DK151262B - Fremgangsmaade til fremstilling af 3- og/eller 4ae-acylderivater af tylosin. - Google Patents

Description

i 151262

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 3- og/eller 4"-acylderivater af tylosin med den almene.formel ELC OH, HO CH.

j \ / j / j N X 2

CH3 CH2CH0 ho I [ I" °“R

ti I-'°~\)'Χ!Η:,

o_l I J

°^CH3 R1 (I) A0 >-°-CH2 * " ~r

1 2 hvori R betyder H eller en acetyl- eller propionylgruppe, og R

betyder H eller en n-butyryl- eller isovalerylgruppe, idet dog R^· og R ikke samtidig kan betyde H. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man acylerer i det mindste den ene af hydroxy lgrupperne i 3- eller 4"-stillingen i tylosin eller derivater deraf med den almene formel H,C CH, HO CH-,

N XX

CH3 CH20H0 HO I X\|-0-R2 i i x/\—°_l a ^ΛΛ η I A '^° 0H3 X h,o-A ΧΆ3 X-o-r-1- (id OCHt ^A-ch^ S' EO I <J>-0 XX\-0CH3 XX Xo^ /V J-0- J CH2CH3 2 151262 1' 2'

hvori R betyder H eller en acetyl- eller propionylgruppe, og R

betyder H eller en n-butyryl- eller isovalerylgruppe, idet dog mindst 1' 2' én af R og R betyder H, i nærværelse af mindst én acyldonor valgt blandt acetyl-CoA og propionyl-CoA, såfremt der ønskes fremstillet 3-acy 1-eller 3-, 4"-diacylderivater af tylosin, n-butyryl-CoA og isovaleryl^-CoA, såfremt der ønskes fremstillet 4"-acyl- eller 3-, 4"-diacyIderivater af tylosin, og de tilsvarende forstadier for disse acyl-CoA og i nærværelse af en mikroorganisme valgt blandt Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, Streptomyces mycrarofaciens ATCC 21454 og Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 eller enzympræparater deraf.

Der kendes to tilfælde af mikrobiel acylering af 16-leddede makro-lidantibiotika, nemlig ud fra henholdsvis spiramycin og YL-704.

Fremstillingen ud fra spiramycin er beskrevet i US-patentskrift nr. 2.943.024 ("Preparation of spiramycin III"), og nr. 2.943.025 ("Preparation of spiramycin II"), fransk patentskrift nr. 1.262.571 ("Transformation biochimique de la spiramycin I en spiramycin II et III") samt japansk patentskrift nr. 36-349 ("Process for producing spiramycin II, spiramycin III and the mixture thereof"). Det drejer sig hovedsageligt om samme opfindelse, beskrevet på forskellige sprog. Fremstillingen går kort ud på følgende:

En spiramycin-producerende organisme, Streptomyces ambofaciens NRRL-2420, dyrkes i et dyrkningsmedium, hvortil er sat spiramycin I (der som bekendt har en 3-hydroxylgruppe) og acyleringsmiddel, og der dannes herved spiramycin II (der har en 3-acetylgruppe) og spiramycin III (der har en 3-propionylgruppe).

Celler, der er dyrket i fravær af spiramycin og acyleringsmiddel, suspenderes i et reaktionsmedium, til hvilket er sat spiramycin I og acyleringsmiddel. Efter inkubation fås spiramycin II og III.

.Ved den fermentative produktion af spiramycinerne med den nævnte organisme forøges udbyttet af spiramycin II og III ved tilsætning af acyleringsmiddel.

3 151262

Fra DE-fremlæggelsesskrift nr. 1.278.441 kendes envidere en fremgangsmåde til direkte acylering af tylosin med kemiske acylerings-midler.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse adskiller sig i princippet væsentligt fra denne kendte teknik og af følgende grunde:

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen sker der en specifik acylering af 3- og/eller 4"-stillingen i tylosin ved anvendelse af en acyl-donor og i nærværelse af en nærmere angivet mikroorganisme eller enzympræparater deraf. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen går man således ud fra tylosin eller et derivat deraf, og under den enzymatiske indvirkning af en af de omtalte mikroorganismer eller præparater deraf sker der specifik acylering under anvendelse af særlige acyldonorer. For det første sker der ikke fremstilling af tylosin eller derivater deraf som følge af en mikrobiologisk fermentering. For det andet sker der en specifik acylering, hvilket ikke er muligt ved fremgangsmåden ifølge tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.278.441. Ved sidstnævnte kendte fremgangsmåde ville det således ikke være muligt ved kemisk acylering af tylosin med hydroxylgrup-per i 3-, 2'-, 4"- og 4,n-stillingerne: at opnå selektiv acylering af 3- og/eller 4"-stillingerne, som det er tilfældet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Omdannelsen af YL-704, der tilhører leucomycinfamilien, er kendt fra japansk patentskrift nr. 49-13992 ("Process for producing an antibiotic YL-704A1"). Ifølge denne kendte fremgangsmåde dyrkes en organisme valgt blandt Streptomyces eurocidicus NIHJ-267, Strep-tomyces albireticuli IFO-12737, Streptomyces kitasatoensis NRRL-2486 og Streptomyces sp. MCKL-0737 i et medium indeholdende "DHP-for-bindelse" 4"-deacyl YL-704A^ eller "DHP-forbindeIse" og L-leucin, hvorved der fås et dyrkningsprodukt, YL-704A^, der i DHP-forbin-delsens 4"-stilling har en isovalerylgruppe.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen adskiller sig også klart fra denne kendte teknik til fremstilling af YL-704A^ med hensyn til de anvendte organismer, fremgangsmådens enzymatiske art, dens almene anvendelse samt i forskelligheden af de fremstillelige produkter og i den samtidige acylering i 3- og 4"-stilling i et cellesystem og finder med fordel industriel anvendelse.

4 151262

Biokemisk acylering af tylosin har ikke tidligere været beskrevet.

I nærværende beskrivelse betyder 3- og 4"-stiliingen i tylosin henholdsvis den 16-leddede rings 3-stilling og mycarosedelens 4"-stilling.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis ved, at man dyrker en af ovennævnte streptomycesstammer i et til dyrkning af stammer af slægten Streptomyces sædvanligt medium, acylerer forbindelsen med formlen II, der har en 3- og/eller 4"-stillet hydroxyl-gruppe, med mindst én af de ovenfor anførte acyldonorer eller et si:of skiftef or stadium deraf, i nærværelse af en enzymatisk kilde af den således dyrkede organisme, f.eks. dens voksende eller ikke-voksende celler eller et enzymatisk præparat deraf, og udvinder de acylerede produkter fra reaktionsblandingen ved hjælp af metoder sædvanligvis anvendt til udvinding af makrolidantibiotika.

Tolysinderivaterne med formlen I inhiberer væksten af mikroorganismer, herunder lægemiddelresistente bakteriestammer, og ved oral og enteral administration opnås vedvarende høj blodkoncentration.

De omhandlede forbindelser kan anvendes i en farmaceutisk sammensætning mod. infektioner af grampositive mikroorganismer i mennesker og dyr, hvilken indeholder en omhandlet forbindelse i en til kontrol af disse infektionssygdomme tilstrækkelig mængde, samt anvendes i en dyréfodersammensætning, hvilken indeholder en omhandlet forbindelse i en til fremme af dyrets vækst tilstrækkelig mængde.

Fig. 1 og 2 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for henholdsvis 4"-n-butyryltylosin og 3-acetyl-4"-isovaleryl-tylosin, fig. 3-10 det infrarøde absorptionsspektrum af henholdsvis 3- acetyltylosin, 3- ac e tyl-4" -n-butyryl tylo s in, 3-acetyl-4”-isovaleryltylosin, 3-propionyltylosin, 3-propionyl-4"-n-butyryltylosin, 3-propionyl-4"-isovaleryltylosin, 5 151262 4"-n-butyryltylosin og 4"-isovaleryltylosin, fig. 11-18 i samme rækkefølge NMR-spektret (CDCl^) af samme forbindelser som ved det infrarøde absorptionsspektrum, fig. 19-21 kemisk-ionisations-massespektret af henholdsvis 3-acetyl-tylosin, 3-propionyltylosin og 3-acetyl-4"-isovaleryl-tylosin, fig. 22 og 23 spektret af 3-acetyltylosin og 3-·acetyl-4,,- isovaleryltylosin.og fig. 24 tyndtlagskromatogrammet af de omhandlede tylosinderi-vater.

Acylering af antibiotika er en af de praktiske metoder til fremstilling af hidtil ukendte antibiotikatyper og -derivater, Acyleringen må imidlertid ske på ensartet måde. Når man ved en almindelig kemisk metode skal fremstille et produkt, der er acyleret i særlige stillinger, er det ofte nødvendigt at foretage yderligere foranstaltninger,. f.eks. selektiv beskyttelse af funktionelle grupper.

Ved biokemiske fremgangsmåder sker der derimod selektiv acylering i de bestemte stillinger på grund af de enzymatiske reaktioners specif itet, og udbyttet er sædvanligvis højt. Til grund for opfindelsen ligger en grundig undersøgelse af en sådan biokemisk reaktion til acylering af tylosinforbindelserne med formlen II. Omsætningerne er yderligere undersøgt med det formål at etablere.industriel biokemisk produktion af derivater af tylosin.

Forsøg 1.

Der fremstilles et medium af følgende bestanddele! 40 g sojabønnemel 50 g glucose 1 g gærekstrakt 0,5 S MgS04.7 H20 0,5 s k2hpo4 1000 ml vand (pH 7>0) 100 ml af dette medium i en 500 ml kolbe til rystekulturer steriliseres ved 120°C i 20 min., og der podes med Streptomyces thermotole-rans ATCC 11416 og dyrkes ved 37°° under rystebetingelser. Når ca. halvdelen af glucosen er forbrugt efter en dags dyrkning, tilsættes 6 151262 en opløsning af leucomycin A-^ til en s lut kone entr at ion i mediet på 2 g/1, og man lader reagere i 6 timer. Den opnåede reaktionsblanding /klares ved centrifugering, indstilles til pH 8,5 med fortyndet natriumhydroxidopløsning og ekstrakeres med et tilsvarende rumfang ethylacetat. Ekstrakten inddampes under formindsket tryk til ca. en trediedel af det oprindelige rumfang, og lidt af koncentratet prik-kes på en tyndtlagsplade af silicagel. Pladen fremkaldes derefter med en opløsningsmiddelblanding af n-hexan-acetone-methanol-benzen-ethyl-acetat (30:10:8:25:20), tørres fuldstændigt og dyppes i 10%'s svovlsyre og opvarmes. Der iagttages to pletter, hvis Rf-værdier er ca.

0,50 og 0,65, og som ved analytisk sammenligning med autentiske prøver kan tilskrives leucomycin A-^ og leucomycin A^ (3-acetylleucomycin

Ai).

fforsøg 2.

Celler, der er dyrket som i forsøg 1 (indtil tilsætningen af antibiotika) samles ved centrifugering, skylles en gang med 0,05 M phosphatpuffer med pH 6,5 og gensuspenderes i 0,05 M phosphatpuffer indeholdende glucose i en koncentration på 2 g/1. Koncentrationen af celler i pufferen er ca. 10 g tørstof pr. liter. Derefter tilsættes leucomycin Y og L-leucin i koncentrationer på 0,5 g/1 og 1 g/1, og der inkuberes aerobt under lignende betingelser som ved celledyrkningen. Tre timer derefter afsluttes omsætningen, og der gås frem som i forsøg 1. På en tyndtlagskromatografisk plade fremkommer to pletter, hvis Rf-værdi er på henholdsvis ca. 0,3 og 0,65, og som identificeres som udgangsstoffet leucomycin V og produktet leucomycin A^ (3-acetyl-4,,-isovaleryl-leucomycin V).

fforsøg 3.

Celler, der er dyrket og renset som i forsøg 2, gensuspenderes i lidt af phosphatpuffer en og homogeniseres under anvendelse af en fransk presse, hvorfra der ved centrifugering ved 3000 x G i 10 min. fås en ovenstående væske. Til en fortyndet opløsning af denne ovenstående væske sættes leucomycin U og isovaleryl-Coenzym A (i det følgende er Coenzym A forkortet til CoA), begge i koncentrationer op 0,2 g/1, og der omsættes som i forsøg 2. Dannelsen af leucomycin A^ (4-"-iso-valeryl-leucomycin U) bekræftes ved tyndtlagskromatografi.

7 151262

Forsøg 4 20 ml portioner af den i forsøg 3 fremstillede fortyndede opløsning af den ovenstående væske fra celle-homogenatet kommes i hver af 9 500 ml Erlenmeyerkolber, der er nummererede 1-9. I hver kommes desuden 20 mg tylosin. I flere af kolberne kommes desuden 20 mg acyl-CoA, nemlig acetyl-CoA i kolbe 2, propionyl-CoA i kolbe 3, n-butyr-yl-CoA i kolbe 4, isovaleryl-CoA i kolbe 5, acetyl-CoA og n-butyryl-CoA i kolbe 6, acetyl-CoA og isovaleryl-CoA i kolbe 7, propionyl-CoA og n-butyryl-CoA i kolbe 8 og propionyl-CoA og isovaleryl-CoA i kolbe 9. Til kolbe 1 sættes intet acyl-CoA.

Der inkuberes i tre timer ved 37°0 under rolig rystning, og reaktionsopløsningerne gøres derefter svagt basiske og ekstraheres hver med 30 ml ethylacetat. Ekstrakterne inddampes under formindsket tryk til ca. 2 ml, og koncentraterne kommes på tyndtlagsplader, der fremkaldes som i forsøg 1. Efter fremkaldelse belyses de tørrede plader med en UY-lampe, der således viser beliggenheden af hovedprodukt-pletten på pladen. Hovedprodukterne opløses i acetone, der derpå afdampes og efterlader hovedproduktet, hvis bestanddele opløses i svagt surt vand. Efter opløsningerne er. gjort svagt basiske, ekstraheres de med benzen, og ekstrakterne inddampes til tørhed, .hvorved man får 7-10 mg hovedprodukt fra hver kolbe. Ca. 50 mg pulver af hvert produkt opnås ved anvendelse af flere kolber for hver omsætning. Produktet identificeres, gennem forskellige analyser, såsom UY-spektret, IR-spektr et, HMR-spektret, smeltepunkt, ro.t at ions evne, frigørelse af organisk syre ved gaskromatografi og Rf-værdien ved tyndtlagskromatografi, se i fig. 24, hvor tallene 1-9 ud for pletterne refererer til tallene i parentes i tabel 1. Resultaterne er sammenfattet i tabel 1, der viser sammenhængen mellem udgangs antibiotika, acyl-CoA og hovedprodukt...

8 151262

Tabel l.~~ ' m!"be ^oS" aoyl-CoA Hovedprodukt 1 tylosin intet tylosin (l) 2 " acetyl-CoA 3-acetyltylosin (4) 5 " propionyl-CoA 3-propionyltylosin (7) 4 ” n-butyryl-CoA 4" -n-butyryltylo s in (2) 5 " isovaleryl-OoA 4''-isovaleryltylosin (3) 6 " acetyl-CoA + 3-acetyl-4-"-n- n-butyryl-CoA butyryltylosin (5) 7 " acetyl-OoA + 3-acetyl-4"- isovaleryl-CoA isovaleryltylosin (6) 8 " propionyl-CoA + 3-propionyl-4"- n-butyryl-CoA n-butyryltylosin (8) 9 " propionyl-CoA + 3-propionyl-4"- isovaleryl-CoA isovaleryltylosin (9)

Den omhandlede acylering af tylosin er betinget af tilstedeværelsen og sammenføringen af tre grundkomponenter, nemlig et enzymaktivt præparat til acyleringen i form af celler eller et enzympræparat, tylosin eller et derivat deraf og en acyldonor. I det følgende er fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere beskrevet.

De: anvendte streptomycesstammer med acyleringsvirkning er: Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 og Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454. Varianterne og mutanterne, der opnås naturligt eller kunstigt af nævnte organismer, og som har acyleringsaktivitet, kan også anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Mutanter, der viser forøget acylerings-virkning, kan f.eks. fås ved til mikrobiel mutation og selektion sædvanlig anvendt teknik.

De omhandlede organismer dyrkes efter almindelige procedurer til dyrkning af stammer af slægten Streptomyces, men egnede betingelser bør tilvejebringes, så den enzymatiske virkning kan få fuld acyle-ringseffekt. Kulturmediet indeholder fortrinsvis sådanne carbonkil-der, som glucose, maltose, saccharose, stivelse eller maltsirup, alkoholer, såsom ethanol og glycerol, olier, fedtstoffer og voks af ve- 9 151262 getabilsk eller dyrisk oprindelse, organiske syrer, såsom eddikesyre og citronsyre, eller salte deraf, men man kan også anvende andre assimilerbare bestanddele, der tjener som sådanne carbonkilder. Stofferne anvendes bver for sig eller to eller flere sammen i en koncentration på almindeligvis 0,5-10 g/dl, og fortrinsvis 2-6 g/dl, afhængigt af arten af det anvendte stof. Fortrinsvis anvendte nitrogenkilder er proteinrige,organiske forbindelser af dyrisk, vegetabilsk eller mikrobiel oprindelse, såsom kasein, pepton, melprodukter fremstillet af sojabønner, korn, bomuldsfrø og præparater fra gær og bakterier og forskellige uorganiske forbindelser, der sædvanligvis anvendes som nitrogenkilder, såsom ammoniumsalte. Andre nitrogenrige forbindelser, der kan assimileres af organismerne, kan også anvendes. Disse nitrogenkilder anvendes alene eller to eller flere sammen i mediet i en koncentration på 0,1-10 g/dl. Med organiske materialer er den foretrukne koncentration 1-6 g/dl, medens den med uorganiske forbindelser sættes lavere. Mediet kan også indeholde sådanne uorganiske salte som phosphater, magnesiums alte og mineralsalte og vækstfremmende materialer, såsom gærekstrakt, kødekstrakt og vitaminer eller vitaminrige materialer.. De anvendes i koncentrationer på 0,01 g/dl-0,05 g/dl afhængigt af arten af organismen og den anvendte mediumsammensætning. Dyrkningen af organismerne sker aerobt under beluftning og omrøring. Mediets pH holdes på mellem 4,5 og 9^9 fortrinsvis på mellem 6,0 og 8,0.

Dyrkningstemperaturen holdes på 20-45°G, den foretrukne temperatur er 20-55°C med en almindelig Streptomycesstamme og 30-40°C specielt med Streptomyces thermotolerans. De omhandlede organismers acyle-ringsvirkning på forbindelserne med formlen II udvikles på et tidligt vækststadium og bibeholdes,efter væksten er ophørt. Særlig høj specifik aktivitet for acylering af en 3-hydroxylgruppe findes i celler fra det tidlige til sene vækststadium og for acylering af en 4”-hydroxylgruppe fra det sene vækststadium· til. eftervækststadiet.

Som vist i forsøg 1-4 kan acyleringsreakfcionen udføres med celler under vækstbetingelser eller i hvile og enten i dyrket medium eller efter adskillelse fra mediet eller med forskellige former af enzymatiske præparater, f.eks. tørrede celler, cellehomogenater og ovenstående væskeopløsninger opnået fra homogenatet og enzympræparaterne.

ίο 151262

Immobiliserede enzymatiske præparater, såsom sådanne fikseret i acrylamidpolymere, kan også anvendes. Som et resultat af undersøgelser over acyleringens art har det vist sig, at der i acyleringsomsætningen uafhængigt findes to enzymsystemer. De benævnes tylosin- 3-acyltransferase og tylosin-4"-acyltransferase og omdanner en 3-henholdsvis 4"-hydroxylgruppe i tylosin til en acylgruppe. Disse enzymsystemer katalyserer omdannelsen på uspecifik måde med hensyn til acylgruppe., . men har hver sin acylgruppepreferenee> idet tylosin- 3-acyltransferase fortrinsvis indfører en acetylgruppe, propionyl-gruppe og n-butyrylgruppe i nævnte rækkefølge, medens tylosin-4"-acyltransferase fortrinsvis indfører en isovalerylgruppe, n-butyr-ylgruppe og propionylgruppe i nævnte rækkefølge.

Den ved den omhandlede acyleringsreaktion anvendte acyldonor kan være acyl-CoA, der er en direkte donor af acylgruppe, som skal indføres, eller en forstadieforbindelse (precursor) for et sådant acyl-CoA, fra hvilken pågældende acyl-CoA-produceres i cellen ved dens stofskifte. De anvendte acyl-CoA er acetyl-CoA, propionyl-CoA, n-butyryl-CoA og isovaleryl-CoA og forstadieforbindelser heraf, herunder organiske syrer, såsom eddikesyre, propionsyre, n-smørsyre og isovalerylsyre, og salte deraf, såsom med. kalium, natrium og ammonium, estere deraf, såsom med methanol eller ethanol, og amider deraf. Omfattet er også aminosyrer, såsom α-aminosmørsyre, norvalin, L-leucin og ketosyre, såsom cc-ketosmørsyre og α-ketovalerianesyre.

I almindelighed sættes acyl-CoA til reaktionsmediet, når omsætningen gennemføres med et enzymatisk system, der har ringe evne til at danne det respektive acyl-CoA ud fra CoA og acylprecursorer. Acylpre-cusorforbindelser kan imidlertid anvendes, når systemet til gendannelse af det pågældende acyl-CoA arbejder godt, f.eks. under cellevækstbetingelser .

Molmængden af den til reaktionsmediet satte acyldonor er sædvanligvis lig eller næsten lig molmængden af udgangsantibiotikumet i tilfælde af acyl-CoA, men er højere, f.eks. 3-10 gange højere, når der anvendes precusorforbindelser. Levende celler kan producere acetyl-CoA fra carbonkilder gennem deres stoffskiftecyclus. Hvis en tilstrække- 11 151262 lig mængde carbonkilde således er tilstede i re airt ionsblandingen med levende celler, der enten foreligger i dyrkningsvæsken eller i form af en cellesuspension, forløber acetyl-er ingen sædvanligvis ved anvendelse af endogent dannet acetyl-CoÅ. I et sådant reaktionssystem produceres også propionyl-CoA og andre CoA, men i meget mindre mængder end acetyl-CoA, idet man også har bemærket en lille mængde af sådanne acylerede produkter i den reagerede blanding. I det tilfælde man anvender acyl-CoA i omsætningen,kan CoA efter reaktionens afslutning genvindes fra reaktionsblandingen ved sædvanligt anvendte metoder til CoA-isolering og kan genanvendes ved syntesen af acyl-CoA.

Udgangsforbindelserne med formlen II sættes til reaktionsblandingen i form af f.eks. opløsning i vand, svagt sure, vandige væsker eller opløsningsmidler,, der har lille effekt på omsætningen, f.eks. methanol og ethanol, eller i form af blanding med vandigt opløsningsmiddel/ suspension/ opslæmning eller fint pulver. Koncentrationen af udgangsforbindelserne II i reaktionsblandingen er 0/1-50 g/1 og fortrinsvis 0/5-30 g/1. Tylosinudgangsforbindelserne med formlen II har en 16-leddet makrolidstruktur og to sukkerkomponenter bundet til 5-stillingen i makrolidringen. Gruppen i 3- og/el-ler 4"-stilling er naturligt hydroxyl eller hydroxyl fremstillet ved kemiske eller biokemiske metoder.

De kemiske og fysiske betingelser for acyleringsreaktionen er praktisk taget identiske med betingelserne, der er fordelagtige for celledyrkning af den organisme, som er omfattet af de for sådanne særlige celler relevante enzymatiske omsætninger. Reakt ionstemperaturen bør være 25-43°C, fortrinsvis 28-40°C,og pH-værdien holdes indenfor området 5,0-8,5» fortrinsvis 5»5-8,0,for acylering i 3-stilling og 6,5-8,5 for acylering i 4"-stilling. Anvendelse af en passende puffer er ønskelig til opretholdelse af den ønskede pH-værdi, når omsætningstypen er en sådan uden cellevækst. De til almindelige enzymatiske omsætninger sædvanligvis anvendte puffere, såsom phosphat-puffer eller citratpuffer, er anvendelige, men acetatpuffer eller puffer indeholdende en acetylgruppe bør kun anvendes i forbindelse med acetyleringsomsætninger. Reaktionstiden er sædvanligvis fra 30 minutter til 10 timer» 12 151262 I det følgende er yderligere illustreret nogle fordelagtigt gennemførte acyleringsprocesser til fremstilling af de omhandlede tylosin-derivater.

1) -n-butyryltylo sin.

De ovennævnte organismer dyrkes i et medium indeholdende begrænsede koncentrationer af carbon- og nitrogenkilder, og når carbonkilderne næsten fuldstændigt er forbrugt, sættes tylo s in i en mængde, der overskrider cellernes acyleringskapacitet i 3-stilling, til væsken sammen med n-butyryl-CoA eller et forstadium deraf.

Omsætningen udføres under praktisk taget samme betingelser som ved celledyrkning. En del af det tilsatte udgangsstof acetyleres under dannelse af 3-acetyltylosin, medens andet forbliver uacetyleret. Samtidig forløber konkurrerende butyrylering af 4"-hydroxylgruppen, hvilken resulterer i dannelse af 4”-n-butyryltylosin og en mindre mængde 3-acetyl-4n-n-butyryltylosin. Af reaktionsblandingen isoleres ovennævnte produkt 1).

2) 4"-isovaleryltylosin.

Ved en på lignende måde som i 1) udført acyleringsomsætning får man ved anvendelse af isovaleryl-CoA eller et forstadium deraf som acyldonor 4"-is oval eryl tylo sin i reaktionsvæsken.

3) 3-acetyltylosin.

Til fremstilling af 3-acetyltylosin dyrkes en organisme, f.eks. Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, i et medium indeholdende rigelige carbon- og nitrogenkilder. Får maksimal vækst er nået, findes stadig meget carbonkilde, og der sættes tylosin til mediet i en begrænset mængde, der ikke overstiger cellernes acetylerings-kapacitet. Kraftig omrøring og beluftning opretholdes under den af cellevækst ledsagede reaktion, hvor acetylering forløber ved anvendelse af det i cellerne gendannede acetyl-GoA, og derved fås 3-acetyltylosin.

4) 3-acetyl-4n-n-butyryltylosin.

i) De ovennævnte organismer dyrkes i et medium, indeholdende en meget begrænset mængde carbonkilde og en balanceret mængde nitrogenkilde, indtil koncentrationen af carbonkilde er faldet til bund- 13 151262 niveauet, og der tilsættes derefter tylosin eller 3-acetyltylosin i en mængde, der ikke overskrider cellernes acyleringskapacitet, sammen med n-butyryl-CoA eller en precusorforbindelse heraf, som n-butyryl gruppedonor. Omsætningen fortsættes indtil det antibiotiske udgangsstof fuldstændigt er acyleret, og det acylerede produkt, 3-acetyl-4"-n-butyryltylosin, isoleres.

ii) Under anvendelse af 4"-butyryltylosin som udgangsstof gennemføres omsætningen på praktisk taget samme måde som i 3) til fremstilling af 3-acetyltylosin, hvorved 3-hydroxylgruppen acetyleres, og der fås 3-acetyl-4"-n-butyryltylosin.

3) 3-acetyl-4j'-isovaleryltylosin.

Til fremstilling af 3-acetyl-4"-isovaleryltylosin anvendes praktisk taget den samme metode som i 4 i) og ii), idet isovaleryl-CoA eller pr ecus or forbindeis er dog anvendes som acyldonor i i) og 4"-isovaleryltylosin som udgangsstof i ii).

6) 3-propionyltylosin.

Til fremstilling af 3-propionyltylosin dyrkes de ovennævnte organismer i et medium indeholdende en begrænset mængde carbonkil-de, men rigelig nitrogenkilde. Uår carbonkilderne næsten fuldstændigt er forbrugt,sættes udgangsstoffet tylosin til den dyrkede væske i en mængde, der ikke overskrider cellernes propiohylerings-kapacitet, sammen med propionyleringsdonorer, nemlig propionyl-CoA eller dens precusorer. Omsætningen forløber til fuldstændig propionylering.

7 ) 3-propionyl-4" -n-butyryltylo sin.

3-propionyl-4"-n-butyryltylosin kan fremstilles i to trin. Først fremstilles 3-propi'onyltylosin fra tylosin efter metoden i 6).

Uår denne første omsætning næsten fuldstændigt er afsluttet, sættes en n-butyryldonor, nemlig n-butyryl-CoA eller dens precusor, og,om nødvendigt, en lille mængde carbonkilde til mediet,, og der omsættes aerobt. Således fås 3-propionyl-4"-n-butyryltylosin.

Forbindelsen kan også fremstilles i ét trin ved tilsætning af 3-propionyltylosin som udgangsstof til vækstcelleblandingen sammen med de nævnte acyldonorer.

14 151262 8) 3-Propionyl-4,'-isovaleryltylosin.

På lignende måde som i 7) får man ved anvendelse af en i s oval er yl-donor, nemlig isovaleryl-CoA eller dens precusorforbindelse, i stedet for n-butyryldonoren 3-prop i onyl-4" - i s oval eryl tyl o sin.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede acylerede forbindelser kan isoleres, renses og formuleres ved anvendelse af metoder, der almindeligvis anvendes ved produktionen af tylosin-forbindelser.

Til isolering af tylosinderivaterne med formlen I skilles reaktionsblandingen, efter den om nødvendigt er gjort svagt sur, fra cellerne og andre uopløselige partikler ved f.eks. filtrering eller centrifugering. Den klarede opløsning indstilles derefter til neutral til svagt basisk pH og ekstraheres med vandublandbare opløsningsmidler, der sædvanligvis anvendes til ekstraktion af makrolidantibiotika, f.eks. ethylacetat, toluen eller benzen. Til yderligere fjernelse af urenheder hidrørende fra reaktionsblandingen blandes ekstrakten med surt vand eller puffer, således at tylosinderivaterne overføres til det vandige lag ,og derefter gentages ekstraktionen ovenfor med de nævnte opløsningsmidler.

En række tylosinderivater forekommende i ekstrakten kan separeres efter forskellige metoder til adskillelse af makrolidantibiotika.

I det tilfælde, hvor deres fordelingskoefficienter mellem vand og organiske opløsningsmidler har en rimelig størrelse, kan man anvende sådanne metoder som modstrøms ekstraktion og adskillelsesekstraktion. Hvis koefficienterne på den anden side er for dårlige, kan man anvende kromatografiske metoder, f.eks. kromatografe-ring på silicagel, og ionbytterharpiks, idet der under hensyn til derivatforbindelsens type foretages valg af den mest hensigtsmæssige metode.

Derivaterne af tylosin opnås i fast form ved sædvanlig inddampning af de antibiotiske opløsninger til tørhed eller krystallisation.

Til omkrystallisation af derivaterne i højren form opløses det rå præparat i sådanne organiske opløsningsmidler som acetone og meth- 15 151262 anol, og derefter- sættes opløsningen lidt efter lidt til en anden væske, såsom vand eller n-hexan, i hvilken derivatet er tungtopløseligt. Omkrystallisation er også mulig under anvendelse af sådanne opløsningsmidler som ethyl ether og en "blanding af ethyl ether og isopropionylether, der udviser lav opløselighed overfor derivaterne.

De otte efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede tylosinderivater, nemlig 3-acetyltylosin, 3-acetyl-4"-n-butyryl-tylosin, 3-acetyl-4"-isovaleryltylosin, 3-pr op i onyltylo sin, 3-propionyl-4n-n-butyryltylosin, 3-prop i ony1-4"-is ovaleryltylosin, 4n-n-butyryltylosin og 4"-i s oval eryl tylo sin har. som et resultat af undersøgelsen af deres fysisk-kemiske egenskaber, kemiske struktur m.m. vist sig at være hidtil ukendte forbindelser. Fy- sisk-kemisk analyse og bestemmelse omfattede elementæranalyse, smeltepunkt, specifik rotation, UV-spektrum, IR-spektrum, UMR, C^-IJMR, massespektrum (kemisk ionisering), frigørelse af organiske syrer under basiske betingelser (gaskromatografisk undersøgelse), opløselighed i opløsningsmidler, farvefremkaldelses-reaktion, forbindelsernes alkalitet, udseende og krystallinsk form. Molekylærvægten bestemtes som QM+ (Quasi Molecular ion) ved kemisk ioniseret massespektrumanalyse. Resultaterne er vist i tabel 2 og i fig. 1-23.

16 151262 , S?a? w

i—l O CO

{>* OQOC^H o CM

ρ vo oj oj oj vo o cs

•H P lACQC^O (Τ' Η M ,, OJ

p,*H -4" 4 Lf\Lf\ CM Ο M

0 03 Γ* r Ο I r* *p CD

in Ο O CO C^H Η H £J

ftH VO CM CN K\ 1 h> 00 ·<

ίΛ-Ρ OWOS Η I

con'c^i I

Ocj-nt^ c» f· r> r ζ} C\1

I i—l 00 O'i—l CM O, GO CM

• I i>i VO CM 4 4 CM

p rH -P '—'' /v / o co P

0) |>5 I rl LiNKM'CNCT' Η H CM P

-p -P O h> OfOCMfOi ΙΆ M OJ 60 erf Φ 03 p p ~ *· ** ** I ~ OH CM ·Η

ί> O-H Φ-rl HCQC5>H 4 -P <2 ‘H

•H erf I Η M VO CM O fA P3 d ίΗ I = erf O CO ^ <D KN4 |> Η Ο Μ O ^___cd__I----- Ό ^§

rj ’lAKNVO VO

Η I |>-ΚΜΑΙΆ CM

02 — «S : r* c· O 00

o 4- I OOOCAH 00 o CM O

Η I H VO CM CM H 4

h H h, '---O 00 H M CM

•P i>5 (4 p O (Τ' i—I O rH I—l O M

-P h.-H P [NKMA4 H 4^3 «Η Φ -P 03 Φ es ^ c- I - ft a

erf O p O !> OCOCAH H

erf ,Q H i—I VO CM A- tOi <<

^ I I h> p ........ EN

(D KVp-P ft OMOS H I

,Ω-------

- a M

M CQ

m p P P -H ^

bD 03 iH A-H VO VO P

CD o erf Η ΙΆΟ 4

j—i _p i' ^ ^ ^ o CM

<Dt>^ 03 O 00 O i—I O 00 id+a hiVDIA (Τ' CM ΙΛ ΜΗ P wwww 00 Η ΙΆ

ri h> M 1ACNCOO IA CM K CU

g -p CM CM (Τ'LA (Τ' O' OM

φ φ -p ΐ' ί' r' ί> I ί' (D φ

Μ Ο Ό Ο 00 CT'H ΓΆ S S

IP ·Η VO CM 4 fOi

Jsj | |> ........ H ^

03 ΓΑ ,p OK O ft CM I

•rl ______ h / i ft / pi

/ P P

/ o o / -Η -rl O 03 / «d -P +3 <D / P I erf H erf a

03/ 83+=0 4= 'w' P

H / £ bO p 4= O 4= P

Φ / I Ρ-Ρ,ΜΡ hcd+3 <d / jft-p t>,y p Ο H ,¾ p / Φ & Φ OJ CD P^j poo •H/ O+^Op Hft ft -P erf *H ft 43/ PP03&0 h03 Φ'Η,,Ρ^ω^ P/ Φ Φ hO ΓΜΦ·Η+3·Ρ4+= erf 03 a

Ο/ Φ SHP Φ 03 ft rH O CM PI Φ pp O

• ft/ Φ 03 Φ erf Φ^ν H03O Φ Φ h*? g +3 O-^.

CM /03 ·Ρ H ^ Ρ» Η·ΗΗΗ / j>s p Φ SS03 03 03 ‘—‘Ο P-PP3

1—I / I—I

φ / P f \ ,Ο / p i—I CM KN 4 UN v£> p / «aj V_y v_v w v_x w E4 L_L______ 17 151262 d s~\ s-\ ^

•H it A- CA O

CQ OJ LA IN it v ^

Q «s ** r* c* O CO CN

Η HOOOOH O CM H

h cd CM CN M ^ 40 '—/ v_/ O Lf\ Μ IH ΙΑ ιΛ CD CD Ο Η ΟΝ Ο h ΙΑ CD LT\ it Ο 00 +? g

m U ».**«»«< H I ^ WS

•η φ h 00 co h . ,O

I H CD OJ it CA

= Crf ...... " >A , H

4· > O M O S Η I __ /-~Λ f~\ s~\ P(

0 I O CO O CM ,- , H

£j H (A it CM it >A it „

s h, ~ - -- O COHH

-p u O 00 CA H 0 cm cm a erf K O OJ η M -5? s 40 s—/ '—- w (D IA pq ·Η •H a a ΚΝΙΛ^-WOOH OH Ή U rQ-rl Ο Λ ON ^ 4· +? g

CP | CQ r' r* 0 ·> I ** ΡΊ H

rdilO HOOOOH >A

1 I H CD CM D- LT\

d = i>j ······« 4- H

•H it-P O W O Η I

02 _____________ .

O

iH Cj i>5 i a

Id - /—\ rs ss H

it O ON 00 ^ <H I Ψ ^ Ο- ^ mrv.

rrf j—4 I «Ν c» c* r* O CO

h>H H 00 00 Η Ο (M CM

^ fih' 0 oj n ω a) 0 a ^ ^ w vo co 3.,

p ·Η Φ ri ιλ ώ 0 h ia h ON

Crf ftH'ri fH O t N ^ g CM g § id OttitQ Φ «.ror. Η I *· W Θ

CQ Ci>0 > HC0C0H !A

a ft Ο Η H CD oj g rc\ φ i ra (5¾ a ······ ” 00 . --=1

{£ KVH-P ft Ο Μ Ο I25 Η I

φ -----:— ----

M

0 CQ

M Pi p| P) 02 I H -H g h=cqh^^~n^o h a t O H 00 r-H O'- it ..

0 I H Crf O it H IA oj

M pllbs. -P r r r r· O CO

T W β H 00 (JNH o OJ O

J4 riHhiCDOJ 00 ., H

02 Ok> fH W w ^ OJ 00 M CM

H -HP id CA CN CA IA it H ON

5 ftR, , O IA CM IA g CM g I

i>a OH-3 43 »- 0 »- «- Η I ** PH Η

ft a a =d H 00 0^ H *A

ftp H CD CM CM NY H

II J> ........ 00 iAd p O ixi O IS,___H__!-—j—- I ft / a ?h

/ OO

0 / ·Η Ή ^ CQ

m / =d -P -5 ^ H / fH I erf H erf a

0/ § -PO -P '—’ P

-d / ^ bD fH -P Ο -P fH

a/ ffin^jypHCD-p H / fH +3 a OH^d p/ 0{b<d φφ a rN ao® fn/ >d p Φ a H ft ft Ή eg ·Η ft 0/ a a to bD 1>sCQ 0«H p>O2 ft/ ΦΦ^,Φ id®TH-P-rHit-Pcrfra a / φ ana φ 02 ft h ocm η ® aa^-o

• / © M 0 erf 0^. H 02 Ο Φ Φ a -p 0 >R

cm / cq -d h ap^. ^ ft1 * ·* *τ3*ri ^i-1 / hi a φ 3 a a cq m ω»ο a-p w H / Η I—1 0 / erf ' /-'s p / d H CM IA 4-LTN ω

Crf / ^ EH ______·—- 18 151262 c« c» r* r> t·* r· r> c*· c* r> c* c* ·** lAO^H^tfXHOOOKIcO^O ^-OOJOOO^-OVO CVlLAOOKNrl i σΝοθΕΝνί)ΚΝΚ\κ\ΗΗθσ>σΝ(ϊ) i—] CM CM i—I i—I i—I i I ! 1 i i i I i i ®

Sv c i'r'i'f'i'*'·'*'*'*’· ^ ^ "sj1 H

d o Od-K'.C'-OCT'a'fftO-OOOtl'ft CO H h

0 COLfNd-K'iftCOftLrsK'.COO-'COd- · · W

•Hd ^(DNiD^lAIAWHO^mcO kD &D d

Pift CMCMftftfti—Iftftftft ft ·ΗΟ

O ζβ rroi'i'r.i'rf'i'f'rsi'i'H-l SH *H

d O O OOOCJ'd‘O-HlACN-COOH-^1· Pi P)H COCOKNCOLftO-CMGO^OOftOOOGO o

Ih. d-OOENCO^'t'ftt'PCMftOOCT'a'CN d K\-P KN WWrlrlrlHHHH ft’ Pi_ #S ΟΟί'ί'ί'ί'ί'ί'Γ*

OLT\HCOI>-t>-[>-l>-OJCU

cod-d-CTNO-O-d'iAoo^- &0 1 C^OOCNlAhftOJHOCT'CO Od = 1 CM CMftftftftftft ^ ^ m Fl j—I rif'rtr.f'r.f'»'*'*' LT\ r-! O p^j I h o IA O CVJ CO KN OJ 00 O O · ·

Hd d-COOJt'PHOCNCOOO &D bDhd

hPdd-COEN'Dd'l'ftHOOCT' ft H CQ CD

ft ft ft K\ CMCUftftftfti—Ift ft ftOft

CD C\5 CQ I #sr»rv^rvr»^o*N ^ CD

0 !> O OOOCOO-OCMCMOft Ή >

d OH H^OtNIAOJ-iCVIfAOJ tiO

irn'h ir\cjNco<O^-fft<M Η'οσ^ 'd cq ΙΛ·Η ft ΙΌ\ CMCMftftftftftft ® ft rvrvoor'oi'f'*'»' ΟΟΟΜΑΙΛ^ΜΒΟ' ΜΦΐΛσ.1ΝΟ^·ΡΦ<1· &0

1 O' CO ENLfNKNKNOJOO'OO O

s ' ojojhhhhhh cm

.H" I cvr»r*or*cvr*r*o*^ -^J" j—j 0) O

IH OOOHOJOO(7'd-C\] ° 'PR

Hh d" O' K\ IC. CO t\l U) 00 CO O M) 60 h h hddd-coi>-'X)hftrftOJOcr'Cr' ·η h cq cq ft hft K\ CM CM HHHHH ftftCJd φ _(_D CQ I ,^Η §1

CdOOO OLP\M)OOd-OLfN ft S

niPH O^ONiAÆdONftlCM *d oi

IlhlAO'COCO^J-KNCMHOCJ' 'dl rOvd-PfPCMCMHHHHHH ® ij

O OCOCOOLT\tC\OiA CMC''.—ICOcOKNCMftCM

CT'O-O-IAKNCMHOCT' H

CMCMHHHHHH ft f.r.fsi'i'of'i'r·»' · · Φ I O LT\rO\0 KNLTNOO ΚΛΚΝ0Ο fc0 &0 d H kOK\rCvCMOCOrC\-d'lAl>C\ ft ft h

hd O'COtNVD^WftOO'tt) ft ft CQ

P>ft CMCMftftftftftft P

ØCQ r'Oori'i'Af'r'r ^ OO OLfNOO-K'.LfNCT'COC'-KN ft dft ^-COftCO^j-C^LTNiNOOCr' 'd

Ih ^OOINVD^-aiftOO'CO 'd rC\ft K\ CM CM ft ft ft i—Ift. ® 0 / 01 / i ft / ft R ft o / d o ^ ft d / o a R o d d/top^-'' hi>d ft ft R ft '“V m &0 ft / d ft d rc\ -p o H / H d d ft o / d »p OrMdd ft/ oftd pCQdg / d cq ft O « ft ft o / d ra i ft d Md / d R R I s ro ® / d ft o pq g PR &Dft cq /cQdftWO SO d o d / [4, H ft ^ ^ od h0 / 'd / 4 £_ p p 19 151262 #» #> ^ λ ^ _o é* - I ΙΛΟΟ1Λ4^γΙ00Κ\Ο

H iAONlA(TN[NINWaiCOO

h. CTs[N1NlAKN(\lHOCr>Cr> Φ P-l CMCMHHHHHH O CO j~l

(1) —! I—I rS

Η ΙΛΟΟΟ'ΝΟΜΛΙΛΟΟ ψ

Cd CD 4· 4* CM Η CT> Η ΙΑ Ο OJ · d > d (^COMDiWHOOON 60 60 Φ OH OJ OJ Η Η Η Η Η Η Η ·Η ·Η Η

(ft (ft r*r»o-r»r»r*r*#^r*r» S—| HH CO

•H O 0-0 OHCNCNCTNtACOH; >

IH O'nCOK'sOOIAHCDCOHCD O

= t>s HCOD-VDH^HOOCT' Φ H -P rO\CMCMHHHHHH ‘d is <% r> r c* f* c *> LAOOCOrOiHCOKA i ia^ooJhwhcm H <T>O-'X>d-N>'HO0v‘ [>ϊ CM CM Η Η Η Η H O- fi t^r^r^r->r*€>r^r*r* (j\ j—| Φ R, oO^d-COiAOiAKNCM d -P O- H CM CO CN O- CA O H · * P?

p d (j\COOlAK>rlOCJNOO 60 60 M

,Q H OJOJHHHHH ·Η ·Η d I JQ rof'r'f'f'i'#'#' HH HH Sk

do ΟΟΟΙΛίΟΙΰΙΛΟΙΛ S

IH COOOHOJOCDCOCOO W

= h> ^-coo-cd^-cmoc^co I

Η -P KNCMCMHHHH h - •ri I 02 isr**'*'*'***'·'·' = o ΟΙΜΛΙΛΜΗΝ1ΛΟ 60

HH O-HKNCOO-O-COOO „ O

I f>s CACOCN-LAIAHOOCA _ M3 „ ®

H-P CMCMHHHHHH CO H ® B

si.p-) HP’s d>s OOOlSCMOCMlAH · · h> ®

Od J-COHWHOCMNCM 60 bO Φ d

•ΗΦ HCOO-COHKNHOC^ Η ·Η fl D

ftH rAOJCMHHHHH *H 'H OH

Q I Ή CO

pi> οοιαοοοοοοοοηγα fti>

Qj o (J'Hcoo-lpvhHlpncoH po

I 03 HOND'-COHtAHOCT'OO d M

KVH ΙΆ CM CM H r—1 Η Η H Pj*H

d ; IQ OIAOOOOCOOO 60

HoHCOO-LAHCOCOO o

IH

Hh, CM CM Η Η Η H - ®

dH lAlAHCMcfCJOfCi h> H

oh enHiacao-o-hoj · * “ H d 0"\ 00 IN ΙΑ ΙΑ H OCT'' 60 bo dw

PiRj OJCMHHHHH ·Η ·Η p d ø _p hH HH *riSk

p p OOOlOd-OiAOtA ft S

ftp rpOOlACMOCNLTSCDH p ® II 403MD4WOOC0 dl K\ pj ΚΛ OJ OJ i—ii—li—ii—1 ftrf

/ q. d H

/ f? Φ 'd Ή Φ Og B ®® CQ / CQ p^' 15¾ p d H/^d-P ra_on

Φ / Cd-p φ m m R

Ό / H S R "S

d / fri 0) XI r^PHCu •H / O ft cd ''H 2 -2 o

p / p cq -P ^ OmHmR

p / cd CQ I H HSSmB

O d d d I § H S® -¾ Φ H O PQ S g « _ 2 / CQ d H W o CP CD f-l J j>3 .,-1-pcD OP W) / cd ^~n /~'

ti CN 00 CO

/ .¾ O' 20 151262

I #· 1 - I

Pi r· (1) CD 3

I Pi H

Η O O

h> -P -P P

£ 02 02 0 O bD ,3

•rl fl Hi :0 -P

PrH * ' ®'

ora · pi ^ H

ρ o 02 ω I ri frfH ,¾ N ^ rf 1 h ® rf . +? K\rf · ω Pi 02

rf A O

I—I

. ^ j—1 —-

P -P -H

<D crf S

I Pi -P

= I O 02

Η -P O ~ P

1 h, 02 irf ^ ® rH P rf rH P I rf

02 Pi h, 02 ^ -P

-P H -H A A . ®

02 Crf 02 -P -P Pi H

0 !> Ο H 02 02 ·Η h>

(rf Ο Η O 02 P A

1 02 k. Pi · g ·ρ -P

ΓΌ\ ·Η -P erf 02 p i>s- 02 rf rf 02 rf -P 02 H Pi _ 02 · Ο ·γ1 -- «HP Si 02 02 02 rf ** -

I rf P ft I O

a ω ω ro rf +

ctl · -p &D f> Pi P

1 Η rf 02 O Crf 02 rfS>s 02 -P !> 02 rf

I^Plpj^pjrH P -P

-P h>*H p ~ 3 P rf h> ^ 02

02 -P 02 02 p Μ P 02 02 I . H

C2pOH02 02 *'-P-HH'—' i>5 erf rf h o rf rf rf rf æ rf

llh>rf-PlP®PO-P -P

K\p-p o©pcrf-prfi>02 02 Μ H i> 02 p.

Η ·Η ·Η ·Η · p 02 erf rf rf O 02 02 rfrfprfrf P FQ H - - ω 02 &o P 6D bo ο ω -

Pl -H 02 ·Η ·Η rf ** rf

02 · r—I Η H P

i> 02 Φ ·Η 02 02 »· I ·Η erf rf 02 m 02 ^ ^ rf rl 0) S rf S 8 + p

1 Η Η) Η H '—/ Ή O

Η ·Η ft ·Η Pi ft ^ rf rf

i>sP -OH OOrfO

rf-H rf 02 02 C2 p rf P

02 02 [Q p rf 02 rf rf 02 bD 02 02

00 8Φ6θ8θ)ΜτΙδ! ·Η P

crfrlrHrfprHbOpr-Irf 02 r—I

1 h ρ,-Pp. ft'OpQCrfCrf 0 K>rf OQ2rfOprfgCQ rf rf

I P

ω / 0

02 / I -H

H / rf grf ω / ω i 0 erf rf / rf . 11 02 i 02 d/Έθ g 02 -P bD g H -rl •rl / -rl 02 02 Pj 02 Pj 3-Hr)

rf/H p 02 O rf ·Η -PH

p/ CD rf H *rl ·Η P H Crf

Of m 0202-P rf 02Q2rfrf (rf/ & . · f>rfrf erf Slrfrf02 / H Prltii rf rlrfPh / 02 (rf Crf Crf 02 rf fprf 02 p /02 O rf rf P Crf O g {>rf / ^ / irf Ο H CVJ |rf>

/ p H t—I H i—I

21 151262 __ Η .

h * to . *7* ω I h> H Hrg ft > ft · «» A ®

ο -H 02 -P ο I

02 03 ,±4 ft ·* ^¾¾ •Ηοω-Ρ ^ ft® ^

I H · <D I o P P

— J>jj C[_i ¢) ^ 03

4- {? * Cd -Η Φ <D

ft H g <D t>s o _ ft Λ η ---

Ο -P H

I -P ® -ft

Η Φ £ I

>5 P · , d ρ cq *· ih !>a p »» ^ h rft

-P ~ © U I h-P

ft ft H ° ft ^ A ¢0 p -Η O A P . p I .

I CQ ft -P ft ft ft ft ft O ft ft ft ·Η (¾¾ ® I H p ft ft ft o p p = bL 53 3 ft P cq-p-p d- -P <D-P ft h -h ft ft m <d p o ft H ft ---

CQ O -H

I M - ft S

= <d ft -p _r ft- · φ ftp - ~ I <h P A ft . 'Ο ri I « -P CD ft + hH ft ft t)D ί> ft ^ ft ft h ® η o 3 ®

Oft H h . -P i> ft -ft

Ή ft ft O p ft H ft -P

AH *H rft -P ^ cd P h ^ ft

0 ft ft O ft M ft ft oil H

ft b O rM ft «* -P H A v-/ h

Pi Ο Η H · p P ft ft !> P

1 CQh ti 03 I ft Φ ft p -P -p KVH-P M ft 3 ft P !> ω ft φ Φ i> ft ft ft · -Η -Η -rf · ft Φ _ φ ift ^ .μ o ft ra----

ft |> ** ft -P ft -ft -ft ft FQ H

I -ft cd Φ ft 60 ft 60 60 O ft

= 03 H ft ft -H ft -H -rl P « P

d" O ft Η Η HH ^ ft I Η ·Η p O ft ·Η ft ft '•I -rl

H h -P-PD3 02 CQ ^ ^ P

h+3 +> ft 8 -P S 8 + ft ft

ft H 60 bfl H bO Η Η '-'•Η O ft Oh) -rl ·* O’ A ·Η A A .rft A P

•H ft H® OHOO P O -P

q. h ftftft ft O ft P ®

0+3 CQ O ft += ft -P -P CQhO CQ H

ft ft . φ +3 n bD o ft bD Ή fi ·Η h AP H ft ft ί rl bO d Η P ft rft II cl o ft ft A O ft oro co 43 K> ft O ft p -P O ft -P S CQ P ft ft / ft / Si 1—1 / Ό ri ft / rft ft ft rft / ft I Φ-Ρ ft / H || 03 > 03 •H / to -p M)d>5 p/.rl ftftft ft ft ft f-j ft

p/H ft 03 O -P -H P O

O / ft iH H rl Ή ft Η Η Ή (X,/ CQ ft ft -P Η 02ΦΟ-Ρ / s [> P P ft ® P ft / H hH ft Λ HftH 03 / CD Qi ft ft ft Η A’d ·Η ·Η

/ CQ O CHpftftO^-PH

/ H* /"» ^ ^ / ft O A CVJ K\

/ ft Η Η Η H

/ <} V-/ N^/ w V-/ 151262 .....— 22

De otte forbindelsers ultraviolette spektre afviger kun lidt, som illustreret i fig. 1 for 4"-n-butyryltylosin og fig. 2 for 3-acet-yl_4»-isovaleryltylosin. Den største absorptionsspids ligger mellem 282 og 285 mi (det samme som for tylosin), hvilket indikerer, at der ikke er sket nogen strukturel forandring i makrolidringens keton- og dobbeltbindingsstruktur.

Era bestemmelsen af frigjort organisk syre ved gaskromatografi og fra analytiske data for molekyle vægt en ses det, at forbindelserne har fælles grundstruktur: tylosin bærende en eller to acylerende grupper, nemlig: acetyl-, propionyl-, n-butyryl- og isovalerylgrupp er.

Ira analyse af data fra IR-spektrene og DMR-spektrene bekræftes ovennævnte struktur af tyl o s inder ivat erne med den almene formel I. Data fra kemisk ioniseringsmassespektrometri er vist for 3-acetyl-tylosin (fig.19) og 3-propionyltylosin (fig.20) som eksempler på 3-acylerede derivater og for 3-acetyl-4"-isovaleryltylosin (fig.21) som eksempel på 3- og 4"-acylerede derivater. Ved sammenligning med data fra tylosin kunne hver del henføres , hvilket afslørede fragmentation i bindinger C^-0, 0~C^" og 0-0-^, dehydrering og deacylering i både tylosin og derivaterne. Det blev således vist, at acetyl- og propionylgruppen er bundet til makrolidringen, og at isoval erylgrupp en er bundet til mycaroseringen. Data med andre forbindelser er ikke vist her, men gav: samme konklusion.

Eksempler på C ^ EIMR-spektre er vist i fig. 22 for 3-acylerede derivater med 3-acetyltylosin, og for 3- og 4"-acylerede derivater i fig. 23 med 3-acetyl-4"-isovaleryltylosin (25,2 MHz). Som et resultat af sammenligning med signalerne med de for tylosin kan det yderligere sluttes, at acetylgruppen sidder i 3-stillingen af makrolidringen og isovalerylgruppen i 4M-stillingen af mycarose. Andre forbindelser gav også lignende data, der viste bindingsstillingen for propionylgruppen og n-butyrylgruppen og identificerede den kemiske struktur.

Yderligere sammenligninger blev foretaget mellem de omhandlede deri- 23 151262 vater og de kemiske syntetiserede ifølge den kendte teknik. I japansk patent nr. 36-22649 ("fremgangsmåde til fremstilling af tylosin") er i eksempel 4 beskrevet den kemiske syntese af en tylosinacetylester under anvendelse af acetylcblorid. Det bemærkes, at vægtindboldet af acetylgruppen er 8,22 vægtprocent og pk-værdien ca. (elektrometrisk bestemmelse med en opløsning i di- methylformamid-H^O = 2:1 efter volumen). I eksempel 5 i ovennævnte patentskrift er ligeledes beskrevet synteser af acetyleret tylosin ved anvendelse af eddikesyreanhydrid som acetyleringsmiddel. Acetylindholdet er 8/91 vægt-% og pk-værdien er ca. 5/2. Kemisk syntese af det acetylerede tylosin blev derfor udført ifølge metoderne ovenfor og sammenligning udført med de tilsvarende omhandlede forbindelser med hensyn til deres Rf-værdier ved tyndtlagskromatografi under anvendelse af pladerne "ART 5715, Merck Co." og en fremkaldelsesopløsning af ethylacetat:ethanol:pyridin (85:15:2 efter volumen).

Ifølge dette gav den efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede 3-acetyltylosin en Rf-værdi på 0,59, medens den i eksempel 4 i ovennævnte patentskrift omhandlede acetylerede tylosin havde en Rf-værdi på 0/71 og produktet ifølge eksempel 5 i ovennævnte patentskrift Rf-værdierne 0/70, 0,75 og 0,83, hvilket viser, at stoffet er en blanding af 3 forbindelser.

Andre undersøgelser bekræfter også forskellen mellem det omhandlede 3-acetyltylosin og disse kemiske produkter. I det refererede patentskrift angivet smeltepunktet af den kemisk syntetiseret propionyleret tylosin at være 101-111WC. Denne værdi adskiller sig klart fra værdien 187-192°C for 3-propionyltylosinet fremstillet efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

De antimikrobielle spektre af de omhandlede derivater af tylosin er vist i tabel 3, udtrykt i de minimale væksthæmmende koncentrationer (MIC yg/ml). Disse forbindelser har et forholdsvis bredt antibakte-rielt spektrum overfor grampositive bakterier. Toksiciteten af forbindelserne blev prøvet på dyr, og LD^q-værdien på mus ved intravenøs administration viste sig at være større end 400 mg/kg med alle forbindelser. Ved terapeutiske forsøg på mus, der kunstigt er inficeret med Staphylococcus aureus Smith, var ed^q-værdierne mindre end 50 mg/kg (p.o.) med alle de antibiotiske derivater.

24 151262

En af de særlige fordele ved derivaterne af tylosin i forhold til kendte makrolidantibiotika er deres udprægede antimikrobielle virkning mod lægemiddelresistente bakterier.

Resultaterne af nogle sådanne forsøg er optaget i tabel 3.

25 151262

Η I

S Η ^ S3

^ o m w in « W

·Η d CM H CM H rH

&·Η ·> * ·> ·> ·>

rj OCQ OOO O O O O O O O

o do in in in in in

H PH CM CM CM CM CM

-P I 15¾ . \/ \/

d oo -p A A A A VV

d________—-—-

"P

g ='.

O Η" H

r-l I

0 i—i d οί cr> in ca in

rM !>s CD d -=4- CA H" CM

.|_1 Λ *N Λ Λ ω ωώωοοο m ο ο ο Η ο ο Η ο > ο in in in cm in

d di OH CM CM CM H CM

Φ I 01 i>3 1 oo -H -Ρ Λ Λ Λ_ Λ____ d =

-Ρ I

μ Η^, inmcocncM

li^dd CMCMC^-^H

J> _b b4*H ·»·*·* * * cd-pmooo o oooooo H o d o in m in in in

d 03 rC2 H CM CM CM CM CM

S I I !>a •H oo d -Ρ Λ Λ Λ Λ V.

d-------

•H

S d

•H

01

0 H

i>5

-P

H in cm cr\ in cm

CM H ^ CM H

1 -I Λ Λ Λ Λ Λ (1) οοο ο ο ο ο ο ο ο ο ιη ιη ιη ιη ιη

CM CM CM CM CM

% jno__AAA_A__V

'M- in

CM

^ oo pq d ω Ph oo p h) -P d φ d -sf-WHooWl

d / cmh o3 -hcmeh fP

-p /inCTi^ a) -p 0 H <3- / o w ° Is ^ d ,

Φ / cn οι φ (d so M3 . ρ4 H

p. /'=4-gdcHtH cn (¾ 'vira ^ o o d ra ra g oo / s η o h d d o _ ^

pj / mo <Dd)pS

Η η οι o -P d d d eh d o CD / -Hd d ° § § <3 -H p •H / CD Η O -H -p -rl 'H d d d & JO / fd cd ^ 1 -r4 -rH CQ CD «=lj o / 8oHOp>dQ> m κ d -p ^ d / u -H 'h cj ra 3 -P d d ® gi «fl M CD / .HP ^ d W) d O O d W) Φ H ra / p o ra d h d -Ρ οοωω-ρ ρ H / Hdn5-H o-η ooogd •η ω/υ aS-Pd^Hg -p^ ο o d 43 O/i o 0 tf ra ra o 0 ra ra d d/1 cedg-Hdrad^HHddca <j -H/ro Η d 0 do d ·η ra b’b,riri ^ P/+3 ·Η H 'd ® ·Η CD 8 d d Η Η -H d / ai 'd 'd d d -ρ -p ra ω ρ p-η -H 0 η ο/m d d ^ o tf 0 d ra . tf cd 0 0 d ^/60 3 3 01 ra H d Eh -Η -Ρ -P d d d

H / s ooPhWS-p ^p w m pq W W

'φ / q H CM 00 P" in M3 C~- oo CA H

26 151262 cr\ in cr> in cm ri C\l CM Η d λ Κ »v ^ Λ CQ οο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ιη ιη ιη ιη ιη

Η CM CM (Μ CM CM

ri·*. ·ρ Λ Λ_Λ_Λ _ ^ Η i >s ^ ri

CD

ο ώ στ in co οο cm •Η ί> ri Η* CM OT OT Η +3 O -ri ·.·.·.*.·.

d mm οο o m oooooo ri -ri o inin in cm in

-p I H CM CM CM H CM

Φ ^f--p Λ Λ Λ Λ V

Ο --- — η > Ο Η Μ 1¾ ri CD !>a rri Jjj in in co ^ in

. CM CM (Τ' CM

0 -Q .|-j λ *s ·>. λ

g 103 OO O in OOOOOO

g d o in in m cm in STh cmcm cm h cm £ - ί>3 +3 ^+3 Λ Λ Λ Λ 03--—-_ ”

Μ I

£6 Η > 1 &

Η ri Η >s CD

g ο "ο3 cn in co or in

3 ·Η > ri H- OT OT ^ CM

d P O -Η ···.·'·'*'

ri O 03 03 O O O O O O H O O O

g ri H o in m m in m

Pi I H CM CM CM CM CM

1=1¾ m^-P Λ Λ Λ _ Λ _ i 1 Η Η !>a >ι ri d 1¾ m op« oo in in or cm

•H ri ri OT CM OT .J- H

P O ·> *> ·. » ·» 0103 O O O O O O O H o o ri ri o m in in m in

Pi I H CM CM CM CM CM

I = >3 nM-p Λ Λ_Λ_Λ__Μ— οο ^ (ri ςη 1 cq στ στ

S·^- Ή CD Ο Κ I

CM Η +3 03 CM ΕΗ fri ri ιηστ α3 ω ο3 R η ^ -ρ ο <- ri ri ω <ij s ro jri

W στ 03 O ·Η 03 (ri tri CO Ph H

CD S g -ri -ri CJT rtj p. cd +3 o R 03 03 am 03 gHo cd ^-* r ri ri o _ στ

y<3 03 R,riE-l03 CD CDO S

H 03 0 **ri +3 ^ri ri ri ri Ej ri O

•ri ri H o ri ri < -H O

CQ i—1 O ·Η θ3 ·Η ri Ctf Co EH

d cd ri HCD-H+3 mø-aj 8 oh oMricrmra ri-P^ o-hH o cocDririDriri •Η P P6DPOOri&i00 +3003 dOriri°ocucuri! H ri cd h oHoooari

cd +3 g ,ri ø S o o H

οιηο+3 ροοωω^ dririCM.Hri03OHHririri Η H O •ri+3ricHb,c?'-fHri Η -Η H (ri CD ·Η © ,ri rri Η Η ·Η HH ri H R+3+3® PP-H-H O ri ri CD m 0030+3Cdo300ri S8o3h 03driri-P+3cdo3cd oofMSfriHp-ptritriirifritri „ „ „ „ _ _ _ _ _ o 27 151262 - — pj 1 £ i>S ° u +3 0 cm in H in ω •Hfl H cm cn cm in in g

pLj»rH ·*·*·»·* ·> CQ

ora oomoocMCM ® s_i o in co co rf

ftH CM vH

1 1¾ ^ ΓΟ-P V A _ |h

j - -P

z \ Ph

«d-Η P

I >3 ‘H

H g? ®

Φ d in ο H co H

-PH-H CMincncninvoO'i ra cd c3 ra » 0 > O O O ro O CM in no > ώ o H co H — 1 ra (¾ ra-H-p_____

J

I H

H !>s in O m crt 1¾ d £ cm in cn a- coco -ρ [^,.η ·>·..·*·* *- * Φ-praoOHO Oinin ϋϋο in Η H ’

cd & H <M

111¾ cOfl-P _____ ' 111 - 1 " Γ; H CM in H O'* rf H CM 00 "d- _|_D .j_| » » (s »» Φ03 OOtr- OOOin ο o in in · cm

CO H CM CM H

1 I» co -P V__A___ t- .

O

CO H

O O C~- 'Φ

Ο Η H C~- S

o oo ' co c~- · a O B ro o co M co H <! CO S +3 co co oq co * ra H ra s g ra

•h o -*· * ® -P

ra -ρ o ra ra d £ / η ·η σ1 Ej ί ί ® ® / !> ά <ή Φ φ 60 , -Ρ mow ΗΒΡ 03 /dprarappi^ ·η > g τΐ ni (j ft ra

Id g ra Η φ / Η ρ ·η ra ra k /i+H-Hg-Pi^raH / m ρ ,ω ο ο 2 φ φ/ΙΏΦ·Η^Οϋ ·ϋ ^ ra / d -ρ k ra ο ο ο Ό η/οοφ οοο-η φ/φ ocd-praooo β /g Ο ,Ω Ο Ρ Η Η Ο φ rj/a Ο Φ CO Η >a 1¾ Ρ ® •Η / S Ο d rQ Η rP rP ft ίΒ £t -Ρ Ρ P>> O ·Η ft ft Φ Η U m ο g-ι ο ο cd ctf ?η o/ra-rioi^cd-p-p-p *

fr/fciDSO^fQ WtoCO

/s I CQ /-s y^-N <^S · / Sh HCMrO'd"inco[~- g lo HHHHHHH ^ 28 151262 οΰ δ η ό\ Η m oo "vt- (—} »i ·>» *ν •Η O O c~- Ο Ο Ο Ο ^ 01 in in in d ο (Μ CM cm ro Η Λ ^ i>a ΛΑΟ -ρ -Ρ __ ω

S

Η d g Q) -Η Η ιτ\ Ο Η CT\ Ο 'd tf w ιη σ> ιη νο ω d j>ri ~ — ----- ο ·η οο mocviLPiir- -p οι σι - νο Η d •Η Ο ·ρ I Η 'Η = ί» 2

"vh-P

--------------- 01 1 s Η > 1¾ d -ρ σι οο η σ d d ^t-θΊ cri'vt- ir\vo Ο #r_J Α «V Λ Λ ·*» Λ 101 ΟΟ ro 0-0 CM ΙΓΝ do ιτ\ νο Η Τη ^ -15¾ , •'t-Ρ Λ_ - ϊΗ I >3 Η d >3 0) d Η Οι Ο Η Οι Η Οώ ο CTi^mvoCTi .(_] |> rv λ r» »s Ρι Ο ·Η OH roOCMinm

0 Cd 01 VO H

d H O

Pi I H

1 = >3 rO"vf--P_______ i

I H

H >3 >3 d d 15¾

o -P LO O H CO

Hid CM LTi CT\ ^ mvo plto .f-j ·*.·> »s ·* *» ·*

0 I 01 O O ro O O H LO

d d O LO ro H

PiTh CM

1 = >3 ro>=d--P______— ----o oh ω o η H tH g

^ ro VO C- C- I

0 cl o σι co ro H <h vo ffi +3 co vo m m S oi H oi S S * ."i o * * oi -p 01 d o ω οι ω d h-η tf H ddd ®

£> S <| <D <1) CD H

01 O få d d W) 01 dPm oiddo h I £ 5 -H cj tf 1>3 01 / d S m H pi ω / Η P . H 01 01 d /hh s -p d d ω h / d d ,o o o d ω

α> / οι ω ·η d o o o H

01 d -P d OlOOO H

H / o o ro ooo h

Q)/(DOd-P OlOOO S

rtf/gOrOo d Η Η o ω d / S O (D tf H !>3 1>3 -p •h /ro odP i i rd rd Pi

,13/+3 d R> O H Pi Pi 03 H

d/oi odOi^-odejd O 01 HOf^OCj -P-P-P *

Pi/6D gogcopqcaracQ

y s I r. i r\ r wn h- ia in r»«— cf 29 151262

Stammerne mærket * i tabel 3 er lægemiddelresistente stammer isoleret fra patienter, nemlig Staphylococcus aureus MS 9610, der er resistent overfor angolamycin, penicillin, tetracyclin, erythromycin, leucomycin, spiramycin, josamycin og tylosin. Staphylococcus aureus MS 8710, der er resistent overfor angolamycin, penicillin, tetracyclin, erythromycin, leucomycin og tylosin, og Streptococcus pyogenes ΜΗ 771, der er resistent overfor angolamycin, erythromycin, oleandomycin, leucomycin og tylosin. Blandt derivaterne har de med en 4"-acylgruppe, nemlig 4"-n-butyryltylosin, 4"-isovaleryl-tylosin, 3-acetyl-4"-n-butyryltylosin, 3-acetyl-4"-isovaleryltylo-sin, 3-propionyl-4"-n-butyryltylosin og 3-propionyl-4"-isovaleryl-tylosin, særlig stærk antimikrobiel virkning mod en lang række lægemiddelresistente stammer.

En anden fordel ved derivaterne af tylosin er deres høje blodkoncentration i dyr. Når en af disse forbindelser administreres oralt i mus i en dosis på 100 mg/kg måles en koncentration i blodet på 5-20 yg/ml, hvilket er en meget høj værdi sammenlignet med værdien for tylosin (< 1 yg/ml). De derivater, der bærer n-butyryl- eller isovalerylgrupper, udviser specielt fremragende absorption ved oral indgift. Deres koncentration i blodet en time efter administrationen når op på 15-20 yg/ml. Disse fordele viser de omhandlede forbindelsers fremragende terapeutiske nytte.

De omhandlede derivater af tylosin er basiske forbindelser og danner ugiftige syreadditionssalte med forskellige organiske syrer, såsom vinsyre, eddikesyre, propionsyre, citronsyre og ravsvre, og uorganiske syrer, såsom hydrogenchlorid, svovlsyre og phosphorsyre. Disse salte dannes, isoleres, renses og formuleres ved de til salt-dannelse af 16-leddede makrolidantibiotika almindeligvis anvendte metoder. Et vilkårligt af tylosinderivaterne og den valgte syre opløses f.eks. hver for sig i et passende opløsningsmiddel, der har lav opløselighed af salte, f.eks. ethylether og acetone eller deres blandinger, og blandes derefter. Opløsningen inddampes om nødvendigt og afkøles, hvorved der fås krystaller af syreadditionssaltet, som samles og tørres til et hvidt krystallinsk pulver. De resulterende salte har højere opløselighed i vand end de tilsvarende acy-lerede antibiotiske derivater og anvendes fortrinsvis terapeutisk.

30 151262

Som eksempler på sådanne syreadditionssalte kan nævnes 3-acetyl-4n-isovaleryltylosin, hydrochlorid med smp. 129-l33°C og 3-acetyl-4"-i s ovaleryItylo sin, tartrat med smp. 119-122°C.

På grund af deres særlige antimikrobielle virkninger er de omhandlede forbindelser nyttige som infektionsbekæmpelsesmidler i human-og veterinærmedicinen og kan f.eks. anvendes i den enterale, parente-rale eller topicale kontrol af infektionssygdomme på lignende måde som kendte makrolidantibiotiske lægemidler. Under hensyn til den særlige nytte af tylo sin som vækstfremmende middel for dyr kan de omhandlede tylosinforbindelser også anvendes som fodertilsætning ved dyre-opdræt.

De omhandlede forbindelser kan anvendes i blanding med sædvanlige eks-cipients og bærestoffer, d.v.s. farmaceutisk acceptable organiske eller uorganiske bærestoffer, der er egnede til enteral, parenteral eller topical applikation, og som ikke reagerer ødelæggende med de aktive forbindelser.

Egnede farmaceutiske acceptable bærere omfatter vand, saltopløsninger, alkoholer, vegetabilske olier, poethylenglycoler, gelatine, lactose, amylose, magnesiumstearat, talk, kiselsyre, paraffiner, parfumeolie, fedtsyremonoglycerider og-diglycerider og hydroxymethylcellulose, men er ikke begrænset til disse stoffer. De farmaceutiske præparater kan steriliseres og om nødvendigt blandes med yderligere midler, f.eks. smøremidler, preserverende midler, stabilisatorer, befugtningsmidler, emulgeringmidler, puffere, farvestoffer og aromastoffer, der ikke reagerer ødelæggende med de aktive forbindelser.

De omhandlede forbindelser kan også anvendes i foder tilsætningsformer, såsom foderstofblanding, efter sædvanlige formuleringsmetoder.

Oral, enteral og intramuskulær administration er foretrukket, f.eks. i form af tabletter, drageer, kapsler, sirupper og eleksirer, i form af injektionsopløsninger eller i form af fodertilsætningsblandinger til dyr, herunder mennesker, husdyr, kæledyr, laboratoriedyr og fjer- 31 151262 kræ. En virksom daglig dosis af forbindelserne administreret oralt til mennesker er fortrinsvis 1 til 20 mg/kg legemsvægt. Dosen kan administreres ad én gang eller i løbet af dagen i deldoser.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1

Fremstilling af 4"-butyryltylosin ud fra tylosin.

Der fremstilles et vandigt medium af følgende bestanddele: 2 g/dl sojabønnemel, 2 g/dl glucose, 0,1 g/dl gærekstrakt, 0,05 g/dl K^HPO^ og 0,05 g/dl MgSO^.TH^O (pH 7,0). 100 ml af dette medium steriliseres i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe ved 120°C i 20 minutter, og ved hjælp af en platinløkke podes der fra en skråagarkultur af Streptomyces thermotolerans ATCC 11416. Man dyrker i én dag ved 37°0 på en roterende ryster. 15 liter af mediet, hvortil er sat antiskummiddel i en mængde på 0,05 g/dl, og som er steriliseret ved 120°0 i 15 minutter i et 30 liters fermenteringkar, podes antiseptisk med 100 ml af den ovenfor opnåede podekultur. Der dyrkes ved 37°C under kraftig omrøring og beluftning i ca. én dag, indtil koncentrationen af glucose i væsken er faldet til under 0,3 g/dl, hvorefter 60 g tylosin og 15 g DI-nor-valin som n-butyrylgruppe-donor suspenderes sammen i en liter vand til kulturvæsken. Omsætningen får lov til at fortsætte i ca. 6 timer til fuldstændig udreagering.

Den således opnåede reaktionblanding indstilles til pH 3,5 med fortyndet svovlsyre, og myceliet skilles fra ved centrifugering, hvorved man inklusive vaskevand får ca. 16 liter væske. Denne indstilles til pH 6,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning og ekstraheres ved 30°C med 10 liter benzen. Benzenlaget, der indeholder 4"-n-butyryl-tylosin, skilles fra og ekstraheres ved 5°C med 2 liter citratpuffer af pH 3,5. Efter pH-værdien af det vundne lag er indstillet til 7,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning ekstraheres væsken med en liter ethylacetat, og ekstraktopløsningsmidlet afdampes, og remanensen tørre under vakuum, hvorved der fås ca. 5 g af et gulligbrunt materiale indeholdende 4M-n-butyryltylosin. Materialet kommes i en 60 cm lang og 2,1 cm tyk søjle fyldt med "Wakogen C-200”, og søjlen elueres med benzen-methanol-blanding (97:3). Eluateme, der kun indeholder 4"-n-butyryl tylo sin opsamles og inddampes til tørhed under vakuum. Det 32 151262 opnåede materiale opløses derefter mider opvarmning i en ethylether-isopropylether-blanding (4:l), og man lader opløsningen henstå med det formål at opnå krystaldannelse ved langsom afdampning af ethyletheren. Der fås ca. 1,5 g hvide krystaller af 4"-n-butyryltylosin.

Efter det vandige lag ovenfor er ekstraheret med benzen indstilles det til pH 8,0 og ekstraheres derefter med 15 liter ethylacetat ved 30°C. Ekstrakten blandes med 15 liter citratpuffer af pH 3,5 ved 5°C, og det vandige lag indstilles til pH 8,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning og ekstraheres med 10 liter benzen ved 30°C. Ekstrakten inddampes under formindsket tryk til et rumfang på 150 ml, og man lader den stå ved 7°0, hvorved der fås krystaller af 3-acetyltylosin. Krystallerne samles ved filtrering og tørres, hvorved der fås 25 g hvide krystaller (smp. 4"-n-butyryltylosin 149°C, smp. 3-acetyltylosin 2l6°C).

Eksempel 2

Fremstilling af 4"-isovaleryltylosin ud fra tylosin.

Der udføres dyrkning og omsætning som i eksempel 1, idet DL-norvalin dog erstattes med L-leucin som isovaleryldonor. Af 60 g tylosin og 15 g L-leucin opnås ca. 900 mg hvide krystaller af 4"-isovaleryltylosin og 17 g hvide krystaller af 3-acetyltylosin. (Smp. 4"-isovaleryl-tylosin 155°C, smp. 3-acetyltylosin 2l8°C.)

Eksempel 3

Acety lering' af en 3-stillet hydroxygruppe og acylering af en 4"-stillet hydroxygruppe.

Fra en skråagar af Streptomycec thermotolerans ATCC 11416 podes et podemedium bestående af de samme bestanddele som i eksempel 1, og der dyrkes ved 37°C på en roterende ryster. 15 liter af et medium, der består af 5 g/dl glucose, 1 g/dl sojabønnemel, 0,1 g/dl gærekstrakt og 0,1 g/dl K2HP04, 0,1 g/dl MgS04.7H20. 0,02 g/dl InS04.4-6H20 og 0,1 g/dl CaCO^ (pH 7,0), hældes i et 30 liters fermenteringskar og steriliseres. 150 ml af podekulturen tilsættes, og der dyrkes ved 37°C under beluftning og omrøring. Hår koncentrationen af glucose i mediet efter 33 151262 24 timer er faldet til 2 g/dl, hældes væsken antiseptisk over i tre 2 liters fermenteringskar i en mængde på 1 ltr. pr. kar. Til hver af de tre fermenteringskar sættes 2 g tylosin. Omsætningen udføres ved 37°C under beluftning og omrøring. Efter 3 timer undersøges omdannelsen af antibiotikaene ved tyndtlagskromatografi. Når ca. halvdelen af det til de tre fermenteringskar tilsatte antibiotikum er omdannet, er de tilsvarende forbindelser, der i makrolidringens 3-stilling har en acetylgruppe, dannat. På dette tidspunkt sættes 1 g ar nver precursor af den ønskede acylgruppe, nemlig DL-norvaiin og 1-leucin, til hver af de tre fennenteringskar, og pH-værdien indstilles til pH 8,0. Til det sidste af de tre fermenteringskar sættes ingen precursor. Omsætningen udføres under de samme betingelser som anført ovenfor. Efter reaktionens afslutning ekstraheres hver del af reaktionsblandingen med ethylacetat, og forholdet mellem det anvendte udgangsstof og de dannede forbindelser undersøges ved tyndtlagskromatogradi. Hver af slutreaktionsblandingerne fjernes og filtreres i svagt sur tilstand, og filtraterne ekstraheres med 0,5 liter ethylacetat i svag basisk tilstand ved 30°C. Ethylacetat-laget blandes med 1,5 liter svagt surt vand. Det vundne vandige lag ekstraheres med 0,4 liter ethylacetat ved pH 7,5, og ethylacetat-ekstrakterne inddampes og tørres, hvorved der fås 1,5 til 1,7 g råt gullighvidt pulver. Af dette pulver isoleres og renses hovedprodukterne ved de i eksempel 1 anvendte rensningsmetoder for n-butyryltylosin ved kromatografi på en silicagel-søjle, og pulverne af tylosinderivaterne omkrystalliseres af ethylether. Der fås 0,5-0,8 g hvide krystaller. Sammenhængen mellem udgangsstofferne, pre-cursorerne af acyl-CoA og produkterne er vist i tabel 4.

Tabel 4

Sammenhæng mellem udgangsstof, precursors* af acyl-CoA og produkterne.

Udgangsstof precursor- af hovedproduktet

acyl-CoA

tylosin - 3-acetyltylosin tylosin DL-norvalin 3-acetyl-4"-n- butyryltylosin tylosin 1-leucin 3-acetyl-4M-isovaleryl- tylosin 34 151262

Eksempel 4

Acylering i 3- og 4"-stilling.

Der fremstilles en podekultur af samme bestanddele som den i eksempel 1 under anvendelse af samme mikroorganisme. 10 liter af et medium, der består af 2 g/dl stivelse, 1 g/ål pepton, 1 g/ål gærekstrakt, 0,2 g/dl K2HP04, 0,02 g/dl MgS04.7H20, 0,02 g/dl MnS04.4-6H20 og 0,1 g/dl CaCO^ (pH 7,0), hældes i et fermenteringskar (totalvolumen 20 liter) og steriliseres. 300 ml af podekulturen podes,, og der dyrkes ved 37°C under beluftning og omrøring. Efter 30 timer har mikroorganismens vækst nået den stationære fase, og når det anvendte glucose efter 36 timer næsten fuldstændigt er forbrugt, hældes væsken antiseptisk over i tre 1 liter fermenteringskar i et rumfang på 500 ml pr. kar.

Der sættes 500 mg tylosin til hver af de tre fermenteringskar, og til hver af de tre fermenteringskar sættes desuden 100 mg a-amino-smørsyre. Omsætningen udføres under de samme betingelser som ved dyrkningen. Under omsætningen undersøges omdanneisesgraden af og til ved tyndtlagskromatografi. Efter 6 timer er det tilsatte antibiotiske udgangsstof næsten fuldstændigt acyleret til den tilsvarende forbindelse med en 3-stillet propionylgruppe. På dette tidspunkt sættes glucose til alle fermenteringskarrene i en koncentration på 1 g/dl, og reaktionsblandingens pH indstilles til 8,0.

Omsætningen fortsættes ved tilsætning af 200 mg af henholdsvis DL-norvalin og 1-leucin til de to af de tre fermenteringskar indeholdende tylosin. Det tredie fermenteringskar tjener som kontrol.

Omsætningen fortsættes på samme måde som beskrevet ovenfor. Efter .. 48 timers dyrkning, d.v.s. 12 timer efter tilsætningen af antibiotikum, afsluttes omsætningen. Fra reaktionsblandingen isoleres ho-vedproduktét ved lignende metoder som i eksempel 3, i tabel 5 er vist produkterne, der hver fås i en mængde på 70-120 mg som hvide krystal ler.

35 151262

Tabel 5

Sammenhæng mellem udgangsstof, precursorer af acyl-CoA og produkterne

Udgangsstof precursor - af acyl-CoA hovedprodukt acylering af en acylering af en hydroxylgruppe hydroxylgruppe i 3-stilling i 4"-stilling tylosin a-aminosmør- - 3-propionyltylosin syre tylosin " DL-norvalin ' 3-propionyl-4"-n- butyryltylo sin tylosin " L-leucin 3-propionyl-4"- isovaleryltylosin

Bemærkning:

De i eksempel 1-4 opnåede derivater af tylosin blev hver analyseret og strukturen identificeret gennem bl.a. UV-spektrum, IR-spektrum, NMR-spektrum, massespektrum, smeltepunkt, specifik rotation, elementæranalyse og gaskromatografi af de ved basisk hydrolyse frigjorte organiske syrer, og om nødvendigt blev forbindelserne sammenlignet og identificeret ved bestemmelse af blandingssmeltepunktet og tyndt-kromatografi.

Eksempel 5

Man dyrker den samme mikroorganisme som i eksempel 1 under anvendelse af samme dyrkningsmetoder, og 10 liter af dyrkningsvæsken centrifugeres til samling af cellerne, der suspenderes i 5 liter phosphat-puffer (pH 7,0). 100 ml af denne suspension i puffer hældes i hver 46 kolber på 500 ml. I kolberne hældes 100 μ§Λη1 udgangsstof og 0,1 g/dl acylprecursor som vist i tabel 6,. og der omsættes i 12 timer ved 37°C under rystning. De omsatte blandinger gøres svagt basiske, og produkterne ekstraheres med benzen til analyse ved tyndtlagskromato-grafi. Produkterne identificeres ved sammenligning med autentiske derivater af tylosin under anvendelse af parallelfremkaldelse og dobbeltplet-fremkaldelsesteknik. Sammenhængen mellem udgangsstof , acylprecursorer og produkterne er vist i tabel 6.

36 151262

Tabel 6

Sammenhæng mellem udgangsstof-/ acylprecursorer og produkter.

Udgangsstof acylprecursor produkt tylosin a-ketosmørsyre 3-propionyltylosin tylosin natriumpropionat 3-propionyltylosin 4"-n-butyryltylosin ,a-ketosmørsyre 3-propiony1-4"-n- butyryltylosin 4"-n-butyryltylosin natriumpropionat 3-propiony1-4" -n- butyryltylosin 4"-i sovalery11ylo sin α-ketosmørsyre 3-propionyl-4"- i s ovaleryltylo s in 4,,-isovaleryltylosin natriumpropionat 3-propionyl-4"- i s ovaleryltylo sin 3-acetyltylosin _ α-ket o-n-valerianesyre 3-acetyl-4"-n- butyryltylosin 3-acetyltylosin natrium-n-buryrat 3-acetyl-4"-n- butyryltylo s in 3-acetyltylosin ethyl-n-butyrat 3-acetyl-4"-n~ butyryltylosin 3-acetyltylosin n-butyrylamid 3-acetyl-4"-n- butyryltylosin tylosin isovalerianesyre 4"-i s ovalery ltylo si: tylosin ethyl-isovalerat 4"-isovaleryltylo si: tylosin isovalerylamid 4 "-i sovaleryltylo si: 3-acetyltylosin isovalerianesyre 3-acetyl-4”-iso- valeryltylosin 3-acetyltylosin ethyl-isovalerat 3-acety1-4"-iso val eryltylosin 3-acetyltylosin isovalerylamid 3-acetyl-4"-iso- valeryltylosin

Eksempel 6

Som mikroorganisme anvendes henholdsvis Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomuceticus ATCC 21574, Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 og Streptomyces mycaro-faciens ATCC 21454, der dyrkes og omsættes på lignende måde (når der bortses fra dyrkningst emper atur en) som følger:

Der anvendes samme medium som i forsøg 1. Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 dyrkes ved 37°C, medens de andre stammer dyrkes ved 28°c på 37 151262 en roterende ryster. Efter 30 timer filtreres 1200 ml af væsken (12 kolber) til samling af de levende celler, der suspenderes i 1200 ml tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-puffer (pH 7,2, l/lO M) ,og cellerne knuses i en fransk presse. 3 ml af hver pufferopløsning indeholdende sønderdelte celler anbringes i en reagensglasfermenter af Irtypen. Til hvert glas sættes 40 μ§Λη1 antibiotisk udgangsstof og derefter forskellige acyl-CoA som anført i tabel 7 i ækvivalent molkoncentration. G-lassene rystes svagt under omsætningen i en time. Omsætningen afsluttes ved tilsætning af en glycin-HaOH-puffer. Produkterne ekstraheres med benzen og identificeres på samme måde som ved forsøget. Der opnås lignende resultater med de ovenfor anførte mikroorganismer.

Sammenhængen mellem udgangsstoffer, acyl-CoA og produkter er vist i tabel 7.

Tabel 7

Sammenhæng mellem udgangsstoffer, acyl-CoA og produkter.

Udgangsstof acyl-CoA produkt tylosin aeetyl-CoA 3-acetyltylosin .

tylosin propionyl-CoA hovedsagelig 3-propionyltylosin tylosin n-butyryl-CoA hovedsagelig 4M-n- butyryltylo sin tylosin isovaleryl-CoA 4"-isovaleryl- tylosin 3-acetyltylosin acetyl-CoA ingen reaktion 3-acetyltylosin n-butyryl-CoA 3-acetyl-4"-n- butyryltylo sin 3-acetyltylosin isovaleryl-CoA 3-acetyl-4"-iso- valeryltylosin .

3-propionyltylosin n-butyryl-CoA 3-propionyl-4"-n- butyryltylosin 3-propionyltylosin isovaleryl-CoA 3-propionyl-4"-iso- valeryltylo sin 4"-n-butyryltylosin acetyl-CoA 3-acetyl-4"-n- butyryltylo sin 4"-n-butyryltylo sin propionyl-CoA 3-propionyl-4"-n- butyryltylosin 4"-isovaleryltylosin acetyl-CoA 3-acetyl-4"-iso- valeryltylo sin 4"-isovalerv1tvlosin nromonv"]-CnA -A»-i ολ.

Claims (3)

151262 PATENTKRfty Fremgangsmåde til fremstilling af 3- og/elier 4”-aoylderivater af tylosin med den almene formel CH, HO CH. J v / i > i “ X

2 CH^ CHpCHO Ho I < \-0-R tYV°A ✓s 0 1 1

3 N0'^ch3 R1 (I) A0^°—ch2 ‘ J h3c υ 1 '9 hvori R betyder H eller en acetyl- eller propionylgruppe/ og R betyder H eller en- n-butyryl- eller isovalerylgruppe, idet dog 1 2 R og R ikke samtidig kan betyde H, kendetegnet ved, at man acylerer i det mindste den. ene af hydroxylgrupperne i 3-og 4”-stillingen i tylosin eller derivater deraf med den almene formel H-jC CH-j HO CH. Y X E2. CH-j CHpCHO HO ^ N-O-R I I _0_l / Λ yK Xo^CH. °=< v >-o-II 3 X h3o-X t ^°¾ ^ \-0-R1’ (II) 0CH3 \-ch3 / <XX H.XV-0_·°Η2 T 0H20H, 151262 hvori R betyder H eller en acetyl- eller prooionylgruppe, og 2' ’ R betyder H eller en n-butyryl- eller isovalerylgruppe, idet dog 1' 2 1 mindst én af R og R betyder H, i nærværelse af mindst én acyldonor valgt blandt acetyl-CoA og propionyl-CoA, såfremt der ønskes fremstillet 3-acyl- eller 3-, 4"--diacylderivater af tylosin, n-butyryl-CoA og isovaleryl-CoA, såfremt der ønskes fremstillet 4"-acyl- eller 3-, 4"-diacylderivater af tylosin/ og de tilsvarende forstadier for disse acyl-CoA og i nærværelse af en mikroorganisme valgt blandt Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454 og Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 eller enzympræparater deraf.