KR970000528B1

KR970000528B1 - 신규 황산화 폴리사카라이드 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 이의 제조방법 및 유효성분으로서 이를 함유하는 약제

Info

Publication number: KR970000528B1
Application number: KR1019900702212A
Authority: KR
Inventors: 후이-젱 판; 유송; 에쓰지 야마나까; 가즈히로 누마따; 도시노리 오까; 노리히꼬 스즈끼; 요시유끼 무라나까
Original assignee: 고바야시 유끼오; 다이호 야꾸힝고오교 가부시끼가이샤; 이시가와 후미오; 고따이가세이고오교 가부시끼가이샤
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-10-06
Publication date: 1997-01-13
Also published as: ES2087907T3; DK0408770T3; EP0408770A4; CA2026992A1; AU634521B2; EP0408770A1; DE69027256D1; DD297165A5; ATE138938T1; CA2026992C; AU5032590A; JP2714718B2; HU211988A9; KR910700269A; EP0408770B1; DE69027256T2; WO1990008784A1

Abstract

내용 없음

Description

신규 황산화 폴리사카라이드 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 이의 제조방법 및 유효성분으로서 이를 함유하는 약제

본 발명자들은 해삼의 체벽으로부터 알칼리로 추출함으로써 헤파린 특유의 항-응고활성 및 지질 크리닝 활성을 갖는 황산화 폴리사카라이드를 분리하였다. 발명자들은 이를 폴리사카라이드 FGAG로 명명하였다. (Yao Hsueh 1980, 15(5), 263~270, Zhongyao Tong-bao 1982, 7(4), 27~29, Hsueh Pao 1983, 18(3), 203~208 및 일본국 특허공개 제63-123001호). 일본국 특허공개 제63-10601호에는 다른 연구자들에 의해 연구된 황산화 폴리사카라이드의 또다른 분리예가 기재되어 있다. 상이한 명칭이긴 하지만, 상기의 선행 기술 출판물에 기술된 황산화 폴리사카라이드는 모두 동일하며, 하기의 물리화학적 상수를 갖는다.

특성 : 백색, 비결정질, 고흡습성의 분말

분자량 : 약 15,000~약 80,000(겔 여과에 의해 측정)

조성물 분석 : 하기에 나타낸 바와 같다.

갈락토 사민 13~17중량%

글루쿠론산 16~19중량%

퓨코오즈 13~27중량%

설페이트 27~38.5중량%

몰 비율 : 하기에 나타낸 바와 같다.

갈락토 사민 : 글로쿠론산 : 퓨코오즈 : 설페이트=1 : 1±0.2 : 1.35±0.35 : 3.6±0.6

상기 분석치등에 따라서, FGAG는 갈락토 사민, 글루쿠론산, 퓨코오즈 등으로 구성된 고-분자량의 황산화 폴리사카라이드임이 확인되며, 공지의 천연황산화 폴리사카라이드보다 더 많은 함량의 설페이트를 갖는다는 특징이 있다.

높은 항-응고 활성을 가지므로, 상기 FGAG는 한때 전염성 혈관내 응고(DIC)의 치료를 위한 약제로서 인정 되었었다. 그러나, 이후에 FGAG는 사람에게 사용될 때 혈소판 응집을 일으키는 고활성을 갖는 다는 점과 이러한 부작용 때문에 그 자체로서 사용되는 경우 사람의 DIC 치료에서 무익하다는 점이 발견되었다.

발명의 개시

이러한 상황을 고려하고, 본 발명자들은 DIC의 치료를 위해 우수한 약제로서 사용될 수 있으며 헤파린과 유사한 활성을 갖는 화합물에 대해 광범위한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은, FGAG 또는 그의 염을 해중합시킴으로써 제조한 황산화 폴리사카라이드가 헤파린과 유사한 항-응고 활성 및 기타의 활성을 유지하는 반면에 혈소판 응집을 일으키는 활성은 실질적으로 나타내지 않는다는 점을 발견하였다. 또한 헤파린과는 달리, 황산화 폴리사카라이드는 항-Xa 또는 항-트롬빈 활성을 나타내지 않으면서 트롬빈의 생성을 저해하는 활성을 가지며, 따라서 잠재적으로 혈전증의 치료에서 효과적일 수도 있다는 점을 발견하였다. 본 발명자들은 신규 황산화 폴리사카라이드를 D-HG로 명명하였다.

본 발명은 상기 새로운 발견을 기초로하여 완성되었다.

본 발명에 따라서, 하기 일반식의 신규 황산화 폴리사카라이드(D-HG) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 이의 제조방법 및 유효 성분으로서 이를 함유하는 DIC 및 혈전증 치료용 약제를 제공한다.

본 발명의 D-HG는 하기에 보여지는 물리화학적 특성을 갖는다.

(1) 분자량 : 3,000~42,000(고성능 GPC에 의해 측정됨)

(2) 특성 : 백색, 비결정질, 고흡습성의 분말.

(3) 용해성 : 수용성 그러나 에탄올, 아세톤 및 기타 유기용매에는 불용성

(4) 비선도 :=-55~-73^o(c=1%)

(5) 색반응 : 하기에 나타낸 바와 같다.

엘슨-모르간(Elson-Morgan) 반응 +

카르바졸-황산반응 +

시스테인-황산반응 +

오르시놀-염산반응 +

아주르(Azure) A 메타크로매시아 반응 +

(6) 조성물 분석 : D-HG는 갈락토 사민(GalN로 악기), 글루코론산(GA로 약기) 및 퓨코오즈(Fuc로 약기) 및 설페이트를 GalN : GA : Fuc : 설페이트=1 : 0.8±0.2 : 0.85±0.15 : 3.4±0.9의 몰 비율로 포함하는 구성 사카라이드로 구성된다.

갈락토 사민, 글루쿠론산, 퓨코오즈 및 설페이트를 감사하기 위해 하기 방법에 의해 분석을 수행한다.

GalN : 백색 방법(Carbohydrate Research, 114 : 586, 201)

GA : 비터-뮤어(Bitter-Muir)방법 (Anal. Biochem., 4 : 330, 1962)

Fuc : 디쉐(Dische)방법 (J.Biol.Chem., 175 :595,1948)

설페이트 : 도그슨 프라이스(Dodgson Price)방법 (Biochem.J., 84 : 106, 1962)

상기 분석의 결과는 D-HG가 분자내에 염기와 함께 반응하여 염을 형성할 수 있는 설페이트 및 카르복실기를 가지고 있음을 나타낸다. D-HG는 염의 형태에서 안정하며, 통상적으로 염의 형태로 분리하고 정제한다. 칼륨, 나트륨 등의 알칼리 금 속의 염, 및 칼슘, 마그네슘, 바륨 등의 알카리 토금속의 염, 또는 파리디늄염 등의 유기 염기를 포함하는 약학적으로 허용가능한 염들이 염으로서 유용하다. 염을 형성하지 않은 형태, 즉 유리 형태의 구성 사카라이드의 조성을 하기에 나타낸다.

GalN 18∼24중량%

GA 14∼21중량%

Fuc 13∼20중량%

설페이트 31∼44중량%

D-HG 및 그의 염의 바람직한 분자량은 약 4,000 내지 약 15,000이다. (고 성능 GPC에 의해 측정됨).

본 발명의 D-HG는 출발물질인 FGAG로부터 제조된다. D-HG의 제조에 있어서, FGAG 또는 그의 염을 해중합시킨 다음 분리 및 정제를 행한다. FGAG는 해양 생물인 해삼의 체피를 알칼리로 분해시키고, 추출을 위해 얻어진 생성물을 판코레아틴 등의 단백질 분해효소로 더욱 분해시킨 다음 분리 및 정제를 행함으로써 수득된다.

본 발명의 D-HG의 제조에 사용하기 위한 FGAG 또는 그의 염은 선행 기술에 관하여 상기에 언급된 공지의 출판물에 기재되어 있는 방법에 의해, 더욱 구체적으로는, 하기 참조예에 기술되는 방법에 의해 쉽게 제조될 수 있다. FGAG 또는 그의 염의 제조에 유용한 해삼의 예는 하기와 같다 :

스티코푸스 자포니쿠스 셀렌카(Stichopus japonicus Selenka), 스티코푸스 콜로로노유스 브란트(Stichopus chloronoyus Brendt), 스티코푸스 바리에가투스 셈퍼(Stichopus variegatus Semper), 홀로투리아 퍼비칵스 셀렌카(Holothuria pervicax Selenka), 홀로투리아 아트라(Holothuria atra), 홀로투리아 아트구스(Holothuria araus), 홀로투리아 에둘리스(Holothuria edulis), 홀로투리아 스카브라(Holothuria scabra), 파라스티코푸스 니그리푼크타투스(Parastichopus nigripunctatus), 테레노타 아나나스(Thelenota ananas), 홀로투리아 모나카리아 레송(Holothuria monacaria Lesson), 홀로투리아 류코스피로타 브란트(Holothuria leucospilota Brandt), 쿠쿠마리아 크론젤미(Cucumaria chronhjelmi), 쿠쿠마리아 에키나타(Cucumaria echinata), 쿠쿠마리아 프론도사 자포니카(Cucumaria frondosa Japonica), 펜타크타 아우스트랄리스(Pentacta austalis), 파라카우디나 킬렌시스 란슨네티(Paracaudina chilensis ransonneti), 몰파디아 무스쿨루스(Molpadia musculus), 렙토시나프타 인하에렌스(Leptosynapta inhaerens), 폴리케이라 루페센스(Polycheira rufescens), 시나프나 마큘라타(Synapta maculata), 할로데이타 시네라센스(브란트)〔Halodeima cinerascens(Brandt)〕, 악티노피가 라카노라(재거)〔Actinopyga lacanora(Jaeger)〕, 악티노피가에키니테스(재거)〔Actinopyga echinites(Jaeger)〕, 미크로텔레 노빌리스(셀렌카)〔Microthele nobilis(Selenka)〕등.

출발물질로 사용되는 해삼은 남킷 또는 건조된 것일 수 있다. 상기에 예시된 해삼 중에서, 스티코푸스 자포니쿠스 셀렌카가 출발 물질로서 가장 바람직하다.

D-HG는 상기에서 수득한 FGAG 또는 그의 염을 물에 용해시키고, 용액을 해중합반응시킴으로써 제조된다. 해중합반응에서 헤파린등과 같은 고분자 황산화 폴리사카라이드는 저분자 황산화 폴리사카라이드로 전환된다. 해중합체가 통상적으로 반응에 사용된다. 유용한 해중합제의 예로는 과산화수소, 차아염소산, 차아브롬산, 차아염소산나트륨 등의 차아할로겐산 및 그의 염; 과요오드산, 과요오드산나트륨 등의 과요오드산 및 그의 염등이 있다. 아스코르브산, 제1철 이온 등이 반응 가속제로서 유용하다. 임의로는 해중합반응은 초음파, 자의선, 감마선 등의 조사를 해중합제 대신에 단독으로 또는 상기 해중합제와 배합 사용함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서 가장 바람직한 해중합방법은 해중합제로 과산화수소를 사용하는 것이다. 과산화수소는 과산화수소 농도로 1 내지 31중량%, 바람직하게는 1 내지 16중량%의 양으로 반응시킨다. 반응시간은 통산 1 내지 60시간, 바람직하게는 3 내지 40시간이며, 반응 온도는 실온 내지 약 80^oC, 바람직하게는 약 40 내지 60^oC이다. 과산화수소의 반응에서 pH 범위는 1~8, 바람직하게는 3~7의 산성 또는 중성이다. 일정한 pH 값을 유지하기위해, 과산화수소를 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 트리스 완충액등과 같은 완충액 중에서 반응시키거나, 또는 물은 수산화나트륨 등을 사용하는 pH 조절제를 반응에 사용할 수 있다. 반응 완결시, pH를 중성 범위로 되돌리고, 분리 및 정제를 수행한다. 분리 및 정제는 예를 들면 에탄올, 아세톤 등과 같은 유기 용매; 포타슘 아세테이트, 바륨 아세테이트, 칼슘 아세테이트, 암모늄 아세테이트 등과 같은 아세테이트; 또는 세틸 트리메틸 암모늄염 등과 같은 4차 암모늄염을 사용하여 분별 침전에 의해 수행될 수 있다. 분리 및 정제는 또한 DEAE-셀룰로오즈(시그마 케미칼 사 제품) DEAE-도요필(도오소 코오포레이션 제품), DEAE-셀로로핀(치소 코오포레이션 제품), 도웩스-1(다우케미칼사 제품)등과 같은 수지를 사용한 이온교환 크로마토그래피; 세파덱스 G-50, 세파덱스 G-200(모두 파마시-LKB 바이오테크놀로지 제품)과 같은 겔을 사용한 겔여과 크로마토그래피; 스펙트라/포어(스펙트럼 메디칼 인더스트리, 인코포레이티드 제품)을 사용한 투석 또는 한의 여과에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 단독으로 또는 적당히 조합하여 사용한다. 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 한의여과는 혈소판 응집을 일으키는 활성은 가지지 않은 D-HG를 쉽게 제조하기 위해서 바람직하다.

이렇게 수득한 D-HG는 통상나트륨 및/또는 칼륨등의 염의 형태로 분리된다. 염형태의 D-HG는 도웩스 50W등과 같은 양이온-교환 수지로 처리함으로써 유리 D-HG로 변형될 수 있다. 필요하다면, 염 형태의 D-HG는 일반족으로 사용되는 염 교환에 의해 약학적으로 허용 가능한 염으로 전환될 수 있다. 황산화 폴리사카라이드의 염으로서 유용한 것은 칼륨, 나트륨 등의 알칼리금속의 염, 및 칼슘, 마그네슘, 바륨 등의 알칼리토금속의 염, 또는 피리디늄 염등의 유기염기를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 염이다.

본 발명의 D-HG에 의한 DIC 및 혈전증의 치료는 DIC 및 혈전증을 일으키는 혈관내의 응고 촉진에 대항한 항-응고 활성을 이용함으로써 수행된다. D-HG의 항-응고 활성의 범위는, 항-응고 요소 활성, 즉 전형적으로 트롬보플라스틴 부분적 활성화 시간을 연장시키는 활성, 및 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 저해시키는 활성을 포함한다. D-HG의 항-응고 활성은, D-HG가 활성을 나타낼 때 항-트롬빈 Ⅲ와 같은 임의의 혈장 인자를 요구하지 않으며 혈소판 인자 4와 같은 황-헤파린 인자에 의해 영향 받지도 않는다는 점에서 헤파린과 완전히 상이하다. 헤파린과의 또 다른 차이점은 D-HG가 항-Xa 활성 또는 항-트롬빈 활성은 나타내지 않으면서 트롬빈의 생성을 저해하는 활성을 가지며, 따라서 혈전증에 대해 매우 효과적이라는 점이다. D-HG의 특징은 헤파린 및 FGAG와는 달리, D-HG는 실질적으로 DIC 및 혈전증의 치료용 약제의 치명적 활성인 혈소판 응집을 일으키는 활성을 가지지 않는다는 점이다. 실질적으로 혈소판 응집을 일으키는 활성이 없다는 표현은, 유기체, 특히 사람에게 투여할 때 D-HG는 유기체에 유해하거나 또는 혈전증을 약화시키는 혈소판응집을 나타내지 않는다는 것을 의미한다.

D-HG는 DIC 및 혈전증 치료를 위해 유용한 여러 가지의 약학 조성물로 제조된다. 더욱 구체적으로 말하자면, D-HG 및/또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체의 유효량을 함유하는 조성물은 다양한 투여형태로 제조될 수 있다. 본 발명에 유용한 투여형은 정제, 켑슐, 분말, 과립, 그레인, 용액, 유탁액, 현탁액과 같은 경구형, 및 주사제, 좌약, 연고, 플라스터와 같은 비경구형이다. 이런 형태의 제제는 이분야에 통상의 지식을 갖는 자가 통상적으로 사용하는 공지의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여용 고형제제는 본 발명의 유효성분을 결합제, 붕해제, 윤활제, 착색제, 풍미제, 향료 등을 첨가하면서 또는 첨가하지 않고 부형제와 함께 혼합하고, 혼합물을 통상적인 방법에 의해 정제, 캡슐, 분말, 과립, 그레인 등의 형태로 제형함으로써 제조된다. 주사용제제는 유효성분에 pH 조절제, 완충액, 안정화제, 등장제, 국소마취재 등을 첨가하고, 혼합물을 통상적인 방법에 의해 정맥내, 근육내, 피하, 경피 도는 북강내 주사액으로 제형함으로써 제조된다. 좌약은 유효성분, 기재물질 및 필요하다면 계면활성제등의 혼합물을 통상의 방법에 의해 좌약으로 제형함으로써 제조될 수 있다.

경구 고형제제에 유용한 부형제의 예로는 락토오즈, 슈크로오즈, 녹말, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 결정 성셀룰로오즈, 메틸셀룰토오즈, 카르복시메틸셀룰로오즈, 글리세린, 소듐아르기네이트, 아라비아고무 등이 있다. 경구 제제용 결합제의 예로는 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오즈, 아라비아고무, 쉘락, 슈크로오즈 등이 있다. 윤활제의 예로는 마그네슘스테아레이트, 활석등이 있다. 첨가되는 착색제, 붕해제 및 기타 첨가제는 이 분야에서 통상 사용되는 것이다. 정제는 공지의 방법에 의해 피복될 수 있다.

좌약에 유용한 기재물질의 예로는 마크로골, 라놀린, 카카오오일, 지방산트리글리세리드, 위텝솔(다이나마이트 노벨 제품의 등록상표)등과 같은 유성기재물질이 있다.

각 단위 투여량당의 유효성분의 양은 제제를 투여하는 환자의 증세, 제제형태 등에 따라 변화한다. 보통, 바람직한 양은 각 단위 투여량당 경구 제제는 10 내지 200㎎, 주사제는 1 내지 100㎎ 또는 좌약은 10 내지 100㎎이다. 본 발명의 조성물의 일일임상 투여량은 또한 화자의 나이, 성별, 조건 및 기타 요인에 따라 변하며, 통상 유효성분의 관점에서 약 10 내지 1000㎎, 바람직하게는 약 50 내지 200㎎이며, 1 내지 4회에 나누어서 투여할 수 있다.

본 발명에 따라서, 실질적으로 혈소판 응집을 일으키는 활성을 가지지 않으며, DIC 및 혈전증의 치료용 약제로서 뛰어난 항-응고 활성 및 현저한 특성을 갖는 신규 황산화 폴리사카라이드인 D-HG가 제공된다.

발명을 수행하는 최선의 방법

본 발명은 하기 참고예, 실시예 및 약리시험을 참고로 더욱 상세히 설명된다. 참조예 및 실시예에서 퍼센트는 모두 중량 퍼센트이다.

참조예 1

FGAG의 제조

1㎏의 건조 스티코푸스 자포니쿠스를 10ℓ의 온수에 밤새 침지시켜 팽윤시킨다. 육질을 제거하여 균질화시킨다. 수산화 칼륨을 1N 혼합물이 되는 양으로 첨가한다. 혼합물을 60^oC에서 100분간 처리하고 pH 8.5로 맞춘다. 50g의 판코레아틴을 첨가한 후, 혼합물을 50^oC에서 3시간동안 교반한다.

원심분리에 의해 불순물을 제거한 후, 4.3ℓ의 에탄올을 잔류물에 첨가한다. 혼합물을 4^oC에서 정치시키고 얻어진 침전물을 수집한다. 침저물을 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 50g의 조생성물을 수득한다. 50g의 조생성물을 3.5ℓ의 물에 용해시키고, 용액을 원심분리시켜 불용성 물질을 제거한다. 상층액에 5% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 수득한다. 침전물을 원심분리에 의해 수집한다. 침전물을 2.5ℓ의 물에 용해시킨 후, 용액을 pH 10.5로 맞춘다. 용액에 30% 과산화수소 수용액을 적가한다. 혼합물을 약 3시간동안 가열하면서 50^oC의 물 배스에서 탈색시킨다. 냉각후에 불용성 물질을 원심분리로 제거한다. 상측액에 약 490g의 아세트산 칼륨을 첨가하고, 혼합물을 4^oC에서 밤새 유지시킨다. 다음날, 얻어진 침전물을 2ℓ의 물에 용해시키고, 용액을 0^oC로 냉각하고, pH 를 2.8로 맞춘다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 용액으로부터 제거한다. 상층액을 중화시킨 후, 196g의 아세트산 칼륨을 첨가한다. 혼합물을 4^oC에서 정치시켜 침점물을 얻은 다음, 이것을 원심분리에 의해 수집한다. 침전물을 물에 용해시켜 0.5M의 아세트사 칼륨 농도을 갖는 용액을 얻고, 용액을 4^oC에서 밤새 유지시킨다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고 40% 메탄올로 세척하고 1ℓ의 물에 용해시킨다. 용액에 5% 염화 나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침점루을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 메탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 17g의 FGAG 나트륨/칼륨 염을 수득한다. 염의 물리화학적 상수는 하기와 같다.

분자량 : 55,000(고성능 GPC에 의해 측정)

조성물 분석 : 하기에 나타낸 바와 같다.

Ga1N : 20.0%

GA : 18.6%

Fuc : 17.2%

설페이트 : 36.6%

Na : 6.2%

K : 7.4%

내용 없음.

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 10g을 75㎖이 물에 용해시키고, 25㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가한다. pH 조절제를 사용하여 물은 수산화나트륨용액으로 용액을 약 pH7에서 유지시키면서, 용액을 60℃에서 12시간동안 가열한다. 냉각후에, 2% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 7.15g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다.

실시예 2

24시간동안 과산화수소로 처리하는 것 이외에는 실시예 1에서와 동일한 방법에 의해 6.95g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다.

실시예 3

물은 알칼리용액으로 약 pH4를 유지하면서 반응을 수행하는 것 이외에는 실시예 1에서와 동일한 방법에 의해 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다. 수율 6.4g

실시예 4

참조에 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨 염 10g을 83.3㎖의 0.2M 포스페이트 완충액(pH7.0)에 용해시킨다. 용액에 16.7㎖의 30% 고산화수소 수용액을 첨가한다. 혼합물을 60℃에서 12시간동안 처리한다. 냉각후에, 2% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고 감압하에서 건조시켜 7.18g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다.

실시예 5

0.2M 아세테이트 완충액(pH3.5)을 사용하여 반응을 수행하는 것 이외에는 실시예 4에서와 동일한 방법에 의해 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다. 수율 7.05g

실시예 6 및 7

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 15㎖의 물에 용해시킨다. 용액에 5㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 14시간동안(실시예 6) 또는 40시간동안(실시예 7) 처리한다. 냉각후에, 혼합물을 pH 7 내지 pH 8로 맞추고, 스펙트라/포어(Spectra/por) 3을 사용하여 물에 대해 완전히 투석시킨다. 혼합물을 냉동건조시키고 감압하에서 건조시킨다. 이러한 방식으로, 1.62g 및 1.76g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다.

실시예 8

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 16.7㎖의 물에 용해시킨다. 용액에 3.3㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가하고, 혼합물을 45℃에서 24시간동안 처리한다. 냉각후에, 혼합물을 pH 7로 되돌인 다음, 2% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 1.41g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다.

실시예 9~12

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 15㎖의 물에 용해시킨다. 용액에 5㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 4,8,12 또는 24시간동안 처리한다. 냉각후에, 혼합물을 약 pH 7 내지 pH 8로 맞춘 다음 스펙트라/포어 3을 사용하여 물에 대해 충분히 투석시킨다. 이어서 실시예 8에서와 동일한 처리로 행한다. 이러한 방식으로, 1.42g, 1.35g, 1.35g, 및 1.2g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다.

실시예 13 및 14

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 14.7㎖의 물에 용해시킨다. 용액에 5.3㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가하고, 혼합물을 45℃에서 14시간 또는 40시간동안 처리한다. 냉각후에, 혼합물을 pH 7로 되돌린 다음, 2% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 얻는다. 실시예 6~7에서와 동일한 처리를 행한다. 이러한 방식으로, 1.64g 및 1.62g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 제조한다.

실시예 15

참조예 1에서 수득한 FGAG나트륨/칼륨염 2g을 30㎖의 물에 용해시키고, 실시예 8에서와 동일한 방식으로 12시간동안 처리한다. 용액을 세파덱스 G-50T 컬럼(파마시마-LKB 바이오 테클놀로지의 제품)상에서 염화나트륨 용액으로 분별한다. 우론산을 모니터링하면, 피크가 세개로 나뉘어진다. 마직막에 수득되는 용출액을 수집하고, 물에 대해 충분히 투석시키고, 냉동 건조시키고 감압하에서 건조시켜, 0.2g의 D-HG 나트륨염을 수득한다.

실시예 16

실시예 8에서 수득한 D-HG 나트륨/칼륨염 0.5g을 실시예 15에서와 동일한 방식으로 분별하여, 0.18g의 D-HG 나트륨염을 수득한다.

제1도는 D-HG 나트륨염의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 정제로 측정)을 나타내며, 제2도는 D-HG 나트륨염의 양성자 핵자기공명 스펙트럼(D2O, 90MHz, 70℃)을 나타낸다.

실시예 17

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 16.7㎖의 물에 용해시키고 용액에 3.3㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가한다. 혼합물을 45℃에서 5시간동안 처리한다. 냉각후에, 혼합물을 약 pH 7로 되돌린 다음 2% 염화나트륨 및 40% 에탄올을 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 아세톤의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다. 수율 1.60g

실시예 18

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 실시예 17에서와 동일한 방법으로 9시간동안 처리하여, 1.54g의 D-HG 나트룸/칼륨염을 수득한다.

실시예 19

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 2g을 실시예 17에서와 동일한 방법으로 12시간동안 처리하여, 1.52g의 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다.

실시예 20

참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염 1g을 8.7㎖의 0.2M 포스테이프 완충액(pH 7.0)에 용해시킨다. 용액에 1.3㎖의 30% 과산화수소 수용액을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 3시간동안 처리한다. 냉각후에, 5% 염화나트륨 및 66% 에탄올을 혼합물에 첨가하여 침점물을 얻는다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 디에틸에테르의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 D-HG 나트륨/칼륨염을 수득한다. 수득한 염을 10mM의 20mM 트리스-HC1 완충액(pH 7.0)에 용해시키고, 용액을 DEAE-도요필(도오소코오포레이션의 제품)과 혼합하고, 완충액으로 완전히 평형화시킨다. 염화나트륨의 선형농도 경사(0~M)를 가진 완충액중에서 용출을 수행한다. 우른산을 모니터링하면서, 피크 분획을 수집하고, 에탄올의 2배량을 첨가하면 침전이 발생한다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 80% 에탄올, 무수 에탄올 및 디에틸에테르의 순서로 세척하고, 감압하에서 건조시켜 D-HG 나트륨염을 수득한다. 수율 0.39g

실시예 21

건조 스티코푸스 자포니쿠스를 분쇄하여 수득한 5.0㎏의 분쇄 스티코푸스 자포니쿠스를 10ℓ의 아세톤을 사용하여 속슬렛 장치(Soxhlet apparatus)로 처리한다. 잔류물을 건조시켜 약 4.6㎏의 분쇄 및 탈지된 스티코푸스 자포니쿠스를 수득한다.

아세트산 칼륨 534g을 물 27.2ℓ에 용해시킨다. 탈지후 분쇄된 스티코푸스 자포니쿠스 4.0㎏을 거기에 가하고 생성된 혼합물을 70℃로 가열한 다음, 32g의 브로틴(Brotine, 다이와 가꼬 가부시끼가이샤제)을 첨가한다. 첨가한지 1시간후에, 30g의 브로틴을 더 가한다. 첨가한지 2시간 30분 후에, 생성된 혼합물을 열처리하고 원심분리시켜 불용성물질을 제거한다. 다음, 1,2ℓ의 물 및 640ℓ의 염화나트륨을 용해시킨다. 6.4ℓ의 에탄올을 가하고 생성된 혼합물을 차가운 곳에 밤새 방치한다. 상기와 같이 수득된 침전물을 분리 수거하다. 침전물을 4.4ℓ의 물에 용해시키고 용액의 pH를 염산수용액을 이용하여 pH 2.5로 조정한다. 용액을 냉각하면서 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다. 상층액을 1.5㎏의 아세트산칼륨을 가하고, 생성된 혼합물을 차가운 곳에서 밤새 교반한다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수거한다. 침전물을 2M 아세트산 칼륨 수용액 1.6ℓ, 및 2% 염화나트륨 및 35% 에탄올의 수용액 2ℓ로 순차적으로 세척한다. 침전물을 2ℓ의 에탄올로 2번 더 세척한다. 수득된 침전물을 2.3ℓ의 물에 용해시키고 소듐 보로하이드리드 88g 및 수산화칼륨 108g을 가한다. 수득된 혼합물을 60℃에서 50분간 교반한다. 반응 혼합물을 시온으로 냉각하고, 1.6ℓ의 에탄올, 0.5ℓ의 아세트산 및 0.6ℓ의 물을 가한다. 수득된 혼합물의 pH를 아세트산을 이용하여 5.0으로 조정한다. 혼합물을 4℃로 냉각하고 수득된 침점물을 냉각하면서 원심분리에 의해 수거한다. 수득된 침전물 및 32g의 염화나트륨을 1.2ℓ의 물에 용해시킨다. 0.5ℓ의 에탄올을 가하고 생성된 혼합물을 찬 곳에 밤새 방치한다. 침전물을 냉각하면서 원심분리하여 수거하고 무수 에탄올 및 아세톤으로 용화 유리 깔대기 상에서 순차적으로 세척한다. 침전물을 건조시키고 물에 다시 용해시킨다. 18g의 수산화나트륨을 가하고 170㎖의 3% 과산화수소 수용액을 적가하여, 수득된 혼합물을 실온에서 40분간 반응시킨다. 6N 염산을 이용하여 혼합물의 pH를 6.5로 조정한다. 거기에 염화나트륨 40g을 가하고 1.2ℓ의 에탄올을 더 가한다. 수득된 혼합물을 4℃에서 밤새 방치한다. 다음날, 생성된 침전을 냉각하면서 원심분리하여 불용성분을 수거한다. 침전물을 용화유리 깔대기 상에서 에탄올 및 아세톤으로 순차적으로 세척한다. 생성된 물질을 감압하에서 건조시켜 104g의 FGAG 나트륨염을 수득한다.

100g의 FGAG 나트륨염을 2.5mM의 인산염 완충액(pH 7.0)에 용해시켜 900㎖의 용액을 수득한다. 황산 제2구리 5수화물(0.4g)을 가하고 100㎖의 30% 과산화수소수용액을 더 가하여 생성된 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 반응도중, 4N 수산화나트륨을 이용하여 자동 pH 조절기(pH 6.8~7.2)로 반응혼합물의 pH를 조절한다. 생성된 혼합물을 1% 염화나트륨 및 50% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. 수득된 침전물을 원심분리에 의해 수거한다. 침전물을 80% 에탄올 및 무수 에탄올로 순차적으로 세척한 다음 감압하에서 건조시킨다. 소듐 보로하이드리드를 저분자량 물질의 양을 기준으로 0.1%의 양만큼 저분자량 물질의 10% 수용액에 가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 10분간 반응시킨다. 수득된 불용성 물질을 정밀여과(구멍 크기 : 0.45u)하여 제거한다. 여액을 6N 염산을 이용하여 pH 4.5로 조정하고 증화시킨 다음, 1% 염화나트륨 및 50% 에탄올로 침전시킨다. 수득된 침전물을 80% 에탄올 및 무수 에탄올로 순차적으로 세척한 다음, 감압하에서 건조시켜 85.4g의 조 DHG 나트륨염을 수득한다.

활성화된 DEAE 셀롤로파인(Cellulophaine) A 800(Chisso 사제)로 충진된 컬럼(Φ180×25)을 10㎖의 트리스-염산 완충액(pH 7.0)으로 평형시킨다. 조 DHG 나트륨염(80g)을 10㎖의 트리스-염산 완충액(pH 7.0)에 용해시켜서 DEAE 셀룰로파인 A 800으로 충진된 컬럼상에 놓는다. 컬럼을 동일한 완충액으로 완전히 세척한다음, 0.45M 염화나트륨 및 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0)을 칼럼 부피의 4배량으로 컬럼에 가한다.

다음 0.45M 염화나트륨 및 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0)을 컬럼 부피의 4배량으로 컬럼에 가한다. 다음, 064M 염화나트륨 및 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0)을 칼럼에 가하여 1ℓ의 각 분획을 수득한다. 각 분획을 유론산 검출에 사용했을 경우 단일 피크가 관찰된다. 그 분획들을 수거하여 한외여과(S1Y3 Amicon)하여 농축시킨다. 그 농축액에 농축액과 같은 양의 에탄올을 가하고 생성된 혼합물을 찬 곳에서 밤새 방치한다. 수득된 침전물을 80% 에탄올 및 무수 에탄올로 순차적으로 세척한 다음 감압하에서 건조시켜 35.2g의 DHG 나트륨염을 수득한다.

결정방법

NMR 장치(Model GSX-400, JEOL 사체)를 이용하여 70^oC에서 NMR 스텍트럼을 측정한다. 모든 양성자 시그날은 DQF-COSY(이중 양자 여과된¹H-¹H 상관관계 분광분석법), HOHAHA(동형핵 하트만-한(Hartman-Hahn)분광분석법) 및 양성자 상관관계 이차원 NMR 등을 조합하여 부여된 것이다.

각 당의 결합형태는¹H-¹³C간의 원격 결합을 기준으로 하여 결정되었다.¹³C-NMR은 CH-COSY(¹H-¹³C상관관계 분광분석법)에 의해 양성자 시그날과의 상관관계를 기준으로 하여 부여되었다. 원격결합은¹H 검출 이핵종상관관계법(¹H detecting different nuclide correlation method)인 HMBC(¹H-검출된 이형핵다중 결합 결합성)에 의해 구한다.

제1위치의 각 당의 입체 배위는 C-H직접 결합상수(¹J_1c-1H) 및 제1위치의 비시날(vicinal) 결합상수(³J_1H-2H)에 의해 결정된다.

¹J_1H-2H는 HMQC(¹H-검출된 이형핵 다중 양자 간섭) 스펙트럼에 의해 결정된다.

표 1은 상기 실시예에서 수득한 D-HG의 물리화학적 특성을 나타낸다.

주 : 표1에서, 분자(MW)는 고성능 GPC에 의해 측정된 것이다.

Sul는 설페이트를 나타낸다.

실시예 1~19에서 수득한 D-HG는 전기영등에서 하나의 점적을 나타낸다(Dietrich.C.P., J.Chromatogr., 130, 299(1997))

제조예 1

주사용 제제

실시예 16에서 제조한 D-HG 나트륨염을 주사액을 위해 증류수에 용해시켜 5% 수용액을 수득한다. 50㎎(D-HG로 환산시)의 용액을 바이알에 채우고 냉동건조를 행한다. 2㎖의 생리 식염수를 용매로서 첨가한다.

제조예 2

주사용 제제

하기에 나타낸 처방에 따라 주사용제제를 제조한다.

D-HG 나트륨/칼륨염 40㎎

실시예 12

제조예 3

정제

하기에 나타낸 처방에 따라 정제를 제조한다.

D-HG 나트륨/칼륨염 10㎎

실시예 14

제조예 4

좌약

하기에 나타낸 처방에 따라 좌약을 제조한다.

D-HG 나트륨/칼륨염 50㎎

실시예 4

약리 시험

DIC 모델에 대한 영향

일본국 J.Pharmaco1, 35,203~227(1984)에 기술된 방법에 따라, D-HG, FGAG 및 헤파린이 DIC 모델에 미치는 영향을 시험한다.

D-HG로서는 실시예 16에서 수득한 나트륨염, FGAG로서는 참조예 1에서 수득한 나트륨/칼륨염, 헤파린으로서는 185.6U/㎎의 효력을 갖는 나트륨 염을 사용한다.

800U/㎏의 트롭빈을 ICR 생쥐(1그룹당 10~15마리의 생쥐)에 정맥 주사한다. 24시간후에 DIC에 의해 일어나는 생쥐의 사망을 관찰하여 생존율을 계산한다. D-HG 나트륨염, FGAG 나트륨/칼륨염 또는 헤파린 나트륨염을 트롬빈의 투여전에 1분간 정맥 주사한다.

D-HG는 1㎎/㎏의 양으로 사용될 때 헤파린 및 FGAG와 동일한 항-DIC 효과를 갖는다. 이 모델은 또한 혈전증 모델로서 작용하며, 따라서 혈전증에 대해서 효과적이다. (항-응고 활성)

토끼로부터 얻은 시트르산-함유 혈장에 D-HG 나트륨염(실시예 16) 또는 D-HG 나트륨/칼륨염(실시예 11)을 10μg/㎖의 농도로 첨가한다. 대조표준(생리 식염수)에 대한 트롭보플라스틴 부분적 활성화 시간(APTT)을 연장시키는 활성을 관찰한다. 표 3은 그 결과를 나타낸다.

D-HG는 현저한 항 응고 활성을 나타낸다.

인체 내에서의 항-응고 활성

6명 이상의 정상인으로부터 얻은 시트르산-함유 혈청을 사용하여, D-HG 나트륨염(실시예 16) FGAG 나트륨/칼륨염 및 헤파린 나트륨 염을 항 응고 배개변수(ug/㎖)에 관한 활성에 대해 각각 관찰한다.

x2APTT는 (약제가 첨가되지 않은)대조표준의 트롬보플라스린 부분적 활성화 시간을 두배로하기 위해 요구되는 농도(㎍/㎖)를 나타낸다.

II a I C은 트롭빈 시간을 연장시키는 활성을 측정함으로써 계산되는 트롬빈 활성의 90% 저해농도(㎍/㎖)이다.

Xa I C은 인자 X에 의한 합성 기질 S2222의 분해를 50% 저해하기 위한 약제농도(㎍/㎖)이다.

VIII I C은 인자 VIII를 80% 저해시키기 위한 약제농도(㎍/㎖)이며, 이는 인자 VIII결핍 혈장을 사용하여 소량의 인자 VIII의 존재하에 접촉-활성화 응고 시간을 연장시키는 활성을 측정함으로써 계산된다.

II a G I는 접촉-활성화된 혈장내에서 프로트롬빈의 완전한 불활성화를 위해 억제 시간을 두배로 만드는데 요구되는 농도(㎍/㎖)이다. 이것은 트롬빈 생성을 저해하는 활성을 나타낸다.

APTT 연장 활성으로부터 밝혀진 바와 같이, D-HG 나트륨염은 항-응고 활성을 가지지만, 헤파린 나트륨 염과는 달리, 실질적으로 항-트롬빈 활성 또는 항-인자 Xa 활성을 가지는 않는다. 다른 한편, D-HG 나트륨 염은 트롬빈 생성을 저해하는 활성을 나타내며, 이는 염이 항-혈전증 활성을 가지고 있음을 확증시킨다. 이 활성은 인자Ⅷ 활성의 저해 및 응고 케스케이드의 양성 피이드백 저해에 기인한 것으로 추측된다. 이것은 D-HG가 현저하게 DIC 또는 혈전증의 치료를 위해 유일한 약제임을 나타낸다.(트롬빈-유발 혈소판 응집에 대한 저해 활성)

실시예 16에서 수득한 D-HG 나트륨염 또는 185.6U/㎎의 효력을 갖는 헤파린 나트륨염을 첨가한 결과는 토끼로부터 얻은 혈장-유리 세척된 혈소판의 현탁액에 0.1U/㎖의 트롬빈을 첨가함으로써 일어나는 혈소판 응집(투광도의 증가로 표현됨)을 관찰하여 평가될 수 있다. 표 5는 그 결과를 나타낸다.

헤파린과는 달리, D-HG는 혈장- 유리 시스템에서 트롬빈 응집에 대해 현저한 저해 활성을 나타낸다. 따라서, D-HG의 활성은 ATIII등과 같은 혈장 인자에 무관함이 확증되었다. (인체내에서 혈소판 응집을 일으키는 활성)

다섯명의 정상인(B,E,G,H,J)로부터 시트르산화 혈소판이 풍부한 혈장을 얻는다. 실시예 16에서 수득한 D-HG 나트륨염 또는 참조예 1에서 수득한 FGAG 나트륨/칼륨염을 혈장에 첨가하고, 혈소판 응집을 일으키는 활성(투광도의 증가로 표현됨)을 측정에 의해 평가한다. 표 6은 그 결과를 나타낸다.

D-HG는 1㎎/㎖의 농도에서 혈소판 응집을 일으키는 활성을 갖지 않지만, FGAG는 300㎍/㎖의 낮은 농도에서도 혈소판 응집을 일으키는 활성을 나타낸다.

Claims

FGAG 또는 그의 염을 해중합시킴으로써 제조되고, 하기의 물리화학적 특성을 가지며, 혈소판 응집 작용을 실질적으로 가지고 있지 않는, 황산화폴리사카라이드(D-HG) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염 : (1) 분자량 : 3,000~24,300 돌튼(daltons)(고성능 GPC에 의해 측정). (2) 특성 : 백색, 비결정질, 고 흡습성의 분말, (3) 용해성 : 수용성, 그러나 에탄올, 아세톤 등의 유기 용매에는 불용성, (4) 비선도 :=-55~-72°(c=1%), (5) 색반응 : 하기에 나타낸 바와 같다.

엘슨-모르간(Elson-Morgan)반응 +

카르바졸-황산반응 +

시스테인-황산반응 +

오르시놀-염산반응 +

아주르(Azure) A 메타크로매시아 반응 +

(6) 조성물 분석 : 하기에 나타낸 바와 같다.

갈락토사민 : 클루쿠론산 : 푸코오즈 : 설페이트=1:0.8±0.2:0.85±0.15:3.4±0.9
제1항에 있어서, 분자량 3,000~21,100돌튼(daltons)(고성능 GPC에 의해 측정)을 가짐을 특징으로하는, 황산화 폴리사카라이드(D-HG) 및 그의 염.
FGAG 및 그의 염을 해중합시킨 다음, 결과된 생성물을 분리 및 정제시키는 단계로 구성된, 제1항에 정의된 황산화 폴리사카라이드 (D-HG) 및 그의 염의 제조 방법.
제3항에 있어서, 아세트산 칼륨을 사용한 분별 침전 및/또는 에탄올을 사용한 침전에 의해서 분리 및 정제를 실행함을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 겔여과에 의해서 분리 및 정제를 실행함을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 이온 교환에 의해서 분리 및 정제를 실행함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 정의된 황산화 폴리사카라이드 (D-HG) 및/또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체의 유효량을 함유하는, 전염성 혈관내 응고의 치료용 약제.
제1항에 정의된 황산화 폴리사카라이드 (D-HG) 및/또는 그의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체의 유효량을 함유하는, 혈전증의 치료용 약제.
제1항에 있어서, 분자량 4,000~15,000돌튼(daltons)(고성능 GPC에 의해 측정)을 가짐을 특징으로하는, 황산화 폴리사카라이드(D-HG) 및 그의 염.