DE69431620T2

DE69431620T2 - Zusammensetzungen für die anwendung in menschlicher therapie, charakterisiert durch die assoziation eines muramylpeptids mit einem cytokin

Info

Publication number: DE69431620T2
Application number: DE69431620T
Authority: DE
Inventors: Georges Bahr; Louis Chedid; Pierre Lefrancier
Original assignee: Vacsyn SA
Current assignee: Vacsyn SA
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2014-03-22
Also published as: JP3723206B2; AU6285694A; JPH08511235A; DK0689449T3; CA2157758A1; DE69431620D1; EP0689449A1; WO1994021275A1; EP0689449B1; PT689449E; US5932208A; ES2187520T3; ATE226828T1

Description

Die Interferon (im speziellen das Interferon α) werden von den Leukocyten sezerniert. Sie werden daher zu den Cytokinen gerechnet, Mediatoren, welche hauptsächlich von den Zellen des Immunsystems produziert werden. Allgemein gesagt können die Cytokine als charakteristische Hormone des Immunsystems betrachtet werden. Die Möglichkeit, Cytokine durch genetische Rekombination zu produzieren hat es ermöglicht, ausgefeiltere Studien durchzuführen, welche das Verhalten einiger dieser Cytokine untersuchen, insbesondere rekombinanter Interferone beim Tier. Unter den Interferonen ist das Interferon α (IFN α) am besten untersucht, welches unterteilt wird in Interferon α 2a, IFN α 2b und IFN 2c.
Insbesondere wurde die antivirale Aktivität einiger Mausinterferone, und sogar die Potenzierung dieser Aktivität bei der Maus mit Hilfe einiger Derivate des N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamins (MDP) oder Homologen desselben dargestellt. Jedoch, wie es F. Dianzani in seinem Artikel mit dem Titel "Interferon Treatments: how to use an Endogenous System as a Therapeutic Agent" (Behandlungen mit Interferonen: Wie verwendet man ein endogenes System als Therapeutikum) in dem "Journal of Interferon Research, Special Issue, May 1992, Mary Ann Liebert, Inc., Hrsg., S. 109-118" erwähnt, waren die zahlreichen klinischen Versuche, die beim Menschen mit Interferonen unternommen wurden, "mehr als enttäuschend". Auch wenn in der Tat die Tierversuche breite therapeutische Möglichkeiten zu eröffnen schienen, haben die schlecht kontrollierbaren Nebenwirkungen bis zum heutigen Tag nur eine sehr reduzierte Anzahl an therapeutischen Indikationen erlaubt. Des weiteren wurde neuerdings vorgeschlagen, das Interferon α 2a nur in einer reduzierten Anzahl von "Nischen" zu verwenden, wie es auch erwähnt wird in "Scrip's Cytokines Report", PJB publications Ltd. 1993, mit Bezug auf die Schwierigkeiten, welche bei der Anwendung der Interferone in der menschlichen Therapie auftraten:
a) in der Behandlung von schwersten Fällen von Hepatitis B und C. Die Behandlungen bestehen aus täglichen Verabreichungen oder dreimaliger Verabreichung pro Woche von 5 bis 10 Millionen Einheiten während 3 bis 6 Monaten. Positive Resultate werden in 30 bis 40% der Fälle beobachtet;
b) im Krebsbereich, in der Behandlung der Haarzellenleukämie und der chronischen myeloischen Leukämie, und der ins Auge gefassten Anwendungen bei AIDS, dem Kaposi-Syndrom, dem multiplen Myelom, dem Melanom und verschiedenen Arten des Karzinoms.
Die Schwere dieser Symptome ist dergestalt, dass auch schwere Nebenwirkungen, welche die Verwendung des Interferon α in der Therapie beim Menschen begleiten, akzeptiert werden. 98% der so behandelten Patienten leiden an einem grippalen Syndrom, oft sehr schweren Ausmaßes, begleitet von Schwindelgefühlen, Brechreiz, Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems und Herzstörungen. Diese Effekte sind zum Teil zumindest der Induktion seitens des Interferons von Fiebermediatoren zuschreibbar, welche das IL-1 sein könnten, und Prostaglandine, deren Produktion durch das Interferon aktiviert würde. Hinzu kommen Müdigkeitsanfälle, Anorexie, Gewichtsverlust, welche zumindest teilweise an die Produktion von TNF gekoppelt sein könnten, und/oder die erhöhte Expression von TNF-Rezeptoren, welche ebenfalls von den Interferonen induziert werden. Jegliches Verfahren, welches die positiven Effekte der Interferone oder der therapeutisch angewendeten Cytokine verbessern würde, würde auch die Produktion oder die Aktivität der Cytokine oder anderer biologischer unerwünschter Signalstoffe wie das IL-1, IL-8 und/oder TNF (TNF ist die Abkürzung des englischen Ausdrucks "Tumor Necrosis Factor") optimieren, was nur in einem sicheren Mißerfolg enden kann. Schließlich werden die Verabreichungen von Interferonen häufig begleitet von starken Leukopenien und Thrombopenien, die begleitet sind von einer Blockierung der Reifung der myeloiden Vorläuferzellen. Diese Phänomene machen es notwendig, dass die Behandlungen auf Interferonbasis in regelmäßigen Abständen unterbrochen werden, um jedes Mal eine Wiederherstellung des Blutbildes zu ermöglichen. Diese Nachteile erlauben bis zum heutigen Tage keine Erkundung der reellen Möglichkeiten der Verwendung der Interferone in der Therapie am Menschen, mit Ausnahme der Syndrome welche weiter oben erwähnt wurden. Vergleichbare Schwierigkeiten tauchen mit anderen Cytokinen auf, deren therapeutisches Interesse gesichert sein würde, wenn es möglich wäre, diesen Schwierigkeiten zu begegnen. Dies gilt z. B. für IL-2, IL-3, IL-6, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, usw... TNF und IL-1, deren therapeutisches Potenzial nur sehr selten ausgelotet werden kann.
Man weiß, dass es vorgeschlagen wurde, im spezifischen IL-3 und bestimmte CSF zu verwenden um die Wiederherstellung der Hämatopoese bei Patienten zu beschleunigen, welche an Knochenmarkaplasie leiden (welches verursacht wird durch einen endogenen und/oder iatrogenen Faktor, im spezifischen in Folge von Chemotherapien oder bei Knochenmarkstransplantations-Patienten. Die Verwendung von IL-3 in der Humanmedizin oder der aktivsten Formen der CSFs (z. B. GM-CSF) begegnen in der Praxis den gleichen Schwierigkeiten wie das Interferon α.
Zusätzlich zu diesen therapeutischen Nachteilen kommen noch die hohen Kosten der aktuellen Behandlungen auf Basis der therapeutisch verwendeten Cytokine hinzu. Die verabreichten Dosierungen, auch wenn man ihren Effekt in vivo regulieren kann, sind in der Tat beträchtlich, verglichen mit den wirksamen therapeutischen Dosierungen, was sich möglicherweise durch die Tatsache erklären lässt, dass die Cytokine, im Gegensatz zu den endokrinen Hormonen, nicht auf Distanz wirken, sondern nur auf die Zellen, welche sich in der Nähe der sekretorischen Zellen befinden. Mit anderen Worten, jedes verabreichte Cytokin, welches nicht die Zielzellen erreicht, kann als "therapeutisch verloren" betrachtet werden.
EP-A-228 823, EP-A-329 609, EP-A-257 890, Malik et al. British Journal of Cancer, 63(3) S. 399-403 (1991) und Azuma et al. Advances in Experimental Medicine and Biology, 319, S. 253-263 (1992) beschreiben immunstimulierende Agenzien, umfassend ein Muramyl-Dipeptid und ein Cytokin, wobei diese Muramylpeptide jedoch eine Struktur besitzen, welche sich von den hier offenbarten unterscheidet. Sanceau et al, Chemical Abstracts, 112 (19) 1990, Abstrakt Nr. 17668u beschreibt die Verwendung eines Muramyldipeptids, verwendet ohne Cytokin, zur Stimulierung der Sekretion des Interleukin-6.
Pouillart et al, Journal of Interferon, Res. 11, Sup. 1, S. 162 (Nov. 1991) stellt fest, dass das Murametid in der Lage ist, die antivirale Aktivität des Interferons in einer Zellkultur zu verstärken.
Pouillart et al. Journal of Interferon, Res. 11, Sup. 1, S. 162 (Nov. 1991) beschreibt Versuche an der Maus und verwendet MDP-Analoga und Interferon α/β der Maus und erwähnt, dass es eine Korrelation zwischen der Konformation verschiedener Analoga des MDP und ihrer Fähigkeit gibt, die Wirkungsweise des Interferons zu verstärken.
Wyde et al. Journal of Biological Response Modifiers, 9(1) S. 98-102 (1990) beschreibt eine Kombination von Muramyl-Dipeptid und von poly-IC, welche gegen das Influenzavirus der Maus aktiv ist. Wyde et al beschreiben außerdem eine Kombination von Muramyl-Dipeptid und Interferon-α der Maus. Sie stellen fest, dass diese Kombination nicht aktiv gegen das Influenzavirus ist. Sie legen weiterhin dar, dass das Ersetzen dieser Muramyl-Dipeptid-Zusammensetzung durch das Muradimetid keine erhöhte Wirksamkeit gegen das Influenzavirus aufzeigte.
Die Erfindung hat das Ziel, zumindest zum großen Teil, diese Nachteile und Schwierigkeiten zu überwinden.
Die Möglichkeit von den therapeutischen Effekten des IFN α und anderer therapeutisch verwendbarer Cytokine als das Interferon α, zu profitieren, gegebenenfalls in geringeren Dosierungen, ohne unerträgliche Nebenwirkungen zu verursachen, wäre ein wichtiger Schritt sowohl in therapeutischer als auch wirtschaftlicher Hinsicht. Dies ist eines der Ziele der Erfindung.
Im speziellen ist das Ziel der Erfindung, die Wirksamkeit der Therapeutika zu erhöhen, durch Verwendung von Interferon oder allgemeiner gesagt, eines Cytokins, welchen einen therapeutischen Wert hat, und sogar, die Erweiterung der therapeutischen Anwendbarkeit dieser Cytokine (darunter natürlich das Interferon) und gleichzeitig die Überwindung eines Großteils der oben erwähnten Nachteile, im Speziellen mit Bezug auf die Interferone.
Die Erfindung basiert zum Großteil auf der Entdeckung, dass die Assoziation von einigen Muramylpeptiden mit einem Cytokin, welches möglicherweise einen therapeutischen Effekt beim Menschen hat, nun die Verwendung einiger dieser Cytokine beim Menschen in einer wirksamen Dosierung ermöglichet, was zuvor nicht ernsthaft in Betracht gezogen werden konnte, und bestenfalls (z. B. im Falle des Interferons), neue Wege der therapeutischen Behandlung zahlreicher klinischer Indikationen mit einer stark verbesserten Wirksamkeit eröffnet. Es wurde in der Tat festgestellt, dass diese Muramylpeptide ebenfalls die in vivo-Synthese anderer Cytokine induzieren konnten, welche nicht, zumindest nicht in nachweisbaren Konzentrationen, erschienen, wenn lediglich eines der beiden Elemente, Interferon oder Muramylpeptid, verabreicht wurde. Daraus resultiert eine Erweiterung des therapeutischen Aktivitätsspektrums der Cytokine und der Muramylpeptide. Unter den induzierten Cytokinen seien insbesondere das Interleukin 6 (IL-6), das G-CSF und ein Antagonist (IL-1 RA) des Rezeptors des Interleukin 1 erwähnt. Des weiteren erlauben die gleichzeitigen Verabreichungen von bestimmten Muramylpeptiden mit dem Interferon α IFN α) das Erreichen gewünschter Effekte bei Verwendung suboptimaler Dosierungen der Cytokine, im Speziellen des Interferon α, dank einer Verstärkung der positiven Effekte des Cytokins, jedoch in Abwesenheit der Induktion von nicht gewünschten Cytokinen, insbesondere des IL-1, des TNF oder des IL-8.
Die Erfindung betrifft daher insbesondere eine Verbindung von mindestens einem Cytokin mit mindestens einem Muramyl-Peptid ausgewählt aus denjenigen, welche, wenn sie in vivo in Verbindung mit einem Interferon verabreicht werden, ebenfalls eine erhöhte Produktion in vivo eines Antagonisten IL-1 RA des Rezeptors des Interleukin I bewirken und, vorzugsweise, nicht eine Erhöhung der Cytokine IL-1, TNF und IL-8 induzieren.
Vorzugsweise verwendet man insbesondere diese Muramyl-Peptide die, ansprechend auf die oben erwähnten Bedingungen, ebenfalls, wenn sie mit einem Interferon verabreicht werden, eine verstärkte Synthese in vivo des IL-6 oder des G- CSF induzieren, oder vorzugsweise beide auf einmal.
Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verbindung eines Interferons (α, β oder γ) an solch ein Muramyl-Peptid. Die Interferone können ebenfalls ersetzt werden durch andere Cytokine, insbesondere durch diejenigen, welche oben beispielhaft aufgeführt wurden. In anderen Worten ergibt sich die Erfindung aus der Fähigkeit einiger Muramyl-Peptide, wenn sie verabreicht werden in Verbindung mit einem Cytokin:
- die biologische Aktivität des betreffenden Cytokins zu verstärken und so die gewünschten Effekte nach Verabreichungen von geringeren Dosierungen als diejenigen, welche augenblicklich als therapeutisch notwendig erachtet werden zu erhalten;
- nicht zu begünstigen und möglicherweise sogar zu hemmen die Induktion in vivo durch dieses Cytokin von limitierenden Faktoren, welche die Möglichkeiten der therapeutischen Anwendung begrenzen, wie es im Fall der Verbindung mit dem Interferon beobachtet wurde und, gegebenenfalls und gleichzeitig;
- die in situ Produktion zu induzieren, einerseits von Inhibitoren dieser limitierenden Faktoren, wie z. B. IL-1 RA und, besonders wenn das Cytokin ein Interferon ist, des löslichen Rezeptors des TNF (STNF-R) und, andererseits, die in situ-Sekretion seitens der kompetenten Zellen des lymphoiden Systems der Cytokine zu induzieren, wie beispielsweise IL-6 und G-CSF im Fall der Interferone, welche daher die Erweiterung des Wirkungsspektrums der Cytokine der verabreichten Verbindung erlauben.
Die Erfindung betrifft daher jegliche Verbindung aus einem oder mehreren Cytokinen und einem Muramyl-Peptid, ausgewählt aufgrund seiner Fähigkeit, beim Menschen die Sekretion von biologischen Signalstoffen seiner kompetenten Zellen wie IL-1 und/oder IL-8 und/oder TNF nicht zu induzieren, oder sogar zu inhibieren oder zumindest ihre Effekte zu inhibieren. Man weiß in der Tat, dass diese Signalstoffe wahrscheinlich eine große Rolle spielen bezüglich der Nebenwirkungen, welche an die Verabreichung von bestimmten Cytokinen gekoppelt sind. Die Fähigkeit des Muramyl-Peptids, die Wirkung des Cytokins zu verstärken und gleichzeitig den Empfänger zu schützen vor der Induktion von Cytokinen und anderen schädlichen Signalstoffen kann, in jedem einzelnen Fall, durch vergleichende in vivo-Studien verifiziert werden, vorzugsweise durchgeführt beim Menschen, durch Einwirken einerseits des ausgewählten Cytokins allein und,
andererseits, einer Verbindung dieses Cytokins mit dem ausgewählten Muramyl- Peptid, und den Nachweis und das Messen auf einer vergleichenden Basis (z. B. in RIA- oder ELISA- Messungen unter Verwendung von geeigneten Antikörpern) der untersuchten induzierten Cytokinraten. Die geeigneten Ergebnisse sind in nicht einschränkender Weise in den folgenden Beispielen illustriert, welche sich auf das Interferon α beziehen und weiter unten dargestellt sind.
Vorzugsweise sind die verwendeten Cytokine immer Cytokine menschlichen Ursprungs. Es wird darauf hingewiesen, dass dieser Ausdruck so verstanden werden soll, dass neben den natürlichen Cytokinen menschlichen Ursprungs (man kann die Schwierigkeiten nicht verkennen, welche ihre Isolierung in angemessenen Quantitäten verursacht) auch die entsprechenden Cytokine umfasst sind, welche durch Gentechnologie produziert werden, d. h. Cytokine, die dennoch durch Aminosäuresequenzen charakterisiert sind, welche identisch sind zu den Aminosäuresequenzen dieser natürlichen Cytokine, was jedoch äquivalente Aminosäuresequenzen nicht ausschließt, die sich von den vorhergehenden unterscheiden, insbesondere durch Substitution, Addition oder Deletionen von Aminosäuren, welche weder substantielle Modifikationen charakteristischer Eigenschaften der rekombinanten Cytokine mit "identischen Sequenzen", noch das Auftauchen von schädlichen Eigenschaften (z. B. Induktion von Antikörpern beim menschlichen Empfänger) verursachen.
Vorzugsweise sind die in der Erfindung verwendeten Muramyl-Peptide solche Muramyl-Peptide, die insbesondere ausgewählt sind aus denen, welche durch die allgemeine folgende Formel charakterisiert sind:
In welcher der Rest R ein Wasserstoff oder eine Methylgruppe ist, X eine L-Alanyl-, L-Leucyl-, L-Isoloeucyl-, L-Valyl-, L-Threonyl-, L-(N-Methyl)-Alanylgruppe ist und R&sub7; und R&sub8; unabhängig voneinander Hydroxylgruppen, Aminogruppen, O(CH&sub2;)xH- Gruppen sind, wobei x = 1, 2, 3, 4, oder 5 ist, oder peptidische Gruppen, umfassend 1 bis 3 Aminosäurereste, vorzugsweise linksdrehende. Eine Kategorie von bevorzugten Muramyl-Peptiden sind diejenigen, welche:
- R = CH&sub3;,
- X ist ein L-Alanyl- oder L-Threonylrest;
- R&sub7; ist die Gruppe O(CH&sub2;)x'H, mit x' = 1, 2, 3 oder 4,
- R&sub8; ist eine Aminogruppe oder eine O(CH&sub2;)x"H-Gruppe, mit x" = 1, 2, 3 oder 4.
Besonders bevorzugte Muramyl-Peptide bestehen aus dem Murametid (R = CH&sub3;, X = L-Ala, R&sub7; = OCH&sub3; und R&sub8; = NH&sub2;), dem Murabutid (R = CH&sub3;, X = L-Ala, R&sub7; = OnC&sub4;H&sub9; und R&sub8; = NH&sub2;) und schließlich aus dem Muradimetid (R = CH&sub3;, X = L-Ala, R&sub7; = R&sub8; = OCH&sub3;) und gegebenenfalls ihren Homologen, wobei der L-Alanylrest ihrer Peptidgruppe ersetzt ist durch einen Threonylrest.
Es versteht sich von selbst, dass die vorhergehenden Klassen von Muramyl- Peptiden mit hydrophilem Charakter in keinster Weise limitierend sind. Lipophile Muramyl-Peptide, sowie diejenigen, die in dem französischen Patent Nr. 8407340 beschrieben sind, können ebenfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Es versteht sich des weiteren von selbst, dass man auch alle anderen adjuvanten Muramylpeptide verwenden kann, welche Substituenten an den Positionen 1,4 oder 6 des Zuckerrests tragen, sobald sie die gleichen vorteilhaften Effekte aufweisen
wie die bevorzugten Muramylpeptide, welche weiter oben erwähnt sind.
Es wird weiterhin festgestellt, dass der Ausdruck "Verbindung/Assoziation" nicht beinhaltet, dass das Cytokin und das ausgewählte Muramylpeptid notwendigerweise einem menschlichen Empfänger als Mischung oder gleichzeitig verabreicht werden. Der Begriff bezieht sich auch auf jegliche Verwendung oder Präsentation umfassend ihre Anwendungen in Intervallen, die nicht Null sind, wobei nichtsdestotrotz diese Intervalle selbstverständlich kurz genug sein müssen, um die wechselseitigen Interaktionen der beiden Konstituenten der Verbindung unter Bedingungen wie erwähnt zu ermöglichen.
Diese Art der Verbindung aus Interleukinen und Muramylpeptiden ist wirkungsvoll, wenn die Interleukine in folgenden Dosierungen verabreicht werden:
- bezüglich des Interferons:
0,05 MU/kg/Tag bis 10 MU/kg/Tag und vorzugsweise 0,5 MU/kg/Tag bis 5 MU/kg/Tag mit einer optimalen Dosierung von 1 MU/kg/Tag bis 5 MU/kg/Tag. Es sei darauf hingewiesen, dass die spezifische Aktivität des verwendeten Interferons zwischen 4 und 8 UI/mg Protein ist.
- für das IL-2:
0,3 MU/kg/Tag bis 10 MU/kg/Tag vorzugsweise zwischen 1 MU/kg/Tag bis 2 MU/kg/Tag, unter der Voraussetzung, dass die spezifische Aktivität des IL-2, insbesondere desjenigen, welches von der Firma Cetus unter dem Namen Proleukin vertrieben wird, im Bereich von 10 Millionen UI pro mg Protein liegt.
- für das GM-CSF sind die bevorzugten Dosierungen zwischen 1 bis 25 ug pro kg und pro Tag und vorzugsweise zwischen 5 und 10 ug pro kg und pro Tag.
- die Muramylpeptide, insbesondere das Murabutid, welches verabreicht wird in Dosierungen im Bereich von 10 bis 350 ug pro kg pro Tag und vorzugsweise 50 bis 200 ug pro kg pro Tag; eine Dosierung von 100 ug pro kg pro Tag ist in jedem Falle verbunden mit der suboptimalen oder optimalen Dosierung des Cytokins.
Weitere Charakteristika der Erfindung werden noch in den nicht limitierenden Beispielen dargestellt, welche im folgenden beschrieben werden.
Im Verlauf klinischer Studien, ausgeführt an gesunden freiwilligen menschlichen Probanden, wurde Interferon α 2a (Interferon Roferon A, dosiert zu 3 MU/ml, vertrieben durch Röche unter der Handelsbezeichnung Roferon A) verabreicht in Verbindung mit Muramylpeptiden, im spezifischen mit Murametid und Murabutid. Es wurde gezeigt:
a) dass die Sekretion von Neoptrin, welches der anerkannte biologische Marker für eine immunstimulierende Aktivität des Interferons ist, sehr stark anstieg, auf Grund der Verabreichung von suboptimalen Dosierungen von Interferon, verbunden mit Dosierungen von Murabutid und Murametid; das gleiche gilt für den Antagonisten des Rezeptors des IL-1 (IL-1 RA) wobei das Interferon allein schwach die Synthese induziert, welche bei Zugabe von Muramylpeptiden beträchtlich erhöht ist, was eine synergistische Aktivität zwischen Interferon und den synthetischen Immunmodulatoren zeigt; dies gilt ebenfalls für den löslichen Rezeptor des TNF(STNF-R);
b) dass die Probanden, welche die Verbindung erhielten, eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Zellen der weißen Blutkörperchen aufweisen, verglichen mit der Gruppe, welche mit Interferon behandelt wurde;
c) dass in dem Plasma der Probanden welche mit der Verbindung behandelt wurden, Signalstoffe des Immunsystems auftauchen: Interleukin 6, G-CSF, wohingegen man keinerlei Induktion der pyrogenen und hauptsächlichen inflammatorischen Signalstoffe beobachten kann, im spezifischen der Cytokine IL-1, IL-SundTNF.
Diese Feststellungen basieren im spezifischen auf den Ergebnissen der Versuche die im Folgenden dargestellt sind:

Erste Versuchsserie

Subkutane Injektion von Gemischen aus Interferon α-IFN-α-2a mit Murabutid oder Murametid

Gesunde Probanden wurden einer Testserie unterzogen, um ihre Fähigkeit zu zeigen, an den Versuchen teilzunehmen. Sie erhalten auf subkutanem Weg die in der folgenden Tabelle 1 beschriebenen Mischungen von Murabutid (MUB) oder Murameiid (MOM) mit Interferon α 2a (IFN α).
Die Probanden werden während der drei auf die Verabreichung des Interferon und/oder des Muramylpeptids folgenden Tage überwacht und die Gesamtheit der Tests und Untersuchungen, welche für die Realisierung der Phase 1 notwendig sind, werden ausgeführt.

Im spezifischen werden die folgenden Untersuchungen ausgeführt

Hämatologische Analyse mit Zählen der weißen Blutkörperchen zum Zeitpunkt der Injektion und anschließend zu den Zeitpunkten 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 36 Stunden, 60 Stunden und 72 Stunden nach Injektion. Blutproben werden genommen vor der Injektion und 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Injektion, um das Serum zu gewinnen, um die Messungen von Neopterin, Interleukin 1, 6 und 8 G-CSF, IL-1 RA und TNF-α auszuführen.
Die Leukozytenzählungen werden ausgeführt in einem automatischen Zählgerät, dem COULTER COUNTER. Die Blutproben für die Messung im Serum werden direkt nach der Entnahme bei 4ºC und 3000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Die Seren werden bei -20ºC aufbewahrt. Die Leukocytenzählungen und die Messungen von Neopterin und der Cytokine werden mit Hilfe kommerziell erhältlicher Kits ausgeführt.

Ergebnis der Untersuchungen und der Tests

1. Nebenwirkungen

Die Nebenwirkungen, die im Verlauf der Versuche aufgezeichnet wurden (wie z. B. Migräne, Fieber und Gelenkschmerzen) hatten ein geringes Ausmaß. Im speziellen, wurden die Effekte des grippalen Symptoms, welche bei starken Dosierungen von Interferonen von 3 M und 6 M Einheiten beobachtet werden, nicht durch die Kombination mit den Muramyl-Peptiden erhöht, obwohl es eine starke Erhöhung der biologischen Aktivität des Interferons gibt und ein modifiziertes Profil dieser Aktivität mit Synthese von neuen biologischen Signalstoffen erscheint.

2. Leukozytenzählungen

Die Neutrophilen sind die Zellen, welche am meisten von den Leukopenie- Behandlungen beeinträchtigt werden. Die Verringerung der Konzentration der Neutrophilen ist verantwortlich für eine verringerte nicht-spezifische Immunabwehr bei den Probanden, welche der Radiotherapie oder einer cytotoxischen und/oder myelotoxischen Chemotherapie unterzogen wurden. Zur Vereinfachung wurden nur die Zahlenwerte der Neutrophilen angegeben, zu dem Zeitpunkt, an dem ihre Variation am stärksten ausgeprägt ist. Tabelle II Erhöhung der Anzahl der Neutrophilen bei den gesunden Probanden nach Verabreichung der Verbindung Muramyl-Peptid-IFNα
a: Höchste beobachtete Werte 24 h nach Verabreichung.
b: Durchschnitt ± Standardabweichung.

3. Messungen des Neopterins

Die Messungen werden ausgeführt in den entnommenen Seren zu den Zeitpunkten 0,24 h und 48 h. Ein RIA-Kit (Radio Immuno Assay) (Behring Diagnostic, Frankreich) wird verwendet. Die Ergebnisse werden in nanomol/ml angegeben, die Normalwerte variieren zwischen 4 bis 9 nanomol/ml. Tabelle III
Man sieht in dieser Tabelle, dass zum Zeitpunkt 0 alle Probanden normale Werte von Neopterin aufwiesen, dass die Probanden, welche lediglich ein Placebo erhielten, einen konstanten normalen Wert von Neopterin haben, und dass das Murametid oder das Murabutid bei einer Dosierung von 100 ug/Kg nicht in signifikanter Weise den Wert verändern.
Bei den geringsten Interferon-Dosen bewirkt die Verbindung mit den Muramyl- Peptiden eine signifikante Erhöhung des Wertes von Neopterin. Bei der höchsten Menge bewirkt die Verabreichung von Murabutid bei einer Konzentration von 100 ug/Kg sicherlich auch eine signifikante Erhöhung, welche jedoch viel schwächer ausfällt als diejenige, welche mit der Verbindung beobachtet wurde.

4. Messung des Antagonisten des Rezeptors von IL-1 (IL-1 RA)

Die Messungen, welche in den Seren der Probanden ausgeführt wurden, welche 10&sup6; Einheiten von Interferon α erhalten hatten, sind in der folgenden Tabelle (Tabelle 4) aufgeführt und man sieht einen sehr starken Effekt der Verbindung aus Muramyl-Peptid und Interferon (hier auch Kit British Biotechnology Products Ltd.) Tabelle IV Menge an Antagonist des Rezeptors von IL-1 (IL-1 RA) im Serum von gesunden Probanden, 6 Stunden nach Verabreichung von Muramyl-Peptid und Interferon α
+: bestimmt 6 Stunden nach Verabreichung der Zusammensetzung, die Werte vor Verabreichung waren alle geringer als 200 Pg/ml;
: durchschnittliche ± Standardabweichungen bei den sechs Probanden einer Gruppe;
*: Substantiell abweichende Werte von den Werten induziert allein durch das Interferon α (p < 0,05 - p < 0,005 im Test von Mann Whitney Rank)

5. Messungen des IL-6

Die Messung wird ausgeführt mit Hilfe eines Messungskits Elisa (British Biotechnology Products Ltd.) mit den zum Zeitpunkt 0 und nach 6 Stunden entnommenen Seren. Die Zahlen stellen pg/ml dar, die normalen Werte sind unter 6 pg. Tabelle V
: jede Gruppe umfasste sechs Probanden mit Ausnahme der Probanden für das Murametid, welche lediglich 4 waren;
+: Werte gemessen 6 Stunden nach Verabreichung; kein Wert wurde bestimmt vor der Verabreichung der nachgewiesenen Zusammensetzung;
S: mittlere ± Standardabweichung;
*: Substantiell abweichende Werte von den Werten induziert allein durch das Interferon α (p < 0,05 - p < 0,005 im Test von Mann Whitney Rank)
Man sieht in Tabelle V, dass alle untersuchten Mengen an Murabutid und Interferon in synergistischer Weise wirkten.

6. Messung des G-CSF

Diese Messungen wurden ausgeführt unter Verwendung des Kits von British Biology Products Ltd. (cf. Tabelle VI). Tabelle VI Menge an G-CSF im Serum von gesunden Probanden vor und 6 Stunden nach Verabreichung der Verbindung aus Muramyl-Peptid und Interferon α
*: jede Gruppe umfasste sechs Probanden mit Ausnahme der Probanden für das Murametid, welche lediglich 4 waren;
x: mittlere ± Standardabweichung;
*: Substantiell abweichende Werte von den Werten induziert allein durch das Interferon α (p < 0,05 - p < 0,005 im Test von Mann Whitney Rank)
in diesen Fällen stellt man ebenfalls eine synergistische Aktivität der Muramyl-Peptide und des Interferons fest bezüglich der Induktion des G- CSF.

7. Messungen des löslichen Rezeptors des TNF (STNF-R)

Diese Messungen werden ausgeführt mit einem ELISA Test in den Seren der Probanden, welche mindestens 6 M Einheiten von Interferon erhalten haben. Bei dieser Menge gibt es schon eine beträchtliche Erhöhung des Wertes an STNF-R, aber das Hinzufügen von Murabutid erlaubt eine signifikante Erhöhung der Sekretion dieses Mediators. Tabelle VII
*: Signifikant verschieden von den Werten induziert durch IFN-α allein (p = 0,005 Mann Whitney Rank Test)

8. Messungen des IL-1, IL-8, TNF α

Diese Messungen wurden unter den gleichen Bedingungen ausgeführt und keines der Cytokine konnte in den getesteten Seren nachgewiesen werden. Alle verwendeten Kits sind von British Biotechnology Ltd.

9) ZWEITE TESTREIHE

9.1 Zusammensetzung von IFN und MURABUTID

1) Verabreichung nur an den Menschen

Die Patienten, die an der Studie teilgenommen haben, wurden untersucht, um den Einfluss der verschiedenen Behandlungen auf das mögliche Auftreten der folgenden klinischen Anzeichen festzustellen: Kopfweh, Arthralgie- Myalgie, Fieber, Zittern, Asthenie, Übelkeit verbunden mit Erbrechen. Eine Zusammenfassung der gemachten Beobachtungen wird in Tabelle VIII gegeben. Tabelle VIII
a: Anzahl der Individuen mir Nebenwirkungen verglichen mit der Gesamtzahl der getesteten Individuen.
b: Durchschnittliche Intensität der Nebenwirkungen. Der Wert folgt den Regeln des CTC-NCI. Der Wert geht von 0 = keine Nebenwirkung bis 4 = Wirkungen, die die Verwendung des Medikaments bei der in Betracht gezogenen Indikation verbieten. Der Abstufungen 1 und 2 entsprechen unerwünschten aber Erträglichen Wirkungen.
In dieser Tabelle sieht man, dass die beobachteten Nebenwirkungen in allen Gruppen ungefähr vergleichbar sind. Die Gruppe, die lediglich 6 MU IFN erhalten hat zeigt eine durchschnittliche Rate im Bezug auf die Häufigkeit und die Intensität der Nebenwirkungen, die gleich ist wie oder höher ist als die Rate aller Gruppen, bei denen IFN-α und Murabutid zusammen gegeben wurden; im Hinblick auf gewisse Wirkungen, kann man besonders bei der Verbindung von IFN (6 MU) + Murabutid eine Abnahme der Häufigkeit und der Intensität der Nebenwirkungen beobachten.
Tabelle IX zeigt die biologischen Wirkungen, die sich in denselben Gruppen zeigten, wobei die Ergebnisse zeigen, dass die biologischen Wirkungen, die sich bei einer Verbindung von Murabutid oder Murametid mit Interferon a bei 1 MU zeigen mindestens den Ergebnissen entsprechen oder besser sind als die Ergebnisse, die mit Interferon α alleine bei einer Dosierung von 6 MU erzielt wurden. Tabelle IX
*: 6 Stunden nach der Injektion getestet
Δ: Zählungen durchgeführt 6 bis 12 Stunden nach der Injektion
Aus den Tabellen wird deshalb sehr klar, dass es durch die Erfindung möglich ist, bei den untersuchten Wirkungen von den synergistischen Wirkungen der Verbindung von Murabutid-Cytokinen zu profitieren und zwar ohne eine Erhöhung der Nebenwirkungen. Es muss festgestellt werden, dass die Verabreichung von 1 MU IFN in Verbindung mit Murabutid oder mit Murametid viel wirkungsvoller ist als die Verabreichung von 6 MU IFN alleine. Außerdem wird die Wirkung der 6 MU durch die Zugabe von Murabutid oder Murametid verstärkt, bei gleichzeitiger Verminderung der Nebenwirkungen.

2) Wiederholte Verabreichung beim Menschen

Tests der Phase I/IIa wurden bei 3 Gruppen von 6 gesunden Freiwilligen durchgeführt, die die folgenden Behandlungen an den Tagen 1, 3 und 5 erhielten:
a) IFN-α2a (1 MU) Roferon,
b) Murabutid 7 mg
c) Verbindung der beiden Immunstimulantien,
Diese Behandlungen waren sehr gut verträglich und bei den Patienten der Gruppe C wurde auch nach der dritten Injektion keine nennenswerte Nebenwirkung festgestellt.
Das therapeutische Potential der Behandlungen wurde ausgewertet:
a) durch Untersuchung der Nebenwirkungen
Durch Untersuchung ihres Einflusses auf die Zahl der zirkulierenden Neutrophilen. Die in der Tabelle X dargestellten Ergebnisse zeigen, dass es durch die Verbindung von Murabutid + IFN zu einer Erhöhung der Anzahl von Neutrophilen kam, die wesentlich stärker ist als die Erhöhung, die durch die alleinige Verabreichung der Immunstimulantien erreicht wird, und es ist interessant, dass dieses Phänomen nach der fünften Injektion genauso ausgeprägt ist, wie nach der dritten Injektion. Tabelle X
b) durch Analyse des Einflusses der verschiedenen Behandlungen auf die Induktion der Gene, die aufgrund ihrer Wichtigkeit bei der Manifestation der biologischen Aktivität von Interferon ausgewählt wurden. Diese ex vivo-Tests sind mit Zeilen aus zirkulierendem Blut der behandelten Patienten durchgeführt worden.
Folgende Genprodukte: PKR, MxA, 2-5 OAS, 9-27 und 15 Kd sind die Mediatoren der antitumoralen und antiviralen Aktivitäten von EFN, deshalb ist es wichtig zu bestätigen, dass durch die Verbindung von Murabutid mit IFN Induktionsspiegel erhalten werden können, die mindestens genauso hoch sind wie die, die bei IFN alleine beobachtet werden.
Die Analyse der mRNA-Produkte mittels der Zellen der Patienten der verschiedenen Gruppen wurde durch die Technik des "Northern Blot" und durch Hybridisierung mit spezifischen Nucleotidsonden gemäß Schreck et al 1992, Clin. Exp. Immunol. Bd. 90, S. 188-192 durchgeführt. Diese Studie bezog sich auf Zellen, die 4 Stunden nach den Behandlungen entnommen wurden, weil dies der früheste Zeitpunkt ist, um die Wirkung von IFN auf die Induktion der Gene zu beobachten, die auf IFN reagieren.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung von Murabutid-IFN bei der Aktivierung der untersuchten Gene mindestens genauso wirksam ist wie IFN alleine.
Alle in klinischen Versuchen erhaltenen Ergebnisse, bei denen die Verbindung von Murabutid-IFN mindesten 3 mal im Intervall von 2 Tagen verabreicht wurde, zeigen:
- dass die wiederholten Behandlungen genau so gut verträglich sind wie einmalige Verabreichungen,
- dass die biologische Aktivität der Verbindung sich nach der dritten Verabreichung im selben Maß zeigt wie nach der ersten, besonders im Bezug auf die Erhöhung der Anzahl der Neutrophilen und der Induktion der untersuchten Gene bei den antiviralen und antitumoralen Wirkungen.

3) In-vitro-Versuche bzg. des Einflusses der Verbindung Murabutid und IFN-α auf die Synthese der Mediatoren durch die menschlichen Monocyten

Blut, das gesunden Freiwilligen entnommen wurde, wurde in vitro inkubiert mit verschiedenen Kombinationen aus Murabutid und IFN-α. Murabutid wurde verwendet mit einer Dosierung von 20 ug/ml und IFN mit 30 bis 100 u/ml. Zu verschieden Zeiten während dieser Inkubation wurden Blutproben entnommen und mononucleäre Zellen mit einem Ficoll-Gradient aufgetrennt. Die gesamte RNA wird extrahiert, gereinigt und durch Elektrophorese aufgetrennt. Sie wird dann nach der Schreck-Methode analysiert, um durch Hybridisierungstechnik festzustellen, welche Gene durch die Behandlung induziert wurden. Die Technik hat es ermöglicht zu zeigen, dass sehr wichtige Cytokine produziert werden von Zellen, die beeinflusst werden von der Verbindung Murabutid-IFN-a, neben Cytokinen wie IL-1 RA, sTNFR2, IL-6 und G-CSF, deren Vorhandensein im Serum nachgewiesen werden kann. Die in Tabelle XI gezeigten, in vitro erhaltenen Ergebnisse bestätigen die Beobachtungen, die während der (weiter oben beschriebenen) in vivo bei gesunden Freiwilligen durchgeführten Versuche gemacht wurden, und zeigen die Anwesenheit von IL-1 RA, sTNFR2, IL-6 und G-CSF in den Seren.
Andere Cytokine, IFN-γ und IL-12, die eine sehr wichtige Rolle als interzelluläre Mediatoren spielen, können im Kreislauf nicht nachgewiesen werden aber Hybridisierungstechniken haben erhöhte Mengen ihrer entsprechenden RNAs gezeigt. Diese Cytokine sind an der Abwehr intrazellulärer Infektionen beteiligt. Tabelle XI

4) In-vivo-Versuche bei der Swiss-Maus, die die Aktivität der Verbindung von Murabutid-IFN in einem Modell des toxischen Schocks zeigen

Diese Versuche zeigen die Wirkung der Verbindung von Murabutid-IFN bei einem Modell des toxischen Schocks und, im Besonderen, die Schutzwirkung gegen den endotoxischen Schock und eine synergistische Aktivität des Interferons.
Die Verabreichung von D-Galactosamin mit Lipopolysaccharid (LPS) an Swiss-Mäuse bezweckt, innerhalb von 24-48 Stunden einen endotoxischen Schock mit mindestens einer 70%igen Sterblichkeit hervorzurufen. Die prophylaktische oder therapeutische Wirkung von Murabutid wurde an diesem Modell untersucht, um seine anti-inflammatorische Aktivität zu beurteilen wenn es alleine oder in Verbindung mit IFN-α/β verabreicht wird. Eine Vorbehandlung der Mäuse mit Murabutid oder mit Interferon-α/β hat beim Test mit der Mischung Galactosamin/LPS keine prophylaktische Wirkung (Tabelle XII) gezeigt. Im Gegensatz dazu induziert die Vorbehandlung mit einer Verbindung aus Murabutid und Interferon-α/β einen erheblichen Schutz mit einer Sterblichkeit von nur 33% (gegenüber 78% in den Kontrollen).
Die Verabreichung von Murabutid bei Mäusen 1 Stunde nach der Induzierung des endotoxischen Schocks hat eine bedeutende kurative Wirkung, die sehr viel besser ist als die Wirkung, die durch die Verabreichung von Interferon -α/β induziert wird. Andererseits zeigt die Behandlung mit einer Kombination von Murabutid und Interferon -α/β eine sehr starke synergistische therapeutische Wirkung mit nahezu 80% Schutz der Mäuse gegen Sterblichkeit aufgrund des endotoxischen Schocks. Tabelle XII Schutz gegen den endotoxischen Schock in einem Modell einer Galactosamin-Maus durch propylaktische oder therapeutische Verabreichung von Murabutid mit Interferon-α/β der Maus
1) Die Swiss-Mäuse wurden durch intraperitoneale Verabreichung getestet zur Zeit 0 mit 18 mg D-Galactosamin + 50 ng LPS. Die Sterblichkeit wurde nach 48 gemessen
2) Die Verbindungen werden intravenös verabreicht entweder 3 Stunden vor oder 1 Stunde nach dem Test.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Kombination von Interferon -α/β + Murabutid zu einer deutlichen Verringerung der Sterblichkeit bei den untersuchten Mäusen durch D-Galactosamin und LPS kommt, ob es sich nun um Prophylaxe (33% Sterblichkeit gegenüber 75% bis 81% bei Abwesenheit der Verbindung) handelt oder 12% Sterblichkeit bei der Therapie verglichen mit 30% bis 73% in Abwesenheit der Verbindung IFN--α/β + Murabutid.

9.2 Verbindung mit GM-CSF

Studien, die den oben beschriebenen ähneln, wurden durchgeführt, um die Verbindung Muraburtid-GM-CSF zu untersuchen. Diese Studien wurden in vitro an Zellen gesunder Freiwilliger nach Inkubation mit Immunmodulatoren allein oder in Verbindung durchgeführt.

a) Analyse bezüglich der RNA

Bei allen getesteten Spendern konnte eine Induktion der Synthese des Interferon-γ und der Synthese des IL-1RA beobachtet werden.

b) Analyse der Überstände

Bestimme Cytokine sind in den Überständen gesucht und gemessen worden (siehe Tabelle XIII). Diese Analyse bestätigt, dass große Mengen IL-1 RA unter dem Einfluss der Verbindung gebildet werden, was zeigt, dass Murabutid eine bessere Toleranz von GM-CSF erlauben dürfte, bei dem ein Teil der Nebenwirkungen mit entzündlichen Phänomenen verbunden ist.
Die in diesen Versuchen erzielten Ergebnisse zeigen deshalb, dass, wie im Fall von IFN, die Verbindung Murabutid-GM-CSF eine starke Induktion der Mediatoren erlaubt, die nicht vorhanden sind, wenn getrennt behandelt wird. Außerdem zeigt die Induzierung dieser Mediatoren, dass Murabutid zu einer Erhöhung der Toleranz bei der Verabreichung von GM-CSF führen muss. TABELLE XIII

9.3. Verbindung mit IL-2

1) In vivo-Versuche bei Mäusen unter Verwendung von Murametid

IL-2 hat bei metastatischen Nierenkarzinomen und malignen Melanomen starke therapeutische Wirkungen gezeigt. Seine Verwendung ist jedoch beschränkt durch seine stark toxische Wirkung, die ein Syndrom verursacht, das dem toxischen Schock ähnelt, der in 25% der Fälle tödlich enden kann.
Ein murines Modell ist bei der C3H/HeN-Maus entwickelt worden. KHT- Sarkomzellen werden venös verabreicht. Nach 4 Tagen und nach 6 Tagen werden sie wie folgt behandelt:
a) mit Murametid alleine,
b) mit IL-2,
c) mit einer Verbindung der beiden Immunomodulatoren,
d) eine vierte Gruppe wird nicht behandelt.
- Murametid in Verbindung mit Interleukin-2 als Behandlung in der Immuntherapie von disseminiertem Krebs:
Die Immuntherapie mit IL-2 hat sich in der Behandlung von metastatischen Karzinomen von Nierenzellen und malignen Melanomen als wirksam erwiesen. Trotz seiner Effizienz ist die Verabreichung von IL-2 von einer Reihe von sekundären Effekten vom septischen Typ begleitet, die die verabreichbaren Dosen begrenzen und seine Verwendung auf spezialisierte medizinische Zentren beschränkt haben. Wenn das Hilfspeptid des Murametids mit IL-2 verabreicht wird, reduziert es die Toxizität des IL-2 in den Tumor-befallenen Mäusen. Die Mäuse, die nur IL-2 erhalten, gruppieren sich zusammen und sind normalerweise inaktiv. In Überlebensstudien überleben die Mäuse, die eine Kombination aus IL-2 und Murametid erhalten, diejenigen, die IL-2 alleine erhalten. Obwohl Murametid allein keine Antitumorwirkung in der Maus, die mit Lungensarkommetastasen befallen ist, hat, ist die Kombination von IL-2 und Murametid effizienter als IL-2 allein. Diese vorläufigen Daten lassen vermuten, dass Murametid in Kombination mit IL-2 nützlich sein kann als Mittel zur Reduzierung der Toxizität in großen Behandlungsdosen mit IL-2.

2) In vitro-Versuche mit menschlichen Zellen unter Verwendung von Murabutid

In Versuchen, die mit Zellen von gesunden Freiwilligen durchgeführt wurden, hat sich gezeigt, dass die Verbindung IL-2 mit Murabutid es ermöglicht, einen sehr hohen Gehalt an für IFN-γ und IL-12 codierender RNA zu erhalten. Diese beiden Cytokine sind essentiell für die Antitumorwirkung. Man muss anmerken, dass keine TNF-Synthese stattfindet, dessen Produktion während der Behandlung mit IL-2 für einen großen Teil der Nebenwirkungen, vor allem der Kachexie, verantwortlich ist.
Die Ergebnisse in vivo und in vitro zusammen genommen zeigen deutlich, dass die Verbindung von Murabutid mit IL-2 eine bessere therapeutische Wirkung mit weniger gleichzeitigen Nebenwirkungen erzielt, weil geringere Dosen IL-2 nötig sind und weil Murametid oder Murabutid die toxische Wirkung von IL-2 verringern.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen also Folgendes:
A) Besonders in Bezug auf Interferon
a) Bei Dosen, für die es unmöglich ist, die Synthesemengen von Neopterin bedeutend zu verändern, wenn es allein verabreicht wird, werden durch die Verbindung von IFN α mit Murabutid oder Murametid wesentliche Mengen dieses Markers erhalten. Bei höheren IFN-Dosen bewirkt die Verbindung eine deutliche Erhöhung seines Gehalts. Da Neopterin als einer der Hauptmarker der Interferonaktivität auf dem Gebiet der menschlichen Makrophagen gilt, zeigen diese Ergebnisse also, dass die Wirkung von IFN α, die mit der Aktivierung diese Zellen verbunden ist, mit verringerten, gut tolerierten Dosen erzielt werden kann; eine ähnliche Bemerkung lässt sich für 1L-1 RA machen, bei dem sehr hohe Raten nach Verabreichung der Verbindung beobachtet werden. Man kann sogar beobachten, dass zwischen IFN und Murabutid oder Murametid eine synergistische Aktivität besteht, und dass eine dosierte Wirkung erhalten wird, da etwa eine Verdopplung des 1L-1 RA-Gehalts erhalten wird, wenn die IFN-Dosis verdoppelt wird. Die gleiche Beobachtung kann für SNF-R gemacht werden, das durch IFN allein induziert wird, aber in geringerem Maß im Vergleich mit dem Gehalt, der durch die Verbindung induziert wird.
b) Durch die Verbindung IFN mit dem Muramyl-Peptid können höhere Leukocytenzählungen erhalten werden als bei den Kontrollpersonen;
c) die Verbindung von Muramyl-Peptiden mit IFN α hat zudem die selektive Sezernierung von anderen Cytokinen oder Immunmediaroten hervorgerufen. Bei den Personen, die mit der Verbindung behandelt wurden, konnte nämlich festgestellt werden, dass wesentliche Unterschiede bestehen zwischen ihrem Serumgehalt an IL-6, G-CSF und STNF-R und denjenigen der Personen, die mit IFN allein oder Murabutid allein behandelt wurden. Jedoch wurde keine Erhöhung bei 1L-1, IL-8 oder TNF α beobachtet. Diese selektive Wirkung der Verbindung von Muramyl-Peptiden mit Interferon auf die Sekretion von Cytokinen ist völlig unerwartet und besonders interessant. Sie konnte, ausgehend von den bekannten Eigenschaften der beiden Bestandteile, wenn sie allein verabreicht werden, nicht vorhergesagt werden. Diese Entdeckung bietet sehr interessante Anwendungsmöglichkeiten.
B) G-CSF ist das Cytokin, das verantwortlich ist für die Differenzierung von Stammzellen hinsichtlich der Granulocytenlinie und ihre Regeneration nach myelotoxischer Behandlung und 11-6 ist auch sehr involviert in der Hämatopoese. So stellt die Möglichkeit, die Aktivität von exogenem IFN α mit den Aktivitäten von endogenen, durch dieses exogene IFN, das dem Wirt verabreicht wird, induzierten G-CSF und IL-6, zu kombinieren, einen wichtigen therapeutischen Fortschritt dar. Nämlich:
a) diese Verbindung findet unter Bedingungen mit minimaler sekundärer Wirkung statt; die nötigen IFN-Dosen sind nicht sehr hoch;
b) sie greift bei sehr viel physiologischeren Dosierungs- und Verfügungsbedingungen ein, als wenn man einen "Cocktail" entsprechender Cytokine verabreichen würde;
c) die fehlende Sekretion von TNF, IL-1 und IL-8 ist ein besonders vorteilhafter Punkt, umso mehr, da die Sekretion von STNF-R, das sich mit möglichen Mengen an TNF verbindet, seine Wirkung neutralisieren würde, wie das IL-1 RA im Fall einer aktiven Menge IL-1 machen würde. Die Gesamtheit dieser Tatsachen führt zu neuen therapeutischen Anwendungen in der Humanmedizin und zu einer Vergrößerung der bestehenden Anwendungsgebiete. Im Besonderen:
1. Alle Situationen, wo das therapeutische Interesse an IFN α von nun an deutlich gemacht werden kann. Insbesondere ermöglicht die Erfindung die Ausdehnung der Interferone in dieser Form von Verbindungen auf die Behandlung von Tumorerkrankungen, die bis heute kaum in Betracht gezogen wurde, vor allem aufgrund der zu großen Wichtigkeit bezüglich der Nebenwirkungen wie oben beschrieben. Hier kann man z. B. an das Kaposi- Sarkom, chronische myeloische Leukämie, verschiedene Karzinome, multiples Myelom, Melanome, verschiedene Leukämien und Lymphome denken. Durch den ausgeübten Stimulationseffekt bezüglich der Produktion therapeutisch nützlicher Cytokine ermöglicht die Erfindung, zumindest teilweise die komplexen biologischen physiologischen Systeme, die normalerweise bei der Erhaltung der Homöostase angewendet werden, dank der Interaktion ihrer Bestandteile mit anderen löslichen oder zellverbundenen Regulierungsfaktoren, wiederherzustellen.
2. Besonders bevorzugt in Situationen, die ein Defizit der spontanen Granulocytenlinien voraussetzen, wie im Fall von myelodisplasischen Syndromen, oder verursacht durch medikamentöse Behandlung, vor allem auf Basis von Cytokinen. Einer der großen Vorteile in der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung besteht in dem Schutz des Wirtes gegen eine Leukopenie-Wirkung der selben Cytokine, die allein verwendet werden, so dass cytotoxische Verbindungen, die das geeignete Cytokin bereitstellen, vor allem bei der Behandlung von Krebserkrankungen, infektiösen Erkrankungen oder Schwächen genetischer Ursache, verlängert werden können, bis ein sichererer Heilungseffekt erzielt werden kann. In anderen Worten, die Verbindung ermöglicht sowohl eine Verlangsamung der Erschöpfung als auch eine ausreichende Erholung des Granulocytensystems (bis hin zu einer Wiederherstellung des Knochenmarks), jedes Mal, wenn dieses durch cytotoxische Behandlung (Chemotherapie oder Krebsbestrahlung, Behandlung von AIDS durch AZT) und/oder Immunsuppressiva beeinträchtigt wird. Eine Verbindung kann auch in Situationen gemäß der Erfindung verwendet werden (Cytokin und Muramyl-Peptid), wo die verwendeten cytotoxischen Mittel von dem Cytokin der Verbindung verschieden sind, einhergehend mit der betreffenden cytotoxischen Behandlung, oder jedes Mal, wenn die Behandlung mit dem cytotoxischen Mittel unterbrochen ist, damit die Phagocyten und die Blutplättchen sich erholen können und eine Stimulation des Knochenmarks bewirkt wird. Schließlich eröffnet die Erfindung den Weg für eine schnellere Erholung des hämatopoetischen Systems bei Personen, deren Immunsystem vorher inhibiert oder sogar zerstört worden war, zum Beispiel um eine Transplantation von Knochenmark oder allgemeiner von allogenen Stoffen oder Organen zu ermöglichen.
Die Induktion des IL-6 erlaubt auch die Überlegung, dass die Verbindung/Assoziation einen Effekt auf die Megakariocytopoiese hat und daher auf die Regeneration der Blutplättchen. Dies wurde übrigens bei einigen der Probanden, welche während zwei Wochen beobachtet wurden, festgestellt, im Rahmen dieses antineutropenischen oder antileukopenischen Effekts bezieht sich die Erfindung ebenfalls auf Zusammensetzungen umfassend eine Verbindung eines Cytokins, z. B. das Interferon oder ein Interleukin, verbunden zum einen Teil mit dem GM-CSF und, zum anderen Teil, mit einem Muramylpeptid und insbesondere einem Murabutid; in der Tat hat, wie schon zuvor gesehen, das Cytokin einen therapeutischen Effekt beim Menschen bezüglich der Verringerung von Tumoren und einer viralen Infektion, aber unter all diesen Nebenwirkungen verursacht es in dem Patienten eine Neutropenie oder eine Leukopenie welche sehr schädlich ist. Das GM-CSF verursacht bei Verabreichung Nebenwirkungen des entzündlichen Typs, welche starke Auswirkungen auf den Patienten haben. Es hat jedoch ebenfalls einen antineutropenischen oder antileukopenischen Effekt durch Vergrößerung der Anzahl der Neutrophilen und der Leukophilen im Blut; wir haben gesehen, dass das Muramylpeptid, wie das Murabutid oder das Murametid, ebenfalls den neutropenischen oder leukopenischen Effekt der Cytokine repariert.
Die Verbindung aus GM-CSF, einem Cytokin, wie z. B. dem Interferon oder dem IL- 2, und dem Muramylpeptid ist daher eine Verbindung von drei Produkten: das Murabutid und das GM-CSF haben einen kumulativen regenerativen Effekt auf die Neutropenie und ermöglichen die Elimierung der Nebenwirkungen des GM-CSF, wenn es allein verabreicht wird.
c) Man beobachtet ebenfalls eine wichtige Produktion von IL-1 RA und von STNF-R in Abwesenheit der Sekretion von TNF, von IL-1 und von IL-8. Dies führt zu einer zweiten Art der Anwendung. Zum ersten führt dies zur Prävention und Behandlung des septischen Schocks, wobei IL-1 und TNF eine wesentliche Rolle spielen. Die anderen Indikationen sind all diejenigen, bei denen es nötig ist, Entzündungen zu behandeln, wie z. B. im Falle von rheumatoider Arthritis oder einiger Autoimmunkrankheiten oder Krankheiten welche bei Transplantationen von Knochenmark, von Geweben oder Organen, oder durch eine Reaktion auf Grund von Xenotransplantation auftritt.
D) Selbstverständlich ist die Verbindung auch nützlich zur Behandlung von viralen Krankheiten, wie z. B. der chronischen Hepatitis C oder B oder viraler respiratorischer Infektionen, wobei es sich hierbei um eine Behandlung handeln kann, welche das Cytokin direkt in seiner antiviralen Fähigkeit involviert (beispielsweise im Falle des Interferons) oder um eine Substitutionsbehandlung oder eingeschoben zwischen antiviralen Behandlungen, welche in unregelmäßigen Abständen unterbrochen werden müssen (z. B. die Inhibierung der viralen Vervielfältigung von HIV mit Hilfe von AZT oder anderer Nucleosidderivaten, welche ein vergleichbares antivirales Wirkungsspektrum haben).
Im Allgemeinen betrifft die Erfindung daher jegliche Verbindung entsprechend den unten aufgeführten Kriterien, umfassend gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ohne darauf eingeschränkt zu sein, sind diese Arzneimittel vorzugsweise zusammengesetzt aus Lösungen, welche parenteral verabreicht werden können, insbesondere subkutan, intravenös oder durch Infusion. Die Muramylpeptide können oral alleine verabreicht werden, oder in einer galenischen Form, in der sie geschützt sind (z. B., eingekapselt in Liposomenkapseln oder Microsphären, was eine Überwindung der gastrischen Schranke erlaubt. Das gleiche gilt für die verwendeten Cytokine, insbesondere die Interferone.
Im Fall der Verbindung Interferon mit Muramylpeptid liegen die bevorzugten Mengen an Interferon für eine Injektion im Bereich von 5 : 10&sup4; bis 5 : 10&sup6; (0,05 M bis 5 M) IE und die Mengen an Muramylpeptid, insbesondere an Murametid und Murabutid, liegen im Bereich von 10 ug bis 250 ug/kg. Was den Fall der Verbindung GM-CSF mit Muramylpeptiden betrifft, liegen bevorzugte Mengen im Bereich von 1 bis 25 ug/kg GM-CSF und 10 ug bis 250 ug/kg Muramylpeptide.
Es ist selbstverständlich, dass die oben genannten Mengen lediglich die Erfindung erläutern. Selbstverständlich obliegt es dem Kliniker zu bestimmen, welche Mengen den einzelnen Bestandteilen der Verbindung zuzuordnen sind, abhängig vom Zustand des Patienten und von der Beeinträchtigung, an der er leidet.
Die Erfindung betrifft auch die Verbindung mit IL-2, welche anerkannte antitumorale Aktivitäten besitzt, im Speziellen bezüglich Metastasen des renalen Karzinoms oder anderer Krebsarten, wobei deren therapeutischer Index sehr schwach ist. Die bevorzugten Mengen für eine Injektion befinden sich in dem Bereich von 1-10 Millionen Einheiten pro Kilogramm pro Tag an IL- 2 in Verbindung mit 10 ug bis 250 ug/kg von Muramylpeptiden.
Als weitere Beispiele umfasst die Erfindung auch die Verbindung mit einem schon beschriebenen Muramylpeptid, IL-6 IFNγ und/oder mit einem Faktor TGFβ ("transforming growth factor") oder "transformierender Wachstumsfaktor"). Man schreibt ihm eine wichtige Bedeutung in der negativen Regulation der Immunglobuline der Klasse IgE zu, welche verantwortlich sind für allergische Phänomene. Unter "negativer Regulation" wird eine Reduktion der Produktion der Immunglobuline der IgE Klasse verstanden, verglichen mit der Produktion anderer Immunglobuline, insbesondere der IgA und IgG. Die Verabreichung der Verbindung einer oder mehrerer dieser Cytokine in Verbindung mit einem Muramylpeptid erlaubt eine Modulation des Profils der synthetisierten Immunglobuline mit Hilfe der Zellen des Immunsystems, dergestalt, dass die Produktion von IgG und IgA im Vergleich zu der von IgE favorisiert ist, oder sogar zu Lasten dieser. Dieses Ergebnis zeigt die Möglichkeit, die Verbindung gemäß der Erfindung zur Behandlung von Allergien in einer Therapie zu verwenden. Die Mengen jedes Bestandteils der Verbindung, insbesondere wenn es sich darum handelt, sie über parenteralen Weg zu verabreichen, sind im Folgenden dargestellt für etwa 10 ug bis 250 ug/kg Muramylpeptid:
- von 0,05 M bis 10 M IE an Interferon γ pro kg und pro Tag, vorzugsweise 0,5 M IE/Kilogramm pro Tag bis 5 IE/kg pro Tag, besonders bevorzugt von 1 M IE/Tag bis 5 M IE/Tag
- von 0,5 ug bis 100 ug/kg TGF β, und/oder
- von 0,1 ug bis 25 ug/kg IL-6.
Es ist weiterhin selbstverständlich, dass die folgenden Ansprüche nur ihre Wirkung entfalten können bezüglich Zusammensetzungen, welche mit dem ausgewählten Cytokin ein Molekül des Muramylpeptidtyps zusammenbringen, welches wiederum verwendbar ist in der Humanmedizin, oder ein Molekül, welches die wesentlichen biologischen Eigenschaften des selben aufweist. Es seien beispielshaft die folgenden Produkte erwähnt:
- Nac Mur-L-Thr-D-isoGln-sn glyceryl dipalmitoyl
- NAc-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2-(1',2'dipalmitoyl)-sn-glycéro-3'- phosphorylethylamid (MTP-PE);
- N&sub2; (Nac-Mur-L-Ala-D-isoGln)-N&sub6;-stearoyl-L-Lysin (Muroctasine) oder MDP-Lys (L18);
- Nac-glucosaminyl-Nac-Mur-L-Ala-D-isoGln-L-Ala-Glyceryldipalmitat (DTP- GDP) oder Nac-glucosaminyl-Nac-Mur-L-Thr-D-iso-Gln-L-Ala-Glyceryldipalmitat;
- Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln;
- Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol
- Nac-Mur-D-Thr-D-isoGln-1,2,dipalmitoyl-sn-glycerol
- die Analoga des MDP in welchen die zweite Aminosäure, das Glutamin, ersetzt ist durch ein Norleucin, und welche keine pyrogene Aktivität aufweisen;
- die Derivate oder Analoga (erhältlich durch Fraktionierung oder besser durch Synthese) der Bakterienprodukte, welche ausreichend entgiftet sind und insbesondere von pyrogenen Produkten befreit sind. Zu diesen Produkten gehören die Endotoxine, insbesondere Monomere oder Peptidoglycane, welche in der Lage sind, die immunologisch kompetenten Zellen zu aktivieren und Cytokine beim Menschen zu induzieren.

Claims

1. Therapeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein natürliches oder rekombinantes menschliches Cytokin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Interferon, einem CSF und einen Interleukin in Verbindung mit mindestens einem hydrophilen Muramylpeptid, welches folgende Formel aufweist:

in welcher R eine Methylgruppe ist:

X eine L-Alanyl- oder L-Threonylgruppe darstellt;

R&sup7; ein Rest O(CH&sub2;)x'H ist, wobei X' = 1, 2, 3 oder 4, und

R&sup8; eine Aminogruppe oder ein Rest O(CH&sub2;)x"H ist, wobei X" = 1, 2, 3 oder 4.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Muramylpeptid in vivo eine Steigerung der Synthese von IL-6 oder von GM-CSF oder von beiden verursacht.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei

R eine Methylgruppe ist;

X eine L-Alanyl- oder L-Threonylgruppe ist;

R&sup7; ein O(CH&sub2;)x'-Rest ist, wobei X' = 1, 2, 3 oder 4; und

R&sup8; eine Aminogruppe oder ein Rest O(CH&sub2;)x", ist, wobei X" = 1, 2, 3 oder 4.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Muramylpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend als dem Murameiid, dem Murabutid und seinen Homologen und wobei ein L-Threonylrest durch einen L-Alanylrest der Muramylpeptidgruppe ersetzt ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das menschliche Cytokin Interferon-β ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das menschliche Cytokin Interferon-α ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das menschliche Cytokin ein CSF ist.

8. Zusammenseizung nach Anspruch 7, wobei CSF GM-CSF ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Muramylpeptid ausgewählt ist aus denjenigen, in denen der Rest R&sup7; OC&sub4;H&sub9; oder O-CH&sub3; ist, und denjenigen, in denen der Rest R&sup8; NH&sub2; oder O-CH&sub3; ist.

10. Zusammenseizung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Muramylpeptid dasjenige ist, in dem der Rest R&sup7; OC&sub4;H&sub9; und der Resi R&sup8; NH&sub2; ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Muramylpeptid dasjenige ist, in dem der Rest R&sup7; O-CH&sub3; und der Rest R&sup8; O-CH&sub3; ist.

12. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, Infektionen, Krankheiten oder genetischen Defekten.

13. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion des granulocytären. Systems bei einem Patienten.

14. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur schnellen Wiederherstellung des hämatopoetischen Systems bei einem Patenten mit beeinträchtigtem Immunsystem.

15. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Anspüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von viralen Erkrankungen.

16. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder zur Behandlung des septischen Schocks.

17. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder zur Vorbeugung von entzündlichen Prozessen.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das Cytokin GM- CSF oder IL-2 ist.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18 zur Herstellung eines Medikaments, welches die Verabreichung von 10 bis 350 ug/kg/Tag Muramylpeptid erlaubt.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18 zur Herstellung eines Medikaments, welches die Verabreichung von 50 bis 200 ug/kg/Tag Muramylpeptid erlaubt.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments, welches die Verabreichung von 0.05 bis 5 ng/kg/Tag des Cytokins Interferon erlaubt.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments, welches die Verabreichung von 3 bis 10 MU/kg/Tag des Cyiokins IL-2 erlaubt.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments. welches die Verabreichung von 5 bis 10 ug/kg/Tag des Cytokins GM-CSF erlaubt.