DK173804B1

DK173804B1 - Depolymeriserede naturlige hepariner, heparansulfater eller dermatansulfater med en antithrombotisk, fibrinolytisk, antiinflammatorisk aktivetet, fremgangsmåde til fremstilling heraf samt farmaceutiske midler indeholdende disse

Info

Publication number: DK173804B1
Application number: DK198700157A
Authority: DK
Inventors: Giuseppe Mascellani; Pietro Bianchini
Original assignee: Opocrin Spa
Priority date: 1985-05-17
Filing date: 1987-01-13
Publication date: 2001-11-05
Also published as: CN86104301A; HUT46028A; CA1283098C; DK15787A; IL78772A0; DD251355A5; AU5953386A; WO1986006729A1; EP0221977A1; AR240461A1; JP2510177B2; CN1009096B; DK15787D0; AU601910B2; US4973580A; JPS63500184A; IT1214609B; DE3673329D1; IL78772A; IT8520769A0

Description

i DK 173804 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til depolymerisering af naturlige hepariner, heparansulfater og dermatansulfater.

Opfindelsen angår ligeledes de hidtil ukendte resulterende produkter af fremgangsmåden samt de hermed forbundne farmaceutiske midler med antithrombotisk, antiinflammatorisk 5 og fibrinolytisk aktivitet.

De resulterende produkter har en høj kapacitet til at hæmme Xa-faktoren, en høj antithrombotisk aktivitet, en ringe eller ingen antikoagulerende aktivitet, en høj fibrinolytisk aktivitet og en antiinflammatorisk aktivitet.

De nævnte produkter er også udstyret med en god biolilgængelighed, efter oral indgift, 10 hvilket skyldes oligomeremes reducerede molekylvægt i sammenligning med udgangspoly-saccharideme.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at polysaccharideme i en 10-20% vandig opløsning ved en temperatur mellem 20° og 70°C underkastes en radikalreaktion, som initieres af et radikal i nærværelse en katalysator valgt blandt Cu++, Fe++, Cr+++ og 15 Cr20/\

Depolymerieerlnjsproduktet isoleres sædvanligvis 1 fast tilstand fra reaktionsopløsningen ved udfældning aed opløsningsmidler eller aed kvaternære aaaoniumbaser.

De resulterende ol1gosaccharlder omdannes sædvanligvis til 20 salte aed alkallmetaller, såsom natrium, kalium eller llthlua, eller med JordalkalImetaller såsom calcium eller magnesium.

Det erkendt, at heparin med en lav molekylvægt, dvs. mellem 3.500 og 8.000 d, har en mærkbar antithrombotisk aktivitet, soa er forbundet med Ingen eller en ringe antikoagulerende virkning.

2 DK 173804 B1

Desuden er fragienter af dermatansu1fat Indeholdende mindst 12-14 sukkerrester og resulterende fra en nedbrydning med per -Jodsyre (Tollefsen DM. Nouv. Rev. Fr. Haematol., 26, 233, 1984) og fraktionering på en affinitetssøjle rapporteret som 5 varende udstyret »ed en mcrkbar aktivitet på heparin cofaktor II, idet denne aktivitet var højere end aktiviteten af det ufraktionerede deraatansu1fat. På den anden side kendes ingen produkter af depolymerlsering af andre chondroitinsulfater og heparansulfater.

10

Forskellige fremgangsmåder til depo1 ymer i s er i ngen af naturligt heparin er beskrevet I litteraturen. En fremgangsmåde, som er egnet til opnåelse af 1avmo1eky1*re forbindelser, består i den deamlnative hydrolyse af heparin med salpetersyrling i en for-15 tyndet opløsning. De resulterende forbindelser er karakteriseret ved en terminal rest bestående af 2,5-anhydromannose (I) :

C«2OR

20 J-O

OH

/\TxCH0 (I.

OH i

H

25 R = H, SO

(US-patentskrift nr. 4.438.261, W0 82/03827, publiceret 28. okt. 1982, europæisk patentansøgning nr. 0048231).

30

Der er også beskrevet en fremgangsmåde til alkalisk hydrolyse på heparin (eur. patentansøgning nr. 0040144) eller på heparln-alkyl- eller -arylestere (eur. patentansøgning nr. 0044228), som ved β-elimlnering fører til oligomerer med en middelmole- kylvcgt på 2.000-9.000 d, og som viser den umcttede sukker 35 (II) som den terminale gruppe: 3 DK 173804 B1

CH OSO H

I I

l_o )-o 5 f ^-O-/ iIT) \pH / \$H /

H OR* NHSO^j H

10 R' = S0JH

R = COOH

Udbytterae ved denne fremgangsnåde er meget lave.

En anden depolymeri seringsnetode består 1 den enzymatiske hy-1 5 drolyse af heparin med heparinase i meget fortyndede opløsninger og »ed et meget lavt udbytte, og aed dannelse af sukker (III) og glucosamin 1 en hemiacetalform (IV)

KOOH) Cfi oso H

/—°\ F-< //éooH V o_J )-0-( Von \ OH / * ^ \ OH / 25 (III) (iv) R =» H, SO^H 30 son terminale grupper (eur. patentansøgning nr. 0064452, J. Biol. Chem., 257, 7310. 1962).

Der er også beskrevet fremgangsmåder til heparlndepolymerlse- ring, som er baseret på anvendelsen af oxidationsnidler såsom alkaliske perjodater, der oxiderer bindingen mellem de proxl-nale C2-C3~hydroxylgrupper 1 de usulfaterede uronsyrer med heraf følgende labilisering af den glucosidlske binding (Casu 35 4 DK 173804 B1 B. "Structure and Biological Activity of Heparin", Advances in Carbohydr. Che·. Blochem. bind. 43, 1985, 51-134, Acad. Press).

Andre freagangsmåder er baseret på den kombinerede virkning af hydrogenperoxid og den sure pH-verdi på heparin ved en høj

D

temperatur (125eC) under tryk. Der sker en depolymeriserlng med heraf følgende endring og mulige svekkelse af oligomerer-nes aktivitet (eur. patentansøgning nr. 0101141, publiceret 22. aug. 1984 ) .

Andre fremgangsmåder er baseret på den sure depolymeriserlng v.h.a. svovlsyre og en samtidig eller efterfølgende gensulfa-tering med en blanding af chlorsulfonsyre (Nagasawa K. et al., Arhiv. Biochem. Biophys., 150, 451, 1972, fransk patentansøgning nr. 2.538.404).

15

Alle disse fremgangsmåder, som er beskrevet i laboratorlemåle~ stok, er karakteriseret ved lave udbytter og en dårlig reproducerbarhed, hvilket er vssentligt ved opskalering til en preindustriel og industriel målestok.

20 I den italienske patentansøgning nr. 40021 A/83, som svarer til europeisk patentansøgning nr. 0121067, beskrives en fremgangsmåde, hvori der samtidigt anvendes hydrogenperoxid, as-corbinsyre og kobberacetat til opnåelsen af ol igosaccharider 25 med en egnet molekylvagt.

I denne opfindelse forekommer der temmeligt forlcngede reaktionstider, d.v.s. op til 24-48 timer, og sterkt fortyndede heparlnopløsninger med heraf følgende lave udbytter. Desuden er de resulterende depolymeriseringsprodukter forurenede med 30 ascorbinsyrenedbrydningsprodukter.

Det har nu overraskende vist sig, at ethvert polysaccharid af typen hepariner og heparinsuffater og derma tansul fa ter kan depolymeriseres i en vandig 35 opløsning ved koncentrationer, som er endnu højere end 10-15%, ved temperaturer mellem 20 og 70°C i løbet af få timer ved en radikalreaktion, som initieres af et radikal, fx · 0H-radikalet, der dannes 1 en vandig opløsning fra en persyre 5 DK 173804 B1 eller et peroxid såsom pereddikesyre, hydrogenperoxid, 3-chlorperbenzoesyre, cumenhy-droperoxid, natriumpersulfat eller benzoylperoxid, i nærværelse af en katalysator i en koncentration mellem 0,1 og 0,001 M og bestående af et metal såsom Cu++, Fe++,

Cr* + + eller et anhydrid såsom Cr207'\

Freagangsaåden ifølge den foreliggende opfindelse giver de ^ neden for nævnte fordele i forhold til de allerede kendte aetoder: - hurtighed ved udførelse, - opn&else af polysaccharlder aed den ønskede niddelaolekyl-vegt, - aulighed for også at arbejde i stor aålestok 1 høje koncen-10 trationer af biopolyaer, soa skal depo 1 yaer1 seres, således at der Ikke kraves nogle efterfølgende og dyre processer til opkoncentrering og oprensning til udvinding af de depolyaerise-rede produkter.

De resulterende oligosaccharlder er 1 alt væsentligt rene, ef-^ tersoa peroxidoadannelsesprodukterne neat kan fjernes, og ka-talyeatoraetal1 erne kan sekvestreres v.h.a. EDTA eller v.h.a. sekvestrerende harpikser soa fx dea, der bærer en funktionel imlnodieddike8yregruppe.

Der er ikke noget andet forurenende stof til stede 1 reak-tionsaassen, hvilket er ulig fx tilfældet aed den depolyaerl-20 serlngsproces, soa er baseret på anvendelsen af ascorbinsyre, og son ligger til grund for dehydroascorbinsyre, diketoglutar-syre, threoninsyre og oxalsyre (Niederaeier W. et al., 141, 336, 1967), soa alle er aulige forurenende stoffer for de depolyaeriserede polysaccharlder.

6 DK 173804 B1

Faktisk kan de 1avmo1eky1 ære produkter, der opnås ved den foreliggende depolymer i ser 1ngsfremgangsmåde, direkte isoleres fra reakt ionsaed1et, i alt væsentligt i fora af natriumsalte ved et pH-niveau omkring neutralitet og aed et lkke-opløsningsmiddel såsom methanol, ethanol, acetone eller ^ dioxan. Produktet kan renses ved dobbelt udfældning eller ved opløsning, eluerlng på en søjle af en egnet harpiks og genudfældning med methanol eller ethanol.

Produkterne ifølge den foreliggende opfindelse kan også omdannes til salte med kalium, lithium, calcium, barium eller ^0 magnesium, eller kan omdannes til salte med organiske baser såsom a idde11angkædede eller langkædede aminer.

Til omdannelsen til salte med andre kationer end natrium består den sædvanlige procedure 1 frigivelsen af heparinsyre eller af syrerne svarende til dermatansulfat eller heparansul-2^ fat på en kationbyttersøjle og den efterfølgende omdannelse til salt med den ønskede kation.

01lgosacchariderne Ifølge den foreliggende opfindelse har hovedsageligt de reducerende terminale grupper på Cj-carbon af typen V og VI.

20 ch2or2 <COOH) / V /cOOH \

r O—\ WOH R50 / VyOH

R< \?R3 / \θΗ / NHR 0R' (V) <VI) R - SO3H, Ac

For heparin og Rx » R2 = R3 = H, SO3H

heparansulfat R4 = uronsyre R5 = amlnosukker 7 DK 173804 B1 R - Ac

For deraatansulfat Ri ~ ” H

R3 = uronsyre R4 = SO3H

5 R5 ·* 4,0-sulfateret, N-acetyleret falactosaiin

De nævnte terminale grupper kan let oxideres til aldonater, f.eks. med NaIO, eller reduceres til alkoholer med f.eks. NaBH4.

Fremgangsmåden Ifølge den foreliggende opfindelse endrer ikke Indholdet af "S03H-grupperne, soa er vigtig for den biologiske 10 aktivitet, hvilket fremgår af “S03ff-*kv/-C00H-*kv-forholdet, der udledes i depolymeriseringsprodukterne i sammenligning med udgangsprodukterne.

Den nævnte fremgangsmåde kan holdes under kontrol og blive afbrudt ved et ønsket depolymeriseringsomfang med heraf følgende væsentlige fordele, som vil fremgå for fagfolk indenfor området.

15

Fremgangsmåden styres ved at vurdere mlddelmoleky1vagten eller en oligomers biologiske aktivitet, soa er direkte forbundet med dens alddelmolekylvmgt, såsom fx APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) eller aktiveret anti-faktor X-aktivitet.

Fremgangsmåden kan standses efter ønske ved at senke reak-tions-pH-verdien eller temperaturen, eller ved at afbryde dannelsen af radikaler eller ved at heane aed en kendt inhibitor såsom SOD, katalase eller p-oxybenzoater.

Produkterne Ifølge den foreliggende opfindelse bar en delmolekylvegt mellem 2.000 og 7.000 d.

25 8 DK 173804 B1

De farmaceutiske midler ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de som aktiv bestanddel indeholder de ovenfor beskrevne fraktioner af naturlige polysaccharider. Til det formål formuleres de omhandlede forbindelser ved hjælp af konventionelle teknikker og excipienter som farmaceutiske midler, som er egnede til parenteral, topisk og oral 5 indgift.

Eksempler p& formuleringer, so· er egnede til parenteral Indgift, omfatter sterile opløsninger Indeholdt i ampuller.

Eksempler på formuleringer, som er egnede til oral indgift, omfatter kapsler, tabletter og sirupper, hvori den aktive bestanddel også kan vere båret i form af liposomer eller miceller.

^ Eksempler på topiske formuleringer er salver omfattende de scdvanllge excipienter, der er kendt Inden for området.

De nedenfor angivne eksempler illustrerer opfindelsen.

Eksempel i 15 305 g HPA 116-7 rå heparin hmldes sammen med 300 g natrium- chlorid og 300 g natriumacetatdihydrat i en reaktionsbeholder sammen med 2 liter vand.

Så snart der er sket opløsning heraf, tilsmttes et salt svarende til 4,35 g divalent kobber opløst i 300 ml vand. En opløsning af 1000 ml 15* hydrogenperoxid og en normal opløsning af NaOH tildryppes separat og under konstant omrøring for at holde pH-verdien på en vmrdl på 7,5 under reaktionsforløbet. Tildrypning og omrøring fortsmttes 1 2 timer. Reaktions- 9 DK 173804 B1 assens temperatur holdes på 45-60"C. Reaktionsmassen afkøles derefter til stuetemperatur og tilsmttes 17 g di natri urnethy-lendlamlntetraacetatdihydrat (EDTA). pH-vmrdien justeres til en vmrdi på 5,9 med eddikesyre.

Depolymer1 seret heparin udfmldes med 7,9 1 methanol. Bundfal-5 det, der opsamles på et filter, opløses igen 14 1 vand og tilsmttes 75 g natriumacetatmonohydrat og 4 g EDTA. Den resulterende opløsning, som justeres til pH-verdi 5,8 ned eddikesyre, behandles ned 8 1 methanol. Det resulterende bundfald opsamles ved filtrering, vaskes ned methanol og acetone og tørres.

^ Der opnås 255 g (83,8% udbytte) af en lavmolekylmr, hvid heparin (OP 85/0201) med følgende karaktertrek: nlddelmoleky1vmgt 4200 (Hilborn J.C. og Anastassi adis, Anal. Biochem. 39, 88, 1971), U-APTT 33 19 (Basu D. et al.. N. Engl . J. Hed. 287, 324, 1972), U-aXa 81.7 (Teien A.N. et al., Thromb. Res., 8.

413, 1976). Den rå udgangsheparin havde følgende respektive *5 egenskaber: 13.700, 170,7, 166,8.

Eksempel 2 200 g 116,7 HFA-heparin indføres i en ternostateret reaktions-beholder sammen med 200 g natriunacetattrihydrat og 200 g natr iunchlor id. 2100 ml af en 0,02 M opløsning af et cupri- ^ kobbersalt tilsmttes. Når der er sket opløsning heraf, til-dryppes separat 500 ni 19% hydrogenperoxld og N NaOH i et 15-ainutters tidsinterval for at holde reaktionsmassens pH-værdi på 7,2. I den Indre reaktionsbeholder varierer temperaturen mellem 35 og 50°C.

25 30 g natrium-EDTA tilsmttes 60 min. efter reaktionens start.

Opløsningen Justeres med eddikesyre til pH-verdi 5,9, og produktet udfcldes med 2 voluminer MeOH.

Bundfaldet vaskes med acetone og opløses straks igen (uden nogen tørring) 12 1 vand. 5 g EDTA og 50 g natriumacetat tilscttes. pH-verdien Justeres til 6, og der tilsmttes 2,5 voluminer MeOH under omrøring.

Efter filtrering, anhydratisering med acetone og tørring opnås 183 g råprodukt med koden 0P84/2810 i et udbytte på 91,5% og med de 1 tabel I viste karaktertrek.

10 DK 173804 B1

X X

r—i O σ' 0 O n 1/1 ω <J * "

i I fN fN

> > % i _________ 5 1 df> . *· *· CO M3 U3

0 P rN <N

U >,

O W

o O

o« N

(/> O ^

H »-H

10___ y ' o o

>H o CO

m rn

Q) -P

s >___ 15

P

•5S

6 > u"i r- > . m 1—1 M >-< '—<

^ > J

W c c 2 - < 20 g ___^___ m OO <1 I X % ^ 4J (0 \θ Cv| ^ * V£> <0 13 —* 25 g--- u

•h H

> E-t r* ^

Ou v ^ c < o ™ t—i i r- 13 —i 30 r-

V

-P

•Μ Ή P Η H \

Ό <r O

O Q, *00^1 H <U H O. Ά

(¾ X 0 O N

35 11 DK 173804 B1

Kobberindholdet resulterer I at være 3,93 ppn.

Den antithromboti ske aktivitet (Ant. akt.) blev vurderet in vivo i overensstemmelse med metoden Ifølge Reyers S., Mussonl g L·., Donatl M.B., De Gaetano G., Thromb. Res. 18. 699, 1980, efter Intravenøs Indgift. Svovl og uronsyrer blev målt poten-tlometrisk efter fjernelse af en mulig uorganisk surhed ved kromatografi på en anionisk søjle (OH“-form), og frigivelse af heparinsyre gennem overførsel på en kationisk søjle (H+). Por-2Q holdet mellem de to titreringsprofiler svarer til *kv "S03H/ ækv “COOH.

Bi o111 gænge 11ghed efter oral indgift Når produktet Indgives ad den intraileale vej v.h.a. en egnet 15 bmrer bestående af en lipldfase og et overfladeaktivt middel, som er egnet til at sikre et stabilt mice11esystem (Stanzani L., Mascellanl G., Corbelli G.P., Bianchini P.. J. Brit.

Pharmacol., 33, 783, 1981) i venethrombosemodellen i overens stemmelse med Reyers et al., opnås de nedenfor rapporterede ED 20 50-v*rdier for halvering af trombevægtene.

HFA - 116,7 - 7,5 mg/kg OP 84/2610 - 3,25 mg/kg

Eksempel 3 25 I en reaktionsbeholder forsynet med et termostateret bad, om-rører, kalibrerede dråbetragte og termometer indføres 1 kg HFA 15 rå heparin, 0,495 kg natriumchlorld og 1 kg natriumacetat, som opløses med 10 1 vand. 46 g kobberacetatmonohydrat opløst 30 ill vand tilsættes derefter, temperaturen justeres til 35eC, og i løbet af 2,5 timer tilsættes separat en opløsning af N NaOH dertil for at justere pH-verdien til 7,5, og en 9¾ hydrogenperoxidopløsning. Den indre temperatur kontrolleres samtidigt for at tillade et forløb fra 35*C til 60eC.

I løbet af reaktionen udtages prøver med regelmæssige tidsintervaller for at kontrollere de parametre, som vedrører in vi-tro-akti vi teten (U-APTT og U-aXa) og mlddelmo1ekylvægten.

35 12 DK 173804 B1

Ved reaktionens afslutning tilsættes 90 g EDTA, pH~værdien justeres til 5,9 aed 30¾ eddikesyre, og der tilsættes 44 1 ae - thanol til reaktionsmassen.

Det dannede bundfald opsamles ved filtrering, vaskes med »e-5 thanol og opløses igen i 10 1 vand.

Den resulterende opløsning tilsættes 350 g natriumacetat, 20 g EDTA og, efter Justering af pH-værdien til en værdi på 5,8, 20 1 methanol. Det dannede bundfald opsamles, vaskes med methanol 10 og acetone og tørres. Der opnås 845,5 g (84,5¾ udbytte) af en lavmolekyler, hvid heparin med følgende karaktertræk: molekylvægt: 4.600 d U-APTT 34,4, U-aXa 72,5.

15 Mønsteret for oligomerernes alddelmolekylvægte på de forskel lige trin af den foreliggende fremgangsmåde samt de herned forbundne analytiske karaktertræk og biologiske aktiviteter er angivet 1 den følgende tabel 2.

20 13 DK 173804 B1

I X

r-ι O

O O

t/j /j in r» °o -r* O O O >t > > K ^ 5 IS -¾ ~ u __a *> Λ g

Q) CM '-O

G OO O ^ ST

>1 .. ° tn u~i r~ co

C CM CM CM

10 g ____c

<D

P

aa CM 00 m S' cn r~ cn mj C;

». " ** _I

CO CTi O ^ M — ------ dj m

1 = rH CM

15 „ O σν nj -> O £ CTi X ' ,—I -

<0 (" σ' ι~> n Q) O

I O 0O Γ" C~~ rjj

O -η Ό II

Ή ___E ^ CM £ i- φ 00 ,jj e- r~ τ <m r-im 20 ω cl. -**··' η id HJ < .0 00 MJ CM O cO μ- φ ,-| <3 I CM <T> 0O lO u"> O ro g *.

F-c 3 H ► o

C! CN

0)

----Ή I

m c

“j -H X

O 1-1 y η Λ _ ϋ) ΙΛ B >1 O O O O O O O Gin oc OOOOOOO o o d 5 7 N T H o> n M3 -H oo

rrt JL Γ-l C7\ CO >0 u"> <T -P O

3 >1 * s s* ® °

' .............. " GO

G

O II

S

3 O ..

30 Jtj m <d -d Ό

H .....J SS

5 O <n O O O O O' O' s ^ ~ -p 5 « IH S g, ^ Ή V-< <u 35 * 14 DK 173804 B1

Det resulterende råprodukt opløses 161 vand og perkoleres på en anionbytterharpikssøj1e, som er starkt basisk 1 en 0H_-form (ambe r 11 te type) ( 100 0 x 650 am) aed en hastighed på ca. 2 voluminer/time. Eluatet tilsettes eddikesyre til pH-vardi 5 og 5 perkoleres på 2 1 af en mildt sur chelatdannende harpiks.

Eluatet giver, efter udfaldnlng ned methanol, 803,2 g sterkt oprenset lavmolekyler heparin (LMW OP 144). Atomabsorptions-testen viste fraveret af kobber.

Signalerne for de reducerende terminale grupper fremkommer i det anomere område af l^C-NMR-spektret, optaget ved 20 MHz i D2O, d.v.s. C-l fra N-sulfateret glucosamin (δ 92,7 ppm) og 2,0 sulfateret iduronsyre (94,4 ppm) i sammenligning med methanol som intern standard, hvis kemiske forskydning er 51,75 15 ppm.

Eksempel 4 25 g heparin, som i forvejen er depolymeri seret (0P84/0410) 2Q v.h.a. en fremgangsmåde, soa er analog aed den 1 eks. 3 beskrevne og med følgende karaktertrak: (U-APTT/ag - 7, U-aXa/ag - 52, in vivo antitrombotlsk aktivitet 116, molekylvagt 3300), underkastes en yderligere depolyaeri seringsproces som angivet nedenfor.

2 5 25 g af navnte LMW-heparin haldes i 200 ml vand sammen med 0,75 g kobberacetat. 180 ml 16% hydrogenperoxld tilsattes derefter 1 løbet af 2 timer under omrøring ved en temperatur på 65-70e C. pH-vardien holdes på 7,4 v.h.a. NaOH. Den resulterende opløsning afkøles, Justeres til pH-verdi 6, overføres 3 0 til en chelex lOOR-søjle (2,8 0 x 13 cm), derefter på en amberliteR-8øjle (IRA 400 OH'-form, 4,2 0x8 cm) og derefter på en polystyrensøjle, som er starkt sur i en H+-form.

Eluatet Justeres ned NaOH til pH-vardi 7 og frysetørres. Der 35 opnås 19,55 g (78,2% udbytte) af en lavmolekylar OP 119 heparin. Dens karaktertrak, sammenlignet med udgangsproduktets, er angivet i tabel 3.

15 DK 173804 B1 TABEL 3

*kv_-S03H

Produkt Molekylvagt S» Uronsyre* «kv “C00H

5 P85/0410 3200 10,78 31,23 2,09 VLMW OP 119 1700 7,3* 20,8* 2,12

Bemark: * en prøve af de meget lavmolekylare materialer (very low molecular weights) blev holdt tilbage fra anionsøjlen: 10 dette forklarer nedgangen i de procentvise verdier for svovl og uronsyrer. Faktisk viste akv . “S03H/ekv "COOH-vardierne sig at vere uandrede.

13C-NMR-spektret viser, ved 92,7 ppm, et meget klart signal, som kan tilskrives det anomere carbon fra N-sulfateret I 5 glucosamin. Signaler, som muligvis kan tilskrives Cj-carbon-atomerne fra henholdsvis glucuronsyre og iduron-2-O-sulfat fremkommer ved 90,9 og 94,4 ppm.

Eksempel 5 20 10 g dermatansulfat (060284 Ac/sol) med en middelmolekylvcgt på ca. 12.000 for 50% og > 25.000 for ca. 50% og med 21 U antitrombotisk aktivitet og henholdsvis 1,7 og 17 U-APTT og U-aXa, haldes 1 100 al vand sammen med 10 g natriumchlorid og 25 10 g natriumacetat. 0,45 g kobberacetatmonohydrat tilsattes.

Når der er sket opløsning heraf, tilsattes 20 al 24% hydrogen-peroxid 1 løbet af 40 »in., idet temperaturen holdes mellem 25 og 47*C og pH-vardien på 7,6 »ed NaOH.

Omrøring fortsattes 1 yderligere 20 min. Der tilsattes 0,5 g

o U

EDTA, og pH-v*rdien Justeres til β med eddikesyre. Det depoly-meriserede produkt udfcldes med 2 voluminer methanol. Den faste rest opsamles ved filtrering og opløses igen i 100 ml vand. Efter tilsatnlng af natriumacetat og 0,45 g EDTA og Justering af pH-v*rdien til 6 udfaldes forbindelsen igen med methanol.

3 v

Efter filtrering og tørring giver den opsamlede faste rest 7,1 g (71% udbytte) af et lavmolekylart dermatansulfat. Produktet, der underkastes en kemisk og biologisk analyse, gav følgende data.

16 DK 173804 B1

Midde1 no 1eky1 vegt: 3000-2800 S*: 7,4

Uronsyrer*: 28,9 Ækv S03"/*kv "COOH: 1,4 5 "In vitro"-aktivitet U-APTT: * 1 U-aXa: 29 "In vivo"-antitrombotisk aktivitet: 35.

Dernatansulfat 060284 blev fraktioneret på en Cellex D DEAE-10 cellulosesajle, aktiveret med 0,5 N HC1 under følgende

betingelser. 8 g dernatansu1fat blev kronatograferet på en søjle (2,5 0 x 55 cn), son var afbalanceret ned 0,1 M NaCl. Elueringer blev foretaget ned 2 1 0,1 M, 0,3 M og 1,5 M

NaCl-opløsninger. Eluaterne blev koncentreret, og dernatansul- fat blev udfaldet ned 2 voluminer methanol.

1 o

De testede fraktioner er sannen ned deres fraktioneringsudbytter og karaktertrek angivet i tabel 4.

17 DK 173804 B1 > M i" r* —< · nj »

> -P ·”Η CO CO

C Γ- X Ϊ C‘ rf C* 5 £ « 5 53----- * 5 I (5 r» oo O I —A ro U 3 U___________

-A

ίο ^ m o o_

*-< < cf r~I

3 cP 8 cro (7) (J ·ο- II „

> > -I -I

15 ' -¾ %__

t*P

Φ

>1 CN OD

tft - -

p; CO CO

O (NI <M

5-1 20 £ ~--- g *> ^ ® g w «Γ o“ oK ^™ ^ HH §

25 d) +5 ,-h Λ ·—i n. r-A

S >______ <#>

<U

P _J ΓΜ I'- jJ K * IT φ ^ vo jy rg fM ''-i 30 g i 1

. G O

0 -H

Ή 4-J

•P Ai «Ρ _ 3 2 S * 3 * £ S g_° ° - 35 18 DK 173804 B1

Depolyaerisering muliggør opnåelse ned godt udbytte af o 1 i go-erer aed en tilfredsstillende aktivitet, bob ellers kun kan opnås 1 aeget lavt udbytte gennem sterkt tidsforbrugende fraktioneringer .

5

Depolymeri ser ingsprodukterne har desuden en fibrino lytisk aktivitet .

Eksempel 6 10 5 g heparin aed en middelmolekylvegt på 13.700 d opløses i 100 al vand sammen aed 10 g natriumacetat. 15 ml af en 0,32 M opløsning af ferrosulfat tilsettes, og 50 ml 5,4¾ hydrogenper-oxid dryppes derefter til i løbet af 40 min. Reaktionsmassens temperatur holdes på 60eC. pH-v*rdien justeres til 7,5 aed 15 NaOH. Reaktionsaassen afkøles og filtreres på decalite. Filtratet tilsettes 0,6 g EDTA, og produktet udfeldes med 300 al methanol. Bundfaldet opsamles ved filtrering og opløses igen i 300 ml vand. 0,6 g EDTA og 18 g natriumacetat tilsettes. Den resulterende masse genudfeldes aed 800 al methanol. Depolyme-20 rlserlngsproduktet, opsamlet ved filtrering, giver efter tørring 4,8 g (92¾ udbytte) heparin aed en molekylvagt på 7.950.

Eksempel 7 2 g OP 438-7/08 heparansulfat' med en molekylvegt på 20.800

2 S

opløses i 30 al vand sammen 92 mg kobberacetataonohydrat. 15 ml 7,2¾ hydrogenperoxid opløses i løbet af 60 min., idet pH-verdien holdes på 7 aed natriumhydroxid og temperaturen på 50 " C .

30 Ved afslutningen af reaktionen tilsettes 2 g natriumacetat, 100 ag EDTA og 100 al ethanol. Det dannede bundfald opsamles ved filtrering, vaskes aed methanol og genopløses i 15 al vand. Opløsningen syrnes med eddikesyre op til en pH-verdi på 4.5 og elueres på en IRC 718 aaberlite-harpikssøJle (1.2 0 x 35 12 cm). Eluatet tilsettes 0,45 g natriumacetat ved pH-verdi 5.5 og endelig 30 al methanol.

Det depolymeriserede heparansulfat udfelder, og bundfaldet opsamles og tørres. Der opnås 1,18 g (59¾ udbytte) produkt med 19 DK 173804 B1 de karaktertrek, der er vist i tabel 5.

Tabel 5

-SOaH

5

Produkt Molekylvagt U-APTT U-aXa S% Uronsyre -COOH

HS 436-7/08 20800 5,32 19,45 5,95 23,52 1,53 LMW HS 5300 10,49 5,45 22,05 1,48 10 Eksempel 8 5 g rå heparin aed en molekylvagt p& 14.500 d heldes i 100 al af en 0,01 M opløsning af et divalent kobbersalt indeholdende 5% natriuachlorid og 5% natriumacetat. 50 ml af en 1,6 H opløsning af natriuapersulfat tilsattes under omrøring ved op-15 varanlng til 58eC.

pH-verdien holdes på den omtrentlige verdi 7 aed natriumhydroxid. Opløsningen afkøles. Det rå reaktionsprodukt udfaldes med 350 al methanol. Bundfaldet opløses igen 1 50 ml vand, 20 elueres på en anionbytterharpiks (4,2 0 x 15 cm) i 0H_-foraen og derefter på en kationbytterharpiks i H+-formen (4,2 0 x 10 cm). Eluatet, neutraliseret til pH-verdi 7 og tilsat 3 g natriumacetat, behandles med 200 ml methanol.

25 Bundfaldet, opsamlet ved filtrering, giver efter tørring 3,47 g (69,5% udbytte) sterkt oprenset heparin med en aolekylvegt på 3.900.

Ekseapel 9 30 Saltdannelse med calcium 200 g OP 146 LMW heparin aed en aiddelmolekylvegt på 4,700, 28,4 U-APTT/mg. 88,67 U-aXa/ag aed 9,55% svovl, 27,8% uronsy-rer og et R3-forhold * ekv S03H/*kv C00H - 2,08 (analyseret potentiometrisk) heldes i 2000 al vand og perkoleres på en

O O

søjle (4,2 0 x 100 cm) indeholdende en sterkt sur polystyrenharpiks i H+-formen.

20 DK 173804 B1

Det markbart sure eluat neutraliseres konstant med en opløsning af calciumhydroxid. Ved afslutning af perkoleringspro-cessen tilsettes 60 g cal c lunch 1 orid, og LMW-ca1 ciumheparin udfcldes med 2 voluminer methanol.

5

Efter tørring opnås 191 g OP 149 Ca (95,5* udbytte) calciumhe-parin, som viser en molekylvagt på 4.600 d og følgende karakter trak : S - 10,63%, uronsyre - 28,78%, R3 - 2,24 (potentiometriske 10 analyser).

Ca * 9,58% (ved atomabsorption)

Na *> 0% (ved atomabsorpt ion) U-APTT - 25,2/mg, U-aXa - 84,2/mg (analyser ved kromogen metode ) .

1 5

Praparatet viste sig at vare pyrogenfrit.

Eksempel 10

Heparin, depolymeriseret i overensstemmelse med den forelig-20 gende fremgangsmåde (0P118 K med 94,81 U-aXa (kromogen) per mg og 29,92 U-APTT/mg), blev givet til rotter ad den intraileale vej med en dosis på 35 mg/kg 1 sammenligning med heparin (ikke-depolymeriseret) givet i samme dosis. Der blev opsamlet prøver med intervaller, og den anti-aktiverede faktor X- aktivitet (aXa) blev analyseret i rotteplasma. Plasmaniveau- 2 5 erne er angivet i den følgende tabel β.

21 DK 173804 B1

Tabel 6

Produkt N# eln. pg/al AUC

LMW/0P118K 1 0 0 5 2 15 13,9 3 30 19,1 4 60 32,3 3585,7 5 90 26,5 6 120 11,7 10 7 240 5,1

Heparin 100 15 2 15 J'9 3 30 2.4 4 60 4,6 426 5 120 0,95 6 240 0,85 2 0

Den opnåede lavmolekylere (LMW) heparin har en blotllgengelig-hed, so· er 8 gange så høj soa bioti lgengellgheden for den højmolekylere heparin Ifølge saaaenligningerne af arealerne under kurven (AUC).

25 Eksempel 11

Deraatansulfat (DS), depolyaeriseret 1 overensstemmelse med betingelserne fra eks. 5, gav de i den følgende tabel 7 viste kemiske karaktertrek og aktivltetskaraktertrmk sammenlignet __ med karaktertrekkene for det udepolyaerlserede produkt.

o U 35 22 DK 173804 B1

Tabel 7

Produkt U-APTT U-aXa Molekylvægt S* Oronsyrer SO^H

COOH

5 DS 3,7 24,1 14000 6,8 27,4 1,51 LMW-DS 5,2 25,3 3000 7.7 27,8 1,87

Efter en intralleal indgift, givet til rotter i den eksperimentelle trombosemodel, gav LMW-DS en EDgo-værdi (for halve-10 ring af trombevægten) på 6,9 mg/kg mod 8,9 mg/kg for det ude- polymer i s erede DS.

LMW-DS viste sig også at være fibri no 1yti sk.

Eksempel 12 15 10 g dermatansulfat OP 239 (dannet af følgende blanding af molekylvægte: 19* > 20.000, 30* * 14.000, 50* * 12.000, bestemt ved HPLC) og med [α]^ - -60 placeres i 100 ml vand sammen med 250 kobberacetat.

20 30 ml 15* hydrogenperoxid tilsættes i løbet af en time ved en temperatur mellem 37 og 40eC. pH-værdien holdes på 7,5 med i alt 14 ml N NaOH.

Ved afslutningen af reaktionen afkøles opløsningen til 20°C, 25 og pH-værdien sænkes til 5,8 med eddikesyre.

Der tilsættes to voluminer methylalkohol , og det således opnåede bundfald isoleres ved filtrering. Derefter opløseliggøres det i 60 ml vand og elueres på Chelex 100R-harpiks (0 2, 30 h 18 cm). Den opnåede opløsning, sammen med søjlens vaskevand, tilsattes 2 voluminer ethanol. Bundfaldet, isoleret ved filtrering og tørret, giver 6,11 g (61* udbytte) dermatansulfat med følgende egenskaber: ta] - -59,3, S - 6,7*. iduronsyrer =* 30,7*,

35 ækv SOoH ækv C00H

middelmolekylvægt = 4.800 d (ved HPLC på Protein Pak 125 column (Waters)) 23 DK 173804 B1

Kemiske 13C-NMR-forskydninger gives med hensyn til ekstern te-tramethylsilan under anvendelse af methanol som en intern reference. Den kemiske forskydning af methanol i D2O i forhold til forskydningen for tetramethylsilan var 51,75 ppm.

5

Kemiske forskydninger for L-i dosy1uronsyre (U) og for acetamldodeoxy-D-galactose (A) sammen ned angivelsen af de carbonatomer, hvortil de hører, er givet: δ (ppm): 104,8 (U1), 103,6 (Al), 82 (A3), 77,73 (U4), 76,94 (A4), 76,08 10 (A5), 72,7 (U3). 70,9 (U2-5). 60,72 (Αβ). 52.9 (A2). 25,7 (CH3) .

I intervallet 90-95 ppm fremgår signalerne fra de reducerende endegrupper (Ai og Ui).

15 In vitro-forbinde1 sen giver: U-aXa - 2,5 U.I./mg og U-APTT - 1.3 U.I./mg.

I den eksperimentelle kaolintrombose 1 overensstemmelse med Hladovec (Physiologia Bohemos1ovaca, 24, 551, 1975): den har 20 givet ED50 - 1,2 mg/kg e.v.

Eksempel 13 5 g dermatansulfat 7-8 HP med en molekylvagt > 34.000 (ved HPLC) placeres 1 100 ml vand sammen med 5 g natriumacetat.

25 230 mg cupriacetatmonohydrat tilscttes, og derefter tlldryppes 20 ml 12* hydrogenperoxid i 1 time.

Temperaturen holdes mellem 30 og 38°C, og pH-vmrdien holdes p& 7,5 ned i alt 5 ml 0,1 N NaOH.

30

Ved reaktionens afslutning tilscttes 500 mg dinatrlun-EDTA-dihydrat, pH-vmrdien Justeres til 5,9 ned eddikesyre, og depo-lymeriseringsproduktet udfcldes med 2 voluminer methylalkohol.

o- Produktet oparbejdes derefter som 1 de foregående eksempler.

35

Der opnås 2,95 g OP 116 (59% udbytte).

24 DK 173804 B1

Produktegenskaber:

»kv SOqH

S » 6,16%, uronsyrer =» 30,84%, *kv COOH =» 1,21

Molekylvmgt * 6000 d, bestemt ved HPLC på Protein Pak 125 co~ 5 lumn (Waters), flux 1 ml/mln, fase: mobil 0,125 M Na2S04, puf-ret ved pH-v*rdi 6 med 2 mM Na2HP04/NaH2P04. Refraction index Detector.

13-C-NMR (TMS som ekstern standard og methanol som intern jq standard med kemisk forskydning 51,75 ppm): 6 ppm 104,8 (C-1 — iduroneyre), 103,37 (C-l-aminosukker-4,0-sulfat), 60,72 (C-6-am inosukker-0-8U1fat), 52,95 (C-2-aminosukker-N. Ac.).

[α] - -60 (i vand) "In vivo"-antithrombotisk aktivitet: 24,7 U.

15 "In vitro"-U-APTT: 2 U.I./mg.

Claims

1. Fremgangsmåde til depolymerisering af naturlige hepariner, heparansulfater eller dermatansulfater, kendetegnet ved, at nævnte polysaccharider, i vandig opløs- 5 ning og ved en temperatur mellem 20 og 70°C, underkastes en radikalreaktion, som initieres af et radikal i nærværelse af en katalysator valgt blandt Cu+ + , Fe++, Cr+ + + og Cr207 .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at radikalet er dannet fra en peroxidforbindelse valgt blandt pereddikesyre, 3-chlor-perbenzoesyre, hydrogen- 10 peroxid, cumenhydroperoxid, natriumpersulfat og benzoylperoxid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendetegnet ved, at katalysatoren anvendes i en koncentration fra 0,1 til 0,001 M.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at koncentrationen af polysaccharid er højere end 10 vægt%.

5. Lavmolekylære (2000-7000 daltons) fraktioner af naturlige polysaccharider, ken detegnet ved, at de er opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 1-4. 1 Farmaceutiske midler med en antithrombotisk, antiinflammatorisk og fibrinolytisk aktivitet, kendetegnet ved, at de som aktiv bestanddel indeholder fraktionerne af naturlige polysaccharider ifølge krav 5. DK 173804 B1

7. Midler ifølge krav 6, som er egnede til parenteral eller oral eller topisk indgift, kendetegnet ved, at de foreligger i form af sterile, injicerbare opløsninger eller suspensioner, kapsler, tabletter eller sirupper, hvori den aktive bestanddel eventuelt kan være båret i liposomer eller miceller, eller i cremer eller salver. 5