JPH04504651A - 自然に存在しないアミノ酸をタンパク質に部位特異的に導入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自然に存在しないアミノ酸をタンパク質に部位特異的に導入する方法本発明は、 １９８８年１１月１８日に出願された米国特許出願番号２７．．４５５及び米国 特許出願番号２７３．７８６の一部継続出願である。これらの関連出願は参考文 献として本明細書に取り入れられる。

コノ発明は、オフィス　オブネイバルリサーチ（Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｎａｖａ ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）により付与されたＯＮＲ：＋メトラクトＮ０００１４− ８６−０５２２及び、ＤＯＥグランド（ｇｒａｎｔ）Ｎｏ、　ＤＥ　ＡＣ０３− ７６ＳＦＯＯ０９ｇに基づく政府援助のもとで為されたものである。政府はこの 発明につき、確定した権利を有する。

及匪立札里立互 この発明は一般的にはタンパク質の生化学に関し、更に詳しくいうと酵素の特異 性及び活性を調節するため、そして自然に存在するタンパク質の構造を改変する ために有効にタンパク質の部位特異的な修飾を行う方法に関する。

発明の背景 古典的には、生化学者はタンパク質機能の修飾を、精製したタンパク質を化学的 に変化させたり、自然的に発生する変異体を選択することによって行ってきた。

化学的な改変は典型的には、非常に反応性で溶媒に可溶性のアミノ酸側鎖に同け られる。しかしながら、しばしば望むべき修飾部位は利用不能であり、また興味 のある修飾は化学的に不可能である。修飾反応の特異性の低さは、この方法の有 効性を劇的に妨げる。さらに、自然的に発生する変異体はまれであり、通常、変 異の性格の決定のため、十分な解析を必要と共に、自然に発生するアミノ酸残基 の変換は通常限定されている。

分子生物学工学の出現により、手段が限られているにも関わらず特定のアミノ酸 を、ペプチド鎖の伸張過程において、タンパク質やペプチドに取り込ますことが できる他の方法が改良されてきた。ペプチドの合成法、半合成法は、新しいアミ ノ酸を非常に小さなタンパク質やペプチドに導入するために使われてきた。アミ ノアシルトランスファＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の機能をもつアナローブを用いて修飾 されたアミノ酸を、均一にペプチドやタンパク質に取り込まれてきた。さらに付 は加えて、いくつかの不自然なアミノ酸は、化学的に誤ってアシル化されたｔＲ ＮＡを用いてジペプチド中に取り込まれた。

これら全ての方法は、１つないしはそれ以上の、以下に述べる欠点に苦しんでき た。即ち、新しいアミノ酸を導入するときの部位特異性の欠如、修飾部位の不均 一さ、修飾効率の低さ、置換の部位と性質を正確に決定するため十分な解析をす る必要性、興味のあるタンパク質の非常にきびしい大きさの制限、そして置換や 修飾の可能性が非常に限定されていること、などである。かくして、タン、ｆり 質の望むべき部位に特定の修飾を行うための改良された方法が必要性である。こ こで述べる発明はこれらの必要性を十分に満たし、さらに他の必要性を満たすも のである。

発明の概要 ここで述べる発明によって、不自然なアミノ酸アナローグをタンノ＜り質に部位 特異的に取り込ませる新しい方法が提供された。その方法は以下の段階からなる 。

（ａ）　前もって選択されたコドンを、タンノイク質をコードするメノセンジ＋ 　−ＲＮＡ配列上の少なくとも１つの部位に導入すること、そして（ｂ）不自然 なアミノ酸アナローグを、合成途中のポリペプチド鎖の、前もって選択されたコ ドンの部位に重合することのできるアミノアシルｔＲＮＡアナローグを含むタン パク質合成系でこのメツセンジャーＲＮＡ配列を翻訳すること。

タンパク質合成系は主に試験管内のタンノくり質合成系を用−＼、前もって選１ ｆれたコドンとしては終止コドン、例えばＵＡＧ　（アンノイー）を、前もって 決定された部分に挿入する。

自然に存在しないアミノ酸アナローグとして典型的には、自然のアミノ酸を修飾 したもの、荷電していないアミノ酸を修飾したもの、酸性アミノ酸を修飾したも の、塩基性アミノ酸を修飾したもの、非アルファ型アミノ酸、φある℃１はφ角 を変換したアミノ酸、次のような機能群を含むアミノ酸すなわちニトロ、アミジ ン、ヒドロキシルアミン、キノン、脂肪族化合物、環状そして不飽和化合物から 選ばれたものが選ばれる。好ましい条件下では、アミノアシルｔＲＮＡアナロー グは、タンパク質合成系において唯一の前もって選択されたコドンを認識するこ とのできるアミノアシルｔＲＮＡ分子であり、また、前もって選択されたコドン は、典型的には１００００ダルトン以上の分子量を持つタンノイク質をフードす るメ１．センジ＋　−ＲＮＡの１つの場所に導入される。自然に存在しな（旭ア ミノ酸アナローグ１ま基質結合部位や酵素活性部位やタンパク質とタン／ｆり質 の結合部位、コファクターの結合部位あるいはリガンド（作動剤あるいは拮抗剤 （アゴニストあるＬＳＩｔアンタゴニスト））などの結合部位から約１００オン グストローム以内に位置できる。

この発明のもう１つの側面は、前もって選ばれた１つな（１しはそれ以上の部分 を化学量論的に十分均一に、自然には存在しないアミノ酸アナローグ１こ置き換 えた新しいタンパク質（通常１０キロダルトン以上のもの）を含む。タンノくり 質の物理的あるいは生化学的特性の解析は、そのさまざまな特性、即ちポリペプ チド鎖の静力学的特性や酵素反応のメカニズム、タン、（り質のリガンド結合の 特異性、対象となったタンパク質のアミノ酸残基の基質との相互反応、タン７＋ り質のホールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ・高次構造の形成）、タン１＜り質と他 のタンノくり質、核酸や糖との相互反応などの特性を決定することができる。典 型的には、自然（こ存在しないアミノ酸残基を挿入した部位の約１００オングス トロームの範囲で解析できる。

もう１つの側面として、以下に述べる手順で、この発明はタンノ＜り質の前もっ て選択したアミノ酸部位を、さまざまな他のアミノ酸で択一的置換できる方法を 提供する。： ａ）前もって選択されたアミノ酸部位に相当するメツセンジャーＲＮＡの部位を 、間違って翻訳されるコドンに置き換えたメツセンジャーＲＮＡを作る。そして 、ｂ）メツセンジャー１ｉＮＡをアミノアシルｔＲＮＡアナローグを必ず含む２ つなｃ＋ＬＩｔそれ以上の翻訳系を用いてタンパク質に翻訳する。ここで、１つ の翻訳系によって作られたタンノ＜り質は、他の系によって作られたタン、（り 質と比較して、前もって選択されたアミノ酸部位が異なっている。

望ましい条件では、１つのアミノ酸部位が置き換えられ、異なる翻訳系（こよっ て作られたタンパク質各々の違いは、それぞれどの様なアミノアシルｔＲＮＡ＋ こ結合した自然に存在しないアミノ酸アナローグを選ぶかによって前もって決定 される。

自然に存在しないアミノ酸の置換は、例えばＤ−フェニールアラニン、（Ｓ）− ｐ−ニトロフェニールアラニン、（Ｓ）−ホモフェニールアラニン、（Ｓ）−ｐ −フルオロフェニールアラニン、（Ｓ）−３−アミノ−２−ベンジルプロピオン 酸ある（Ｘは（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−フヱニールブロビオン酸等である。

さらにこの発明のもう１つの特徴は、アミノアシルｔＲＮＡアナローグ分子を作 る方法に関係している。その方法は以下の手順からなる。

ａ）マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）の３°末端ヌクレオチドの２°あるいは ３゛リボンルヒドロキシル部位にアミノアシル化結合によって前もって選択した 自然に存在しないアミノ酸アナローグを結合させること、そしてｂ）アミノアシ ル化されたマルチヌクレオチド分子（アミノアシル−ＭＮＭ）を、末端を切除し たｔＲＮＡ分子（ｔＲＮＡ　（−Ｚ）　）に結合させる。こうして機能をもった アミノアシルｔＲＮＡアナローグ分子が合成される。

好ましくは、マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）は、例えば５°ｐＣｐＡ３°、 がｔＲＮＡの３′端に相当するジヌクレオチドである。マルチヌクレオチド分子 （ＭＮＭ）をｔＲＮＡ（−Ｚ）分子に結合することは、典型的には完全なｔＲＮ Ａ分子を作り出す。そして、ｔＲＮＡ（−Ｚ）は読み取り終結後の（ラン−オフ ）転写物からも作られる。

マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）の３°末端ヌクレオチドの２あるいは３“リ ボンルヒドロキシ部位に前もって選択された自然界に存在しないアミノ酸アナロ ーグをアミノアシル化結合させることは次の手順反応からなる。

ａ）　ＭＮＭ上の反応基を保護剤によって保護すること、ｂ）アミノ酸アナロー グ上の非アミノアシル化反応基を阻害剤によって保護すること、 Ｃ）ブロック剤によって保護したアミノ酸アナローグを用いてＭＮＭをアシル化 すること、そして ｄ）保護された反応基から保護剤やブロック剤を除去すること。

上記の反応基を保護する手順のいくつかあるいは全ては、以下のブロック剤ある いは保護剤を用いた手順からなる。すなわち、０−ニトロフェニルサルフェニル （ＮＳＰ）　；β−７アノエチル（ＥｔＣＮＯ）　；ベンジルオキシカルボニル （ＣＢＺ）　；　９−フルオロエニルアメンルオキ７カルボニル＜ＦＭＯＣ）　 ；　２−　（４−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル（ＢＰＯＣ）　、 ビニルオキシカルボニル（ＶＯＣ）　；テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）　；メ トキ／テトラヒドロピラニル；そして光感受性のグループ例えば４−メトキシ− ２−ニトロベンジルオキシカルバメート（１ｆｆＯｃ）を含む。保護処理は、０ −ニトロフェニルスフェニル（ＮＦＳ）をブロック剤としても保護剤としても使 われる場合がある。さらにアミノアシル−ＭＮＭをｔＲＮＡ（−Ｚ）に結合させ る反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ酵素を用いて行われる場合がある。

この発明のもう１つの点は、アミノアンルｔＲＮＡアナローグが次のような式を 持つことからなる。式とはＸ−Ａ−Ｙ−Ｍである。

ここで、Ｘ＝ｔＲＮ＾分子の５゛ヌクレオチド配列；Ａ＝アンチコドンのヌクレ オチド； Ｙ　＝　ｔＲＮＡ分子の３゛ヌクレオチド配列、例えば５−ｐｃｐｃｐＡ−３° ； Ｍ；以下のグループから選ばれたアミノ酸アナローグ１）修飾した非荷電自然ア ミノ酸 １１）修飾した酸性の自然アミノ酸 ｉｉ＋）非アルファ型アミノ酸 これらのアナローブは、Ｍ成分として合成途中のポリペプチド鎖に取り込まれ、 それに続（ペプチド重合の受容体として働くことができる。例えば、（Ｓ）−ｐ −ニトロフェニールアラニンによってアミノアシル化されたｔＲＮＡＰｃ’ｕ” ｌＩに相当するアナローブは以下の要領で合成される。

ａ）　ＸはＤループとアンチコドンループの部分を含むｔＲＮＡＰｃｈｕ−の５ ゛部分からなる； ｂ）　Ａ　（アンチコドン）はトリヌクレオチド５’−ｐｃｐＵｐＡ−３°から なる；ｃ）　Ｙはアンチコドンループの一部分、可変ループ、ＴφＣループそし てアクセプターステムを含むｔＲＮＡ’ｃ’ｕ・＾の３゛部分からなる；ｄ）　 Ｍは（Ｓ）−ｐ−ニトロフェニールアラニンである。

この発明は、さらにこのようなアミノアシルｔＲＮＡアナローグを含む翻訳系を 含む。さらにまた同時転写翻訳系を含む。この系では転写系で合成されたものが このようなアミノアフルｔＲＮＡアナローグを含む翻訳系で翻訳される０図面の 簡単な説明 図１は、自然に存在しないアミノ酸を部位特異的にタンパク質に投入する方法の 模式図である。

図２は、アミノア／ル化された匹ｐＡの合成法の図である。

図３は、β−ラクタマーゼの試験管内発現に用いられるベクター、ブラズミドｐ ＳＧ７の作成法を示す図である。ａ分節は、ｐＫＫＫ２２３−３　（ブロス−り とホジー。

（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｉ ｌｌ：６９２９）のタックプロモーター（ｔａｃｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含む２５ ９−ベースペア（ｂｐ）ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１部分である。ｂ分節は、ＲＴＥ Ｍβ−ラクタマーゼ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆ、　（１９７ｇ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、１５：３１３１：Ａｍｂｌｅｒ及び５ｃ ｏｔｔ、　（１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔ ｌｓＡ、　ＩＳ：３１３Ｚ；そしてＰｏ１ｌｉｔｔ及びＺａｌｋｉｎ、　（１９ ８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３：２７）の最初の部分を含む３７ ６ベースベア（ｂｌ））Ｓｓｐ１部分（ｐＴＧ２ｄｅｌｌ（Ｋａｄｏｎａｇａ　 ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２T９： ２１４９）のＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕｌフラグメントに結合されている）であり、リ ーダーシーフェンス中の２１アミノ酸に相当する６３塩基の欠損がある。Ｃ分節 は、ｐＴ７−３　（Ｔａｂｏｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　（１９８５）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＬＩＳＡ、　８２：ＬＯ７４） のβ−ラタタマ[ゼ 遺伝子の残りとＣｏ１Ｅ１の複製オリジンを含む１３８６塩基対のＰｖｕｌ−Ｈ ａｅｌｌフラグメントである。ｄ分節は、ｐＧＰｌ−２（Ｔａｂｏｒ及びＲｉｅ ｈａｒｄｓｏｎ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｅａｄＳｅｔ、　 ＵＳＡ、　８２：１０７４）のＴｎ９０３　（Ｏｋａ　ａｔ　ａｌ、、（１９８ １）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１４７＋２１V）か らのカナマイシン抵抗性遺伝子を含む１４３０＃Ａ基対の１ｌａａｌ　１−）１ ａｅ１７ラグメントを含む。この遺伝子はタックプロモーターの転写制御下には 置かれていないようになっている。Ｃ分節は、ｐＴ７３からの２８９塩基対Ｈａ ｅ　ｌ　！−Ｐｖｕ　Ｉ　＋７ラグメント（Ｂａ■旧サイトのみを作るためにａ 分節のプラントエンド化したＢａｍＨ１部分に結合させた）である。

ＰｈｅＪ６　（図中の＊）部の変異株はエクスティン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）の方 法（Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ、　（１９１１６）　Ｎｕｃｌ、　 Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、　１４：９６７９）を用いて作られた。Ｐｈｅ６６の コドンを含む２０４塩基対の合成ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｅｌ＋７ラグメントはＭ１ ３ｍｐ１ｇ中に導入された。３つのオリゴデオキシヌクレオチット５−ＡＴＣＡ ＴＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴ−３’　。

５°−ＡＴＣＡＴＴＧＧＡ匹ＡＣＧＴＴＣＴＴ−３’　、　５°−ＡＴＣＡＴＴ ＧＧ虹ＡＡＣＧＴＴＣＴＴ−３’　（下線を引いた塩基は野生株の塩基配列と異 なるものを意味する）はそれぞれＦ６６Ｙ、Ｆ６６Ａ、　Ｆｆ＋６ｕ変異株を作 るために使われた。突然変異誘発の効率は、Ｔｙｒ６６で１００％、　Ａｌａ６ ６で８３％、ＴＡＧ６６で６０ｉであった。

図４は末端を切除されたβラクタマーゼの試験管内合成と精製の方法を示す。

１列：粗試験管内合成反応物；　２列：試験管内で合成されたβラクタマーゼ精 製物；　３列：生体内で（ＪＭＩＯＩ／ｐｓＧ７）合成されたβラクタマーゼ精 製物。

図５は、酵素を用いて決定されたｔＲＮＡ　Ｔ’ｌｌＥ／ＣＬＩＡ（−ＣＡ）配 列を示す。ｔＲＮＡ’ｃｈｕ”Ａ（−ｃＡ）は、Ｃ５’−３２ｐｌ−ｐＣｐを用 いて３°末端を標識され、塩基配列−酵素を用（Ａた方法（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌ ｌｅｒ、　（１９８０）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、８：３Ｈ３） で決定された。分解産物は１０％の変性ポリアクリルアミドゲルに充填された。

塩基配列決定のオートラジオグラムは図のとおりである。：酵素なしく１列）、 　−ＯＨ分解く２列と７列）、　ＲＮａｓｅＴ１分解（Ｇ特異的、３列＞、　Ｒ Ｎａｓｅυ２（Ａ特異的、４列＞、　ＲＮａｓｅＰｈｙ）４（υ＋八へ異的、５ 列）、ＲＮａｓｅＢセレウス（ｅｅｒｅｕｓ）　（Ｌｌ＋ＣｌＩ的、６列）であ る。アンチコドンステムとル−プの塩基配列は図のとおりであり、ＣＵＡＡ導入 部分は大文字で示されて０る。ｔＲＮＡＰｃｈｕ・Ｑ（−ＣＡ）は電気泳動法に よって精製され化学ミスアシル化反応に用０られるカ瓢、ある−）１よヌクレオ チディルトランスフエレース（Ｃｕｄｎｅｙ及びＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、　（１９ ８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２６１：６４５０）によって処理され、電気泳動で精製した後、 イーストＰＲＳを用いてミスアシル化反応に使われた。

図６は、アシル化されたあるいはアシル化されな℃１サブレ・７サーｔＲＮＡの 試験管内での試験を示す。反応（３０μＬ）は図４に示すように、０℃で冷やさ れ遠ｒｉ１されて行われた。それぞれの上清の３μＬは変性し１２．５％ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルａｅｍｍｌｔ．　（１９７（１）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏ ｎｄｏｎ）　、２２７：６８０）Ｉこ充填された後、ゲルを乾燥し、オートラジ オグラフィーを行った。１列：ｐＳＧ７　（末端を切除されたβーラクタマーゼ ）によって開始された反応；　２列：サプレッサーを添加せずｐＦ６６ａｍを用 Ｌ）で開始された反応；　３列ＨｐＦ６６ａ■に非ア／ル化サブレ・ｌす（５μ ｇ）添加したものを用０て開始した反応。１．２及び３列は、最終宵効濃度１９ ０Ｃｉ／ｍｏｌの［’Ｈ］−Ｐｈｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加された；４列： ｐＦ６６組と［”Ｈ］Ｊｈａ　（スペシフイ・ｌクアクテイビテイ９．　４Ｃｉ ／ｍ賞０１Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ）存在下で酵素を用いてアシル化された５μｇのサ プレッサー用（Ｘで開始された。

酵素を用いたミスアシル化反応（総１１３００μＬ）は、以下のものを含む：４ μＭｔ”ＮＡｐＣ”ＬＩ＠Ａ　（３０Ｍｇ，ゲルを用いて精製した後、脱塩凍結 乾燥されたものである）。

８０ＭＭフェニールアラニン、　４（ｌｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）［　８．５ ）、Ｈ＋ａＭ　ｉＡｇｃｌｚ　、４５Ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ。

３、　３＋ａＭ　ＤＴＴ．　２ｍＭ　ＡＴＰと２２単位イーストＰＲＳ　（ここ で、１単位の活性とは２分間３７℃で以下の条件において１００ｐｍｏｌのフェ ニルアラニン（Ｐｈｅ）を取り込む条件である：２　μＭ　ｔＲＮＡ””　（Ｂ ｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、　２ｍＭ　ＡＴＰ，　３．　３ｍＭ　 ＤＤＴ，　８．　ｌ　μＭ　oｈｅ．　４０ＭＭ　Ｎａ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　７．　４）、　１５ｍＭ　ＭｇＣ１２．　２５ｍＭ　ＫＣＩ および５０Ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡｏ（反応液は、３７°Ｃで３分間加温された後、 ２．　５Ｍ　ＮａＯＡｅ（ｐＨ　４．　５）を最終濃度１０％ｖ／ｖで加え、反 応を停止させた。停止後の反応液は、フェノール（０．　２５Ｍ　ＮａＯＡｃ， ｐｉｆ　４．　５）で平衡化された）、フェノール：　Ｃ１１Ｃ１３（１・１） 、ＣＨＣＬ３でただちに抽出され、モしてＥｔｏｌｌで沈澱された。

抽出と沈澱は、さらに２回繰り返された。ｔＲＮＡは、次にファルマシアのファ ストディサルティングカラムで脱塩され凍結乾燥された。アシル化された及びア シル化されていないｔＲＮＡの凍結乾燥物は、試験管内のタンパク質合成反応に 使われる直前まで、−８０℃で貯蔵された。

反応液上清のβーラクタマーゼ活性は、ニトロセフイン加水分解測定法により測 定された（０°Ｃａｌｌａｇｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．　、　（１９７２）Ａｎｔｉ ＋ｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇ．　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、　１：Q８３．　１単位 のニトロセフイン加水分解活性は（１μｍｏｌのニトロセフイン加水分解物／園 ｉｎ／ｍＬ。

０、１ｍＭニトロセフイン、５０鶴フォスフェートバッフｙ，ｐＨ７）でブラ・ ７ドフオード測定法によって測定した０．６１Ｍｇの酵素に相当する。）。

区座　Ｌ紅畦 １　ｐＳＧｌ　４４．６ ２　ｐＦ６６ａｍ　Ｑ ３　ｐＦ６６ａｍ．非アシル化サプレッサー　０４　ｐＦ６６ａｔアシル化サブ レ・アサブレ　６．７図７はジヌクレオチドｐＣｐＡの化学的なアミノアシル化 の方法を示す。ジヌクレオチドｐＣｐＡは、通常の液層フォスフオトリエステル 合成法（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　、　（１９１０）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ．３６　＋３０１５；　Ｖａｎ　Ｂｏｏｍ　ａｎｄ　Ｗｒｅｅｓｍａｎ　ｉｎ 　−０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉр■ Ｓ３’ｎｔｈ６ＳＩＳ”、　Ｇａｉｔ　（Ｅｄ．）、ｌＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｗ ａｓｈｉｎｔｏｎ，　１９８４）により準備された。完全に保護された分子は、 ４−クロロフェニル−４−Ｎ−アニソイル−２゛−０−テトラヒドロビラ＝　ル ー５−Ｑ−　［βーンアノエチルオキシフォスフォリルコ／チジリル（３’−５ °〉−［６−Ｎ、　６−Ｎ、　２’　−０，３−０−テトラベンゾイリル］アデ ノンンであった。つぎに、０−二トロフェニルスルフェニルクロライド（１，ｂ ＋ｍｏｌ）およヒドリエチルアミン（１８ｍ＋１ｏｌ）が、ジメチルスルフオキ シド（６ｋＬ）に溶解したｐＣｐＡ（２８５μｍｏｌ）に６時間にわたって添加 された。反応は、　５０＋＋Ｍアンモニウムアセテート、　ｐＨ５（ｌｏＯａＬ ）ヲ添加し、停止させた後、溶媒は真空吸引で除去された。逆相ＨＰＬＣの精製 で（ＨＰＬＣ条件Ａ＝１５ＩＩＭアンモニウムアセテートｐＨ５，ＢｌｌＭｅＣ Ｎ、グラディエンド＝０〜１５％Ｂが６０分間；１５〜３０％Ｂが３０分間、流 出速度＝８■Ｌ／ｓｉｎ、、カラム＝ワノトマンパーティンルｌ０Ｍ−２０１０ １５００ＤＳ−３，）　、６５％のＮＦＳ−ｐＣｐＡ、　２２％のｐＣｐＡを回 収した。ＮＰＳ−ｐＣｐＡは逆相１１ＰＬｃによって脱塩された（ＨＰＬＣ条件 ：　Ａ＝Ｈ２０，ＢｌｌＭｅＣＮ、グラディエンド＝Ｏ〜ｉｓ％Ｂが６０分間； １５〜３０％Ｂが３０分間、流出速度ｉ＋８■Ｌ／■ｉｎ、　、カラム＝ワノト マンパーティンルｌ０Ｍ−２０１０１５００ＤＳ−３，）後、つづいてダウエッ クスカラム（ＬＬ＋型）に通された。

０−ニトロフェニルスルフェニルフェニルアラニン（７４μｍｏｌ）とＮ、Ｎ− カルポニルジイミダゾル（８３μｍｏｌ）は、窒素下で無水ジメチルスルフォキ サイド（３２０μＬ）中で３０分間混ぜられた。次に溶液にＮＦＳ−ｐＣｐＡ　 （１５μｍｏｌ、）ルエン中で繰す返し蒸発乾固された）のリチウム塩を添加さ れた。反応液を窒素下で５０℃で８時間かき混ぜた後、０℃で５０ｍＭアンモニ ウムアセテート、　ｐＨ５（２ｍＬ）を添加し停止し、凍結乾燥後、逆相ＨＰＬ Ｃ（ＨＰＬＣ条件：　ｆｉ、・５０ｍＭアンモニウムアセテート、　Ｂ＝ＭｅＣ Ｎ、グラディエンド＝０〜７０％Ｂで７０分間、流出速度＝ｌｌ＋＋Ｌ／ｗｉｎ 、、カラム−ワットマンパーティフルｌ０Ｍ−２０１０１５００ＤＳ−３，）に よって精製され、３８％の反応開始材料と１６駕の効率で望むべき産生物が回収 された。凍結乾燥後、この産生物（２，４μｍｏｌ）は４０ｍＭのソジウムチオ サルフェート、５０ＩＩＭのソジウムアセテート、　ｐＨ４，５（２ｍＬ）に溶 解され１時間かき混ぜられた。逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ条件：　Ａ＝８ｍＭ　Ｈ ＯＡｃ、　Ｂ＝ＭｅＣＮ、グラディエンド−〇〜３０％Ｂが４５分間、流出速度 ＝４ｍＬ／■ｉｎ、、カラム＝ワソトマンバーティンル１０Ｍ９１５００ＤＳ− ３，）によって脱保護化されたアシル化ｐｃｐＡが８１％の効率で回収された。

全ての産生物はＵＶ、　ＮＭＲおよび２Ｄ　ＮＭＲにより解析された。

図８は、図１に従って合成されたＰｈｅ６６β−ラクタマーゼの精製を示す。β −ラクタマーゼは、図４に述べられた方法にしたがって化学的にアシル化された Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｕＡ１５０μｇを添加された９００μＬのｐＦ６６ａｍ−添 加反応から精製された。典型的な効率は、０．３−０．７μｇ（７−ｔｓ％）の 精製酵素が、４５μｇの粗反応物から開始して得られた。

試料（５５０−２００ｎ／ｂｉｎｄ）は、　１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル（Ｌａｅｍｗ＋ｌｉ。

（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２２７：６８０）　、　に よって電気泳動後、銀染色された。分子量Ｍｒ・６７０００と６００００の拡散 したバンドは、通常高＠度銀染色で観察されるアーティファクトである（Ｍｅｒ ｒｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 　９６：２３０）　ｏ　１列：粗試験管内反応物；　２列：精製された試験管内 合成β−ラクタマーゼ；　３列：精製された生体内合成β−ラクタマーゼ（ＪＭ ＩＯＩ／ｐＳＧ７）。

図９は、野生株と抑制型のβ−ラクタマーゼのトリブ／ン分解ペプチドマツピン グの図を示す。野生株β−ラクタマーゼは［３旧−フェニルアラニノ存在下で、 ｐＳＧ７から試験管内タンパク質合成系によって均一によって標識された。図４ に示すように、セファデックスＧ−７７（Ｐｈａｒ−ｍａｅｉａ）によるゲルフ ィルトレーン３ンとクロマトフォーカンングクロマトグラフイーを用いて精製し た試験管内合成産物は、精製に先だって非標識のβ−ラクタマーゼが添加された 。ｐＳＧ７からのβ−ラクタマーゼの配列を下に示す。トリプシン分解部分は、 スペースで示唆されている。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を含むペプチドは太字 で示されている。　Ｐｈｅ６６は下線をほどこされティる：　ＭＳＨＰＥＴＬＶ Ｋ　ＶＫ　ＤＡＥＤＱＬＧＡＲＶＧＹＩＥＬＤＬＮＳＧｌｆ　ＩＬＥＳＦＲＰＥ ＥＲＦＰＭＭＳＴＦＩＶＬＬＣＧＡＶＬＳＲＶＤＡＧＱＥＱＬＧＲＲＩＨＹＳＱ ＮＤＬＶＥＹＳＰＶＴＥＫ　ＨＬＴＤＧＭＴＶＲＥＬＣＳＡＡＩＴＭＳＤＮＴＡ ＡＮＬＬＬＴＴＩＧＧＰＫ　ＥＬＴＡＦＬＩＩ）１ＭＧＤＨＶＴＲＬＤＲＷＥＰ ＥＬＮＥＡＩＰＮＤＥＲＤＴＴＭＰＡＡＭＡＴＴＬＲＫ　ＬＬＴＧＥＬＬＴＬＡ ＳＲＱＱＬＩＤｌｆＭＥＡＤＫ　ＶＡＧＰＬＬＲ５ＡＬＰＡＧＷＰＩＡＤＩ　５ ＧＡfＥＲ ＧＳＲＧＨＡＡＬＧＰＤＧＫＰＳＲＩＶＶＩＹＴＴＧＳＱＡＴＭＤＥＲＮＲＱＩ ＡＥＩＧＡＳＬＩＫ　ＨＷ０ト！Ｉプシン分解後のペプチドは、ファルマシアＰ ｅｐ　ＲＰＣ５１５カラムによって分離された。カラム流出物の吸光度は、２５ ４ｎ■でモニターされ（パネルＡ）、そして０．５ｍＬづつ分画回収され放射活 性を測定された（パネルＢ）。放射標識抑制型β−ラクタマーゼは、［”Ｈ］− Ｐｈｅ。

ｔＲＮＡＰｃｈｕ−存在下において、ｐＦ６６ａ＋＊より試験管内反応によりで 合成された。抑制型β−ラクタマーゼの精製とトリブ７ン分解は同様に行われた 。ただし、６０００ＣＰＭの標識抑制型酵素が分解反応に使われた点が異なる（ パネルＣ）。

図１Ｏは、自然型及び変異型β−ラクタマーゼの解析を示す。野生型およびＰｈ ｅ６６−抑制型β−ラクタマーゼは、各々ｐＳＧ７あるいはＰｐＦ６６ａ７Ｐｈ ｅ−ｔＲＮＡｃｕａ・を用いた反応で試験管内合成された後精製された。当初の ニトロセフイン加水分解反応の比率は、２４°Ｃで５０μＭソジウムフオスフエ ートｐ１１７７０．５％ＤＭＳＯ及び２５−２５０μＭの範囲内の基質存在下で 決定された。ＫＭとｖｌｌ、ｘの値は、イーデイーーホフステイ　プロット（Ｅ ａｄｉｅ−１１ｏｆｓｔｅ　ｐｌｏｔｓ）から得られた。また、ＫｅｓＬ値を決 定するために酵素のブラッドフォード測定定量法が使われた。

変異型酵素の反応速度定数は以下のようにして決定された。１５μＣｉ　［”Ｓ ］−メンオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む試験管内反応（６０μｌ）を、ｐＦ ６６Ｙ、　ｐＦ６６担／Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰＣｈＵ”Ａ、　ｐＦ６６ｇ／ｐ−Ｆ Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｃ”ｕ−、ｐＦ６６ｕ／ｐ−Ｎ０２−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｃ ’ｕ”ｎ。

ｐＦ６６県〆）ＩＰｈｅ−ＬＲＮＡＰｃｈｕ”ｏ、ｐＦ６６！！／ＰＬＡ−ｔＲ ＮＡ’ｃ”ｕ・Ａ、ｐＦ６６Ｌ７ＡＢＰＡ−ｔＲＮＡＰｃｈ普翌P１ある いはｐＦ６６ａｍ／Ｄ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ’ｃｈｕ−によって開始され、３７℃ で３０分間加温された。ＫＩＩとＶ□８の値は、粗精製の酵素を用いて加温反応 後直ちに上記したように決定された。

酵素量の定量は、粗反応液をトリクロロ酢酸で沈澱した後、結合していない橿識 物を除くため、９０°Ｃで洗った後の最初の沈澱物を用いて測定された（Ｐｒａ ｔｔ　ｉｎ”Ｔｒａｎｎｓｃｒｉｐｕｔｊｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ ｎ”、　Ｈａｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　（Ｅｄｓ、）、　ＩＲk　Ｐｒ ｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　１９８４．　ｐｐ、１７９−２０９）　、　Ｐｈｅ６６酵素の アイソトープ標識結合量の測定値は、ブラッドフォード定量法で決定されたに。

５ｔ−８８０ｓ−’とともに酵素のμ＋＊ｏｌあたりの結合放射活性量（典型的 には５−Ｃｉ／μｍｏ１）を計算するために用いられた。この値は、次にそれぞ れ測定された結合放射活性に基づいて変異型酵素の定量に用いられた。図に示さ れている値は、３回の実験の平均である。

好ましい実施態様の詳細な説明 この発明は、自然に存在しないアミノ酸を特定の部分に含むタンノくり質の新し い合成方法を提供する。この方法は、望んでいる目的の自然界に存在しないアミ ノ酸を、ｍＲＮＡ配列の特異的なコドンの部分に重合させることのできる、修飾 されたアミ／アシルｔＲＮＡを主として用いる。この方法を用いて、非常に多種 多様な自然界に存在しないアミノ酸を、興味のあるタンパク質に選択的に導入す ることができるであろう。この方法は、タンパク質の特定の選択した部位に化学 量論的に十分かつ均一に置換されたタンパク質を提供することができる。この方 法は、本質的に簡単であり、かつ又非常に無制限な数の可能な限りの変化でタン １＜り質分子に修飾する形や部位を制御することを可能とする。

この発明の１つの点は、以下に述べるように、修飾されたｔ　ＲＮＡ分子の製造 と、望むタンパク質を製造する際にこのｔＲＮＡを用いることに関連している： ａ）望んでいるポリペプチドに翻訳することのできる核酸配列を準備すること、 この核酸配列はポリペプチドの望んでいる前もって選択されたアミノ酸の置換に 相当する少なくとも１つのコドンを含んでいること。

ｂ）目的とするコドンを認識し又ポリペプチドへ置換するアミノ酸を重合するア ダプター分子として機能できるアミノアシルｔＲＮ＾アナローグを手に入れるあ るいは合成すること。

Ｃ）核酸配列とアミノアンルｔＲＮＡアナローグを含むタンパク質翻訳系を共用 すること。ここで、タンパク質翻訳系は以下の点を除いては正常に核酸のメツセ ージを翻訳する機能を果たす。以下の点とは、アミノアンルｔＲＮＡアナローグ が、それ以外では自然界に存在するアミノ酸を取り込む場所にアミノ酸置換を起 させ取り込ませることができるという点である。

ｄ）翻訳系が、塩基配列を翻訳させるように機能すると共に、翻訳系は産物のタ ンパク質の選択されたコドンに前もって決定されたアミノ酸アナローグを導入置 換することができるようにする。

これら各々の段階は、発明の重要な部分であるが、この方法を以下に示すような 特殊な使い方に適用する技術に優れている人にとっては様々な改良が可能であろ う。

タンパク質は生命器官を形づくる基礎単位であり様々な機能を果たす。典型的に は、これらタンパク質は構造をささえる機能、あるいは触媒（酵素）の機能また はこれら２つの混合として機能する。タンパク質は、メ・ノセンジャーＲＮＡ　 （■ＲＮＡ）を形づくっている塩基配列に含まれる情報に従って、２０の一般的 なアミノ酸単量体のセットからポリペプチド鎖を重合するりボゾーム上で合成さ れる。ｍＲＮＡは、３個のヌクレオチドの単位（１コドン）を１度に読むことの できるリボゾームにより翻訳される。特殊な配列Ａｔ１Ｇあるいは開始コドンか ら、リボゾームは、３個のヌクレオチド単位を連続的に読み、翻訳の”骨格”を 形づくる。

ＲＮＡは４種類のヌクレオチド、それぞれアデニン、／トシン、グアニンあるい はウラノルを含むヌクレオチドからなる。３つのヌクレオチド単位（コドン）は 、６４種類の可能な組合せがあり、その内３種類は通常翻訳されず、結果として ポリペプチド鎖延長の停止を意味する。これらの３種のコドン、　ＬＩＡｆ：ｉ 、［ＩＡＡそしてＵＧＡは、正常の停止コドンである。他の６１のコドンは、各 々に相当するアダプター分子（ｔＲＮＡ）を持つ。このｔＲＮＡは、メツセージ コドンを塩基の相補性の配列適合により認識（あるいは相捕的にマツチ）する。

相補性の配列は、ｔＲＮＡのこれらの”アンチコドン”に含まれている。このｔ ＲＮＡアダプター分子のもう１つの部分は、タンパク質のポリペプチド鎖”伸張 反応”の基質として動くようにアミノ酸をリボゾームの正しい部分に位置づける アダプター分子として働く。ここで、合成途中のペプチド鎖はｔＲＮＡ上のアミ ノアシル化された成分に重合される。５゛末端のコドンは、アミ７基側末端のア ミノ酸をコードする。そしてこれに続くコドンは、合成途中のペプチド鎖の次の カルボキシル側のアミノ酸を指令する。このようにして、ポリペプチド鎖はアミ ノ基末端から開始して合成され、それぞれの連続するアミノ酸は、カルボキシル 端側に添加される。

正常な場合、ｔ　ＲＮＡは極めて高度に忠実に正しいアミノ酸成分を酵素的に結 合されている。従って、このアダプター分子はアンチコドンに適切に対応する正 しいアミノ酸を結合されている。もし、ｔＲＮＡが間違ったアミノ酸結合を受け ていると、それにもかかわらずｔＲＮＡはメツセンジャーＲＮＡの適切な場所を 認識し、適切なアンチコドンを認識するので、不適切なアシル化されたアミノ酸 成分はそれにもかかわらず合成途中のポリペプチド鎖に重合される。さらに加え て、この点は停止コドンにマツチする修飾されたアンチコドンを持つｔＲＮＡに も適用できる。これらは”抑制”　ｔＲＮＡとして知られている。なぜならば、 これらはｍＲＮＡ上にある適切な位置の停止コドンの効果を抑えるからである。

この現象は、一部分この発明の基本的基盤である。

この発明は、多くの場合化学的に特異的に限定されてほこなかった手段や分子を 使う。そして、必ずしも正確に同じ意味を他の分野で意味するものではない一般 的な用語を使う。以下に述べる定義は、基本的に機能本位に定義されている。

ここで用いられている技術や概念の記述の多くは、Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、　（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎ ｅ、　Ｖｏｌｓ、　１及び２に含まれている。さらに、Ｗａｔｓｏｎ　ａｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅに言及されている。

″読み取り（ｒｅａｄｉｎｇ）″という言葉は、タンパク質翻訳系がｍＲＮＡの 与えられたコドンを認識し、コドンの方向に特別なアミノ酸を合成途中のポリペ プチド鎖の相当する部分に重合する過程のことである。

”読み間違い（ｍｉｓｒｅａｄｉｎｇ）″という言葉は、元々のタンパク質翻訳 系で合成される合成途中のポリペプチドに挿入されるアミノ酸と相当するコドン の暗号の間違った翻訳のことを意味するために使われている。（即ち、そうでな かったらアミノアシルｔＲＮＡがタンパク質翻訳系に取り込まれる前のことであ る。）”停止コドン”という言葉は、使われている、タンパク質翻訳系において 翻訳停止の信号として使われるコドンのことを意味する。翻訳系としては、通常 の使われるものが使われている場合、′統一暗号”として使われているコドンが ある。

通常これらのコドンはＵＧＡ、　ＵＡＧそしてＵＳＡである。しかしながら、ア ミノ酸に対応するコドンが全く異なる翻訳系を作ることも可能である。そこでこ の用語（停止コドン）は、どのようなコドンであっても翻訳系で用いられたコド ンを含むことを意味する。

“ｔＲＮＡＲＮＡアナローブ言葉は、合成中のペプチド鎖の転移とコドン認識の 活性を持つｔＲＮＡのアナローブであればどのような分子であってもそれをさす 。各ｔＲＮＡ種は、化学的規定では厳密に均一ではない。何故ならたとえ基本的 性質にその影響が少しであったりあるいは全くその影響がなかったとしても数多 くのメチル化や他の修飾あるいは一次核酸配列の変化が行われるからである。し たがって、この用語は様々の修飾された型を含む漠然とした核となる化学的な定 義を包含する。通常全てのｔ　ＲＮＡ分子は、特別なコドンを認識するように機 能し、単一の遺伝子から直接転写されるものであるから正確に“ｔＲＮＡ″と考 える。したがって、機能的な定義は、化学的な記述よりずっと適切である。様々 な出所からの多くのｔＲＮＡは、“核”となる骨格の塩基配列に従って常識的に 定義されてきた（Ｓｐｒｉｎ−ｚｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、（１９ｇ？）Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ　１５：Ｒ５３；ＧｅｎＢａｎｋ”／ＥＭＢ Ｌ　Ｄａｔ≠aａｎｋ）。

一方、メチル化とその他の修飾の数と場所は、多様であるし不正確に定義されて いると思える。この定義は、ｔＲＮＡの以下に述べるような小さな修飾を含む、 不均一あるいは均一なｔＲＮＡ分子種の変異型の各々を特に含もうとするもので ある。このささいな修飾とは、これに限定されるものではないが、メチル化変化 あるいは他の修飾型の違い、ｔＲＮＡ骨格塩基配列の差異（置換、添加、欠失、 塩基の修飾を含む）、外来性由来のｔＲＮＡ、あるいはｔＲＮＡ分子に一般的に 関連する機能を持つであろうと思われる他の分子などを含むものである。翻訳系 構成成分（リボゾーム、エロンゲー７−１ンファクター、ｔＲＮＡなど）間の相 互作用の効率は、必ずしも特に高いものではない。しかしながら、通常の技術を 持った人ならばこの発明の各々の様々な具体的な内容について関係した基本的な 機能について理解できるであろう。ｔＲＮＡ機能の上で最小限必要なことは、ｔ ＲＮＡが酵素的あるいは化学的にいくらかの過程でアンル化されるとともに、ア ／ル化された分子がアクセプター分子としての活性を持つことが必要である。分 子間相互作用のキネティ、クスは特にクリティカルではないが、効率という点で は重要である。

“アミノアシルｔＲＮＡアナローグという言葉は、アミノアシル化されたｔＲＮ Ａの以下に述べるようなアナローブのどれかを意味する：ａ）アダプター因子と しての機能、つまりメツセンジャーＲＮＡとリボゾームとそれに付随する翻訳因 子とエロンゲーンロン因子、及び合成途中のポリペプチド鎖に適切に相互作用す ること：そして ｂ）以下のものを含む： １）機能を持ったアンチコドンとしての性質、そしてｉｌ）合成途中のポリペプ チド鎖に重合されることのできるアミノ酸アナローローグ成分 以下のこともここで記しておくべきであろう、即ちこの発明に基づくある種の方 法においては、アミノ酸アナローグは読み取り終止の終末アミノ酸であることが あり、その場合合成途中のポリペプチド分子に重合されることは必ずしもそのア ミノ酸がさらにアミノ酸モノマーを受け止める能力を持つこと（すなわち、さら なるペプチドの延長のこと）を意味するものではない。

化学的には、アミノア／ル化されたｔＲＮＡは以下のものを含む分子であると規 定できるであろう： Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｍ； ここでＸは、Ｄループやアンチコドンループの一部を構成する、ヌクレオチドや 修飾されたヌクレオチド（メチル化やその他の塩基部分にたいする修飾）からな る、ｔＲＮＡの５′端のことである；Ａは、ｔＲＮＡのアンチコドン部分である ；狭義の意味は翻訳されるコドンに７７チする３ヌクレオチドのことであるが、 広くはアンチコドンの３ヌクレオチドの近傍のヌクレオチドも含むものと拡大さ れ得る；Ｙは、アンチコドンループの部分と可変ループ、ＴφＣループ、アクセ プターステムの一部分を構成するヌクレオチドと修飾されたヌクレオチド（メチ ル化そしてその他の塩基部分に対する修飾）からなるｔＲＮＡの３′部分である ；Ｂは、通常これはｔＲＮＡ遺伝子にはフードされておらず、３’ｔＲＮＡヌク レオチジルトランスフエレースによって添加される、ｔＲＮＡの５’−ｐＣｐＣ ｐＡ−３’端である、そして Ｍは、アミノ酸成分である。

この定義は、３′末端ヌクレオチドを除去された短くなったｔＲＮＡ分子、例え ばｔＲＮＡ　（−Ａ）　、ｔＲＮＡ　（−ＣＡ）あるいはｔＲＮＡ　（−ＣＣＡ ）のようなｔＲＮＡ分子のアミノアシル化の可能性を除去することを意味するも のではないことに注意せよ。もし、これらが機能的であるならば、ここで用いら れるようなｔＲＮＡと等価であろう。

ａマルチ−ヌクレオチド”　（ＭＮＭ）という言葉は、核酸、典型的にはリボヌ クレイン酸の短い配列のことを意味する。この言葉は、アミノアシルｔＲＮＡア ナローグの合成の中で使われる。“ｔＲＮＡ（−Ｚ）”は、これの相当するｔＲ ＮＡ　（すなわち脱アシル化された形）から短いセグメント２を除去し短くした もの、またこれに相当するＺセグメントを除去したｔＲＮＡ分子のことである。

あるいは、末端を除去されたｔＲＮＡ（−Ｚ）は、リコンビナントＤＮＡあるい は化学的な方法で合成することができる。

この２セグメントは、ある意味ではマルチ−ヌクレオチド（ＭＮＭ）に相当する 。かくして、短縮化されたｔＲＮＡ　（−Ｚ）をマルチ−ヌクレオチド分子（Ｍ ＮＭ）に結合させることで、ｔＲＮＡは脱アシル化アミ／アシルｔＲＮＡアナロ ーグになる。この発明の１つの方法は、アミノアシル化されたＭＮＭを、ｔＲＮ Ａ（−Ｚ）分子に結合させアミノアンルｔＲＮＡアナローグを合成する基質とし て用いる。

かくして、”ｔＲＮＡ（−Ｚ）″という言葉は、アミノアンルーマルチ−ヌクレ オチドに結合させることで、機能を持ったアミノアシルｔＲＮＡアナローグ分子 を作ることのできる分子のことを意味する。この言葉は、特に短い形のｔＲＮＡ 典型的には３′　ヌクレオチド端の２から３個のヌクレオチドを除去したものを 含もうとするものである。ＬＲＮＡ（−Ｚ）をアミノアンルーマルチ−ヌクレオ チド（アミノアノルーＭＮＭ）に結合させることで機能を有したアミノア／ルｔ ＲＮＡアナローグを合成する。典型的には、２とＭＮＭは同じ意味であり、具体 的には５’　−ｐＣｐＡ−３’　ジヌクレオチドのようなものである。

Ｍ自然に存在しないアミノ酸アナローグという言葉は、アミノ酸のアナローブそ のものあるいはそのアミノ酸の修飾型を意味する。この言葉は、自然のアミノ酸 の修飾したもの、自然界に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナローグそしてアミ ノ酸誘導体を含む。

自然界に存在するアミノ酸のセットとは、通常リボゾームによって行われる重合 過程に使われるアミノ酸を含む。通常、これらアミノ酸は、タンパク賀重合反応 の／グナルとなるコドンを持っている。普通の場合でも、タンパクにまれな形の アミノ酸が存在するが、これらは通常２０のよく使われるアミノ酸グループの１ つを比較的単純に修飾したものである。さらに又、自然界でも実際に発生するが 、その形のままでは最終的に翻訳過程で重合されることはないアミノ酸をも含む 。これら自然の修飾は、合成中のポリペプチド鎖やさらにもつと多（の場合は、 ポリペプチド鎖完成後に起こる重合反応後のアミノ酸の修飾から明らかに生じる ものである。これらは、次のような翻訳後修飾アミノ酸、４−ヒドロキシプロリ ン、５−ヒドロキシリジン、ンスチンそしてその他を含む。これらの修飾は、酵 素によって行われ、その修飾の形そして修飾の標的となるアミノ酸の種類におい てきわめて限定されている。

自然のアミノ酸の修飾型、自然に存在しないアミノ酸、アミノ酸のアナローブ、 そしてアミノ酸誘導体等は、アミノ酸のアルファ型あるいはその他の機能を持つ すべての修飾を含むことを意味する。これはさらに、まれな形の原子の置き換え や添加、コファクターやその結合部分、糖付加やアセチル化等の側鎖の添加を含 む修飾である。

“予め選ばれたコドン”という言葉は、合成されるタンパク質のリーディングフ レーム内で、なんらかの機能的な形での変化をさせようというコドンのことであ る。従って、特定の塩基配列がもし１つ以上のリーディングフレームを持つ場合 、このコドンはそのうちの１つにだけ影響を与えることを必要とする。

“部位特異的導入”は、特定のコドンをメツセージのリーディングフレームの特 別の場所に導入すること、あるいは特別のアミノ酸アナローグをポリペプチド鎖 の特定の部位に導入することを意味する。コドンの位置とその対応するアミノ酸 の位置は１対の位置的な相互対応間係があるのでアミノ酸アナローグの置換部位 はこれに相当するコドンの場所によって決定されることがわかる。結果として、 アミノ酸の部位特異性は、コドンの部位によって決定されるし、その逆も又真実 である。

合成途中のポリペプチド鎖は、機能中のコドンの５′上流側の霞ＲＮＡから翻訳 された不完全なポリペプチド鎖のことである。作用中のコドンは、合成途中のポ リペプチド鎖に重合されるつぎのアミノ酸アナローグの特異性を決定する。通常 のポリヘフチド鎖延長過程において、合成途中のポリペプチド鎖は、リボゾーム のＡサイトに隣接するコドンを認識するｔＲＮＡ上のアミノアシル化部分上にお いて重合される。

タンパク質やポリペプチドという言葉は、タンパクあるいはポリペプチドに実質 的に同等な修飾された分子でこのシステムで合成される産物を含むことに使われ る。これは、特にアポプロティンやホロプロティンはもちろんのことタンパク質 やポリペプチドのことを意味する。この定義に含まれるポリペプチド分子は以下 のものである： ａ）修飾されたアミノ酸を（そのアミノ酸に相当する）アミノ酸の通常の部位に 置換したちの；あるいは ｂ）アミノ酸と構造あるいは組成が異なるかも知れないがアミノ酸のような成分 。

これは以下のものを含む、但しこれに限定されるものではない；ｉ）　ベータ、 ガンマ、デルタあるいはその他の炭素分子のアミノグループを含むペプチド化結 合を持つ成分（即ち、非アルファアミノ酸）：ｉｆ＞ポリペプチド骨格上で炭素 や窒素原子以外の原子を持つもの；＋ｉ＋）　（ヘテロ原子、環状あるいは非環 状基あるいは金属結合基；又放射性同位元素標本物を含む）合成側鎖に相当する ような側鎖Ｒを含むアミノ酸ｉｖ）カルボキシル基がその他の群たとえばサルフ ォニル、フォスフォリル、フォスフオニル基等によって置換されたアミノ酸、さ らにＶ）　φ、φ角が限定されたアミノ酸、例えばブローリンアナローブある（ Ａはジアルファ置換型アミノ酸。

これらの方法は、基本的にはどのようなタン、＜りでも特別には触媒能や受容体 機能あるいはリガンド結合能を持った酵素の構造や機能において基本的に適用可 能である。触媒を持ったタンパクとは以下のものを含む、但しこれに限定される ものではないが、ペプチダーゼ、ヌクリアーゼ、グリコシダーゼ、モノオキシゲ ナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ビリドキサルフオスフエート依存酵素、フラビン依 存性酵素、リパーゼおよびアルドラーゼである。受容体タン／＜りとは以下のも のを含む、但しこれに限定されるものではないが、抗体、Ｔ細胞、ムスカリン受 容体、Ｇタンパク、レクチン、ＤＮＡ結合タンパク、チトクロームである。構造 タンノくりとは、以下のものを含む、但しこれに限定されるものではないが、ミ オンン、ンルクである。

“基質結合部位”という言葉は、ポリペプチド鎖の三次構造上基質結合に重要な 部分に近接するあるいはその機能に重要なアミノ酸であり、または基質やリガン ドがポリペプチド骨格に結合する領域の近傍に位置するアミノ酸である。

“酵素的に活性な部位”という言葉は、酵素の触媒反応に必要な位置的化学的特 性に基本的な部分に属するあるいはその近傍に位置するアミノ酸残基のことであ る。

“タンパク−タンパク界面”という言葉は、相互に独立したポリペプチド鎖が相 互反応する部分に近接する残基のことである。

“コファクタ　パインディングサイビという言葉は、コファクタやリガンドが結 合する部分あるいはその結合のための認識に用いられる部分あるＬＸはその近傍 部分の残基のことである。

目的とするポリペプチド鎖を作るために翻訳される核酸配列、選ばれたコドンを 特定の部位に含む核酸配列を作る方法は様々であることはいうまでもない。これ ら方法は以下のものを含む、ただしこれに限定されるものではないが、自然界に 存在する配列を使う、自然の配列を修飾する、部分的あるいは全く全体を合成し た配列、そして様々の自然に存在する配列を組み合わせて新い）ノ・イブリット タンバクを作ることなど、　Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｗｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａ ｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　ＩＳ３．ａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９１１７） Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ撃≠秩@Ｂｉｏｌｏ ｇｙ。

Ｖｏｌｓ、　１ａｎｄ２、それぞれは特にリファレンスに含まれている、を見る こと。

このような配列は、ＤＮＡ型及びＲＮＡ型の両方の配列を意味する。ＤＮＡ型は 以下のものを含む、ただしこれに限定されるものではないが、遺伝子に組み込ま れた配列、クロー１−ソーム外因子に組み込まれた配列（プラズミド、エピゾー ムそしてミニクロモシームまたは自由型ＤＮＡを含む〉、ファージ、ウィルスそ してその他の同様の型である。同様のＲＮＡ型のものも同時に含まれる。

翻訳されるＲＮＡの配列は、その様々の部分において異なるいろいろなコドンに 置換することによって変化されるであろう。さまざまなコドンの代わりになぜ特 定の１つのコドンが使われるか、そして各々の様々なコドンがその他の内の１つ と置換されることが何故なのか十分分かっていない。理論的には明らかに６３の 異なるアミノ酸とそれに追加して１つのアミノ酸コドンとそれに追加して１つの 停止コドンを用いて翻訳系を作ることもできる（Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｇｅｎｅ）。この方法を用いて、ユニバーサルコードとは全（異なる遺伝子暗号 を持った翻訳を作ることができる。特に、望む産物を作るための開始配列は、自 然のものや修飾された配列あるいは全（合成された配列でもかまわない。

置換の場所は、特別に前もってアミノ酸の挿入のために選ばれたものならばどの ようなコドンでも変えることができる。使用にあたって望ましいことは、曖昧な 多様性を持ったコドン、即ち読み間違えを完了させるために選ばれたｔＲＮＡと は異なるアミノアシルｔＲＮＡによって翻訳されるようなコドンを選ばないこと である。

本当にユニークにコドンとアミノアシルｔＲＮＡが対応する場合、全く化学量論 的に完全に置換が起こるが、翻訳間違いをするために選ばれたコドンを認識し、 アダプタ分子として機能するような他のアミノアシルｔＲＮＡが働くことを可能 にするなんらかの機構によってこれが化学量論的に完全でな（なることもある。

かくして、理論的にはどのようなコドンでも翻訳間違いのために選ぶことができ るが、通常はポリペプチド鎖のリーディングフレームの中で他のどの部分でも使 われていないコドンを選ぶのが普通である。そして使用される基本的な翻訳系の 中に含まれて存在するどのようなアミノアシルｔＲＮＡによっても翻訳されない コドンを選ぶことが必要であろう。

これらの理由のために、停止コドンは塩基配列上池のインフレーム停止コドンが ないために条件に適する。最適の条件では、実際に翻訳を停止するために使われ るものと異なる停止コドンが選ばれる。さらに選ばれたユニークなコドンは、遺 伝子合成の力でユニークであろう。特異的なコドンにするためには、同じコドン を含む他の全ての部分を、そのコドンを他の異なる多様なコドンに置き換え、従 って特別のその部分を単独の選ばれたコドンを持つ部分として残すことにより可 能とすることができる。これに付は加えて、この系は、同じ前もって決定された アミノ酸アナローグによる２つないしそれ以上の置換あるいは２つないしそれ以 上の異なるアナローブを用いる場合など、複数のユニークなコドンを選ぶことに 基づいて２つないしそれ以上の置換を簡単に行うことができるようになる。

“実質的均一”という言葉は、修飾の部位及び形の画点において均一であるとい う概念を意味する。ある種の修飾が十分に均一であるということは、大多数の翻 訳産物が均一、典型的な例として６０％以上が単一の形であり、望むらくは８０ ％以上が同一、最も最適の場合９８％が同一であるという意味で使われる。

“実質的に化学量論的”という言葉は、はとんど全ての産物が望んだ部分に置換 が起きる条件、典型的には７０から８０％以上の産物が置換され、望むらくは９ ０％以上の置換、最も最適の場合９８％以上が置換されることを意味する。

“タンパク合成系”は、リボゾーム、ｔＲＮＡ、エロンゲーシヲンファクタそし てｍＲＮＡ添加と適切な条件下でｍＲＮＡをタンパクに翻訳するに必要な全ての 要素からなる系である。この言葉はまた、′翻訳系”とも述べられる。

典型的にはどのような細胞でもタンパク合成系を遺伝的に持っている。しかし、 これは多くの場合いろいろな理由から非常に低い活性を持っている。ここで述べ る用途のために、生体内系が使用されることもあるが、この場合は必要なアミノ アフルｔＲＮＡを導入するのに困難をつきまとうことがある。この生体内系は、 通常の微量注入法や他の外来性の産物分子を細胞内に導入する機構例えば球形の 細胞への電気的な注入法を用いることによって可能である。明らかに可能な技術 として、ポリエチレングリコールあるいはセンダイウィルス融合のような方法を 用いて細胞あるいはりボゾームを融合させる方法がある。好まれて使われる翻訳 系は、カエルの卵子に微量注入をする方法である。この微量注入法は、他の大き な細胞を翻訳系として使う場合にも用いられる。もっと典型的には、試験管内系 が好まれる。なぜならば、それは高濃度の荷電状態の自然界に存在しないアミノ アシルｔＲＮＡ分子を合成系に高濃度に導入することが簡単であるからである。

このような翻訳系は購入可能であり、大腸菌（ＩＩ：、ｃｏｉｌ）　、エスセル ピアーエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）・ウイートジャーム（ｗｈｅａｔ　ｇ ｅｒｍ）　、うさぎのせきがきゅう細胞（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＳ）の可溶 物とから作られてきた。

この方法の特徴の１つは、自然界に存在しないアミノアシルｔＲＮＡを取１１） 込むことのできる異なる翻訳系を同一の単一の情報を用いて行うことができるこ とである。異なる翻訳系は、異なる自然界に存在しないアミノ酸を選んだ部位に 取り込ませるために使われるであろう。かくして、選ばれた場所に前もって選ば れた自然界に存在しない適当なアミノ酸を挿入した各々異なる一連の産物を作る ことができる。この方法はまた、その他の場合においては、それに相当するアミ ノアシルｔＲＮＡを持っていないので、この終止コドンを特に選ばれたコドンと して用いる。

適切な翻訳系は、前もって存在するｔＲＮＡを除く必要はない、しかしながら新 しいｔＲＮＡを添加することにより作ることができる。機能を持つ不自然なアミ ノアシルｔＲＮＡは、以下の過程を複合して合成される：ａ）適切なアンチコド ンを使用のために選択する；そしてｂ）適切な前もって決定されたアミノ酸アナ ローグを結合する。

１度誤翻訳コドンが選ばれると、それに相当するアンチコドンをもっｔＲＮＡが 選択されるか合成されなければならない。選択は好ましくは自然のｔＲＮＡを隔 離することにより行われれる。製造する場合は、変異と選択をあるいは部位特異 的に適切なアンチコドンを導入することにより行われよう。

改良した翻訳系は、通常不自然なアダプタ分子の酵素的ア／ル化を用いることは ない。したがって、ｔＲＮＡの機能上の定義は、通常酵素的なアシル化能を含ん ではいない。しかしながら、この点は、酵素的なアシル化が可能な場合は必ずし もそれを除外するものではなく、アシル化能が重要な場合には酵素的なアシル化 を除外するものではない。

アミノ酸をｔＲＮＡに結合させることは、通常アミノアンルｔＲＮＡンンセター ゼによって触媒される。これらの酵素は可逆的であり、そして適切なｔＲＮＡ　 （アシル化の特異性は、認識のためアンチコドンを使用しない）と結合に必要な アミノ酸の両方に非常に特異的である。ときには自然のシンセターゼを使うこと が可能ではあるがあるいはその特異性を改良することが可能ではあるが、そのよ うなことは通常は行われない。したがって、適切なアミノアフルｔＲＮＡを合成 することは非常に重要である。そして、反応は可逆的であるために、不自然なア ミノアシルｔＲＮＡがその場に存在する何らかのシンセターゼの基質として動く ことがないような特性を持つことが何らかの方法（変異あるいは化学的修飾によ る不活化例えば抗体による除去またはその他の方法）によって脱ア／ルカシンセ ターゼと除去することにより脱アシル化活性が働かないようにすることが重要で ある。アミノアシルｔＲＮＡは、この発明の中心となる重要なものである。そし てこのアミノアシルｔＲＮＡ分子の合成は主な点である。不自然なアミノ酸に対 するシンセターゼが存在しない場合、このアダプタ分子を作り上げる必要がある 。

まれには、不自然なアミノ酸は、シンセターゼの基質であることがあり、そして 、適切なｔＲＮＡに結合される。他のいくつかの場合においては、アミノアシル ｔＲＮＡをそのアダプター機能を破壊することなくアミノ酸部分を改変すること が可能である。この方法はまれにしか利用できない。なぜならば、核酸部分の反 応基は、通常修飾反応の特異性と競合し相互に除外し合うからである。

これに代わる不自然なアミノアシルｔＲＮＡを合成する方法は、アミノアシルヌ クレオチドを合成することである。そして、それとともにこの分子を適切なｔＲ ＮＡ（−２）分子にその後結合させることである。この方法は、どの様なアミノ アシルｔＲＮＡ分子にも全く通常は適用できる。このアミノアシルｔＲＮＡとは 、通常のアミノ酸の結合を含めて可能である。ただし、シンセターゼ反応よりは ずっと効率が悪い。唯一の制限は、不自然なアミノ酸が、アシル化反応や保護反 応ステ・ノブと干渉し合わないこと、そしてまた結合反応とも干渉し合わないこ とである。もしそうならば、アダプタ分子を合成する代わりの化学的方法がある であろう。全体ノ大まかな案は、不自然なアミノ酸をオリゴヌクレオチドに結合 させ、つぎにヌクレオチド部分好むらくはＴ４　ＲＮＡリガーゼを使ってヌクレ オチド部分とともに結合させることである。この反応には、ジヌクレオチドが好 ましい、なぜならばこれはアミノ酸をヌクレオチドに化学的に結合させるときに 、干渉反応を最小限にするし、それから単一のヌクレオチドやＡｐｐＡアナロー グは結合のより高い効率を持っているからである。通常、ｔＲＮＡの３′末端ヌ クレオチドは、５’　−ｐＣｐＣｐＡ−３’である。そこで、ジヌクレオチドと して選ばれるのは、　５’−ｐＣｐＡ−３’である。他のヌクレオチド（ジヌク レオチドないしオリゴヌクレオチド）例えばデオキシ−〇−リボーＡ（即ちｐｄ ＣｐＡ）あるいは完全なデオキシＲＮＡ　（即ち、ＤＮＡ）で３′端がリボＡと なっているものを使うことは可能であろう。不自然なアミノ酸をヌクレオチドに 主にはジヌクレオチドを使って結合させた後、ｔＲＮＡ（−Ｚ）はアミノアシル −マルチ−ヌクレオチド（ａａ−ＭＮＭ）に結合され、最終的なアミノアシルｔ ＲＮＡが合成される。

結合反応が、化学的にあるいは酵素反応を用いて敢行されるということは、酵素 が一本鎖ＲＮＡ分子に結合能を持った酵素を意味する。実例に使われたＴ４　Ｒ ＮＡリガーゼにとってジヌクレオチドは十分に長い基質である。他の酵素はもっ と長いあるいは短い基質を必要とするであろう。ときには、脱防護反応が結合反 応の後で行われることがある。

ｔＲＮＡ（−Ｚ）の材料は、自然のｔＲＮＡを処理することから作られる。１つ の方法は、ｔＲＮＡ０ｃ’ｕνｎの遺伝子合成である。このとき自然のｔＲＮＡ ”　Ｖのアンチコドンは、アミノアンルｔＲＮＡシンセターゼによってｔＲＮＡ の認職を破壊する終結抑制因子に変えられる。

もう１つの方法は、サプレッサｔＲＮＡ（−Ｚ）をランオフ転写によって作るこ とである。その場合、このｔＲＮＡは通常のｔＲＮＡのように修飾を受けていな い。しかし、翻訳の一定の活性を持っている。これら各々のｔＲＮＡ分子は、典 型的には１回だけ化学的にアシル化されるので（通常の酵素反応と対象的に）、 通常伸張反応においてい（ぶん効率の下がった能力を持つアミノアシルｔＲＮＡ から作られることが多い。

もし適切なｔＲＮＡ（−Ｚ）がアシル化化学反応によって簡便に非常に大量に作 られる場合、適切なｔＲＮＡアクセプタ分子を高い効率で修飾を受けることな（ 翻訳するための特別に計画された系を使うことは非常に重要である。そして、こ の方法は、材料を作るために含まれている。かくして、修飾を受けないｔＲＮＡ 分子は、発明明細書の中に含まれている。ただし、通常のｔＲＮＡの定義の中に は含まれていない。

アミノアシルｔＲＮＡを作る化学的な方法は、記述された方法を簡便に改変でき る。

最も明解なのは、少し修飾されたｔＲＮＡ（−Ｚ）を使うことである。それは、 最初の分子よりはいくぶん長かったり短かったり修飾を受けたりしたものである 。これら分子は、ここでははっきりと発明明細書に含まれている。もう１つの明 らかな改良は、ジヌクレオチドの代わりに、モノヌクレオチド、トリヌクレオチ ド他のオリゴヌクレオチドを使うことである。これらは、明細書には含まれてお り全てマルチヌクレオチド（ＭＮＭ）分子の定義中に含まれている。５’−ｐＣ ｐＡ−３’から異なるヌクレオチドの組合せを使うことは可能である。

少なくとも３つのアミノアシル−ジヌクレオチド（第１図を見よ）を合成するた めに使われるアシル化法がある。通常これらは、ジヌクレオチドの反応性の基を ブロックすることを含む。アミノ酸をリボース環の３′端に結合させることモし て次にブロック基を除去することを含む。

最初の方法は、シチジンベース基をブロックするためにニトロフェニルスルフェ ニルクロライド（ＮＦＳ−ＣＩ）でジヌクレオチドを処理することを含む。１． １′−カルボニジイミダゾール（ＣＤＩ）中でこのアミノアフルＮＰＳを反応さ せると、アミノ酸は３′　ヌクレオチドリボース環の水酸基に結合する。チオサ ルフェートで処理をすることによって、アミノアシル−ジヌクレオチドを残して シチジンからＮＦＳが除去される。

第２の方法は、ジヌクレオチドの直接の合成あるいはジヌクレオチドを以下の薬 剤で処理すること、すなわち９−フルオレニルメチルオキシカルボニルクロライ ド（ＦＭＯＣＣＩ）　、β−ンアノエチルクロライド（ＥｔＣＮｏｃｌ）そして テトラヒドロピラニルクロライド（ＴＨＰＣＩ）　、これらはフオスフオリル基 、ヌクレオチド塩基、そしてリボース２′　ヒドロキシル基を保護する。ＣＤＩ 中でアミノアシル−２−（４−ビフェニル）イソプロビルオキシカルボニルを反 応させると、３′　ヒドロキシル基に結合する。１．１．３．３テトラメチルグ アニジン、２−ピリノニルドキンムおよびギ酸で処理すると、これらの保護基が 除去され、アミノアシル−ジヌクレオチドが合成される。アミノアシルービニル オキフルカルボニル（ａａ−ＶＯＣ）は、アミノアシル−ＢＰＯＣの代わりに使 われることがある。

第３の合成方法は、ジヌクレオチドの合成あるいはペンジルオキシ力ルボニル（ ＣＢＺ）とテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）でジヌクレオチドを処理し、シチジ ン塩基とリボース２′と３′、ヒドロキシ基を保護することによって合成される 。

ＣＤＩ中でアミノア／ルーベンジルオキ７カルボニルを反応させ、リボース２′ ＯＨ基に結合させる。水素と酸中でパラジウムと［１ａＳＯ４を処理すると、こ の保護基が外れアミノアンルーツヌクレオチドが産生される。カルボベンゾキ７ アミノ酸は、ｐ　ＣＮ　Ｐ　’！ｉ　ｐＡと結合することが証明されてきている 、そしてＮＰＳとＣＢＺ基に最終的に３５％の効率で除去することができること が証明されてきている。ヌクレオチドをアシル化する能力を持った酵素や、じき にオリゴヌクレオチドあるいはｔＲｌｌＡをアシル化することのできる酵素があ るであろう（Ｔｈｉｒｓｏｄ　ａｎｄ　Ｋ１１ｂａｎｏｖ、　（１９８６）Ｊ、 ＡｔＣｈｅｔ　Ｓｏｃ、　、　１０８：　５６３８＆３９７７　：Ｓｗｅｅｒｓ 　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ、　（１９８６）Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、@Ｓｏｃ、　、 　１０８　＋６４２１　；５ｂａｖ　ａｎｄ　Ｋ１１ｂａｎｏｖ、　（１９８７ ）Ｂｉｏｔｅｅｈ、Ｂｉｏｅｎｇ、、２９：６４８；ａｎｄ　Ｉｆｏｎｇ　ｅｔ 　ａｌA　、Ｆｌｕｏｒｏ− ｅａｒｂＯｂｙｄｒａｔｅＳ：ＣｈｅｍｉＳｔｒｙ＆Ｂ１０ｅｂｅ＋ｍ１Ｓｔｒ ｙ、ＴａｙＩＯｒ（Ｅｄ、）、ＡＣＳ　ｓｙｍｐｏｓｔｕｍ@５ｅｒｉｅｓ。

ＡＣＳ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，）。

ポリペプチドに取り込まれる前もって決められたアミノ酸アナローグの選択は、 使用者の必要によって決定される。使用者によっては、いくつかの数の特別な修 飾されたアミノ酸をいくつかの部分にそれぞれ異なる目的で置換することを望む 場合がある。とくに、最も興味のあるのは、新しい必要性を満たすためにタンノ ｆりの特性、活性あるいは構造を改変することのできる残基である。この発明の 技術の１つの力は、単に自然のアミノ酸しか選択の幅がないという以前の制限を 破る重要な可能性を持っていることである。この発明は、Ｄ−アミノ酸はもちろ んのこと、自然に存在しようとあるいは自然に存在しないであろうとどのような し一アミノ酸も置換することができる。

この発明のタンパクへの様々な利用法は、特別な形の残基を以下に述べるように 、ただしこれに限るものではないが、導入することである：ａ）重金属原子（ク リスタログラフィに有用である）；ｂ）クロスワンキング剤； Ｃ）マーカー（例えば、放射性同位元素、スペクトロスコープ、蛍光、磁性そし て電子）； ｄ）電子受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒｓ）あるいは提供体（ｄｏｎｏｒｓ）　；ｅ ）金属キレータ； ｆ）構造の制限された残基；そして ｇ）新しい塩基構成を持った残基： ｈ）変化した酸性あるいは塩基性残基；ｉ）変化した構造を持った残基（例えば 、ホモセリン、ホモシスティンあるいはオルニチン）；そして 」）変化した水素結合特性を持った残基（例えば、アミジン対アミド）。

特定の知られている部分に置換を行うことで研究可能となる物理的あるいは生化 学的特性は、数多くある。光学的なマーカは、タンパクやポリペプチド複合体の 三次元構造の特定の場所に導入されることがある。異なるｐＫａを持っ残基を導 入することあるいは、近接する残基のｐＫａに影響を与えるような残基、異なる 核酸構成を持つあるいは近接する残基の核酸構成に影響を与える残基を導入する こと、電子受容体機能、金属キレート機能、変化した水素結合の提供体あるいは 受容体、改変しあるいは制限された結合ねじれ角を持ったもの、コツアクタ結合 能をもったものあるいは蛍光や他の検出精製法の特別な標識物を持ったものなど 。この発明は、自然のアミノ酸残基の範囲を越えた化学的物質をポリペプチドに 導入し、そして自然によって壊された様々な束縛から逃れることのできる機会を 提供する。

特に、この発明の使用上置も重要な使用方法は、ポリペプチドの位相的な場所に 、重金属散乱中心を結合させることにより、結晶化に際してポリペプチド鎖の三 次構造を決定するに必要な波動方程式を解くことを相対的に容易にするであろう 。タンパクの構造は、非常に重要でありそして通常酵素がその機能を果たすに際 して基本的な性質となる。これらの機能とは、触媒能、基質結合特異性そして反 応構造の特徴それから制御相互反応の機構等の属性である。

しかしながら、多くの方法がポリペプチドの基質結合部位、酵素活性部位、リガ ンド結合部位、タンパク間界面そしてコツアクタ結合部位の場所の近（にある部 分に近接した部分の物理的生化学的特性を評価するのに適しているものがある。

ここで言う近接したという言葉は、約５０から１００ｉンク゛ストロームの範囲 で興味のある部分から離れていること、望むら（は約３０オノク゛ストトム以下 、最も適した条件では１５オンク゛ストローム以下の三次空間で存在することを 意味する。

ここでは、通常試験管内翻訳系が使われる。しかし、時には生体内タンパク合成 系を使うことも可能である。典型的な試験管内タンパク合成系は大腸菌を含む幻 覚細胞からのものそして兎のせきがきゅう（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）可溶物 、ウィートジャーム可溶物、それからイースト可溶物、様々なソースの部分を混 ぜた多様な系からのしんかく細胞由来のものが使われるａ　（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｇ ｒｏｓｓ＋＋ａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　 １５３）。望ましい翻訳系は、タンパクの遺伝子を結合させた強いプロモータの 制御のもとで、転写を著名に更新させた改良された転写翻訳系を含んでいる。あ るいは、非常に活性なＲＮＡポリメラーゼを添加することいよりメツセージの量 を増大させることができる。Ｔ７スベシフイツクブロモータに結合させたメツセ ージを、リファンピシン非感受性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写させ、− 万能の内在性の転写物はりファンビシンの存在下で、抑制することによりバック グランドの産生物を低下させることができる。持続的な翻訳系は、ラージスケー ルの産生目的の改良として可能である（Ｓｐｉｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９ ８ｇ）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：１１６２）。カエルの卵や筋細胞の細胞内に注 入することにより、メツセージｔＲＮＡあるいはアミノアシルｔＲＮＡを細胞の 中へ導入することができる。

ある場合においては、１つの特別な翻訳系のソースが望まれる。望んでいる産物 の産生量とその後の変化は、翻訳系に存在するあるいは欠損している活性に依存 している。そのような点としては、とうぶ化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）　 、アセチル化あるいは他のプロセッシング酵素あるいはプロテアーゼやその他の 酵素の欠如である。

この方法の解析研究にとっての重要な利点は、様々の非常に多くの置換を選んだ 場所に作ることが可能であるということである。読み間違いコドンを持った単一 のｍＲＮＡを作るに際し、はとんど無制限の数の異なる置換が特定の場所に作ら れる。唯一の制限は、翻訳そして読み間違い過程に使われるに必要な不自然なア ミノアシルｔＲＮＡの数のみである。停止コドンを選択することは特に有用であ る、何故ならば、内在性のｔＲＮＡを除去したり不活性化する必要がないからで ある。遺伝的に自然のｔＲＮＡはこの停止コドンにたいして存在せず、そして新 しい不自然なアミノ酸アナローグは、単に新しいアミノアシルｔＲＮ＾を添加す ることで取り込まれる。不自然なアミノ酸アナローグの１欄から適切なｔＲＮＡ を選択することにより、選んだ場所にどのような不自然なアミノ酸アナローグで も置換ができる。

選択されるであろう不自然なアミノ酸は、自然のアミノ酸の修飾、自然以外のア ミノ酸の修飾、αアミノ酸以外の修飾（即ち、β、γその他）、異なった立体特 異性を持ったアミノ酸（即ち、Ｄ−アミノ酸あるいは池の非対称炭素あるいはそ の他の原子の立体特異性の異なるもの）、アミノ酸原子や普通でない要素あるい は残基を含みコツアクタ結合部位を持つようなものである。

転写翻訳同時系は、合成されたｍＲＮＡを精製したり隔離したりすることなく、 転写系の産物を直接同一の系で翻訳することである。この系は、最初に転写に最 も適切な条件で開始され、後に転写産物を翻訳するに適切な状態にされる。

翻訳系の基本的な特徴を持つ翻訳系を、特別に設計することは可能であるが、一 方極めて特徴的に改変された暗号を持つ翻訳系を使うことも可能である。この理 由から、コドンとアミノ酸の間の対応が全（異なる翻訳系も含まれている。

この方法により作られるタンパクは、様々な特性を持っている。例えば、ａ）タ ンパクの修飾部位と形の均一性；ｂ）化学量論的に十分な修飾（全ての目的とす るタンパクが修飾され、非修飾型によって希釈されることがない）；そしてＣ） 修飾の形と部位の良（知られた特徴付け。

そのような産物の極めて多くの可能な利用は、直ちにタンパク生化学者には理解 される。タンパクの特徴付けは、この方法でバックグランドを低め、非修飾型や 異なる形で修飾された形によるノイズを下げることにより単純化される。物理的 あるいは生化学的解析にとっての意味は、精製されたタンパクに利用可能なある いは適用される技術の種類と同じ程度に幅広い、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ ＥｎｚｙＩＩｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　ｌ−１８７；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；５ｔｒｙｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ狽窒凵Fａｎｄ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓを見よ。

例えばこの解析技術をＸ線結晶学に適用すると、タンパクに特徴的かつ均一な重 金属結合中心を導入することにより、タンパクの三次元結晶構造を決定するのに 必要な波動方程式を解くための波形パターンデータの解析を助けるであろう（Ｍ ａｔｈｅｗｓ、　（１９７６）Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉ ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：４９３−５２３）　B 分光学への適用では、タンパクのユニークかつ均一な場所に選ばれた特定の物理 的な標識を導入することで電子構造の結合部位、活性部位あるいは他の重要な部 分の静的及び動的に明解な化学エレクトロニックな構造を解析するにきわめて有 用である。

次の実験項目は、実例を提供するものであり、これに限定されるものではない。

実験 六黙　と　タンパク４ 突然変異誘発の方法論は、前述のように、非常によく研究された加水分解酵素、 ＲＴＥＭβ−ラクタマーゼを用いて進められてきた（Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｍｉｌ ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ　Ｅｄｓ、（１９７９）“Ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍ ａｓｅｓ″、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ；Ｊａｃｋ　ａｎ ｄ　５ｙｋｅｓ、@（１９７１）Ａｎ ｎ、　Ｎ、　Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　１８２：２４３；ａｎｄ　Ａｂｒａｈａ ｔ　（１９７７）Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　３０：５１；Ｆ奄唐■■秩@ａｔ　 ａｌ、　。

（１９７１１）Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ１７　＋２１８０）。このバクテリアの （大腸菌）酵素は、１個のジサルファイド結合を持つ単一の２９ｋＤの鎖を持つ タンパクである（Ｓｕｔｅｌｌｆｆｅ、　（１９７８）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１ ．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５：３７３７：Ａｍｂｌｅｒ　ａｎｄ　５ｃ ｏｔｔ、　（１９７８）Ｐｒｏｃ、mａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｅｔ ＬＩＳＡ７５：３７３２：ａｎｄ　Ｐｏ１ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｚａｌｋｉｎ、　 （１９８３）Ｊ、　Ｂａｅｔａｒｉｏｌ、　１５３：２７）@ｏ　β−ラクタマ ーゼをコードしている電子は、塩基配列が決定された　（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、 　（１９７８）Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７５　＋３７３７：Ａｍｂｌａｒ　 ａｎｄ　５ｃｏｔｔ、　（１９７８）Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌA　Ａｅａｄ、　Ｓ ｅｉ、　ＵＳＡ７５ ：３７３２：ａｎｄ　Ｐｏ１ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｚａｌｋｉｎ、　（１９８３） Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３＋２７）　、同一クラスのＡβ−ラクタマーゼ の三次元構造が解像されている（Ｈｅｒｚｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍｏｕｌｔ、　（ １９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６・６９４）そして酵素活性を測るために簡単な 分光光度計を用いた方法がある（１ニトロセフイン加水分解単位（１μｍｏｌｅ ニトロセフイン加水分解反応／ｗｉｎ／ｍＬ、　Ｏ，１ｍＬ−トロセフイン、５ ０ｍＭフォスフェートバ１ファ、ｐＨ７）は０．６１　ｕ　ｇの酵素に相当し、 フラッドフォード測定により以下のように決定された；ｏ′Ｃａｌｌａｇｈａｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７２）Ａｎｔｉｍｉｅｒｏｂ、Ａｇ、Ｃｈａｍｏｔｈ ｅｒ、　ｌ：２８３）　ｏ　この酵素はAβラ クタム型の抗生物質（ペニシリンとセファロスポリン）を、βラクタムアミド結 合を加水分解することにより不活化する。反応は二段階よりなり、セリン７゜（ Ｓｅｒ７０）にきゅうか（的（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ）に結合し、アシル基 −酵素の中間体を形成する。その後、それに相当する酸と再び自由となった酵素 に加水分解する（Ｆｉｓｈｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　（１９８０）Ｂｉｏｃｈ＋＋ １ｓｔｒｙ１９：２８９５；Ｋｎｏｗｌｅｓ、　（１９８５）Ａｃｅ、　Ｃｈ■ 煤@Ｒｅｓ、　１８： ９７：Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８２ ）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡV９：６４０９　： ａｎｄ Ｓｉｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ２５９：５３２ ７）。

Ｐｈｅ６６は、それは４型Ａ　β−ラクタマーゼではよく保存されて（するので あるカイ（Ａｍｂｌｅｒ、　（１９７９ビＢｅｔａ−Ｌａｃｔａｍａｓｅｓ”Ｈ ａｍｉｌｔｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ　Ｅｄｓ、、Ａｃ≠р■高 奄メ@Ｐ ｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ　ｐｐ、９９−１２５）　、最初の突然変異誘発の 標的として選ｆｆれた、何故ならば多くのし一フ二二一ルアラニンアナローグが 簡単に合成することカイでき、フエニールアラニ／は、化学アミノア／ル化反応 の段階において側鎖の保護を必要としない。スタフィロコッカスアラレス（Σ４ ■旦担）の酵素（大腸菌のこの酵素と３３％のホモロジーをもつ）の２５オ圧ス ト０−ム結晶構造にお（１て、フェニールアラニンは、埋め込まれたβ−ンート と活性部位をもつα−ヘリカルドメインとの間に広カダるループに存在する（Ｈ ｅｒｚｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍｏｕｌｔ、　（１９Ｂ？）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６： ｌ１９４）　ｅ　この残基の構造上の重要性は、Ｐｈｅ６６をＡｌａ　（ｐＦ６ ６＾）に変換そしてＰｈｅ６６をＴｒｙ　（ｐＦ６６Ｙ）　＋こ変換するミュー タントを作ることにより確認され、両方のミュータント（よ粗細胞抽出液中で極 わずかな活性を示すのみであった。（全ての試験管内反応ζよ、大腸菌株ＪＭＩ ＯＩ　（△１ａｃｐｒｏ　ｔｈｉ、５ｕｐＥ、Ｆ’　ｔｒａＤ３６．ｐｒｏＡＢ 、１ａｃｌＱｚΔＭ１５）を用０て行われた。

［Ｃ，Ｊａｎｉｓｃｂ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８３）Ｇｅｎｅ２ ２：１０３］　ｏ全での試験管内反応（ま、５−３０抽出液を用いて行われた［ Ｐｒａｔｔ、　（１９８４）“Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎ ｓｌａｔｉｏｎ”、　Ｒａｎ５　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ、　（Ｅｄｓ、　）Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　、０ｘｆｏｒｄコ、この抽出液（ま大腸菌のＤ−１０株（ｒ ｎａ−１０，ｒｅｌＡｌ、５ｐｏＴ１．ｍｅｔＢｌ）　［Ｇｅ５ｔｅｌａｎｄ（ １９６６）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６：６７］　）力）ら準備■■ た。Ｆ６６Ａ　ミュータントから酵素を精製しようとしたが結果として全ての活 性力（失われた。Ｆ６６Ｙ　ミュータントは、非常に低い効率で精製され解析さ れた。Ｆ６６Ｙ　ミュータントのニトロセフインを用いたＫｒ＋は、野生株酵素 のそれと同一であった。一方Ｋｃａｔは野生株のそれの１６％であった（結果は 示して（１な（Ｘ）。

β−ラクタマーゼの試験管内及び生体内合成は、ブラズミドｐＳＧ７を用０て行 われた（第３図）そしてこれは以下の点を考慮して考案された：　ＲＴＥＭβ− ラクタマーゼは生体内では２３−アミノ酸ジーダーシークエンスと共に合成され 、そしてこの１ノーダー７−フェンスは、酵素が内側の膜中でトランスロケ−７ ｇンをおこす過程で酵素から外され、酵素は完全にな活性型酵素となる。試験管 内で、活性型酵素を発現するため我々は、β−ラクタマーゼの末端を削った遺伝 子を用℃）た（Ｋａｄｏｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｔ　２５９：２１４９）　。この遺伝子（よＩ）−ダーンークエンス中の ２１アミノ酸に相当する６３塩基配列を欠如しており、活性型酵素を発現するの に十分である。末端を切除した遺伝子は、強いハイブリッドタックプロモータの 転写制御の下に置かれた（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｇｅｎｅ２ ５：１６７）　、試験管内タンパク合成系において、合成されるタンパクの量は 、その系に添加されたｍＲＮＡの量に比例することが示されている（Ｒｅｉｎｅ ｓｓ　ａｎｄ　Ｚｕｂａｙ、　（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、Ｂｉｏｐｈｙｓ 。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、５３：９６７）。末端を切除された遺伝子は、Ｔ７　ＲＮＡ ポリメラーゼによって反応を補うために、バクテリオファージＴ７のφプロモー タ（Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｌｃｈａｒｄｓｏｎ、　（１９８５）Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ８２：１９７４）の制御下に置かれ た。このＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、大腸菌のポリメラーゼの１０倍のＲＮＡ合 成活性をもっている（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ｒｙａｎ、　（１９８２ ）Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙ＋＊ｅｓ１５：８７）、Ｔｎ９０３（Ｏｋａ　ａｔ　ａｌ、 @、　（１９８１）　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４７：２１７）からのカナマイノン抵抗性遺伝子が夕 、りとＴ７ブロモータの反対側に挿入されて、このプラズミドの選択マーカとし て用いられた。

タンパク合成は、翻訳装置にアミノアンルサプレッサｔＲＮＡに添加することを 容易にするために、試験管内反応で行われた。ザビー（Ｚｕｂａｙ、　（１９７ ３）Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎ、７：２６７）によって開発され、コリンズ（Ｃ ｏｆｆｉｎｓ、　（１９７９）Ｇｅｎｅ６：２９）とブラツト（Ｐｒａｔｔ、（ １９ｇ４）“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ″ Ｈａｎｅｓ　ａｎｄ　１１１ｇｇ１ｎｓ（Ｅｄｓ、　）A　ＩＲｓ　Ｐｒｅｓｓ 、０ｘｆｏｒｄ、　ｐｐ、　１７９−２０９＞によっていくらかの改良のされた 大腸菌の複合系は、塩基に弱いアフル結合を安定化させるためにｐＨを８．２か ら７．４に下げるような少しの改良を加えて使われた（第４図）。

ｐＳＧ７によって開始される活性型β−ラクタマーゼの合成効率は、ニトロセフ イン加水分解活性に基づいて測定すると典型的には反応液Ｉｃｅあたり３０−４ ５μｇの範囲内である（第６図を見よ）。これは、遺伝子１コピーあたり２３− ３３コピーの活性型酵素に相当する。そして、ｐＢＲ３２２由来のｐｓＧｌの野 生型のＡｐｒプロモータ制御制御台成された酵素に比べ１１倍の増加を示す。（ 生体内における合成量もＪＭＩＯＩ／ｐＳＧ７ｖｓ、　ＪＭＩＯＩ／ｐｓＧＩの 比率は、粗細胞抽出液の特異的活性に基づいて算定すると同じように１１倍であ る）驚くことに、ＴＲ７ＲＮＡポリメラーゼ（最終濃度８５００ユニ・、ト／畦 ）をＴ７ブロモータを持ったブラズミドｐｓＧ１の反応液に添加すると、ｐＳＧ ７で開始された反応液の産生量の６５−７０％の活性化酵素の産生量でしかなか った。（強力なタックプロモーターの後に発現している４３４リプレツサーの試 験管内タンパク合成は、遺伝子コピーあたり１５０コピ一以上のタンパクを作る ）。試験管内反応で合成されたβ−ラクタマーゼは、硫酸アンモニウム沈澱とク ロマトフオーカ７ングそして陰イオン交換クロマトグラフィーによって均一にな るまで精製された（第４図）、タンパクが均一であるかどうかをＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動によって決定された。そして、ニトロセフインに対する ＫｅａｔとＫＭが、生体内で合成された酵素のそれと同一かどうかを検定された 。全ての抑制反応は、ｐＳＧ７誘導体のｐＦ６６ａｍ（第３図）を用いて行われ た。このｐＦ６６ａ園は、Ｐｈｅ６６をＴＡＧに変異したものである。

サプレッサーｔＲＮＡ　生の リボゾーム上で成長中のペプチド鎖にユニークなアミノ酸を運ぶために使われる サブレ、サーｔＲＮＡは、以下の２つの条件を満たさなければならない：それは 、ＵＡＧメツセージに反応して十分にアミノ酸を挿入しなければならない。さら にそれは試験管内転写翻訳系中に存在するどのような大腸菌のアミノアフルｔＲ ＮＡシンセターゼによっても、アシル化されたり脱アシル化されてはならない。

上記の第１の条件は、精製しさらに解析するために十分な量のタンパクを産生ず るために必要である。第２の条件は、試験管内反応においてタンパク中に挿入さ れるアミノ酸が、唯−望む自然界に存在しないアミノ酸だけであり、自然の２０ のアミノ酸のどれでもないことを保証するために必要な条件である（Ｓｅｈｉｍ ｍｅｌ　ａｎｄ　５ｏｌｌ（１９７９）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｊｏｃｈｅ＋＊ 、　４８：６０１：Ｆｅｒｓｈｔ　ａｎｄ　Ｋａｅｔｈｎｅｒ、　（１９７６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉ唐狽窒凾P５：３３４２： Ｉｇｏｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：３ ４５９：５ｃｈｒｅｉｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｉｍ＋＊ｅｌ（P９７２）Ｂｉｏ− ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙｌ　１　：　１５８２；ａｎｄ　Ｙａｒｕｓ、　（１９７２）Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ６９@：１９１５）　ｏ 　イースト のｔＲＮＡＰｈ・から誘導されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡ　（Ｂｒｕｅｅ 　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｅｋ（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２１：３ ９２１ａｎｄ２１：８５５）は、以下の結果からこれら２つの要求を満たしたと 思われた：イーストｔＲＮＡＰｈ・の３４−３７残基を５’−ＣＵＡＡ−３’に 置き換えられたイーストのｔＲＮＡｐｃ’ｕ’＋１は、ヤルーの延長アンチコド ンループ仮説（Ｙａｒｕｓ。

（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１ｇ＋６４６）によれば十分効率的なサプレッサ ーであると期待される。

これに加えて、ブルースとその共同研究者（Ｍｉ　１ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、 　（１９７７）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ。

＋０９：２７５：Ｂｒｕｃｅ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８２）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、５ｅｌＵＳＡ７９ニア１２７；Ｂｏｓｓｉ　ａ獅п@Ｒｏｔｈ。

（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ２８６：１２３：ａｎｄ　Ｓｔｅｅｇｅ、　（１９７ Ｂ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔ”、Ｖｏｌ、　１．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　Ｅｄ、　、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ ｓ）は、イーストのｔＲＮＡＰｃ’ｕ−■ 哺乳動物のタンパク合成系において十分にＩＩＡＧコドンを翻訳する（ウィード ジャーム系のおいては、いくぶん効率が悪いが）ことが示された。フォークとそ の共同研究者（にｗｏｋ　ａｎｄ　Ｗｏｎｇ、　（１９８０）Ｃａｎ、　Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、５８：２１３）らは、大腸菌の７エニールアラニルｔＲＮＡシン セターゼ（ＰＲＳ）は、アシル化されＥ　、ｃ　ｏ　ｉ　１　ｔＲＮＡＰｈ＠に 比べてイーストのｔＲＮＡ””を１％以下の効率でアミノアシル化することを示 した。

イーストのｔＲＮＡＰｃｈｕ−は、ブルースとユーレンベソク（Ｂｒｕｃｅ　ａ ｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ。

（１９８２）Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ２１：８５５ａｎｄ２１：３９２１）の アンチコドンループを置換する方法によってミリグラム量まで作られる。この方 法は、イーストｔＲＮＡ”・のアンチコドンループから修飾されたヌクレオチド Ｙ３７はもちろんのこと、３つのアンチコドンヌクレオチドＧ−３４，Ａ−３５ およびＡ−３６を除去することを含んでいる。この４つの除去されたヌクレオチ ドは、化学合成されたＣｐＵｐＡｐＡに置き換えられ、これはアンバーサプレッ サーに要求されるアンチコドン配列を持っている。

ブルースとユーレンベノク（Ｂｒｕｃｅ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　（１ ９８２）Ｂｊｏｅｈｅｍｌｓｔｒｙ２１：８５５ａｎｄ　２１：３９２１）の改 良された方法の詳細は、以下の通りである。最初にブリムを除去する手順を行っ た後、ｔＲＮＡ−ｙはエタノール沈澱で回収され、そしてアニリンハイドロクロ ライドにより処理された。分割された産物は、エタノール沈澱により回収され、 プレハラティブ＊−ｆ＋Ｕ７グＰＡＧＥゲル（８％、０．０１５ｃ＋ｗＸ　１６ ｅ＋ｗＸ　４２ｃｍ；各々のゲルに粗ｔＲＮＡ５ｃｇが添加された）によって分 離された。バンドは０７ｏ２％のトルイジンブルーで染色され、切り出された後 、２×１ｏ諷り、　１０軸ＭのＮａ０Ａｅ　（ｐＨ４，５）と１＋＊Ｍ　ＥＤＴ Ａそしテロ。１％５ＤＳｒ溶出された。染色は７エ／　ｋとＣＨＣｌ３１Ｃよる 抽出で除去された。ｔＲＮＡの半分の分子はエタノール沈澱により回収された。

部分ヌクレアーゼ分解のためＲＮａｓｅ　Ａが２μｇ／ｍＬまで濃縮された。そ の後、エタノール沈澱を行い、沈澱物を蒸留水に溶がし、フェノール、フェノー ル：　ＣＨＣｌｚ（１：１）、ＣＨＣｌ３で抽出し、再びエタノールで沈澱させ た。リボヌクレオチドテトラマーＣｐＵｐＡｐＡは保護されたヌクレオシドのシ ークエンシャルホスホトリエステルカップリングにより合成された（Ｊｏｎｅｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３６：３０１５： 　Ｂｏｏｍａｎｄ　Ｗｒｅｅｓｔｓａｎ、（１９８４）　−０１軸ｇｏｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″、ＧａＩｔ　Ｅｄ、、ＩＲＬ　Ｐ窒■唐刀 B Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）。完全に脱保護化されたＣＵＡＡは、宝酒造のＴ４　Ｒ ＮＡ　’Ｊガーゼを使って１、ＲＮＡの半分の分子を３゛−末端に結合させた。

結合のための条件は、５０μＭＡＴＰ、＋９μＭ　ｔＲＮＡ　（両者の半分の分 子は反応液中に存在する）　、８２０ｇＭ　ＣＵＡＡと５０　Ｕ／ｍＬのＴ４　 リガーゼである。結合反応は典型的には５ｍｇのＲＮａｓｅ　Ａ分解ｔＲＮＡを 用いて１０ｍＬの反応液用量で行われた。キナーゼ処理は４μＭｔＲＮＡ、　１ ２０ｇＭ　ＡＴＰそして５００／ｍＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒ４ｃ ｈａｒｄｓｏｎ　（１９６５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ ＵＳＡ　５４：１５８；　ａｎｄ　Ｍｉｄｇｌｅｙ　ａｎｄ　Ｍｕｒｒａｙ　（ １９８５）　ＥＭＢＯＪ、　４：２６９５）を用いて行われた。最終的な結合反 応は２５［１／ｍＬのＴ４　ＲＮＡリガーゼで行われた。

この方法を用いて作られたサプレッサーは３°一端ｐＣｐＡアミノアンルアクセ ブタ−ステムを失っている。これらのヌクレオチドはｔＲＮＡＲＮＡ補修酵素ヌ クレオチラルトランスフェラーゼて置換でき（Ｃｕｄｎｙ　ａｎｄ　Ｄｅｕｔｃ ｓｈｅｒ、　（１９６ｇ）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｌｌ、　２６１：６４５０）　、完全長のイーストｔＲＮＡＰｃｈｕ”＋ が得られる。過剰量のイーストＰＲ３を用いてサブレ・ノサーｔＲＮＡは、試験 管内反応で［”Ｈ］−Ｐｈｅ存在下で３０−３５％（［３Ｈ］−Ｐｈｅ−ｔＲＮ Ａ’ｃ’ｕ・ｎ精製物に取り込まれた放射溝活性に基づいて算定）までアミノア シル化される。酵素を用いたミスアシル化反応（全量３００μｇ）は以下のもの を含む。４μＭ　ｔＲＮＡＰｃ’ｕ’ａ　（３０μｇ、これはゲルで精製した後 、脱塩、凍結乾燥されたものである）、８０μＭのフェニルアラニン、４０＋＊ Ｍのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．４５μｇ／ｍＬ　 ＢＳＡ、　３．３　ｍＭ　ＤＴＴ、２＋＋Ｍ　ＡＴＰと２２単位のイーストＰＲ Ｓ　（この単位はｌｏＯｐＭ　Ｐｈｅを２分間、３７℃で以下の条件で取り込む 活性である：２μＭｔＲＮＡＰｈ＠（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）、２　＋＋Ｍ　ＡＴＰ、　３．３　ｍＭ　ＤＴＴ、　８．１μＭ　Ｐｈｅ、　 S０ｍＭ　Ｎａ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、　Ｉｓ　＋ａＭ　ＭｇＣｌ２．２５　ｍＭ　ＫＣｌ 、そして５０μｇ／■Ｌ　ＢＳＡ）。この反応溶液は３７°Ｃで３分間加温され た後、２．５　Ｍ　Ｎａ０Ｎａ（ｐＨ４，５）　ｔｏ％Ｖ／Ｖの添加により反応 を停止させた。反応停止後、直ちにフェノール（前もって０．２５　Ｍ　Ｎａ０ Ａｃ、　ｐＨ４，５で平衡化したもの）、フェノール：　ＣＨＣｌ３（１：ｌ） 、ＣＨＣｌ３で抽出、その後、ＥｔＯＩ＋で沈澱させた。抽出と沈澱は更に２回 繰り返された。ｔＲＮＡは、次にファルマシアファースト　デサルティングカラ ムで脱塩化の後、凍結乾燥された。凍結乾燥したアシル化ｔＲＮＡ及び非アシル 化ｔＲＮＡの混合物は、試験管内タンパク質合成反応に使われる直前まで、−８ ０°Ｃで貯蔵された。

同様の反応条件で野生型イーストｔＲＮＡ””は、イーストＰＲＳで４０−４５ ％までア／ル化される。ＢＤ−セルロースフ０？トゲラフイー（にｒｅｉｇ　ｅ ｔ　ａｌ、、（１９８６）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：８６０４；　Ｉｆｉｅｄ＋ ＋ａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９ｇ？）　Ｎａｔｕｒｅ　（kｏｎｄｏｎ） ３２８：８３０：　Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７６）　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　１５：５６９；　Ｂａ１ｄｉｎｉ、　ｅｔ@ａｌ、。

（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７９５１；　Ｈｅｃｋｌｅｒ 　ａｔ　ａｌ、、　（１９８４）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ@４０：８７： ａｎｄ　ｌ１ｅｃｋｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　２３：１４６Ｂ）でアシル化されたｔＲＮＡを非アシル化ｔＲＮＡから 分離しようとする試みは、分離度が悪く、又、受は入れがたいほど低い効率でし かアシル化ｔＲＮＡを分離できなかった。そこでアシル化及び非アシル化ｔＲＮ Ａの混合物はそのまま試験管内タンパク質合成反応液に用いられた。イーストＰ ＲＳを用い、フェニルアラニンのい（っかのアナログを用いてｔＲＮＡ’ｃｈｕ ・。

をミスアシル化しようと我々は試みたが、これらの実験はｐＦＩ、緩衝液あるい は塩の濃度、そして有機溶媒の濃度をさまざまに変えても成功しなかった。

重要な点としてイース）　ｔＲＮＡＰｃ’ｕ”＋は我々の試験管内系に存在する 大腸菌アミノアシルｔＲＮＡンンセターゼによっては認識されない（ｒＸＪ６） 。ｐＦ６６ａｍと非アシル化サプレッサーを用い、［”ＩＩ］　フェニルアラニ ン存在下で開始された試験管内反応の結果、β−ラクタマーゼ活性は得られず、 又、変性ポリアクリルアミドゲルで解析した時、正しい分子量の放射活性バンド も得られながった。ｐＦ６６ａｍと［”＋１］−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ’ｃｈｕ−で 開始された反応で、試験管内β−ラクタマーゼ合成反応のｐＦ６６ａｍからのレ ベルは、ｐＳＧ７からのそれに比べて２５−２０％であった。これらの結果はイ ーストのＬＲＮＡＰｃｈｕ−は上記に概説した、意図した条件に合うということ が明かである。：　ｔＲＮＡは酵素的にアミノアシル化されておらず、また、脱 アシル化されてもいない。そしてそれはアシル化アミノ酸をＬＩＡＧに対応して 挿入されている。

イーストのＬＲＮＡＰｃｈｕ”ａ　（−ＣＡ）を精製した後に、フェニルアラニ ン−ｐＣｐＡ（ｓｕｉｅｈとＮｏｒｅｎの未公表の結果）に結合した配列に相当 するｔＲＮＡのラン−オフ転写物が作られた（Ｓａｉ＋ｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｕｈ ｌｅｎｂｅｃｋ、　（１９８８）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵrＡ ｌｌ５：１０３３）。このアミノアシルｔＲＮＡを試験管内合成反応に添加した 時に、β−ラクタマーゼ活性は、同量のアンチコドンループを置換することによ って作られたＰｈｅ−ｔＲＮＡＰｃｈｕ−を反応液に添加した場合にみられるβ −ラクタマーゼ活性の５０−６５％の効率であった。ラン−オフサプレッサーを 用いたこの翻訳系の効率は同様の方法で合成されたｔＲＮＡ”　ｖのデータと非 常に都合よく比較される。（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ　ｅｔａｌ、、（１９８ｇ） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２６３：１３９２）。

−なアミノアシル 上記のように、アミノアフルｔＲＮＡ／ンセターゼによる酵素的なミスアシル化 は、これらの酵素の高い特異性のために一般的な方法ではない。化学的なミスア シル化はしかしながら、どのようなアミノ酸様構造にも通用するであろう。無傷 のｔＲＮＡを直接化学的にアシル化することは非常にたくさんの反応的な部位が この巨大分子の上に存在するために、現実的ではない。Ｈｅｅｈｔと共同研究者 （）Ｉｅｃｋｌｅｒ　ｅｔａｌ、、　（１９８４）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　 ４０：８７；　ａｎｄ　Ｈｅｃｋｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９ｇ４）　Ｂｉ ｏｃｈ■高奄唐狽窒■ ２３＋１４６８）は、アミノアシルｔＲＮＡを作るために化学的にジヌクレオチ ドｐＣｐ＾をアシル化した後、これを酵素的にＴ４　ＲＮＡ　リガーゼを用いて 末端を切除したｔＲＮＡ［ｔＲＮＡ　（−ＣＡ）　］の３゛末端に結合させるこ とによってこの問題を簡便にした。この方法は、成功したが２つの大きな問題点 に苦しんだ。：αアミ／保護基は除去されなかったので、アミノアシルｊＲＮＡ はただＰサイト供与体にのみ限定され、かつ、化学的なアミノアシル化は非常に 抵抗率であった。

ｐＣｐＡの化学的なアシル化の一般的な方法論は、Ｎ−ブロック化アミノ酸のカ ルボニル基の活性化と、それに続く末端アデノシン（２°と３°のアンル基は迅 速に水性溶液中で相互置換する。）のジオールとのエステル結合とからなる。ア ミノアシル化反応は／アミンの環外のアミ７基のアシル化と、アデノシンの２° と３°のノア／ル化を好むために複雑である。α−７ミノ基を保護するとアミノ アンルエステルリンケーノの加水分解に対する安定性を著しく増大させると共に 、カルボキシル基活性化の間の重合反応を抑制する（Ｓｅｈｕｂｅｒｔ　ａｎｄ 　Ｐｉｎｅｋ、　（１９７４）　ＢＩｏｃｈｉ＋ａｉｅ５６：３８３）。しかし ながら、保護した基は、もしもアシルｔＲ１１ＡがＡサイト供与体として機能す るためには、除去されなければならない。最近、ブルーナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ） 　（Ｋｒｅｉｇ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：８U０４： Ｗｉｅｄｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８７ン　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ ｏｎ）　３２８：８３０：　ノｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、A　（１９７６） ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ　１５：５６９；　Ｂａ１ｄｉｎｉ、　ｅｔ　ａｌ 、、　（１９８ｇ）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７X５１）によっ て次のようなことが示された。α−アミ７基を保護されたアミノアシルｐＣｐＡ は、アミノ　ア／ルエステル結合を加水分解することなく　ＬＲＮＡ　（−ＣＡ ）の結合の前に、脱保護化できた。

ｔＲＮＡＰｃ’ｕ−の７ミモ 外アミンが０−ニトロフェニルスルフェニルクロライド（ＮＦＳ−ＣＩ）によっ て保護しただけの最小限の保護がなされたものが示されている。アミノ酸のα− アミノ基は又、ＮＦＳ基によって保護される。ＮＦＳ−ｐＣｐＡは活性化剤とし てＮ、Ｎ−カルボニルジイミダゾールを用い、Ｎ−ブロック化Ｐｈｅによってア ／ル化された。ＮＦＳ保護基は／アミンから除去され、アミノ酸は水性チオサル フェートを用いて非常に高い効率で生産された（Ｌａｐｉｄｏｔ　ｅｔ　ａｌ、 、　（１９７０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａｔ 　３８：５５９ａｎｄ　Ｈｅ１ｋｋｉｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ａ ｃｔａ、　Ｃｈｅｔ　５ｃａｎｄ、　Ｂ３７：８５７）　ｏ　アシル化反応^ 脱保護化反応は全体として１４％の効率で行われ（未発表結果によればモデルと した物質のアシル化反応の主な制御因子は２°、３°−ジアシル化反応であった と思われる）、たとえとして、１４％であった効率はＨｅｃｈｔとＢｒｕｎｎｅ ｒによって示された効率、３−４％と比べると好ましい（Ｋｒｅｉｇ　ｅｔ　ａ ｌ、、（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８３：８６０４；　ＷｉｅｄｌＩＩａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９Ｂ？）　Ｎ ａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２８：８３０；　Ｊｏｈｎｓｏｎ@ｅｔ　ａ ｌ、、（ １９７６）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５：５６９；　Ｂａ１ｄｉｎｉ、　 ｅｔ　ａｌ、、（１９８８）　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ@２７：７９５１： Ｈｅｃｋｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８４）　Ｔｅｄｒａｈａｄｒｏｎ　４０ ：８７；　ａｎｄ　Ｈｅｃｋｌｅｒ　ａｔ　ａｌ、、（１９W４） ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ　２３：１４６８）。しかしながら、Ｃｈｌａｄｅ ｋ　（Ｈａｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、（１９Ｂ？）　Ｊ。

Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ＋＋、　５２：５３８７）は最近、異なる方法論で５−ｃｐｃ ｐ＾のアミノアシル化反応を行い、最終的に２６％の効率であったことを報告し た。

化学的なアシル化反応（全量８０μＬ）は、以下のものを含む。：　６００ＢＭ 　ｐＣｐＡ−Ｐｈｅ（４０μｇ）、　１０μＭ　ｔＲＮＡ’ｃ’ｕ”ａ　（２０ μｇ、　これはゲルで精製化された後に脱塩、凍結乾燥されたも））　、　５５ ＊Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）、　２５０８Ｍ　ＡＴＰ、　１５ｍＭ　Ｍｌ ＩＣ１２，２０ｍｇ／ｍＬ、　ＤＭＳＯ（１０％ｖ／ｖ）と２００−ｆｆ−ニッ トのＴ４　ＲＮＡ　リガーゼ。反応混合液は、３７℃で１２分間加温され、２． ５Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　（ｐＨ４，５）を１０％Ｖ／Ｖニなるように添加して反応を 停止された。ただし１回の抽出と沈澱を行っただけであった。ジーＮＦＳで保護 されたアミ／アシルｐＣｐＡもＴ４　ＲＮＡ　リガーゼの基質となった。しかし ながら、結合した後説保護基化するよりもむしろ、脱保護基化した後結合する方 がより高い効率のアミノアシルｔＲＮＡが得られた。完全に脱保護化されたｐＣ ｐＡ−ＰｈｅはＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いて直接ｔＲＮＡＰｃ”ｕ”ａ　（− ＣＡ）に結合されたくアンチコドンループ置換方法を用いて、直接末端を切除さ れたサブレ・ノサーｔＲＮＡが合成されたことに注意せよ）。

３Ｈ−Ｐｈｅの精製サプレッサーへの取り込みを解析した結果から、Ｐｈｅ−ｔ ＲＮＡＰｃｈｕ−の効率は３５％であった（ゲル電気泳動法による解析によって ｔＲＮＡＰｃｈｕ”＋　（−ＣＡ）の８０＝９０％が同じ移動度のＬＲＮＡＰｃ ｈｕＩＩＱに転換された）。この方法を用いてｔＲＮＡＰｃ’ｕ・１１（−ＣＡ ）はまた、Ｄ−フェニルアラニン＜Ｄ−Ｐｈｅ）、（Ｓ）−１）−二トロフェ二 ルアラニン（ｐ−ＮＯ２−Ｐｈｅ）＋　（Ｓ）−ｐ−ホモフェニルアラニン（２ −アミノ−４−フェニルブタノイノクアンノド、　ＨＰｈｅ）、（Ｓ）−１）− フロロフェニルアラニン（ｐ−ＦＰｈｅ）、（Ｓ）−３−アミノ−２−ベノジル プロピオニノク　アシッド（ＡＢＰＡ）及び＜５）−２−ヒドロキシ−３−フェ ニルプロピオニック　ア／、ド（ＰＬＡ）を用いてアシル化された（この場合α −ヒドロ牛）保護基は用いられなかった）。これらのアミノアシルｔＲＮＡは試 験管内タンパク質合成反応系を用いて、変異型β−ラクタマーゼを合成するのに 使われた（下記参照）。アミノア／ル化反応を効率的に行うために、酸不安定な 保護基、水素添加により除去できる保護基、あるいは保護されていないＲＮＡの アミノアシル化に利用できる非選択的リパーゼの検索などの努力が現在、行われ ている。水素添加や酸によって除去可能な保護基は、自然に存在しないアミノ酸 の側鎖の保護も又、単純化するであろう。

における　、 ｐＦ６６ａ＋ｎと酵素的に［３Ｈ］フエニルアラニン存在下でアシル化されたサ ブレ０．サー　（３０％ア／ル化された）で最終濃度１６７μｇ／ｍＬに調製さ れたものを用いて開始された試験管内反応で、活性型β−ラクタマーゼが５．５ −Ｌ５μｇ／ｌの効率で作られた。

これは抑制効率の１５−２０％に相当する（図８）。Ｉ）ＣＩＩＡ−Ｐｈｅを用 いて化学的にアシル化されたサブレ・ノサー（３鴎ア／ル化）は、２．８−７． ５Ｈｇ／ｍＬの効率であった。これは１　＋ａＬの反応液から７−１５％の全体 としての効率で酵素をほとんど均一に精製するのに充分な効率である（図８）。

精製法として、アンモニウムサルフェートによる沈澱と、それに続くタロマドフ ォーカシングと陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた。重要な点として、精 製したβ−ラクタマーゼのｋｃｓｔとＫＭは試験管内で作られた野生型酵素の値 と同一であった（図１０）。［３Ｈ］　−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｃｈｕ・９によっ て部位特異的にβ−ラクタマーゼに挿入された３Ｈフエニルアラニンはペプチド マツピング実験によって確認された。ＴＲＥＭβ−ラクタマーゼにはトリプシン によって分解可能な２７＠所の部分があり、５個のフェニルアラニン残機が存在 する（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、　（１９７Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７５：３７３７；　Ａ＋ｍｂｌｅｒ　ａ獅п@５ｃｏｔ ｔ （１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５ ：３７３２：　Ｐｏ１ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｚａｌｋｉｎ、　i１９８３）　Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１５３：２７）。これらの５個のフェニルアラニンは２ ８のトリブソン分解断片のうちの４個に分布している。この内の一つは８残基よ りなるペプチドでＰｈｅ　６６とＰｈｅ　７２の両方を含んでいる。β−ラクタ マーゼは［”ｌｆ］フェニルアラニン存在下では、ｐＳＧ７より試験管内反応に より合成された。精製された放射標識酵素はトリプシンで分解され、断片は逆相 ＦＰＬＣによって分離された（図９）。ＲＴＥＭβ−ラクタマーゼ中の［３Ｈ］ 　−Ｐｈｅの部位に一致して４つの明解な放射標識のピークが観察された（Ｓｕ ｔｃｌｉｆｆｅ、　（１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｉ　ＵＳＡ　７Ｓ：３７３７；　Ａｍｂｌｅｒ　ａ獅■ Ｓｃｏｔｔ　（１９７Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＬＩＳＡ　７５：３７３２；　Ｐｏ１ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｚ≠撃汲奄氏B （１９ｇ３）　Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１５３＋２７：　Ｆｉｓｈｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　（１９８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　P９：２１１９５ ａｎｄ　Ｋｎｏｗｌｅｓ　（１９８５）　Ａｃｅ、　Ｃｅｔ　Ｒｅｓ、　１８： ９７）。フラクション４４と４５に溶出されたピークは他の３つのピークに比較 して２倍のカウントを持っており、ペプチドのＦｆｉ６とＦ７２を含んでいると 考えられた。［’ｌｌコーＰｈｅ−ｔＲＮＡ’ｅｌｌｕ＠＋１存在下でｐＦ６６ ａｍがら試験管内反応で合成されたβ−ラクタマーゼからのトリプソン分解ペプ チドの同様の解析は一つの放射活性ピークを示す。野生型（ｐＳＧ７）と抑制型 （ｐＦ６６ａｍ）の両者においてフラクション４４に放射活性が溶出されたとい う事実は野生型の実験においてこのピークが他のそれに比べて２倍の放射活性を 持つという観察結果と共に、抑制実験において［３Ｈ］−Ｐｈｅが標的とする部 位（Ｆ１ａ）に挿入されたということを強く示唆する。

フェニルアラニンアナログのＤ−ＰＨｅ、Ｈｐｈｅ、　ＡＢＰＡそしてＰＬＡは 各々サプレッサーｔＲＮＡに上記のように結合された。［３５Ｓ］−メチオニン 存在下で行われた試験管内タンパク質合成反応は、ｐ−ＦＰｈｅ、　＋＋−ＮＯ ２ＰｈｅそしてＨｐｈｅの反応においての同様のレベルの放射活性が、トリクロ ロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱物の中に取り込まれた結果となった。これらの反応におい て合成されたβ−ラクタマーゼの酵素反応速度の解析は同様のＫＭを持つが異な るｋｃｓｔを持つことを示した（図１０）。精製されたｐ−Ｎ０２Ｐｈｅそして Ｈｐｈｅ変異型の直接的な定量は不可能であった。なぜならば、両者の変異型は 精製の試みの中で失活したからである。結果として、　［３５幻−メチオニンの ＴＣ＾沈澱物への取り込みがこれらの変異型の直接的な比較定量化のために用い られた。Ｄ−ＰＨｅ、　ＰＬＡそしてＡＢＰＡを用いた実験ではβ−ラクタマー ゼ活性またはタンパク質合成は検出できなかった。

これらの結果はフェニルアラニンの場合、原子構造、及び電子特性の異なるアナ ログをタンパク質の中に置換できることを示す。Ｐｈｅ　６Ｂをチロシンに置換 すること、それは原子構造的に（４−ＯＨ基）及び電子構造的に（−ＮＯ２は良 性のπ−電子供与体）　Ｐｈｅとは異なっており、その置換はｋｃｓｔを１とし て約２分の１の減少とＫＭに対しては何等の影響もなかった。同様に、Ｐｈｅ　 ６６をｐ−ニトロフェニルアラニンに置換することはこの場合も再び原子構造的 （４−ＮＯ２基）と電子構造的（−ＯＨ基はπ電子の良質の受容体）に異なって おり、ｋａａｔの２倍の減少とＫＭに対して明らかに影響のない結果となった。

一方、Ｐｈｅ　６６をｐ−フルオロフェニルアラニンに置換するとこの場合は原 子的にも電子的にもＰｈｅに同様であるが、ｋｃ、ｔはやや上昇するが、Ｋｎに 影響は見られなかった。Ｐｈｅ　６６をホモフェニルアラニンに置換すると、こ の場合は電子的にＰｈｅと同様であり、原子構造として非常に異なるがｋｃ、は 約６倍減少し、ｒｎが上昇した。ＨＰｈｅとｐ−ＮＯ２Ｐｈｅの変異型は両者共 に原子構造で顕著な変化が起こるが、両者共不安定であり、おそらくタンパク質 の巻き込み（ｕｎｆｏｌｄ）が起こらず精製過程でタンパク質分解を受けたと思 われた。

アミノリンケージをエステルリンケージ（ＰＬＡ）に置換すること、骨格に追加 のメチレン基を添加すること（ＡＢＰＡ）あるいは立体的にα−カーボン（ＤＰ ｈｅ）を変化させることによってタンパク質骨格を改変しようと試みたが、タン パク質合成も酵素活性も検出されなかった。現在のところ、これらの結果がタン パク質の巻き込みや安定性（ＰＨｅｅもがプロリン残基に近接している）が損な われること、あるいはこれらアミノ酸がリボゾームのＡサイトの受容体として機 能しないことによるかどうかは明かではない。ＰＬＡはポリフェニルアラニンの アミノ末端の位置に結合することが報告されており（Ｈｅｒｖｅ　ａｎｄ　Ｃｈ ａｐｅｖｊｌｌ、　（１９６５）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１３ニア５７ ）　、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンがポリ−（Ｕ）メツセージに反応し てＰ−サイト供与体として充分に機能しないことも報告されている（Ｒｏｓｅｓ ｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：６３６１　ａｎｄ　Ｈｅｃｋ ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　bｈｅｗ。

２５８：４４９２）、ヤマネ（ｙａｍａｎｅ）らはＤ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−ＥＦ −Ｔｕの三次複合体のＫｄｌｓｓはＬ−Ｔｙｒ−ｔＲＮＡ−ＥＦ−Ｔｕの三次複 合体のＫｄｌｓｓよりも２５倍高いことを報告した（ｙａｍａｎｅ　ｅｔａｔ、 、（１９８１）　ＢｉｏｃｈｅＩｌｉｓｔｒｙ　２０ニア０５９）　ａ　ＥＦ− ＴｕとＤ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｃｈｕ＠＋の間の三次■ 合体形成の同様なレベルの立体化学的な選択性により試験管内反応時のアミノア フルエステルの実質的な加水分解を起こすと共に、リボゾームへのアミノアフル ｔＲＮＡに対するＥＦ−Ｔｕ媒介の結合が非常に低い結果となる。

変異株の触媒定数や特異性を解析するため、又、ＥＳＲや蛍光スペクトロスコピ ー等のような技術を用いてタンパク質構造を明らかにするための機械的あるいは ７ノピングの限定的な解析を行うために、充分なタンパク質が精製されうる。試 験管内タンパク質合成系ｔＲＮＡ産生の方法、そしてｔＲＮＡアミノアンル化反 応化学の改良によってこの目的のために変異株タンパク質がミリグラムの単位で 産生ずることが可能となる。

前述したように、この発明は改変されたタンパク質産生の改良された方法を提供 することで評価されるであろう。この方法は迅速、藺略、そして万能の利用価値 がある。

この明細書に述べられた全ての出版物と特許出願はこの発明の適する技術を持っ た人たち（当業者）の技術レベルを示している。全ての出版物と特許出願はあた かも各々の出版物あるいは特許出願が特別に独立して引用されて、援用されてい る。発明の内容は、ここに完全に著述された。通常の技術を持った人にとって、 この特許請求の範囲の精神、あるいは目指す方向から離れることなく多くの変更 や改変を加えることが可能であることは明白である。

ＦｆＧ、Ｊ。

＝　−２１，５ ＦＩＧ、−５゜ ＦＩＧ、−６゜ 弔１港、知−に虜、ぶへ゛ ＦＩＧ、Ｊ。

Ｄ−Ｐｈｅ　ｐＦ６Ｅｉａｍ　Ｄ−ＰｌｒｔＲＮＡにＵＡＯｆＦｉＧ、ＪＯ。

国際調査報告

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．自然に存在しないアミノ酸アナローダをタンパク質中に部位特異的に取り込 ませるための方法であって、当該方法は次の（ａ），（ｂ）を備えたことを特徴 とする方法： （ａ）前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列中の少なくとも１つの部位に前 もって選択されたコドンを導入すること；および（ｂ）前記自然に存在しないア ミノ酸アナローダを、合成途中のポリペプチド鎖の前もって選択されたコドンの 位置に重合させることのできるアミノアシルｔＲＮＡアナローダを含むタンパク 質合成系中において前記ｍＲＮＡ配列を翻訳すること。
2. ２．タンパク質合成系が試験管内タンパク質合成系である第１項に記載の方法。
3. ３．試験管内タンパク質合成系が以下のものから調製されている第２項に記載の 方法： ａ）大腸菌； ｂ）ばくしゅ酵母菌； ｃ）ウイードジヤーム； ｄ）兎せきがきゅう。
4. ４．前もって選択されたコドンが翻訳停止コドンである第１項に記載の方法。
5. ５．前もって選択されたコドンがＵＧＡ（アンバー）コドンである第４項に記載 の方法。
6. ６．前もって選択されたコドンが前もって定められた部位に挿入される第４項に 記載の方法。
7. ７．自然に存在しないアミノ酸アナローダが以下の群から選択されたものである 第１項に記載の方法： ｉ）修飾された自然のアミノ酸； ｉｉ）修飾された非荷電アミノ酸； ｉｉｉ）修飾された酸性アミノ酸； ｉｖ）修飾された塩基性アミノ酸； ｖ）非アルファ型アミノ酸； ｖｉ）φ，φ角を変換したアミノ酸； ｖｉｉ）ニトロ、アミジン、ヒドロキシルアミン、キノン、脂肪族化合物、環状 および不飽和化学基の群から選ばれた官能基を含むアミノ酸。
8. ８．アミノアシル化ｔＲＨＡアナローダは、前もって選択されたコドンを認識す ることのできるタンパク質合成系における唯一のアミノアシルｔＲＮＡ分子であ る第１項に記載の方法。
9. ９．前もって選択されたコドンがタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の１つの 部位に導入される第１項に記載の方法。
10. １０．タンパク質が約１００００ダルトン以上の分子量を持つ第１項に記載の方 法。
11. １１．自然に存在しないアミノ酸アナローダが以下の部位から約１００オングス トローム以内に位置する第１項に記載の方法：ａ）基質結合部位； ｂ）酵素活性部位； ｃ）タンパク質とタンパク質間の界面；ｄ）コファクターの結合部位； ｅ）リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）結合部位。
12. １２．第１項、第８項または第１０項に記載の方法により合成されるタンパク質 。
13. １３．タンパク質が１または複数の前もって定められた部位に十分化学量論的に 置換されている第１２項に係るタンパク質。
14. １４．タンパク質が１または複数の前もって定められた部位に十分均一に置換さ れている第１２項に係るタンパク質。
15. １５．タンパク質がその置換において十分均一である第１３項に係るタンパク質 。
16. １６．タンパク質の物理的，化学的または生化学的性質の決定のための方法であ って、当該方法は次のａ），ｂ）の手順を備えていることを特徴とする方法：ａ ）第１項、第８項または第１０項に記載の方法により特異的部位で化学量論的に 置換される十分に純粋なタンパク質を合成すること；およびｂ）タンパク質の物 理的あるいは生化学的性質を解析すること。
17. １７．タンパク質がＸ線結晶学あるいはＮＭＲによって解析される第１６項に記 載の方法。
18. １８．タンパク質の物理的あるいは生化学的性質の解析が以下のことを決定する 第１６項に記載の方法： ａ）ポリペプチド鎖の静力学的特性； ｂ）酵素反応の作用メカニズム； ｃ）タンパク質のリガンド結合の特異性；ｄ）目的とするタンパク質のアミノ酸 残基の基質との動的相互作用；ｅ）タンパク質のホールディング； ｆ）タンパク質と他のタンパク質、核酸または糖との相互反応。
19. １９．タンパク質が自然に存在しないアミノ酸アナローダの約１００オングスト ロームの範囲で分析される第１６項に記載の方法。
20. ２０．次のａ），ｂ）を備えタンパク質の前もって選択されたアミノ酸部位に多 数の択−的な置換を行うための方法： ａ）前もって選択されたアミノ酸部位に相当するメッセンジャ−ＲＮＡの部位を 、間違って翻訳されるコドンに置き換えたメッセンジャ−ＲＮＡを作る；ｂ）メ ッセンジャ−ＲＮＡをアミノアシルｔＲＮＡアナローダを含む２つまたはそれ以 上の翻訳系を用いてタンパク質に翻訳し、前記において１つの翻訳系によって作 られたタンパク質は、前もって選択されたアミノ酸部位において他の系によって 作られたタンパク質と比較して異なっている。
21. ２１．異なる翻訳系で作られたタンパク質の相違点が、アミノアシルｔＲＮＡに 結合した自然に存在しないアミノ酸アナローダを前もって選択することにより前 もって決定される第２０項に記載の方法。
22. ２２．タンパク質が約１００００ダルトン以上の分子量を持つ第２０項に記載の 方法。
23. ２３．１つのアミノ酸部位が置換される第２０項に記載の方法。
24. ２４．自然に存在しないアミノ酸の置換が以下の群から選択される第２０項に記 載の方法。 ｉ）ｄ−フェニールアラニン； ｉｉ）（Ｓ）−ｐ−ニトロフェニールアラニン；ｉｉｉ）（Ｓ）−ホモフェニー ルアラニン；ｉｖ）（Ｓ）−ｐ−フルオロフェニールアラニン；ｖ）（Ｓ）−３ −アミノ−２−ベンジルプロピオン酸；ｖｉ）（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−フ ェニールプロピオン酸。
25. ２５．間違って翻訳されるコドンが翻訳停止コドンである第２０項に記載の方法 。
26. ２６．翻訳停止コドンがＵＧＡ（アンバー）である第２５項に記載の方法。
27. ２７．アミノアシルｔＲＮＡアナローダ分子を生成する方法であって、当該方法 は以下の手順を備えていることを特徴とする方法：ａ）マルチヌクレオチド分子 （ＨＮＭ）の３′末端ヌクレオチドの２′あるいは３′リボシルヒドロキシル部 位にアミノアシル化結合によって前もって選択した自然に存在しないアミノ酸ア ナローダを結合させること、ｂ）アミノアシル化されたマルチヌクレオチド分子 （アミノアシル−ＭＮＭ）を、末端を切除したｔＲＮＡ分子（ｔＲＮＡ（−Ｚ） ）に結合させ、前記において機能をもったアミノアシルｔＲＮＡアナローダ分子 が形成される。
28. ２８．マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）がｔＲＮＡの３′末端に相当する第２ ７項に記載の方法。
29. ２９．マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）がジヌクレオチドである第２７項また は第２８項に記載の方法。
30. ３０．ジヌクレオチドが５′ｐＣｐＡ３′である第２９項に記載の方法。
31. ３１．マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）のｔＲＮＡ（−Ｚ）分子への結合が完 全なｔＲＮＡ分子を作り出す第２７項に記載の方法。
32. ３２．ｔＲＨＡ（−Ｚ）が読み取り終結後（ラン−オフ）の転写物から作られる 第２７項に記載の方法。
33. ３３．マルチヌクレオチド分子（ＭＮＭ）の３′末端ヌクレオチドの２あるいは ３′リボシルヒドロキシ部位に前もって選択された自然界に存在しないアミノ酸 アナローダをアミノアシル化結合させる方法が、以下の手順によって行われるよ うにしたことを特徴とする第２７項または第３０項に記載の方法：ａ）ＭＮＭ上 の反応化学基を保護剤によって保護すること；ｂ）アミノ酸アナローダ上の非ア ミノアシル化反応基をブロック剤によって保護すること； ｃ）ブロック剤によって保護したアミノ酸アナローダを用いてＭＮＭをアシル化 すること、 ｄ）保護された反応基から保護剤やブロック剤を除去すること。
34. ３４．いくつかのあるいは全ての反応基を保護する手順が、以下の群から選択さ れたブロック剤あるいは保護剤を用いた手順で行われることを特徴とする第３３ 項に記載の方法： ａ）０−ニトロフェニルサルフェニル（ＮＳＰ）；ｂ）β−シアノエチル（Ｅｔ ＣＮＯ）；ｃ）ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）；ｄ）９−フルオロエニル アメシルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）；ｅ）２−（４−ビフェニル）イソプロ ピルオキシカルボニル（ＢＰＯＣ）；ｆ）ビニルオキシカルボニル（ＶＯＣ）； ｇ）テトラヒドロビラニル（ＴＨＰ）；ｈ）メトキシテトラヒドロビラニル； ｉ）光感受性の基。
35. ３５．保護の手順がブロック剤及び保護剤の両方として０−ニトロフェニルサル フェニル（ＮＳＰ）を用いて行われ第３３項に記載の方法。
36. ３６．アミノアシル−ＭＮＭのｔＲＮＡ（−Ｚ）への結合反応がＴ４ＲＮＡリガ ーゼ酵素によって形成される第２７項に記載の方法。
37. ３７．以下のものを有するアミノアシルｔＲＮＡアナローダ：ａ）式Ｘ−Ａ−Ｙ −Ｍ、ここで： Ｘ＝ｔＲＮＡ分子の５′ヌクレオチド配列；Ａ＝アンチコドンのヌクレオチド； Ｙ＝ｔＲＮＡ分子の３′ヌクレオチド配列；Ｍ＝以下の群から選ばれたアミノ酸 アナローダ：ｉ）修飾した非荷電自然アミノ酸； ｉｉ）修飾した酸性の自然アミノ酸； ｉｉｉ）非アルファ型アミノ酸； ｂ）Ｍ成分を合成途中のポリペプチド鎖に重合させ、それに続くペプチド重合の 受容体として働くように制御する活性。
38. ３８．Ｙ成分が５′−ｐＣｐＵｐＡ−３′の３′末端を有する第３７項に記載の 分子。
39. ３９．（Ｓ）−Ｐ−ニトロフェニールアラニンによってアミノアシル化されたｔ ＲＮＡｐｃｈｕｏＡに相当する第３８項に記載の分子。 ここで： ａ）ＸはＤループとアンチコドンループの部分を含むｔＲＮＡＰｃｈｕａＡの５ ′部分からなる； ｂ）Ａ（アンチコドン）はトリヌクレオチド５′−ｐＣｐＵｐＡ−３′からなる ；ｃ）Ｙはアンチコドンループの一部分，可変ループ，ＴφＣループそしてアク セプターステムを含むｔＲＮＡＰｃｈｕｏＡの３′部分からなる；ｄ）Ｍは（Ｓ ）−ｐ−ニトロフェニールアラニンである。
40. ４０．第３７項に記載のアミノアシルｔＲＮＡアナローダ分子を含む翻訳系。
41. ４１．転写系で合成されたものが第３７項に記載のアミノアシルｔＲＮＡアナロ ーダを含む翻訳系で翻訳される同時転写翻訳系。
42. ４２．自然には存在しないアミノ酸が特定の部位に化学量論的に十分に置換され ている約１００００ダルトン以上の十分に均一なタンパク質。