DE69806003T2

DE69806003T2 - Dna polymerasen, die verbesserte fähigkeiten zum einbau markierter nukleotide besitzen

Info

Publication number: DE69806003T2
Application number: DE69806003T
Authority: DE
Inventors: Curtis Bloom; John Brandis; Jack Richards
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2018-03-13
Also published as: EP2202312A2; EP2202312B1; AU743025B2; DE69841023D1; US20100311959A1; EP2202312A3; CA2283789C; US6265193B1; EP0983364B1; EP2208789A1; WO1998040496A1; US7897738B2; US20020164591A1; US20110244548A1; CA2283789A1; EP2208789B1; DE69806003D1; JP2000510344A; JP2003144143A; US20060088879A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft DNA-Polymerasen mit Mutationen, die die Fähigkeit des Enzyms zum Einbau markierter Nukleotide in ein Polynukleotidmolekül verändert.

Hintergrund

DNA-Poiymerasen sind Enzyme, die die Bildung Von DNA-Molekülen aus Desoxynukleotidtriphosphaten unter Verwendung eines Matrizen-DNA-Strangs und eines komplementären Synthese-Primers, der an einen Teil der Matrize angelagert ist, synthetisieren. Eine detaillierte Beschreibung von DNA-Polymerasen und ihre enzymologische Charakterisierung kann in Kornberg, DNA Replication, 2. Auflage, W. H. Freeman (1989), gefunden werden.
DNA-Polymerasen besitzen eine Vielzahl von Verwendungen in molekularbiologischen Techniken, die sowohl für Forschungs- als auch für klinische Zwecke geeignet sind. Unter diesen Techniken stechen die DNA-Sequenzierung und Nukleinsäure- Amplifikationstechniken wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) hervor.
Die Aminosäuresequenz vieler DNA-Polymerasen wurde bestimmt. Durch Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen DNA-Polymerasen wurden viele Bereiche der Homologie zwischen den verschiedenen Enzymen identifiziert. Röntgenstrahlen- Beugungsuntersuchungen haben die tertiären Strukturen des Klenow-Fragments, der T7- DNA-Polymerase und der Taq-DNA-Polymerase bestimmt. Untersuchungen der tertiären Strukturen von DNA-Polymerasen und Sequenzvergleiche der Aminosäure haben zahlreiche strukturelle Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen DNA-Polymerasen offengelegt. Im Allgemeinen weisen DNA-Polymerasen einen großen Spalt auf, von dem man annimmt, dass er die Bindung der Duplex-DNA bewerkstelligt. Diese Spalte wird durch zwei Sätze von Helices gebildet, wobei der erste Satz als der "Finger"-Bereich und der zweite Satz der Helices als "Daumen"-Bereich bezeichnet wird. Der Boden der Spalte wird durch antiparallele β-Strukturen gebildet und als "Handflächen"-Bereich bezeichnet. Übersichtsartikel über die Struktur der DNA-Polymerase können in Joyce und Steitz, Ann. Rev. Biochem. 63: 777-822 (1994), gefunden werden. Computerlesbare Dateien, die die dreidimensionale Struktur einiger DNA-Polymerasen beschreiben, wurden öffentlich verbreitet.
Fluoreszenzmarkierte Nukleotide haben die Nützlichkeit vieler Verfahren in der Molekularbiologie stark vereinfacht und verbessert. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden zur Markierung von Polynukleotiden in Syntheseverfahren hat die Verwendung radioaktiver Markierung zum größten Teil ersetzt. Fluoreszenzmarkierte Nukleotide wurden in der DNA-Sequenzierung, vgl. Smith et al., Nature 321: 674-679 (1986), in der PCR und anderen Formen der Polynukleotid- Fragmentanalyse verwendet.
Ein Hauptproblem bei der Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden besteht in der Fähigkeit der DNA-Polymerase, gegen den Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden zu diskriminieren. Die Erfinder haben z. B. entdeckt, dass die Taq-DNA- Polymerase in Kompetitions-Assays zwischen einem TET-(6-Carboxy-4,7,2',7'- tetrachlorfluorescein) markierten 2'3'-Didesoxynukleotid und dem entsprechenden nichtmarkierten Didesoxynukleotid das unmarkierte Didesoxynukleotid wenigstens 85 Mal häufiger als das entsprechende nicht-markierte Nukleotid in DNA einbaut. Diese Diskriminierung zwischen markierten und nicht-markierten Nukleotiden hat weitgehende Auswirkungen auf Verfahren, bei denen DNA-Polymerasen zur Markierung der DNA verwendet werden. So müssen z. B. in Sequenzierungsreaktionen viel größere Mengen an fluoreszenzmarkiertem Nukleotid verwendet werden. Diese große Menge an fluoreszenzmarkiertem Nukleotid ist teuer und kann außerdem eine exzessive Hintergrundfluoreszenz hervorrufen, wodurch die Ausbeute an Sequenzinformation vermindert wird.
Angesichts der Probleme, die aus der Fähigkeit der DNA-Polymerasen entstehen, den Einbau fluoreszenzmarkierter Nukleotide zu benachteiligen, haben die Erfinder einige neuartige DNA-Polymerasen entwickelt, die gegenüber dem Einbau eines oder mehrerer fluoreszenzmarkierter Nukleotide in DNA eine verminderte Diskriminierung aufweisen.

Zusammenfassung

Natürlich auftretende DNA-Polymerasen bauen bevorzugt nicht-markierte Nukleotide gegenüber entsprechenden fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in Polynukleotide ein. Diese Fähigkeit von DNA-Polymerasen, gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu diskriminieren, hat unerwünschte Auswirkungen auf viele Verfahren der Molekularbiologie, die die enzymatische Addition von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden erfordern, z. B. die markierte Didesoxy-Terminatorsequenzierung. Die vorliegende Erfindung betrifft mutante DNA- Polymerasen, welche eine verminderte Diskriminierung gegen den Einbau fluoreszenzmarkierter Nukleotide in Polynukleotide aufweisen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Polymerasen weisen wenigstens eine Mutation des Enzyms im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung auf, so dass die Mutation zu einer verminderten Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide führt, wobei wenigstens eine Mutation an einer Position vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus R660 und E681 in der Taq-DNA-Polymerase ausgewählt ist oder in analogen Aminosäureresten in anderen DNA-Polymerasen. Der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer DNA-Polymerase wird durch Teile (i) der O-Helix, (ii) der K-Helix und (iii) der Zwischen-O-P-helikalen Schleife der Taq-DNA-Polymerase oder analogen Positionen in anderen DNA-Polymerasen gebildet. Aminosäurereste innerhalb des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung, die durch TET (II)·ddC definiert sind, sind E520, A531, L522, R523, E524, A525, H526, P527, 1528, V529, E530, K531, 1532, R536, E537, R573, Q582, N583, V586, R587, P589, Q592, R593, R595, D610, T612, Q613, E615, R636, D637, T640, F647, V654, D655, P656, L657, R659, R660, T664, E681, L682, A683, 1684, P685, E688, F692, Q754, H784, L817, E820, L828, K831 und E832. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zur Verwendung mit Fluorescein-Farbstoffen ist eine Mutation an der Position 681 anwesend, wodurch ein E (Glutaminsäure) zu M (Methionin) umgewandelt wird, d. h. E681M. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können Fluorescein-Fluorescein-Energietransfer-Farbstoffe verwendet werden. Zusätzlich zur Bereitstellung von mutanten Taq-DNA-Polymerasen mit einer verminderten Diskriminierung gegen markierte Nukleotide, beinhaltet die Erfindung Mutanten, die von einer großen Vielzahl von DNA-Polymerasen abgeleitet sind, sowohl thermostabil als auch andere.
Zusätzlich zur Bereitstellung neuer mutanter DNA-Polymerasen stellt die Erfindung auch Polynukleotide bereit, die für die jeweiligen mutanten DNA-Polymerasen kodieren. Die bereitgestellten Polynukleotide können Expressionsvektoren für die rekombinante Herstellung der mutanten Polymerasen umfassen. Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die die betreffenden Polymerase-Polynukleotide enthalten.
Die Erfindung beinhaltet auch zahlreiche Verfahren zur Verwendung der betreffenden DNA- Polymerasen. Diese Verfahren beinhalten die Synthese eines fluoreszenzmarkierten Polynukleotids durch eine Polynukleotid-Synthesereaktion, die von einer mutanten DNA- Polymerase katalysiert wird, welche gegenüber dem Einbau markierter Nukleotide in Polynukleotide eine verringerte Diskriminierung aufweist. Die Verfahren der Polynukleotid- Synthese schließen den Schritt der Verlängerung einer "geprimten" Polynukleotid-Matrize mit wenigstens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid ein, wobei die Verlängerung durch eine DNA-Polymerase katalysiert wird, die beim Einbau markierter Nukleotide in Polynukleotide eine verringerte Diskriminierung aufweist. Die Verfahren der Synthese eines fluoreszenzmarkierten Polynukleotids können in einer Vielzahl von Verfahren wie Sanger- Sequenzierung und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Kits zur Synthese von fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden mit den erfindungsgemäßen Verfahren. Kits der Erfindung umfassen eine mutante erfindungsgemäße DNA-Polymerase und ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid, welches im Hinblick auf die mutante DNA-Polymerase im Kit eine verminderte Diskriminierung aufweist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Computermodell einer DNA, die an Taq-DNA-Polymerase gebunden ist.
Aminosäurereste, die die Stelle der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung bilden, sind orange dargestellt. Der Rest der Polymerase ist in grün dargestellt. Die Matrize ist blau gezeigt. Der Färberest des markierten Nukleotids ist rot. Der Rest des markierten Nukleotids ist weiß.
Fig. 2 ist ein Plot eines Assays für den "next nucleotide effect".
Fig. 3 ist ein Plot eines Assays des "next nucleotide effect".
Fig. 4 ist eine Darstellung der Struktur des fluoreszenzmarkierten Nukleotids "TET(II)·ddCTP".

Ausführliche Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung

Terminologie

Positionen von Aminosäureresten innerhalb einer DNA-Polymerase werden entweder durch Zahlen oder durch Kombinationen aus Zahlen/Buchstaben angegeben. Die Nummerierung beginnt an dem Rest am Aminoterminus. Der Buchstabe entspricht dem Einbuchstaben- Aminosäurencode für den Aminosäurerest an der angezeigten Position im natürlich vorkommenden Enzym, von dem die Mutante abgeleitet ist. Solange nicht anders gezeigt, soll eine Bezeichnung der Aminosäurerest-Position so aufgefasst werden, dass sie sich in allen DNA-Polymerasen auf die analoge Position bezieht, auch wenn der Einbuchstaben- Aminosäurencode sich spezifisch auf den Aminosäurerest an der angezeigten Position in der Taq-DNA-Polymerase bezieht.
Individuelle Substitutionsmutationen werden durch eine Kombination aus Buchstabe/Zahl/Buchstabe angezeigt. Die Buchstaben sind der Einbuchstabencode für Aminosäurereste. Die Zahlen zeigen die Aminosäurerest-Position des Mutationsortes an. Die Nummerierung beginnt am Rest am Aminoterminus. Die Nummerierung der Reste in der Taq-DNA-Polymerase entspricht der, die in der US-PS Nr. 5,079,352 (Gelfand) beschrieben ist. Homologie in der Aminosäuresequenz zwischen verschiedenen DNA-Polymerasen ermöglicht es, dass entsprechende Positionen für andere DNA-Polymerasen als die Taq- Polymerase zu Aminosäureresten zugeordnet werden können. Solange nicht anders angegeben, bezieht sich eine gegebene Zahl auf die Position in der Taq-DNA-Polymerase. Der erste Buchstabe, d. h., der Buchstabe links von der Zahl, stellt den Aminosäurerest an der angezeigten Position in dem nicht mutierten Enzym dar. Der zweite Buchstabe stellt den Aminosäurerest in der gleichen Position im mutanten Enzym dar. Der Begriff "R660D" zeigt zum Beispiel, dass das Arginin an Position 660 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt wurde.
Der hier verwendete Begriff "Diskriminierung" bezieht sich auf die Eigenschaft einer DNA- Polymerase, unmarkierte Nukleotide gegenüber entsprechend fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bevorzugt in DNA einzubauen, d. h., die DNA-Polymerase diskriminiert das fluoreszenzmarkierte Nukleotid. Der vorzugsweise Einbau kann in einem Assay gemessen werden, indem ein fluoreszenzmarkiertes 2'3'-Didesoxynukleotid und ein entsprechendes, nicht-markiertes 2'3'-Didesoxynukleotid um den Einbau in die gleiche Stelle eines Polynukleotids konkurrieren. Ein Beispiel eines solchen Assays kann nachstehend in Beispiel 2 gefunden werden.
Der hier verwendete Begriff "verminderte Diskriminierung" bezieht sich auf eine Verminderung der Diskriminierung gegen den Einbau eines fluoreszenzmarkierten Nukleotids in einer mutanten Polymerase verglichen zum Eltern-Enzym. Eine Reduktion der Diskriminierung kann quantitativ durch Bezug auf die Selektivitäts-Assays in Beispiel 2 oder durch Bezug auf andere Assays beschrieben werden, die eine Messung der gleichen Eigenschaften der Polymerase bereitstellen. Eine durch die Selektivitäts-Assays gemessene Selektivitätszahl ist eine Reduktion der Diskriminierung und kann als ein Verhältnis von Selektivitätszahlen ausgedrückt werden. Eine mutante DNA-Polymerase mit einer Selektivitätszahl von 8 würde z. B. verglichen mit einer parentalen DNA-Polymerase, die eine Selektivitätszahl von 80 aufweist, eine um 10fach verminderte Diskriminierung besitzen.
Der Begriff "parental" oder "parentales Enzym" wird dazu verwendet, eine mutante DNA- Polymerase von der DNA-Polymerase zu unterscheiden, von der das mutante Enzym abgeleitet wurde. Somit kann jede natürlich auftretende DNA-Polymerase als ein parentales Enzym bezeichnet werden. Eine erste DNA-Polymerase, die Mutationen im Hinblick auf ein natürlich auftretendes Enzym aufweist, wird ebenfalls als ein parentales Enzym bezeichnet im Hinblick auf eine zweite DNA-Polymerase, die zusätzliche Mutationen trägt.
Der Begriff "die Diskriminierung vermindernde Mutationen" bezieht sich auf Mutationen im Bereich der Wechselwirkung einer DNA-Polymerase mit der Nukleotidmarkierung, die zu einer verminderten Diskriminierung gegen den Einbau fluoreszenzmarkierter Nukleotide führt. Dieser Begriff wird dazu verwendet, Mutationen in einer DNA-Polymerase zu unterscheiden, einschließlich Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung, die die Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide nicht vermindern von solchen Mutationen, die die Diskriminierung vermindern.
Der hier verwendete Begriff "Nukleotid" wird, wenn nicht anders angegeben, dazu verwendet, sich sowohl auf natürlich vorkommende Nukleotide als auch auf eine Vielzahl von Analoga, einschließlich 2'3'-Didesoxynukleotide, zu beziehen.
Der Begriff "Fluorescein-Farbstoffe" bezieht sich auf eine Klasse von Xanthen-Farbstoff- Molekülen, die das folgende fusionierte Drei-Ring-System beinhalten:
wobei an jeder Position des Desoxyrings eine große Vielzahl von Substitutionen möglich ist. Eine besonders bevorzugte Unterklasse der Fluorescein-Farbstoffe schließen die 4,7- Dichlorfluoresceine (Menchen) ein. Beispiele von Fluorescein-Farbstoffen, die als Fluoreszenzmarkierungen in DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet werden, beinhalten 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), 6-Carboxy-4,7,2',7'- tetrachlorfluorescein (TET), 6-Carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorfluorescein (HEX), 5-(und 6-) Carboxy-4',5'-dichlor-2'7'-dimethoxyfluorescein (JOE) und 5-Carboxy-2',4',5',7'- tetrachlorfluorescein (ZOE). Häufig wird nach der Abkürzung eines bestimmten Farbstoffs die Bezeichnung -1 oder -2 angehängt, z. B. HEX-1. Die "-1"- und "-2"- (oder "I" und "II") Bezeichnungen zeigen das bestimmte verwendete Farbstoff-Isomer an. Die 1- und 2- Isomere werden durch die Elutionsreihenfolge (wobei das 1-Isomer als erstes eluiert wird) von freiem Farbstoff in einem Reverse-Phase-chromatographischen Auftrennungssystem definiert, indem eine C-8-Säule und ein Elutionsgradient von 15% Acetonitril/85% 0,1 M Triethylammoniumacetat gegen 35% Acetonitril/65% 0,1 M Triethylammoniumacetat verwendet werden.
Der Begriff "Alkynylamino-Typ-Linker" bezieht sich auf einen Alkynylamino-Linker der Art wie beschrieben in den US-PSen Nr. 5,047,519 (Hobbs), 5,151,507 (Hobbs) und US- Patentanmeldung Nr. 08/696,808, eingereicht am 13. August 1996. Zusätzliche Alkynylamino-Linker sind in der US-Patentanmeldung Nr. 08/833,855, eingereicht am 10. April 1997, beschrieben.
Der Begriff "TET(II)·ddCTP" bezieht sich auf ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid mit der in Fig. 4 gezeigten Struktur.
Der Begriff "Fluoreszenz-Energietransfer-Farbstoff' bezieht sich auf Farbstoffreste, die durch einen Linker verbunden sind, der zwischen den beiden Farbstoffresten den Fluoreszenz-Energietransfer ermöglicht. Zur Verwendung in der Ketten- Terminationssequenzierung ist der Linker ausreichend klein und besitzt eine geeignete Form und Orientierung, damit eine DNA-Polymerase ein Nukleotidtriphosphat, das mit dem interessierenden Farbstoff markiert ist, einbauen kann. Beispiele von Energietransfer- Farbstoffen können in der EP-Anmeldung Nr. 0 805 140, in der US-Patentanmeldung Nr. 08/642,330 (eingereicht am 3. Mai 1996) und in der US-Patentanmeldung Nr. 08/726,462 (eingereicht am 4. Oktober 1996) gefunden werden.
Der hier verwendete Begriff "Mutation" bezieht sich auf eine Veränderung eines Aminosäurerests an einer spezifischen Stelle eines Proteins. Die Veränderung des Aminosäurerests ist eine Veränderung, die im Hinblick auf ein natürlich auftretendes Protein definiert wird. Ein Protein mit einer Mutation kann als ein "mutantes" Protein bezeichnet werden.

Ausführungsformen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Polymerasen mit Mutationen, die die Fähigkeit der Polymerase verringern, den Einbau von mit Fluorescein-Farbstoff markierten Nukleotiden in Polynukleotide zu diskriminieren, wobei wenigstens eine Mutation an einer Position vorliegt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R660 und E681 in der Taq-DNA-Polymerase oder in analogen Aminosäureresten in anderen DNA-Polymerasen. Diese Mutationen befinden sich in einem Bereich der DNA-Polymerase, der hier als Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung bezeichnet wird. Der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung wird durch Teile dreier Bereiche der DNA- Polymerase gebildet. Diese drei Bereiche sind lokalisiert in (i) der O-Helix, (ii) der K-Helix und (iii) der Inter-O-P-helikalen Schleife der Taq-DNA-Polymerase oder analogen Positionen in anderen DNA-Polymerasen. DNA-Polymerasen mit verminderter Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide sind insbesondere nützlich für Kettenabbruch-DNA- Sequenzierung mit 2'3'-Didesoxynukleotiden, d. h., für Sanger-Sequenzierung.
Enzymkinetische Experimente (in Beispielen 2 und 3 beschrieben), die mit Taq-DNA- Polymerase und fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden durchgeführt wurden, unterstützen eine Theorie, dass die Taq-DNA-Polymerase und andere DNA-Polymerasen nach Bindung von Nukleotiden während der DNA-Synthese eine Veränderung in der Konformation eingehen. Diese vorhergesagte Veränderung der Konformation legt einen Satz von Aminosäureresten nahe, die mit Fluoreszenz-Markierungen wechselwirken, die durch einen Linker an der Nukleinsäurebase eines Nukleotids verbunden sind, was zu einer Diskriminierung gegen Nukleotide führt, die fluoreszenzmarkiert sind. Dieser Satz von Aminosäureresten bildet den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung. Das spezifische molekulare Modell für die Bindung fluoreszenzmarkierter Nukleotide an einer DNA-Polymerase, das von den Anmeldern vorgeschlagen wird, wird dazu verwendet, Aminosäurereste vorherzusagen, die den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer gegebenen DNA-Polymerase bilden. Das Modell der Anmelder einer Veränderung der Konformation der DNA-Polymerase während der DNA-Synthese wird als eine Erklärung angeboten, wie der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung bestimmt wurde. Das Modell bietet Anleitung bei der Erzeugung von Mutationen in DNA-Polymerase, die die Fähigkeit einer DNA-Polymerase vermindern, den Einbau fluoreszenzmarkierter Nukleotide in Polynukleotide zu diskriminieren. Fig. 1 ist ein Computermodell, das zeigt, wie DNA und Taq-DNA-Polymerase im Modell wechselwirken.
Ob der wahre Mechanismus der DNA-Polymerase-Nukleotid-Wechselwirkung der gleiche oder ein anderer als in dem Modell ist oder nicht, das dazu verwendet wurde, die Parameter des Bereichs der Nukleotidmarkierungs-Wechselwirkung zu bestimmen, sagt Nichts über die Durchführbarkeit der hier beschriebenen Erfindung aus.
Die erfindungsgemäßen mutanten DNA-Polymerasen zeigen eine verminderte Diskriminierung gegen Nukleotide, die mit einem Fluorescein-Farbstoff markiert sind. In anderen Worten enthalten die erfindungsgemäßen mutanten DNA-Polymerasen wenigstens eine Mutation, die die Fähigkeit der Polymerase erhöht, ein mit einem Fluorescein-Farbstoff markiertes Nukleotid verglichen zum entsprechenden nicht-markierten Nukleotid einzubauen. Zusätzlich zur verminderten Diskriminierung gegen Nukleotide, die mit Fluorescein-Farbstoffen markiert sind, können die erfindungsgemäßen mutanten DNA- Polymerasen auch eine verminderte Diskriminierung gegen Nukleotide zeigen, die mit anderen Fluoreszenz-Farbstoffen als Fluorescein-Farbstoffe markiert sind, als auch verminderte Diskriminierung gegen andere nachweisbare Reste. Die fluoreszenzmarkierten Nukleotide, für die eine bestimmte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mutanten DNA-Polymerasen verminderte Diskriminierung zeigt, kann sich in Abhängigkeit der jeweiligen Fluoreszenzmarkierung, des Linkers, der zur Anheftung der Fluoreszenzmarkierung an das Nukleotid verwendet wurde, der Stelle der Anheftung des Linkers auf der Fluoreszenzmarkierung der spezifisch ausgewählten Nukleotidbase und der Stelle der Anheftung des Linkers auf dem Nukleotid variieren. Das genaue Ausmaß der Verminderung der Diskriminierung gegen ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid wird gemäß der spezifischen Mutation oder Mutationen, die in die DNA-Polymerase eingebracht wurden, variieren. Das genaue Ausmaß der Reduktion der Diskriminierung variiert auch gemäß dem spezifisch untersuchten fluoreszenzmarkierten Nukleotid, z. B. Variationen in der Base, Farbstoff oder Linker. Erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerasen können von einer kleinen Verminderung der Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide bis zu einer kompletten Auslöschung der Diskriminierung alles aufweisen, d. h., das mutante Enzym unterscheidet sich nicht signifikant im Hinblick auf die Rate des Einbaus markierter oder nicht-markierter Nukleotide. Es wird bevorzugt, Ausführungsformen der mutanten DNA- Polymerase zu verwenden, die eine wenigstens zweifache Reduktion der Diskriminierung gegen eines oder mehrere Fluorescein-Farbstoff-markierte Nukleotide aufweisen.
Für Fachleute in der Molekularbiologie ist offensichtlich, dass der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer gegebenen DNA-Polymerase im Hinblick auf ein spezifisch fluoreszenzmarkiertes Nukleotid definiert ist. Veränderungen in einem oder mehreren der folgenden Parameter der Struktur eines fluoreszenzmarkierten Nukleotids können die Identität der Aminosäurereste, die die Stelle der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer gegebenen DNA-Polymerase bilden, verändern: (1) Identität der Base, (2) Ort der Anheftung auf der Nukleotidbase, (3) Identität des Linkers, der die Base an den Fluoreszenz-Farbstoff koppelt und (4) Identität des Fluoreszenz-Farbstoffs. Der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung von Taq, definiert im Hinblick auf TET(II)·ddCTP umfasst die Aminosäurereste E520, A531, L522, R523, E524, A525, H526, P527, 1528, V529, E530, K531, 1532, R536, E537, R573, Q582, N583, V586, R587, P589, 0592, R593, R595, D610, T612, Q613, E615, R636, D637, T640, F647, V654, D655, P656, L657, R659, R660, T664, E681, L682, A683, 1684, P685, E688, F692, Q754, H784, L817, E820, L828, K831 und E832. Die Stellen bei R660 und E681 sind Stellen für den Einbau von Mutationen. Da die dreidimensionale Struktur der Taq-DNA-Polymerase (und von anderen DNA-Polymerasen) gut bekannt ist und da die dreidimensionale von TET(II)·ddCTP mit einem gewissen Grad von Sicherheit verstanden wird, kann der Ort der Aminosäurereste, die den Bereich der Wechselwirkung des markierten Nukleotids im Hinblick auf TET(II)·ddCTP darstellen, in einen anderen Satz von Aminosäureresten übersetzt werden, um strukturelle Unterschiede zwischen TET(II)·ddCTP und anderen fluoreszenzmarkierten Nukleotiden anzupassen, um die Wechselwirkungsstelle des markierten Nukleotids im Hinblick auf diese andere Nukleotide zu definieren. Eine Erhöhung der Länge des Linkers zwischen der Base und der Fluoreszenzmarkierung und der Base kann z. B. die Identität von Aminosäureresten, die die Stelle der Wechselwirkung mit dem markierten Nukleotid bilden, vorhersehbar ändern, obwohl die Base, die Basen-Anheftungsstelle und der Fluoreszenz- Farbstoff die gleichen sind. In vielen Ausführungsformen der Polymerasen wird sich der Satz von Aminosäureresten, die die Wechselwirkungsstelle des markierten Nukleotids im Hinblick auf ein gegebenes fluoreszenzmarkiertes Nukleotid bilden, sich mit einem Satz von Aminosäureresten überlappen, die die Stelle der Wechselwirkung des markierten Nukleotids bilden, definiert im Hinblick auf ein zweites fluoreszenzmarkiertes Nukleotid.
Ausführungsformen der Erfindung beinhalten mutante DNA-Polymerasen mit verminderter Diskriminierung gegen Nukleotide, die mit Fluorescein-Farbstoffen markiert sind, wobei der Fluorescein-Farbstoff durch einen Alkynylamino-Linker an die Nukleotidbase gekoppelt ist. Der Fluorescein-Farbstoff kann ein Fluroeszenz-Energietransfer-Farbstoff sein, umfassend als ein Bestandteil des Energietransfer-Farbstoffs einen Fluorescein-Farbstoff. Zusätzlich zur verminderten Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierte Nukleotide, die einen Alkynylamino-Linker umfassen, können die erfindungsgemäßen mutanten DNA- Polymerasen auch verminderte Diskriminierung gegen Nukleotide zeigen, die andere Linkerarten umfassen. Zur Minimierung sterischer Interferenz zwischen dem Polynukleotid und der Fluoreszenzmarkierung werden Purine gewöhnlich an Position 7 und Pyrimidine gewöhnlich an Position 5 markiert.
Erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerasen weisen eine oder mehrere diskriminierungsreduzierende Mutationen an Aminosäurerest-Positionen innerhalb des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer gegebenen DNA- Polymerase auf, wobei wenigstens eine Mutation an einer Position vorliegt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R660 und E681 in Taq-DNA-Polymerase oder analogen Aminosäureresten in anderen DNA-Polymerasen. Mutationen, die die Diskriminierung vermindern, sind gewöhnlich Substitutionsmutationen, obwohl dies nicht notwendig ist. Einige unterschiedliche Aminosäurereste können an gegebenen Positionen von parentalen Enzymen substituiert werden, um eine die Diskriminierung vermindernde Mutation entstehen zu lassen. Die Aminosäurereste an einer gegebenen Rest-Position innerhalb des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung können systematisch variiert werden, um zu bestimmen, welche Aminosäure-Substitutionen zur Verminderung der Diskriminierung gegen das interessierende, mit einem Fluorescein-Farbstoff markierte Nukleotid führen und das Ausmaß einer solchen Verminderung der Diskriminierung. Das Ausmaß, in dem eine bestimmte Mutation (oder ein Satz von Mutationen) die Diskriminierung vermindert, kann durch einen wie im Beispiel 2 beschriebenen Selektivitäts-Assay gemessen werden. Die Substitutionsmutation ist vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise eine Mutation, die die Größe der Aminosäurerest-Seitenkette der Aminosäurereste, die in der parentalen DNA- Polymerase anwesend sind, vermindert. Mutationen sind vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise konservativ, um den spezifischen polaren oder nicht-polaren Charakter des Aminosäurerests an der analogen Position im parentalen Molekül aufrecht zu erhalten. Die Mutationen in dem Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung einer DNA- Polymerase führen vorzugsweise zu einer Substitution des Aminosäurerests des parentalen Enzyms mit dem Aminosäurerest an der entsprechenden Position der Phagen-T7-DNA- Polymerase (unter der Voraussetzung, dass ein Unterschied zwischen den Aminosäureresten an dieser Position in der T7-Polymerase und dem parentalen Enzym vorliegt).
Mutationen, die die Diskriminierung verhindern, befinden sich im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung der DNA-Polymerasen. Der Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung wird durch Teile dreier Bereiche der DNA- Polymerase gebildet. Diese drei Bereiche sind in (i) der O-Helix, (ii) der K-Helix und (iii) der Inter-O-P-helikalen Schleife der Taq-DNA-Polymerase oder analogen Positionen in anderen DNA-Polymerasen lokalisiert. Positionen in der Taq-DNA-Polymerase, die den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung bilden, sind die Positionen E520, A531, L522, R523, E524, A525, H526, P527, 1528, V529, E530, K531, 1532, R536, E537, R573, Q582, N583, V586, R587, P589, Q592, R593, R595, D610, T612, Q613, E615, R636, D637, T640, F647, V654, D655, P656, L657, R659, R660, T664, E681, L682, A683, 1684, P685, E688, F692, Q754, H784, L817, E820, L828, K831 und E832. Analoge Positionen in anderen DNA- Polymerasen als Taq bilden ebenfalls eine Nukleotidmarkierungs-Wechselwirkungsregion. Eine besonders bevorzugte Position für Mutationen ist E681, wobei die bevorzugte Substitution an der Position 681 M ist. Andere geeignete Substitutionsmutationen bei E681 sind wie folgt (aufgelistet in der Reihenfolge absteigender Präferenz, außer dort, wo ein Gleichheitszeichen angenäherte Äquivalenz anzeigt):
M> I> W> L> V> P> H=K=G=T=S> D=A=N> Y=C. Eine bevorzugte Substitutionsmutation an Position R660 ist R660D.
Die spezifischen Aminosäurereste, die den Nukleotid-Wechselwirkungsbereich bilden, werden sich gemäß der bestimmten DNA-Polymerase unterscheiden, die als parentales Enzym zur Einbringung von Mutationen, die die Diskriminierung vermindern, ausgewählt wurde. Die Bestimmung analoger Aminosäurerest-Positionen zwischen verschiedenen DNA- Polymerasen kann durch den Fachmann leicht durchgeführt werden, aufgrund der großen Anzahl von Aminosäuresequenzen von DNA-Polymerasen, die bestimmt wurden und anhand der vielen Bereiche der Homologie, die zwischen diesen verschiedenen DNA- Polymerasen gefunden wurden. Eine große Zusammenstellung der Aminosäuresequenzen von DNA-Polymerasen aus einem großen Bereich von Organismen und Homologieabgleiche zwischen den Sequenzen können in Braithwaite und Ito, Nucl. Acids Res. 21 (4): 787-802 (1993), gefunden werden. Beispiele von Aminosäureresten innerhalb des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung der Phage T7-Polymerase und der E. coli- DNA-Polymerase sind in Tabelle 1 bereitgestellt. Zusätzlich zur Bereitstellung von mutanten DNA-Polymerasen mit verminderter Diskriminierung für Fluorescein-Farbstoffe in Taq, T7- und E. coli-DNA-Polymerase I stellt die Erfindung mutante DNA-Polymerasen aus vielen anderen Organismen bereit. Im Allgemeinen kann die Lehre der Erfindung dazu verwendet werden, mutante DNA-Polymerasen mit verminderter Diskriminierung für Fluorescein- Farbstoffe aus jeder DNA-Polymerase herzustellen, die mit der Taq-DNA-Polymerase eine ausreichende Homologie der Aminosäuresequenz aufweist, um es einem gewöhnlichen Fachmann möglich zu machen, eine oder mehrere Aminosäure-Position in der DNA- Polymerase zu identifizieren, die zu den Positionen R660 und E681 in der Taq-DNA- Polymerase analog sind. Parentale DNA-Polymerasen, die modifiziert werden können, um diskriminierungsreduzierende Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung zu enthalten, beinhalten DNA-Polymerasen von Organismen wie Thermus flavus, Pyrococcus furiosus, Thermotoga neapolitana, Thermococcus litoralis, Sulfolobus solfataricus, Thermatoga maritima, E. coli Phage T5 und E. coli Phage T, sind aber nicht darauf beschränkt. Die DNA-Polymerasen können thermostabil oder nicht thermostabil sein. Es ist offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung es den Fachleuten ermöglicht, in DNA-Poiymerasen aus einer Vielzahl von Organismen Mutationen einzubringen, die die Diskriminierung gegenüber Fluorescein-Farbstoff reduzieren, einschließlich DNA-Polymerasen, die zur Zeit der Anmeldung dieser bereitgestellten Anmeldung noch nicht isoliert wurden. Zusätzlich beinhalten Ausführungsformen der Erfindung einige aufgereinigte natürlich vorkommende DNA-Polymerasen, die das erwünschte niedrige Ausmaß an Diskriminierung gegen fluoreszenzmarkierfe Nukleotide aufweisen. Solche natürlich auftretenden DNA-Polymerasen sind zu den hier explizit beschriebenen mutanten DNA-Polymerasen strukturell und funktionell analog.
Die Aminosäurereste, die in einer gegebenen DNA-Polymerase den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung darstellen, variieren gemäß dem spezifisch fluoreszenzmarkierten Nukleotid, das dazu verwendet wird, den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung zu definieren. In ähnlicher Weise können die Mutationen, die zur Reduktion der Diskriminierung führen, gemäß dem spezifisch fluoreszenzmarkierten Nukleotid variieren, das zur Definition des Bereichs der Wechselwirkung mit dem markierten Nukleotid verwendet wird. Zusätzlich kann das Ausmaß an Verminderung der Diskriminierung, das durch die Mutation (oder Mutationen) in der Stelle der Wechselwirkung mit dem markierten Nukleotid erzielt wurde mit dem spezifisch interessierenden markierten Nukleotid variieren. E681 M ist z. B. die bevorzugte, die Diskriminierung verringernde Mutation in Taq im Hinblick auf TET(II)·ddCTP, die zu einer 47fachen Verminderung der Diskriminierung und zu einer signifikant geringeren Reduzierung der Diskriminierung gegen ein zweites fluoreszenzmarkiertes Nukleotid führt. Umgekehrt kann eine E681T-Mutation zu einem hohen Spiegel an Reduktion der Diskriminierung gegen das zweite fluoreszenzmarkierte Nukleotid und nur zu einem geringen Spiegel an Reduktion der Diskriminierung gegen TET(II)·ddCTP führen.
Unter der Voraussetzung, dass eine erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase eine die Diskriminierung reduzierende Mutation im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung aufweist, die für ein spezifisch fluoreszenzmarkiertes Nukleotid zu einem signifikanten Ausmaß an Verminderung der Diskriminierung führt und die gegen ein anderes fluoreszenzmarkiertes Nukleotid zu wenig oder keiner Verminderung des Ausmaßes der Reduktion der Diskriminierung führt (unter der Annahme, dass die parentale DNA-Polymerase gegen dieses fluoreszenzmarkierte Nukleotid eine signifikante Diskriminierung zeigt), dann kann man behaupten, dass eine gegebene mutante DNA- Polymerase im Hinblick auf ein oder mehrere fluoreszenzmarkierte Nukleotide "empfänglich" ist. Eine spezifische mutante DNA-Polymerase wird im Hinblick auf ein spezifisches fluoreszenzmarkiertes Nukleotid als empfänglich bezeichnet, wenn eine die Diskriminierung vermindernde Mutation in dem Nukleotidmarkierungs-Wechselwirkungsbereich des spezifischen interessierenden Enzyms zu einer wenigstens 5fachen Verminderung der Diskriminierung gegen dieses gegebene, fluoreszenzmarkierte Nukleotid führt. Eine erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase kann im Hinblick auf mehr als ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid empfänglich sein. Umgekehrt kann auch ein spezifisch fluoreszenzmarkiertes Nukleotid "empfänglich" im Hinblick auf eine gegebene erfindungsgemäße DNA-Polymerase sein.
In Ausführungsformen der mutanten DNA-Polymerasen, die im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung mehr als eine Mutation umfassen, die die Diskriminierung reduziert, kann die Mutationsstelle im gleichen oder in einem unterschiedlichen Bereich der drei Bereiche einer Polymerase vorliegen, die den Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung bilden. Allgemein werden erfindungsgemäße mutante DNA- Polymerasen eine, zwei oder drei die Diskriminierung reduzierende Mutationen besitzen. Die Erfindung stellt jedoch auch mutante DNA-Polymerasen mit mehr als drei Mutationen, die die Diskriminierung vermindern, bereit. Durch Verbindung mehrerer die Diskriminierung reduzierende Mutationen können größere Spiegel an Reduktion bei der Diskriminierung markierter Nukleotide erreicht werden. In vielen Ausführungsformen der Erfindung weisen die mutanten DNA-Polymerasen jedoch verminderte Diskriminierung gegenüber markierten Nukleotiden auf, die identisch oder niedriger als die Spiegel von DNA-Polymerasen mit einzelnen die Diskriminierung reduzierenden Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung sind. Bevorzugte Kombinationen von Mutationen in einem Hintergrund einer Taq-DNA-Polymerase sind R660D, E681 G und F667Y, d. h., eine Taq- DNA-Polymerase-Mutante (R660D, E681 G und F667Y).
Verschiedene Ausführungsformen der DNA-Polymerase mit Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung unterscheiden sich im Hinblick auf das Ausmaß der Verminderung der Diskriminierung gegenüber spezifischen fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Diese Unterschiede können in einem Assay gemessen werden, um zu bestimmen, welche spezifischen Ausführungsformen das größte Ausmaß an Reduzierung in der Diskriminierung gegen die · jeweiligen interessierenden fluoreszenzmarkierten Nukleotide aufweisen. Im Allgemeinen messen solche Assays die Kompetition zwischen einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid und einem unmarkierten Nukleotid um den Einbau in die gleiche Stelle auf einer geprimten Matrize. Ein Beispiel eines solchen Assays (hier als "Selektivitäts-Assay" bezeichnet) wird nachstehend in Beispiel 2 ausführlich beschrieben.
Die erfindungsgemäßen mutanten DNA-Polymerasen können zusätzlich zu Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung, die die Diskriminierung vermindern, zusätzlich zahlreiche Mutationen umfassen. Diese sekundären Mutationen können entweder innerhalb oder außerhalb des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung vorliegen. Sekundäre Mutationen können so ausgewählt werden, dass sie der mutanten DNA-Polymerase eine nützliche Eigenschaft verleihen. Zusätzliche Mutationen können z. B. eingebracht werden, um Thermostabilität zu erhöhen/zu verringern, um die Verarbeitung zu erhöhen/zu vermindern, um die 3'-5-Exonuklease-Aktivität zu verringern/ zu steigern, um die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität zu senken/ zu steigern und um den Einbau von Didesoxynukleotiden zu steigern. Alternativ können die sekundären Mutationen in ihrem Effekt auch wesentlich neutral sein.
Von besonderem Interesse sind Ausführungsformen der mutanten DNA-Polymerase, die eine oder mehrere sekundäre Mutationen umfassen, die die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität vermindern. DNA-Polymerasen, die einen Mangel in der 3-5'-Exonuklease-Aktivität aufweisen, besitzen überlegene Eigenschaften für die PCR und für die Kettenabbruch- Polynukleotidsequenzierung. Mutationen, die die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität in DNA- Polymerase reduzieren, sind dem normalen Fachmann gut bekannt. Ausführliche Anleitung zur Einführung von Mutationen, die die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität verringern, kann unter anderem in den US-PSen Nr. 4,795,699 (Tabor), 5,541,099, 5,489,523 und Bernad et al., CeII 59: 219-288 (1989), gefunden werden. Beispiele solcher Mutationen in der Taq-DNA- Polymerase schließen G46D ein. Hinsichtlich Ausführungsformen der mutanten DNA- Polymerasen, die zur Sequenzierung verwendet werden, wird bevorzugt, eine G46D (oder analoge Mutation in anderen DNA-Polymerasen neben Taq) zusätzlich zu Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung mit aufzunehmen.
Ebenfalls von Interesse bei den sekundären Mutationen in den DNA-Polymerase-Mutanten sind Mutationen, die den Einbau von Didesoxynukleotiden steigern, d. h. die die Fähigkeit einer DNA-Polymerase, Didesoxynukleotide gegenüber Desoxynukleotiden zu diskriminieren, vermindert. Anleitung zur Herstellung von solchen Mutationen kann z. B. in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 96/12042 (Anmeldenummer PCT/US95/12928) gefunden werden. Von besonderem Interesse ist die Mutation F667Y in Taq und analoge Mutation in einer anderen DNA-Polymerase. Während F667Y kein Teil des Bereichs der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung in der Taq-DNA-Polymerase hinsichtlich TET(II)·ddLTP ist, können F667Y-Mutationen die Diskriminierung gegen Fluorescein- Farbstoff-markierte Nukleotide (vgl. Tabelle 1) vermindern. Demgemäss kann es für die Verwendung in bestimmten Verfahren, z. B. DNA-Sequenzierung, wünschenswert sein, eine F667Y-Mutation mit einer oder mehreren die Diskriminierung reduzierenden Mutationen im Bereich der Wechselwirkung mit der Nukleotidmarkierung zu kombinieren, um die Diskriminierung der Polymerase zwischen Desoxynukleotiden und 2'3'-Didesoxynukleotiden zu verringern. Mutante DNA-Polymerasen der Erfindung, die die F667Y-Mutation (oder ein Äquivalent davon) tragen, sind insbesondere nützlich bei der Sanger-DNA-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten 2'3'-Didesoxynukleotid-Kettenterminatoren.
Zahlreiche Gene, die für DNA-Polymerasen kodieren, wurden isoliert und sequenziert. Diese Sequenzinformation ist auf öffentlich zugänglichen DNA-Sequenz-Datenbanken wie GenBank erhältlich. Eine große Zusammenstellung der Aminosäuresequenzen von DNA- Polymerasen einer weiten Spanne von Organismen kann in Braithwaite und Ito, Nucl. Acids Res. 21(4): 787-802 (1993), gefunden werden. Diese Information kann bei der Ausgestaltung verschiedener erfindungsgemäßer Ausführungsformen von DNA-Polymerasen und von Polynukleotiden, die für diese Enzyme kodieren, verwendet werden. Die öffentlich erhältliche Sequenzinformation kann auch dazu verwendet werden, Gene zu klonieren, die für DNA- Polymerasen kodieren, durch Techniken wie ein Screening einer genetischen Bibliothek mit Hybridisierungssonden.
Andere Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotidsequenzen, die die hier bereitgestellten mutanten DNA-Polymerasen kodieren. Polynukleotidsequenzen, die für die mutanten erfindungsgemäßen DNA-Polymerasen kodieren, können für die rekombinante Produktion der mutanten DNA-Polymerasen verwendet werden. Polynukleotidsequenzen, die für mutante DNA-Polymerasen mit verminderter Diskriminierung gegenüber fluoreszenzmarkierten Nukleotiden kodieren, können anhand einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Polynukleotidsequenzen, die für mutante DNA-Polymerasen mit verminderter, Diskriminierung gegenüber fluoreszenzmarkierten Nukleotiden kodieren, besteht in der Verwendung orts-gerichteter Mutagenese zur Einführung erwünschter, die Diskriminierung reduzierender Mutationen in Polynukleotide, die die parentalen DNA-Polymerasemoleküle kodieren. Orts-gerichtete Mutagenesetechniken sind im Stand der Technik gut bekannt, wie beispielhaft dargestellt wird durch die US-PSen 4,711,848, 4,873,192, 5,071,743, 5,284,760, 5,354,670, 5,556,747; Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982), und Edelmann et al., DNA 2 : 183 (1983). Ausführliche Protokolle für die orts-gerichtete Mutagenese werden auch in vielen allgemeinen Molekularbiologie-Lehrbüchern wie Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (neueste Auflage) beschrieben. Zusätzlich beschreiben auch viele Lehrbücher über PCR (die Polymerase-Kettenreaktion) wie Diefenbach und Dveksler, PCR Primer A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1995), Verfahren zur Verwendung von PCR zur Einbringung direkter Mutationen. Gene, die für parentale DNA-Polymerase kodieren, können anhand konventioneller Klonierungstechniken in Verbindung mit öffentlich erhältlicher Sequenzinformation isoliert werden. Alternativ dazu wurden viele klonierte Polynukleotidsequenzen, die für DNA-Polymerasen kodieren, in öffentlich zugänglichen Sammelstellen hinterlegt, z. B. ist die American Type Culture Collection, Hinterlegungsnummer ATCC 40336 ein Phagenklon einer Taq-DNA-Polymerase.
Zusätzlich zur Herstellung der Polynukleotide, die für mutante DNA-Polymerase kodieren, durch Einbringung direkter Mutationen in Polynukleotide, die für parentale DNA- Polymerasen kodieren, ist es auch möglich (wenn auch schwierig), erfindungsgemäße Polynukleotide hauptsächlich durch in vitro-DNA-Synthesetechniken herzustellen. In vitro DNA-Synthesetechniken sind den Fachleuten gut bekannt und Beispiele der in vitro DNA- Synthese können in den US-PSen 5,252,530, 4,973,679, 5,153,319, 4,668,777, 4,500,707, 5,132,418, 4,415,732, 4,458,066 und 4,811,218 aufgefunden werden. Bei der Herstellung der jeweiligen Polynukleotidmoleküle durch in vitro DNA-Synthese werden üblicherweise zuerst kleinere Moleküle synthetisiert und danach durch Hybridisierung und Ligation nachfolgend verbunden. Polynukleotide, die für mutante DNA-Polymerase kodieren, können auch durch eine Kombination von in vitro Synthese und orts-gerichteter Mutagenese klonierter Gene hergestellt werden.
Polynukleotide, die für erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase kodieren, können zur rekombinanten Expression der mutanten DNA-Polymerasen verwendet werden. Im Allgemeinen wird die rekombinante Expression der mutanten DNA-Polymerase durch Einbringen einer mutanten DNA-Polymerase in einen Expressionsvektor ausgeübt, der zur Verwendung in einer bestimmten Art von Wirtszelle adaptiert ist. Somit besteht ein anderer Aspekt der Erfindung in der Bereitstellung von Expressionsvektoren, die ein Polynukleotid umfassen, das für eine erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase kodiert, so dass das die Polymerase kodierende Polynukleotid funktionell in den Expressionsvektor inseriert ist.
Die Erfindung stellt auch Wirtszellen bereit, die die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren umfassen. Wirtszellen zur rekombinanten Expression können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Beispiele von Wirtszellen schließen ein Bakterienzellen, Hefezellen, kultivierte Insektenzelllinien und kultivierte Säugerzelllinien. Vorzugsweise wird das rekombinante Wirtszellsystem so ausgewählt, dass es am besten zu dem Organismus passt, von dem die mutante DNA-Polymerase abgeleitet wurde. Prokaryotische DNA- Polymerasen werden z. B. bevorzugt in einem prokaryotischen Expressionssystem exprimiert. Im Stand der Technik ist eine große Anzahl von Expressionsvektoren bekannt. Eine Beschreibung verschiedener Expressionsvektoren und eine Anleitung, wie sie zu verwenden sind, kann unter anderem in den US-PSen 5,604,118, 5,583,023, 5,432,082, 5,266,490, 5,063,158, 4,966,841, 4,806,472, 4,801,537 und in Gödel et al., Gene Expression Technology, Methods of Enzymology, Bd. 185, Academic Press, San Diego (1989), aufgefunden werden. Die Expression von DNA-Polymerasen in rekombinanten Zellsystemen stellt eine gut etablierte Technik dar. Beispiele der rekombinanten Expression von DNA-Polymerase können in den US-PSen 5,602,756, 5,545,552, 5,541,311, US gesetzliche Erfinderregistrierung H1,513; 5,500,363, 5,489,523, 5,455,170, 5,352,778, 5,322,785 und 4,935,361 gefunden werden.
Andere Ausführungsformen der Erfindung beinhalten multiple DNA-Polymerase- Zusammensetzungen, die insbesondere nützlich zur Polynukleotidsequenzierung sind, solche Zusammensetzungen umfassen wenigstens zwei verschiedene erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerasen, wobei (I) die erste mutante DNA-Polymerase empfänglich hinsichtlich eines ersten fluoreszenzmarkierten Nukleotids ist; (2) die zweite mutante DNA- Polymerase empfänglich im Hinblick auf ein zweites fluoreszenzmarkiertes Nukleotid ist und (3) die ersten und zweiten fluoreszenzmarkierten Nukleotide sich voneinander hinsichtlich ihrer Nukleotidbasen und Fluoreszenzmarkierungen unterscheiden. Die ersten und zweiten fluoreszenzmarkierten Basen können sich auch hinsichtlich der Art des Linkers, der Basen- Anheftungsposition oder der Anheftungsstelle des Fluoreszenz-Farbstoffs voneinander unterscheiden. Die Zusammensetzungen sind nützlich zur Katalysierung der Sequenzierungsreaktionen in bei Sanger-DNA-Sequenzierung mit Fluoreszenz-Farbstoffmarkierten 2'3'-Didesoxy-Kettenterminator-Nukleotiden. Kettenabbruch-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierten Terminatoren verwendet bevorzugt wenigstens zwei und insbesondere bevorzugt vier verschiedene fluoreszenzmarkierte Kettenterminatoren, wobei jede verschiedene Base mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung markiert ist. Aufgrund der notwendigen strukturellen Unterschieden zwischen den verschiedenen für eine Sequenzierungsreaktion erforderlichen fluoreszenzmarkierten Kettenterminatoren, d. h. Nukleotidbasen und Fluoreszenzmarkierungen, gibt es viele erfindungsgemäße mutanten DNA-Polymerasen, die nicht für alle der fluoreszenzmarkierten Terminatoren, die für eine gegebene Sequenzierungsreaktion notwendig sind, empfänglich sind. Somit gibt es Ausführungsformen der DNA-Polymerasen mit unerwünscht hohen Spiegeln an Diskriminierung gegen einen oder mehrere der markierten Terminatoren, die in einem Sequenzierungsreaktions-Set verwendet werden. Die Zusammensetzungen aus zwei oder mehreren mutanten Polymerasen lindern dieses Problem durch die gleichzeitige Verwendung multipler mutanter DNA-Polymerasen, die für verschiedene markierte Kettenterminatoren empfänglich sind, wobei wenigstens eine der mutanten Polymerasen die Diskriminierung gegen einen bestimmten fluoreszenzmarkierten Terminator durch die anderen Polymerasen, die die Sequenzierungsreaktionen katalysieren, kompensiert. Das Verhältnis der verschiedenen DNA-Polymerasen in der Zusammensetzung ist bevorzugt so ausgewählt, dass es zu etwa gleichen Spiegeln von Gesamtaktivität für jede der verschiedenen mutanten DNA-Polymerasen führt. Unterschiede in der spezifischen Aktivität zwischen den verschiedenen mutanten Polymerasen müssen in Betracht gezogen werden, wenn die Gesamt-Aktivitätsverhältnisse zwischen den Polymerasen ausgeglichen werden. Unterschiede in Aktivitätshöhen der verschiedenen mutanten DNA-Polymerasen in Zusammensetzungen können auch durch Anpassung der Mengen der verschiedenen fluoreszenzmarkierten Terminatoren in den Zusammensetzungen kompensiert werden. Die multiplen Polymerasezusammensetzungen können zwei, drei, vier oder mehrere verschiedene mutante DNA-Polymerasen umfassen. Die mutanten Polymerase kann oder kann nicht von der gleichen Spezies oder vom gleichen Stamm abgeleitet sein. Die verschiedenen mutanten DNA-Polymerasen in den jeweiligen Zusammensetzungen mutanter Polymerasen können für eines oder mehrere der fluoreszenzmarkierten Nukleotide in einem gegebenen Satz fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide zur Sequenzierung empfänglich sein oder nicht.
Die Erfindung beinhaltet auch zahlreiche Verfahren zur Verwendung der mutanten DNA- Polymerasen (oder multipler mutanter DNA-Polymerase-Zusammensetzungen) der Erfindung. Die erfindungsgemäßen mutanten DNA-Polymerasen können gegen jede der entsprechenden parentalen DNA-Polymerasen in den meisten Verfahren, in denen DNA- Polymerasen verwendet werden, ausgetauscht werden. Um einen größeren Vorteil aus den Eigenschaften der mutanten DNA-Polymerasen zu ziehen, kann die Menge (oder die Konzentration) der markierten und nicht-markierten Nukleotide, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, im Hinblick auf die Mengen (oder Konzentrationen), die in den entsprechenden Verfahren mit herkömmlichen DNA- Polymerasen verwendet werden, verändert werden. Diese Veränderungen in der Menge an Nukleotid können durch Routineversuche optimiert werden. Verfahren der Erfindung umfassen den Schritt der Verlängerung einer geprimten Polynukleotid-Matrize mit wenigstens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid, wobei die Verlängerung durch eine erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase katalysiert wird. Somit führt das Verfahren zur Bildung eines oder mehrerer unterschiedlicher fluoreszenzmarkierter Polynukleotide, die durch Primerverlängerung hergestellt wurden. Die Verfahren zur Synthese eines fluoreszenzmarkierten Polynukleotids können in einer Vielzahl von Prozeduren angewandt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sanger-Sequenzierung (z. B. Didesoxynukleotid-Kettenabbruch), die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Polynukleotidmarkierung und Minisequenzierung. Die verminderte Diskriminierung gegen Eigenschaften fluoreszenzmarkierter Nukleotide der mutanten DNA-Polymerase ist insbesondere nützlich für Sanger-DNA-Sequenzierungsreaktionen, einschließlich Zyklussequenzierung. Die Verwendung der mutanten DNA-Polymerasen für die Sanger- Sequenzierung vermindert die Menge an fluoreszenzmarkierten Kettenabbruch-Nukleotiden, die für eine Sequenzierungsreaktion erforderlich ist, und kann in vielen Fällen dazu verwendet werden, die Anzahl an Basen, die in einer einzelnen Sequenzierungsreaktion identifiziert werden können, die auf einem automatisierten fluoreszenzbasierenden Sequenzierungsgerät wie auf einem Applied Biosystems 310 oder 377 (Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer, Foster City, CA) analysiert wird, zu erhöhen. Ausführliche Protokolle für die Sanger-Sequenzierung sind dem Fachmann bekannt und können z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), gefunden werden.
Die Erfindung stellt auch Kits zur Synthese fluoreszenzmarkierter Polynukleotide bereit. Die Kits können zur Durchführung spezifischer Polynukleotid-Syntheseverfahren wie DNA- Sequenzierung oder PCR adaptiert werden. Erfindungsgemäße Kits umfassen eine erfindungsgemäße mutante DNA-Polymerase und ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid, welches im Hinblick auf die mutante DNA-Polymerase im Kit eine verminderte Diskriminierung zeigt. Kits enthalten vorzugsweise ausführliche Instruktionen, auf welche Weise die Prozeduren durchgeführt werden sollen, für das Kit adaptiert ist. Optional kann der Kit auch wenigstens ein anderes Reagenz umfassen, das für die Durchführung des Verfahrens nötig ist, für das der Kit angepasst ist. Beispiele solcher zusätzlicher Reagenzien schließen nicht-markierte Nukleotide, Puffer, Klonierungsvektoren, Restriktionsendonukleasen, Sequenzier Primer und Amplifizierungs-Primer ein. Die in den erfindungsgemäßen Kits enthaltenen Reagenzien können in einer vorab gemessenen Einheit bereitgestellt werden, um eine größere Präzision und Genauigkeit bereitzustellen.
Andere Ausführungsformen der Erfindung beinhalten Kits, umfassend (I) Kompositionen multipler mutanter DNA-Polymerasen und (2) fluoreszenzmarkierte Kettenabbruch- Nukleotide, die zur Verwendung mit den Zusammensetzungen geeignet sind, d. h. jeder markierte Kettenterminator ist im Hinblick auf wenigstens eine der mutanten DNA- Polymerasen in der Zusammensetzung empfänglich. Zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung beinhalten Kits zur Sequenzierung von DNA, die eine Zusammensetzung einer erfindungsgemäßen multiplen mutanten Polymerase umfassen und wenigstens zwei verschiedene fluoreszenzmarkierte kettenterminierende Nukleotide, die an verschiedenen Basen markiert sind, wobei jedes der fluoreszenzmarkierten kettenterminierenden Nukleotide hinsichtlich wenigstens einer mutanten DNA-Polymerase in der Zusammensetzung empfänglich ist.
Die vorstehend beschriebene Erfindung kann anhand der folgenden Beispiele besser verstanden werden. Die Beispiele werden unter anderem zur Veranschaulichung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung bereitgestellt und sollten nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden. Andere Polymerasen als jene mit wenigstens einer Mutation an einer Position ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R560 und E681 in der Taq-DNA-Polymerase oder an analogen Aminosäureresten in anderen DNA-Polymerasen sind lediglich für Zwecke der Veranschaulichung dargestellt.

BEISPIELE

Beispiel 1

Aufreinigung mutanter Formen von Taq-DNA-Polymerase

E. coli-Lysate, die rekombinante Konstrukte enthalten, die zur Herstellung rekombinanter mutanter Taq-DNA-Polymerasen entworfen wurden, wurden im Wesentlichen wie in tDesai, U. J. und Pfaffle, P. K., Biotechniques 19: 780-784 (1995), beschrieben hergestellt. Um zu verhindern, dass die Polymerase an chromosomale und Plasmid-DNAs bindet, die das Lysat kontaminieren, wurde 5 M NaCl tropfenweise zu den hitzebehandelten, geklärten Lysaten zugegeben, um die Endkonzentration von NaCl auf 0,25 M einzustellen. Die DNA wurde dann aus diesem Gemisch durch tropfenweise Zugabe von 5% Polyethylimin (in 20 mM Tris·CL, pH 8,5) präzipitiert, um eine Endkonzentration von PEI von 0,3% zu erzielen. Die Präzipitation wurde 5 Minuten auf Eis fortgesetzt. Durch Zentrifugation bei 15000 · g für 15 Minuten bei 4ºC wurde ein weißes, wolkiges Präzipitat entfernt. Die Flüssigkeit im Überstand wurde dekantiert und aufgehoben. Nach der Zentrifugation wurde die Konzentration an NaCl auf 0,13 M vermindert durch Überwachen der Leitfähigkeit der Lösung während der Zugabe von TETT minus NaCl (20 mM Tris·Cl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, 0,05% Triton-X100, 1% Glycerin, pH 8,5).
Überschüssiges PEI wurde mit einer Bio-Rex 70- (BIO-RAD, Richmond, CA) Säule (2,5 · 30 cm) entfernt. Die Säule wurde abgegossen und mit TETT-Puffer + 0,1 M NaCl equilibriert. Die Polymerase bindet unter diesen Bedingungen nicht an Bio-Rex 70.
Zur Entfernung kontaminierender E. coIl Proteine wurde das Bio-Rex 70-Säuleneluat direkt auf eine Heparin-Agarose- (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) Säule (1,5 · 30 cm) geladen, die ebenfalls abgegossen und in TETT-Puffer + 0,1 M NaCl equilibriert wurde. Die Heparin-Agarose-Säule wurde mit 2 Säulenvolumen TETT + 0,1 M NaCl gewaschen und die Taq-DNA-Polymerase wurde als scharfer Peak mit TETT + 1 M NaCl eluiert. Die Elution wurde bei 280 nm überwacht.
Die Heparin-Agarose-Säulenfraktionen, die der Peakabsorption entsprachen, wurden zusammengeführt und mit Ultrafree-15-Zentrifugenfiltervorrichtungen (Millipore Corporation, MA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers für Zentrifugationsgeschwindigkeiten und -zeiten auf 0,15 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit TETT-Puffer + 5% Glycerin auf 15 ml verdünnt und die Probe wurde auf 0,15 ml aufkonzentriert. Dies wurde noch ein weiteres Mal wiederholt, um die Endkonzentration von NaCl unter 1 mM in den Proteinproben zu vermindern.
Die konzentrierten Polymeraseproben wurden zweifach mit TETT + 5% Glycerin verdünnt und ein gleiches Volumen von TETT + 95% Glycerin wurde zugegeben, um die Endkonzentration von Glycerin bei etwa 50% einzustellen. Die Proben wurden bei -20ºC gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem "Bradford Protein-Assay" (BIO-RAD, Richmond, CA) bestimmt. Die Aktivität wurde mit einem radiometrischen Assay (anderswo beschrieben) gemessen.
Typische Polymerase-Erträge aus 2 I induzierter E. coli Kultur (entsprechend zu 30-50 ml hitzebehandeltem geklärtem Lysat) lagen im Bereich von 4 bis 24 mg. SDS-PAGE-Analyse der aufgereinigten Proben zeigte eine dunkle Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 94 000 und einige kleinere Banden nach Coomassie Blau-Färbung. Die Gele zeigten einen typischen Aufreinigungslevel von > 90%.

Beispiel 2

Selektivitäts-Assay

Ein Terminator-Assay ("Terminator" wird als eine nicht-verlängerbare Base wie 2',3'-ddNTPs definiert) eines nicht-markierten gegenüber einem farbstoff-markierten Terminator wurde zum Screening mutanter Taq-DNA-Polymeraseproben verwendet, um bessere TET(II)·ddCTP-einbauende mutante Formen dieser Polymerase zu finden. Dieser Assay basiert auf zwei Substraten, die zur gleichen Zeit während einer Reaktion im stationären Zustand, in der nur die Konzentration an Polymerase beschränkend wirkt, um die gleiche aktive Stelle konkurrieren. Daher misst der Assay die Selektivität der Polymerase für das nicht-markierte gegenüber dem Fluorescein-markierten Terminator. Der in diesem Format verwendete DNA-Primer/Matrize ist nachstehend angegeben:
Die nächste Matrizenposition nach dem 3'-Ende des Primers ist vorstehend bei dem fetten und unterstrichenen G gezeigt.
Die Reaktion bestand aus:
80 mM Tris·Cl (ph 9,0 bei 20ºC)
1000 nM DNA-Primer/Matrize [5'-(FAM)25mer/36 G&sub1;-Matrize]
2 mM MgCl&sub2;
50 uM TET(II)·ddCTP
1 uM ddCTP
0,25 Einheiten Enzym
40 ul Reaktionsvolumen
60ºC Reaktionstemperatur
Proben (2 ul) wurden an vorbestimmten Zeiten aus dem Reaktionsgemisch entfernt (typischerweise 20-Sekunden-Intervalle für 0,25 Einheiten Polymeraseaktivität pro ul) und eiskalten 50 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) zugegeben. Zeitlich entnommene Aliquots wurden gemischt und für die weitere Verarbeitung auf Eis behalten.
Die Proben jedes Zeitpunkts wurden weiter bearbeitet, um überschüssiges, nichteingebautes TET(II)·ddCTP zu entfernen. Typischerweise wurden 1,6 ul jeder unterdrückten Probe zu 250 ul von 0,8 M LiCl plus 0,2 ug/ml E. coli tRNA zugegeben, gefolgt von 750 ul 95% Ethanol. Nach dem Mischen konnten die Nukleinsäuren 20 Minuten bei -20ºC präzipitieren. Die Präzipitate wurden anhand Standardverfahren durch Zentrifugation entfernt. Der flüssige Überstand wurde verworfen und die Pellets wurden in 50 ul 50% Formamid aufgelöst. Gelproben wurden hitzebehandelt (95ºC für 2 Minuten) und pro Probenspur wurden 2 ul auf einem 16% denaturierenden DNA-Sequenzierungsgel geladen. Die Gele wurden auf einem Applied Biosystems Modell 373 Sequenzierer mit GeneScan Fragment-Analyse-Software gefahren zur Messung der Menge an FAM-Fluoreszenz in den Banden, die dem 25mer-Primer entsprechen, dem 26mer-Produkt (was ein Einbauereignis von ddC anzeigt) und der offensichtlichen 27mer-Produktbande (was ein Einbauereignis von TET(II)·ddd anzeigt).
Das Fluoreszenzsignal in jeder der Banden wurde zusammengezählt und der Prozentsatz des Signals in jeder Bande wurde für weitere Berechnungen als Normalisierung verwendet, um Unterschiede in der Beladung von Spur zu Spur zu vermeiden. Energietransfer des %- FAM-Rests, die auf den offensichtlichen "27-mer"-Produktmolekülen anwesend ist zum TET(II)-Rest auf der neu eingebauten 3'-Base wurde nicht korrigiert, da alle Verhältnisse zum Wildtyp oder Taq G46D verglichen wurden. Die normalisierten Fluoreszenz-Signale im 26-mer und im "offensichtlichen" 27-mer-Produkt wurden hinsichtlich den in der Reaktion verwendeten unterschiedlichen Konzentrationen der beiden Moleküle korrigiert und die korrigierten Werte wurden gegen die Zeit aufgetragen. Die Schnelligkeit des Einbaus für jedes Substrat wurde anhand der geringsten "square fits" zu den Daten bestimmt. Das Verhältnis der ddC/TET(11)·ddC-Einbauraten entspricht der Neigung zur Selektivität, die die Probenpolymerase für die unmarkierten gegenüber den TET(II)-markierten Nukleotiden zeigt und spiegelt folgendes Verhältnis wieder:
VddC ÷ VTet·ddc = (kcat/KM)ddC[ddC] ÷ (kcat/KM)Tet·ddc (TET(II)·ddCTP)
wobei:
vddc = Geschwindigkeit des Einbaus von ddC
VTet·ddc = Geschwindigkeit des Einbaus von TET(II)·ddCTP
kcat = Konstante der katalytischen Rate
KM = Nukleotid-Gleichgewichts-Bindungskonstante
[ddC] = ddCTP-Konzentration in der Reaktion
[TET(II)·ddCTP] = TET(II)·ddCTP-Konzentration in der Reaktion
In dieser Assay-Form zeigte "Wildtyp"-Taq oder (Taq G46D) eine Neigung zur Selektivität oder ddC/TET(II)·ddC-Zahl von etwa 85 zu 1. Mutanten, die geringere Selektivitätsneigungsverhältnisse zeigen, wurden weiteren Tests unterzogen. Die nachstehende Tabelle 2 zeigt Ergebnisse für einige der Mutanten, die anhand einiger Beispiele getestet wurden: Tabelle 2

Beispiel 3

Assay für den "Next Nucleotide Rate Effect"

Ein zusätzlicher kinetischer Schritt zwischen Nukleotidbindung im "Grundzustand" oder der anfänglichen Kollision und der richtigen Basenpaarbindung und der Gruppentransferreaktion würde erwartungsgemäß die Dissoziationsrate der Polymerase von einem Enz·DNA- Komplex mit einem 3'-Didesoxynukleotid in einem Assay verlangsamen, der als "Next Nucleotide Rate Effect" (Patel et al., 1991) bezeichnet wird. Dieser Assay misst die Rate des stationären Zustands des Einbaus von ddTTP (d. h. das Enzym ist beschränkend) in Ab- oder Anwesenheit des nächsten richtigen Nukleotids. Nachstehend wird das Primermatrizenpaar gezeigt:
Die nächste Matrizenposition wird durch das fettgedruckte unterstrichene A angezeigt. Die nächste Matrizenposition neben A ist G. Unter Reaktionsbedingungen des stationären Zustands ist im Wesentlichen die vollständige erhältliche Polymerase an den Primer/die Matrize gebunden. Wenn ddTTP in Lösung alleine anwesend ist, wird es nach der Bindung an seine Matrizenposition, A, eingebaut. Zusätzliche Einbauereignisse erfordern, dass die Polymerase aus dem Enz·DNA-Komplex dissoziiert und einen anderen erhältlichen Primer/Matrize findet, die noch kein Einbauereignis eingegangen ist. Somit ist unter diesen Bedingungen die Einbaurate die Dissoziationsrate der Polymerase aus dem Enz·DNA- Komplex. Wenn das nächste richtige Nukleotid, dGTP oder ddCTP, ebenfalls im Reaktionsgemisch anwesend ist, dann wird die Dissoziationsrate der Polymerase aus dem Enz·DNA·ddCTP-Komplex z. B. langsamer sein, wenn ein zusätzlicher kinetischer Schritt zwischen der Gruppentransferreaktion, die das ddTTP einbaute, und einem Versuch der Polymerase, ddCTP in einer fortschreitenden Syntheseart einzubauen, anwesend ist. Diese langsamere Dissoziationsrate kann als eine langsamere Einbaurate von ddTTP nachgewiesen werden, da keine chemische Reaktion stattfinden kann, wenn ddTTP und die Polymerase trotz der Anwesenheit eines anderen richtigen Nukleotids nicht verarbeitet werden können. Wie in Fig. 2 gezeigt, verlangsamt die Anwesenheit des nächsten richtigen Nukleotids tatsächlich den Umsatz oder die Dissoziationsrate der Polymerase (Taq G46D; F667Y). Fig. 2 zeigt ebenfalls, dass die Anwesenheit eines Fluorescein-Farbstoffs auf dem nächsten richtigen Nukleotid (in diesem Fall TET(II)·ddCTP) die Umsatzrate zu beschleunigen scheint. Wir interpretieren dies so, dass die Polymerase eine ständige Veränderung in der Konformation eingeht und dass sie sogar in Abwesenheit des nächsten richtigen Nukleotids versuchen kann, die Veränderung einzugehen. Die Anwesenheit eines Fluorescein-Farbstoffs auf dem nächsten richtigen Nukleotid blockiert jedoch die Fähigkeit der Polymerase, eine solche Veränderung einzugehen und führt daher zu einer unmittelbaren Dissoziation des Enzyms nach dem Gruppentransferschritt für den ddTTP- Einbau. Somit scheint der Fluorescein-Farbstoff die Polymerase-Dissoziationsrate durch Eliminierung eines kinetischen Schritts (oder Schritte) nach der Gruppentransferreaktion zu beschleunigen.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse für einen "Next Nucleotide Rate Effect-Assay" für eine multiple mutante Form der Taq-DNA-Polymerase, Taq G46D; R660D; F667Y; E681 G. In diesem Fall ist die Anwesenheit von Tet(II) auf dem nächsten richtigen Nukleotid für die mutante Polymerase "transparent". Wir interpretieren dies so, dass die mutante Polymerase tatsächlich nach Gruppentransfer die gleichen kinetischen Schritte eingehen kann, die auch "Wildtyp"-Formen dieser Polymerase eingehen. Wir interpretieren diese Ergebnisse auch dahingehend, um anzuzeigen, dass die F667Y-Mutation zu einer anderen Klasse als die R660D- oder E681 G-Mutationen gehört, da Taq G46D; F667Y im "Next Nucleotide Rate Effect-Assay" noch einen "Fluorescein-Effekt" zeigt, die multiple Mutante Taq G46D; R660D, F667Y; E681 G zeigt diesen Effekt jedoch nicht.
Typische Assay-Bedingungen für den "Next Nucleotide Effect-Assay" waren wie folgt:
1000 nM Primer/Matrizen-DNA
80 mM Tris·Cl(ph 9,0 bei 20ºC)
2,4 mM MgCl&sub2;
0,02 Einheiten/ul Polymeraseaktivität
400 uM jedes Nukleotid (sofern anwesend)
Die Proben wurden in der gleichen Weise wie unter "Selektivitäts-Assay" beschrieben entnommen und verarbeitet. In diesem Fall ist es möglich, ein ddC-Einbauereignis von einem TET(II)·ddC-Einbauereignis durch die Wanderungsrate der entstehenden Fragmente in einem 16%igen Gel zu unterscheiden. Einbau von ddC führt zu einer normalen 26mer- Bande, die wie erwartet oberhalb oder langsamer als der 25mer-Primer wandert. Einbau von TET(II)·ddC führt zu langsamerer Wanderung, die dazu führt, dass die Bande mit einer offensichtlichen Größe, die zu einem 27- oder 28mer äquivalent ist, wandert.

Beispiel 4

Analyse zusätzlicher Mutanten

Die nachstehend bereitgestellte Tabelle 1 stellt eine Zusammenfassung der Ergebnisse bereit, die in Selektivitäts-Assays, die mit einigen verschiedenen Taq-Mutanten durchgeführt wurden, erhalten wurden. Die analoge Stelle für die Mutation in den Enzymen E. coli DNA- Polymerase 1 und Phage T7-DNA-Polymerase sind ebenfalls angegeben. Der Begriff "FS" bezieht sich auf eine Taq-DNA-Polymerase mit einer F667Y-Mutation.

Literaturstellen

Barnes, W. M. (1992) The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an Nterminal deletion. Gene 112: 29-35.
Brandis, J. W., Edwards, S. G. und Johnson, K. A. (1996) Slow rate of phosphodiester bond formations accounts for the strong bias that Taq DNA polymerase shows against 2',3'-dideoxynucleotide terminators. Biochemistry 35: 2189-2200.
Desai, U. J. und Pfaffle, P. K. Single-step purification of a thermostable DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Biotechniques 19: 780-784.
Fersht, A. (1985) in "Enzyme Structure and Function", W. H. Freeman and Company, 2nd ed., pp. 111-112.
Johnson, K. A. (1993) Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. Ann. Rev. Biochem. 62: 685-713.
Patel, S. S., Wong, L. und Johnson, K. A. (1991) Pre-steady-state kinetic analysis of processive DNA replication including complete characterization of an exonucleasedeficient mutant. Biochemistry 30: 511-525. Tabelle 1 Tabelle 2 R660-Mutanten Tabelle 2 (Fortsetzung) E681-Mutanten
*Verhältnis > 1 bedeutet verbesserten TET(II)·ddCTP-Einbau Enzym.
**Verhältnis = 1 bedeutet Wildtyp-Aktivität.
***Verhältnis < 1 bedeutet schlechtere Aktivität als Wildtyp. Tabelle 2 (Fortsetzung)
*Verhältnis > 1 bedeutet verbesserten TET(II)·ddCTP-Einbau. Muss "85" sein, um für das Enzym "transparent" zu sein.
**Verhältnis = 1 bedeutet Wildtyp-Aktivität.
***Verhältnis < 1 bedeutet schlechtere Aktivität als Wildtyp.

Claims

1. DNA-Polymerase mit einer Mutation, die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität verringert, und Mit wenigstens einer Mutation in der Nukleotid-Markierungsinteraktionsregion, wobei die DNA-Polymerase eine verringerte Diskriminierung gegenüber Fluoresceinfarbstoff-markierten Nukleotiden besitzt, wobei die Mutation an einer Position ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R660 und E681 in Taq-DNA-Polymerase oder analogen Aminosäureresten in anderen DNA-Polymerasen als Taq-DNA-Polymerase besitzt.

2. DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase ist.

3. DNA-Polymerase gemäß Anspruch 2, wobei die Mutation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R660D und E681 G ist.

4. DNA-Polymerase gemäß Anspruch 3, wobei diese einen Mutationssatz gehörend zu der Gruppe bestehend aus (G46D, R660D, F667Y), (G46D, R595D, R660D, F667Y) und (G46D, R660D, F667Y, E681G) und (G46D, F667Y, E681G) besitzt.

5. DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist.

6. Polynukleotid, kodierend für eine DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1.

7. Expressionsvektor mit einem Promotor, wobei der Vektor ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 in funktioneller Kombination mit dem Promotor umfasst.

8. Wirtszelle, umfassend einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 7.

9. Verfahren zur Synthese eines fluoreszenzmarkierten Polynukleotids, umfassend den Schritt des Mischens einer DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1 mit einem "geprimten Template".

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das "geprimte Template" ein "geprimtes Template" in einer Kettenabbruch-Sequenzreaktion ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das "geprimte Terriplate" ein "geprimtes Template" in einer Polymerase-Kettenreaktion ist.

12. Kit zur Fluoreszenzmarkierung eines Polynukleotids, umfassend eine DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1 und ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid.