DE69812100T2

DE69812100T2 - Adenosin enthaltendes arzneimittel

Info

Publication number: DE69812100T2
Application number: DE69812100T
Authority: DE
Inventors: Ilan Cohn; Pnina Fishman
Original assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Current assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2018-07-11
Also published as: AU8239298A; JP2001509479A; DE69812100D1; WO1999002143A3; IL121272A; EP0994702B1; WO1999002143A2; EP0994702A2; IL121272A0; ATE234082T1; US6911435B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Medikamente zur Verwendung in der Therapie des Menschen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Verwendungen von Adenosin.

STAND DER TECHNIK

Die folgende ist eine Auflistung von Dokumenten des Standes der Technik, die als für die Erfindung relevanter Hintergrund erachtet werden:
1. Daly J. W., Adenosine receptors: Targets for future drugs. J. Med. Chem., 25: 197-207, 1982.
2. Stiles, G. L., Adenosine receptors and beyond: Molecular mechanisms of physiological regulation, Clin. Res., 38: 10-18, 1990.
3. Collis, M. G., The vasodilator role of adenosine, Pharmacol. Ther., 41: 143-162, 1989.
4. Klabunde, R. E., Dipyridamole inhibition of adenosine metabolism in human, blood, European J. Pharmacol., 93: 21-26, 1983
5. Berne, R. M., The Role of adenosine in the regulation of coronary blood flow, Circ. Res., 47: 807, 1980.
6. Dobson, J. G., Jr., Mechanism of adenosine inhibition of catecholamine-induced responses in heart, Circ. Res., 52: 151, 1983.
7. Soderback, U., Sollevi, A., Wallen, V. H., Larsson, P. T., and Hjemdahl, P., Antiaggregatory effects of physiological concentrations of adenosine in human whole blood as assessed by filtragometry, Clin. Sci., 81: 691-694, 1991.
8. Paul, P., Rothmann, S. A., and Meagher, R. C., Modulation of erythropoietin production by adenosine, J. Lab. Clin. Med., 112: 168-173, 1988.
9. Elgler, A., Greten, T. F., Sinha, B., Haslberger, D. Sullivan, G. W. and Endres, S., Endogenous adenosine curtails lipopolysaccharide-stimulated tumor necrosis factor synthesis, Scand. J. Immunol., 45: 132-139, 1997.
10. Bouma, M. G., Stad, R. D., van den Wildenberg, F. A. J. M., and Buurman, W. A., Differential regulatory effects of adenosine an cytokine release by activated human monocytes, The J. of Immunol., 153: 4159-4168, 1994.
11. Pospisil, M., Hofer, M., Netikova, J., Pipalova, I., Vacek, A., Bartonickova, A., and Volenec, K., Elevation of extracellular adenosine induces radioprotective effects in mice., Radiation Research, 134: 323-330, 1993.
12. Bajaj, S., Insel. J., Quagliata, F., Hirschhorn, R. and Silber. R., Adenosine and adenosine analogues are more toxic to chronic lymphocytic leukemia than to normal lymphocytes, Blood, 62: 75-80, 1983.
13. Tey, H. B., Khoo, H. E., and Tan, C. H., adenosine modulates cell growth in human epidermoid carcinoma (A431) cells, Biochem. & Biophysic. Res. Communications., 187: 1486-1492, 1992.
14. Rapaport, E., Experimental cancer therapy in mice by adenine nucleotides, Eur. J. Cancer Oncol, 24: 1491-1497, 1988.
15. Rapaport, E., J. Fontaine, Anticancer activities of adenine nucleotides in mice are mediated through expansion of erythrocyte ATP pools, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1662-166, 1989.
16. Weisman, G. A., De, B. K., Pritchard, R. S., and Heppel, L. A., Cellular responses to external ATP which precede an increase in nucleotide permeability in transformed cells, J. of Cellular. Physiol., 119: 211-219, 1984.
17. Heppel, L. A., Weisman, G. A., Friedberg, I., Permeabilization of transformed cells in culture by external ATP., Membrane Biology, 86: 189-196, 1985.
18. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A. and Buell, G., The cytolytic P2z receptor for extracellular ATP identified as a P3x receptor (P2X&sub7;), Science, 272: 735-738, 1996.
19. Jackson, R. C. Ross, D. A., Harkrader, R. J., Epstein, J., Biochemical approaches to enthancement of antitumor drug selectivity: selective protection of cells from 6- thioguanine and 6-mercaptopurine by adenosine, Cancer Treatment Reports, 64: 1347-1353, 1980.
20. Gentile, P., Epremian B. E., Approaches to ablating the myelotoxicity of chemotherapy. CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 7: 71-87, 1987.
21. Epstein, J., Preisler, H. D., Protection of normal hematopoietic stem cells from the toxicity of purine base analogs: in vivo application. Cancer Treatment Reports, 68: 1153-1156, 1984.
22. Pines, M., Ashkenazi, A., Cohen-Shapnik, N. Binder, L. and Gertler, A., Inhibition of the proliferation of Nb2 cells by femtomolar concentrations of cholera toxin and partial reversal of the effects by 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate, J. of Cellular Biochem., 37: 119-129, 1988.
Die Anerkennung dieser Dokumente wird hierin durch das Anzeigen von deren Nummer aus der oben genannten Liste in Klammern erfolgen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Adenosin ist ein Purinnukleosid, von dem bekannt ist, dass es extrazellulär wirkt, um verschiedene physiologische Prozesse durch seine Bindung an spezifische Zelloberllächenrezeptoren (A1- und A2-Rezeptoren)(1,2,3) zu regulieren. Die Tatsache, dass Adenosin eine extrazelluläre Wirkung ausübt, wurde beispielsweise durch eine erhöhte Wirkung von Adenosin auf Zellen gezeigt, wenn diese zusammen mit Dipyridamol gegeben werden, welches die Aufnahme von Adenosin durch Zellen hemmt(4).
Von Adenosin ist bekannt, dass es den Herzrhythmus beeinflusst und entsprechend wurde es klinisch verwendet, um das Myokardium in verschiedenen pathologischen Situationen zu schützen(5,6). Zusätzlich ist von Adenosin bekannt, dass es sowohl eine vasokonstriktorische Wirkung auf die Niere wie auch eine vasodilatorische Wirkung in anderen vaskulären Geweben aufweist. Von Adenosin ist auch bekannt, dass es eine Wirkung auf Blutzellen hat einschließlich: der Hemmung der Plättchenaggregation(7); der Stimulation der roten Blutzellhematopoese durch die Herstellung von Erythropoietin(8); das Ausüben einer entzündungshemmenden Wirkung, die sich durch Hemmung entzündlicher Cytokine(9,10) manifestiert; und die Verringerung eines septischen Schocks. Für Adenosin wurde auch gezeigt, dass es eine radioprotektive Wirkung aufweist, wenn es einige wenige Minuten (ungefähr 15 Min.) vor der radiotherapeutischen Behandlung verabreicht wird(11).
Von Adenosin ist auch bekannt, dass es eine antiproliferative Wirkung auf Krebszellen ausübt. Bajaj et al., 1983(12) stellten fest, dass Adenosin und Adenosinanaloga eine toxische Wirkung auf lymphozytische Leukämiezellen aufweisen, die noch deutlicher ausviel als die toxische Wirkung auf normale Lymphozyten. Des Weiteren zeigten Tey et al., 1992(13), dass Adenosin eine Wirkung bei der Modulation des Zellwachstums in menschlichen epidermalen Karzinomzellen ausübt. Zusätzlich wurde in der Literatur festgestellt (14), dass parenteral verabreichte Adeninnukleotide (AMP, ADP und ATP) die Tumorentwicklung in Mäusen hemmen(15). Von ATP wurde berichtet, dass es die Durchlässigkeit transformierter Zellen erhöht(16,17), allerdings sollte zur Kenntnis genommen werden, dass ATP seine Wirkung durch die zellulären Rezeptoren P2X, P2Y und P2Z(18) ausübt, welche sich von denen der A1- und A2-Rezeptoren unterscheiden, durch welche Adenosin seine regulatorische Wirkung ausübt.
Weiße Blutzeilen (Leukozyten) bestehen aus drei Hauptgruppen von Zellen: Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten. Viele therapeutische medikamentöse Behandlungen haben unerwünschte Nebenwirkungen, die sich in der Verringerung von Leukozyten manifestieren und insbesondere in der Verringerung der Zahl und des relativen Anteils von Granulozyten (welche typischerweise 70% der weißen Blutzellen ausmachen) und insbesondere von Neutrophilen, welche typischerweise mehr als mehr als 90% der Granulozyten ausmachen. Beispiele von Medikamenten, welche eine Verringerung in der Zahl von Leukozyten bewirken und insbesondere Neutrophilen sind zytotoxische Medikamente, z. B. solche, die in der Krebschemotherapie verwendet werden, neuroleptische Medikamente und andere. Die Wirkung der Verringerung in der Zahl der weißen Blutzellen wird auf dem Fachgebiet normalerweise als "Leukopenie" bezeichnet und die Verringerung der Anzahl von Neutrophilen als "Neutropenie". Eine hauptsächliche negative Auswirkung der Leukopenie und insbesondere der Neutropenie ist eine Erhöhung in der Anfälligkeit von Individuen auf opportunistische infektiöse Krankheiten. In vielen Fällen, insbesondere in der Krebschemotherapie, sterben die Patienten oft an solchen opportunistischen infektiösen Krankheiten (z. B. durch Lungeninfektion) und nicht durch deren primäre Krankheit, d. h. Krebs. Medikamente, welche gegen die unerwünschte toxische Nebenwirkung von Leukopenie und insbesondere Neutropenie schützen können oder diese hemmen, wären somit höchst wünschenswert. Jackson et al.(19), wie rückblickend beschrieben durch Gentile et al.(20), zeigten, dass die toxische Wirkung von zwei Purinanaloga (6-Thioguanin und 6-Mercaptopurin) auf Lymphoblasten und Fibroblasten durch Adenosin gehemmt werden kann. Es wurde postuliert, dass diese Wirkung in Hinblick auf die Hemmung der Herstellung von Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) durch Adenosin stattfindet. Jackson et al. weisen in der Schlußfolgerung ihrer Studie auf die Möglichkeit der Entwicklung zytotoxischer Medikamente mit einer höheren Selektivität für Krebszellen, basierend auf den unterschiedlichen Enzymmustern zwischen Tumor und normalen Zellen, hin. Es wird betont, dass die Arbeit von Jackson et al. nur in vitro durchgeführt wurde und als Adenosin in in vivo ausprobiert wurde, wurde von Epstein et al.(21) gezeigt, dass in vivo Schutz gegenüber einer toxischen Wirkung von Purinanaloga mit Adenosinmengen von ungefähr 500 mg/kg Körpergewicht erzielt werden kann. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass bei solchen Riesendosierungen Adenosin wahrscheinlich toxisch ist und selbst eine Reihe von Nebenwirkungen aufweist.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verwendung von Adenosin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Leukopenie in einem Individuum, wobei nicht mehr als 50 mg Adenosin pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass Adenosin eine Wirkung bezüglich der Induktion der Proliferation von Knochenmarkszellen aufweist, was in einer Erhöhung in der Anzahl von Leukozyten und insbesondere von Neutrophilen in peripherem Blut resultiert. Es wurde des Weiteren gemäß der Erfindung festgestellt, dass Adenosin eine schützende Wirkung gegen einige toxische Wirkungen chemotherapeutischer Medikamente aufweist, insbesondere Schutz gegen die Verringerung in der Anzahl von Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, welche ansonsten durch das chemotherapeutische Medikament verursacht wird. Zusätzlich wurde gemäß der Erfindung festgestellt, dass Adenosin die spezifische Antitumorwirkung chemotherapeutischer Medikamente verstärkt.
In in vivo Studien an experimentellen Tieren wurde gezeigt, dass die Gesamtwirkung von Adenosin, wenn dieses zusammen mit einem chemotherapeutischen Medikament verabreicht wird, den therapeutischen Index erhöht, nämlich die toxischen Nebenwirkungen reduziert und die spezifische Aktivität verbessert. Im Folgenden wird der Begriff "Erhöhen des therapeutischen Index" verwendet werden, um entweder eine Verbesserung der therapeutischen Wirkung eines Medikaments auszudrücken, nämlich die Erhöhung seiner Wirksamkeit auf eine spezifische Zielzelle oder die Verringerung unerwünschter toxischer Nebenwirkungen, die sich auf Zellen, die keine Zielzellen sind oder beide manifestieren.
Im Folgenden wird der Begriff "Zielzellen" verwendet, um das Ziel des besagten Medikaments zu bezeichnen; der Begriff "Nicht-Zielzellen" wird verwendet werden, um Zellen zu bezeichnen, die keine Zielzellen sind, auf die das Medikament eine zytotoxische Nebenwirkung ausübt.
Der Begriff "antikrebs-chemotherapeutisches Medikament" wird verwendet, um ein zytotoxisches Medikament oder einen Cocktail, der eine Kombination von zwei oder mehr zytotoxischen Medikamenten umfasst, die einem Individuum zum Zweck der Verringerung der Tumormasse des Patienten gegeben werden, zu bezeichnen.
Wie bereits bekannt, kann extrazelluläres Adenosin an einer Reihe von Rezeptoren auf der Zellemembran binden, einschließlich, unter anderem, die A1- und die A2-Rezeptoren. Des Weiteren enthalten Zellmembranen typischerweise Transporter, welche Adenosin (sowie andere Nukleoside) in und aus der Zelle transportieren können. Des Weiteren gibt es in dem extrazellulären Medium, das die Zellen umgibt sowie innerhalb dieser Zeilen eine Reihe von Enzyme, die Adenosin metabolisieren können. Die Wirkung von extrazellulär verabreichtem Adenosin auf Zellen ist eine Kombination dieser drei unterschiedlichen Mechanismen (nämlich der Bindung an Rezeptoren, der Transport durch Nukleosidtranporter und der Abbau durch Enzyme). Es wurde gemäß der Erfindung festgestellt, dass Adenosin seine differenzierte Wirkung auf Knochenmarkszellen auf der einen Seite und Krebszellen auf der anderen Seite durch die Wechselwirkung über diese Mechanismen (unterschiedliche im jeweiligen Fall) ausübt. Im Folgenden wird die Erfindung mit Bezug auf Adenosin beschrieben.
Zudem, wie weiter unten erläutert wird, weist die Erfindung mehrere unterschiedliche Aspekte auf. Ein Aspekt betrifft die Induktion der Proliferation von Knochenmarkszellen. Ein anderer Aspekt betrifft die Hemmung der Proliferation von Tumorzellen. Ein dritter Aspekt betrifft die Erhöhung der Wirksamkeit einiger Medikamente, insbesondere chemotherapeutischer Medikamente auf Zielzellen, insbesondere Krebszellen. Ein vierter Aspekt betrifft die Erhöhung des therapeutischen Indexes von bestimmten Medikamenten, insbesondere von chemotherapeutischen und neuroleptischen Medikamenten, durch entweder die Erhöhung von deren spezifischer Wirkung auf die Zielzelle, durch die Verringerung ihrer toxischen Nebenwirkungen bezüglich der Verringerung der Anzahl von weißen Blutzellen oder beides.
Viele Medikamente üben zytotoxische Nebenwirkungen auf eine Reihe von Zellen aus, insbesondere auf metabolisch aktive und sich teilende Zellen. Diese schließen hematopoetische Zellen wie Knochenmarkszellen, Leukozyten, insbesondere Neutrophile sowie Fibroblasten, Zellen des Verdauungstrakts und andere ein. Im Folgenden wird eine Verringerung der Anzahl von Leukozyten oder der Anzahl von Neutrophilen durch zytotoxische Medikamente hierin gelegentlich jeweils als "Medikament-induzierte Leukopenie" oder "Medikament-induzierte Neutropenie" bezeichnet.
Im Folgendem ist zu verstehen, dass jedes Mal, wenn "Leukopenie" erwähnt wird, dieses sich insbesondere auf "Neutropenie" bezieht (Eine Medikament-induzierte Leukopenie manifestiert sich primär in der Verringerung der Menge an Neutrophilen.).
Adenosin kann gemäß einem Aspekt der Erfindung verwendet werden, um die Proliferation von Knochenmarkszellen zu induzieren. Dieser Aspekt der Erfindung ist in einer Reihe klinischer Situationen anwendbar. Zum Beispiel kann Adenosin zur Behandlung von Patienten verwendet werden, die eine Krankheit oder Erkrankung aufweisen, die bewirkt wird durch oder assoziiert ist mit einer Schwächung des Immunsystems, z. B. im Falle von vererbter oder angenommener Immunschwäche. Zudem sind bestimmte Audioimmunkrankheiten mit einer Gesamtabschwächung des Immunsystems assoziiert und besagte aktive Inhaltsstoffe können dann auch verwendet werden. Eine andere Situation eines geschwächten Immunsystems, die gemäß diesem Aspekt der Erfindung behandelt werden kann, ist eine solche, die oft in späteren Stadien von Krebs vorkommt. Dieser Aspekt der Erfindung ist auch nützlich in der Therapie im Falle von Leukopenie und insbesondere von Neutropenie, die als Ergebnis der Verabreichung eines chemotherapeutischen Medikaments oder neuroleptischen Medikaments vorkommen. Die Wirkung von Adenosin wirkt der Medikament-induzierten Leukopenie entgegen und kann sich durch eine reduzierte Verringerung in der Menge (oder Zahl) der Leukozyten im Vergleich zu der Zahl ohne Adenosin manifestieren oder manchmal sogar durch eine Erhöhung in der Anzahl von Zellen sogar über die Kontrollmengen hinaus.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird Adenosin verwendet, um die Proliferation von Tumorzellen im Rahmen einer Antikrebstherapie zu hemmen.
Des Weiteren kann Adenosin gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung verwendet werden, um die Wirksamkeit zytotoxischer Medikamente gegen bestimmte Zielzellen, insbesondere antikrebs-therapeutischer Medikamente gegen Krebszellen, zu erhöhen. Diese Erhöhung der Wirksamkeit kann sich durch eine stärkere Zerstörung von Tumorzellen bei einer gegebenen Dosis des Medikaments oder durch eine Verringerung der benötigten Dosis des Medikaments, das benötigt wird, um eine bestimmte therapeutische Wirkung zu erzielen, manifestieren.
In einem weiteren seiner Aspekte wird Adenosin verwendet, um den therapeutischen Index bestimmter therapeutischer Medikamente zu verbessern, insbesondere das Verhältnis zwischen einer spezifischen therapeutischen Wirkung des chemotherapeutischen Medikaments oder neuroleptischen Medikaments auf seine jeweilige Zielzelle im Vergleich zu den toxischen Nebenwirkungen dieser Medikamente, die sich als Leukopenie manifestieren. Mit anderen Worten, das Adenosin kann entweder zu einer Erhöhung der Wirksamkeit eines Medikaments führen, was die Fähigkeit bedeuten kann, eine geringere Dosierung zu verwenden, die Behandlungsdauer zu verringern, etc., zur Verringerung der vorgenannten toxischen Nebenwirkung, oder zu beidem führen kann. Der aktive Inhaltsstoff gemäß diesem Aspekt kann in Kombination mit dem therapeutischen Medikament verabreicht werden, z. B. kann er zusammen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit besagtem therapeutischen Medikament enthalten sein.
Die vorliegende Erfindung stellt für jeden der vorgenannten Aspekte ein Medikament zur therapeutischen Behandlung zur Verfügung, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des entsprechenden wirksamen Inhaltsstoffes an ein Individuum, das dessen bedarf, umfasst. Des Weiteren wird für jeden der Aspekte der Erfindung die Verwendung des wirksamen Inhaltsstoffs zum Zwecke der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die therapeutischen Behandlungen von Krankheiten oder Krankheitszuständen zur Verfügung gestellt, welche im Umfang verschiedener Aspekte der Erfindung, wie oben festgehalten, vorliegen. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung für jeden dieser Aspekte eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung einer Reihe von Krankheitszuständen, Krankheiten oder Erkrankungen zur Verfügung, welche im Umfang der oben genannten Aspekte liegen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge von besagtem wirksamen Inhaltsstoff umfasst.
Der Begriff "wirksame Menge", wie oben und unten verwendet, sollte dahingehend verstanden werden, dass er eine Menge an Adenosin bedeutet, welche in der Lage ist, eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen. Die gewünschte therapeutische Wirkung hängt von der Art und dem Modus der Behandlung ab. Wenn beispielsweise besagter aktiver Inhaltsstoff verabreicht werden soll, um eine Medikament-induzierte Leukopenie zu unterbinden, kann eine wirksame Menge des aktiven Inhaltsstoffs eine Menge sein, welche das Individuum gegen die Medikament-induzierte Verringerung der Anzahl an Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, schützt; eine Menge des wirksamen Inhaltsstoffes, welche zu einer Erhöhung in einer bereits verringerten Menge solcher Zellen führt, z. B. die Menge auf eine normale Menge oder manchmal sogar darüber wieder herstellt, etc. Wenn der wirksame Inhaltsstoff zu verabreichen ist, um die Wirkung eines antikrebs-chemotherapeutischen Medikaments zu verstärken, kann die wirksame Menge eine solche Menge sein, welche entweder die krebsspezifische Toxizität der chemotherapeutischen Behandlung erhöht; eine Menge, welche wirksam ist in der Verringerung der Menge des chemotherapeutischen Medikaments oder der Medikamentenkombination, die notwendig ist, um eine gewünschte Wirkung des chemotherapeutischen Medikaments oder der Medikamentenkombination zu erzielen, d. h., die Verringerung der Tumorbelastung; etc. Ein Beispiel einer wirksamen Menge ist eine tägliche Menge an Adenosin von mehr als ungefähr 10 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise mindestens ungefähr 25 ug/kg Körpergewicht; und unter ungefähr 50 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise unter ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht, und am meisten bevorzugt unterhalb ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht. Typischerweise liegt die zu verabreichende Adenosinmenge in dem Bereich von 30-100 ug/kg Körpergewicht. Solch eine Adenosinmenge wird typischerweise in einer einzelnen Tagesdosis verabreicht, obwohl manchmal eine Tagesdosis in mehrere Dosen unterteilt werden kann, die über den Tag verabreicht werden, oder manchmal können verschiedene Tagesdosen in einer Einzeldosis kombiniert werden, die dem Patienten einmal alle paar Tage verabreicht wird, insbesondere, wenn diese in einer verzögerten Freisetzungsformulierung verabreicht wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zusammensetzung, insbesondere, wenn der aktive Inhaltsstoff Adenosin ist, eine orale Zusammensetzung. Solch eine Zusammensetzung kann als Flüssigkeit, z. B. ein Sirup, zur Verfügung gestellt werden; sie kann als Pulver oder Lyophilisat zur Vermischung mit einer geschmacklich annehmbaren Flüssigkeit vor der Verabreichung vermischt werden; sie kann in einer Dosierungsform zur Verfügung gestellt werden, z. B. in Form einer Kapsel oder Pille, etc.
In einer anderen Ausführungsform wird die Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung (intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung) formuliert. Eine Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform kann als fertig verwendbare Flüssigkeitsmischung zur Verfügung gestellt werden oder kann als Pulver oder Lyophilisat zum Vermischen mit Salzlösung oder jeder anderen physiologischen Flüssigkeit vor der Verwendung zur Verfügung gestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Adenosinzusammensetzung als inhalierbare Zusammensetzung in der Form eines Sprays oder Aerosols zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung in Form eines Pflasters zur transdermalen Verabreichung zur Verfügung gestellt.
In dem Fall der Aspekte der Erfindung, die die Verringerung toxischer Nebenwirkungen oder die Erhöhung des therapeutischen Indexes von therapeutischen Medikamenten betreffen, kann die Verabreichung von besagtem wirksamen Inhaltsstoff zu einem Zeitpunkt einige Tage vor der Behandlung mit dem therapeutischen Medikament beginnen, z. B. dem chemotherapeutischen Medikament oder einem neuroleptischen Medikament und kann dann auch über den Zeitraum der Verabreichung des Medikaments weitergeführt werden. Eine solche vorzeitige Verabreichung kann eine extra schützende Wirkung zur Verfügung stellen, z. B. gegen die Medikament-induzierte Leukopenie.
Manchmal kann eine Vorbehandlung mit besagtem wirksamen Inhaltsstoff ausreichend sein und in anderen Fällen kann besagter wirksamer Inhaltsstoff ein Mal oder mehrere Male während dem Zeitraum der Verabreichung des therapeutischen Medikaments verabreicht werden. Während einem Zeitraum einer kombinierten Verabreichung des wirksamen Inhaltsstoffes und des therapeutischen Medikaments können eine Reihe möglicher kombinierter Verabreichungsstrategien verwendet werden, z. B.: tägliche Verabreichung von beiden, tägliche Verabreichung des therapeutischen Medikaments und mehrere tägliche Verabreichungen des wirksamen Inhaltsstoffes; ein sich wiederholender Zyklus einer Verabreichung, umfassend die Verabreichung des therapeutischen Medikaments an einem Tag und dann die des wirksamen Inhaltsstoffs an einem anderen Tag; etc.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann besagter wirksamer Inhaltsstoff in einer Einzelzusammensetzung mit dem anderen Medikament kombiniert werden und eine solche kombinierte Zusammensetzung bildet auch einen Aspekt der Erfindung aus.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele mit gelegentlichem Bezug auf die beigefügten Zeichnungen in einer nichteinschränkenden Weise illustriert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Wirkung sich erhöhender Adenosinkonzentrationen auf die Proliferation von Nb-2-11c-Lymphom-Zellen, wie gemessen durch die Zellzahl und ausgedrückt als Prozent des Kontrollwerts.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von 4 uM Adenosin auf die Proliferation von Tumor- und normalen Zellen: Abschnitt A zeigt die Wirkung von Adenosin auf einer Anzahl von Leukämie und Lymphom-Zellinien; Abschnitt B zeigt die Wirkung von Adenosin auf eine Anzahl fester Tumore; und Abschnitt C zeigt die Wirkung von Adenosin auf normale Zellen. Die Proliferation von Zellen wurde durch einen Thymidinaufnahmeassay gemessen.
Fig. 3 zeigt die Wirkung verschiedener Dosierungen von Adenosin auf die Proliferation von Knochenmarkszellen (gemessen durch einen Thymidinaufnahmeassay).
Fig. 4 zeigt die Wirkung von Tyheophyllin in der Neutralisation der hemmenden Wirkung von Adenosin auf Tumorzellproliferation.
Fig. 5 zeigt die Wirkung von Adenosinrezeptorantagonisten auf die Proliferation von Knochenmarkszellen (Die dunkel gefärbten Säulen zeigen die Proliferation von Knochenmark ohne Adenosin; hell gefärbte Säulen zeigen die Wirkung der Proliferation in der Gegenwart von Adenosin).
Fig. 6 zeigt die in vivo Antitumorwirkung von drei unterschiedlichen Behandlungen: Verabreichung von Adenosin, Verabreichung eines chemotherapeutischen Medikaments - Cyclophosphamid und eine Kombination von Adenosin und dem chemotherapeutischen Medikament. Die Wirkung wurde durch Zählen der Anzahl von Tumorfoci in den Lungen der untersuchten Mäuse gemessen.
Fig. 7 zeigt die in vitro Wirkung von Adenosin auf die Aktivität menschlicher natürlicher Killer (NK)-Zellen und die IL-2-Produktion durch menschliche periphere mononukleare Zellen. (Kontrolle - dunkle Säulen; Zellen, die Adenosin ausgesetzt waren - hell gefärbte Säulen).
Fig. 8 zeigt die Wirkung von in vivo verabreichtem Adenosin auf die Aktivität von NK-Zellen. (dunkel gefärbte Säulen - NK-Zellen, die aus naiven Mäusen erhalten wurden; hell gefärbte Säulen - NK-Zellen, die aus Adenosin-behandelten Mäusen erhalten wurden).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Beispiel 1 In vitro Studien

Material und Methoden

a. Tumorzellen

Es wurden Tumorzellinien aus Menschen (K562 myeloische Leukämie, Tib-180 Erythroleukämie, LNCaP Prostatakarzinom und MDA-MB-468 Brustadenokarzinom) und Mäusen (Yac Lymphom B-16-Melanom) verwendet und von der American Type Tissure Culture Collection, Rockville käuflich erworben. Nb2 11c Rattenlymphomzellen (Pines et al.(19)) wurden auch verwendet. Die Zellen wurden routinemäßig in RPMI-Medium aufbewahrt, das 10% fetales Kälberserum enthält. Zweimal pro Woche wurden die Zellen auf frisch hergestelltes Medium überführt.

Normale Zellen

Als eine Kontrolle für Tumor-proliferierende Zellen wurden zwei normal proliferierende Zelltypen verwendet, d. h., Knochenmarkszellen, die aus dem Femur von C57BL/6J- Mäusen abgeleitet wurden; Fibroblasten, die aus primären Kulturen von neugeborenen Rattenskelettmuskelzellen abgeleitet wurden. Die Zellen wurden wie vormals aufbereitet (Djaldetti, M. Sredni, B., Zigelman, R., Verber, M., and Fishman, P. Muscle cells produce a low molecular weight factor with anti-ancer acitivity. Clin. Exp. Matastasis, 14: 189-196, 1996). Es wurde auch die L-8 Myoblastenrattenzelllinie verwendet, die von der ATCC gekauft wurde.

c. Zellproliferationsassays

(i) Zellzahlassay:

Die Wirkung von Adenosin auf die Proliferation von Ratten Nb2-11C Lymphomzellen wurde durch das Zählen der Zellen beobachtet. Die NB2-11C-Zellen wurden in der G0/G1-Phase vor der Kultivierung mit dem cm synchronisiert durch Transferieren der Zellen auf Pferdeserum- (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) supplementiertes Medium für die Über-Nacht Inkubation. 1·2 · 10&sup5; Zellen/ml wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in 1 ml RPMI-Medium kultiviert, das 5% Pferdeserum enthielt und 20, 10, 8, 6, 4, 2 und 1 uM Adenosin (von Sigma, USA, käuflich erworben) wurden hinzugefügt. Die Zellproliferation wurde durch das Hinzufügen von menschlichem Wachstumshormon (Biotechnology General, Rehovot, Israel) auf eine Endkonzentration von 1 ng/mL initiiert. Die Kulturen wurden bei 37ºC bei 5% CO&sub2; inkubiert und 48 Stunden später in einem Coulter Counter gezählt. Die Hemmung der Zellproliferation wurde wie folgt berechnet:
wobei I = Grad der Hemmung (%)
CS = Zellzahl mit Adenosin
Cnh = Zellzahl ohne Hormon und ohne Adenosin
Cwh = Zellzahl mit Hormon aber ohne Adenosin

(ii) [³H]-Thymidinaufnahmeassay:

0,9 · 10&sup4;/pro Vertiefung von jeder Tumorzellinie oder normalen Zellen (Knochenmarkszellen oder Fibroblasten) wurden mit RPMI-Medium, das 10% FCS und 2 uM Adenosin enthält, für 48 Stunden in 96er Mikrotiterplatten inkubiert. Während der letzten 6 Stunden der Inkubation wurde jede Vertiefung mit 1 uCi [³H]-Thymidin versetzt. Die Zellen wurden geerntet und die [³H]-Thymidin-Aufnahme wurde in einem LKB-Flüssigkeitsszintillationszähler (LB, Piscataway, NJ, USA) bestimmt.

ERGEBNISSE

a. Wirkung von Adenosin auf die Proliferation von Tumor- und normalen Zellen

Das Wachstum der Nb2-11c-Rattenlymphomzellen (durch die Zellzahl gemessen) wurde deutlich nach der Inkubation mit verschiedenen Adenosinkonzentrationen gehemmt. Wie in Fig. 1 zu sehen ist, gibt es eine dosisabhängige Wirkung von Adenosin auf die Proliferation der Nb2-11c-Zellen.
Adenosin in einer Konzentration von 4 uM induzierte einer Proliferationshemmung in den Leukämie-, Lymphom- und festen Tumorzelllinien, wobei es zur gleichen Zeit die Proliferation der drei getesteten normalen Zellen stimulierte (Fig. 2): alle Ergebnisse werden als % der Kontrolle gezeigt).
Zusätzliche Studien zeigten eine dosisabhängige stimulierende Wirkung von Adenosin auf die Knochenmarkszellproliferation (Fig. 3) mit einer Maximalwirkung bei ungefähr 10 uM).

b. Theophyllin (Adenosin A1 & A2 Rezeptor-Antagonist) neutralisiert die hemmende Wirkung von Adenosin auf die Tumorzellproliferation

Theophyllin ist ein Antagonist von beiden, den A1- und A2-Adenosinrezeptoren. Theophyllin in einer Konzentration von 0,1 uM wurde zu einer Kultur von K562-Zellen in der Gegenwart von 4 uM Adenosin hinzugefügt. Die Kulturbedingungen waren identisch mit den oben beschriebenen. Wie in Fig. 4 zu sehen ist, wurde diese hemmende Wirkung neutralisiert, während Adenosin die Tumorzellproliferation in der Gegenwart von Theophyllin hemmte.

c. Wirkung von Theophyllin (Adenosin A1- und A2-Rezeptorantagonist), DPCPX (Adenosin A1-Rezeptorantagonist) und DPSPX (Adenosin A2-Rezeptorantagonist) auf die Knochenmarkszellproliferation

Es wurde die Proliferation von Knochenmarkszellen in der Gegenwart von den drei Adenosinrezeptorantagonisten in der Abwesenheit und der Anwesenheit von Adenosin untersucht. Die Konzentration von Theophyllin betrug 0,1 uM; und die von DPCPX und DPSPX betrug 0,01 uM. Die Konzentration von Adenosin betrug 10 uM.
Die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass alle diese Rezeptorantagonisten eine kleine Erhöhung in der Proliferation von Knochenmarkszellen bewirkten, während eine wesentlich höhere Wirkung auf die Erhöhung der Knochenmarkszellproliferation in der Gegenwart von Adenosin zu beobachten war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die stearine Wirkung von Adenosin auf Knochenmarkszellen durch einen Mechanismus, der nicht von den Adenosinrezeptoren abhängt, wahrscheinlich ist. Zusätzlich, obwohl keine Einschränkung auf diese Theory erwünscht ist, ist es wahrscheinlich, dass die Erhöhung der Proliferation, die in der Gegenwart von Adenosinrezeptorantagonisten erhalten wird, das Ergebnis der Freisetzung einer größeren Menge an Adenosin, das natürlicherweise in der extrazellulären Umgebung vorhanden ist, ist, z. B. von Adenosin, das durch Zellen aus internen Pools sezerniert wird, um durch die proliferationsstimulierenden Stoffwechselwege zu wirken.

Beispiel 2 in vivo Studien

Material und Methoden

40 C57BL6/J-Mäuse wurden in 4 Gruppen aufgeteilt, wobei jede (durch intraperitoneale Injektion) gemäß einer der folgenden Protokolle behandelt wurde:
1. Kontrollgruppe: 6 Tage der Behandlung durch tägliche Injektion mit 1 ml Salzlösung.
2. Adenosin und Chemotherapiegruppe: tägliche Injektion einer 1 ml 5 mM Adenosinlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit Cyclophosphamid injiziert.
3. Adenosingruppe: tägliche Injektion von einer 1 ml 5 mM Adenosinlösung für 5 aufeinanderfolgenden Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit 1 ml Salzlösung injiziert.
4. Chemotherapiegruppe: tägliche Injektion von 1 ml Salzlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit Cyclophosphamid injiziert.
Fünf Mäuse von jeder Gruppe wurden 25 Stunden und 96 Stunden nach den Behandlungen geopfert und zwei Parameter wurden ausgewertet:
1. Zellzahl des vollständigen Blutes.
2. Proliferationskapazität von Knochenmark: Knochenmark wurde aus dem Femur herausgesaugt und für jede Testgruppe vereint. Die Zellen wurde abgetrennt, gezählt und die proliferative Kapazität wurde durch den [³H]-Thymidinaufnahmeassay, wie oben beschrieben, ausgewertet.

ERGEBNISSE

Adenosin hat eine chemoprotektive Wirkung

Nach der Behandlung mit Cyclophosphamid viel die Anzahl der weißen Blut nach 24 Stunden wie in Tabelle 1 unten gezeigt. In der Gruppe, welche 5 Tage mit Adenosin vor der Verabreichung des Cyclophosphamids behandelt wurde, war die Anzahl der weißen Blutzellen sogar höher als die der Cyclophosphamid-behandelten Gruppe. Tabelle 1
Die schützende Wirkung von Adenosin wurde auch durch das Untersuchen der Knochenmarkszellproliferation nachgewiesen, wie unten in Tabelle 2 zu sehen ist. Es ist zu sehen, dass Adenosin die Proliferationskapazität des Knochenmarks sogar über die Kontrolle erhöht, sogar in der Gegenwart des chemotherapeutischen Medikaments.

Tabelle 2

Knochenmarkszellproliferation (CPM) nach 24 Stunden
Kontrolle 603,6 ± 23,7
Adenosin 1480,0 ± 68,5
Cyclophosphamid 434,5 ± 52,2
Adenosin + Cyclophosphamid 1072,6 ± 85,3

Beispiel 3 In vivo Studien

Material und Methoden

40 C57BL6/J wurden in vier Gruppen aufgeteilt, von denen jede (durch intraperitoneale Injektion) gemäß einem der folgenden Protokolle behandelt wurde:
1. Kontrollgruppe: 6 Tage der Behandlung durch tägliche Injektion von 1 ml Salzlösung.
2. Chemotherapiegruppe: tägliche Injektion von 1 ml Salzlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit Cyclophosphamid injiziert.
3. Adenosingruppe: tägliche Injektion von einer 1 ml 5 mM Adenosinlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit 1 ml Salzlösung injiziert.
4. Adenosin- und Chemotherapiegruppe: täglich Injektion einer 1 ml 5 mM Adenosinlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage.
Die folgenden Parameter wurden für jede Gruppe ausgewertet:
i. Zahl der roten Blutzellen (RBC).
ii. Hämoglobinmenge (HGB).
iii. Zahl der weißen Blutzellen.
iv. Anteil der drei Hauptgruppen von weißen Blutzellen: Lymphozyten (LYM), Monozyten (MID) und Granulozyten (GRAN).

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse (Durchschnitt ± Standardabweichung) für jede der verschiedenen Gruppen wird in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
¹ Zählen der roten Blutzellen - 10&sup6;/l
² Hämoglobinzahl - in Gramm/100 ml
³ % der Anzahl von weißen Blutzellen
Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen, während das chemotherapeutische Medikament fast keine Wirkung auf die Zahl der roten Blutzellen und auf die Menge an Hämoglobin hatte, dass dieses eine Verringerung in der Menge an weißen Blutzellen bewirkte. Wie zu sehen ist, wurde die Zahl der weißen Blutzellen auf Mengen oberhalb des Kontrollwerts nach Verabreichung von Adenosin hochgebracht und, wenn Adenosin zusammen mit den chemotherapeutischen Medikament verabreicht wurde, blieb die Zahl der weißen Blutzellen bei Mengen, die ähnlich zu dem Kontrollwert waren.
Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen, während das chemotherapeutische Medikament fast keine Wirkung auf die Zahl der roten Blutzellen und auf die Menge an Hämoglobin hatte, dass dieses eine Verringerung in der Menge an weißen Blutzellen bewirkte. Wie zu sehen ist, wurde die Zahl der weißen Blutzellen auf Mengen oberhalb des Kontrollwerts nach Verabreichung von Adenosin hochgebracht und, wenn Adenosin zusammen mit den chemotherapeutischen Medikament verabreicht wurde, blieb die Zahl der weißen Blutzellen bei Mengen, die ähnlich zu dem Kontrollwert waren.
Während die chemotherapeutischen Medikamente eine toxische Wirkung aufwiesen und somit zu einer Verringerung aller weißen Blutzellen führten, ist diese Wirkung in Granulozyten dominierender. Dieses ist aus der Tatsache herzuleiten, dass nach der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments sich der relative Anteil der Granulozyten verringert, während sich der relative Anteil an Lymphozyten verringert. Diese Wirkung kehrt sich nach Verabreichung von Adenosin um, denn Adenosin hat eine stärker ausgeprägte Wirkung bei dem Auslösen der Proliferation von Granulozyten in verschiedenen anderen Typen von weißen Blutzellen.

Beispiel 3 Zusätzlich in vivo Studien

In einer großen Zahl von in vivo Studien, die unter Verwendung ähnlicher Protokolle durchgeführt wurden, war die Adenosindosierung, die verwendet wurde, auf ungefähr 54 ug/kg Körpergewicht pro Tag reduziert, mit einer ähnlichen Wirkung von Adenosin in der toxischen Wirkung des chemotherapeutischen Medikaments auf die Zahl von Leukozyten und periphere Blutgranulozyten. Zudem wurde in weiteren Experimenten, die gemäß dieser Erfindung durchgeführt wurden, gefunden, dass, um seine schützende Wirkung auszuüben, es ausreicht, das Adenosin für einige Tage vor der Behandlung mit dem chemotherapeutischen Medikament zu verabreichen und diese Wirkung bedarf keiner kontinuierlichen Verabreichung von Adenosin während der Dauer der Behandlung mit einem chemotherapeutischen Medikament.

Beispiel 4 In vivo Studien

Materialien und Methoden

B-16-F10-Melanomzellen (2 · 10&sup5;) wurden intravenös in 40 C57BL6/J-Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden in 4 Gruppen von jeweils 10 Mäusen aufgeteilt, welche durch intraperitoneale Verabereichung von einem der folgenden behandelt wurden:
1. Kontrollgruppe: tägliche Verabreichung von 1 ml Salzlösung pro Maus vom Tag der Tumorinokulation bis die Mäuse geopfert wurden.
2. Adenosingruppe: tägliche Verabreichung von 1 ml einer 5 mM Adenosinlösung pro Maus vom Tag der Tumorinokulation bis die Mäuse geopfert wurden.
3. Chemotherapiegruppe: eine Injektion von Cyclophosphamid 24 Stunden nach der Inokulation von Tumorzellen und tägliche Verabreichung von 1 ml Salzlösung pro Maus vom Tag der Tumorinokulation bis die Mäuse geopfert wurden.
4. Chemotherapie und Adenosin: eine Injektion Cyclophosphamid 24 Stunden nach der Inokulation des Tumors und tägliche Verabreichung von 1 ml von 5 mM Adenosinlösung pro Maus vom Tag der Tumorinokulation bis die Mäuse geopfert wurden.

Ergebnisse

Nach 18 Tagen wurden die Mäuse geopfert und Melanomtumorfoki wurden in der Lunge gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4

Gruppe Nr. der Foki
Kontrolle 7,6 ± 2,68
Adenosin 6,11 ± 2,74
Chemotherapie 4,16 ± 1,42
Adenosin + Chemotherapie 3,0 ± 1,16
Das oben gezeigte Ergebnis weist die zusätzliche Wirkung von Adenosin auf die Erhöhung der Stärke der Antitumorwirkung des chemotherapeutischen Medikaments nach.
In einem weiteren Experiment wurde ein ähnliches Protokoll verfolgt, mit einer geringeren Adenosindosierung (orale Verabreichung von 0,5 ml einer 10 uM Adenosinlösung, einer Dosis, die ungefähr 54 ug/kg Körpergewicht Adenosin entspricht). Die Ergebnisse werden in Fig. 6 gezeigt. Wie zu sehen ist, weist Adenosin hier wiederum eine mit dem chemotherapeutischen Medikament synergistische Wirkung auf, um die Tumorlast zu verringern.

Beispiel 5 In vivo Studien

Materialien und Methoden

50 C57BL6/J-Mäuse wurden in 5 Gruppen von jeweils 10 Mäusen aufgeteilt, welche durch intraperitoneale Injektion mit einer der folgenden Behandlungen behandelt wurden:
1. Kontrollgruppe: 6 Tage Behandlung durch tägliche Injektion von 1 ml Salzlösung.
2. Adenosingruppe I: tägliche Injektion von 1 ml 5 M Adenosinlösung für 6 Tage (eine Dosis von ungefähr 5 uM/kg Körpergewicht).
3. Adenosingruppe II: tägliche Injektion von 1 ml 10 M Adenosinlösung für 6 Tage. (eine Dosis von ungefähr 1,08 ug/kg Körpergewicht).
4. Chemotherapiegruppe: tägliche Injektion von 1 ml Salzlösung für 5 aufeinander folgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit Cyclophosphamid injiziert.
5. Adenosin und Chemotherapiegruppe: tägliche Injektion von 1 ml 10 M Adenosinlösung für 5 aufeinanderfolgende Tage. Am Tag 6 wurden die Mäuse intraperitoneal mit Cyclophosphamid injiziert.

Ergebnisse

Die Gesamtzahl der weißen Blutzellen und der Prozentanteil Granulozyten in jeder der Gruppen wird in der folgenden Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen, dass Adenosin bei beiden Konzentrationen keinerlei Wirkung auf die Erhöhung der Prozentzahl an Granulozyten in der Zellpopulation der weißen Blutzellen bewirkt. Zusätzlich war das Adenosin in der Lage, die Gesamtzahl weißer Blutzellen wieder herzustellen, obwohl nicht ganz auf die Kontrollwerte, aber wichtiger, ohne der Chemotherapie entgegenzuwirken, bewirkte es eine sehr große Erhöhung in dem relativen Anteil an Granulozyten, während die Chemotherapie eine Verringerung in der Anzahl weißer Blutzellen und dem relativen Anteil an Granulozyten bewirkte.

Beispiel 6 Adenosin bewirkt eine immunomodulatorische Wirkung

a. In vivo Wirkung auf die NK-Aktivität und IL-12-Sezernierung

Mononukleare Zellen (MNC) wurden aus heparinisiertem Blut von 10 gesunden Voluntären unter Verwendung eines Ficoll-Hypaque-Gradienten fraktioniert. 5 · 10&sup6; mononukleare Zellen/ml wurden mit 4 uM Adenosin und RPMI, das 10% FCS enthält, mit und ohne 0,0075% des Mitogens Staphylococcus Aureous Crown (SAC, Calbiochem Pansorbin) für 18 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde der Überstand gesammelt, zentrifugiert und durch einen 0,22 sterilen Filter filtriert und bei -70ºC bis zur Untersuchung aufbewahrt. Die Menge an IL-12 in den Überständen wurde analysiert unter Verwendung eines käuflichen Kits von R & D-System.
Die Wirkung von Adenosin auf die Aktivität menschlicher peripherer Blut-NK-Zellen wurde durch einen üblichen 4 h &sup5;¹Cr-Freisetzungstest unter Verwendung von K562 Leukämiezellen als Zielzellen untersucht. Periphere mononukleare Blutzellen wurden aus 10 gesunden Voluntären unter Verwendung eines Ficoll-Hypapue-Gradienten abgetrennt. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 5 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in 96er Rundbodenplatten kultiviert und als Effektor (E)-Zellen verwendet. Die Zellen wurden mit 4 uM Adenosin in RPMI, enthalten 5% FCS, für 18 Stunden vorinkubiert. K562-Zellen wurden als Ziele (Targets, T) verwendet und mit 100 uci Na&sub2;[&sup5;¹Cr]O&sub4; bei 37º für 1 h markiert. Nach intensivem Waschen, um den Überschuss Cr zu entfernen, wurden die Zellen (1 · 10&sup4;) resuspendiert und mit den Effektorzellen bei dem E : T-Verhältnis von 1 : 50 in einem Volumen von 200 ul unter Verwendung von Dreifachassays vermischt. Nach 4 h Inkubation bei 37ºC in 5% CO&sub2; wurden die Platten zentrifugiert und die Überstände in einem Gammazähler (LKB) gezählt.
Die NK Zyctotoxizität wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:
wobei CPM spontan und CPM maximal durch Messung der CPM der Überstände der Zielzellen allein in der Gegenwart des Testmediums oder in der Gegenwart von 1% SDS bestimmt wurden. Die spontane Freisetzung lag unter 8% der maximalen Freisetzung für die Dauer dieses Experiments.

Ergebnisse:

Adenosin stimulierte die Produktion von IL-12 durch menschliche periphere mononukleare Blutzellen in der Gegenwart des SAC-Mitogens (Fig. 7). In einer anderen Reihe von Experimenten induzierte Adenosin die IL-12 Produktion ohne die Gegenwart des Mitogens in dem Kultursystem (19% Stimulation der IL-12 Produktion). Die NK-Aktivität wurde auch gefolgt von dem Zusatz von Adenosin zu dem Kultursystem um 32% stimuliert. Es kann rückgeschlossen werden, dass einer der potentiellen Mechanismen, durch welchen Adenosin die NK-Aktivität stimuliert, die Induktion der IL-12 Produktion ist, von dem bekannt ist, dass es ein Aktivator von NK-Zellen ist.

b. In vivo Wirkung von Adenosin auf die NK-Aktivität von Mäusemilzzellen

ICR-Mäuse wurden für 5 aufeinanderfolgende Tage mit 10 uM Adenosin behandelt. Drei Tage später wurden die Mäuse geopfert, die Milz wurde entnommen und mononukleare Zellen wurden unter Verwendung eines Ficoll-Hypaque-Gradienten abgetrennt. Die NK- Aktivität wurde wie oben für den menschlichen Assay gemessen, außer dass XAC- Mäuse Lymphomzellen als Zielzellen anstatt der K652-Zellen verwendet wurden.

Ergebnisse:

NK-Zellen, die aus Adenosin-behandelten Mäusen abgeleitet wurden, waren stärker in der Lyse der Yac-Zielzellen, wie aus den zwei Verhältnissen von untersuchten Effektoren: Zielzellen (Fig. 8) zu sehen ist.
Die modulierende Wirkung von Adenosin kann vielleicht einen Teil seiner in vivo Antitumorwirkung, wie im Folgenden gezeigt, erklären.

Claims

1. Verwendung von Adenosin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Leukopenie in einem Individuum, wobei nicht mehr als 50 mg Adenosin pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden.

2. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei nicht mehr als 10 mg Adenosin pro kg Körpergewicht verabreicht werden.

3. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei nicht mehr als 1 mg Adenosin pro kg Körpergewicht verabreicht werden.

4. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung und Vermeidung von Arzneimittel-induzierter Leukopenie.

5. Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei besagtes Arzneimittel ein chemotherapeutisches oder ein neuroleptisches Arzneimittel ist.

6. Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei besagtes Arzneimittel ein chemotherapeutisches Arzneimittel ist.

7. Verwendung von Adenosin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums, um den therapeutischen Index eines therapeutischen Arzneimittels zu erhöhen, das toxische Nebenwirkungen aufweist, die Leukopenie bewirken, wobei das Adenosin zu nicht mehr als 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht wird.

8. Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Adenosin zu nicht mehr als 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.

9. Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Adenosin zu nicht mehr als 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht wird.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei besagtes therapeutisches Arzneimittel ein Antikrebs-chemotherapeutisches Arzneimittel oder ein neuroleptisches Arzneimittel ist.

11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Erhöhung des therapeutischen Index durch:

die Erhöhung der Wirksamkeit des besagten therapeutischen Arzneimittels bei der zu verabreichenden Menge im Vergleich zur Verabreichung ohne Adenosin;

verringerte toxische Nebenwirkungen des besagten therapeutischen Arzneimittels; oder

die Erhöhung der Wirkdauer des besagten therapeutischen Arzneimittels

manifestiert ist.