EA007739B1 - Гетероциклические трипептиды в качестве ингибиторов вируса гепатита с - Google Patents

Abstract

В заявке описаны соединения формулы (I)в которых Rобозначает гидроксил или сульфонамидное производное; Rобозначает трет-бутил, или -СН-С(СН), или -СН-циклопентил; Rобозначает трет-бутил или циклогексил и Rобозначает циклобутил, циклопентил или циклогексил; или их фармацевтически приемлемые соли, которые можно применять в качестве ингибитора NS3-протеазы HCV.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, способам их синтеза, композициям и способам лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (НСУ). В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидным аналогам, фармацевтическим композициям, содержащим такие аналоги, и к способам применения этих аналогов для лечения вызываемой НСУ инфекции.

Предпосылки создания изобретения

Вирус гепатита С (НСУ) является основным возбудителем гепатита, относящегося к не-А, не-Б гепатиту, который передается при переливании крови и который поражает людей во всем мире. Установлено, что свыше 200 миллионов людей в мире заражено вирусом. Большой процент носителей становится хронически инфицированным, и у многих пациентов это приводит к хроническому заболеванию печени, так называемому хроническому гепатиту С.

В свою очередь, эта группа больных имеет высокий риск заболевания такой серьезной болезнью печени, как цирроз печени, печеночно-клеточный рак и последняя стадия болезни печени, приводящая к смерти.

Механизм, с помощью которого происходит сохранение вируса НСУ в организме и обеспечивается высокий коэффициент заболеваемости хронической болезнью печени, пока недостаточно изучен. Неизвестно, как НСУ взаимодействует с иммунной системой хозяина и преодолевает ее действие. Кроме того, также еще не выявлены роли клеточных и гуморальных иммунных ответов в защите от НСУ-инфекции и при заболевании гепатитом. Имеются данные о том, что для профилактики связанного с переливанием крови вирусного гепатита можно применять иммуноглобулины, однако, Центр по контролю заболеваемости в настоящее время не рекомендует для этой цели применять лечение с использованием иммуноглобулинов. Отсутствие эффективного защитного иммунного ответа затрудняет разработку вакцины или адекватных профилактических мер после контакта, поэтому в ближайшее время надежды, в основном, возлагаются на антивирусные средства.

С целью выявления фармацевтических агентов, обладающих эффективностью в отношении лечения НСУ-инфекции, были проведены различные клинические исследования с участием пациентов, страдающих хроническим гепатитом С. В этих исследованиях применяли интерферон-альфа индивидуально или в сочетании с другими антивирусными агентами. Эти исследования позволили установить, что у основного большинства участников эксперимента не было обнаружено реакции на такие схемы лечения, а из тех участников, которые оказались чувствительными к лечению, у большей части после окончания лечения происходил рецидив.

Таким образом, до последнего времени терапия с использованием интерферона (ΙΡΝ) оставалась единственным доступным методом лечения пациентов, страдающих хроническим гепатитом С, которая обладала доказанной в клинических условиях эффективностью. Однако эффективность такого лечения сохраняется в течение непродолжительного периода времени, и, кроме того, лечение интерфероном вызывает серьезные побочные действия (т. е. ретинопатию, тиреоидит, острый панкреатит, депрессию), что снижает качество жизни пациентов, подвергающихся лечению. В настоящее время интерферон в сочетании с рибавирином предложен для лечения пациентов, не чувствительных к ΙΡΝ при его индивидуальном применении. Однако побочные действия, вызываемые ΙΡΝ, не уменьшаются при такой совместной терапии. Установлено, что пэгилированные формы интерферонов, такие как ΡΕΟ-Ιηίτοη® и Редакук®, могут частично снижать указанные вредные побочные действия, однако, антивирусные лекарственные препараты все еще остаются основным средством для орального лечения НСУ.

Таким образом, существует необходимость в разработке эффективных антивирусных агентов для лечения НСУ-инфекции, которые были бы лишены недостатков существующих методов лечения, основанных на применении фармацевтических средств.

НСУ представляет собой заключенную в оболочку положительную цепь РНК-ового вируса семейства ИауМпбае. Геном НСУ, представленный одноцепочечной РНК, состоит приблизительно из 9500 нуклеотидов и имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует один большой полипротеин, состоящий примерно из 3000 аминокислот. В зараженных клетках этот полипротеин расщепляется во многих сайтах клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных и неструктурных (N8) протеинов. В случае НСУ под действием двух вирусных протеаз образуются зрелые неструктурные протеины (N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и Ν85Β). Первая из указанных протеаз, которая пока еще недостаточно охарактеризована, расщепляет связь Ν82-Ν83 (далее в контексте настоящего описания обозначена как №2/3-протеаза); вторая представляет собой сериновую протеазу, содержащуюся в Νконцевой области Ν83 (далее обозначена как №3-протеаза), и она опосредует все последующие расщепления, происходящие по ходу транскрипции Ν83, как в цис-ориентации в сайте расщепления Ν83-Ν84Α, так и в транс-ориентации в остальных сайтах Ν84Α-Ν84Β, Ν84Β-Ν85Α, Ν85Α-Ν85Β. Протеин Ν84Α, вероятно, обладает множественными функциями, действуя в качестве кофактора для Ν83-протеазы и возможно способствуя мембранной локализации Ν83 и других компонентов вирусных репликаз. Образование комплекса протеазы Ν83 с Ν84Α, вероятно, необходимо для процессирования, усиления протеолитической эффективности во всех сайтах. Протеин Ν83 обладает также нуклеозидтрифосфатазной активностью и РНК-геликазной активностью. Ν85Β представляет собой РНК-зависимую РНК-полимеразу,

- 1 007739 принимающую участие в репликации НСУ.

Общая стратегия разработки антивирусных агентов предусматривает инактивацию кодируемых вирусом ферментов, которые играют основную роль в репликации вируса.

Ниже приведен перечень заявок на патенты, опубликованных в течение последних нескольких лет, в которых описаны пептидные аналоги, являющиеся ингибиторами N83-протеазы НСУ, которые по строению отличаются от соединений, предлагаемых в настоящем изобретении: ОБ 2337262; ДР 10298151; 1Р 11126861; 1Р 11292840; 1Р 2001-103993; и8 6159938; и8 6187905; АО 97/43310; АО 98/17679; АО 98/22496; АО 98/46597; АО 98/46630; АО 99/38888; АО 99/50230; АО 99/64442; АО 99/07733;

АО 99/07734; АО 00/09543; АО 00/09558; АО 00/20400; АО 00/59929; АО 00/31129; АО 01/02424;

АО 01/07407; АО 01/16357; АО 01/32691; АО 01/40262; АО 01/58929; АО 01/64678; АО 01/74768;

АО 01/77113; АО 01/81325; АО 02/08187; АО 02/08198; АО 02/08244; АО 02/08251; АО 02/08256;

АО 02/18369; АО 02/60926 и АО 02/79234.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что в нем заявлены трипептидные производные, которые обладают ингибирующей активностью в отношении N83-протеазы, фермента, который играет важную роль в репликации вируса гепатита С.

Еще одним преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что эти соединения специфически ингибируют №3-протеазу и не проявляют заметной ингибирующей активности в отношении других сериновых протеаз, таких как эластаза лейкоцитов человека (НЬЕ), эластаза панкреатической железы свиньи (РРЕ) или бычий химотрипсин поджелудочной железы, или в отношении цистеиновых протеаз, таких как катепсин В печени человека (Са! В). Кроме того, соединения проявляют активность в опытах на культуре клеток и обладают хорошим фармакокинетическим профилем ίη νίνο.

Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что заявлемые соединения обладают биологической доступностью для млекопитающих при оральном введении.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)

в котором В¹ обозначает гидрокси или NН8О2Β^1Α, где В^1А обозначает С1-С8алкил, С₃-С₇ циклоалкил или С1-С6алкил-С3-С7циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, ОС1-С₆алкил, амидо, амино или фенил, или В^1А обозначает С6- или С10арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С1-С6алкил, ОС1-С6алкил, амидо, амино или фенил; В² обозначает трет-бутил, -СН2С(СН3)3 или -СН2-циклопентил; В³ обозначает трет-бутил или циклогексил и В⁴ обозначает циклобутил, циклопентил или циклогексил; или его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемой средой носителя или вспомогательным веществом.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, дополнительно содержит интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, или их любую комбинацию.

Еще одним важным объектом изобретения является способ лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I, или его фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, которые в каждом случае вводят совместно или раздельно.

Следующим важным объектом изобретения является способ предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффек

- 2 007739 тивное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I, или его терапевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, которые вводят совместно или раздельно.

Настоящее изобретение относится также к применению описанного выше соединения формулы I для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Определения

Если не указано иное, то в контексте настоящего описания используемые понятия имеют следующие значения.

В тех случаях, когда для обозначения абсолютной конфигурации заместителя или асимметричного центра соединения формулы (I) используют дескрипторы (В) или (8), то обозначение относится ко всему соединению, а не только к заместителю или асимметричному центру.

Обозначение «Р1, Р2 и Р3» в контексте настоящего описания относится к положению аминокислотных остатков, начиная с С-конца пептидных аналогов и простираясь к Ν-концу (т.е. Р1 обозначает положение 1 относительно С-конца, Р2 обозначает положение 2 относительно С-конца и т.д. (см. Вегдег А. и 8сйесЫет I., Ттапкасйопк ок 111е Воуа1 8оае1у Ьопбоп кепек. В257, 1970, с 249-264)).

В контексте настоящего описания понятие «(1К,28)-винил-АЦКК» относится к соединению формулы

О

т.е. (1В,28)-1-амино-2-этенилциклопропилкарбоновой кислоте.

Понятие «С1-С₆алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает ациклические алкильные заместители с прямой или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, и включает, например, метил, этил, пропил, бутил, 1-метилэтил, 1метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил и гексил. Аналогично этому понятие «С1-С₈алкил» обозначает ациклический алкил с прямой или разветвленной цепью, содержащий 1-8 атомов углерода, например октил.

Понятие «С₃-С₇циклоалкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает циклоалкильный заместитель, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Понятие «С1-С₆алкил-С₃-С₇циклоалкил» в контексте настоящего описания обозначает циклоалкильный радикал, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, который непосредственно связан с алкиленовым радикалом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, например циклопропилметил, циклопентилэтил, циклогексилметил, циклогексилэтил и циклогептилпропил. Например, когда К.'⁴'' обозначает С1-С₆алкилС₃-С₆циклоалкил, то эта группа связана с 8О₂-группой через С1-С₆алкил (т.е. алкиленовый фрагмент).

Понятие «С₆- или Сварил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает либо ароматическую моноциклическую группу, содержащую 6 атомов углерода, либо ароматическую бициклическую группу, содержащую 10 атомов углерода. Например, арил представляет собой фенил, 1-нафтил или 2-нафтил.

Понятие «ОС1-С6алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает радикал -ОС1-С₆алкил, в котором алкил, как указано выше, содержит вплоть до 6 атомов углерода, и включает метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1-диметилэтокси. Последний радикал обычно обозначают как трет-бутокси.

Понятие «гало» в контексте настоящего описания обозначает галогеновый заместитель, выбранный из группы, включающей бром, хлор, фтор или йод.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль» обозначает соль соединения формулы (I), которую, с медицинской точки зрения, можно использовать в контакте с тканями человека и низших животных без признаков повышенной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., которая соответствует приемлемому соотношению польза/риск и, как правило, может растворяться или диспергироваться в воде или масле и обладает эффективностью при целевом использовании. Понятие включает фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Перечень приемлемых солей приведен, например, у 8.М. Виде и др., 1. Рйатш. 8ск, 66, 1977, с. 119, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие «фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кисло

- 3 007739 та, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, адипиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, масляная кислота, камфорная кислота, камфорсульфоновая кислота, коричная кислота, лимонная кислота, диглюконовая кислота, этансульфоновая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, глицерофосфорная кислота, полусерная кислота, капроновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота (изэтионовая кислота), молочная кислота, гидроксималеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, мезитиленсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота, никотиновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, щавелевая кислота, памовая кислота, пектиновая кислота, фенилуксусная кислота, 3-фенилпропионовая кислота, пивалиновая кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, сульфаниловая кислота, винная кислота, паратолуолсульфоновая кислота, ундекановая кислота и т.п.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль присоединения основания» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных кислот и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими основаниями, такими как аммиак или гидроксид, карбонат или бикарбонат аммония, или катионами металла, такого как натрий, калий, литий, кальций, магний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий и т.п. Наиболее предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, четвертичных аминовых соединений, замещенных аминов, включая встречающиеся в естественных условиях замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, изопропиламин, трипропиламин, трибутиламин, этаноламин, диэтаноламин, 2-диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, Ν-этилпиперидин, производные тетраметиламмония, производные тетраэтиламмония, пиридин, Ν,Ν-диметиланилин, Ν-метилпиперидин, Ν-метилморфолин, дициклогексиламин, дибензиламин, Ν,Ν-дибензилфенэтиламин, 1-эфенамин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, полиаминовые смолы и т.п. Наиболее предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин.

Понятие «антивирусный агент» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Антивирусные агенты включают, например, рибавирин, амантадин, УХ-497 (меримеподиб, фирма Уейех Рйагтасеийсак), УХ-498 (фирма УсПсх Рйагтасеийса1к), левовирин, вирамидин, цеплен (максамин), ХТЬ-001 и ХТЬ-002 (фирма ХТЬ Вюрйагтасеийсак).

Понятие «другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агенты, эффективные в отношении снижения или предупреждения развития связанных с гепатитом С симптомов болезни. Такие агенты выбирают из антивирусных агентов, иммуномодуляторов, ингибиторов №3-протеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ или ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ.

Понятие «иммуномодулятор» в контексте настоящего описания обозначает агенты (химические соединения или биологические агенты), которые обладают эффективностью в отношении повышения или потенциирования реакции иммунной системы у млекопитающего. Иммуномодуляторы включают, например, интерфероны класса I (такие как α-, β-, δ- и ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интерфероны и азиало-интерфероны), интерфероны класса II (такие как γ-интерфероны) и пэгилированные интерфероны.

Понятие «ингибитор №3-протеазы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции №3-протеазы НСУ у млекопитающего. Ингибиторы №3-протеазы НСУ включают, например, соединения, описанные в +0 99/07733, +0 99/07734, +0 00/09558, +0 00/09543, +0 00/59929 или +0 02/060926, перспективное соединение, разработанное фирмой Воейпидег 1идеШе1т, обозначенное как ΒΙΕΝ 2061, которое изучено в клиническом исследовании, и перспективные соединения, разработанные фирмой Уейех/ΕΙί ЬШу, обозначенные как УХ-950 или ЬУ-570310, которые еще не окончательно исследованы. В частности, соединения №№ 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 и 127, представленные в таблице на сс. 224-226 +0 02/060926, можно применять в сочетании с соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении.

Понятие «ингибитор полимеразы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции полимеразы НСУ у млекопитающего. Оно относится, например, к ингибиторам Ν85Β

- 4 007739 полимеразы НСУ. Ингибиторы полимеразы НСУ включают не относящиеся к нуклеозидам соединения, например, описанные в:

заявке на патент США № 10/198680, которая соответствует РСТ/СА02/01127, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма Воейппдет 1пдеШе1т), заявке на патент США № 10/198384, которая соответствует РСТ/СА02/01128, оба документа поданы 18 июля 2002г. (фирма Воейппдет 1пдеШе1т), заявке на патент США № 10/198259, которая соответствует РСТ/СА02/01129, оба документа поданы 18 июля 2002г. (фирма Воейппдет 1пдеШе1т),

АО 02/100846 А1 и АО 02/100851 А2 (обе на имя фирмы 8Ыте),

АО 01/85172 А1 и АО 02/098424 А1 (обе на имя фирмы О8К),

АО 00/06529 и АО 02/06246 А1 (обе на имя фирмы Мегск),

АО 01/47883 и АО 03/000254 (обе на имя фирмы 1арап ТоЬассо) и

ЕР 1 256 628 А2 (на имя фирмы Адоигоп).

Кроме того, другие ингибиторы полимеразы НСУ включают также нуклеозидные аналоги, например соединения, описанные в:

АО 01 /90121 А2 (фирма 1бешх),

АО 02/069903 А2 (ВюстуЧ Рйаттасеибсак 1пс.) и

АО 02/057287 А2 и АО 02/057425 А2 (обе на имя фирмы МетскЛЧк).

Конкретными примерами ингибиторов полимеразы НСУ являются 1ТК-002, ЛК-003 и ЛК-109 (фирма 1арап ТоЬассо).

Понятие «ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НСУ у млекопитающего, отличной от ингибирования функции Л83-протеазы НСУ. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом НСУ механизмы, необходимые для образования и/или репликации НСУ в организме млекопитающего. Ингибиторы другой мишени в жизненном цикле НСУ включают, например, агенты, которые ингибируют мишень, выбранную из ряда, включающего геликазу, N82/3протеазу НСУ и внутренний сайт входа в рибосому (1ЯЕ8). Конкретным примером ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ является 1818-14803 (1818 РйаттасеибсаИ).

Понятие «ингибитор ВИЧ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Ингибиторы ВИЧ включают, например, нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интегразы.

Понятие «ингибитор НАУ (вирус гепатита А)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НАУ включают вакцины, содержащие вирус гепатита А, например Наупх® (фирма О1ахо8тййК1ше), УАЦТА® (фирма Мегск) и Ауах1т® (фирма АуепШ РаЧеит).

Понятие «ингибитор НВУ (вирус гепатита В)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НВУ включают, например, агенты, которые ингибируют ДНК-полимеразу вируса НВУ или вакцины на основе НВУ. Конкретными примерами ингибиторов НВУ являются ламивудин (Ер1у1т-НВУ®), адефовирдипивоксил, энтекавир, ЕТС (СоупасП®), ΌΛΡΌ (ΌΧΟ), Ь-ЕМАИ (С1еуибше®), АМ365 (амрад), Ьб! (телбивудин), моновалентный-ЕбС (валторцитабин), АСН-126,443 (Ь-Еб4С) (ахиллион), МСС478 (фирма Е11 ЬШу), рацивир (ЯСУ), фтор-Ь- и -Ό-нуклеозиды, робустафлавон, ΙΟΝ 2001-3 (ΙΟΝ), Ват 205 (№уе1ок), ХТЬ-001 (ХТЬ), иминосахара (ШпуЮЮ) (фирма 8упегду), НерВхуте; иммуномодуляторы, такие как интерферон альфа 2Ь, НЕ2000 (фирма НоШк-Ебеп), Тйетаб1дт (эпиммун), ЕНТ899 (фирма Епхо Вюсйет), тимозин альфа-1 (2абахш®), вакцина на основе ДНК НВУ (фирма Ро^беНес!), вакцина на основе ДНК НВУ (фирма 1ейетоп Сеп!ег), антиген НВУ (фирма ОтаОеп), ВауНер В® (фирма Вауег), №1Ы-НВ® (фирма №1Ы) и антитела к вирусу гепатита В (фирма Сапдепе); и вакцины на основе НВУ, такие, например, как Епдепх В, ЯесотЫуах НВ, ОепНеуас В, Нерасаге, Вю-Нер В, ТЖпКтх, Сотуах, Нехауас.

Понятие «интерферон класса Ι» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа Ι. Оно включает как встречающиеся в естественных условиях, таких и полученные синтетическим путем интерфероны класса Ι. Примеры интерферонов класса I включают α-, β-, ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интер

- 5 007739 фероны, азиало-интерфероны.

Понятие «интерферон класса II» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа II. Примеры интерферонов класса II включают γ-интерфероны.

Ниже представлены конкретные предпочтительные примеры некоторых таких агентов: антивирусные агенты: рибавирин и амантадин;

иммуномодуляторы: интерфероны класса I, интерфероны класса II и пэгилированные интерфероны; ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, мишенью такого ингибитора являются N83геликаза, №2/3-протеаза НСУ или внутренний сайт входа в рибосому (ГВЕ8);

ингибиторы ВИЧ: нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интеграз; или ингибиторы НВУ: агенты, которые ингибируют вирусную ДНК-полимеразу НВ У, или вакцина на основе НВУ.

Как указано выше, совместная терапия предусматривает совместное введение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из следующего ряда: антивирусный агент, иммуномодулятор, другой ингибитор №3-протеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ, ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, ингибитор ВИЧ, ингибитор НАУ и ингибитор НВУ. Примеры таких агентов приведены выше в разделе «Определения». Указанные дополнительные агенты можно объединять с соединениями, предлагаемыми в изобретении, получая лекарственное средство, которое содержит однократную фармацевтическую дозу. В другом варианте указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту индивидуально в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства, например, используя набор. Указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту до, одновременно или после введения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, для облегчения или устранения симптомов гепатита С и/или снижения вирусного титра у пациента.

В контексте настоящего описания понятие «предупреждение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, после контакта индивидуума с вирусом, но до проявления симптомов болезни и/или до обнаружения вируса в крови.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В¹ обозначает гидрокси, NН8Ο2Μе, NН8О2-циклопропил или ΝΠ8Ο2ΡΡ. Более предпочтительно В¹ обозначает ΝΠ8Θ2Μο или гидрокси. Наиболее предпочтительно В¹ обозначает гидрокси.

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В² обозначает трет-бутил или СН2-С(СН3)3. Более предпочтительно В2 обозначает СН2-С(СН3)3.

Предпочтительно В³ обозначает трет-бутил.

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В⁴ обозначает циклопентил или циклогексил. Более предпочтительно В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), как оно определено выше, в котором В¹ обозначает гидрокси, В² обозначает СН2-С(СН3)3, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² и В³, каждый обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² обозначает СН2-С(СН3)3, В³ обозначает циклогексил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² обозначает СН2-С(СН3)3 и В³ и В⁴, каждый обозначает циклогексил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² обозначает циклопентилметил, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклобутил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² обозначает СН₂-С(СН₃)₃, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклобутил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает NН8Ο₂Μе, В² обозначает СН2-С(СН3)3, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает ΝΠ8Ο₂ΡΡ, В² обозначает СН2-С(СН3)3, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ. Примеры других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, включают α(альфа), β- (бета), δ- (дельта), γ- (гамма), τ- (тау) или ω- (омега) интерферон, рибавирин и амантадин.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой ингибитор №3-протеазы НСУ.

- 6 007739

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор полимеразы НСУ.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, включая (но не ограничиваясь ими) геликазу, Ы82/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (ΙΚΕ8).

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально, парентерально или с помощью устройства для имплантации. Предпочтительным является оральное введение или введение с помощью инъекции. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать любые общепринятые нетоксические фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или наполнители. В некоторых случаях значение рН композиции можно регулировать с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов с целью повышения стабильности соединения, включенного в композицию или в форму для его введения. В контексте настоящего описания понятие «парентеральный» включает подкожный, внутрикожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставной, интрасиновиальный, интрастернальный, интратекальный путь введения, введение с помощью инъекции или инфузии, а также введение в область повреждения.

Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного препарата для инъекции, например, стерильной инъецируемой водной или жирорастворимой суспензии. Эту суспензию можно получать с помощью хорошо известных методов с использованием диспергирующих или смачивающих агентов (таких, например, как Твин 80) и суспендирующих агентов.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально в виде любой приемлемой формы лекарственного средства, предназначенной для орального введения, включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки и водные суспензии и растворы. В случае таблеток для орального введения обычно применяемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул приемлемые разбавители представляют собой лактозу и безводный кукурузный крахмал. Когда оральным путем вводят водные суспензии, действующее вещество объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять определенные подслащивающие вещества, и/или корригенты, и/или красители.

Другие пригодные наполнители или носители для указанных выше препаративных форм и композиций приведены в обычных фармацевтических справочниках, например в «Кеттд!оп'к Рйагтасеибса1 8с1еисек», Тйе 8с1еисе апб Ргасйсе о£ Рйаттасу, 19-е изд. Маск РиЫМипд Сотрапу, ЕаДоп. Репп., (1995).

Для монотерапии с целью предупреждения и лечения опосредованной НСУ болезни можно применять дозы в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг веса тела в день предлагаемого соединения, которое является ингибитором протеазы. Как правило, фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить от примерно 1 до примерно 5 раз в день или в другом варианте путем непрерывной инфузии. Такое введение можно применять как для длительного, так и для экстренного лечения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителями для получения однократной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Обычная композиция может содержать от примерно 5 до примерно 95% действующего вещества (мас.%). Предпочтительно такие композиции содержат от примерно 20 до примерно 80% действующего вещества.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, можно применять и более низкие или более высокие дозы по сравнению с указанными выше. Конкретные дозы и схемы лечения любого конкретного пациента могут зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время введения, скорость выведения, сочетание лекарственных средств, серьезность и особенности развития болезни, предрасположенность пациента к инфекции, и их определяет лечащий врач. Как правило, лечение начинают с небольших доз, существенно более низких, чем оптимальная доза пептида. Затем дозу повышают небольшими порциями до достижения оптимального действия в конкретных условиях. Как правило, наиболее предпочтительно вводить соединение в таком диапазоне концентраций, которые, в целом, обеспечивают антивирусную активность, но не обладают какими-либо вредными или опасными побочными действиями.

Когда композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, включают в комбинацию, содержащую соединение формулы (Ι) и один или несколько дополнительных терапевтических или профилактических агентов, то соединение и дополнительный агент должны присутствовать в дозе, составляющей примерно от 10 до 100% и более предпочтительно примерно от 10 до 80% от дозы, обычно применяемой в режиме монотерапии.

Когда эти соединения или их фармацевтически приемлемые соли объединяют в препаративной форме с фармацевтически приемлемым носителем, то полученную композицию можно вводить ш у1уо млекопитающему, такому как человек, для ингибирования Ы83-протеазы НСУ или для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом НСУ. Такое лечение можно осуществлять также при использовании соединения, предлагаемого в изобретении, в сочетании с агентами, включающими (но не

- 7 007739 ограничиваясь ими): α-, β-, δ-, ω-, τ- или γ-интерферон, рибавирин, амантадин; другие ингибиторы N83протеазы НСУ; ингибиторы полимеразы НСУ; ингибиторы других мишеней жизненного цикла НСУ, которые включает (но не ограничиваясь ими) геликазу, N82/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (1КЕ8); или их комбинации. С соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении, можно объединять другие агенты, получая однократную дозу лекарственного средства.

В другом варианте эти дополнительные агенты можно вводить млекопитающему по отдельности в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования N83протеазной активности НСУ у млекопитающего, заключающийся во введении соединения формулы (I).

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения этот способ предназначен для снижения N83-протеазной активности у зараженного вирусом гепатита С млекопитающего.

Если фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества только соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, то такой способ может дополнительно предусматривать введение указанному млекопитающему агента, выбранного из ряда, включающего иммуномодулятор, антивирусный агент, ингибитор N83-протеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ или ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, таких как геликаза, N82/3-протеаза или 1КЕ8. Такой дополнительный агент можно вводить млекопитающему до, одновременно или после введения композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве лабораторного реагента. Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также для устранения или предупреждения вирусного загрязнения материалов, снижая тем самым риск заражения вирусом персонала лабораторий или медицинских учреждений или пациентов, которые имеют контакт с такими материалами (например, кровью, тканями, хирургическими инструментами и предметами одежды, лабораторными инструментами и предметами одежды, приборами и материалами для сбора крови).

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве реагента для исследований. Соединение формулы (I) можно использовать в качестве позитивного контроля для обоснования модельных анализов на клетках или анализов ίη νίίτο или ίη νίνο репликации вирусов.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем, заявляемый в приведенной ниже формуле изобретения.

Примеры

Температуры даны в градусах Цельсия. Проценты для растворов представляют собой % (мас./об.), а соотношения в растворах представляют собой соотношения объемов, если не указано иное. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали с помощью спектрометра фирмы Вгискег при частоте 400 МГц, химические сдвиги (δ) выражены в ч./млн. Экспресс-хроматографию проводили на силикагеле (8ίΟ₂) согласно методу экспресс-хроматографии Стилла (У.С. 8ΐί11 и др., I. Огд. Сйет., 43, 1978, с. 2923).

В примерах использовали следующие сокращения: ДБУ: 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен; ДХМ: дихлорметан; ДИЭА: диизопропилэтиламин; ДИПЭА: диизопропилэтиламин; ДМФ: Ν,Ν-диметилформамид; ДМАП: 4-(диметиламино)пиридин; ЕЮАс: этилацетат; ГАТУ: [гексафторфосфат О-(7азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония]; ЖХВР: жидкостная хроматография высокого разрешения; МС: масс-спектрометрия; МАБЭБТОБ: Ма1п\ А^Щеб Ба^ег Όίδοτρΐίοη [οηί/αΐίοη-Τίηκ о£ БНд1П; ЕАВ: бомбардировка быстрыми атомами; Ме: метил; МеОН: метанол; Ρΐι: фенил; К.Т.: комнатная температура (18-22°); трет-бутил или т-бутил: 1,1-диметилэтил; ТЬд: трет-бутилглицин:трет-лейцин; ТФК: трифторуксусная кислота; и ТГФ: тетрагидрофуран.

Синтез соединений формулы (I).

В целом, соединения формулы (I) и их промежуточные продукты получают известными методами с использованием реакционных условий, для которых известно, что они являются приемлемыми для реактантов. Некоторые такие методы описаны в УО 00/09543, УО 00/09558 и И8 6323180, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Получение тиомочевин.

Получение тиомочевины 2а.

η₂ν

н (2а)

Тиомочевину (5,0 г, 66 ммолей) растворяли в толуоле (50 мл) и добавляли трет-бутилацетилхлорид (8,88 г, 66 ммолей). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в течение 14 ч, получая раствор желтого цвета. Смесь концентрировали досуха и остаток распределяли между ЕЮАс и насыщенным №НС’О₃. Органическую фазу желтого цвета сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали, получая твердое вещество желтого цвета. Твердое вещество растворяли в минимальном количестве ЕЮАс и растирали с гексаном, получая соединение 2а в виде твердого вещества белого цвета (8,52 г; 75%).

МС (электроспрей): 173 (М-Н)- 175 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой

- 8 007739 (0,06% ТФК; СН₃СП:Н₂О): 99%.

Получение тиомочевины 2Ь.

С помощью описанного выше процесса и используя поступающий в продажу циклопентилацетилхлорид вместо трет-бутилацетилхлорила, получали тиомочевину 2Ь.

Синтез промежуточных продуктов 3.

Получение карбамата 3 а.

Тетрагидрофуран (350 мл) добавляли в колбу, содержащую 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир циклопентилового эфира угольной кислоты (9,00 г, 39,6 ммоля) и трет-лейцин (6,24 г, 47,5 ммоля), получая суспензию. При интенсивном перемешивании добавляли дистиллированную воду (100 мл). Небольшое количество твердого вещества оставалось нерастворенным. Затем добавляли триэтиламин (16,6 мл, 119 ммолей), получая гомогенный раствор, который перемешивали при К.Т. Через 2,5 ч ТГФ выпаривали, и водный остаток разбавляли водой (100 мл), и реакционную смесь подщелачивали, добавляя 1н. ПаОН (25 мл - конечное значение рН>10). Раствор промывали ЕЮАс (2х200 мл) и затем водную фазу подкисляли с помощью 1н. НС1 (примерно 70 мл - конечное значение рН<2). Мутный раствор экстрагировали ЕЮАс (200+150 мл). Экстракт сушили (Мд8О₄) и упаривали, получая соединение 3а в виде твердого вещества белого цвета (8,68 г).

Получение карбаматов 3Ь, 3 с и 34.

С помощью описанного выше процесса и используя соответствующие комбинации трет-бутилглицина или циклогексилглицина и 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир циклобутилового, циклопентилового или циклогексилового эфира угольной кислоты, получали следующие карбаматы:

Получение промежуточного продукта 5.

Получение промежуточного продукта 5 а.

α-Бромкетон 4 (3,61 г, 5,71 ммоля) объединяли с тиомочевиной 2а (1,09 г, 6,28 ммоля) в изопропаноле (140 мл) и раствор желтого цвета помещали в предварительно нагретую масляную баню с температурой 70°С и выдерживали в течение 1,5 ч. Раствор охлаждали до К.Т. и упаривали досуха. Остаток растворяли в ЕЮАс. ЕЮ Ас-раствор промывали насыщенным №НСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд8О₄) и упаривали, получая продукт в виде пены оранжево-коричневого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии с использованием гексана:ЕЮАс, 7:3, удаляли менее полярные примеси, а с использованием гексана:ЕЮАс, 6:4, получали чистый продукт в виде твердого вещества светло-желтого цвета (3,05 г, 76%).

МС (электроспрей): 706,3 (М-Н)- 708,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СП:Н₂о): 99%.

Получение промежуточного продукта 5Ь.

С помощью описанного выше процесса и используя тиомочевину 2Ь вместо тиомочевины 2а, полу- 9 007739 чали соответствующий промежуточный продукт 5Ь.

Получение промежуточного продукта 5с.

С помощью описанного выше процесса и используя поступающую в продажу тиомочевину вместо тиомочевины 2а, получали соответствующий промежуточный продукт 5с.

Пример 1. Синтез соединения 100.

Стадия 1. Получение промежуточного продукта 6а.

Защищенный с помощью Вос дипептид 5а (3,05 г, 4,31 ммоля) растворяли в смеси 4н. НС1/диоксан (22 мл). После перемешивания при К.Т. в течение 30 мин осаждался гидрохлорид. Для растворения осадка добавляли МеОН (2 мл). Через 2 ч реакционную смесь упаривали досуха. Образовавшийся гидрохлорид растворяли в ДХМ (22 мл) и ДИЭА (3,0 мл, 17,24 ммоля); добавляли карбамат 3а (1,15 г, 4,47 ммоля) и ГАТУ (1,72 г, 4,516 ммоля). Раствор перемешивали при К.Т. в течение 6 ч. Затем смесь разбавляли ЕЮАс и раствор промывали насыщенным №1НСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд§О₄), фильтровали и упаривали, получая соединение 6а в виде твердого вещества желтого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии, осуществляя сначала элюирование гексаном:Е1ОАс, 7:3, а затем этой же смесью в соотношении 6:4, получали чистый метиловый эфир 6а в пены белого цвета (3,25 г, 90%).

МС (электроспрей): 831,4 (М-Н)- 833,4 (М+Н)+ 855,4 (Μ+Να)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂О): 98%.

Стадия 2. Гидролиз сложного эфира.

6а Соединение 100

Сложный метиловый эфир 6а (3,24 мг, 3,89 ммоля) растворяли в ТГФ (40 мл) и МеОН (20 мл) и добавляли водный раствор ЫОН (1,63 мг, 38,9 ммоля в 25 мл). Реакционную смесь желтого цвета перемешивали в течение 5,5 ч и затем концентрировали, получая беловатую суспензию. Суспензию растворяли в ЕЮАс и соляном растворе, приготовленном на деионизированной воде. Значение рН полученного рас

- 10 007739 твора доводили до 6, добавляя 1н. НС1. Слои разделяли и водный слой дополнительно экстрагировали ЕЮАс (2х). Объединенные ЕЮАс-экстракты промывали деионизированной водой (2х), приготовленным на деионизированной воде соляным раствором (1х), сушили (М§80₄), фильтровали и упаривали, получая соединение 100 в виде твердого вещества желто-белого цвета (3,02 г, выход 95%).

Превращение в Ца-соль.

Нейтральное соединение 100 (1,22 г, 1,49 ммоля) растворяли в МеОН (30 мл) и добавляли 1 экв. 0,01н. ΝαΟΗ (14,85 мл) - при этом не происходило осаждение продукта. Прозрачный раствор желтого цвета концентрировали, разбавляли деионизированный водой, замораживали и лиофилизировали, получая продукт (Ца-соль) в виде аморфного твердого вещества желто-белого цвета (1,24 г, выход 99%).

Να-соль: ММ: 84,98 С42Н5зЦбО9§Ца

МС (электроспрей) : 817,3 (М-Н)- 819,4 (М+Н)+ 841,4 (М+Ца)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СЦ:Н₂О): 98%.

'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 6:1; δ 8,11-7,65 (т, 4Н), 7,33 (Ьз, 1Н), 7,18-6,97 (т, 2Н), 6,36-6,08 (т, 1Н), 5,55-5,33 (т, 1Н), 4,98 (б, 6=18,0 Гц, 1Н), 4,85 (Ьз, 1н), 4,80 (б, Д=10,4 Гц, 1Н), 4,50-4,41 (т, 1Н), 4,22-4,02 (т, 2Н), 3,92 (8, 3Н), 2,72-2,45 (т, 1Н), 2,50 (при регистрации в ДМСО, з, 2Н), 2,40-2,26 (т, 1Н), 1,89-1,43 (т, 9Н), 1,37-1,30 (т, 1Н), 1,30-1,12 (т, 1Н), 1,03 и 0,90 (2 х з, 9Н), 0,98 и 0,94 (2 х з, 9Н).

С помощью процесса, описанного на первой стадии примера 1, и используя Вос-дипептид 5с вместо 5а, получали соединение 6Ь.

Соединение 6Ь (70 мг, 0,095 ммоля) растворяли в 2 мл ДХМ и последовательно обрабатывали ДИЭА (0,045 мл, 0,26 ммоля) и пивалоилхлоридом (0,015 мл, 0,12 ммоля). После перемешивания в течение 1 ч при 40° вносили дополнительную порцию пивалоилхлорида (0,015 мл, 0,12 ммоля) и перемешивание продолжали в течение еще 2 ч. После концентрирования раствора остаток растворяли в ЕЮАс. Раствор промывали насыщенным раствором №НС’О₃ и соляным раствором, сушили (М§80₄) и концентрировали, получая 8 мг неочищенного соединения 6с, которое использовали без дополнительной очистки. Представляющее собой сложный метиловый эфир производное 6с гидролизовали согласно процессу, описанному на стадии 2 примера 1, и очищали с помощью препаративной ЖХВР, используя колонку УМ С СотЫ-Ргер. ΟΌ8-ΑΡ, 50х20 мм, ГО, 8 - 5 мкм, 120 А и программу линейного градиента от 2 до 100% АсСЦ/вода (0,06% ТФК).

Фракции анализировали с помощью аналитической ЖХВР и чистые фракции объединяли, концентрировали, замораживали и лиофилизировали, получая соединение 101 в виде трифторацетата.

Соединение 101 'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 85:15, описание основного изомера; δ 8,56 (з, 1Н), 8,40-8,22 (т, 1Н), 8,17 (б, 1=8,9 Гц, 1Н), 7,67 (Ьз, 1Н), 7,52 (Ьз, 1Н), 7,24-7,15 (т, 1Н), 7,03 (б, 1=8,3 Гц, 1Н), 5,78-5,67 (т, 1Н), 5,61-5,53 (т, 1Н), 5,19 (бб, 1=17,2, 1,6 Гц, 1Н), 5,09-5,03 (т, 1Н), 4,63-4,55 (т, 1Н), 4,49-4,39 (т, 2Н), 4,11-3,92 (т, 2Н), 3,95 (з, 3Н), 2,62-2,53 (т, 1Н), 2,33-2,25 (т, 1Н), 2,06-1,98 (т, 1Н), 1,72-1,25 (т, 10н), 1,30 (з, 9Н), 0,97 (з, 9Н).

МС (электроспрей): 803,3 (М-Н)- 805,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН3СЦ:Н2О): 97%.

- 11 007739

Пример 3. Получение соединения 102.

С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 36 вместо 3а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 102 в виде трифторацетата.

Соединение 102 ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-66): смесь ротамеров, соотношение примерно 90:10, описание основного изомера; δ 12,37 (в, 1Н), 8,54 (в, 1Н), 8,40-8,06 (т, 2Н), 7,67-7,40 (т, 2Н), 7,26 (6, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,26-7,13 (т, 1Н), 5,77-5,65 (т, 1Н), 5,62-5,49 (т, 1Н), 5,23-5,16 (т, 1Н), 5,10-5,03 (т, 1Н), 4,57-4,37 (т, 3Н), 4,033,88 (т, 2Н), 3,94 (в, 3Н), 2,64-2,54 (т, 1Н), 2,41 (в, 2Н), 2,37-2,22 (т, 1Н), 2,04-1,95 (т, 1Н), 1,79-1,21 (т, 16Н), 1,17-0,85 (т, 5Н), 1,04 (в, 9Н).

МС (электроспрей): 843,5 (М-Н)- 845,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂О): 99%.

Пример 4. Получение соединения 103.

Соединение 103

С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3с вместо 3а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 103 в виде трифторацетата.

'И-ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 85:15, описание основного изомера; δ 12,35 (δ, 1Н), 8,52 (т, 1Н), 8,43-8,06 (т, 2Н), 7,67-7,41 (т, 2Н), 7,26 (6, 1=7,8 Гц, 1Н), 7,24-7,11 (т, 1Н), 5,77-5,65 (т, 1Н), 5,62-5,48 (т, 1Н), 5,23-5,15 (т, 1Н), 5,10-5,03 (т, 1Н), 4,52-4,38 (т, 2Н), 4,154,05 (т, 1Н), 4,03-3,89 (т, 2Н), 3,94 (в, 3Н), 2,63-2,52 (т, 1Н), 2,41 (δ, 2Н), 2,35-2,23 (т, 1Н), 2,05-1,96 (т, 1Н), 1,81-1,41 (т, 11Н), 1,38-0,86 (т, 12Н), 1,04 (в, 9Н).

МС (электроспрей): 857,5 (М-Н)- 859,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№ Н₂О): 99%.

Пример 5. Получение соединения 104.

Соединение 104

С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3Ь вместо 3а и Вос-дипептид 5Ь вместо 5а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 104 в виде трифторацетата.

'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 3:1; δ 8,02 (в, 1Н), 7,90 (в, 1Н), 7,84 (6, 1=7,0 Гц, 1Н), 7,70 (в, 1Н), 7,33 (6, 1=2,2 Гц, 1Н), 7,14 (66, 1=2,5, 8,2 Гц, 1Н), 7,09 (66, 1=2,2, 9,2 Гц, 1Н), 6,29-6,08 (т, 1Н), 5,54-5,32 (т, 1Н), 4,99 (6, 1=15,9 Гц, 1Н), 4,80 (6, 1=10,0 Гц, 1Н), 4,76-4,64 (т, 1Н), 4,46 (66, 1=6,7, 13,9 Гц, 1Н), 4,19-4,08 (т, 3Н), 3,92 (в, 3Н), 2,70-2,61 (т, 2Н), 2,37-2,09 (т, 4Н), 2,03-1,82 (т, 1Н), 1,85 (Ьв, 2Н), 1,77-1,44 (т, 8Н), 1,35-1,29 (т, 1Н), 1,29-1,15 (т, 4Н), 0,98 и 0,90 (2 х в, 9Н).

- 12 007739

МС (электроспрей): 815,3 (М-Н)- 817,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СКН₂о): 98%.

Пример 6. Получение соединения 105.

С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3Ь вместо 3 а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 105 в виде трифторацетата.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО^₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 7:1; δ 8,58 (δ, 1Н), 8,19 (ά, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,76-7,50 (т, 2Н), 7,35-7,20 (т, 1Н), 7,19 (ά, 1=8,0 Гц, 1Н), 5,78-5,67 (т, 1Н), 5,65-5,50 (т, 1Н), 5,19 (ά, 1=17,0 Гц, 1Н), 5,07 (ά, 1=10,2 Гц, 1н), 4,51-4,42 (т, 2Н), 4,42-4,31 (т, 1Н), 4,02 (ά, 1=7,4 Гц, 1н), 4,02-3,93 (т, 1Н), 3,97 (δ, 3Н), 2,63-2,52 (т, 1Н), 2,42 (δ, 2Н), 2,35-2,25 (т, 1Н), 2,07-1,95 (т, 3Н), 1,90-1,76 (т, 1Н), 1,70-1,41 (т, 3Н), 1,30-1,23 (т, 1Н), 1,04 (δ, 9Н), 0,96 и 0,87 (2 х δ, 9Н).

МС (электроспрей): 803,4 (М-Н)- 805,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂о): 98%.

Пример 7. Получение соединения 106.

Соединение 106

Соединение 100, описанное в примере 1 (29,8 мг, 0,036 ммоля), объединяли с ГАТУ (1,2 экв., 19,7 мг, 0,052 ммоля) и растворяли в безводном ДМФ (4 мл). Раствор перемешивали при К.Т. и по каплям в течение примерно 1 мин добавляли ДИПЭА (5 экв., 31,4 мкл, 0,18 ммоля). Смесь перемешивали в течение 20 мин при К.Т. и анализировали с помощью аналитической ЖХВР, оценивая образование активированного сложного эфира. Добавляли раствор метансульфонамида (5,8 экв., 19,7 мг, 0,207 ммоля), ДМАП (5,4 экв., 23,5 мг, 0,193 ммоля) и ДБУ (4,8 экв., 25,8 мкл, 0,172 ммоля) в ДМФ (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при К.Т., затем концентрировали в вакууме. Остаток восстанавливали в ДМСО и очищали с помощью препаративной ЖХВР. После лиофилизации получали конечный продукт (23 мг, 71,3%) в виде аморфного твердого вещества беловатого цвета.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-дД δ 12,35 (δ, 1Н), 10,53 (δ, 1Н), 8,87 (δ, 1Н), 8,40-8,20 (т, 1Н), 8,17 (ά, 1=8,8 Гц, 1Н), 7,61 φδ, 1н), 7,51 φδ, 1Н), 5,67-5,55 (т, 2Н), 5,23-5,18 (т, 1Н), 5,10 (ά, 1=12 Гц, 1Н), 4,68-

4,57 (т, 1Н), 4,50 φά, 1=12 Гц, 1Н), 4,46-4,37 (т, 1Н), 4,07 (ά, 1=8,0 Гц, 1Н), 3,95 (δ, 3Н), 3,17 (δ, 3Н), 2,78-

2,58 (т, 1Н), 2,42 (δ, 2Н), 2,29-2,19 (т, 1Н), 2,19-2,09 (т, 1Н), 1,71 (άά, 1=7,8, 7,6 Гц, 1Н), 1,67-1,55 (т, 4Н), 1,55-1,37 (т, 4Н), 1,04 (δ, 9Н), 0,98 (δ, 9Н), 0,97-0,87 (т, 2Н).

МС (электроспрей): 896,5 (М+Н)+ и 894,5 (М-Н)-. ОФ-ЖХВР: К₃=6,7 мин (гомогенность=100%).

Пример 8. Получение соединения 107.

- 13 007739

С помощью процесса, описанного в примере 7, и используя бензолсульфонамид вместо метилсульфонамида, получали соединение 107 в виде аморфного твердого вещества светло-желтого цвета, выход 54%.

¹Н-ЯМР (ДМСО-йб), δ 12,39 (з, 1Н), 10,89 (з, 1н), 8,83 (з, 1Н), 8,40-8,22 (т, 1Н), 8,18 (й, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,90 (з, 1Н), 7,88 (з, 1Н), 7,67-7,63 (т, 1Н), 7,63-7,54 (т, 3Н), 7,54-7,45 (т, 1Н), 7,30-7,15 (т, 1Н), 7,10 (й, 1=7,8 Гц, 1Н), 5,62-5,51 (т, 1Н), 5,38-5,26 (т, 1Н), 5,16-5,08 (т, 1Н), 4,93 (й, 1=10,4 Гц, 1Н), 4,70-

4,58 (т, 1Н), 4,57-4,49 (т, 1Н), 4,48-4,39 (т, 1Н), 4,09 (й, >7,8 Гц, 1Н), 3,95 (з, 3Н), 2,69-2,59 (т, 1Н), 2,41 (з, 2Н), 2,28-2,16 (т, 1Н), 2,14-2,04 (т, 1Н), 1,72-1,52 (т, 4Н), 1,51-1,37 (т, 4Н), 1,29-1,22 (т, 1н), 1,03 (з, 9Н), 1,00 (з, 9Н), 0,99-0,92 (т, 1Н).

МС (электроспрей); 958,5 (М+Н)+ и 956,5 (М-Н)-. ОФ-ЖХВР: В₄=7,2 мин (гомогенность=95%). Пример 9. Анализ \'83-\'84А-протеазы.

Ферментативный анализ, который применяли для оценки соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, описан в АО 00/09543 и АО 00/59929.

Пример 10. Анализ репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Культура клеток.

Клетки линии Ний7, стабильно поддерживающие субгеномный репликон НСУ, создавали согласно описанному ранее методу (Ьоктап и др., 8с1епсе 285, 1999, сс. 110-113) и обозначали их как клеточная линия 822.3 (АО 02/052015). Клетки линии 822.3 поддерживали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (ЭМЕМ), дополненной 10% ФБС и 1 мг/мл неомицина (стандартная среда). В процессе анализа использовали среду ЭМЕМ, дополненную 10% ФБС, содержащую 0,5% ДМСО и не содержащую неомицин (среда для анализа). За 16 ч до внесения соединения клетки линии 822.3 обрабатывали трипсином и разбавляли до 50000 клеток/мл стандартной средой. По 200 мкл (10000 клеток) вносили в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем планшет инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ до следующего дня.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
ϋΜΕΜ	Αΐββηί 1пс.	10013СУ	4°С
ДМСО	81§ша	ϋ-2650	К.Т.
Модифицированный по методу Дульбекко ЗФР	СИЬсо-ВКЬ	14190-136	К.Т.
Фетальная телячья сыворотка (ФТС) (сыворотка плода коровы)	Вю-АЫИакег	14-901Г	-20°С/4°С
Неомицин (0418)	СНЬсо-ВВЕ	10131-027	-20°С/4°С
Трипсин-ЭДТК	Сг1Ьсо-ВВ.Ь	25300-054	-20°С/4°С
96-луночные планшеты	Соз1аг	3997	К.Т.
Фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ), 0,22 мкм	МИНроге	8ЬОУ025Ь8	К.Т.
Титрационный планшет из полипропилена с глубокими лунками	Вескшап	267007	К.Т.

Подготовка тестируемого соединения к анализу.

мкл тестируемого соединения (в 100% ДМСО) добавляли к 2 мл среды для анализа до конечной концентрации ДМСО 0,5% и раствор обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и фильтровали через фильтр типа М1Шроге с размером отверстий 0,22 мкм. 900 мкл вносили в ряд А титрационного планшета из полипропилена с глубокими лунками. Ряды Б-З содержали аликвоты по 400 мкм среды для анализа (содержащей 0,5% ДМСО), и их применяли для приготовления серийных разведений (1/2) путем переноса по 400 мкл из ряда в ряд (в ряд З не вносили никакого соединения).

Внесение тестируемого соединения в культуру клеток.

Среду для культуры клеток аспирировали из 96-луночного планшета, содержащего клетки линии 822.3. По 175 мкл среды для анализа с соответствующим образом разбавленным тестируемым соединением переносили из каждой лунки планшета, содержащего соединения, в соответствующую лунку планшета, содержащего культуру клеток (ряд З применяли в качестве «контроля без ингибитора»). Планшет с культурой клеток инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ в течение 72 ч.

Экстракция общей клеточной РНК.

После 72-часового периода инкубации экстрагировали общую клеточную РНК из клеток линии 822.3, находящихся в 96-луночном планшете, используя набор типа В№азу 96 (Р1адеп®, В№азу НапйЬоок, 1999). В целом, метод состоит в следующем: среду для анализа полностью удаляли из клеток и в каждую лунку 96-луночного планшета с культурой клеток добавляли по 100 мкл ВЬТ-буфера (Р1адеп®), содер

- 14 007739 жащего 143 мМ β-меркаптоэтанол. Микропланшет осторожно встряхивали в течение 20 с. Затем в каждую лунку микропланшета добавляли по 100 мкл 70%-ного этанола и перемешивали пипетированием. Лизат удаляли и вносили в лунки планшета, содержащего КХеазу 96 (Ц1адеп®), который помещали в верхнюю часть блока с квадратными лунками (Ц1адеп® 8с]иаге-\Уе11 В1оск). Планшет с КХеазу 96 запечатывали скотчем и устройство 8циаге-^е11 В1оск с содержащим КХеазу 96 планшетом помещали в держатель и вносили в роторный резервуар центрифуги 4К15С. Образец центрифугировали при 6000 об./мин (~5600 х д) в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли с планшета и в каждую лунку планшета с КХеазу 96 вносили по 0,8 мл К^1-буфера (Ц1адеп® набор КХеазу 96). Содержащий КХеазу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Содержащий КХеазу 96 планшет помещали в верхнюю часть другого чистого блока с квадратными лунками (типа 8циаге-^е11 В1оск), скотч удаляли и в каждую лунку содержащего КХеазу 96 планшета вносили по 0,8 мл КРЕ-буфера (Ц1адеп® набор КХеазу 96). Содержащий КХеазу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли и в каждую лунку содержащего КХеазу 96 планшета вносили еще по 0,8 мл КРЕ-буфера (Ц1адеп® набор КХеазу). Содержащий КХеазу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли, содержащий КХеазу 96 планшет помещали в верхнюю часть адаптора, содержащего предназначенные для сбора образцов микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл. РНК элюировали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл свободной от РНКазы воды, запечатывая планшет новым куском скотча и инкубируя в течение 1 мин при комнатной температуре. Планшет затем центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Стадию элюирования повторяли, используя второй объем, равный 50 мкл свободной от РНКазы воды. Микроцентрифужные пробирки с общей клеточной РНК хранили при -70°.

Количественная оценка общей клеточной РНК.

РНК оценивали количественно с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Отпаписз®), используя набор для количественной оценки РНК типа КАоОгееп® (Мо1еси1аг РгоЬез®). В целом, метод состоит в следующем: реагент КАоОгееп разбавляли в 200 раз ТЭ (10 мМ Трис-НС1 рН=7,5, 1 мМ ЭДТК). Как правило, 50 мкл реагента разбавляли 10 мл ТЭ. Образцы рибосомной РНК для построения стандартной кривой разбавляли в ТЭ до 2 мкл/мл и затем предварительно определенные количества (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 и 0 мкл) раствора рибосомной РНК переносили в новый 96-луночный планшет (СО8ТАК № 3997) и объем доводили до 100 мкл с помощью ТЭ. Как правило, колонку 1 96-луночного планшета использовали для построения стандартной кривой, а другие лунки использовали для количественной оценки образцов РНК. По 10 мкл каждого образца РНК, подлежащего количественной оценке, переносили в соответствующую лунку 96-луночного планшета и добавляли по 90 мкл ТЭ. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили по одному объему (100 мкл) разбавленного реагента К1ЬоОгееп и инкубировали в течение 2-5 мин при комнатной температуре, защищая от света (10 мкл образца РНК в 200 мкл конечного объема, т.е. 20-кратное разбавление). Интенсивность флуоресценции каждой лунки оценивали с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Иупатюз®). Стандартные кривые получали на основе известных количеств рибосомной РНК и соответствующей им интенсивности флуоресценции. Концентрацию РНК в экспериментальных образцах определяли, исходя из стандартной кривой, и корректировали с учетом 20-кратного разбавления.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
ϋΕΡΟ	81§та	ϋ5758	4°С
ЭДТК	81дта	Е5134	к.т.
Основание Тпгта	81дта	Т8524	к.т.
Тпгта-НС1	81дта	Т7149	к.т.
Адапторы с пробирками для сбора	(Дадеп	19562	к.т.
Набор для количественной оценки РНК типа К1Ьо§гееп	Мо1еси1аг РгоЬе	К11490	-20°С
Набор типа КХеазу 96	(Дадеп	74183	К.Т.
Блоки с квадратными лунками	(Дадеп	19573	к.т.

ОТ-ПЦР, проводимая в реальном времени.

ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью системы для анализа последовательности АВ1 Рпзт 7700 с использованием набора ТацМап ΕΖ К.Т.-РСК (фирмы Регкш-Е1тег Аррйеб Вюзуз1етз®). ОТ-ПЦР оптимизировали для количественной оценки 5'-1КЕ8 РНК НСУ с помощью технологии Тацтап (фирма КосИе Мо1еси1аг И1адпоз11сз 8уз1етз), которая аналогична методу, описанному ранее у Маг!е11 и др. I. С1ш. М1сгоЫо1. 37, 1999, сс. 327-332. Система основана на 5'^3' нуклеолитической

- 15 007739 активности ДНК-полимеразы Αтр1^Τа^. В целом, метод состоит в следующем: для его осуществления использовали фторогенный гибридизующийся зонд с двойной меткой (ΡϋΤΚ-зонд), который специфично ренатурирует матрицу между ПЦР-праймерами (праймеры 8125 и 7028). 5'-Конец зонда содержит флуоресцентный репортер (6-карбоксифлуоресцин [ΕΑΜ]), а 3'-конец содержит гаситель флуоресценции (6карбокситетраметилродамин [ΤΑΜΚΑ]). Спектр испускания репортера ΕΑΜ подавляли гасителем на неповрежденном гибридизующемся зонде. Расщепление гибридизующегося зонда высвобождало репортер, что приводило к повышению испускания флуоресценции. С помощью анализатора последовательности типа ΑΒΙ Рг1зт 7700 непрерывно осуществляли определение повышения испускания флуоресценции в процессе ПТЦР-амплификации, при этом количество амплифицированного продукта прямо пропорционально сигналу. Зависимость амплификации от времени анализировали на ранней стадии реакции, в момент времени, соответствующий логарифмической фазе накопления продукта. Точку, представляющую собой определенный порог обнаружения повышения сигнала флуоресценции, связанного с экспоненциальным увеличением количества ПЦР-продукта для анализатора последовательности, обозначали как порог цикла (С_т). Значения С_т обратно пропорциональны количеству введенной РНК НСУ; т.е. при одинаковых условиях ПЦР чем больше исходная концентрация РНК НСУ, тем ниже значение С_т. Стандартную кривую строили автоматически с помощью системы обнаружения ΑΒΙ Рпзт 7700 путем построения графика зависимости С_т от каждого стандартного разведения с известной концентрацией РНК НСУ.

В каждый планшет для осуществления ОТ-ПЦР вносили эталонные образцы для стандартной кривой. РНК репликона НСУ синтезировали (посредством транскрипции Т7) ίη νίΐΐΌ, очищали и количественно оценивали по величине ОП₂₆₀. С учетом того, что в 1 мкг этой РНК содержится 2,15x10¹¹ копий РНК, осуществляли такие разведения, чтобы получать 10⁸,10⁷,10⁶,10⁵,10⁴,10³ или 10² копий геномной РНК/5 мкл. В каждое разведение включали также общую клеточную РНК линии Ний-7 (50 нг/5 мкл). 5 мкл каждого эталонного образца (РНК репликона + РНК Ний-7) объединяли с 45 мкл реагента Μίχ и применяли в проводимой в реальном времени ОТ-ПЦР.

Проводимую в реальном времени ОТ-ПЦР осуществляли также с использованием экспериментальных образцов, которые очищали в содержащих ЕЦеазу 96 лунках планшета, объединяя 5 мкл каждого образца общей клеточной РНК с 45 мкл реагента Μίχ.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
Набор ТацМап ΕΖ К.Т.РСК	РЕ Αρρίΐβά ВюзузТетз	N808-0236	-20°С
Оптические колпачки типа М1сгоАтр	РЕ АррИеб ВюзузТетз	N801-0935	К.Т.
Оптический 96луночный реакционный планшет типа МтсгоАтр	РЕ АррНес! ВюзузТетз	N801-0560	К.Т.

Состав для приготовления реагента Μίχ.

Компонент	Объем для 1 образца (мкл)	Объем для одного планшета (мкл) (объем для 91 образца + «мертвый» объем)	Конечная концентрация
Свободная от РНКазы вода	16,5	1617
5 х буфер ТацМап ΕΖ	10	980	1х
Мп(ОАс)2 (25мМ)	6	588	3 мМ
дАТФ (ЮмМ)	1,5	147	300 мкМ
дЦТФ (ЮмМ)	1,5	147	300 мкМ
дГТФ (ЮмМ)	1,5	147	300 мкМ
дУТФ (20мМ)	1,5	147	600 мкМ
«Прямой» праймер (ЮмкМ)	1	98	200 нМ
«Обратный» праймер (ЮмкМ)	1	98	200 нМ
РиТК-зонд (5мкМ)	2	196	200 нМ
ДНК-полимераза гТ1й (2,5 ед./мкл)	2	196	0,1 ед./мкл
АшрЕгазе ΕΓΝΟ (1 ед./мкл)	0,5	49	0,01 ед./мкл
Общий объем	45	4410

- 16 007739

Последовательность «прямого» праймера (АЕЕ) Ш N0. 1):

5' - АСО САО ААА ОСО ТСТ АОС САТ ООС ОТТ АОТ - 3' Последовательность «обратного» праймера (АЕЕ) Ш N0. 2): 5' - ТСС СОО ООС АСТ СОС ААО САС ССТ АТС АОО - 3'

Примечание: эти праймеры обеспечивают амплификацию области, состоящей из 256 нуклеотидов, которая присутствует в 5'-нетранслируемой области НСУ.

Последовательность РИТК-зонда (8ЕЦ Ш N0. 3):

| 6РАМ |- ТОО ТСТ ОСО ОААССО ОТО АОТ АСА СС - [ГЛМКА|

Несодержащие матрицы контроля (НМК): на каждом планшете по 4 лунки использовали в качестве «НМК». Для получения таких контролей в каждую лунку вместо РНК вносили 5 мкл воды.

Условия проведения реакции в термоячейке:

50°С	2 мин
60°С	30 мин
95°С	5 мин
95°С	15с Ъ
	г 2 цикла
60°С	1 мин ->
90°С	15 с Ί
	> 40 циклов
60°С	1 мин

После завершения ОТ-ПЦР для анализа данных необходимо определять порог обнаружения сигнала флуоресценции для ПЦР-планшета, и для этого получали стандартную кривую путем построения графика зависимости значения Ц от количества копий РНК, применяемых в каждой эталонной реакции. Значения С_ь полученные для анализируемых образцов, использовали для определения путем интерполяции количества копий РНК на основе стандартной кривой.

И, наконец, количество копий РНК стандартизовали (на основе количественной оценки РНК, экстрагируемой из лунки с клеточной культурой, с помощью набора КаЬоОгееп КПА) и выражали в виде геномных эквивалентов/мкг общей РНК [г.э./мкг].

Количество копий РНК [г.э./мкг] для каждой лунки планшета с культурой клеток принимали за меру количества реплицирующейся РНК НСУ в присутствии различных концентраций ингибитора. Ингибирование в % рассчитывали с помощью следующего уравнения:

100-[(г.э./мкг инг.)/(г.э./мкг контр.)х100]

Для обработки данных зависимости ингибирования от концентрации применяли основанную на модели Хилла аппроксимацию нелинейной кривой и значения концентрации, обеспечивающей 50%-ную эффективность (50%-ное ингибирование) (ЕС₅₀), рассчитывали с помощью программного обеспечения 8А8 (8БаБ1811са1 8оП\\аге 8уз1еш; 8А8 1118Ши1е, 1пс. Кэри, шт. Северная Каролина).

При оценке соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, с помощью описанных выше ферментативных анализов и анализов на клеточных культурах выявлена их высокая активность. Более конкретно, установлено, что значения 1С₅₀ соединений составляли менее 0,1 мкМ при анализе П83-Л84А-протеазы, а значения ЕС₅₀ составляли менее 0,5 мкМ при анализе репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Пример 11. Анализы специфичности.

Анализы специфичности, применяемые для оценки избирательности действия указанного соединения, соответствуют описанным в АО 00/09543.

Когда соединения оценивали в опытах по определению специфичности, то было установлено, что соединения формулы (I) обладали селективностью, т.е. они не вызывали существенного ингибирования эластазы лейкоцитов человека и катепсина В.

Пример 12. Фармакокинетические свойства.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают также удовлетворительными фармакокинетическими свойствами, такими как значительные уровни в плазме крыс через 1 и 2 ч после орального введения дозы 4 или 5 мг/кг.

Более конкретно, для оценки уровней в плазме крыс тестируемых соединений после орального введения применяли следующий анализ, основанный на оценке ίη νίνο абсорбции после орального введения.

Материалы и методы.

1. Метод, применяемый для группировки соединений (отбор с помощью «кассет»).

Отбор соединений, предназначенных для объединения в «кассету», был основан на их структурном сходстве и физикохимических свойствах. Был разработан метод твердофазной экстракции, применимый для всех отобранных соединений. Данные начального тестирования, при котором каждое соединение вводили в плазму крыс и с помощью ЖХВР или ЖХВР-МС анализировали каждое соединение, взятое в концентрации 0,5 мкМ, с определением времени удерживания, ионной массы и возможности разделения соединений с помощью ЖХВР и/или ЖХВР/МС, использовали для объединения 3-4 соединений в одну

- 17 007739 «кассету».

2. Подготовка носителя и соединения для орального введения.

Каждая «кассета» содержала 3-4 соединения, каждое в концентрации 5 или 4 мг/кг. Кассету приготавливали в виде суспензии для орального введения, содержащей 0,5% водной метилцеллюлозы и 0,3% полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеата (Твин-80). Объем вводимой дозы составлял 10 мл/кг, и ее вводили через оральный желудочный зонд.

3. Применяемые дозы и отбор образцов плазмы.

Самцов крыс Бргадис Эа\\'1су содержали в индивидуальных клетках в течение ночи, и животные имели доступ к водной 10%-ной декстрозе. Каждую «кассету» вводили 2 крысам. Образцы плазмы (~1 мл) получали через 1 и 2 ч после обработки у каждой из 2 крыс и объединяли для экстракции и анализа.

4. Экстракция и анализ соединений.

Для каждой «кассеты» образцы плазмы, полученные через 1 и 2 ч, образцы контрольной плазмы, образцы контрольной плазмы, в которую вводили все соединения, каждое в концентрации 0,5 мкМ, экстрагировали с помощью метода твердофазной экстракции. Для сравнения образцы анализировали с помощью ЖХВР и ЖХВР/МС. Концентрации в плазме определяли на основе одной концентрации стандарта, составляющей 0,5 мкМ.

Результаты.

При оценке предлагаемых в настоящем изобретении соединений, описанных в примерах 1-8, с помощью указанного выше метода отбора выявлены их высокие уровни в плазме через 1 и 2 ч после орального введения, при этом усредненные уровни в плазме крови составляли 0,83 и 0,75 мкМ соответственно.

Эти результаты демонстрируют, что предлагаемые в настоящем изобретении трипептидные соединения обладают представлящим интерес уровнем абсорбции ίη νίνο после орального введения в сравнении с низким уровнем абсорбции после орального введения, характерным в целом для этого класса пептидов. Способность к абсорбции после орального введения делает указанные соединения перспективными для лечения инфекции, вызываемой НСУ.

Перечень последовательностей <110> Бёрингер Ингельхайм Интернациональ ГмбХ <120> Гетероциклицеские трипептиды в качестве ингибиторов вируса гепатита С <130> 13/107 <150> 2,369,970 <151> 2002-02-01 <160> 3 <170> ГазББЕО для версии Иьпдомз 4.0 <210> 1 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> прямой праймер <400> 1 асдсадааад сдбсбадсса бддсдббадб 30

- 18 007739 <210> 2 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> обратный праймер <400> 2 бсссддддса сбсдсаадса сссбабсадд 30 <210> 3 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> РОТК-зонд <400> 3

ЕддбсЕдсдд аассддЕдад Басасс 26

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (I) в котором К¹ обозначает гидрокси или ΝΗ8Ο2Ε^1Α , где К^1А обозначает С1-С₈алкил, С₃-С₇циклоалкил или С₁-С₆алкил-С₃-С₇циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, ОС₁-С₆алкил, амидо, амино или фенил, или К^1А обозначает С6- или С10арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С1-С6алкил, ОС1-С6алкил, амидо, амино или фенил; К² обозначает трет-бутил, -СН2С(СН₃)₃ или -СН₂-циклопентил; К³ обозначает трет-бутил или циклогексил и К⁴ обозначает циклобутил, циклопентил или циклогексил; или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, ИН8О₂Ме, ИН8О₂циклопропил или ΝΗ8Ο₂ΡΕ.
3. 3. Соединение формулы (I) по п.2, в котором К¹ обозначает NΗ8Ο₂Ме или гидрокси.
4. 4. Соединение формулы (I) по п.3, в котором К¹ обозначает гидрокси.
5. 5. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-4, в котором К² обозначает трет-бутил или СН₂С(СН3)3.
6. 6. Соединение формулы (I) по п.5, в котором К² обозначает СН₂-С(СН₃)₃.
7. 7. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-6, в котором К³ обозначает трет-бутил.
8. 8. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-7, в котором К⁴ обозначает циклопентил или циклогексил.
9. 9. Соединение формулы (I) по п.8, в котором К⁴ обозначает циклопентил.
10. 10. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает СН₂-С(СН₃)₃, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.
11. 11. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² и К³, каждый, обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.

    - 19 007739
12. 12. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает СН₂-С(СН₃)₃, Я³ обозначает циклогексил и К⁴ обозначает циклопентил.
13. 13. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает СН₂-С(СН₃)₃ и К³ и К⁴, каждый обозначает циклогексил.
14. 14. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает циклопентилметил, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклобутил.
15. 15. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает СН₂-С(СН₃)₃, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклобутил.
16. 16. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает ХН8О2Ме, К² обозначает СН2-С(СН₃)₃, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.
17. 17. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает ΝΉ8Ο2ΡΗ, К² обозначает СН2-С(СН₃)₃, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.
18. 18. Применение соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.