JPH10507917A

JPH10507917A - Ｈｉｖプロテアーゼ阻害剤の微生物合成

Info

Publication number: JPH10507917A
Application number: JP8514082A
Authority: JP
Inventors: シヤフイー，アリ; チエン，シー−シユン・テイー; アリスン，バイロン・エイチ; ミラー，ランドール・アール; ギヤリテイ，ジヨージ・エム; ハイムバツハ，ブライアン
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 1998-08-04
Also published as: EP0785786A4; AU3966395A; WO1996012492A1; EP0785786A1; AU702122B2

Abstract

(57)【要約】培養株ＭＡ７０６５を用いて発酵させた生物変換産物は有効なＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である。これらの産物は、単独でも、他の抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗生物質又はワクチンと組み合わせても、化合物、医薬上許容し得る塩、医薬組成物成分として、ＨＩＶ感染の予防又は治療、及びＡＩＤＳの治療に有用である。ＡＩＤＳの治療法及びＨＩＶ感染の予防法又は治療法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の微生物合成発明の背景本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によりコードされるプロテアーゼを阻害する化合物、特に、後述の実施例に記載の化合物Ｊの誘導体のような特定のオリゴペプチド類似体の新規な合成法に関する。これらの化合物は、ＨＩＶ感染の予防、ＨＩＶ感染の治療及びその結果としての後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に有用である。これらの化合物はレニン及び他のプロテアーゼの阻害にも有用である。レトロウイルスと称されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、免疫系の進行性破壊（後天性免疫不全症候群；ＡＩＤＳ）や、中枢及び末梢神経系の変性を含む症候群の病因因子である。このウイルスは、かつては、ＬＡＶ、ＨＴＬＶ− III又はＡＲＶとして知られていた。レトロウイルス複製の一般的な特徴は、ウイルスの構築及び機能に必要とされる成熟ウイルスタンパク質を産生させるための、ウイルスがコードするプロテアーゼによる前駆体ポリタンパク質の広範な翻訳後プロセシングである。このプロセシングを阻害すると、通常は感染性であるウイルスの産生が妨げられる。例えば、Ｋｏｈｌ，Ｎ．Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５，４６８６（１９８８）は、ＨＩＶがコードするプロテアーゼを遺伝子操作により不活化すると、未成熟な非感染性のウイルス粒子が産生されることを証明した。これらの結果は、ＨＩＶプロテアーゼの阻害がＡＩＤＳの治療及びＨＩＶ感染の予防又は治療に対する有効な方法であることを示している。ＨＩＶのヌクレオチド配列は、１つの読み取り枠中にｐｏｌ遺伝子が存在することを示している［Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，２７７（１９８５）］。アミノ酸配列が相同であることから、該ｐｏｌ配列が逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ及びＨＩＶプロテアーゼをコードすることが証明される［Ｔｏｈ,Ｈ.ら,ＥＭＢＯＪ.，４，１２６７（１９８５）；Ｐｏｗｅｒ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１，１５６７（１９８６）；Ｐｅａｒｌ，Ｌ．Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，３５１（１９８７）］。本発明の新規な方法により製造し得る特定のオリゴペプチド類似体を含む化合物は、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤である。１９９３年５月１２日に公開されたＥＰＯ５４１，１６８号を参照されたい。さらに、例えば、該文献に記載の化合物Ｊも参照されたい。かつては、化合物Ｊ及び関連化合物の合成は１２段階からなる手順により行われた。この手順は、ＥＰＯ５４１，１６８号に記載されている。該経路は、極めて長い（１２ステップ）ために、時間がかかり且つ多大な労力を要すると共に、現在のところ高価な多くの試薬及び出発物質を必要とする。経済的にも時間の節約の点からも反応ステップ及び試薬が少なくてすむ経路が望ましい。本出願人は、化合物Ｊを、選択された微生物系、ＭＡ７０６５と共にインキュベートして、化合物Ｊの種々の誘導体を同定・合成した。該新規な化合物はＨＩＶプロテアーゼの有効且つ強力な阻害剤である。発明の要旨培養株ＭＡ７０６５を用いて発酵させた生物変換産物（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ）は有効なＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である。これらの産物は、それ単独でも、他の抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗生物質又はワクチンと組み合わせても、化合物、医薬上許容し得る塩、医薬組成物の成分として、ＨＩＶ感染の予防又は治療、及びＡＩＤＳの治療に有用である。ＡＩＤＳの治療法及びＨＩＶ感染の予防法又は治療法も記載する。発明の詳細な説明以下の構造：を有する化合物Ｊの生物変換産物又はその塩若しくは水和物の合成法を開示する。該方法は、（ａ）培養株ＭＡ７０６５を得るステップ；（ｂ）該培養株を化合物Ｊと共にインキュベートするステップ；（ｃ）化合物Ａ化合物Ｃ１化合物Ｃ２化合物Ｄ化合物Ｅを含む生物変換産物又はその塩若しくは水和物を単離するステップを含む。好ましい化合物は化合物Ａである。この方法により得られた精製された生物変換産物並びに対応化合物も包含される。ＡＴＣＣ寄託物本願の米国出願の前に、微生物(ＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＭＡ７０６５)の試料をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ２０８５２に寄託した。該培養株の受託番号はである。この寄託物は、ＡＴＣＣに少なくとも３０年間保存され、該寄託物を開示する特許が認可されれば一般に利用可能となる。寄託物が利用可能であるということは、関係官庁のアクションにより認可された特許権が制限（ｄｅｒｏｇａｔｉｏｎ）された場合に、当該発明を実施するライセンスを構成するものではないことを理解されたい。ＡＴＣＣの一般的な特性形態学的、培養的、生物学的及び生理学的特性を含む物理的特性及び生物分類学を以下に簡単に説明する。これまで行われてきた生物分類学的分析に基づき、該培養株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ目に分類された。以下は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、ＭＡ７０６５(ＡＳ２０２３，ＣＲＡ −３−４ＡＴＣＣ )の一般的な説明である。この培養株は、生物変換により、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤である化合物Ｊの類似体を産生させる。増殖、一般的な培養特性及び炭素源の利用について、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｌｅｉｂの方法（Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６，３１３−３４０）に従って観察を行った。該細胞の化学組成は、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ及びＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒの方法（ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅＴａｘｏｎｏｍｙ,Ａ.Ｄｉｅｔｚ及びＤ.Ｗ.Ｔｈａｙｅｒ編，ＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８０）を用いて決定した。全細胞脂肪酸を誘導体化し、メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）として、ＭＩＤＩＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）を用い、Ｍｉｌｌｅｒ及びＢｅｒｇｅｒの手順に従い、ガスクロマトグラフィーにより分析した。培養株の色は、Ｉｎｔｅｒ−ＳｏｃｉｅｔｙＣｏｌｏｒＣｏｕｎｃｉｌ−ＮａｔｉｏｎａｌＢｕｒｅａｕｏｆＳｔａｎｄａｒｄｓＣｅｎｔｒｏｉｄＣｏｌｏｒＣｈａｒｔｓ(ＮＢＳＣｉｒｃｕｌａｒ５５３，１９８５の付録であるＵＳＤＥＰＴ．ｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅＮａｔｉｏｎａｌＢｕｒｅａｕｏｆＳｔａｎｄａｒｄｓ)に記載されている色基準と比較して決定した。供給源−培養株ＭＡ７０６５は、試料採取の４８時間前に制御殺菌した休閑地のそばの防火帯で採取した土壌試料から分離した。該休閑地の所在地は、ＳａｎｔａＲｏｓａＰａｒｋ，ＧｕａｎａｃａｓｔｅＰＲ，ＣｏｓｔａＲｉｃａであった。化学分類学的特性 − ＭＡ７０６５のペプチドグリカンは、ＬＬ−ジアミノピメリン酸を含んでいる。主要な全細胞脂肪酸を表１に列記する。一般的な増殖特性 − 酵母エキス麦芽エキス寒天、グリセロール−アスパラギン、無機塩−スターチ寒天、ツァペック寒天、サブローマルトース寒天、オートミール寒天及びトリプチカーゼ大豆ブイヨン寒天上で、良好〜優秀な増殖が認められた。水道水寒天上で中程度の増殖が認められた。増殖は、２７°と３７°で生起した。表２参照。コロニー形態 −（２１ｄの酵母−麦芽寒天上）基体の菌糸は暗黄褐色である。気中胞子集団は豊富で、綿毛状であり、色は黄色っぽい灰色である。コロニーは不透明で盛り上がっており、全周に縁があり、表面は光沢がない。コロニーは弾性の菌糸組織を有する。微小形態 − 気中菌糸（０．５７μｍ）は輪生状に基質菌糸から盛り上がっている。成熟培養株(７−２８ｄｐ.ｉ.)では、気中菌糸は、胞子の鎖をなして終端し、短くゆるやかな螺旋を形成している。胞子形成は、酵母エキス麦芽エキス寒天、無機塩−スターチ寒天、オートミール寒天、グリセロールアスパラギン寒天、ツァペック寒天及び水道水寒天上で生起する。気中胞子集団は、無機塩−スターチ寒天上では合体している。その他の生理学的反応 − 培養株は、ペプトン−鉄寒天ではＨ₂Ｓを産生しない。メラノイド色素は、ペプトン−鉄寒天でもトリプトン−酵母エキスブイヨンでも形成されなかった。スターチは軽度に加水分解されていた。炭素源の利用パターンは以下の通りであった：Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フルクトース、α−Ｄ−グルコース、イノシトール、α−Ｄ−ラクトース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース及びスクロースの利用は良好；Ｄ−ラフィノース及びＤ−キシロースの利用は中程度であった。表３参照。鑑別 − 細胞壁を分析すると、ＭＡ７０６５がタイプＩの細胞壁を有することが示される。微小形態学的実験により、該培養株が、気中菌糸から盛り上がった偽輪生を形成する短い螺旋形の坦胞子体上に短い胞子鎖を生成させることが示される。これらは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種のいくつかの菌株に典型的な特性である。ＭＡ７０６５の表現型データを、妥当な根拠に基づいて生物分類学文献に発表されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の表現型データと比較すると、前者の菌株がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓ、Ｓｔｍｙ．ｐａｒｖｕｌｕｓ及びＳｔｍｙ．ｒｏｃｈｅｉｉと幾らか相似していることが示される。これらの種のうちでは、Ｓｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓのみが気中胞子集団の合体を示すと報告されている。しかし、Ｓｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓの坦胞子体は、偽輪生を形成してはいない。ＭＡ７０６５の脂肪酸プロフィールをＭＩＤＩ放線菌類ライブラリー(３．７バージョン)と比較すると、Ｓｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓとの相似度は低いことが示された。測定基準としてユークリッドの距離を用い、グループ中で分類学的距離が一番遠いものを分析してクラスター分析を行った。この分析結果から、ＭＡ７０６５が他の関連菌株よりもＳｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓに対する相似度が高いことが証明された。これらの知見は、形態学的データ及び生理学的データと一致する。これらの知見を基にすれば、ＭＡ７０６５はＳｔｍｙ．ｌｙｄｉｃｕｓの新規な菌株である。好ましい窒素源は、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実油ミール、大豆ミール及び他の植物ミール（部分的に又は完全に脱脂したもの）、カゼイン加水分解産物、大豆加水分解産物及び酵母加水分解産物、コーンスティープリカー、酵母粉末、小麦胚芽、フェザーミール、ピーナッツパウダー、ＤＳ（ディスティラーズソルブルス）など、並びにアンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）のような無機及び有機窒素化合物、尿素、アミノ酸などである。炭素源及び窒素源は、組み合わせて用いると有利であるが、それらを純粋な形態で用いる必要はない。というのは、微量の増殖因子と、大量の無機栄養素を含む、より純度の低い物質も使用に適しているからである。所望なら、炭酸ナトリウム若しくはカルシウム、リン酸ナトリウム若しくはカリウム、塩化ナトリウム若しくはカリウム、ヨウ化ナトリウム若しくはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などのような鉱物塩を培地に加えてもよい。必要なら、特に培地が高度に発泡性である場合には、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱物油又はシリコーンのような消泡剤を加えてもよい。本発明の化合物は、熟練した技術者による合成有機手順によっても得ることができる。大量にＭＡ７０６５を生産するための条件としては、浸漬好気性培養条件が好ましい。少量の生産には、フラスコ又はビン中での振とう又は表面培養を用いる。さらに、増殖を大型タンク中で行う場合、生産プロセスにおける増殖遅延を回避するために、生産タンク中での接種に微生物の栄養形を用いるのが好ましい。従って、先ず、比較的少量の培地に「斜面」で生産された微生物の胞子又は菌糸を接種し、「シード培地」とも称される該接種培地を培養して微生物の栄養形接種原を生産し、次いで、培養された栄養形接種原を大型タンクに無菌移入するのが望ましい。接種原を生産する発酵培地は、一般に、接種前に培地をオートクレーブに入れて殺菌する。培養混合物の攪拌及び通気は多様な方法で実施し得る。攪拌は、プロペラ若しくは類似の機械的撹拌装置を用いたり、発酵混合物を回転若しくは振とうしたり、種々のポンプ装置を用いたり、又は培地に無菌空気を通したりして行うことができる。通気は、発酵混合物に無菌空気を通して行うことができる。発酵は、通常、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃ の温度で、約１０〜６４時間実施するが、発酵の条件及びスケールに応じて異なり得る。産生培養株は、２２０ｒｐｍで操作される回転式振とう培養機上２８℃ で約４８時間インキュベートするのが好ましく、その場合、発酵培地のｐＨは収穫時まで４．８５に維持する。発酵の実施に好ましい培養／産生培地には以下の培地が含まれる：シード培地（ＫＥ培地）：０．１％デキストロース、１％デキストリン、０．３％肉エキス、０．５％ＡｒｄａｍｉｎｅｐＨ、０．５％ＮＺアミンタイプＥ、０．００５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及び０．０３７％Ｋ₂ＨＰＯ₄(０．０５％ＣａＣＯ₃を用いてｐＨを７.１に調整)からなる；生物変換培地（大豆−グルコース）：２％グルコース、０．５％大豆ミール、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．９８％ＭＥＳ（ｐＨを７．０に調整）を含む。生産物は、他の公知物質の回収に一般に用いられている慣用手段により培地から回収し得る。産生された物質は、培養ブイヨンのろ過若しくは遠心により、減圧下の濃縮、凍結乾燥、塩化メチレン若しくはメタノールなどのような慣用溶媒による抽出、ｐＨの調整、慣用樹脂（例えば、アオン若しくはカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂など）による処理、慣用吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、結晶化、再結晶などのような慣用法により得られる。本発明の化合物は、抗ウイルス化合物用のスクリーニングアッセイの調製及び実施に有用である。例えば、本発明の化合物は、より強力な抗ウイルス化合物用の優れたスクリーニングツールである酵素突然変異体の分離に有用である。さらに、本発明の化合物は、例えば、競合阻害による、ＨＩＶプロテアーゼに対する他の抗ウイルス物質の結合部位の確立又は決定に有用である。従って、本発明の化合物は、これらの目的で販売されるべき市販品である。本発明の化合物は、ＨＩＶプロテアーゼの阻害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の予防又は治療、及びＡＩＤＳのような後天性病原性病態の治療に有用である。ＡＩＤＳの治療又はＨＩＶ感染の予防若しくは治療とは、多岐にわたるＨＩＶ感染状態:症候性及び非症候性のＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）、並びにＨＩＶに対する実際若しくは潜在的接触の治療を含むがそれらには限定されないものと定義される。本発明の化合物は、例えば、輸血、臓器移植、体液交換、咬傷、偶発的な注射針の一剌し又は手術中の患者血液への接触による過去のＨＩＶへの接触に起因し得るＨＩＶ感染の治療に有用である。これらの目的で、本発明の化合物は、経口的に、非経口的に（皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射若しくは注入法）、吸入スプレーにより、又は経腸的に、慣用の無毒性の医薬上許容し得る担体、アジュバント及びビヒクルを含む用量単位剤形として投与し得る。従って、本発明により、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを治療するための方法及び医薬組成物も提供される。該治療には、そのような治療を要する患者に、医薬担体及び治療上有効量の本発明の化合物又はその医薬上許容し得る塩を含む医薬組成物を投与することを含む。これらの医薬組成物は、経口投与し得る懸濁剤又は錠剤；経鼻スプレー；例えば、滅菌注射用水性若しくは油性懸濁剤のような滅菌注射用製剤；又は座薬の形態であってよい。懸濁剤として経口投与する場合、これらの組成物は、医薬製品業界で周知の方法に従って製造され、賦形剤としての微晶質セルロース、懸濁剤としてアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース及び当業界では公知の甘味剤／着香剤を含み得る。即放性錠剤として、これらの組成物は、微晶質セルロース、リン酸二カルシウム、スターチ、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース並びに／又は当業界において公知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑沢剤を含み得る。経鼻エアゾール又は吸入により投与する場合、これらの組成物は、医薬品業界において周知の方法に従って製造され、ベンジルアルコール若しくは他の適当な保存剤、生物利用性を促進する吸収促進剤、フルオロカーボン、並びに／又は当業界において公知の他の可溶化剤若しくは分散剤を用い、生理食塩水溶液として製造し得る。注射用溶剤又は懸濁剤は、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンガー液若しくは等張塩化ナトリウム溶液のような適当な無毒性で非経口的に許容し得る希釈剤若しくは溶媒、又は合成のモノ−若しくはジグリセリドを含む低刺激性の滅菌不揮発性油及びオレイン酸を含む脂肪酸のような適当な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁剤を用い、公知方法に従って調剤し得る。座薬の形態で経腸投与する場合、これらの組成物は、薬剤を、常温では固体であるが直腸内で液化及び／若しくは溶解して薬剤を放出する、ココアバター、合成グリセリドエステル若しくはポリエチレングリコールのような適当な無刺激性賦形剤と混合して調剤し得る。上記症状の治療又は予防には、１日当たり、０．０２〜５．０又は１０．０ｇの範囲の用量レベルで、２回〜５回以上にわけて経口投与するのが有用である。例えば、ＨＩＶ感染は、１日当たり、体重１ｇにつき、１．０〜５０ｍｇの該化合物を、１回〜４回に分けて投与して治療するのが効果的である。１つの好ましい投与計画では、各患者に、１００〜４００ｍｇの用量を６時間置きに経口投与する。しかし、特定の患者に対する特定の用量レベル及び投与頻度は、用いられる特定の化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用期間、患者の年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与の形態及び時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、特定の症状の重篤度並びに宿主が受けている療法に応じて異なり得る。本発明はさらに、ＨＩＶプロテアーゼ阻害性化合物とＡＩＤＳの治療に有用な１種以上の薬剤との組み合わせにも関する。例えば、本発明の化合物は、接触前でも接触後でも、当業者には公知の有効量のＡＩＤＳ抗ウイルス剤、免疫調節剤、感染防止剤又はワクチンと組み合わせて投与するのが効果的であり得る。本発明の化合物とＡＩＤＳ抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗感染剤又はワクチンとの組み合わせの範囲は、上記表中のリストには限定されず、原則として、ＡＩＤＳの治療に有用ないずれの医薬組成物とのどの組み合わせをも包含するものと理解されたい。表Ｃの特定の化合物は以下の通りである：化合物Ｂは、６−クロロ−４−（Ｓ）−シクロプロピル−３，４−ジヒドロ− ４−（（２−ピリジル）エチニル）キナゾリン−２（１Ｈ）−オンであり；化合物Ｃは、（−）−６−クロロ−４（Ｓ）−トリフルオロメチル−１，２−ジヒドロ−４（Ｈ）−３，１−ベンズオキサジン−２−オンであり；ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）は、１１−シクロプロピル−５，１１−ジヒドロ−４−メチル−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２′，３′−ｅ］［１，４］ジアゼピン−６ −オンである。化合物Ｂ及びＣは、ＥＰ０，５６９，０８３号（参照として本明細書に組み込むものとする）の方法に従って合成する。ネビラピンは、Ｋｌｕｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５，１８８７（１９９２）；Ｈａｒｇｒａｖｅ，Ｋ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４，２２３１（１９９１）；Ｃｏｈｅｎ，Ｋ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１４６７０（１９９１）（これら３つの参考文献は全て参照として本明細書に組み込むものとする）に従って合成する。好ましい組み合わせは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤とＨＩＶ逆転写酵素非ヌクレオシド阻害剤との同時又は交互治療である。該組み合わせ中の任意成分である第３の成分は、ＡＺＴ、ｄＣ又はｄｄＩのようなＨＩＶ逆転写酵素ヌクレオシド阻害剤である。好ましいＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は化合物Ａである。好ましいＨＩＶ逆転写酵素非ヌクレオシド阻害剤には、化合物Ｂ、化合物Ｃ又はネビラピンが含まれる。これらの組み合わせは、ＨＩＶ感染の広がり(ｓｐｒｅａｄ)の阻害にも相乗作用を有し得る。好ましい組み合わせには、以下の、（１）化合物Ａと、好ましいＨＩＶ逆転写酵素非ヌクレオシド阻害剤と、場合によって、ＡＺＴ又はｄｄＩ若しくはｄｄＣとの組み合わせ；（２）化合物Ａと、ＡＺＴ又はｄｄＩ若しくはｄｄＣとの組み合わせが含まれる。微生物中で発現されたＨＩＶプロテアーゼの阻害アッセイ大腸菌中で発現されたプロテアーゼと、ペプチド基質［Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−（ベータナフチル）Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ、反応開始時には０．５ｍｇ／ｍｌ］との反応の阻害実験を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間行った。２５μｌのペプチド水溶液に、１．０μ ｌのＤＭＳＯ中の種々の濃度の阻害剤の溶液を加えた。０．１３３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び０．１％ウシ血清アルブミンの溶液中０．３３ｎＭプロテアーゼ（０．１１ｎｇ）１５μｌを加えて反応を開始した。１６０μｌの５％リン酸を加えて反応をクエンチした。反応生成物を、ＨＰＬＣ（ＶＹＤＡＣ広孔５ｃｍのＣ−１８逆相、アセトニトリル勾配、０.１％リン酸）にかけて分離した。反応阻害度を、生成物のピーク高からＩＣ₅₀として測定した。別々に合成した生成物をＨＰＬＣにかけ、定量標準及び生成物の組成を確認した。細胞感染の広がりアッセイＮｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４８８７（１９９１）に従って、細胞培養におけるＨＩＶ感染の広がりの阻害を測定した。このアッセイでは、予決定された接種原を用いてＭＴ−４Ｔ−リンパ球にＨＩＶ−１（特に断りのない限り、野生型）を感染させ、培養物を２４時間インキュベートした。間接免疫蛍光法によると、この時点では、細胞の≦１％が陽性であった。次いで、細胞を徹底的に洗浄し、９６ウエルの培養皿に分配した。該ウエルに２倍希釈系列の阻害剤を加え、さらに３日間培養を継続した。感染後４日目には、対照培養中１００％の細胞が感染した。ＨＩＶ−１ｐ２４の蓄積はウイルス感染の広がりに比例していた。細胞培養阻害濃度を、感染の広がりを少なくとも９５％低減させる阻害剤濃度、即ちＣＩＣ₉₅と定義し、ナノモル／リットルで表した。ウイルス感染の広がりの阻害Ａ．ＨＩＶに感染したＭＴ−４細胞の懸濁液の調製０日目に、ＭＴ細胞に、２５０，０００／ｍｌの濃度でＨＩＶ−１菌株IIIｂストックの１：１０００希釈液(１日目に≦１％の感染細胞を、４日目に２５〜１００％の感染細胞を得るに十分な最終１２５ｐｇｐ２４／ｍｌ)を感染させた。以下の培地中で細胞に感染させ、増殖させた：ＲＰＭＩ１６４０(ＷｈｉｔｔａｋｅｒＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ)、１０％不活化ウシ胎児血清、４ｍＭグルタミン(ＧｉｂｃｏＬａｂｓ)及び１：１００のペニシリン−ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＬａｂｓ）。混合物を５％ＣＯ₂雰囲気下に３７℃で一晩インキュベートした。Ｂ．阻害剤による治療ナノモル範囲の濃度のペア組み合わせのマトリックスを用意する。１日目に、９６ウエルマイクロタイター細胞培養プレート中の等量のＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞（１ウエル当たり５０，０００個）に、阻害剤の１２５μｌアリコートを加える。５％ＣＯ₂雰囲気下に３７℃で３日間インキュベーションを継続する。Ｃ．ウイルス感染の広がりの測定マルチチャンネルピペットを用い、沈殿した細胞を再懸濁し、１２５μｌを別のマイクロタイタープレート中に採取する。上清をＨＩＶｐ２４抗原についてアッセイする。以下に記載のように、酵素イムノアッセイにより、ＨＩＶｐ２４抗原の濃度を測定する。測定すべきｐ２４抗原のアリコートを、ＨＩＶコア抗原に特異的なモノクローナル抗体でコーティングしたマイクロウエルに加える。この時点及び後続の他の適切なステップで、マイクロウエルを洗浄する。次いで、ビオチニル化ＨＩＶ特異的抗体、次いで、結合したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを加える。加えられた過酸化水素及びテトラメチルベンジジン基質から色反応が生じる。色の濃さはＨＩＶｐ２４抗原の濃度に比例する。相乗作用度及び阻害増進度の計算相乗作用が存在する場合、阻害剤のペア組み合わせは、各阻害剤のみ、又は各阻害剤の単なる相加阻害の場合に比べて、ウイルス感染の広がりの阻害が著しく増進されたことが知見される。該データは以下のように処理される:部分阻止濃度率〔ＦＩＣ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏｓ）〕は、Ｅｌｉｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０８，４７７（１９５４）に従って計算する。最大相乗作用であるＦＩＣＳの最小和を、種々のペア組み合わせについて測定する。その数が小さければ小さいほど、相乗作用は大きくなる。実施例１Ａ．培養株の調製培養株ＭＡ７０６５を、それぞれ、シード培地及び生物変換培地中で増殖させた。シード培地（ＫＥ培地）は、０．１％デキストロース、１％デキストリン、０．３％肉エキス、０．５％ＡｒｄａｍｉｎｅｐＨ、０．５％ＮＺアミンタイプＥ、０．００５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及び０．０３７％Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．０５％ＣａＣｏ₃を用いてｐＨを７．１に調整）からなる。生物変換培地（大豆−グルコース）は、２％グルコース、０．５％大豆ミール、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．９８％ＭＥＳ（ｐＨは７．０に調整）を含む。Ｂ．生物変換スクリーニングＭＡ７０６５をＫＥシード培地中で増殖させた。回転振とう培養盤（２２０ｒｐｍ）を用い２７℃で一晩インキュベートした後、各培養株２ｍｌを、５０ｍｌの大豆−グルコース生物変換培地を含む２５０ｍｌ容量のバッフル付きフラスコに移した。０時間に、０．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した５ｍｇの化合物Ｊを各フラスコに加え、シード培養の場合と同じようにインキュベーションを継続した。種々の時間間隔で、生物変換培養物試料をＨＰＬＣにかけて調べた。ＨＰＬＣで測定して、基質の最大変換時点で培養物を採取し、分離、精製し、特性決定した。Ｃ．生物変換産物の分離及び特性決定初期に２５ｍｇのＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、化合物Ｊを含んでいた１０個のフラスコの内容物をプールし、遠心した。上清を回収し、１４％オクタデシル担体を含む活性化カラムの頂部に加えた。カラムを水で洗浄し、次いで、２０→８０％勾配の水性メタノールで溶離した。溶離された各画分を分析カラム上のＨＰＬＣにかけて調べた。このカラムは、タンクＡ及びＢからなる勾配溶媒系で展開させた。タンクＡは、１０％酢酸アンモニウム、０．１％ギ酸を含み、タンクＢは、６７％アセトニトリル、３３％メタノール、０．１％ギ酸を含んでいた。勾配は、３０分後に、３０→８５％溶媒Ｂに変えた。分析カラムから得られた結果に基づき、所望の代謝物を含む画分を、活性化カラムから６０→８５％水性メタノールで溶離した。従って、この画分は、セミ−プレプでさらに精製された。分析カラムから４つに分割された画分をそれぞれ分離し、さらに精製した後で、ＮＭＲ、ＦＡＢ−ＭＳ分析及び生物学的評価にかけた。実施例２ＨＩＶタンパク質阻害剤化合物Ｊと細菌培養株ＭＡ７０６５とをインキュベートしたものから分離した４試料を質量スペクトル分析にかけて特性決定した。以下に示すように、化合物Ａ、Ｃ１、Ｃ２，Ｄ及びＥについて特性決定した。インダニル環、フェニル環及びピリジン環の酸化が認められた。イオンスプレーインターフェース(ｉｏｎｓｐｒａｙｉｎｔｅｒｆａｃｅ)を用い、質量分析計上のＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、質量スペクトル及び娘イオンスペクトルを得た。試料を、５０％ＣＨ₃ＣＮ／５０％１０ｍＭＮＨ₄ＯＡｃ／０．１％ＴＦＡからなる移動相に直接注入して分析した。陽性イオン検出法を用いた。化合物ＪＪの質量スペクトルから、６１３Ｄａの分子量を示す(Ｍ＋Ｈ)⁺＝６１４を得た。ｍ／ｚ５１３、４６５、４２１及び３３８でのＪの娘イオンスペクトルにおける４つの主要フラグメントイオンから、これらの試料の一般的な代謝部位を決定することができた。以下の表は、これらのスペクトルの分析結果を要約したものであり、ＭＡ７０６５生物変換産物（６８０５１−Ａ、６８０５１−９Ｃ、６８０５１−１２Ｆ１及び６８０５１−１２Ｆ３）並びに他の微生物由来の産物の試料を含んでいる。これらの化合物の構造はＮＭＲ分光分析と合致した。実施例３化合物Ｊの生物変換産物のＨＩＶプロテアーゼ阻害活性上記プロトコルに従い、微生物中で発現されたＨＩＶプロテアーゼの阻害アッセイにより、７種の化合物Ｊの生物変換産物を、ｉｎｖｉｔｒｏＨＩＶプロテアーゼ阻害についてアッセイした。該生物変換産物のうち４種は、ＭＡ７０６５をインキュベーションしたものから単離した、化合物Ａ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ及びＥであった。親化合物ＪのＩＣ₅₀を、各テスト化合物のＩＣ₅₀で割り、１００を掛け、Ｊに対する各化合物の力価％を計算した。いくつかのケースでは、テスト化合物の希釈率は、呼称重量を基準とした。他のケース、特に重量が２５０μｇ未満のケースでは、標準としてＪを用いてＨＰＬＣにかけて濃度を調べた。化合物Ｊに対する力価％実施例４アミド１の調製熱電対プローブ、機械的撹拌装置、並びに窒素送込口用アダプター及びバブラーを具備した５０Ｌ容量の丸底フラスコ中の、１７．８Ｌの無水ＴＨＦ（ＫＦ＝５５ｍｇ／ｍｌ）（ＫＦは、カールフィッシャー水分滴定値を表す）及びトリエチルアミン（８６８ｍｌ，６．２２ｍｏｌ）に溶解した(−)−シス−１−アミノインダン−２−オール(８８４ｇ，５．９３ｍｏｌ)の溶液を１５℃に冷却した。次いで、氷−水冷却浴で内部温度を１４〜２４℃に維持しながら、３−フェニルプロピオニルクロリド（１０００ｇ，５．９３ｍｏｌ）を７５分かけて加えた。添加後、混合物を１８〜２０℃で３０分間熟成させ、（−）−シス−１−アミノインダン−２− オールの消失についてＨＰＬＣ分析にかけて調べた。反応の進行を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析〔２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＣ８−ＲＸカラム、６０：４０アセトニトリル／１０ｍＭ（ＫＨ₂ ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）、流速＝１．０ｍｌ／分、注入量＝２０ｍｌ、検出＝２００ｎｍ、試料の調製＝５００×希釈〕にかけてモニターした。おおよその保持時間：保持時間（分）化合物名６．３シス−アミノインダノール反応物を、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（２４１ｇ，０．９６ｍｏｌ，０．１６当量）で処理し、１０分間撹拌した（１ｍｌの試料を等量の水で希釈した後の混合物のｐＨは４．３〜４．６である）。次いで、２−メトキシプロペン（１．２７Ｌ，１３．２４ｍｏｌ，２．２当量）を加え、反応物を２時間３８〜４０℃に加熱した。反応混合物を２０℃に冷却し、酢酸エチル（１２Ｌ）と５％水性ＮａＨＣＯ₃（１０Ｌ）に分配した。混合物を攪拌し、相を分離した。酢酸エチル抽出物を５％水性ＮａＨＣＯ₃(１０Ｌ)と水（４Ｌ）で洗浄した。酢酸エチル抽出物を常圧蒸留により脱水し、溶媒をシクロヘキサン（総量〜３０Ｌ）に交換した。蒸留及び濃縮（酢酸エチル抽出物質量の２０質量％）した後、高温シクロヘキサン溶液をゆっくり２５℃に冷却して、生成物を結晶化した。得られたスラリーをさらに１０℃に冷却し、１時間熟成させた。生成物を濾過して分離し、湿潤ケークを冷（１０℃）シクロヘキサン(２×８００ｍｌ)で洗浄した。洗浄したケークを４０℃で真空乾燥（水銀柱２６″）して、１．６５ｋｇのアセトニド１（ＨＰＬＣにより、８６．４％、９８面積％）を得た。¹ＨＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃、主要回転異性体）δ７．３６−７．１４（ｍ，９Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝４．４，１Ｈ），４．６６（ｍ，１Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），３．０６（広幅ｓ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．３７（ｓ，３Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，主要回転異性体）δ_c１６８．８，１４０，９，１４０．８，１４０．６，１２８．６，１２８．５，１２８．４，１２７．１，１２６．３，１２５．８，１２４．１，９６．５，７８．６，６５．９，３８．４，３６．２，３１，９，２６．５，２４．１。Ｃ₂₁Ｈ₂₃ＮＯ₂の元素分析：計算値：Ｃ，７８．４７；Ｈ，７．２１；Ｎ，４．３６％；実測値：Ｃ，７８．６５；Ｈ，７．２４；Ｎ，４．４０％。実施例５エポキシド３の調製熱電対、機械的撹拌装置、滴下漏斗及び窒素送込口用アダプターを具備した５０Ｌ容量の四首丸底フラスコ中の、１５．６ＬのＴＨＦ（ＫＦ＝２２ｍｇ／ｍｌ）に溶解したアセトニド１（１０００ｇ，３．１１ｍｏｌ）及び２（Ｓ）−グリシジルトシラート２（８５３ｇ，３．７４ｍｏｌ，１．２当量）の溶液を真空− 窒素パージにより３回ガス抜きし、−５６℃に冷却した。次いで、内部温度を− ５０〜−４５℃に維持しながら、リチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＮ［（ＣＨ₃）３Ｓｉ］₂）（２．６Ｌ，１．３８Ｍ，１．１５当量）を２時間かけて加えた。反応混合物を −４５〜−４０℃で１時間攪拌し、次いで、１時間かけて−２５℃に温めた。混合物を−２５〜−２２℃で４時間(又は出発アセトニドが３．０面積％になるまで)攪拌した。反応の進行を、ＨＰＬＣ分析〔２５ｃｍ×４．６ｎｍＺｏｒｂａｘＳｉｌｉｃａカラム、ヘキサン中２０％酢酸エチル、流速＝２．０ｍｌ／分、注入量＝２０ｍｌ、検出＝２５４ｎｍ、試薬の調製＝１００×希釈〕にかけてモニターした。おおよその保持時間：保持時間（分）化合物名５．５アミド１６．５グリシジルトシラート２１３．５エポキシド３ −１５℃でＤＩ水（６．７Ｌ）を加えて、反応混合物をクエンチし、酢酸エチル（１０Ｌ）で分配した。混合物を撹拌し、層を分離した。酢酸エチル抽出物を、１％水性ＮａＨＣＯ₃（５Ｌ）と飽和ＮａＣｌ（０．５Ｌ）の混合物で洗浄した。酢酸エチル抽出物（２８．３Ｌ）を真空蒸留（水銀柱２８″）して濃縮し、追加の酢酸エチルを加えて、酢酸エチルへの溶媒交換（最終容量＝１１．７Ｌ）を完了した。酢酸エチル濃縮物をさらにＭｅＯＨに溶媒交換して生成物を結晶化し、３．２Ｌの最終容量に濃縮した。１０Ｌのメタノールを装入し、１０Ｌの蒸留物を回収して、残留酢酸エチル溶媒を除去した。得られたスラリーを２２℃で１時間攪拌し、次いで、５℃に冷却、０．５時間熟成させた。生成物を濾過して分離し、湿潤ケークを冷メタノール（２×２５０ｍｌ）で洗浄した。洗浄したケークを、２５℃で真空乾燥（水銀柱２６″）し、７２７ｇのエポキシド３（ＨＰＬＣにより、主要エポキシドの６１．２％，９８．７面積％）を得た。¹³ＣＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１７１．１，１４０．６，１４０．５，１３９．６，１２９．６，１２８．８，１２８．２，１２７．２，１２６．８，１２５．６，１２４．１，９６．８，７９．２，６５．８，５０．０，４８．０，４４．８，３９．２，３７．４，３６．２，２６．６，２４．１。実施例６前末端化合物（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）６の調製機械的攪拌装置、還流冷却器、蒸気浴、テフロンコーティングした熱電対及び窒素送込口を具備した、４つの入口を有する７２Ｌ容量の丸底フラスコ中の、イソプロパノール（２−プロパノール，１８．６Ｌ）中の２（Ｓ）−ｔ−ブチルカルボキサミド −４−Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン４（１９５０ｇ，６．８３ｍｏｌ，＞９９．５％ｅｅ）（ｅｅ＝エナンチオマー過剰率）及びエポキシド３（４Ｓ／Ｒエポキシドの９７．５：２．５混合物，２４５６ｇ，６．５１ｍｏｌ）のスラリーを加熱還流した（内部温度は８４〜８５℃）。４０分後に均質溶液を得た。混合物を２８時間加熱還流した。還流中の内部温度は８４〜８５℃であった。反応の進行をＨＰＬＣ分析〔２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＣ８−ＲＸカラム、６０：４０アセトニトリル／１０ｍＭ（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）、流速＝１．０ｍｌ／分、検出＝２２０ｎｍ、試料の調製＝アセトニトリル中１ｍｌに希釈した反応混合物２μｌ〕にかけてモニターした。おおよその保持時間：保持時間（分）化合物名４．８ピペラジン４８．９エポキシド３１５．２結合化合物５２８時間後、残留していたエポキシド３と結合生成物５（ＨＰＬＣ分析による）は、それぞれ１．５面積％と９１〜９３面積％であった。混合物を０〜５℃に冷却し、温度を１５℃以下に維持しながら、２０．９Ｌの６ＮＨＣｌを加えた。添加完了後、混合物を２２℃に温めた。この時点でガス（イソブチレン）の放出が認められた。混合物を２０〜２２℃で６時間熟成させた。反応の進行を上記と同じ条件下にＨＰＬＣ分析にかけてモニターした。おおよその保持時間：保持時間（分）化合物名７．０シス−アミノインダノール１１．９前末端化合物６１５．１結合生成物５混合物を０℃に冷却し、温度を２５℃以下に維持しながら、７．５Ｌの５０％ＮａＯＨをゆっくり加えて、混合物のｐＨを１１．６に調整した。混合物を酢酸エチル（４０Ｌ）と水（３Ｌ）に分配した。混合物を撹拌し、層を分離した。有機層（６０Ｌ）を減圧（水銀柱２９″）下に濃縮し、溶媒をＤＭＦに交換し、１０．５Ｌ（ＫＦ＝１．８ｍｇ／ｍｌ）の最終容量に濃縮した。酢酸エチル中の６の収率をＨＰＬＣでアッセイすると、８６．５％であった。ＤＭＦ中の前末端化合物６をさらに精製せずにそのまま次のステップに用いた。単離した６の¹³ＣＮＭＲ（７５．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１７５．２，１７０．５，１４０．８，１４０．５，１３９．９，１２９．１，１２８．５，１２７．９，１２６．８，１２６．５，１２５．２，１２４．２，７３．０，６６．０，６４．８，６２．２，５７．５，４９．５，４７．９，４６．４，４５．３，３９．６，３９．３，３８．２，２８．９。４０ｍｌのＤＭＦ中に溶解した１０．０ｇ（０．０１９ｍｏｌ）のＮ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−フェニルメチル−４（Ｓ）−ヒドロキシ）−５−（１（−２（Ｓ）−Ｎ−（ｔ−ブチルカルバモイル） −ピペラジニル）−ペンタンアミド６及び３．４５ｇ（０．０２１ｍｏｌ）の３ −ピコリルクロリドに、５．８５ｍｌ（０．０４２ｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。３時間後、追加の０．３１３ｇの３−ピコリルクロリドを加えた。さらに２時間経過後、反応物を４００ｍｌのＥｔＯＡｃで希釈し、水（３×７５ｍｌ）、ブライン（１×１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水、濃縮した。残留物を３０ｍｌのＥｔＯＡｃですり砕き、得られた白色沈殿物を回収した。さらにＥｔＯＡｃから再結晶して、生成物である化合物Ｊ（融点：１６７．５−１６９℃）を得た。実施例７ピラジン−２−ｔ−ブチルカルボキサミド９７２Ｌ容量の三首フラスコ中、Ｎ₂下に、カルボン酸８を２７ＬのＥｔＯＡｃ及び１２０ｍｌのＤＭＦに機械的に攪拌しながら懸濁し、懸濁液を２℃に冷却した。温度を５〜８℃に維持しながら、塩化オキサリルを加えた。添加は５時間で完了した。発熱性添加の間に、ＣＯ及びＣＯ₂が発生した。形成されたＨＣｌはおおむね溶液のままであった。ピラジン酸塩化物のＨＣｌ塩と思われる沈殿物が存在した。反応物の無水試料をｔ−ブチルアミンでクエンチして、酸塩化物形成アッセイを行った。アッセイ完了後、酸８の＜０．７％が残った。酸塩化物形成の完全性についてのアッセイは重要である。何故ならば、反応が不完全であればビス−ｔ−ブチルオキサミド不純物が形成されるからである。ＨＰＬＣ〔流速１ｍｌ／分及び２５０ｎｍで検出する２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム;３０分で、９８％の０．１％水性Ｈ₃ＰＯ₄及び２％ＣＨ₃ＣＮ→５０％水性Ｈ₃ＰＯ₄及び５０％ＣＨ₃ＣＮへの直線勾配〕にかけて反応をモニターし得る。保持時間：酸８＝１０．７分、アミド９＝２８．１分。反応混合物を５℃で１時間熟成させた。得られたスラリーを０℃に冷却し、内部温度を２０℃以下に維持するような速度でｔ−ブチルアミンを加えた。反応が極めて発熱性であったために、添加には６時間を要した。生成されたｔ −ブチルアンモニウムヒドロクロリドの小部分をふわふわした白色固体として反応物から払い落とした。混合物を１８℃でさらに３０分間熟成させた。沈殿したアンモニウム塩を濾過して除去した。フィルターケークを１２ＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。合わせた有機層を６Ｌの３％ＮａＨＣＯ₃及び２×２Ｌの飽和水性ＮａＣｌで洗浄した。有機層を２００ｇのＤａｒｃｏＧ６０炭素で処理、ＳｏｌｋａＦｌｏｋを通して濾過し、ケークを４ＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。炭素処理により、生成物の紫色がかった色あいが効果的に取り除かれた。９のＥｔＯＡｃ溶液を１０ミリバール下に初期容量の２５％に濃縮した。３０Ｌの１−プロパノールを加え、２０Ｌの最終容量に達するまで蒸留を継続した。この時点で、ＥｔＯＡｃは、¹ＨＮＭＲ（＜１％）の検出限界以下であった。この溶媒交換における内部温度は＜３０℃であった。３の１−プロパノール／ＥｔＯＡｃ溶液は数日間常圧還流させても安定であった。アリコートを蒸発させて褐色固体（融点：８７−８８℃）を得た。¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃ ，ｐｐｍ）１６１．８，１４６．８，１４５．０，１４３．８，１４２．１，５１．０，２８．５．実施例８ｒａｃ−２−ｔ−ブチル−カルボキサミド−ピペラジン１０材料１−プロパノール溶液１２Ｌ、２０％Ｐｄ（ＯＨ）₂／Ｃ１６重量％、水１４４ｇ中のピラジン−２−ｔ−ブチルカルボキサミド９２．４ｋｇ（１４．３ｍｏｌ）。ピラジン−２−ｔ−ブチルカルボキサミド９／１−プロパノール溶液を５ガロン容量のオートクレーブに装入した。触媒を加え、混合物を６５℃、４０ｐｓｉ（３ａｔｍ）のＨ₂下に水素化した。２４時間後、反応物を理論量の水素に入れ、ＧＣにかけると、＜１％の９が示された。混合物を冷却し、Ｎ₂でパージし、触媒をＳｏｌｋａＦｌｏｃを通して濾過して除去した。触媒を２Ｌの温１−プロパノールで洗浄した。フィルターケークの洗浄に温１−プロパノールを用いると、濾過が改善され、フィルターケーク上の生成物の損失が減少することが知見された。反応を、ＧＣ〔３０ｍＭｅｇａｂｏｒｅカラム、１０℃／分で１００〜１６０℃、５分間保持、次いで、１０℃／分で２５０℃に；保持時間：９＝７．０分、１０＝９．４分〕にかけてモニターした。反応は、溶媒としてＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（５０：５０）及び展開剤としてＮｉｎｈｙｄｒｉｎを用いるＴＬＣによってもモニターし得る。アリコートを蒸発させると、アミド化及び水素化後の収率は８８％であり、１０の濃度は１３３ｇ／ｌであることが示された。アリコートを蒸発させて、白色固体として１０（融点：１５０−１５１℃）を得た。¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ，ｐｐｍ）１７３．５，５９．８，５２．０，４８．７，４５．０，４４．８，２８．７。実施例９（Ｓ）−２−ｔ−ブチル−カルボキサミド−ピペラジンビス（Ｓ）−ショウノウスルホン酸塩（Ｓ）−１１材料１−プロパノール中のアミン１０の溶液を、バッチ濃縮装置を連結した１００Ｌ容量のフラスコに装入した。溶液を、１０ミリバール下＜２５℃の温度で、約１２Ｌの容量に濃縮した。この時点で、溶液から生成物が沈殿したが、混合物を５０℃に加熱すると、溶液に戻った。均質アリコートを分析すると、１０の濃度は３４１ｇ／ｌであると示された。ＨＰＬＣ〔流速１．５ｍｌ／分、２１０ｎｍで検出、アイソクラチック（９８／２）ＣＨ₃ＣＮ／０．１％水性Ｈ₃ＰＯ₄で溶離する２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム〕にかけて濃度を測定した。１０の保持時間：２．５分。アセトニトリル（３９Ｌ）及び水（２．４Ｌ）を加えて、透明でやや茶色っぽい溶液を得た。ＫＦ滴定により含水量を、及び¹ＨＮＭＲ分光法によりＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール比を測定すると、ＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール／Ｈ₂Ｏの比は２６／８／１．６であると示された。溶液中の濃度は７２．２ｇ／ｌであった。（Ｓ）−１０−ショウノウスルホン酸を４部にわけ２０℃で３０分かけて装入した。ＣＳＡを加えると、温度が４０℃に上昇した。数分後、濃厚な白色沈殿物が形成された。該白色スラリーを７６℃に加熱して固体全てを溶解し、次いで、やや茶色っぽい溶液を８時間かけて２１℃に冷却した。６２℃で生成物が沈殿した。生成物を２１℃で熟成させずに濾過し、フィルターケークを５ＬのＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール／Ｈ₂Ｏ６／８／１.６溶媒混合物で洗浄した。フィルターケークをＮ₂流下に真空オーブン中３５℃で乾燥して、白色結晶性固体として、５．６ｋｇ（３９％）の１１〔融点：２８８−２９０℃（分解）〕を得た。［α］Ｄ²⁵＝１８．９°（ｃ＝０．３７，Ｈ₂Ｏ）。¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ，ｐｐｍ）２２２．０，１６４．０，５９．３，５４．９，５３．３，４９．０，４８．１，４３．６，４３．５，４３．１，４０．６，４０．４，２８．５，２７．２，２５．４，１９．９，１９．８。以下のキラルＨＰＬＣアッセイによれば、該物質のｅｅは９５％であった：１１のアリコート（３３ｍｇ）を４ｍｌのＥｔＯＨ及び１ｍｌのＥｔ₃Ｎに懸濁した。Ｂｏｃ₂Ｏ（１１ｍｇ）を加え、反応混合物を１時間熟成させた。溶媒を完全に真空除去し、残留物を約１ｍｌのＥｔＯＡｃに溶解し、溶離剤としてＥｔＯＡｃを用い、ＳｉＯ₂を含有するパスツールピペットを通して濾過した。蒸発させた生成物画分を約１ｍｇ／ｍｌでヘキサンに再溶解した。ヘキサン／ＩＰＡ（９７：３）溶媒系を用い、流速１ｍｌ／分、２２８ｎｍで検出するＤａｉｃｅｌＣｈｉｒａｃｅｌｌＡＳカラム上でエナンチオマーを分離した。保持時間：Ｓ対掌体＝７．４分、Ｒ＝９．７分。実施例１０塩１１からの（Ｓ）−２−ｔ−ブチルカルボキサミド−４−ｔ−ブトキシカルボニル−ピペラジン４材料滴下漏斗を備えた１００Ｌ容量三首フラスコ中の（Ｓ）−ＣＳＡ塩１１に、Ｎ₂ 下に２５℃で、ＥｔＯＨ、次いでトリエチルアミンを加えた。Ｅｔ₃Ｎを加えると、固体は直ちに溶解した。Ｂｏｃ₂ＯをＥｔＯＡｃに溶解し、滴下漏斗に装入した。温度を２５℃以下に維持するような速度でＢｏｃ₂ＯのＥｔＯＡｃ溶液を加えた。添加には３時間を要した。Ｂｏｃ₂Ｏ溶液の添加完了後、反応混合物を１時間熟成させた。ＨＰＬＣ〔流速１ｍｌ／分、２２８ｎｍで検出、ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整したアイソクラチック（５０／５０）ＣＨ₃ＣＮ／０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄で溶離する２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム〕にかけて反応をモニターし得る。４の保持時間＝７．２分。先行ステップと同じ系を用いてキラルアッセイを実施した。反応は、溶媒として１００％ＥｔＯＡｃを用いるＴＬＣによってもモニターし得る（Ｒ_f＝０．７）。次いで、１０ミリバール真空下にバッチタイプ濃縮装置中＜２０℃の内部温度で溶液を約１０Ｌに濃縮した。２０ＬのＥｔＯＡｃ中でゆっくり放出（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）させて、約１０Ｌに再濃縮して、溶媒交換を完了した。６０ＬのＥｔＯＡｃを用いて反応混合物を抽出器中に洗い出した。有機層を、１６Ｌの５％水性Ｎａ₂ＣＯ₃溶液、２×１０ＬのＤｉ水及び２×６Ｌの飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。合わせた水性洗浄液を２０ＬのＥｔＯＡｃで逆抽出し、有機層を２ ×３Ｌの水及び２×４Ｌの飽和水性塩化ナトリウムで洗浄した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物を、１００Ｌ容量のバッチタイプ濃縮装置中１０ミリバール真空下に＜２０℃の内部温度で約８Ｌに濃縮した。約２０Ｌのシクロヘキサン中でゆっくり放出させ、約８Ｌに再濃縮して、シクロヘキサンへの溶媒交換を行った。該スラリーに、５Ｌのシクロヘキサン及び２８０ｍｌのＥｔＯＡｃを加え、混合物を加熱還流すると、全てが溶液となった。溶液を冷却し、種（１０ｇ）を５８℃で加えた。４時間後に、スラリーを２２℃に冷却し、２２℃で１時間熟成させた後、生成物を濾過して単離した。フィルターケークを１．８Ｌのシクロヘキサンで洗浄し、真空オーブン中Ｎ₂流下に３５℃で乾燥して、やや褐色の粉末として１．８７ｋｇの４（ＨＰＬＣにより、７７％，＞９９．９面積％、検出レベル以下のＲ−異性体）を得た。[α]Ｄ²⁵＝２２.０°（ｃ＝０．２０，ＭｅＯＨ）、融点＝１０７℃；¹³ ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ）１７０．１，１５４．５，７９．８，５８．７，５０．６，４６．６，４３．６，４３．４，２８．６，２８．３。上述の明細書は本発明の原理を教示し、実施例は例示を目的として記載されているが、本発明の実施には、以下の請求の範囲及びその均等物の範囲内に含まれる、通常の変更、改変又は修正が全て包含されるものと理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 //(Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ (72)発明者チエン，シー−シユン・テイーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者アリスン，バイロン・エイチアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ミラー，ランドール・アールアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ギヤリテイ，ジヨージ・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ハイムバツハ，ブライアンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の構造：を有する化合物Ｊの生物変換産物又はその塩若しくは水和物を合成する方法であって、（ａ）培養株ＭＡ７０６５を準備するステップ；（ｂ）該培養株を化合物Ｊと共にインキュベートするステップ；（ｃ）を含む生物変換産物又はその塩若しくは水和物を単離するステップを含む前記方法。２．請求項１に記載の方法により得られた精製された生物変換産物。３．である化合物又はその塩若しくは水和物。４．請求項３の化合物及び医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物。５．ＡＩＤＳの治療及びその発症の遅延、ＨＩＶ感染の予防、ＨＩＶ感染の治療、又はＨＩＶプロテアーゼの阻害に用いるための、請求項３に記載の医薬組成物。６．ＡＩＤＳの治療及びその発症を遅延させる方法であって、そのような治療を要するヒト以外の哺乳動物に、有効量の請求項３に記載の化合物を投与することを含む前記方法。７．ＨＩＶ感染を予防する方法であって、そのような治療を要するヒト以外の哺乳動物に、有効量の請求項３に記載の化合物を投与することを含む前記方法。８．ＨＩＶ感染を治療する方法であって、そのような治療を要するヒト以外の哺乳動物に、有効量の請求項３に記載の化合物を投与することを含む前記方法。９．ＨＩＶプロテアーゼを阻害する方法であって、そのような治療を要するヒト以外の哺乳動物に、有効量の請求項３に記載の化合物を投与することを含む前記方法。１０．請求項３に記載の化合物と、ＡＺＴ又はｄｄＩ若しくはｄｄＣのいずれかとの化合物組み合わせ体。１１．ＭＡ７０６５の純粋培養株。