DE69828519T2 - Membran zur gesteuerten regeneration von gewebe - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mehrschichtmembran aus Collagen zur Verwendung bei der gesteuerten Regeneration von Gewebe, insbesondere zur Verwendung in vivo bei der Rekonstruktion von Knochen- oder Knorpelgewebe, Mehrschichtmembranen, die durch dieses Verfahren erhältlich sind, sowie die Verwendung solcher Membranen bei der Herstellung von Implantaten für die gesteuerte Regeneration von Gewebe.
• Bei der Regeneration von Gewebe hat es sich seit langem als schwierig erwiesen, Knorpelgewebe zur rekonstruieren, etwa bei Knorpel-Läsionen. Knorpelverletzungen können bei allen Gelenken auftreten, wenngleich die größten Risiken bei größeren Gelenken bestehen wie etwa dem Kniegelenk und dem Knöchelgelenk. Solche Verletzungen können aus Trauma, aus degenerativen Bedingungen oder Osteochondritis Dissecans resultieren. Knorpelverletzungen sind ein hauptsächlicher pathomechanischer Faktor bei der Entstehung von Arthrose. Die Freisetzung von Enzymen führt zu einem entzündlichen Prozeß der Synovia, der seinerseits zum Abrieb des Knorpels und zur Zerstörung der Gelenkoberfläche führt. Neuere Ansätze zur in vivo Regeneration von Gelenkknorpel bei chondralen Defekten beruhen auf der Implantation von in Kultur gewonnenen autogenen Gelenk-Chondrozyten (CACs). Diese Technik hatte jedoch nur begrenzten Erfolg.
• Es ist heute allgemein akzeptiert, daß die Rekonstruktion von Gewebe die Bereitstellung einer Matrix erfordert, die als eine Führung für Zellen dient, die entlang und zwischen den Fasern der Matrix wachsen. In jüngerer Zeit ist die Verwendung von CACs vorgeschlagen worden, mit denen sowohl synthetische als auch natürliche resorbierbare Matrizen geimpft werden. Versuche, Knorpelgewebe mit Hilfe von Matrizen auf der Basis von Poly-Milchsäure, Polyglykolsäure und Collagen I oder III zu rekonstruieren, machten es jedoch erforderlich, daß die Matrizen vor der Implantation in vitro mit Chondrozyten beladen wurden. Dies führt zu Komplikationen hinsichtlich der sterilen Kultur der Chondrozyten, d.h. immunologischen Entzündungsreaktionen durch Makrophagen und Fibroblasten an der Grenzfläche zwischen Implantaten und Gewebe.
• WO-A-96/25961 schlägt ein Matriximplantat auf der Grundlage von Collagen II vor, das in vivo implantiert werden kann und auf dem Wachstum von körpereigenen Chondrozyten auf der Oberfläche der Matrix beruht, um die Rege neration des Knorpels zu bewirken. Die Fähigkeit einer solchen Matrix, die vollständige Regeneration von Knorpelgewebe zu bewirken, ist jedoch begrenzt.
• WO-A-96/24310 beschreibt eine mehrschichtige Schablone oder ein mehrschichtiges Implantat auf der Basis von Collagen zur Verwendung bei der Reparatur von Knorpel-Läsionen. Das Produkt wird gebildet durch Kombination einer porösen Collagenmatrix mit einer dichten Collagenmembran. Es wird vorgeschlagen, daß diese Membran an der Oberfläche eines Knorpeldefekts angeordnet werden kann, um Zellmigration aus der subchondralen Platte und der Gefäßwand zu verhindern, während die Bewegung und der Austausch von Fluiden, Nährstoffen, Cytokinen und anderen für die Regeneration von Knorpel notwendigen Faktoren ermöglicht wird. Die angeheftete Collagenmembran soll die Anhaftung und das Wachstum von Zellen ermöglichen, insbesondere von Chondrozyten, wie sie normalerweise in Gelenkknorpeln gefunden werden.
• In der Praxis werden sowohl die Matrix als auch die Membran aus Collagen I gebildet, und sie werden durch Sutur miteinander verbunden; es ist einsichtig, daß dies die Barriereeigenschaften der Membran beeinträchtigen kann. Das Produkt wird häufig eine Impfung mit Chondrozyten vor der Implantation erfordern, was zu den oben erwähnten Komplikationen führt.
• Es besteht somit weiterhin Bedarf an einem mehrschichtigen Matriximplantat mit verbesserten physikalischen Eigenschaften, das das erfolgreiche Einwachsen von körpereigenen Chondrozyten und somit die Regeneration von Knorpelgewebe im Anschluß an die in vivo Implantation erlaubt.
• Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß ein mehrschichtiges Produkt mit solchen vorteilhaften Eigenschaften hergestellt werden kann, indem ein Schlamm aus Collagen II auf eine Barriereschicht aus Collagen I und III aufgebracht und das erhaltene Produkt gefriergetrocknet wird, um dem Schlamm aus Collagen II in eine schwammförmige Matrixschicht umzuwandeln, wie nachstehend näher spezifiziert werden wird. Das so erhaltene Produkt weist eine gute Haftung zwischen den Barriere- und Matrixschichten auf. Knorpel und letztlich neues Knochengewebe kann durch den Einsatz eines solchen Produkts rekonstruiert werden, wobei die Matrix aus Collagen II durch die Barriereschicht, die in der Lage ist, das unerwünschte Einwachsen von beliebigen umgebenden Geweben in die Matrix zu verhindern, in vivo nicht nur gegen das umgebende Bindegewebe sondern auch gegenüber dem unterlagernden Knochen- und Knorpeldefekt abgeschirmt wird.
• Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Mehrschichtmembran geschaffen, die für den Einsatz in vivo bei der Rekonstruktion von Knochen- oder Knorpelgewebe geeignet ist und die aufweist: (i) eine Matrixschicht, die vorwiegend aus Collagen II besteht und eine offene, schwammartige Textur hat, und (ii) wenigstens eine Barriereschicht, die eine geschlossene, relativ undurchlässige Textur hat und vorwiegend aus Collagen I und III hergestellt ist, wobei das Verfahren das Auftragen eines Schlammes aus Collagen II auf eine Oberfläche einer Barriereschicht, wie oben definiert, umfaßt, gefolgt von Gefriertrocknung, um dadurch die Matrixschicht aus Collagen II mit einer offenen, schwammartigen Struktur zu schaffen.
• Die Erfindung schafft weiterhin eine Mehrschichtmembran, die durch das oben genannte Verfahren erhältlich ist.
• Ein besonderer Vorteil der gemäß der Erfindung herstellbaren Membran beim Einsatz bei der Geweberekonstruktion besteht darin, daß körpereigene Zellen wegen der dichten und verhältnismäßig undurchlässigen Textur der Barriereschicht nicht in der Lage sind, in diese Barriereschicht einzudringen oder einzuwachsen.
• Obgleich eine Festlegung auf die Theorie nicht beabsichtigt ist, wird angenommen, daß eine erfolgreiche Regeneration von Knorpelgewebe es erfordert, daß das schnelle Einwachsen nicht nur von körpereigenen Gewebezellen wie etwa Bindegewebe, Blutgefäßen etc., sondern auch von etwaigem neuen Knochengewebe in die Stelle des Defekts verhindert wird. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer zweischichtigen Membran, die in Übereinstimmung mit der Erfindung herstellbar ist und dazu dient, die Collagenmatrix gegen das Einwachsen von körpereigenen Gewebezellen von einer Seite her zu schützen. Während der chirurgischen Implantation kann dies in Kombination mit einem Gewebeimplantat, z.B. einen Periostalimplantat, verwendet werden, das das Einwachsen von körpereigenen Gewebezellen von der entgegengesetzten Seite her wirksam verhindert. So kann z.B. ein Periostalim plantat anfangs so eingenäht werden, daß es eine Abdeckung über dem Kochen- oder Knorpeldefekt bildet. Eine gemäß der Erfindung herstellbare zweischichtige Membran kann dann an der Stelle des Defekts so implantiert werden, daß sie an dem Implantat anliegt, und kann so angeordnet werden, daß die Matrixschicht dem Knochendefekt zugewandt ist. Noch bevorzugter ist es, eine gemäß der Erfindung herstellbare zweischichtige Membran anfangs so an der Stelle des Defekts zu implantieren, daß die Barriereschicht dem Knochen- oder Knorpeldefekt zugewandt ist. Ein Periostalimplantat wird dann so angeordnet, daß es an der Matrixschicht anliegt. Das Implantat kann mit einem biokompatiblen Kleber wie etwa Fibrinkleber befestigt oder mit resorbierbaren Stiften aus Poly-Milchsäure angeheftet werden oder, wenn es erforderlich oder möglich ist, so angenäht werden, daß es dann eine für das Einwachsen von irgendwelchem umgebenden Bindegewebe undurchdringliche Barriere bildet.
• Es versteht sich, daß gemäß der Erfindung auch eine dreischichtige Membran hergestellt werden kann, bei der die Matrixschicht zwischen zwei Barriereschichten liegt. Eine solche Membran kann für sich allein das Einwachsen von irgendwelchen körpereigenen Gewebezellen wirksam verhindern.
• Die Matrixschicht der gemäß der Erfindung herstellbaren Membranen ist in der Lage, als ein Medium für das Einwachsen von körpereigenen Chondrozyten zu wirken und dadurch die Regeneration des Knochengewebes herbeizuführen. Um die Regeneration des Knorpelgewebes weiter zu unterstützen, kann jedoch die Matrixschicht entweder vor oder nach der Implantation in vivo mit Chondrozyten imprägniert werden. Zwar kann die Matrixschicht unmittelbar vor der Implantation mit Chondrozyten imprägniert werden, etwa durch Injektionen, doch wird erwartet, daß im allgemeinen die Chondrozyten durch direkte Injektion einer Suspension aus Chondrozyten im Anschluß an die Implantation in die Matrixschicht eingebracht werden. Auf diese Weise sind die in der Matrixschicht der Membran vorhandenen Chondrozyten in der Lage, die Regeneration von Knorpel und letztlich von neuem Knochen zu bewirken, während die Barriereschicht der Membran zugleich das Einwachsen anderer Zelltypen aus den umgebenden Geweben verhindert.
• Chondrozyten für diesen Verwendungszweck können aus Zellquellen erhalten werden, die allogene oder autogene Zellen, isoliert aus Gelenkknorpel. Periost und Perichondrium, und mesenchymale (stromale) Stammzellen aus Knochen mark umfassen. Da allogene Zellen das Potential für Immunantworten und infektiöse Komplikationen in sich bergen, ist es bevorzugt, die Chondrozyten aus autogenen Zellen zu isolieren, insbesondere aus autogenem Gelenkknorpel. Techniken zur Gewinnung der Zellen sind bekannt und umfassen enzymatische Verdauung oder Auswuchskulturen. Die gewonnenen Zellen werden dann in Zellkulturen expandiert, bevor sie wieder in den Körper eingeführt werden. Im allgemeinen sollte die Matrixschicht mit wenigsten 10⁶, vorzugsweise wenigstens 10⁷ Zellen geimpft werden, damit eine optimale Regeneration von Knorpelgewebe erreicht wird.
• Im allgemeinen ist es erwünscht, daß die gemäß der Erfindung herstellbare Matrixschicht der Membran Glycosaminoglycane (GAGs) enthält, etwa Hyaluronsäure, Chondroitin-6-Sulfat, Keratinsulfat, Dermatansulfat, etc., die dazu dienen, ein natürliches Medium zu schaffen, in dem Chondrozyten eingebettet werden und wachsen können. Zwar ist es möglich, in die Matrix Glycosaminoglycane aus verschiedenen Quellen einzubinden, die nicht notwendigerweise dieselbe Zusammensetzung, das gleiche Molekulargewicht und die gleichen physiologischen Eigenschaften wie solche aus Knorpel haben müssen, doch bevorzugt sind solche Glycosaminoglycane, die direkt aus Knorpel extrahiert werden. Im allgemeinen enthält die Matrixschicht vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-% Glycosaminoglycane, z. B. 2 bis 6 Gew.-%. Obgleich Glycosaminoglycane in gewissem Ausmaß auch in der Barriereschicht vorhanden sein können, wird der größte Teil in der Matrixschicht vorhanden sein.
• Im körpereigenen Collagengeweben treten GAGs, zumindest zum Teil, als eine Komponente von Proteoglycanen (PGs) auf. Die Verwendung von GAGs in der Form von PGs ist unerwünscht im Hinblick auf potentielle immunologische Probleme, die durch den Proteingehalt der PGs verursacht werden können. Bevorzugt ist die Matrixschicht deshalb im wesentlichen frei von irgendwelchen Proteoglycanen. Dies kann zweckmäßig dadurch erreicht werden, daß die Matrixschicht aus einem Gemisch aus einem gereinigten, telopeptidfreien Collagen II Material und Glycosaminoglycanen hergestellt wird.
• Andere Additive, die ebenfalls in der Matrixschicht vorhanden sein können, umfassen z. B. Chondronectin, Laminin, Fibronectin, Kalziumalginat oder Anchorin II zur Unterstützung der Anhaftung der Chondrozyten an den Collagen II Fasern, sowie Wachstumsfaktoren wie etwa knorpelinduzierende Faktoren (CIF), insulinartige Wachstumsfaktoren (IGF), den transformierenden Wachstumsfaktor β (THFβ), der als Homodimere oder Heterodimere vorliegt, und knochenmorphogenetische Faktoren (BMP) wie etwa körpereigenen oder rekombinanten Human-BMP-2, BMP-3 (Osteogenin), BMP-4 und BMP-7 (OP-1, osteogenetisches Protein-1). BMP-2 beeinflußt unabhängig die beiden Pfade der Knochenbildung – die direkte Knochenbildung sowie die Bildung von Knorpel, der dann entfernt und durch Knochen ersetzt wird. Komposite aus BMPs und Collagen, einschließlich Knochenmatrix, die durch Extraktion aus kortikalen Knochen aus verschiedenen Quellen erhalten wird, oder demineralisierter Knochenmatrix bestehen aus 90% Collagen und 10% Nichtcollagen-Proteinen (NCP) für BMP-Aktivität oder für BMP/NCP-induzierte Chondrogenese. Eine in Knochenmatrix unlösliche Collagen-Matrix und Laminin oder Fibronectin wirken als Träger für BMPs. Einige Wachstumsfaktoren können auch in der undurchlässigen Schicht vorhanden sein. Der größere Teil wird jedoch in der Matrixschicht vorhanden sein. Im allgemeinen enthält die Membran 100 μg bis 5 mg Wachstumsfaktoren.
• Mit Vorteil besteht die Barriereschicht aus langen Fasern aus Collagen I und III, die so eng verbunden sind, daß hochmolekulare Substanzen diese Barriere nicht durchdringen können. Die langen Fasern sorgen für eine hohe Zug- und Reißfestigkeit, so daß das Material nicht nur eine gute Trennmembran ist, sondern auch gut genäht werden kann. In der Chirurgie ist es wichtig, daß Membranimplantate in ihrer Position angenäht oder angeheftet werden können, und viele der bisher vorgeschlagenen Membranen haben diese Fähigkeit nicht. Die Membran gemäß der Erfindung ist mechanisch so stabil, daß sie für die Implantation chirurgisch gehandhabt werden kann.
• Die Matrixschicht ist sehr porös und kann ein geringes spezifisches Gewicht von etwa 0,02 haben, was es den Zellen ermöglicht, sehr schnell in diese Schicht einzuwachsen. Diese Schicht der Membran, die normalerweise auch Glycosaminoglycane enthält, quillt stark auf und kann hohe Flüssigkeitsmengen, z. B. 5000%, aufnehmen. Im Idealfall sollte die Matrixschicht eine Porenstruktur (Porenvolumenanteil und Porengröße) haben, die Zelladhäsion und Zellwachstum ermöglicht und es den eingeimpften Zellen erlaubt, den chondrozytischen Phänotyp zu behalten, gekennzeichnet durch Synthese von knorpelspezifischen Proteinen. Die Porengrößen werden vom Gefriertrocknungsprozeß abhängen, der zur Herstellung der Collagen II Matrix ver wendet wird, kann jedoch erwartungsgemäß im Bereich von 10 bis 120 μm, z. B. 20 bis 100 μm liegen. Wahlweise sollte die Porengröße etwa um 85 μm betragen. Eine solche Porengröße kann leicht durch langsames Gefrieren bei –5 bis –10°C in etwa 24 Stunden und anschließendes Gefriertrocknen erhalten werden oder durch Zugabe von Ammoniumbikarbonat zu dem Schlamm vor der Lyophilisierung.
• Die Matrixschicht der Membran wird vorzugsweise durch Collagen II Material gebildet, das aus natürlichem Knorpel erhalten wird, vorzugsweise aus hyalinem Knorpel von Schweinen.
• Die gewünschte Dicke der Matrixschicht hängt von der Art des zu behandelnden Knochen- oder Knorpeldefekts ab, wird jedoch im allgemeinen im Bereich von 2 bis 10 mm, z. B. zwischen 4 und 6 mm liegen. Die Dicke der Barriereschicht beträgt vorzugsweise 0,2 bis 2 mm, z. B. 0,2, bis 0,7 mm.
• Die Barriereschicht wird vorzugsweise durch eine natürliche tierische Membran gebildet, die Collagen I und III enthält. Als Naturprodukt ist diese Membran vollständig im Körper resorbierbar und bildet keine toxischen Abbauprodukte. Solche Membranen haben auch sowohl im feuchten als auch im trockenen Zustand eine besonders hohe Reißfestigkeit und können deshalb erforderlichenfalls chirurgisch genäht werden. Im feuchten Zustand ist das Material sehr elastisch, so daß es über unregelmäßig geformten Knochendefekten gedehnt werden kann.
• Neben Collagen enthalten natürliche tierische Membranen zahlreiche andere Biomaterialien, die entfernt werden müssen. Es ist bekannt, solche Membranen mit Enzymen, Lösungsmitteln oder anderen Chemikalien zu behandeln, um sie zu reinigen und dann in der Medizin einzusetzen. Die meisten Biomaterialien sind zu dünn und sehr oft nicht einfach in der Anwendung. Die Collagenfibrillen haben ihren ursprünglichen Charakter verloren, und weitere Nachteile bestehen darin, daß das Material häufig keine ausreichende Festigkeit für die Verwendung als nähbares Material aufweist, keine Quellungseigenschaften in Wasser besitzt und keinen Unterschied zwischen der glatten Kornseite und der faserigen Fleischseite bietet. Die fibröse Form von gereinigtem telopeptidfreiem Collagen I und III, die weniger löslich und biologisch ab baubar ist, hat sich als die Form herausgestellt, die das vorteilhafteste Barrierematerial bildet.
• Membranen, die zur Bildung der Barriereschicht des gemäß der Erfindung herstellbaren Produkts geeignet sind, umfassen Bauchfellmembranen von Kälbern oder Schweinen, die ihre natürliche Collagenstruktur behalten. Bauchfellmembranen von jungen, 6 bis 7 Wochen alten Schweinen (Gewicht 60–80 kg) sind besonders bevorzugt.
• Die Barriereschicht sollte vorzugsweise reines, natürliches (nicht denaturiertes) unlösliches Collagen enthalten und kann nach dem Verfahren hergestellt werden, das in WO-A-95/18638 beschrieben wird. Die natürliche Membran kann somit zunächst alkalisch behandelt werden, z.B. mit wässrigen NaOH in einer Konzentration von 0,2–4 Gew.-%. Dies dient zur Verseifung etwaiger Fette und auch von Proteinen, die gegenüber Alkalimetallen sensitiv sind. Der zweite Schritt ist die Behandlung des Materials mit einer Säure, üblicherweise einer anorganischen Säure wie etwa HCl. Dies beseitigt säureempfindliche Verunreinigungen. Das Material wird anschließend gewaschen, bis der pH-Wert im Bereich von 2,5–3,5 liegt. Die Membran hat dann eine glatte Seite oder Kornseite und eine lockerere faserige Seite. Es kann zweckmäßig sein, durch Erhitzung auf 100–120°C eine gewisse Quervernetzung der Membran zu bewirken.
• Das Collagen II Material, das zur Bildung der Matrixschicht der Membran dient, kann durch eine ähnliche Prozedur wie die oben in Bezug auf die Barriereschicht, die vorwiegend Collagen I und III enthält, beschriebene aus Knorpel gewonnen werden. Es ist bevorzugt, Wasser durch Behandlung mit Azeton aus dem Knorpel zu entfernen, gefolgt von einer Extraktion von Fett mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel wie etwa n-Hexan, obgleich auch Alkohole wie etwa Ethanol, Ether wie etwa Diethylether, oder chlorierte Kohlenwasserstoffe wie etwa Chloroform oder Gemische hieraus verwendet werden können. Das entfettete Material wird dann einer Alkalibehandlung unterzogen, die etwaige restliche Fette verseift und einige der vorhandenen Proteine abbaut. Schließlich wird das Material mit Säure behandelt, was einen weiteren Proteinabbau bewirkt. Man läßt das Material in Wasser aufquellen und durch eine Kolloidmühle laufen, um einen Schlamm herzustellen.
• Zur Herstellung der Mehrschichtmembran wird der weiche, Collagen II enthaltende Schlamm auf die faserige Seite der glatten Membran aufgetragen, die z.B. gemäß WO-A-95/19638 hergestellt wurde. Normalerweise wird die Membran mit der Kornseite nach unten auf eine glatte Oberfläche aufgelegt, so daß der Schlamm aus Collagen II direkt aufgebracht werden kann, z.B. durch Einreiben in die faserige Seite der Membran. Der Schlamm bildet so eine Schicht mit irgendeiner gewünschten Dicke, die fest an der Collagenmembran haftet. Die so gebildete Doppelschicht wird dann eingefroren und gefriergetrocknet, um die gewünschte schwammförmige Struktur mit einer gewünschten Porengröße zu bilden. Erforderlichenfalls kann ein Teil der Matrixschicht entfernt werden, um eine Doppelmembran mit gleichförmiger Dicke zu schaffen. Zur Bildung einer dreischichtigen Membran wird dann eine zweite glatte Membran so auf die Oberfläche der Matrixschicht aufgelegt, daß ihre faserige Seite mit der Matrixschicht in Kontakt kommt.
• Der auf die Membran aufzutragende Schlamm aus Collagen II enthält im allgemeinen 1,0–4,0 Gew.-% des Collagens, vorteilhafterweise 2–3 Gew.-%. Zweckmäßig sollte der pH-Wert dieses Gemisches auf 2,5–4,5, vorzugsweise 3,0–4,0 eingestellt werden.
• Mit Vorteil kann das Collagen II Material nach dem Gefriertrocknungsschritt quervernetzt werden, um die Matrixschicht zu stabilisieren. Dies dient auch zur Erhöhung der mechanischen Festigkeit der Matrixschicht und zur Verringerung ihrer Resorptionsrate in Körper. Im Idealfall sollte der Grad der Quervernetzung so sein, daß die Abbaurate der Matrix an die Rate der Geweberegeneration angepaßt ist. Physikalisch kann die Quervernetzung durch Erhitzung geschehen, doch muß dies vorsichtig erfolgen, damit ein unerwünschter Verlust der Resorbierbarkeit vermieden wird. Erhitzen auf Temperaturen von 100–120°C für einen Zeitraum von 30 Minuten bis zu 5 Stunden ist bevorzugt. Besonders bevorzugt kann die Quervernetzung durch UV-Bestrahlung mit einer UV-Lampe erfolgen, z.B. für einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden. Das Collagen II Material enthält vorteilhafterweise Glycosaminoglycane. Die letzteren reagieren nämlich mit dem Collagen II, um eine gewisse Quervernetzung zu bewirken, und ergeben ein unlösliches Produkt. Erforderlichenfalls kann eine weitere Quervernetzung durch Erhitzen des Materials oder durch UV-Bestrahlung bewirkt werden, wie oben erörtert wurde. Die Reaktion zwischen den Glycosaminoglycanen und dem Collagen kann bei Umgebungstem peraturen und bei einem pH-Wert im Bereich von 2,5–3,5 erfolgen. Die Menge an Glycosaminoglycan kann zwischen 1 und 10 Gew.-% betragen. Unmittelbar nach einer solchen Behandlung kann das Material gefroren und gefriergetrocknet werden.
• Alternativ kann die Bildung des Schlammes unter Erhöhung des pH-Wertes der Collagen II Masse erfolgen. Bei dieser Prozedur wird die Masse auf etwa 4°C gekühlt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von kaltem wässrigen NaOH bei 4°C langsam auf einen pH-Wert von 6,5–7,5 erhöht. Anschließend wird die Masse 15–25 Stunden lang auf Umgebungstemperatur gehalten. Während dieser Zeit bildet sich der Schlamm, und nach der Bildung des Schlammes kann die Masse gefroren und gefriergetrocknet werden.
• Noch eine weitere Alternative besteht darin, die Collagen II Masse nach dem Entfernen von Luft auf einen pH-Wert von 6,8–7,4 zu neutralisieren. Das Gemisch wird in die Form gegeben und 15–20 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Es entsteht ein feiner Schlamm, der anschließend gefroren und gefriergetrocknet werden kann.
• Welches der drei oben genannten Verfahren angewandt wird, ist von den Eigenschaften des gewünschten Produkts abhängig. Das erste Verfahren ergibt das stabilste Produkt. Die Ausfällung kann jedoch zu Materialklumpen führen und muß sehr sorgfältig vorgenommen werden. Das zweite Verfahren ergibt ein weiches und gleichförmiges Produkt, das jedoch löslicher ist als das aus dem ersten Verfahren erhaltene Produkt.
• Bei der Herstellung des Schlammes ist es möglich, zusätzlich weitere erwünschte Substanzen einzubringen, etwa Medikamente, z.B. antibakterielle Substanzen wie etwa Taurolidin oder Antibiotika wie etwa Gentamyzin.
• Nach dem Auftragen des Schlammes auf die Barriereschicht wird das Material gefroren. Um eine reproduzierbare Porengröße zu erhalten, muß das Gefrieren sorgfältig kontrolliert werden, und die Gefrierrate und -zeit, der pH-Wert und die Partikelgröße müssen präzise gesteuert werden. Um sehr kleine Poren zu erhalten, kann das Material bei sehr niedriger Temperatur schockgefroren werden.
• Die gefrorene Membran wird dann gefriergetrocknet und anschließend auf 110–130°C erhitzt. Auf diese Weise wird eine gewisse Quervernetzung bewirkt. Anschließend kann die gefriergetrocknete Biomembran auf die geforderte Dicke eingestellt werden, so daß die Dicke der Matrixschicht gewöhnlich etwa 2 mm beträgt. Die zweischichtige Membran wird dann sterilisiert, z.B. durch Gamma-Bestrahlung oder mit Ethylenoxid. Sterilisation durch starke Bestrahlung, z.B. mit ⁶⁰Co in Dosen von 25 kGy kann die BMPs deaktivieren. Unter solchen Umständen kann die sterile Matrix vor der Implantation in steriler Sole mit BMPs imprägniert werden.
• Die gemäß der Erfindung herstellbare Membran kann auf folgende Weisen in der Medizin eingesetzt werden:
  Als ein Material für gelenkte Geweberegeneration. Das Zellwachstum wird durch die Matrixschicht gefördert, während die Barriereschicht unerwünschtes Zellwachstum verhindert. Der Gehalt der Membran an Collagen II ist besonders geeignet für die Regeneration von Knorpelgewebe, ist jedoch auch für andere Gewebetypen geeignet.
• Als ein Material zur Reparatur von Knorpeldefekten, d.h., Läsionen, die nicht in die subchondrale Platte eindringen, und bei der Reparatur von osteochondralen Defekten.
• Unter einem anderen Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung einer Mehrschichtmembran, die in der oben beschriebenen Weise herstellbar ist, bei der Herstellung eines Implantats für gelenkte Geweberegeneration vor.
• Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich zu Illustrationszwecken. In den Beispielen müssen alle Schritte unter aseptischen Bedingungen ausgeführt werden, z.B. in Reinräumen.
• Beispiel 1
• (A) Bauchfellmembranen von jungen Kälbern werden auf mechanischem Wege vollständig von Fleisch und Fett befreit, unter laufendem Wasser gewaschen und 12 Stunden lang mit 2% NaOH-Lösung behandelt. Die Membranen werden dann unter laufendem Wasser gewaschen und mit 0,5% HCl angesäu ert. Nachdem das Material auf seiner gesamten Dicke angesäuert worden ist (etwa 3 Stunden), wird es gewaschen, bis man einen pH-Wert von 3,5 erhält. Das Material wird dann mit 7% Salzlösung geschrumpft, mit 1% NaHCO₃-Lösung neutralisiert und unter laufendem Wasser gewaschen. Das Material wird dann mit Azeton dehydriert und mit n-Hexan entfettet.
• (B) Gefrorener Knorpel aus frisch geschlachteten Schweinen wurde in kaltes Wasser eingetaucht, gründlich durchgewaschen und mechanisch von Fleischresten, Knochen und harten Teilen gesäubert. Anschließend wurde das Material 30 Minuten lang unter fließendem Wasser gewaschen.
• Anschließend wurde das Material dreimal in einem Homogenisierer gemahlen. Die optische Partikelgröße am Ende der Größenreduktion betrug etwa 8 mm.
• Die Knorpelstücke wurden durch viermaliges Waschen mit Azeton, jeweils für 8 Stunden, entwässert. Der Knorpel wurde dann durch viermalige Extraktion mit n-Hexan entfettet. Jede Behandlung dauerte wenigstens 8 Stunden. Das Verhältnis von Hexan zu Knorpel betrug 1:10.
• Nach dem Entfetten wurde der Knorpel in Trinkwasser quellen gelassen. Das Verhältnis Wasser:Material betrug 10:1. Die Behandlungszeit betrug 24 Stunden.
• Das Material wurde dann mit NaOH (5 Gew.-%) behandelt, wobei das Verhältnis von Knorpel zu Flüssigkeit 1:4 betrug und die Behandlungszeit 32 Stunden betrug. Während der Behandlung wurden die Knorpelstücke gut gerührt. Anschließend wurde das Alkali vom Knorpel abgewaschen. Der ursprüngliche pH-Wert von 14 wurde dadurch auf 9–11 verringert. Die gelösten Verunreinigungen wurden ausgewaschen und vom Knorpel getrennt. Die aus der Alkalibehandlung erhaltene Flüssigkeit wurde zur Rückgewinnung von Glycosaminoglycan gesammelt.
• Das Collagenmaterial wurde dann mit starker Salzsäure (etwa 3 Gew.-%) behandelt, anfangs mit einem pH-Wert unter 1,0. Die Behandlungszeit betrug 4– 6 Stunden.
• Anschließend wurde das Material mit kaltem Wasser so lange gewaschen, daß der pH-Wert auf 3–3,5 ansteigen konnte. Alle Verunreinigungen wurden entfernt, und das Produkt war eine salzfreie Collagenmasse, geeignet für die Herstellung eines Schwamms oder eines anderen Collagenmaterials. Zu diesem Zweck kann die Knorpelmasse je nach beabsichtigtem Ergebnis entgast, gefroren und gefriergetrocknet werden.
• Der aus der obigen Alkalibehandlung resultierende Extrakt enthielt Glykosaminoglycan, Alkali, denaturierte Proteine und Salze. Der Extrakt wurde zunächst mit HCl neutralisiert, wobei der pH-Wert nach der Neutralisation 6 betrug. Der Extrakt wurde dann mit einem Filterhilfsstoff behandelt, nämlich mit Kieselgur, wodurch die denaturierten Proteine entfernt wurden. Zu dem Extrakt wurden 0,5 Gew.-% Kieselgur zugegeben und durch Filtration zusammen mit dem denaturierten Protein entfernt.
• Der Überstand wurde dann einer Ultrafiltration unterzogen, mit einer Membran mit einer Molekulargewichtsgrenze von etwa 10000 Dalton. Auf Weise wurden Salze entfernt, so daß gereinigtes Glycosaminoglycan zurückblieb.
• Die so erhaltene Lösung von Glycosaminoglycan wurde zu Collagenmaterial aus dem obigen Prozeß zugemischt, um eine Collagen II Matrix zu bilden, die Glycosaminoglycan enthielt.
• Die Masse aus Collagen II hatte die folgenden Eigenschaften:
  TG = 2,8 Gew.-%
  GAG = 3 Gew.-% (berechnet auf der Basis von Collagen)
  pH-Wert 3,5
• (C) Die auf die in (A) beschriebene Weise frisch zubereitete Bauchfellmembran wurde gleichförmig in Wasser eingeweicht und flach mit der faserigen Seite nach oben auf eine Glasplatte gelegt. Anschließend wurde die Membran gründlich mit der in dem obigen Prozeß (B) hergestellten Collagen II Masse befeuchtet. Die Membran wurde in allen Richtungen flach ausgespannt, so daß sie an der Platte haften blieb. Die Masse aus Collagen II wurde dadurch in die Membran eingerieben.
• Die sehr dicke Masse wurde dann auf die Membran aufgetragen, und die Platte wurde über Nacht in einem Kühlschrank bei etwa 4°C stehen gelassen. In dieser Zeit wurde ein Schlamm gebildet.
• Der Schlamm wurde unter den folgenden Bedingungen gefroren:
  Temperatur des Bades = –12°C
  Zeit = 40 Minuten
• Anschließend wurde der gefrorene Schlamm gefriergetrocknet und dann auf 125°C erwärmt.
  Gefriertrocknungszeit = 14 Stunden
• Die Matrixschicht aus Collagen II wurde anschließend auf eine Dicke von 1 mm gespalten.
• Beispiel 2
• Die frisch zubereitete Bauchfellmembran aus Beispiel 1(A) wurde auf eine Glasplatte aufgelegt, und die dicke Masse aus Collagen II mit den Eigenschaften wie in Beispiel 1 wurde in die Membran eingerieben. 50 g der Masse aus Collagen II wurden in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst und gründlich gerührt. Während des Rührens wurden 100 ml Glycosaminoglycan-Lösung langsam zugegeben. Collagen wurde in der Form einer Masse zusammen mit GAG ausgefällt. Nach der Ausfällung wurde die Masse homogenisiert, und die so erhaltene Dispersion wurde auf die Membran aufgetragen. Über Nacht bildete sich ein Schlamm, und die behandelte Membran wurde weiterverarbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung einer Mehrschichtmembran, die geeignet ist zur Verwendung in vivo bei der Herstellung von Knochen- oder Knorpelgewebe, welche Membran aufweist: (i) eine Matrixschicht, die vorwiegend aus Collagen II besteht und eine offene, schwammartige Textur hat, und (ii) wenigstens eine Barriereschicht, die eine geschlossene, relativ undurchlässige Textur hat und vorwiegend aus Collagen I und III hergestellt ist, wobei das Verfahren das Auftragen eines Schlammes aus Collagen II auf eine Oberfläche einer Barriereschicht, wie oben definiert, umfaßt, gefolgt von Gefriertrocknung, um dadurch die Matrixschicht aus Collagen II mit einer offenen, schwammartigen Struktur zu schaffen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Collagen II Material aus natürlichem Knorpel gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Collagen II Material aus hyalinem Knorpel von Schweinen gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, mit physikalischer Quervernetzung des Collagen II Materials durch Erhitzung oder UV-Bestrahlung.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Barriereschicht oder die Barriereschichten aus Bauchfellmembran von Kälbern oder Schweinen gewonnen werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mit Imprägnieren der Matrixschicht mit Chondrozyten, die aus Gelenkknorpeln, Knochenhaut, Herzbeutel (Periocardium) oder mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark isoliert sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, mit Imprägnieren der Matrixschicht und/oder der Barriereschicht oder -schichten mit Glykosaminoglykan.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Glykosaminoglykan Hyaluronsäure, Chondritin-6-Sulfat, Keratinsulfat oder Dermatansulfat ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Matrixschicht und die Barriereschicht oder -schichten im wesentlichen frei von Proteoglykanen sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Matrix- und/oder Barriereschichten außerdem Chondronectin, Laminin, Fibronectin, Kalziumalginat, Anchorin II, Wachstumsfaktoren oder knochenmorphogenetische Faktoren enthalten.
11. Mehrschichtmembran, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Verwendung einer Membran nach Anspruch 11 bei der Herstellung eines Implantats für gelenkte Geweberegeneration.