX33VTVSS；其中：
X1是Q；
X2是Q或V；
X3是P或G；
X4是S或G；
X5是E、Q或G；
X6是T或S；
X7是S或R；
X8是I或L；
X9是T或S；
X10是T或A；
X11是I、L或V；优选地，其中X11是L；
X12是I、L或V；优选地，其中X12是I或V；
X13是P或A；
X14是P或L；
X15是M或I；
X16和X17是ST或NP；
X18是L或V；
X19是S或G；
X20是L或F；
X21是T或N；
X22是S或A；
X23是S或T；
X24是Q或S；
X25是S或Y；
X26是K或Q；
X27是M或L；
X28是S；
X29是R或T；
X30是A；
X31是A或E；
X32是V；并且
X33是L。
3.根据权利要求2所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中：
X2是Q；
X3是P；
X4是S；
X5是E或Q；
X6是T；
X7是S；
X9是T；
X10是T；
X13是P；
X18是L；
X19是S；
X20是L；
X21是T；
X22是S；
X23是S；
X24是Q；
X25是S；
X26是K；
X29是T；并且
X31是A。
4.根据权利要求2所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中：
X2是V；
X3是G；
X4是G；
X5是G；
X6是S；
X7是R；
X8是L；
X9是S；
X10是A；
X13是A；
X14是L；
X15是M；
X16和X17是ST；
X18是V；
X19是G；
X20是F；
X21是N；
X22是A；
X23是T；
X24是S；
X25是Y；
X26是Q；
X27是M；
X29是R；并且
X31是E。
5.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，具有包含以下序列的轻链可变区：
Z1Z2Z3Z4TQSPLSLPVTZ5GQPASISCRSSQSLAZ6SZ7GNTYLHWYLQZ8PGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR；其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是ELQL或DIVM；
Z5是L或P；
Z6是S或D；
Z7是S或Q；并且
Z8是R或K。
6.根据权利要求5所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是ELQL；
Z5是L；并且
Z8是R。
7.根据权利要求5所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中：
Z1、Z2、Z3和Z4是DIVM；
Z5是P；
Z6是S；
Z7是Q；并且
Z8是K。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是拮抗性抗人CD40单克隆抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，包含人抗体的恒定区，优选IgG恒定区，优选地其中所述恒定区是补体活化不足的区域，优选人IgG4恒定区或突变的人IgG1恒定区。
10.一种编码根据权利要求1-9中任一项所述的抗体的核酸。
11.一种包含和/或产生根据权利要求1-9中任一项所述的抗体并且/或者包含根据权利要求10所述的核酸的细胞，优选地其中所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞、NS0细胞或PER-C6TM细胞。
12.一种包含细胞的细胞培养物，所述细胞是根据在权利要求11描述的任一种细胞。
13.一种用于产生和/或纯化权利要求1-9所述的任一种抗体的方法，优选地其中所述抗体的产生包括培养根据权利要求11或12中任一项所述的细胞并从所述培养物中收获所述抗体。
14.一种包含根据权利要求1-9中任一项所述的抗体、根据权利要求10所述的核酸和/或根据权利要求11所述的细胞的药物组合物，优选地用作药剂。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体和/或根据权利要求10所述的核酸和/或根据权利要求11所述的细胞用作药剂以用于改善自身免疫性疾病和/或炎症性疾病的症状，和/或降低移植排斥，和/或治疗CD40阳性癌症，优选地其中所述自身免疫性和/或炎症性疾病选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、银屑病、大疱性类天疱疮和/或特应性皮炎。
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