DE29513622U1

DE29513622U1 - Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase

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Publication number: DE29513622U1
Application number: DE29513622U
Authority: DE
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1994-10-17
Filing date: 1995-08-24
Publication date: 1995-10-19
Anticipated expiration: 2005-08-25
Also published as: EP0727496B1; DE29513639U1; DE69435232D1; IL115643A0; US5614365A; ZA958761B; EP0727496A3; EP0727496A2; ATE440962T1; IL115643A; JPH08205874A; JP2691149B2

Description

LEDERER, KELLER & RiEDERER .·.. : ·..··..' .bWvanderwerth

Patentanwälte - European Patent Attorneys d 934 -1974)

DR. FRANZ LEDERER Dipi.-Chem. München

DR. GÜNTER KELLER Dipl.-Biol. München

ANTON FREIHERR RIEDERERv. PAAR Dipl.-Ing. Landshut

30538 MÜNCHEN Prinzregentenstraße 16 Telefon (089) 21 23 99 0 Telefax (089) 21 23 99 22

24. August 1995

The President & Fellows of Harvard College

17 Quincy Street
Cambridge, Massachusetts 02138 /USA

Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der Anmeldung von Tabor und Richardson mit dem Titel "DNA PoIymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing", eingereicht am 17. Oktober 1994, deren Inhalt (einschließlich Figuren) hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung wurde gemacht mit Unterstützung der Regierung einschließlich eines Stipendiums des US-Ministeriums für Energie, Vertrag Nr. DE-FG02-88ER60688. Die US-Regierung könnte Rechte an der Erfindung haben.

Die Erfindung betrifft DNA-Polymerasen, die für die DNA-Sequenzierung geeignet sind.

Es folgt eine kurze Beschreibung des Standes der Technik, der DNA-Sequenzierungstechniken betrifft. Dieser wird nur angegeben als allgemeine Richtlinie für den, der die Anmeldung liest, und ist nicht als Hinweis zu verstehen, daß die hier

zitierte Literatur oder Literatur, auf die explizit oder implizit Bezug genommen wird, Stand der Technik für die beigefügten Ansprüche ist.

Die DNA-Sequenzierung betrifft allgemein die Erzeugung von vier Populationen einzelsträngiger DNA-Fragmente mit einem definierten Ende und einem variablen Ende. Das variable Ende endet im allgemeinen an spezifischen Nukleotidbasen (entweder Guanin (G), Adenin (A), Thymin (T) oder Cytosin (C)). Die vier verschiedenen Sätze von Fragmenten werden jeweils auf Basis ihrer Länge getrennt, wobei ein Verfahren auf einem hoch auflösenden Polyacrylamidgel erfolgt; jede Bande auf dem Gel entspricht colinear einem spezifischen Nucleotid in der DNA-Sequenz, wodurch die Positionen in der Sequenz der gegebenen Nucleotidbase identifiziert werden. Siehe Tabor und Richardson, EP-A-0386859 und EP-A-0351138.

Es gibt zwei allgemeine Methoden der DNA-Sequenzierung. Eine Methode (Maxam und Gilbert-Sequenzierung) betrifft den chemischen Abbau von isolierten DNA-Fragmenten, die jeweils mit einer einzelnen radioaktiven Markierung am definierten Ende markiert sind, wobei jede Reaktion eine begrenzte Spaltung spezifisch an einer oder mehreren der vier Basen (G, A, T oder C) liefert. Die andere Methode (Didesoxy- oder Kettenabbruch-Sequenzierung) betrifft die enzymatische Synthese eines DNA-Strangs. Sanger et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74:5463, 1977). Vier getrennte Synthesen werden allgemein durchgeführt, wobei jede Reaktion an einer spezifischen Base (G, A, T oder C) abbrechen gelassen wird durch Einbau eines geeigneten Ketten abbrechenden Nucleotids, z.B. eines Didesoxynucleotids. Letzteres Verfahren ist bevorzugt, da die DNA-Fragmente einheitlich markiert werden können (anstatt endmarkiert) durch Einbau eines radioaktiv markierten Nucleosidtriphosphats, so daß die größeren DNA-Fragmente zunehmend mehr Radioaktivität enthalten. Weiterhin können ³⁵S-markierte Nucleotide anstelle von ³²P-markierten Nucleotiden verwendet

werden, was zu einer schärferen Trennung führt; die Reaktionsprodukte sind leichter zu interpretieren, da jede Bahn nur G, A, T oder C entspricht. Die für die Didesoxysequenzierung am häufigsten verwendeten Enzyme schließen T7-DNA-Polymerase und DNA-Polymerasen, die aus thermophilen Organismen, wie Taq, Vent, Tth und anderen isoliert wurden, ein. Andere Polymerasen, die in geringerem Ausmaß verwendet wurden, schließen AMV-Reverse Transkriptase und das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I ein.

Bei der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode wird ein kurzer einsträngiger Primer mit einer einsträngigen Matrize hybridisiert. Der Primer wird am 3'-Ende durch den Einbau von Desoxynucleotiden (dNMP) verlängert, bis ein Didesoxynucleotid (ddNMP) eingebaut wird. Wenn ein ddNMP eingebaut wird, hört die Verlängerung an dieser Base auf. Andere Ketten abbrechende Mittel können anstelle von ddNTP verwendet werden und das ddNTP kann, wie unten diskutiert, markiert werden.

Unter Verwendung der obigen Methodik wurden automatische Systeme für die DNA-Sequenz-Analyse entwickelt. Ein Gerät, das von EG&G hergestellt wird, verwendet die konventionellen Didesoxy-Kettenabbruchreaktionen mit einem radioaktiv markierten Nucleotid. Die entstehenden DNA-Produkte werden durch Gelelektrophorese getrennt, Toneguzzo et al., 6 Biotechniques 460, 1988. Ein Detektor untersucht auf Radioaktivität, wenn das Produkt unten durch das Gel läuft. Vier Synthesereaktionen sind erforderlich, damit jede Matrize sequenziert wird, ebenso wie vier Bahnen auf jedem Gel, wobei eine getrennte Bahn verwendet wird für Produkte, die mit jedem spezifischen Kettenabbruchmittel beendet werden.

Kambara et al., 6 Biotechnology 816, 1988 haben einen fluoreszenzmarkierten Primer verwendet. Die entstehenden fluoreszierend markierten Produkte werden mit einem Laser am Boden des Gels angeregt und die Fluoreszenz mit einem CRT-Monitor

nachgewiesen. Dieses Verfahren erfordert auch vier Synthesereaktionen und vier Bahnen auf dem Gel für jede zu sequenzierende Matrize.

Applied Biosystems stellt ein Gerät her, bei dem vier verschiedene Primer verwendet werden, die mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern markiert sind. Smith et al., 13 Nuc. Acid. Res. 2399, 1985 und 321 Nature 674, 1986. Jeder Primer wird in einem getrennten Ansatz, der eines von vier Didesoxynucleotiden enthält, verwendet. Nachdem die vier Reaktionen durchgeführt wurden, werden die Mischungen vereinigt und die DNA-Fragmente in einer einzelnen Bahn eines Gels aufgetrennt. Ein Laser am Boden des Gels wird verwendet, um fluoreszierende Produkte nachzuweisen, nachdem sie durch das Gel elektrophoresiert wurden. Dieses System erfordert vier getrennte Hybridisxerungsreaktionen und vier getrennte Synthesereaktionen für jede Matrize, aber nur eine einzelne Bahn auf dem Gel. Die Computer-Analyse der Sequenz wird erleichtert, wenn alle vier Banden in einer einzelnen Bahn sind.

DuPont stellte ein Gerät zur Verfügung, bei dem an jedes der vier Didesoxynucleosidtriphosphate ein anderer fluoreszierender Marker gebunden wird. Prober et al., 238 Science 336, 1987. Eine einzige Hybridxsierungsstufe, eine einzige PoIymerasereaktion (die jede der vier markierten Didesoxynucleosidtriphosphate enthielt) und eine einzige Bahn in dem Sequenzgel sind erforderlich. Die vier verschiedenen fluoreszierenden Marker in den DNA-Produkten werden getrennt nachgewiesen, wenn sie durch das Gel elektrophorisiert werden.

Englert et al., US-Patent Nr. 4,707,235 (1987) beschreibt eine Mehrkanal-Elektrophorese-Vorrichtung mit einer Detektionseinrichtung, die im wesentlichen quer über die gesamte Breite des Gels angeordnet ist, die markierte DNA-Produkte nachweisen kann, wenn sie an der Dektektoreinrichtung in vier

getrennten Bahnen vorbeiwandern und identifiziert den Kanal oder die Bahn, in der die Probe angeordnet ist. Bevorzugt .werden Radioisotope als Markierungen verwendet.

Den derzeit für die DNA-Sequenz-AnaIyse verwendeten Verfahren ist die Notwendigkeit inhärent, entweder radioaktiv oder fluoreszierend markierte DNA-Produkte mit einem Gelpermeationsverfahren, z.B. einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu trennen und dann ihren Ort bezogen aufeinander entlang der Bewegungsachse durch das Gel nachzuweisen. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird teilweise durch die Gleichmäßigkeit des Signals in den Banden bestimmt, die ungefähr im gleichen Abstand durch das Gel gewandert sind. Unterschiede oder Variationen in den Signalintensitäten zwischen nahegelegenen Banden erzeugen mehrere Probleme. Zuerst vermindern sie die Empfindlichkeit des Verfahrens, das durch die Fähigkeit, die Banden, die die schwächsten Signale enthalten, nachzuweisen, begrenzt wird. Als zweites erzeugen sie Schwierigkeiten bei der Bestimmung, ob eine Bande mit einem schwachen Signal ein echtes Signal ist aufgrund des Einbaus eines Kettenabbruchmittels oder ein Artefakt aufgrund einer Unterbrechung in der DNA, wo die Polymerase abdissoziiert wurde. Als drittes vermindern sie die Genauigkeit bei der Bestimmung der DNA-Sequenz zwischen nahe beieinanderliegenden Banden, da das starke Signal einer Bande das schwache Signal des Nachbarn maskieren kann. Siehe Tabor und Richardson oben.

Die Variation der Bandenintensität kann durch eine inhärente Eigenschaft der meisten DNA-Polymerasen entstehen. Die meisten DNA-Polymerasen benachteiligen die Ketten abbrechenden Didesoxynucleotide, die in der DNA-Sequenz-Analyse verwendet werden. Die T4-DNA-Polymerase benachteiligt die ddNTPs in einem solchen Ausmaß, daß sie nicht für die DNA-Sequenzierung verwendet werden kann. E. coli DNA-Polymerase I, Taq- und Vent-DNA-Polymerase benachteiligen ddNTPs auch stark, wobei sie ein ddNMP tausendmal langsamer einbauen, als

das entsprechende dNTP. Tabor und Richardson oben (die beide hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden) haben gezeigt, daß T7-DNA-Polymerase am anderen Ende des Spektrums liegt und die ddNTPs nur mehrfach benachteiligt. Wenn eine DNA-PoIymerase ein ddNTP im gleichen Ausmaß bei allen Sequenzen benachteiligen würde, könnte dieses Problem überwunden werden, indem einfach das Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs verändert wird. Eine solche Lösung wurde verwendet mit E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase. Jedoch variiert das Ausmaß der Benachteiligung bei benachbarten DNA-Sequenzen, was zu einer breiten Variation bei der Intensität benachbarter radioaktiver Fragmente führt. Die Intensität der spezifischen Fragmente kann um das 5Ofache variieren bei E. coli DNA-Polymerase I, aber nur um ein mehrfaches bei T7-DNA-Polymerase. Daher haben die auf einem DNA-Sequenzgel mit T7-DNA-Polymerase erzeugten Banden eine ähnliche Intensität, was ihren Nachweis und ihre Analyse durch automatisierte Verfahren erleichtert. Außerdem werden Verfahren beschrieben, die sogar die Benachteiligung von Didesoxynucleotiden durch T7-DNA-Polymerase noch weiter vermindern, so daß Didesoxynucleotide genauso wie Desoxynucleotide eingebaut werden. Diese Verfahrensbedingungen vermindern auch die Benachteiligung durch andere DNA-Polymerasen, wie Klenow- und Taq-DNA-Polymerasen, eliminieren sie jedoch nicht. Zum Beispiel kann die Verwendung von Mangan anstelle von, oder zusätzlich zu Magnesium in der Reaktionsmischung die Benachteiligung von Didesoxynucleotiden vermindern oder eliminieren. Unter solchen Bedingungen unterscheidet die T7-DNA-Polymerase nicht zwischen den zwei Molekülen, wohingegen andere DNA-Polymerasen, wie das Klenow-Fragment, Taq und Vent immer noch in einem gewissen Ausmaß benachteiligen. Zum Beispiel benachteiligt Klenow ddNTPs immer noch vierfach in Gegenwart von Mangan. Wichtiger noch ist, daß obwohl das Gesamtausmaß der Benachteiligung bei solchen Enzymen wie Klenow- und Taq-DNA-Polymerasen vermindert ist, die Intensität spezifischer Fragmente um mehr als das Vierfache variieren kann, aufgrund

einer starken Unterscheidung bei bestimmten Sequenzen in der DNA. Diese Polymerasen und Verfahren werden fast universell bei der manuellen DNA-Sequenzierung verwendet (d.h. ohne Hilfe von Sequenzierungsautomaten, wie oben beschrieben) und werden intensiv bei automatisierten Verfahren verwendet. Die Verwendung von Mangan und die fehlende Benachteiligung der ddNTPs an allen Stellen führt zu Banden von gleichmäßiger Intensität, was das Ablesen der Sequenzgele erleichtert, sowohl bei manuellen Verfahren als auch bei automatisierten Verfahren. Außerdem ermöglicht die fehlende Benachteiligung die Verwendung neuer Verfahren zur Sequenzanalyse (Tabor und Richardson oben). Ein Verfahren auf Basis dieser Erkenntnis wird bereitgestellt, um eine DNA-Sequenz in einer einzigen Reaktion zu bestimmen, die alle vier ddNTPs in verschiedenen Verhältnissen enthält, indem die relative Intensität jedes Peaks nach der Gelelektrophorese gemessen wird. Die Autoren geben an:

die DNA-Polymerasen dieser Erfindung unterscheiden nicht wesentlich zwischen Didesoxynucleotidanalogen und normalen Nucleotiden. Das heißt, die Chance des Einbaus eines Analogons ist ungefähr gleich groß wie die des Einbaus eines normalen Nucleotids oder zumindest wird das Analogon mit mindestens 1/10 der Effizienz eines normalen Analogons eingebaut. Die Polymerasen der Erfindung benachteiligen auch andere Analoge nicht wesentlich. Dies ist wichtig, da zusätzlich zu den vier normalen Desoxynucleosidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP und dCTP) die Sequenzierungsreaktionen den Einbau anderer Arten von Nucleotidderivaten erfordern, z.B. von radioaktiv oder fluoreszierend markierten Nucleosidtriphosphaten, gewöhnlich zur Markierung der synthetisierten Stränge mit ³^S, ³²P oder anderen chemischen Mitteln. Wenn eine DNA-Polymerase Analoge nicht benachteiligt, besteht die gleiche Wahrscheinlichkeit für den Einbau eines Analogons wie für ein normales Nucleotid. Für die markierten Nucleosidtr!phosphate

ist dies wichtig, um die synthetisierten DNA-Stränge unter Verwendung eines Minimums an Radioaktivität wirksam zu markieren [EP-A-0386859, Seite 4, Zeilen 44 bis 54].
Sie geben auch an:

Die Fähigkeit, naheliegende Banden von ungefähr gleicher Intensität herzustellen, ist nützlich, da es zuläßt, die Ergebnisse irgendeiner Sequenzierungsreaktion leichter und mit größerer Sicherheit abzulesen. Da weiterhin die DNA-Produkte aus einer Sequenzierungsreaktion mit einem spezifischen Kettenabbruchmittel Banden bilden, die ungefähr die gleiche Intensität haben, wie nahegelegene Banden, liefert die Bandenintensität selbst eine spezifische Markierung für die Reihe von so gebildeten Banden. Die Anzahl von DNA-Produkten mit durch ein gegebenes Kettenabbruchmittel erzeugtem gleichem Molekulargewicht variiert abhängig von der Konzentration des Kettenabbruchmittels. Durch Verwendung verschiedener Konzentrationen jedes der vier Kettenabbruchmittel für die Synthese werden die DNA-Produkte, die ein Kettenabbruchmittel einbauen von DNA-Produkten mit ungefähr gleichem Molekulargewicht, bei denen ein anderes Kettenabbruchmittel eingebaut wird, unterschieden, da sie sich in der Anzahl oder Menge unterscheiden; demzufolge können die Banden der DNA-Produkte identifiziert werden gemäß dem Kettenabbruchmittel einfach, indem ihre Intensität mit den Intensitäten der naheliegenden Banden verglichen wird. Als Ergebnis können zwei oder mehr Reihen von DNA-Produkten, wobei jede Reihe ein anderes Kettenabbruchmittel aufweist, der Gelpermeation in einer einzelnen Bahn unterzogen werden und identifiziert werden, d.h. voneinander unterschieden werden durch die Intensität jeder Bande verglichen mit der Intensität der naheliegenden Banden. Außerdem müssen die Synthesen der DNA-Produkte, die verschiedene Kettenabbruchmittel beinhalten, nicht getrennt durchgeführt werden in getrennten Behältern, sondern können alle gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden und die gleiche Markierung, z.B. ein Radioisotop, ein fluoreszierendes Mittel etc., kann, falls

erwünscht, für alle Kettenabbruchmittel verwendet werden, anstelle von verschiedenen Markierungen für jedes Kettenabbruchmittel, was das Verfahren vereinfacht [EP-A-0351138, Seite 3, Zeilen 20 bis 37].

Siehe auch Tabor und Richardson Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 4076-4080 (1989), die angeben, daß der Ersatz von Manganionen für Magnesiumionen bei der Katalyse durch T7-DNA-Polymerase oder E. coli DNA-Polymerase die Benachteiligung dieser Polyinerasen für ddNTPs um das Vier- bis Hundertfache vermindert, und Tabor und Richardson J. Biol. Chem. 265, 8322-8328 (1990), die die Verwendung von Pyrophosphatase und Manganionen beschreiben, um Fragmente mit Didesoxyenden mit einheitlicher Intensität unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase zu erzeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelderin nimmt an, daß die geringere Nützlichkeit einiger DNA-Polymerasen für die Didesoxy-DNA-Sequenzierung teilweise auf der verminderten Fähigkeit dieser Polymerasen beruht, ein ddNMP (oder ein anderes Nucleotidanalogon) anstelle eines dNMPs einzubauen. Wie oben angegeben, läßt die Fähigkeit, nicht zu unterscheiden, die Verwendung geringerer Konzentrationen von ddNTPs als bei Enzymen, die unterscheiden, zu und, was am wichtigsten ist, es werden Bandenmuster in den Sequenzgelen bereitgestellt, die über die ganze Länge eine gleichmäßigere Intensität haben. Diese beiden Ergebnisse machen ein automatisiertes Sequenzieren mit dem Enzym leichter und profitabler, da längere DNA-Sequenzen mit größerer Zuverlässigkeit bestimmt werden können.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, mit dem eine sonst unterscheidende DNA-Polymerase so verändert werden kann, daß sie ddNTPs weniger benachteiligt, als das entsprechende natürlich vorkommende Enzym. Dieses Verfahren betrifft die genetische Modifikation der Polymerase, um Aminosäure-

reste an den Schlüsselstellen vorzusehen, die die Fähigkeit der Polymerase, Analoge der dNMPs einzubauen, verbessern. Die Anmelderin hat bestimmt, daß Aminosäureveränderungen in einem spezifischen Bereich der DNA-Polymerasen eine dramatische Wirkung auf die Fähigkeit dieser DNA-Polymerasen haben, Didesoxynucleotide einzubauen; der spezifische eingebaute Aminosäurerest bestimmt, ob die Polymerase ddNTPs mehr oder weniger benachteiligt. Die Anmelderin hat festgestellt, daß das Modifizieren der DNA-Polymerasen, so daß sie Didesoxynucleotide effizienter einbauen, eine starke Wirkung auf ihren Nutzen bei der DNA-Sequenzierung hat. Es ist möglich, daß solche modifizierten DNA-Polymerasen sich auch als nützlich für andere übliche molekularbiologische Verfahren erweisen, z.B. die Amplifizierung von DNA (z.B. bei der PoIymerase-Kettenreaktion), die in vitro Mutagenese und das Auffüllen der Enden von DNA-Fragmenten. Die Kombination dieser Technik mit dem existierenden Wissen zur Veränderung der 3'-5'-Exonucleaseaktivitat einer DNA-Polymerase (z.B. T7-DNA-Polymerase, wie von Tabor und Richardson oben beschrieben) und die Verwendung von Mangan und Pyrophosphaten bei Sequenzierungsreaktionen läßt die Erzeugung von wesentlich besseren Enzymen, als den derzeit bekannten, zu. Die Modifikation der DNA-Polymerase erfolgt bevorzugt durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren, kann aber auch durch Einbau einer oder mehrerer zusätzlicher Aminosäuren oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren erfolgen.

In einem wesentlichen Aspekt, nämlich der DNA-Sequenzierung, sind termophile Enzyme mit der Fähigkeit, die Polymerisation von Nucleotiden bei Temperaturen oberhalb 50°C, und insbesondere oberhalb 60°C, 70°C oder sogar 80°C, unter Bedingungen, die für die DNA-Sequenzierung verwendet werden, zu katalysieren, wohlbekannt. Solche Enzyme sind allgemein in Organismen vorhanden, die bei diesen Temperaturen wachsen. Die Anmelderin nimmt jedoch an, daß viele dieser Enzyme unter Beschränkungen leiden, einschließlich der begrenzten Fähigkeit,

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Didesoxynucleotide einzubauen. Durch Modifikation dieser Enzyme unter Verwendung der unten gezeigten Verfahren kann der Fachmann jetzt jede gewünschte termophile DNA-Polymerase so modifizieren, daß sie Didesoxynucleotide effizienter einbaut. Solche Enzyme sind denen, die derzeit für die DNA-Sequenzierung existieren, überlegen, sowohl in Automaten als auch bei der manuellen Sequenzierung, insbesondere bei Verfahren, die bekannt sind als cyclische Sequenzierung bzw. Cyclus-Sequenzierung. Bei der cyclischen Sequenzierung werden mehrere Runden der DNA-Synthese durchgeführt ausgehend von der gleichen Matrize, wobei der synthetisierte Strang nach jedem Cyclus durch Hitzedenaturierung entfernt wird; dies läßt es zu, geringere Mengen der DNA-Matrize in einer Sequenzierungsreaktion zu verwenden.

Die Anmelderin hat experimentell festgestellt, daß der Aminosäurerest 526 in dem relativ nicht unterscheidenden Enzym T7-DNA-Polymerase dieses mit dieser Eigenschaft versieht. Die Anmelderin hat festgestellt, daß es durch Modifikation des Restes 526 möglich ist, die Fähigkeit der T7-DNA-Polymerase zu unterscheiden bzw. zu benachteiligen, mehrfach zu erhöhen. Auf Basis der Aminosäurehomologie zwischen T7-DNA-Polymerase und anderen DNA-Polymerasen hat die Anmelderin gefunden, daß die Veränderung des Restes an der homologen Stelle in anderen DNA-Polymerasen ebenso deren Fähigkeit, Didesoxynucleotide zu benachteiligen, beeinflußt. Beispiele für solche homologen Stellen sind der Rest 762 der E. coli DNA-Polymerase I und der Rest 667 der Taq-DNA-Polymerase. Bei allen drei Beispielen hat die Anmelderin gezeigt, daß es wesentlich ist, daß der Rest an dieser Stelle verschieden ist von Phenylalanin (F), z.B. kann er Tyrosin (Y) sein, wie bei der T7-DNA-Polymerase. Überraschenderweise liefert die Modifikation dieses einzelnen Aminosäurerestes, sogar nur durch Addition einer einzelnen Hydroxylgruppe, eine sehr große Veränderung (250 bis 8.00Ofach) bei dem Ausmaß der Benachteiligung. Der Fachmann erkennt, daß Veränderungen an dieser einen Stelle nicht

die Erfindung begrenzen und daß Veränderungen an anderen Stellen, die die Fähigkeit einer Polymerase, zu benachteili- _gen, vermindern, leicht durch Routineversuche gefunden werden können. Zum Beispiel hat die Anmelderin gefunden, daß die Modifikation der T7-DNA-Polymerase an 13 anderen Stellen auch zu einer größeren Fähigkeit des Enzyms, ddNTPs zu benachteiligen, führt, jedoch ist die Wirkung der Veränderungen an diesen Stellen viel geringer, nur 5- bis 2Ofach. Durch Verwendung analoger Verfahren können andere Stellen, die eine Benachteiligung der ddNTPs bewirken, leicht bei anderen DNA-Polymerasen gefunden werden, um sie für die DNA-Sequenzierung geeigneter zu machen. Solche anderen Stellen schließen Aminosäurereste ein in Bereichen, die ein starke Homologie zu E. coli DNA-Polymerase I und T7-DNA-Polymerase aufweisen, da diese Bereiche wahrscheinlich ein Teil der Bindungsdomäne für ddNTPs sind; bei E. coli DNA-Polymerase I schließen diese Bereiche Aminosäuren in Bereichen analog denen bei der T7-DNA-Polymerase von konservierten oder nicht konservierten Aminosäuren in den Bereichen 665 bis 681 und 754 bis 783 und möglicherweise in den Bereichen 709 bis 734, 797 bis 866 und 913 bis 927 ein. Die Veränderung der Aminosäure, um die gewünschte Funktion zu schaffen, kann so ausgewählt werden, daß sie identisch wird mit den entsprechenden Aminosäuren eines nicht unterscheidenden Enzyms wie T7-DNA-Polymerase oder aus anderen funktionell äquivalenten Aminosäuren, die durch Routineversuche ausgewählt werden können. Durch Veränderung von nicht konservierten Aminosäuren wird eine tiefere Veränderung der Fähigkeit zur Benachteiligung erhalten. Nicht konservierte Aminosäuren sind solche, die von einer Polymeraseart zur anderen variieren (d.h. die sich in weniger als 50 % der Polymerasen finden). Der Ausdruck "analog" wird in der allgemein anerkannten Weise verwendet. So ist ein Analogon einer Pol I-Polymerase eine Polymerase mit einer Aminosäuresequenz, wie von Braithwaite und Ito, unten, beschrieben, die bevorzugt mit den anderen Mitgliedern der Pol I-Familie der darin beschriebenen Polymerasen, so wie die

Spo2-DNA-Polymerase in Beziehung steht. Solche Analysen können durchgeführt werden unter Verwendung des Felsenstein PHYLIP Programms.

Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine DNA-Polymerase, bei der die DNA-Polymerase modifiziert ist, um die Fähigkeit der Polymerase, ein Didesoxynucleotid einzubauen, im Verhältnis zu dem entsprechenden Desoxynucleotid verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich vorkommenden DNA-Polymerase mindestens 2Ofach erhöht ist.

Die DNA-Polymerase wird so modifiziert, daß sie verglichen mit der entsprechenden natürlich vorkommenden oder unmodifizierten DNA-Polymerase eine erhöhte Fähigkeit hat, ein Didesoxynucleotid einzubauen, verglichen mit einem Desoxynucleotid.

Unter "erhöhter Fähigkeit" wird verstanden, daß die DNA-Polymerase ein Didesoxynucleotid besser einbauen kann. Das bedeutet, sie benachteiligt ein Didesoxynucleotid in einem geringeren Ausmaß, als eine entsprechende natürlich vorkommende DNA-Polymerase, verglichen mit einem Desoxynucleotid. Spezifische Verfahren, um eine solche Benachteiligung zu messen, sind unten angegeben. Der Ausdruck "erhöht" bedeutet, daß ein meßbarer Unterschied bei der Fähigkeit, solche Didesoxynucleotide einzubauen, vorliegt. In bevorzugten Ausführungsformen ist dies ein Anstieg von mindestens 10 % verglichen mit dem natürlich vorkommenden Enzym, obwohl es bevorzugt ist, daß der Grad der Benachteiligung eines Didesoxynucleotids mindestens 10- bis lOOfach und bevorzugt 100- bis 50Ofach verringert wird. Ein Beispiel eines solchen Enzyms ist E. coli DNA-Polymerase I, die (wie hier angegeben) den Einbau von Didesoxynucleotxden, verglichen mit Desoxynucleotiden, ungefähr 140- bis llOOfach benachteiligt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Enzym abgeleitet werden (durch Veränderung von nur einer oder zwei Aminosäu-

ren), das tatsächlich ddNTPs gegenüber dNTPs bevorzugt, d.h. die Fähigkeit der Polymerase, Didesoxynucleotide einzubauen, .wurde durchschnittlich l.OOOfach erhöht.

Der Ausdruck "entsprechende natürlich vorkommende DNA-Polymerase" ist dem Fachmann wohlbekannt und bezieht sich auf die Polymerase, die sich in der Natur findet und die bevorzugt weder durch in vitro noch durch in vivo Manipulationen im Labor verändert wurde. In ähnlicher Weise ist eine entsprechende Nucleinsäure die Nucleinsäure, die eine in der Natur vorkommende DNA-Polymerase kodiert. Diese wird einfach nur als Basis verwendet, um modifizierte Nucleinsäuren, die solche Polymerasen kodieren, zu vergleichen. So ist Basis für die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (auch als "Taq" bezeichnet) die Nucleinsäure, die natürlicherweise Taq-DNA-Polymerase kodiert, die in dem Bakterium Thermus aquaticus vorhanden ist. Die Anmelderin liefert mindestens eine Stelle, die in solchen Polymerasen verändert werden kann, um die Fähigkeit der Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, zu verändern. Diese Stellen sind nur Beispiele und begrenzen die Erfindung nicht, da dem Fachmann mit dem Wissen, daß die Fähigkeit einer DNA-Polymerase in geeigneter Weise bezüglich dieser Eigenschaft verändert werden kann, die Methodik geliefert wird, mit der solche Enzyme verändert werden, entweder an spezifischen Stellen oder anderen äquivalenten Stellen.

DNA-Polymerasen der Erfindung können auch modifiziert werden, um eine Exonuclease-Domäne zu entfernen oder zu verändern, z.B. die von Tabor und Richardson, oben, beschriebene 3'-5'-Exonuclease-Aktivität oder die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität bei Taq, die von Barnes beschrieben wird (WO 92/06188) . Die Mutationen, die die Fähigkeit der DNA-Polymerasen der Erfindung verändern, ddNTPs zu benachteiligen, beeinflussen bevorzugt die Exonuclease-Aktivität nicht wesentlich; hierunter wird verstanden, daß die Mutationen in der Polymerase-Domäne des Enzyms, nahe der aktiven Stelle für die Polymerisation

sind und daß nicht die Benachteiligung nur durch Verminderung der Fähigkeit der Polymerase, eingebaute Analoge über die JExonuclease-Aktivät zu entfernen, vermindert wird. Besonders geeignete DNA-Polymerasen der Erfindung sind Pol I-artige Polymerasen, wie von Braithwaite und Ito in 21 Nuc. Acid. Res. 787, 1993 beschrieben, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden und als Familie A bezeichnet werden und Polymerase alpha- oder Polyraerase II-artige DNA-Polymerasen, die von Braithwaite und Ito beschrieben werden und als Familie B bezeichnet werden. Die anderen Polymerase-Familien, die von Braithwaite und Ito beschrieben werden, können auch erfindungsgemäß verwendet werden. Insbesondere hat die Anmelderin gefunden, daß die Gegenwart eines polaren, hydroxylhaltigen Aminosäurerestes an einer Stelle in der Nähe der Bindungsstelle für das dNTP-Substrat wesentlich ist, daß die Polymerase wirksam ein Didesoxynucleotid einbauen kann. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, nimmt die Anmelderin an, daß diese Erkenntnis im Gegensatz zu dem erwarteten Ergebnis steht, das eine starke Benachteiligung eines Nucleotids ohne eine Hydroxylgruppe an der 3'-Stelle der Riboseeinheit (d.h. ein ddNTP) die gleichzeitige Abwesenheit einer Hydroxylgruppe an dem Aminosäurerest an der kritischen Stelle erfordert. In anderen Worten führt die Gegenwart des Spalts oder Lochs, das durch die Abwesenheit beider Hydroxylgruppen erzeugt wird, zu einer Benachteiligung des Analogons. Die Kenntnis dieses Ergebnisses liefert eine Lösung dafür, den kritischen Rest sogar bei nur entfernt verwandten DNA-Polymerasen zu finden; die Addition eines Restes mit einer polaren Gruppe für einen nicht polaren Rest in dem Bereich, wo das dNTP bindet, ist ein geeigneter Kandidat für einen Aminosäureaustausch, um die Fähigkeit der Polymerase, ddNTPs zu benachteiligen, zu vermindern. Zum Beispiel wurde mit Röntgenbeugungsuntersuchungen gezeigt, daß das Phenylalanin in Position 272 einer Ratten-DNA- Polymerase b, einer DNA-Polymerase, die wenig, wenn überhaupt irgendeine Homologie zu den Polymerasen der Familie A oder B aufweist, in Kontakt ist mit der 3'-Stelle des ddCTP-

Restes in einem ternären Komplex mit einer Primer-Matrize (Pelletier et al., 264 Science 189, 1994). Das Wissen der erfindungsgemäß beschriebenen Ergebnisse macht die Modifikation dieses Restes zu Tyrosin zu einer logischen Wahl bei einer Auswahl von Mutanten der Ratten-DNA-Polymerase b, die Didesoxynucleotide wirksamer einbauen. Der Fachmann wird somit den unterscheidenden oder benachteiligenden Phänotyp irgendeiner DNA-Polymerase unter Verwendung der hier angegebenen Information verändern können.

Die Fähigkeit einiger Polymerasen der Erfindung, Didesoxynucleotide effizienter einzubauen, kann spezifisch sein (d.h. die Wirkung auf Didesoxynucleotidanaloge ist viel größer als auf andere Analoge). Jedoch sind einige der Polymerasen auch geeignet, den Einbau anderer basenmodifizierter Analoge zu fördern (z.B. Desoxyinosintriphosphat (dITP) und 2'-Desoxy-7-deazaguanosin-5'-triphosphat (dc⁷GTP), um die Kompression der Banden während der Elektrophorese aufzuheben und fluoreszierend markierte Desoxynucleotide oder Didesoxynucleotide zur Verwendung für automatisierte Verfahren). Außerdem können solche Polymerasen fähig sein, Ribonucleotide effizienter einzubauen, was die Synthese von RNA ohne Bedarf für einen Promotor zuläßt. Insbesondere deuten konservierte Stellen zwischen Einzeluntereinheiten von DNA-abhängigen RNA-Polymerasen, wie T7-RNA-Polymerase und DNA-Polymerasen der Familie A (Pol I-artige DNA-Polymerase) darauf hin, daß Mutationen in diesem Bereich (Reste 758 bis 767 von E. coli DNA-Polymerase I) wahrscheinlich die Spezifität gegenüber rNTPs verändern. Dies läßt es zu, RNA-Polymerasen so zurechtzuschneiden, daß die Synthese von einem Primer effizient initiiert wird, was das Erfordernis für einen Promotor für die Synthese von RNA ausräumt. Analog deuten die hier gezeigten Daten darauf hin, daß die Modifikation der Reste 631 bis 640 der T7-RNA-Polymerase die Spezifität gegenüber dNTPs verändert. Dies läßt es

zu, eine neue DNA-Polymerase herzustellen, die die DNA-Synthese de novo von einer Promotor-Sequenz initiiert und keinen Primer verwenden kann.

In bevorzugten Ausführungsformen hat die modifizierte DNA-Polymerase eine ausreichende DNA-Polymerase-Aktivität (z.B. mindestens die, die in einer Standard-Sequenzierungs-Reaktion verwendet wird, und vorzugsweise mindestens 100 Einheiten pro mg Enzym, wie im Stand der Technik definiert; bevorzugt verändert die Mutation in der Polymerase den vorherigen Grad um nicht mehr als das 5- bis 1Ofache) für eine Verwendung zur DNA-Sequenzierung (wenn sie mit irgendeinem Wirtsfaktor, der notwendig ist für die DNA-Polymerase-Aktivität, vereinigt wird) und hat eine ausreichend geringe Exonuclease-Aktivität (z.B. weniger als 500 Einheiten pro mg, siehe Tabor und Richardson oben), damit die Polymerase in der DNA-Sequenzierung verwendet werden kann; hat die DNA-Polymerase ein oder mehrere Aminosäuren der Didesoxynucleotid-Bindungsstelle einer T7-artigen DNA-Polymerase (z.B. eine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T7, T3, pt, J*EI H, W31, gh-1, Y, A1122 und SP6). Bevorzugt wird die modifizierte DNA-Polymerase von einem thermostabilen Enzym modifiziert, z.B. die DNA-Polymerase, die von Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Bacillus sterothermophilus und Vent bacteria kodiert wird, und die Fähigkeit der Polymerase, ein Didesoxynucleotxd einzubauen, wird mindestens 1Ofach, 5Ofach oder am meisten bevorzugt mindestens lOOfach erhöht verglichen mit der entsprechenden natürlich vorkommenden DNA-Polymerase, z.B. durch Veränderung nur einer Aminosäure.

In bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase und die DNA-Polymerase leitet sich ab (d.h. ist mindestens zu 50 % identisch bei den Aminosäureresten) von einer, die von Thermus aquaticus, Thermus

thermophilus, Thermus flavus, Bacillus sterothermophilus, Thermococcus litoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu) oder -Sulfolobus solfataricus kodiert wird.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen hat die DNA-Polymerase weniger als 1.000, 250, 100, 50, 10 oder sogar 2 Einheiten Exonuclease-Aktivität pro mg Polymerase und kann Primer verwenden, die nur 4, 6 oder 10 Basen haben und die Konzentration aller 4 Desoxynucleosidtriphosphate zu Beginn der Inkubationsstufe ist ausreichend, damit die DNA-Synthese fortgesetzt werden kann, bis sie durch das Mittel, z.B. ein ddNTP beendet wird.

Bei der cyclischen Sequenzierung machen es die erfindungsgemäßen Polymerasen jetzt möglich, beträchtlich geringere Mengen an Didesoxynucleotiden zu verwenden, verglichen mit anderen Enzymen. Damit betrifft dieses Verfahren, daß eine überschüssige Menge von Desoxynucleotiden gegenüber allen vier Didesoxynucleotiden in einer cyclischen Sequenzierungsreaktion bereitgestellt wird und die cyclische Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird. Bei anderen Enzymen war es notwendig, einen Überschuß mindestens eines der ddNTPs für solche Reaktionen zuzugeben. Zum Beispiel beschreiben Sears et al., 13 BioTechniques 626, 1992 die Verwendung etwa eines lOfachen Überschusses von ddNTPs zu dNTPs bei Vent-Polymerase und Carothers et al., 7 BioTechniques 494, 1989 beschreiben die Verwendung mindestens eines zweifachen Überschusses von ddNTPs gegenüber dNTPs für Taq-Polymerase. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein solcher Überschuß nicht erforderlich. Bevorzugt wird mehr als ein 2-, 5- oder sogar 1Ofacher Überschuß eines dNTPs gegenüber dem entsprechenden ddNTP bereitgestellt. Bei einem spezifischen Beispiel wird weniger als 10 &mgr;&Mgr; ddNTP bei einer modifizierten Taq der Erfindung verwendet.

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In anderen Aspekten liefert die Erfindung spezifische DNA-Polymerasen, z.B. Thermus aquaticus DNA-Polymerase mit einem Tyrosin an Position 667, eine E. coli DNA-Polymerase I mit einem Tyrosin an Position 762 und irgendeine Pol I-artige DNA-Polymerase mit einem Tyrosinrest an einer Stelle analog zu Rest 762 einer E. coli DNA-Polymerase, z.B. an der N₄-Position der Aminosäuresequenz K N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ Y G, worin jedes N unabhängig irgendeine Aminosäure ist. Weiterhin liefert die Erfindung spezifische Polymerasen der DNA-Polymerase alpha Familie mit der Sequenz K N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ Y G/Q, worin jedes N unabhängig irgendeine Aminosäure ist und worin einer der Reste N₁ bis N₇ mutiert wurde, um eine PoIymerase zu erzeugen, die eine verminderte Benachteiligung von ddNTPs zeigt (bevorzugt mindestens 2Ofach vermindert, verglichen mit einer nicht mutierten Sequenz). Die Erfindung liefert auch eine Nucleinsäure, die irgendeine dieser DNA-PoIymerasen kodiert.

In weiteren Aspekten liefert die Erfindung DNA-Polymeräsen außer Reverser Transcriptase, die in Gegenwart von Magnesium als einzigem zugegebenem divalentem Kation eine durchschnittliche Prozessivität von weniger als 100 haben und den Einbau eines ddNMP weniger als lOOfach benachteiligen, verglichen mit dNMP oder die in Gegenwart von Magnesium als einzigem zugegebenem divalentem Kation eine durchschnittliche Prozessivität von weniger als 50 haben und den Einbau von ddNMP verglichen mit dNMP weniger als 50- bis 5fach benachteiligen. Der Fachmann erkennt, daß die Prozessivität mit irgendeinem Standardverfahren gemessen werden kann, das zeigt, daß die durchschnittliche Prozessivität der T7-DNA-Polymerase mindestens 500 ist, die des Klenow-Fragments etwa 4 bis 40 ist und die für Reverse Transcriptase etwa 150 bis 200 ist. Solche Messungen können durchgeführt werden, wie von Tabor et al., J. Biol. Chem. 262:16212, 1987 beschrieben, die hier

durch Bezugnahme eingeschlossen werden. Es wird erwartet, daß die durchschnittliche Prozessivität von Taq-DNA-Polymerase •unter diesen Bedingungen weniger als 100 ist.

Gemäß besonders bevorzugten Aspekten liefert die Erfindung thermophile DNA-Polymerasen, die z.B. in Gegenwart von Magnesium ein ddNMP verglichen mit einem dNMP um weniger als einen Faktor von 100 benachteiligen und die bevorzugt eine durchschnittliche Prozessivität von weniger als 100 haben und von einer Primer-Matrize zu einer weiteren mehr als einmal pro 1 oder sogar 10 Sekunden wechseln. Ein solches Wechseln kann mit Standardverfahren gemessen werden.

Die Erfindung liefert auch ein Verfahren für die cyclische Sequenzierung unter Verwendung einer DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, und liefert auch celluläre (im Gegensatz zu viralen oder mitochondrialen) DNA-Polymerasen mit einem Tyrosin anstelle der natürlich vorkommenden Aminosäure an einer Stelle, die verursacht, daß die Polymerase ein ddNMP verglichen mit einem dNMP nicht mehr als 5Ofach benachteiligt.

Gemäß anderen Aspekten führt die Substitution der Aminosäure an den angegebenen Stellen zu einer Veränderung anderer Eigenschaften der entsprechenden natürlichen Polymerase. Außerdem können die Polymerasen der Erfindung mit anderen Polymerasen bei den hier beschriebenen Verfahren vereinigt werden, um Vorteile aus den überragenden Eigenschaften jeder Polymerase in der Mischung zu ziehen.

Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen.

Beschreibung der bevorzugten Ausfuhrungsformen Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.

Zeichnungen

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der von Gen 5 des Bakteriophaten T7 kodierten DNA-Polymerase, die die Hand- und Fingerdomänen zeigt, und die Anordnung der verschiedenen didesoxyresistenten (DR)-Mutanten, die Anordnung der mit A bis E gekennzeichneten Bereiche und die Anordnung einer Stelle, die an der ddNTP-Benachteiligung beteiligt ist;

Figur 2 ist eine dreidimensionale Darstellung der Struktur der DNA-Polymerase I, die die Anordnung der Bereiche A bis E zeigt;

Figur 3 ist eine schematische Darstellung eines riboselektiven Bereichs der pol I-artigen DNA-Polymerase mit Aminosäuren, die mit dem Einbuchstaben-Code angegeben sind. Die Anfangs-Aminosäurezahl ist links von der Figur angegeben und der Anteil der Benachteiligung von Didesoxynucleotiden verglichen mit Desoxynucleotiden ist rechts angegeben;

Figuren 4, 5 und 6 sind schematische Darstellungen, die die Modifikationen des riboselektiven Bereichs der E. coli DNA-Polymerase I, der T7-DNA-Polymerase bzw. der Taq-DNA-Polymerase zeigen.

— po — &bgr;··· · ·^# **

Didesoxyresistente Mutanten

Es folgt eine kurze Diskussion von Veröffentlichungen mit einiger Bedeutung. Keine wird als Stand der Technik für die schwebenden Ansprüche angesehen, sie werden aber angegeben, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu fördern.

Reha-Krantz et al. , Mutational Analysis of Bacteriophage T4 DNA Polymerase, von Abstracts für die Poster-Präsentation, gezeigt bei einem Meeting mit dem Titel "The Fidelity of DNA Synthesis: Structural and Mechanistic Perspectives, Beaufort, North Carolina, September 24-29, 1989, beschreiben C-terminale Mutanten mit erhöhter Verwendbarkeit für ddNTPs. Jedoch geben Reha-Krantz et al., J. Virology 67, 60-66 (1993) an, daß obwohl der Ki für ddGTP 50mal niedriger war bei der Mutante L412M verglichen mit der Wildtyp T4-DNA-Polymerase, daß kein Unterschied bei der Wirksamkeit des Einbaus von ddGTP gefunden wurde zwischen der Mutante und dem Wildtyp der T4-DNA-Polymerase. Auf Seite 63 wird angegeben, daß "trotz der Empfindlichkeit der L412M -DNA-Polymerase gegenüber ddGTP kein Unterschied gefunden wurde beim Einbau von ddNTPs durch Wildtyp- und L412M-DNA-Polymerasen". Es wird auch angegeben, daß "es nicht scheint, daß eine einzelne Region die einzige Bindungsstelle entweder für PPi oder Nucleotide ist". Außerdem liefern Reha-Krantz und Nonay, J. Biol. Chem. 269, 5635-5643 (1994) eine Studie der Mutante L412M und anderer mutierter T4-DNA-Polymerasen.

Donlin and Johnson, Advanced ACS Abstracts, 15. Oktober 1994, untersuchten die Wirkung auf die Nucleotiderkennung der auf eine bestimmte Stelle gerichteten Mutagenese des Aminosäurerestes GIu 480 zu Asp und des Aminosäurerestes Tyr 530 zu Phe bei einer Exonuclease-defizienten T7-DNA-Polymerase. Es wurde gefunden, daß im Grundzustand die Nucleotid-Bindungsaffinität der Y530F-Mutante um das 2fache für die Bindung von dATP und um das 8fache für die Bindung von dTTP vermindert war. Für die E480D-Mutante war die Bindung um das 5- bis 6fache für

dATP, dGTP und dCTP und um das 4Ofache für dTTP vermindert. Die Autoren geben an, daß "die Daten für den Einbau von Didesoxynucleotid-Analogen übereinstimmten mit der Beobachtung einer selektiven Stabilisierung von DTTP durch beide Reste". Die Autoren schlagen vor, daß E480 und Y530 beide zu einer Nucleotidbindung im Grundzustand beitragen und daß E480 dazu dient, spezifisch das eingebaute dTTP zu stabilisieren bei A:T-Basenpaaren.

Gibbs et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 6672-6676 (1988) und Larder et al., the EMBO Journal 6, 169-175 (1987) beschreiben das Spektrum von Mutationen, die bei Herpes-DNA-Polymerase erhalten werden, wenn sie auf Resistenz gegenüber einer Anzahl von Nucleotidanalogen selektiert werden: Pyrophosphat, Phosphonoessigsäure und Phosphonoameisensäure, Acyclovir, Vidarabin, Ganciclovir und Bromvinyldesoxyuridin. Es wird darauf hingewiesen, daß viele der Mutanten, die gegenüber einem Arzneimittel resistent sind, auch gegenüber anderen Arzneimitteln resistent sind, sogar wenn sie Analoge von verschiedenen Bereichen des Substrats sind.

Derse et al., J. Biol. Chem. 257, 10251-10260 (1982) beschreiben fünf Klassen von Mutanten von Herpes simplex DNA-Polymerase, die durch Selektion des Wachstums in Gegenwart von Phosphonoameisensäure, einem Pyrophosphat-Inhibitor, isoliert wurden. Bei den Mutanten in jeder Klasse wurde die Resistenz gegenüber ddGTP verglichen (Seite 10256, Tabelle III). Bei allen ist die Ki für ddGTP 20- bis lOOfach erhöht.

Prasad et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 11363-11367 (1991) verwenden ein direktes Screening und zeigen, daß eine einzige Mutation bei der Reversen Transcriptase von HIV (einer Veränderung von GIu 89 zu Glycin) die Polymerase resistenter gegenüber ddGTP macht (es ist etwa lOmal mehr ddGTP erforderlich, um eine Hemmung im gleichen Ausmaß zu erhalten). Diese Mutation trägt eine breite Resistenz gegen-

über einer Anzahl von Analogen bei, einschließlich Phosphonoameisensäure, einem Pyrophosphatanalogon. Obwohl die Mutante genauso resistent gegegenüber ddTTP, ddCTP und ddGTP war, war sie viel weniger resistent gegenüber ddATP.

Song et al-, J. Virol. 66, 7568-7571 (1992) mutieren glu-89 der Reversen Transcriptase des Human-Immunschwächevirus Typ I zu neun verschiedenen Aminosäureresten und messen die Resistenz jedes mutierten Enzyms gegenüber ddGTP und Phosphonoaitieisensäure, einem Pyrophosphatanalogen. Die Mutationen fielen in zwei Klassen; der Ersatz von Glu-89 durch Alanin, Glycin, Valin oder Threonin führte zu Enzymen, die äußerst resistent waren sowohl gegenüber ddGTP als auch gegenüber Phosphonoameisensäure verglichen mit dem Wildtypenzym, während die Mutation zu Serin, Glutamin, Asparagin, Asparaginsäure und Lysin zu Enzymen führte, die nur eine mäßige oder keine Resistenz gegenüber ddGTP zeigten. Keine der Mutanten machte das Enzym weniger resistent gegenüber ddGTP als das Wildtypenzym (Tabelle I, Seite 7569). Die Autoren spekulieren, daß der 89. und 90. Rest der Reversen Transcriptase einen Teil der dNTP-bindenden Tasche bilden, auf Basis ihrer Ergebnisse und der Kristallstruktur der Reversen Transcriptase.

Artikel, die sich mit den Eigenschaften von Mutantenproteinen der E. coli DNA-Polymerase I mit Mutationen in der Nachbarschaft der Mutation, die zu einer ddNTP-Selektivität führt, befassen, schließen die folgenden ein:

Carroll et al., Biochemistry 30, 804-813 (1991) untersuchen zwei Mutanten: Tyr766Ser und Tyr766Phe für den Falscheinbau von normalen Desoxynucleotiden. Polesky et al., J. Biol. Chem. 265, 14579-14591 (1990) charakterisieren Mutationen, die zwei verschiedene Eigenschaften haben: (1) Tyrosin 766, Arginin 841 und Asparagin 845; von denen die Autoren vorschlagen, daß diese Reste die ankommende dNTP kontaktieren.

• ··

(2) Glutamin 849, Arginin 668 und Asparaginsäure 882, von denen die Autoren vorschlagen, daß sie an der Katalyse beteiligt sind. Polesky et al., J. Biol. Chem. 267:8417 (1992) charakterisieren weiterhin Mutationen von Arginin 668, Glutamin 849 und Asparaginsäure 882 und auch Mutationen an der Asparaginsäure 705 und der Glutaminsäure 710. Bei dieser Untersuchung betrachteten die Autoren den Einbau von alphathio-substituierten dNTPs, d.h. Analogen des Phosphatrestes. Pandey et al., J. Biol. Chem. 269, 13259-13265 (1994) betrachteten zwei Mutanten der E. coli DNA-Polymerase I, bei denen Lysin 758 zu Alanin und Arginin verändert war. Die Autoren geben an, daß Basu et al., Biochemistry 26, 1704-1709 (1987) das gleiche Lysin 758 in die dNTP-Bindung einbeziehen. Dies wurde chemisch gezeigt; die DNA-Polymerase I wurde kovalent modifiziert unter Verwendung von Pyridoxal-5'-phosphat, einem Nucleotidanalogon und es wurde angegeben, daß Lysin 758 der modifizierte Rest war.

Beese et al., Biochemistry 321: 14095-14101 (1993) beschreiben die Struktur eines Cokristalls des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I komplexiert mit einem dNTP oder mit Pyrophosphat. Die Autoren geben an, daß das dNTP benachbart zu der Helix O bindet. Die Autoren machen die folgenden Aussagen: (a) "In dem Mg-dCTP-Komplex gibt es eine Wechselwirkung von Cytosin mit His 881, während der Zucker eine Wechselwirkung mit Phe 764 [d.h. 762] (Figuren 3 und 5) eingeht." (b) "Wir schließen jedoch, daß die Position mindestens des dNMP-Restes von dNTP in dem binären Komplex wahrscheinlich nicht die gleiche, wie in dem katalytisch relevanten Komplex mit der Primer-Matrizen-DNA, ist." (c) "Da die gesamte Bindungsstelle für die Base des dNTPs durch Watson-Crick Wasserstoffbindung mit dem Matrizenstrang und das Aufliegen auf der 3'-Basis des Primerstrangs gebildet wird, ist es nicht unwahrscheinlich, daß die Bindungsstelle für die Base in dem binären Komplex völlig zufällig ist, was mit unserer Beobachtung übereinstimmt, daß sie an verschiedenen Stellen abhängig

— 26 — &bgr;··· · ··

von den Bedingungen binden kann." (d) "Die Bindungsstelle für dNTP, die an Kristallen des Binärkomplexes beobachtet wurde, -ist die gleiche, die in Lösungsuntersuchungen beobachtet wurde. Jedoch erfordert ein Extrapolieren von diesem binären Komplex zu einem Modell für den Komplex mit dNTP in Gegenwart von Primer- und Matrizen-DNA erhebliche Vorsicht. Wir nehmen an, daß der Zucker- und Baseanteil des dNTPs Primer-Matrizen-DNA erfordert, um in der korrekten Konformation zu binden."

Joyce und Steitz, 63 Ann. Rev. Bioc. 777, 1994 (nicht als Stand der Technik der vorliegenden Erfindung bezeichnet) diskutieren die Verwandtschaft verschiedener DNA- und RNA-PoIymerasen. Es werden drei Funktionen für die "Hand-" (statt "Finger-")-Subdomäne der DNA-Polymerase I angegeben - nämlich das katalytische Zentrum, die Bindungsstelle für das 3'-Ende des Primers und die dNTP-Bindungsstelle. Bei der Reversen Transcriptase von HIV-I wird angegeben, daß Mutationen, die die Bindung von DNA-Polymerase-Inhibitoren beeinflussen, rund um die Reste 67 bis 70 sind. Es wird auch angegeben, daß "obwohl keine geeigneten Schlüsse gezogen werden konnten aus den Positionen der Nukleotidbase des Zuckers, es möglich ist, daß der kristalline binäre Komplex eine Information geben kann, um die Kontakte zwischen Klenow-Fragment und den dNTP-Phosphatgruppen zu identifizieren." Im vorhergehenden Abschnitt wird angegeben, daß "obwohl ein binärer Komplex Polymerase-dNTP gebildet werden kann, ein solcher Komplex katalytisch nicht kompetent ist." Es wird weiterhin angegeben, daß Daten "die Desoxyribose in die Nähe von Phe 762 bringen würden" und daß "die Mutation von Tyr 766 [im Klenow-Fragment Helix O], das in der Fingerdomäne benachbart zu dem als Modell gebildeten Matrizenstrang angeordnet ist, die Unterscheidung zwischen Desoxy- und Didesoxynukleotid-Substraten beeinflußt ..." Es wird jedoch auch angegeben, "in dem Klenow-Fragment sind Mutationen, von denen gefunden wurde, daß sie die Bindung von dNTP in dem ternären Komplex (als K_m/_dNTp\) wiedergegeben) beeinflussen, an einer Seite

des Polyiaerasespalts innerhalb oder nahe bei der Fingersubdomäne angeordnet. Die Positionen, die bisher identifiziert wurden, umfassen das N-Ende der Helix Q (Arg 841 und Asn 845) und die exponierte Stelle der Helix 0 (Tyr 766, Phe 762 und Arg 754) und benachbarte Reste, die näher am katalytischen Zentrum sind (Asp 705 und GIu 710) ... Ein Vorteil der kinetischen Annäherung ist es, daß der ternäre Komplex sondiert wird; jedoch ist es, wie oben diskutiert, unmöglich, in Abwesenheit anderer struktureller Hinweise, direkte Wirkungen von solchen, die durch Matrizen-Interaktionen vermittelt werden, zu unterscheiden. Außerdem umfassen die oben aufgelisteten Seitenketten einen Bereich, der viel größer ist als das dNTP-Molekül und die daher nicht alle in direktem Kontakt damit sein können. Da der Bereich des Klenow-Fragmentes, der in diese Studien einbezogen wurde, intensiven Kontakt mit dem Matrizenstrang haben soll, ist eine vernünftige Interpretation die, daß eine Untergruppe der oben erwähnten Reste in direktem Kontakt mit dem dNTP sind, während der Rest die Matrizen-DNA bindet."

Pelletier et al., 264 Science 1891 und Sawaya et al., 264 Science 1930, 1994 (nicht als Stand der Technik für die vorliegenden Ansprüche angegeben) geben im Gegensatz dazu an, daß die Reste 271 bis 274 in den Helices M-N von Polß (das analog ist zu den Helices J-K von Klenow) eine allgemeine Funktion zeigen, die Nucleotid-Unterscheidung."

Sousa et al. 364 Nature 593, 1993 (nicht als Stand der Technik für die vorliegenden Ansprüche betrachtet) beschreiben die dreidimensionale Struktur der T7-RNA-Polymerase und ihre Homologie zu der E. coli DNA-Polymerase I. Sie geben an, daß ihre Beobachtungen darauf hindeuten, daß "die C-terminalen Elemente von KF [Klenow-Fragment] (b-Strang 14 [Reste 916 bis 928] und das C-Ende) Kontakt haben mit dem Desoxyriboseteil des dNTPs während der Polymerisation, um zwischen rNTP- und dNTP-Substraten zu unterscheiden."

Didesoxynucleoside, wie Didesoxythymidin, sind potente -Inhibitoren des Wachstums des Phagen T7. Versuche deuten darauf hin, daß die Hemmung der DNA-Synthese eine Folge des Einbaus des Didesoxynucleotids in T7-DNA ist. Didesoxynucleoside hemmen uninfizierte E. coli nicht. Wir haben keine Erklärung für die mangelnde Hemmung der E. coli DNA-Synthese, aber sie könnte erklärt werden durch zelluläre Aufnahme, einen hohen Grad an Benachteiligung des Einbaus durch E. coli DNA-Polyraerase III, eine unwirksame Phosphorylierung zu einem Triphosphat oder eine effiziente Entfernung. In jedem Fall finden wir, daß T7-Mutantenphagen auftreten, die normale Plaques auf Agarplatten liefern, die Didesoxynucleoside enthalten, mit einer Häufigkeit von ungefähr 10~³. Die Anordnung vieler dieser Mutationen ist in Figur 1 gezeigt. Sie liegen im Gen- 5-Protein. Die mutierten Gen-5-Proteine benachteiligen ddNTPs viel mehr (um ein Mehrfaches) als das native Gen-5-Protein. Einige Mitglieder dieser Klasse von Mutanten können den Bereich der Polymerase festlegen, der wichtig ist bei der Erkennung des Riboseteils des dNTPs.

Es ist wichtig anzumerken, daß die durch diese Selektion erhaltenen Mutationen unter Verwendung von Dxdesoxynucleosiden auf einer Veränderung des Bereichs des Gen-5-Proteins basieren, das den Riboseteil erkennt. Es ist jedoch möglich, daß solche Mutationen auch eine dramatische Wirkung auf andere Nucleotidanaloge haben. Außerdem ist es möglich, das gleiche Verfahren zu verwenden, um andere T7-Mutanten auszuwählen, die andere Nucleotidanalogen stark benachteiligen auf Basis des Wachstums des Phagen in Gegenwart dieser anderen Analogen.

Bezugnehmend auf Tabelle I sind verschiedene DR-Mutanten mit der Aminosäuresubstitution in der Tabelle angegeben. Die Aminosäuresubstitution wird weiter gekennzeichnet auf der rechten Seite der Tabelle. Die Anordnung dieser Mutanten ist

29 ···

in Figur 1 gezeigt über die Hand- und Fingerbereiche der T7-DNA-Polyraerase. Der Daumenbereich ist ein flexibler Bereich, der eine Wechselwirkung eingeht mit einer kleineren Vertiefung der Produkt-Duplex-DNA; die Handregion ist das katalytische Zentrum, die Bindungsstelle für das 3'-Ende des Primers und trägt zur dNTP-Bindung bei; die Fingerregionen haben Wechselwirkung mit ss-Matrizen in der Nähe der Synthesestelle und tragen zur dNTP-Bindung bei. Diese Mutanten sind über die Polymerase verstreut und haben alle eine relativ geringe Wirkung auf den Einbau von Didesoxynucleotiden, was die Fähigkeit, ein Didesoxynucleotid einzubauen, nur um das 5- bis 2Ofache vermindert. Außerdem sind einige dieser Mutanten in Bereichen angeordnet, die vergleichsweise nicht homolog zu DNA-Polymerase I sind. Sie liefern daher keinen Hinweis auf die Anordnung von Stellen bei anderen Pol !-Enzymen, die an der ddNTP-Benachteiligung beteiligt sind.

Tabelle

-Zusammenfassung der Didesoxy-resistenten Mutanten der T7-DNA-

Polymerase

Mutante	Nr.	Modifikation	Isolate	AIa	425	->■ Thr	hy dr ophob-+po 1 ar
	1	Phe	434	->· Ser	hydr ophob-+po 1 ar
DRl	1	GIy	442	->■ Ser	hydr ophob->po 1 ar
DR2		VaI	443	-+ He	hydrophob->-hydrophob
	1	Arg	444	-* His	stark basisch->schwach
DR3	2				basisch
DR4		Arg	444	-+ Cys	stark basisch^-neutral
	1				polar
DR5		Ser	477	-*■ Phe	po 1 ar-»hy drophob
	8	Asp	504	-»■ Asn	basisch-meutral
DR6	4	Ala	513	-»■ Thr	hydr ophob-»-po 1 ar
DR7	2	Thr	517	-> He	po 1 ar-*hydr ophob
DR8	2	Ala	532	-»■ Ser	hydr ophob^-po 1 ar
DR9	1	Arg	566	-* Cys	stark basisch-»·
DRlO	1				neutral, polar
DRIl		Ala	619	-»· Thr	hydrophob-+polar
	1	Ala	700	-* Thr	hydrophob-+polar
DRl 2	3
DRl 3

Zusammenfassung

7 hydrophob^-polar

3 stark basisch-»neutral, polar oder schwach basisch

2 polar->hy drophob 1 hydrophob-»hydrophob

In vitro Mutaqenese

Die in vitro Mutagenese des klonierten Gen 5 von T7 wurde verwendet, um Gen 5-Proteine zu konstruieren, bei denen verschiedene Bereiche der E. coli DNA-Polymerase I die analogen oder homologen Bereiche in dem T7-Gen-5-Protein ersetzten. Wie diskutiert waren wir insbesondere daran interessiert, die Fähigkeit dieser Enzyme zu bestimmen, Nucleotidanaloge einzubauen und das Ausmaß zu bestimmen, in dem sie andere Analoge benachteiligen. Bezugnehmend auf Figur 2 werden die Bereiche, innerhalb derer Hybride zwischen T7-DNA-Polymerase und E. coli DNA-Polymerase I erzeugt wurden, gezeigt und als Bereiche A bis E gekennzeichnet.

Bezugnehmend auf Figur 3 hat die Anmelderin bestimmt, daß Region C eine Riboselektivitätregion liefert mit einer deutlich größeren Wirkung als andere Bereiche in der Polymerase. Einige dieser anderen Bereiche sind spezifisch in Figur 3 gezeigt.

Bezugnehmend auf die Figuren 4 bis 6 (und Tabelle 2) wurde bestimmt, daß der Ersatz von Aminosäuren in diesem Bereich die Umwandlung der Riboselektivität einer Polymerase von einer E. coli DNA-Pol I-Art in eine T7-DNA-Polymeraseart und umgekehrt zuließ. So kann durch gezielte Mutagenese dieses Bereichs von Pol I-artigen Polymerasen die Riboselektivität einer Polymerase deutlich verändert werden. Der Wirkungsgrad ist mindestens 50- bis lOOfach und im allgemeinen mehr als 500fach.

DNA-Polymeräsen

DNA-Polymerasen, die für die Erfindung geeignet sind, schließen solche ein, die zu der Klasse von homologen Polymerasen gehören, die als "Pol I-artige DNA-Polymerasen" be-

zeichnet werden, einschließlich T7-artigen DNA-Polymerasen, dem großen Fragment der E. coli DNA-Polymerase I und der Taq-•Polymerase.

DNA-Polymerasen, die erfindungsgemäß geeignet sind, schließen solche ein, die zu einer Klasse von homologen Polymerasen gehören, die T7-artige DNA-Polymerasen (z.B. T7, T3, j21, 011., H W31, gh-1, Y, A1122 oder SP6) einschließen. Unter homologen Polymerasen werden solche Enzyme verstanden, wie sie von Delarue et al., Protein Engineering 3, 461-467 (1990) beschrieben werden, worin eine Einordnung der Pol I-Familie der DNA-Polymerasen dargestellt wird. Es wird auch die Einordnung der konservierten Sequenzabschnitte aus 6 Familien von Polymerasen gezeigt:

Tabelle 2

Wirkung des Domänen-Austausches zwischen E. coli DNA-PoIymerase I, T7-DNA-Polymerase und Taq-Polymerase innerhalb der Helix O auf die Benachteiligung von ddNTPs. Die Sequenz der drei Polymerasen ist oben gezeigt, wobei die Nummer des ersten Restes angegeben ist. Unter der Consensus-Sequenz für diese drei Polymerasen sind die Mutanten, die als T7-DNA-Polymerase (T7), E. coli DNA-Polymerase I (Pol) und Taq-DNA-Polymerase (Taq) gekennzeichnet sind, gezeigt, wobei die mutierten Reste unterstrichen sind. Jede Mutante wurde getestet bezüglich der relativen Rate des Einbaus von ddNMP zu dNMP durch SDS-Aktivitäts-Gelanalyse, wie in Beispiel 2 beschrieben und auf der rechten Seite gezeigt. Die Mutanten T7 C-T8, Pol I C-K6 und Taq C-Q5 wurden zusammen mit den Wildtypproteinen für die weitere Analyse gereinigt.

Enzym

Sequenz

ddNTP-Benachtei1igung

Pol	. I 754	WT
Taq	[ 658	C-T2
T7	517	C-T3
Consensus	C-T4
T7	C-T5
T7	C-T6
&Tgr;7	C-T7
&Tgr;7	C-T8
&Tgr;7	I WT
&Tgr;7	I C-Kl
&Tgr;7	I C-K2
&Tgr;7	I C-K3
Pol	I C-K4
Pol	I C-K5
Pol	I C-K6
Pol	WT
Pol	C-Ql
Pol	C-Q2
Pol	C-Q3
Taq	C-Q4
Taq	C-Q5
Taq
Taq
Taq
Tqa

RRSAKAINFGLIYG RRAAKTINFGVLYG RDNAKTFIYGFLYG R AK G YG

RDNAK

R R S A K

RDNAK

RDNAKTFNYGFLYG

RDNAKTFIFGFLYG

RRSAKAINFGLIYG R D N A K TFIY G F L Y G

T A	F I	1 N	Y F	G G	F L	L I	Y Y	G G
T A	F I	I N	Y F	G G	F F	L L	Y Y	G G
A	I	I	Y	G	F	L	Y	G
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hoch hoch

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hoch

niedrig

hoch

niedrig

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niedrig

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niedrig

hoch

niedrig

hoch

niedrig

Spezifitätsrest

DNA-Polymerasen aus Pol I-, Pol alpha- und Pol ß-Familien, DNA-abhängige RNA-Polymerasen, Reverse Transcriptasen und .RNA-abhängige RNA-Polymerasen; die Ergebnisse deuten darauf hin, daß wenige Reste bei allen Polymerasen konserviert sind. Gemäß ihrer Einordnung (Figur 3, Seite 463) ist der hier identifizierte Selektivitätsrest (Phenylalanin 762 bei E. coli DNA-Polymerase I) in "Abschnitt B". Zusätzlich zu der Pol I-Familie der DNA-Polymerasen findet sich Abschnitt B in der Pol alpha-Familie der DNA-Polymerasen und der T7-Familie der DNA abhängigen RNA-Polymerasen; so deutet diese Einordnung stark auf Reste hin, die man in diesen anderen Familien von Polymerasen mutieren sollte, die T4-DNA-Polymerase, Herpes-DNA-Polymerase, 029 DNA-Polymerase, Vent-DNA-Polymerase und Pfu-DNA-Polymerase einschließen.

Zusätzlich vergleicht Joyce, Current Opinion in Structural Biology 1, 123-129 (1991) die DNA-Sequenzen vieler Polymerasen und schlägt vor, daß eine geringe Anzahl wichtiger Reste an der aktiven Stelle konserviert sind. Insbesondere gibt es eine Diskussion der Ähnlichkeiten zwischen Polymerasen der Pol I-Familie (T7, pol I, Taq) und der pol alpha-Familie (T4, ,029, Herpes). In Figur 1 (Seite 124) zeigt Joyce die Positionen von fünf invarianten Resten, die sich in diesen zwei Familien finden; sie schließen Lysin 758, Tyrosin 766 und Glycin 767 ein? diese sind alle sehr nahe dem hier identifizierten Selektivitätsrest Phenylalanin 762.

Ito und Braithwaite, Nucleic Acids Research 19, 4045 bis 4057, 1991, zeigen die vollständigen Aminosäuresequenzen von 37 DNA-Polymerasen aufgeteilt in die Familien A, B und C nach den Aminosäuresequenz-Homologien mit E. coli DNA-Polymerasen I, II bzw. III. Die Autoren merken an, daß die meisten DNA-Polymerasen der Familie B (Polymerase alpha-Familie) die hoch konservierte Aminosäuresequenz YGDTD enthalten und daß berichtet wurde, daß Aminosäuresubstitutionen in dieser konser-

vierten Sequenz zu Defekten in der DNA-Polymerase-Aktivität führten, ohne die 3'-S'-Exonuclease-Aktivität zu beeinflussen.

Diese Polymerasen werden bei einer DNA-Sequenzierungsreaktion unter Bedingungen verwendet, in denen sie bevorzugt nahe beinander liegende Banden von ungefähr gleicher Intensität (mit einer etwa 1,5- bis 2fachen Variation in der Intensität) erzeugen, wenn die DNA-Produkte der Sequenzierungsreaktion auf einem Gel laufengelassen werden- Nahe beieinander liegend ist so zu verstehen, daß Banden eingeschlossen sind, die DNA-Produkte mit einem Molekulargewicht repräsentieren, das sich um 6.000, d.h. 20 Basen unterscheidet. Der tatsächliche Wert dieser Intensität nimmt mit der Länge des Gels ab, wie von Tabor und Richardson oben beschrieben. Die Bandenintensität spiegelt die Anzahl von DNA-Produkten innerhalb einer bestimmten Bande wieder. Markierungen, wie Fluorophore oder Radioisotope werden verwendet, um eine leicht nachweisbare Intensitätsbande, die die Anzahl solcher DNA-Produkte wiederspiegelt, zu erzeugen. So haben erfindungsgemäß nahe beinander liegende Banden, die aus einer Sequenzierungsreaktion mit einem Kettenabbruchmittel stammen, ungefähr die gleiche Anzahl von DNA-Produkten und somit eine einheitliche Bandenintensität. Die Sequenzierungsbedingungen schließen die Inkubation der Polymerase in Gegenwart spezifischer divalenter oder trivalenter Kationen, wie Mangan (II und III), Eisen(II)- und Eisen(III)ionen ein; monovalente und divalente Kationen, die keine nachweisbare Wirkung haben oder schädlich für die DNA-Synthese sind, schließen: K, Na, Ba, Be, Ca, Cc, Cr, Co, Cu, Ni, Si und Zn ein. Das Anion ist unwichtig, z.B. sind Chlorid, Acetat und Sulfat geeignet. Unter diesen Bedingungen kann das Erfordernis für Kettenabbruchmittel, wie Didesoxynucleoside, um ein Mehrfaches für die erfindungsgemäßen Enzyme verringert werden. Ein Komplexbildner kann auch in dieser Lösung vorgesehen werden, um die Konzentration der verfügbaren divalenten Metallionen regulieren zu helfen.

vierten Sequenz zu Defekten in der DNA-Polymerase-Aktivität führten, ohne die S'-S'-Exonuclease-Aktivität zu beeinflussen.

Diese Polymerasen werden bei einer DNA-Sequenzierungsreaktion unter Bedingungen verwendet, in denen sie bevorzugt nahe beinander liegende Banden von ungefähr gleicher Intensität (mit einer etwa 1,5- bis 2fachen Variation in der Intensität) erzeugen, wenn die DNA-Produkte der Sequenzierungsreaktion auf einem Gel laufengelassen werden. Nahe beieinander liegend ist so zu verstehen, daß Banden eingeschlossen sind, die DNA-Produkte mit einem Molekulargewicht repräsentieren, das sich um 6.000, d.h. 20 Basen unterscheidet. Der tatsächliche Wert dieser Intensität nimmt mit der Länge des Gels ab, wie von Tabor und Richardson oben beschrieben. Die Bandenintensität spiegelt die Anzahl von DNA-Produkten innerhalb einer bestimmten Bande wieder. Markierungen, wie Fluorophore oder Radioisotope werden verwendet, um eine leicht nachweisbare Intensitätsbande, die die Anzahl solcher DNA-Produkte wiederspiegelt, zu erzeugen. So haben erfindungsgemäß nahe beinander liegende Banden, die aus einer Sequenzierungsreaktion mit einem Kettenabbruchmittel stammen, ungefähr die gleiche Anzahl von DNA-Produkten und somit eine einheitliche Bandenintensität. Die Sequenzierungsbedingungen schließen die Inkubation der Polymerase in Gegenwart spezifischer divalenter oder trivalenter Kationen, wie Mangan (II und III), Eisen(II)- und Eisen(III)ionen ein; monovalente und divalente Kationen, die keine nachweisbare Wirkung haben oder schädlich für die DNA-Synthese sind, schließen: K, Na, Ba, Be, Ca, Cc, Cr, Co, Cu, Ni, Si und Zn ein. Das Anion ist unwichtig, z.B. sind Chlorid, Acetat und Sulfat geeignet. Unter diesen Bedingungen kann das Erfordernis für Kettenabbruchmittel, wie Didesoxynucleoside, um ein Mehrfaches für die erfindungsgemäßen Enzyme verringert werden. Ein Komplexbildner kann auch in dieser Lösung vorgesehen werden, um die Konzentration der verfügbaren divalenten Metallionen regulieren zu helfen.

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Zum Beispiel kann Citrat oder Isocitrat vorgesehen werden. Diese Komplexbildner sollen den Gehalt z.B. an freien Mangan- -ionen auf einer Konzentration zwischen 10 und 100 &mgr;&Mgr; über einen weiten Bereich von Mangankonzentrationen halten. Das bedeutet, daß der Komplexbildner als Puffer dient.

Die DNA-Polymerasen der Erfindung unterscheiden nicht wesentlich zwischen Didesoxynucleotidanalogen und Desoxynucleotiden entlang der DNA-Matrize. Das bedeutet, daß diese Polymerasen nicht wesentlich zwischen einem Nucleotid, das eine 3'-Hydroxylgruppe aufweist, und einem, das keine hat (d.h. zwei Wasserstoff atome an Position 3' der Ribose) unterscheiden können. Jedoch können diese Polymerasen Modifikationen an anderen Positionen der Nucleoside benachteiligen, sogar in Gegenwart von Mangan oder Eisen. Zum Beispiel können die Polymerasen einige Didesoxynucleotidanaloge, die fluoreszierende Gruppen gebunden haben, verglichen mit Desoxynucleotiden benachteiligen. Jedoch benachteiligen die Polymerasen benachbarte oder nahe beinander liegende Nucleotide auf Basis der Gegenwart oder Abwesenheit der Modifikation des Didesoxynucleotids in einem verschiedenen Ausmaß. Obwohl sie somit diese Analoge stark benachteiligen, was höhere Konzentrationen bei einer DNA-Sequenzierungsreaktion erfordert verglichen mit unmodifizierten Didesoxynucleosiden, wird die Intensität naheliegender Banden immer noch gleichmäßig sein.

Somit liefern die erfindungsgemäßen Polymerasen eine gleichmäßige Effizienz des Einbaus des Kettenabbruchmittels, sogar wenn sie insgesamt die Einbau benachteiligen. Außerdem ergeben die anderen Polymerasen der Erfindung gleichmäßigere Banden mit fluoreszierenden ddNTPs, als das entsprechende natürlich vorkommende Enzym, obwohl diese nicht so gleichmäßig sind, wie bei unmarkierten oder radioaktiv markierten ddNTPs.

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Kettenabbruchmittel, die erfindungsgemäß geeignet sind, schließen Didesoxynucleoside mit 2',3'-Didesoxystruktur ein. Andere Mittel, die für die Erfindung geeignet sind, sind solche, die spezifisch eine DNA-Sequenzierungsreaktion an einer spezifischen Base beenden können und nicht von der Polymerase unter den obigen Bedingungen benachteiligt werden.

Um zu bestimmen, ob eine spezifische DNA-Polymerase zusammen mit einem spezifischen Kettenabbruchmittel oder einer anderen Komponente einer Sequenzierungs-Reaktionsmischung für die Erfindung geeignet ist, wird eine Standard-Sequenzierungsreaktion durchgeführt, wie von Tabor und Richardson oben beschrieben, und das Ausmaß der Bandenbildung und die Gleichmäßigkeit naheliegender Banden in einem Sequenzgel überwacht. Wenn die Polymerase-Reaktion den Primer um nicht mindestens 20 Basen verlängert, ist sie unter den verwendeten Bedingungen nicht geeignet. Die Gleichmäßigkeit benachbarter Banden innerhalb des Bereichs des 2fachen oder weniger ist für die Erfindung geeignet, bevorzugt liegt die Gleichmäßigkeit in einem Bereich vom 1,0- bis l,5fachen. In ähnlicher Weise werden die optimale Kationenkonzentration oder andere mögliche Kationen, die für die Erfindung geeignet sind, bestimmt durch Verwendung der Sequenzierungsreaktion unter verschiedenen Bedingungen. Zum Beispiel werden Kationen im Bereich von 0,005 bis 100 mM getestet. Ein Beispiel für einen solchen Versuch folgt:

Die Fähigkeit, ein gegebenes ddNMP einzubauen verglichen mit dem entsprechenden dNMP für irgendein Enzym wird gemessen als Verhältnis von ddNTP zu dNTP, das notwendig ist, um eine DNA-Synthese zuzulassen, die in einem vorgegebenen Bereich endet, was nachgewiesen wird, indem Banden erzeugt werden, die nicht größer sind als das vorgegebene Molekulargewicht. Das bedeutet , daß die Banden, die in der Reaktion erzeugt werden, in einem spezifischen Bereich des Sequenzgels enden. Wenn daher ein Enzym ein gegebenes ddNTP l.OOOmal stärker benachteiligt

als ein anderes Enzym, wird ein l.OOOfach höheres Verhältnis von ddNTP zu dNTP notwendig sein, um Banden zu erhalten, die •an entsprechenden Stellen im gleichen Bereich des Gels enden.

Exonuclease-Aktivität

Die DNA-Polymerasen der Erfindung haben bevorzugt weniger als 50 %, bevorzugter weniger als 1 % und am meisten bevorzugt weniger als 0,1 % des normalen oder natürlich zugehörigen Grads an Exonuclease-Aktivität (Menge an Aktivität pro PoIymerase-Molekül). Unter normal oder natürlich zugehöriger Gehalt wird die Exonucleaseaktivität z.B. einer unmodifizierten T7-artigen Polymerase verstanden. Normalerweise ist die zugehörige Aktivität etwa 5.000 Einheiten Exonuclease-Aktivität pro mg Polymerase, gemessen wie unten beschrieben durch Modifikation des Verfahrens von Chase et al. (249 J. Biol. Chem. 4545, 1974). Exonucleasen erhöhen die Zuverlässigkeit der DNA-Synthese, indem sie alle neu synthetisierten Basen, die nicht korrekt basengepaart sind mit der Matrize, herausschneiden. Solche zugehörigen Exonuclease-Aktivitäten können für die Qualität der DNA-Sequenzierungsreaktionen schädlich sein. Sie erhöhen die minimal erforderliche Konzentration der Nucleotid-Vorlaufer, die zu der Reaktion zugegeben werden müssen, da dann, wenn die Nucleotid-Konzentration sinkt, die Polymerase-Aktivität sich auf eine Rate verlangsamt, die vergleichbar ist mit der Exonuclease-Aktivität, was zu keiner Netto-DNA-Synthese oder sogar einem Abbau von synthetisierter DNA führt.

Was wichtiger ist, kann die zugehörige Exonuclease-Aktivität eine DNA-Polymerase dazu bringen, in Bereichen in der Matrize mit sekundären Strukturhxndernissen anzuhalten. Wenn eine Polymerase eine solche Struktur erreicht, nimmt ihre Syntheserate ab, wenn sie versucht vorbeizukommen. Eine zugehörige Exonuclease wird die neu synthetisierte DNA herausschneiden, wenn die Polymerase steckenbleibt. Als Konsequenz werden zahlreiche Synthesezyklen und ein Herausschneiden auf-

treten. Dies kann dazu führen, daß die Polymerase möglicherweise hinter der Haarnadel synthetisiert (ohne Schaden für <lie Qualität der Sequenzierungsreaktion) oder die Polymerase kann von dem synthetisierten Strang abdissoziieren (was zu einer artifiziellen Bindung an der gleichen Position bei allen vier Sequenzierungsreaktionen führt) oder ein Kettenabbruchmittel kann mit großer Häufigkeit eingebaut werden und eine große Variabilität bei der Intensität verschiedener Fragmente in einem Sequenzgel erzeugen. Dies passiert, da die Frequenz des Einbaus eines Kettenabbruchmittels an einer gegebenen Stelle mit der Anzahl von Möglichkeiten, die die Polymerase hat, um das Ketten abbrechende Nucleotid einzubauen, ansteigt.

Eine ideale Sequenzierungsreaktion wird Fragmente erzeugen, die Banden mit gleichmäßiger Intensität in dem gesamten Gel ergeben. Dies ist wesentlich, um die optimale Belichtung des Röntgenfilms für jedes radioaktive Fragment zu erhalten. Wenn eine variable Intensität der radioaktiven Banden vorhanden ist, können schwächere Banden ungezeigt bleiben. Um eine gleichmäßige radioaktive Intensität aller Fragmente zu erhalten, sollte die DNA-Polymerase das gleiche Zeitintervall an jeder Position der DNA verbringen, wobei keine Bevorzugung für eine Addition oder Entfernung von Nucleotiden an einer gegebenen Stelle gezeigt werden sollte. Dies ist dann der Fall, wenn die DNA-Polymerase keine zugehörige Exonuclease hat, so daß sie nur eine Möglichkeit hat, ein Ketten abbrechendes Nucleotid an irgendeiner Position entlang der Matrize einzubauen.

Kurze Primer

Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase ist bevorzugt fähig, Primer mit 10 Basen oder weniger zu verwenden, ebenso wie längere, am meisten bevorzugt mit 4 bis 20 Basen, z.B. 6 Basen (die in Dreiergruppen verwendet werden können, um ein Äquivalent eines 18-mers zu bilden). Die Fähigkeit, kurze Primer

zu verwenden, bietet eine Anzahl von wichtigen Vorteilen für die DNA-Sequenzierung. Die kürzeren Primer sind billiger und leichter zu synthetisieren, als die gewöhnlichen 17-mer-Primer. Sie hybridisieren schneller mit den komplementären Stellen an einer DNA-Matrize, was die Sequenzierungsreaktion schneller macht. Weiterhin läßt die Fähigkeit, kleine (d.h. 6 oder 7 Basen) Oligonucleotidprimer für die DNA-Sequenzierung zu verwenden, Strategien zu, die ansonsten nicht möglich wären für die Sequenzierung langer DNA-Fragmente. Zum Beispiel könnte ein Kit, der 80 bis 4.000 Zufallshexamere enthält, erzeugt werden, von denen keines komplementär mit irgendeiner Stelle in dem Klonierungsvektor ist. Statistisch wird eine der 80 Hexamersequenzen durchschnittlich alle fünfzig Basen entlang des zu sequenzierenden DNA-Fragmentes auftreten. Die Bestimmung einer Sequenz von 3.000 Basen würde nur fünf Sequenzierungszyklen erfordern. Zuerst würde ein "universeller" Primer (z.B. New England Biolabs #1211, Sequenz 5' GTAAAACGAACGGCCAGT 3') verwendet werden, um etwa 600 Basen an einem Ende des Inserts zu sequenzieren. Unter Verwendung der Ergebnisse dieser Sequenzierungsreaktion würde ein neuer Primer aus dem Kit ausgesucht werden, homolog einer Region nahe dem Ende der bestimmten Sequenz. Im zweiten Cyclus würde die Sequenz der nächsten 600 Basen unter Verwendung dieses Primers bestimmt werden. Die fünfmalige Wiederholung dieses Verfahrens würde die vollständige Sequenz der 3.000 Basen bestimmen, ohne daß ein Subklonieren notwendig wäre und ohne die chemische Synthese irgendwelcher neuer Oligonucleotid-Primer. Die Verwendung solcher kurzen Primer könnte verbessert werden, indem Gen-2,5- und Gen-4-Protein von T7 in die Sequenzierungsreaktion eingeschlossen würden.

In vitro Mutagenese

Die Mutagenese der Polymerasegene wurde durchgeführt unter Verwendung von Standard-PCR-Techniken (siehe unten).

Benachteiligung von ddNTPs

-In Gegenwart von Magnesium als einzigem divalentem Kation benachteiligt T7-DNA-Polymerase ddNTPs etwa 3- bis 4fach, weniger als irgendeine andere bekannte Polymerase. Die nächstkommende ist Reverse Transkriptase, die ddNTPs etwa 10-bis 5Ofach benachteiligt (3- bis lOmal mehr als T7-DNA-Polymerase). Nach diesen beiden Enzymen benachteiligen alle anderen in der Literatur gekennzeichneten bekannten DNA-Polymerasen ddNTPs mindestens lOOfach und oft lO.OOOfach oder mehr.

In Gegenwart von Mangan ist die Benachteiligung durch T7-DNA-Polymerase und E. coli DNA-Polymerase I vermindert; mit T7-DNA-Polymerase wird sie von 3,7 auf 1 und mit E. coli DNA-Polymerase I von 550 auf 3,9 (für ddATP) verringert. Die Anmelderin ist die Erste, die eine DNA-Polymerase bereitstellt, die in Gegenwart von Magnesiumionen als den einzigen divalenten Kationen eine Prozessivität von weniger als 100 hat (definiert als durchschnittliche Extensionslänge von einem gegebenen Primer vor dem Abdissoziieren von der Primer-Matrize? Reverse Transcriptase hat eine Prozessivität gemäß dieser Definition von etwa 150 bis 200 und T7-DNA-Polymerase hat eine höhere Prozessivität als diese) und die den Einbau von ddNMP weniger als lOOfach benachteiligt. Im Gegensatz dazu haben die meisten bekannten DNA-Polymerasen, z.B. Taq eine Prozessivität von weniger als 100 und benachteiligen den Einbau eines ddNMPs mehr als lOOfach.

Früher wurde angenommen, daß obwohl Polymerasen mit einer hohen Prozessivität, wie T7-DNA-Polymerase, an einer Primer-Matrize bis zu mehreren Minuten gebunden bleiben, Polymerasen mit einer geringen Prozessivität, wie E. coli DNA-Polymerase I von einer Primer-Matrize zu einer anderen innerhalb von wenigen Sekunden (oder mehr als lOOmal häufiger) wechseln. Siehe z.B. Tabor et al., J. Biol. Chem. 262, 16212-16223

(1987). Während die Prozessivität vorteilhaft ist für die DNA-Sequenzierung, z.B. zur Verminderung des Hintergrundrauschens aufgrund von Abbruchen, die nicht durch Didesoxyeinbau entstehen, ist eine langsame Wechselzeit ein Nachteil. Wenn z.B. die Polymerase bei spezifischen Sequenzen abdissoziiert, führt dies zu starken artifiziellen Banden auf einem Sequenzgel, wenn nicht ein großer Überschuß an Polymerase vorhanden ist. Andererseits kann man mit einer Polymerase, die schnell wechselt, viel weniger Polymerase verwenden, da ein einzelnes Enzymmolekül viele verschiedene Matrizen im Verlauf einer Sequenzierungsreaktion verlängert und jedes gegebene Primerende die Möglichkeit hat, durch viele verschiedene Polymerase-Moleküle verlängert zu werden, wodurch die Chance verringert wird, daß stark spezifische Stops auftreten.

Es ist jedoch besser, daß eine Polymerase, die schnell wechselt, auch ddNMPs effizient einbaut, damit Banden mit gleichmäßiger Intensität entstehen und weniger ddNTPs verwendet werden können. Es ist auch bevorzugt, daß eine derartige Polymerase eine geringe oder keine Exonuclease-Aktivität hat und daß man Pyrophosphatase zugibt, um einen Abbau von Banden durch PyrophosphoroIyse zu verhindern.

Es ist auch bevorzugt, daß man die DNA-Sequenzierungsreaktionen mit Magnesium als dem einzigen divalenten Kation durchführen kann (d.h. in Abwesenheit von Mangan). Erstens neigen Polymerasen dazu, weniger aktiv zu sein mit Mangan verglichen mit Magnesium (siehe z.B. Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 4076-4080 (1989)). Als zweites gibt es, obwohl Polymerasen dazu neigen, über einen breiten Bereich an Magnesium-Konzentrationen aktiv zu sein, eine sehr scharfe niedrige optimale Mangan-Konzentration, die in den meisten Fällen für eine optimale Aktivität erforderlich ist (id.). Und bei den optimalen Mangan-Konzentrationen gibt es eine viel geringere Wirkung auf die Verminderung der Benachteili-

gung von ddNTPs als bei viel höheren Konzentrationen, wo die Polymerase weniger aktiv ist. Als drittes ist es nicht so -geeignet, Mangan als Metallion in einem Kit zu haben; es bildet leicht Niederschläge, insbesondere bei höheren pH-Werten. Als viertes ist nicht klar, ob Mangan als Metallion wirksam ist, um die Benachteiligung von ddNTPs bei jeder thermophilen Polymerase (d.h. bei höheren Temperaturen) zu verringern.

Vor der vorliegenden Erfindung wurde angegeben (Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 4076-4080 (1989)), daß es eine Beziehung zwischen Benachteiligung und Prozessivität gibt:

¹¹ DNA-Polymerase I hat eine geringe Prozessivität, wobei sie nach dem Einbau von weniger als 10 Nucleotiden abdissoziiert. Es gibt eine starke Beziehung zwischen der Häufigkeit, mit der das Enzym während der DNA-Synthese in Abwesenheit von ddNTPs von einer Stelle abdissoziiert und dem Ausmaß der Benachteiligung des Einbaus eines ddNMPs an dieser Stelle (unveröffentlichte Ergebnisse). Dies deutet darauf hin, daß DNA-Polymerase I dNMPs und ddNMPs in ähnlichen Raten während der prozessiven Synthese einbaut; wenn jedoch die Synthese nicht prozessiv ist, werden dNMPs bevorzugt gegenüber ddNMPs eingebaut. Dieses Modell könnte auf die größere Variabilität des ddNMP-Einbaus durch DNA-Polymerase I verglichen mit T7-DNA-Polymerase deuten, da die letztere eine Prozessivität hat, die um zwei Größenordnungen größer ist als bei Ersterer." [Zitierung weggelassen].

So sind die Ergebnisse der Erfindung mit E. coli DNA-Polymerase I und Taq-Polymerase überraschend, da kein Hinweis gefunden wird, daß die hier beschriebenen Mutanten die Prozessivität der Mutanten-Enzyme erhöhen.

_ 45 -

Thermophile Polymerasen

Thermophile Polymerasen, die ddNTP um weniger als einen faktor von 100 benachteiligen, sind besonders geeignet für die Erfindung. Außerdem sind solche, die ddNTP um weniger als einen Faktor von 100 in Gegenwart von Magnesium als dem einzigen divalenten Kation benachteiligen und bevorzugt von einer Primer-Matrize zur anderen mehr als einmal pro Sekunde wechseln, nützlich. Thermophile Polymerasen werden definiert als Polymerasen, die eine optimale DNA-Polymerase-Aktivität in einer 15minütigen Reaktion bei einer Temperatur oberhalb 60°C haben.

Gleichmäßige Banden-Intensitäten

Obwohl Mangan die Benachteiligung des Klenow-Fragmentes von ddATP vom 550fachen auf das 3,9fache verringert, zeigen Tabor und Richardson (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 4076-4080 (1989)), daß immer noch eine große Variabilität bei der Intensität der einzelnen Banden vorliegt (siehe Figur 2 id.). So liefert die Erfindung, außer der T4-DNA-Polymerase zum erstenmal Polymerasen, die schnell wechseln, wie das Klenow-Fragment und von thermophilen Organismen stammen, um Banden zu erzeugen mit gleichmäßiger Intensität, sogar in Gegenwart von Magnesium als einzigem divalenten Kation, Bedingungen, die bevorzugt sind für die Aktivität der meisten Polymerasen (siehe oben). Enzyme, die schnell wechseln, können mit Methoden bestimmt werden, die im Stand der Technik, wie unten beschrieben, bekannt sind.

Spezifische Polymerasen

Mit den obigen Informationen ist es möglich, die folgenden Polymerasen leicht herzustellen, die die gewünschten Eigenschaften, wie oben diskutiert, haben. Jede dieser Polymerasen kann für Sequenzierungsverfahren verwendet werden, wenn der Gehalt an Exonuclease gering genug ist und die Aktivität der

Polymerase ausreichend ist (was beides im Stand der Technik bekannt ist). Siehe Braithwaite und Ito oben zur Bezugnahme -auf jede Aminosäurestelle.

1. Pol I-Familie

E. coli DNA-Polymerase I mit verändertem Phe762 (verändert bedeutet ersetzt z.B. durch Tyr oder eine äquivalente Aminosäure, um die nicht benachteiligende Eigenschaft zu liefern).

Streptococcus pneumoniae DNA-Polymerase I mit verändertem Phe711.

Thermus aquaticus DNA-Polymerase I mit verändertem Phe667.

Thermus flavus DNA-Polymerase I mit verändertem Phe666.

Bacteriophage T5-DNA-Polymerase mit verändertem Phe570.

Bacteriophage Spo 1 DNA-Polymerase mit verändertem Leu526.

Bacteriophage Spo 2 DNA-Polymerase mit verändertem Phe690.

Mitochondriale DNA-Polymerase mit natürlichem Tyr753 oder an dieser Stelle verändert, ohne die nicht benachteiligende Aktivität zu vermindern. Ein solche Polymerase wurde vorher nicht für die DNA-Sequenzierung verwendet. Die Anmelderin nimmt an, daß sie für ein solches Verfahren geeignet ist wegen des erwarteten niedrigen Grads an ddNTP-Benachteiligung. Falls erforderlich, kann sie modifiziert werden, um die mit der Polymerase-Aktivität verbundene Exonuclease-Aktivität zu vermindern.

2. Polymerase alpha-Familie (auch Polymerase II-Familie genannt)

Delarue et al., Protein Engineering 3, 461-467 (1990) zeigen, daß die zwei Familien von Polymerasen (Polymerase I-Familie und Polymerase alpha-Familie) drei übereinstimmende Abschnitte teilen. Der Bereich, den sie "Abschnitt B" (Motif B) nennen, enthält den Rest, der als verantwortlich für die Spezifität für den Didesoxyriboserest identifiziert wurde. Dieser Bereich ist gekennzeichnet durch die Sequenz K N₁ N₂

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N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ Y G in der Polymerase I-Familie, wobei N₄ der Spezifitätsrest ist: wenn N₄ ein Phenylalanin ist, besteht eine hohe Benachteiligung, wenn N₄ Tyrosin ist, besteht eine geringe Benachteiligung. In der Polymerase alpha-Familie ist die Sequenz K N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ Y G (es ist eine Base weniger zwischen den konservierten Resten vorhanden). Es wird vorhergesagt, daß genau wie bei den Polymerase I-artigen Enzymen Veränderungen des Restes/der Reste in diesem Abschnitt (zwischen dem Lysin (K) und dem Tyrosin (Y) die Benachteiligung dieser Polymerasen von ddNTPs verringern. Diese Reste sind wie folgt:

Escherichia coli DNÄ-Polymerase II Ile494-Phe499

PRDl DNA-Polymerase Leu341-Ser3 46

&bgr; 29 DNA-Polymerase Leu384-Leu389

M2 DNA-Polymerase Leu381-Leu386

T4-DNA-Polymerase Ile558-Leu563 Thermococcus litoralis DNA-Polymerase (Vent) Leu492-Tyr497

Pyrococcus furiosus DNA-Polymerase Leu489-Phe494

Sulfolobus solfataricus DNA-Polymerase Val604-Thr609

Human DNA-Polymerase alpha Leu951-His956

S. cerevisiae DNA-Polymerase I (alpha) Leu945-His950

S. pombe DNA-Polymerase I (alpha) Leu931-His936 Drosophila melanogaster DNA-Polymerase alpha Leu960-His965

Tyrpanosoma brucei DNA-Polymerase alpha Leu845-His850

Human DNA-Polymerase delta Val695-Val700

Rinder-DNA-Polymerase delta Val694-Val699

S. cerevisiae DNA-Polymerase III (delta) Ile702-Val707

S. pombe DNA-Polymerase III (delta) Val681-Val686

Plasmodium falciparum DNA-Polymerase delta Ile692-Val697

S. cerevisiae DNA-Polymerase II (epsilon) Val825-Phe830

S. cerevisiae DNA-Polymerase Rev3 LeulO87-ThrlO92

Herpes Simplex virus Typ 1 DNA-Polymerase Val812-Val817

Pferde-Herpes Virus Typ 1 DNA-Polymerase Val813-Val818

Varicella-Zoster Virus DNA-Polymerase Val776-Val781

Epstein-Barr-Virus DNA-Polymerase Cys682-Val687

Herpes-Virus saimiri DNA-Polymerase Val671-

Human Cytomegalovirus DNA-Polymerase Val811-

Maus-Cytomegalovirus DNA-Polymerase Val717-

Human Herpes-Virus Typ 6 DNA-Polymerase Ile667-

Channel Catfish-Virus DNA-Polymerase Ile750-

Chlorella Virus DNA-Polymerase Ile586-

Geflügelpocken-Virus DNA-Polymerase Ile648-

Vaccinia Virus DNA-Polymerase Ile637-

Choristoneura biennis DNA-Polymerase Ile669-

Autographa californica nuclear polyhedrosis

Virus (AcMNPV) DNA-Polymerase

Lymantria dispar nuclear polyhedrosis Virus

DNA-Polymerase Arg624-

Adenovirus-2 DNA-Polymerase Leu696-

Adenovirus-7 DNA-Polymerase Leu762-

Adenovirus-12 DNA-Polymerase Leu694-

S-I Mais-DNA-Polymerase Leu618-

Kalilo neurospora intermedia DNA-Polymerase Leu776-

pA12 Ascobolus immersus DNA-Polymerase Leu951-

pCLKl Claviceps purpurea DNA-Polymerase Leu831-

Maranhar neurospora crassa DNA-Polymerase Leu752-

pEM Agaricus bitorquis DNA-Polymerase Leu573-

pGKLl Kluyveromyces lactis DNA-Polymerase Ile785-

pGKL2 Kluyveromyces lactis DNA-Polymerase Ile770-

pSKL Saccaromyces kluyveri DNA-Polymerase Ile775-

Beispiele

Val676 Phe816 Phe722 Val672 His755 Val591 Val653 Val642 Leu674

Arg606-Ile611

Ile629 Leu701 Leu767 Leu699 Leu623 Leu777 Leu956 Leu836 Leu757 Leu578 Leu790 Gly776 Gly781

Im folgenden werden Beispiele für Verfahren zur Bestimmung der Prozessivität und der Wechselzeiten für verschiedene Polymerasen angegeben. Es werden auch Beispiele angegeben, um den Grad der Benachteiligung durch eine Polymerase zu bestimmen und andere Methoden, die für die Erfindung nützlich sind.

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Beispiel 1

Mutagenese von DNÄ-Polyitierase-Genen und Überproduktion von DNA-Polymerasen-Mutanten

Standardtechniken werden verwendet zur Klonierung und Expression von mutierten DNA-Polymerase-Genen. Die Gene für das große Fragment der E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und das große Fragment der Taq-DNA-Polymerase (KlenTaq oder _Taq-DNA-Polymerase, siehe Barnes 112 Gene 29, 1992 oder Stoffel-Fragment, siehe Lawyer et al. 2 PCR Methods Appl 275, 1993), die Ausgangsmaterialien für die Erzeugung von Mutanten der E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polyraerase, werden unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotors exprimiert. Das Gen für die _28-Aminosäuredeletion der T7-DNA-Polymerase (siehe Tabor und Richardson 264, J. Biol. Chem. 6447, 1989), das Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Mutanten der T7-DNA-Polymerase, wird unter der Kontrolle des lac-Promotors in einem Strang exprimiert, der E. coli Thioredoxin erzeugt, ein notwendiger Faktor für die prozessive DNA-Synthese durch T7-DNA-Polymerase (Tabor und Richardson oben). Das Gen für die Taq-DNA-Polymerase-Mutante F667Y wird von dem Gen, das _Taq-DNA-Polymerase erzeugt, in das Gen, das die Taq-DNA-Polymerase voller Länge erzeugt, transferiert mit Standardtechniken unter Verwendung von PCR und einem Restriktionsverdau gefolgt von einer Ligierung.

Die Mutagenese, um die DNA-Polymerase-Mutanten zu konstruieren, wird durchgeführt unter Verwendung von Standard-Mutagenese-Techniken mit PCR, ähnlich dem von Sarkar und Sommer 8 BioTechniques 404, 1990 beschriebenen Verfahren. Um Hybride zu konstruieren, bei denen mehr als 4 Aminosäurereste ausgetauscht werden, werden zwei Hybrid-Primer konstruiert, wobei die PCR zuerst an der Donor-DNA durchgeführt wird und dann das Produkt für die PCR an der Rezipienten-DNA verwendet wird, was das Hybridraolekül erzeugt. Für die Konstruktion von

Hybriden, bei denen der Austausch von Domänen vier Aminosäurereste oder weniger umfaßt, werden einzelne PCR-Primer synthetisiert, die den gesamten zu transferierenden Bereich enthalten, ebenso wie die richtigen flankierenden Sequenzen des Rezipienten und dieser Primer wird verwendet, um das Hybridmolekül direkt zu konstruieren.

Die Überproduktion bzw. Anreicherung der DNA-Polymerase-Mutanten wird durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausgeber, Kapitel 16, 1994). Mutanten-Proteine werden gereinigt mit Standardverfahren einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie. Für die Reinigung von Mutanten der E. coli DNA-Polymerase I siehe z.B. Joyce und Grindley 80 Proc. Natl. Acad. Sei. 1830, 1983. Für die Reinigung von Taq-DNA-Polymerase-Mutanten siehe z.B. Engelke et al. 191 Analytical Biochemistry 396, 1990. Für die Reinigung von T4-DNA-Polymerase-Mutanten siehe z.B. Tabor und Richardson 264, J. Biol. Chem. 6447, 1989. Polymerasespezifische Aktivitäten jeder der gereinigten Mutanten-Proteine werden mit Standardverfahren bestimmt, die in diesen Literaturstellen beschrieben sind.

Beispiel 2

Schnelles Screening von DNA-Polymerasen auf Mutanten, die in iherer Effizienz bezüglich des Einbaus von Didesoxynucleotiden bezogen auf Desoxynucleotide verbessert sind

DNA-Polymerase-Mutanten werden auf ihre Fähigkeit gescreent, Didesoxynucleotide einzubauen, mit SDS-Aktivitäts-Gelanalyse. Das Verfahren ist eine Modifikation des von Spanos und Hübscher 91 Methods in Enzymology 263, 1983 und Karawya et al. 135 Analytical Biochemistry 318, 1983 beschriebenen. Kurz gesagt werden 10 ml Zellen 4 bis 6 Stunden lang induziert und dann pelletisiert. Das Zellpellet wird in 0,3 ml 25 mM Tris-

HCl, pH 7,0, 5 mM EDTA resuspendiert. 20 &mgr;&idiagr; der resuspendierten Zellen werden mit 40 &mgr;&idiagr; einer Lösung von 1 % SDS -(Natriumdodecylsulfat), 2 % Mercaptoethanol, 30 % Glycerin, 0,04 % Bromphenol blau und 100 mM Tris-HCl, pH 6,8 vermischt. Die Mischungen werden bei 37°C 5 Minuten lang inkubiert und dann werden 20 &mgr;&idiagr; Aliquots doppelt auf SDS-Polyacrylamidgele geladen. Die SDS-Polyacrylamidgele bestehen aus einem Trenngel, das 8 % Polyacrylamid, 0,27 % Bis-Acrylamid, 190 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,05 % SDS und 25 &mgr;g/ml denaturierte Lachsspermien-DNA enthält und einer Samraelgelschicht, die aus 5 % Polyacrylamid, 0,17 % Bis-Acrylamid, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8 und 0,1 % SDS besteht. Die zwei Gele werden mit 100 V 13 Stunden lang bei einer konstanten Temperatur von 13°C in einem Elektrophorese-Puffer, der aus 190 mM Tris-HCl und pH 8,8, 0,05 % SDS besteht, elektrophorisiert.

Nach der Elektrophorese werden die Gele 8 Stunden lang mit vier Austauschlösungen aus jeweils 500 ml Renaturierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol, 40 mM KCl, 400 &mgr;g/ml Rinderserumalbumin, 16 % Glycerin und 0,95 mM EDTA) bei 4°C gewaschen.

Die renaturierten Proteine werden auf DNA-Polymerase-Aktivitär getestet, indem jedes der zwei Gele in 6 ml Renaturierungspuffer, 1,5 &mgr;&Mgr; 4dNTPs, 4 &mgr;&idiagr; [a-³²P]dATP (800 Ci/mmol, 10 mCi/ml) und 80 &mgr;g gereinigtem Thioredoxin inkubiert wird. Eine der Mischungen enthält auch 3 0 &mgr;&Mgr; dTTP (ein 20facher molarer Überschuß gegenüber dTTP). Die Mischungen werden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert (2 Stunden lang bei 70°C bei thermophilen DNA-Polymerasen).

Nach der Inkubation werden die Gele 8 Stunden lang mit 4 Austauschlösungen aus 5 % Trichloressxgsäure und 1 % Natriumpyrophosphat gewaschen. Die Gele werden dann getrocknet und autoradiographiert.

• ·

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Um zu bestimmen, ob eine DNA-Polymerase-Mutante ddTTPs mehr oder weniger benachteiligt, werden die Intensitäten der radioaktiven Banden auf den zwei Gelen, die in Gegenwart und Abwesenheit von ddTTP inkubiert wurden, verglichen und das Verhältnis der Signale der zwei Banden für die unmodifizierte DNA-Polymerase wird verglichen mit dem Verhältnis der Signale der zwei Banden für jede der Mutanten. Wenn eine Mutation dazu führt, daß eine DNA-Polymerase ddTTPs weniger benachteiligt, dann gibt es einen größeren Prozentanteil der Abnahme der Radioaktivität in der Bande, in der ddTTP vorhanden ist für die DNA-Polymerase-Mutante, verglichen mit der unmodifizierten DNA-Polymerase. Zum Beispiel haben unter diesen Bedingungen die radioaktiven Banden, die für Zellen beobachtet werden, die induzierte E. coli DNA-Polymerase I oder TV-DNA- Polymerase-Mutante Y526F enthalten, ungefähr die gleiche Intensität (im Bereich eines Faktors von 2) bei Reaktionen, die in Gegenwart von ddTTP durchgeführt werden, gegenüber Reaktionen, die in Abwesenheit von ddTTP durchgeführt werden. Im Gegensatz dazu haben bei Zellen, die induzierte E. coli DNA-Polymerase I Mutante F762Y oder T7-DNA-Polymerase enthalten, die Banden auf dem Gel, in dem die Reaktionen in Gegenwart von ddTTP durchgeführt werden, weniger als 5 % der Intensität der Banden, die den Reaktionen entsprechen, die in Abwesenheit von ddTTP durchgeführt wurden.

Dieser Test stellt eine schnelle Methode dar, um eine große Anzahl von DNA-Polymerase-Mutanten auf ihre Fähigkeit zu screenen, ob sie Dxdesoxynucleotide benachteiligen. Es können Veränderungen der relativen Benachteiligungsrate um mindestens das 5fache nachgewiesen werden. Diesem Test sollten jedoch die Reinigung der potentiell interessierenden DNA-Polymerase-Mutanten und weitergehende Tests der gereinigten Proteine, ähnlich den unten beschriebenen, folgen, um genau die Wirkung jeder Mutation auf die Benachteiligung von Didesoxynucleotiden zu bestimmen.

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Die folgenden Beispiele sind Verfahren, um die Prozessivität und die Wechselzeiten für verschiedene Polymerasen zu bestimmen, den Grad der Benachteiligung von ddNTPs durch eine PoIymerase zu bestimmen, die Gleichmäßigkeit der Banden, die von Fragmenten mit Didesoxyenden auf einem DNA-Seguenzgel erzeugt werden zu bestimmen und die DNA-Polymeräsen der Erfindung für die DNA-Sequenz-Analyse zu verwenden.

Beispiel 3

Herstellung und Reinigung eines Komplexes aus einzelsträngiger M13-DNA - 5'³²P-markiertem 40-mer Primer

Die Matrize ist einzelsträngige M13 mGPl-2-DNA, 9950 Nucleotide lang, wie in US-Patent 4,795,699 beschrieben (Figur 9). Der Phage M13 mGPl-2 ist bei ATCC hinterlegt unter der Nummer 40303. Einzelsträngige M13 mGPl-2-DNA wird gereinigt, wie von Tabor et al., 262 J. Biol. Chem. 16212, 1987 beschrieben. Kurz gesagt wird der Phage gereinigt durch zwei CsCl-Gradienten-Zentrifugationen, das CsCl durch Dialyse entfernt, die DNA von dem Phagen entfernt durch Extraktion mit Phenol und Chloroform in Gegenwart von 0,1 % Natriumdodecylsulfat und die extrahierte DNA intensiv gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA dialysiert und bei 4°C aufbewahrt. Die Konzentration der einzelsträngigen M13 mGPl-2-DNA wird spektrophotometrisch bestimmt unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 8,1 A₂6o Einheiten = 1 mg/ml oder 0,3 pmol M13 mGPl-2 Matrizenmoleküle pro &mgr;&idiagr;.

Der Primer ist ein synthetisches 40-mer mit der Sequenz 5'd(TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA)3', der mit Standardverfahren synthetisiert wurde. Sie ist komplementär zu der M13 mGPl-2-DNA der Nucleotide 9031 bis 8992 (siehe '699 Patent oben bezüglich der Sequenz). Der Primer wird mit

Ionenaustausch-Chromatographie oder mit denaturierender PoIyacrylamid-Gelelektrophorese vor der endgültigen Markierung gereinigt.

Der Primer wird markiert und mit der Matrize hybridisiert, im wesentlichen wie es von Tabor et al. (oben) beschrieben wird. Der Primer wird am 5'-Ende in einer Reaktionsmischung (15 &mgr;&idiagr;) markiert, die 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl, 50 &mgr;g/ml BSA, 50 &mgr;&udiagr;&idiagr; [g³²P]ATP, 6.000 Ci/mmol, 5 pmol Primer und 10 Einheiten T4-Nucleotidkinase, hergestellt aus der PseTl-Mutante, der die Phosphatase-Aktivität fehlt, enthält. Die Mischung wird 15 Minuten bei 37°C und anschließend 15 Minuten bei 70°C inkubiert, um die Kinase zu inaktivieren. 60 &mgr;&idiagr; einzelsträngige M13 mGPl-2-DNA (0,25 mg/ml), 6 &mgr;&idiagr; IM NaCl und 3 &mgr;&idiagr; 0,2 M MgCl₂ werden zugegeben und die Mischung langsam über einen Zeitraum von 30 Minuten von 70°C auf Raumtemperatur (etwa 20 bis 25°C) gekühlt. Die Mischung wird dann einmal mit einer 1:1 Mischung von Phenol und Chloroform extrahiert und nach 30 Sekunden Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge wird die wäßrige Phase (70 &mgr;&idiagr;) auf eine 1 ml Säule Sepharose CL-6B, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA und 100 mM NaCl äquilibriert wurde, gegeben. Der markierte Primer-Matrizen-Komplex wird von der Säule eluiert mit dem gleichen Puffer, der für die Äquilibrierung verwendet wurde; der markierte Komplex eluiert mit dem Leervolumen. Nach der Elution hat der Komplex eine Konzentration von ungefähr 50 &mgr;g/ml (0,015 pmol Moleküle pro &mgr;&idiagr;) mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 200.000 cpm/&mgr;&idiagr;.

Beispiel 4

'Bestimmung der Prozessivität einer DNA-Polymerase durch Verdünnungstest

Die Prozessivität wird bestimmt durch Enzymverdünnung im wesentlichen, die von Tabor et al. (oben) und Tabor und Richardson, 84 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 4767, 1987 beschrieben. Die Reaktionen werden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie bei den Verlängerungs-ZAbbruchreaktionen, die bei der DNA-Sequenzierung verwendet werden (Tabor und Richardson, oben), außer daß die ddNTPs weggelassen werden und die Polymerase-Konzentration verringert wird, um einen Überschuß von Primer-Matrizen-Molekülen gegenüber PoIymerase-Molekülen bei einigen der Reaktionen zu haben. Die Primer-Matrize besteht aus dem einzelsträngigen Primer mit 5'-markiertem Ende, der hybridisiert ist mit einem einzelsträngigen M13 DNA-Molekül, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Die Extensions-Reaktionsmischungen werden hergestellt, im wesentlichen wie von Tabor et al. (oben) beschrieben. Jede Reaktionsmischung (18 &mgr;&idiagr;) enthält 1,0 &mgr;&idiagr; hybridisierte ³²P-markierte Primer-M13-DNA, wie in Beispiel 3 beschrieben (ungefähr 0,015 pmol, ungefähr 200.000 cpm), 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl₂/ 5 mM Dithiothreitol und 300 &mgr;&Mgr; 4dNTPs. Die Mischungen werden bei 37°C eine Minute lang inkubiert (70°C bei thermophilen DNA-Polymerasen). Die Reaktionen werden initiiert durch Zugabe von 2 &mgr;&idiagr; Aliquots der Verdünnungen der DNA-Polymerase, die analysiert werden soll, verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin. Die Reaktionsmischungen werden weiter bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) entweder 30 Sekunden oder 3 Minuten lang inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten werden 8 &mgr;&idiagr; Aliquots entfernt und entweder zu 8 &mgr;&idiagr; 90 % Formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromphenolblau für die denatu-

rierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder 2 &mgr;&idiagr; 100 mM EDTA, 2 % Natriumdodecylsulfat für die alkalische Agarose-Gelelektrophorese zugegeben.

Die Proben werden entweder mit denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder alkalischer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist am besten für die Analyse von Polymerasen mit einer durchschnittlichen Prozessivität von weniger als 500 Nucleotiden geeignet, während die alkalische Agarose-Gelelektrophorese eine empfindlichere Einschätzung der Prozessivität von DNA-Polymerasen mit einer durchschnittlichen Prozessivität von mehr als 500 Nucleotiden liefert; jedes Verfahren kann jedoch erfolgreich verwendet werden, um die durchschnittliche Prozessivität irgendeiner DNA-Polymerase zu bestimmen .

Um die Prozessivität mit denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu bestimmen, werden Aliquots in Formamid 2 Minuten lang auf 90°C erhitzt direkt vor dem Beladen von 6 &mgr;&idiagr; jeder Probe auf ein Gel, das aus 8 % Polyacrylamid, 0,4 % &Ngr;,&Ngr;'-Methylenbisacrylamid, 7 M Harnstoff in 100 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA besteht. Die Elektrophorese erfolgt bei 2.000 V 90 Minuten lang (bis das Bromphenolblau bis zum Boden des Gels gelaufen ist). Geeignete 5'-³²P-endmarkierte Molekulargewichtsmarker werden auch auf das Gel geladen, die die Bestimmung von Fragmentgrößen mit einer Länge von 100 bis 500 Nucleotiden zulassen. Ein Beispiel für solche geeigneten Marker sind T7-HPaI-Fragmente, die mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurden und dann am 5'-Ende mit ³²P markiert wurden unter Verwendung von [g-³²P]ATP und T4-Polynucleotidkinase unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. Seiten 6.20 bis 6.21 und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,

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N.Y.). Nach der Elektrophorese wird das Gel im Vakuum getrocknet und autoradiographiert. Nach der Autoradiographie Wird die Verteilung der radioaktiv markierten Fragmente mit Phosphorimager-Analyse bestimmt (Molecular Dynamics).

Die Produkte werden mit alkalischer Agarose-Gelelektrophorese analysiert, wie von (1) Villani et al., 256 J. Biol. Chem. 8202, 1981, von (2) Sabatino et al., 27 Biochemistry 2998, 1988 und von (3) Sambrook et al., oben, beschrieben. Um das Agarosegel herzustellen, werden 250 ml einer l,5%igen Agaroselösung in 2 mM EDTA, pH 8,0 in einem Mikrowellenofen erhitzt, um die Agarose zu lösen und dann auf 60°C abkühlen gelassen. 8,75 ml 1 &eegr; NaOH (Endkonzentration 35 mM NaOH) werden zugegeben, das Gel in eine Agarose-Gelelektrophoreseform gegossen. Das Gel wird vor der Verwendung zwei Stunden lang absetzen gelassen. Der Elektrophoresepuffer ist 35 mM NaOH und 2 mM EDTA. Die Proben werden vorbereitet, indem sie in 10 &mgr;&idiagr; Aliquots aufgenommen werden, wie oben beschrieben (in 20 mM EDTA, 0,4 % Natriuradodecylsulfat) und denaturiert durch Zugabe von 1 &mgr;&idiagr; 1 &eegr; NaOH und lOminütigem Erhitzen auf 60⁰C. 7 &mgr;&idiagr; 75 % Glycerin, 0,2 % Bromcresolgrün werden zu jeder Probe zugegeben und dann werden die Probe auf das alkalische Agarosegel geladen. Die Elektrophorese wird bei 4°C mit einem konstanten Strom von 150 mA 15 Stunden lang durchgeführt (bis das Bromcresolgrün etwa 14 cm weit gewandert ist). Die Elektrophoresekammer hat die Dimensionen 26 cm (Länge) &khgr; 20 cm (Breite) &khgr; 2 cm (Höhe). Nach der Elektrophorese wird das Gel 2 Stunden lang in 10 % Trichloressigsäure eingeweicht, im Vakuum getrocknet und autoradiographiert. Nach der Autoradiographie wird die Verteilung der radioaktiv markierten Fragmente mit Phosphorimageranalyse (Molecular Dynamics) bestimmt.

Um die Prozessivität einer gegebenen DNA-Polymerase zu testen, wird die Konzentration dieser Polymerase in der Reaktionsmischung in Schritten jeweils 2fach verdünnt, bis nur

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noch ein Teil (z.B. 25 %) der Primer verlängert werden, während die Mehrzahl (z.B. 75 %) unverändert, 40 Nucleotide -lang, bleibt. Unter diesen Bedingungen sollte eine 2fache Erhöhung oder eine 2fache Verminderung der DNA-Polymerase-Konzentration zu eineir 2fachen Erhöhung bzw. 2fachen Verringerung des Anteils der verlängerten Primer führen. Die durchschnittliche Länge der markierten Fragmente, die verlängert werden, wird entweder durch visuelle Untersuchung des Autoradiogramms oder durch quantitative Auswertung unter Verwendung eines Phosphorimagers bestimmt. Zum Beispiel hat bei Verwendung dieses Tests die Exonuclease-defiziente T7-DNA-Polymerase, die mit ihrem Prozessivitätsfaktor Thioredoxin komplexiert ist (z.B. SEQUENASE^R Version 2.0, United States Biochemical Corporation) eine durchschnittliche Prozessivität von mehr als 500 Nucleotiden, während das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I eine Prozessivität von weniger als 50 Nucleotiden hat.

Beispiel 5

Bestimmung der Wechselrate einer DNA-Polymerase

Die Wechselrate wird bestimmt, im wesentlichen wie von Tabor et al. (oben) beschrieben. Die Reaktionen werden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie bei den Verlängerungs-/Abbruchreaktionen, die bei der DNA-Sequenzierung verwendet werden (Tabor und Richardson, oben), außer daß die ddNTPs weggelassen werden und die Polymerase-Konzentration verringert wird, um einen Überschuß an Primer-Matrizen-Molekülen gegenüber Polymerase-Molekülen zu haben. Die Primer-Matrize besteht aus dem am 5'-Ende mit [³^P] markierten Primer, der mit dem einzelsträngigen Ml3-DNA-Molekül hybridisiert ist, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Zuerst wird ein Test durchgeführt, um das funktionelle Verhältnis von Primer-Matrizen-Molekülen zu Polymerase-Molekülen zn bestimmen, z.B. unter Verwendung des großen Fragments der E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment). Ein Verdünnungstest wird durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben, um die Konzentration der Polymerase-Moleküle zu bestimmen, die notwendig ist, um 20 % der markierten Primer-Matrizen-Moleküle in 10 Sekunden zu verlängern. Dieses Verhältnis von Polymerase zu Primer-Matrize wird definiert als weniger als oder gleich 1:5 und wird verwendet, um die maximale Wechselrate der Polymerase, wie unten beschrieben, zu bestimmen.

Verlängerungsreaktionen werden durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung eines Verhältnisses von DNA-Polymerase zu Primer-Matrize von weniger als oder gleich 1:5, wie im vorhergehenden Abschnitt definiert. Die Reaktionen werden unter solchen Bedingungen durchgeführt (d.h. Puffer, pH, Salz, Temperatur), die optimal für die zu testende Polymerase sind. Aliquots werden nach 10 Sekunden, 20 Sekunden, 40 Sekunden und 80 Sekunden entnommen und die Reaktionen werden beendet und die Produkte analysiert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Für DNA-Polymerasen mit geringer Prozessivität (weniger als 100 Nucleotide), z.B. das große Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, werden Proben bevorzugt analysiert mit denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Für DNA-Polymerasen mit hoher Prozessivität (mehr als 100 Nucleotide) , wie T7-DNA-Polymerase, werden Proben bevorzugt mit alkalischer Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Nach der Elektrophorese werden die Gele im Vakuum getrocknet und entweder mit Autoradiographie oder mit einem Phosphorimager analysiert.

Wenn Reaktionen durchgeführt werden mit einer Polymerase, die sehr langsam wechselt, wie T7-DNA-Polymerase, entsteht keine wesentliche Abnahme (d.h. weniger als um den Faktor 2) in der Anzahl der nicht verlängerten Primer zwischen 10 und 80

Sekunden. Wenn somit die Anzahl der nicht verlängerten markierten Primer zwischen den Zeitpunkten 10 Sekunden und 80 -Sekunden um nicht mehr als das 2fache abnimmt, dann wechselt die DNA-Polymerase langsamer als einmal pro 70 Sekunden. Für Polymerasen, die schnell wechseln, nimmt die Anzahl der nicht verlängerten Primer um einen wesentlichen Anteil ab (d.h. um mehr als das 2fache) zwischen den Zeitpunkten 10 Sekunden und Sekunden. Um die Wechselrate für diese Polymerasen zu bestimmen, wird die folgende Gleichung verwendet:

R = N₁ &khgr; L(t₂)/{L(t₁)x(t₂-t₁)}

worin:

minimale Wechselrate in Cyclen pro Sekunde Verhältnis von Primer-Matrizen-Molekülen zu funktioneilen DNA-Polymerase-Molekülen (N₁ = 5 in dem Beispiel oben)

maximale Prozessivität der zu untersuchenden DNA-Polymerase in Nucleotiden. Dies wird definiert als maximale Anzahl von Nucleotiden, die von den markierten Primer verlängert werden unter Bedingungen, bei denen die DNA-Polymerase begrenzt ist (wo nur 20 % der Primer zum 10 Sekunden Zeitpunkt verlängert werden), wie in Beispiel 3 beschrieben.

L(t₂)= maximale Länge der Verlängerung (in Nucleotiden) der markierten Primer zum Zeitpunkt t₂, der in diesem Beispiel 80 Sekunden ist.

kürzeste Zeit, zu der ein Aliquot entnommen wird oder 10 Sekunden in diesem Beispiel.

längste Reaktionszeit, die zugelassen wird, bevor ein Aliquot entnommen wird, oder 80 Sekunden in diesem Beispiel.

Wenn dieser Test für das große Fragment der E. coli DNA-Polymerase I durchgeführt wird, wird ein Wert von mehr als 0,2 Zyklen pro Sekunde erhalten.

Die Beispiele 6 und 7 liefern Tests, um die Effizienz des Einbaus von Didesoxynucleotiden einer unbekannten DNA-Polymerase zu bestimmen unter Verwendung eines am 5'-Ende mit ³²P markierten 40-mer Primers, der mit einer einzelsträngigen Ml3-DNA-Matrize hybridisiert ist, und einer Analyse auf Basis einer Gelelektrophorese. Beispiel 6 ist am besten für DNA-Polymerasen, die Didesoxynucleotide effizient einbauen (z.B. Wildtyp T7-DNA-Polymerase und Taq-DNA-Polymerase F667Y) geeignet, während Beispiel 7 am besten geeignet ist für DNA-Polymerasen, die den Einbau von Didesoxynucleotiden stark benachteiligen (z.B. T7-DNA-Polymerase Y526F und Wildtyp Taq-DNA-Polymerase) .

Beispiel 6

Bestimmung der Einbaurate von Didesoxynucleotiden im Vergleich zu Desoxynucleotiden auf Basis einer Gelelektrophorese unter Verwendung eines Verhältnisses von dNTP zu ddNTP von 1:1.

Die primäre Anwendung dieses Tests besteht darin, das absolute Verhältnis des Einbaus von ddNMP zu dNMP für eine DNA-Polymerase zu bestimmen, die Didesoxynucleotide effizient einbaut, z.B. T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I Mutante F762Y oder Taq-DNA-Polymerase Mutante F667Y. Er kann auch den Benachteiligungsgrad von ddNTPs für jede DNA-Polymerase anzeigen; für DNA-Polymerasen, die ddNTPs stark benachteiligen, wie die T7-DNA-Polymerase Mutante Y526F, E. coli DNA-Polymerase I oder Taq-DNA-Polymerase, sind jedoch höhere Verhältnisse von ddNTP zu dNTP notwendig, um den Benachteiligungsgrad genau zu bestimmen, was im Detail in Beispiel 7 beschrieben wird.

Die DNA-Synthese-Reaktionen werden an einem mit ³^P endmarkierten 40 mer-Ml3 mGPl-2-DNA-Matrizenkomplex, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Es werden solche Reaktionsbedingungen verwendet, die optimal für die zu testende DNA-Polymerase sind, im Hinblick auf Puffer, pH, Salze und Temperatur der Reaktion. Eine Konzentration der DNA-Polymerase wird ausgewählt, bei der die meisten Primer in einer lOminütigen Reaktion verlängert werden und durch den Einbau von Didesoxynucleotid abgebrochen werden. Die Reaktionsmischung enthält 100 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 100 &mgr;&Mgr; von einem der vier ddNTPs.

Dieser Test wurde verwendet, um die Fähigkeit von 6 DNA-PoIymerasen zu vergleichen, jedes der vier ddNMPs einzubauen. Die getesteten DNA-Polymerasen waren (1) T7-DNA-Polymerase mit einer Deletion von 28 Aminosäuren in der Exonuclease-Domäne, komplexiert in einem Verhältnis von 1:1 mit Thioredoxin (Tabor und Richardson 264 J. Biol. Chem. 6447, 1989) (hier bezeichnet als ^IIT7-DNA-Polymerase"), (2) das große Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, allgemein als Klenow-Fragment bezeichnet (hier als "E. coli DNA-Polymerase I" bezeichnet), (3) unmodifizierte DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (hier als "Taq-DNA-Polyitierase" bezeichnet), (4) T7-DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, worin das Tyrosin an Position 526 gegen ein Phenylalanin ausgetauscht wurde (hier bezeichnet als "T7-DNA-Polymerase Y526F"), (5) E. coli DNA-Polymerase I, wie oben beschrieben, worin das Phenylalanin an Position 762 gegen ein Tyrosin ausgetauscht wurde (hier als "E. coli DNA-Polymerase I F762Y" bezeichnet) und (6) Taq-DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, worin das Phenylalanin an Position 667 gegen ein Tyrosin ausgetauscht wurde (hier als "Taq-DNA-Polymerase F667Y" bezeichnet).

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Um die relative Rate der Verwendung jedes der 4 ddNTPs, im Vergleich zu den vergleichbaren dNTPs, für jede der oben angegebenen DNA-Polymerasen, zu testen, enthielten die Reaktionsmischungen (8 &mgr;&idiagr;) 1,0 &mgr;&idiagr; hybridisierte ³^P-markierte Primer-M13-DNA, wie in Beispiel 3 beschrieben (ungefähr 0,015 pmol, ungefähr 200.000 cpm) , 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 100 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 100 &mgr;&Mgr; ddCTP. Die Reaktionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung der DNA-Polymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Die Reaktionen wurden initiiert durch Zugabe von jeweils 2 &mgr;&idiagr; DNA-Polymerase, verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin auf eine Konzentration von ungefähr 0,025 Einheiten/&mgr;&idiagr;. Die Konzentration jeder DNA-Polymerase war ausreichend, um die meisten markierten Primer um mehr als 500 Nucleotide in einer 15minütigen Reaktion in Abwesenheit von ddNTPs zu verlängern. Die Reaktionsmischungen wurden 15 Minuten entweder bei 37° C (T7-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I und E. coli DNA-Polymerase I F762Y) oder 70°C (Taq-DNA-Polymerase und Taq-DNA-Polymerase F667Y) inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet durch Zugabe von 10 &mgr;&idiagr; 90 % Formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromphenolblau. Jede Probe wurde 2 Minuten lang auf 90° C erhitzt direkt bevor 6 &mgr;&idiagr; jeder Probe auf ein Gel geladen wurden, das aus 8 % Polyacrylamid, 0,4 % &Ngr;,&Ngr;'-Methylenbisacrylamid, 7 M Harnstoff und 100 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA bestand. Die Elektrophorese erfolgte mit 2.000 V 90 Minuten lang (bis das Bromphenolblau zum Boden des Gels gelaufen war). Nach der Elektrophorese wurde das Gel im Vakuum getrocknet und autoradiographiert. Nach der Autoradiographie wurde die Verteilung der radioaktiv markierten Fragmente mit Phosphorimager-Analyse (Molecular Dynamics) bestimmt. Alternativ können die relativen Intensitäten der Banden mit Didesoxyenden bestimmt werden, indem das Auto-

U. &Ggr;: Ä. C:

radiogramm gescannt wird unter Verwendung eines Geräts, wie dem SciScan 5.000 Bilddensitometer (United States Biochemical Corp).

Wenn der Satz der vier Reaktionen (die jeweils ein einzelnes ddNTP in einer äquimolaren Konzentration wie das dNTP enthalten) mit jeder der 6 DNA-Polymerasen, die oben beschrieben wurden, durchgeführt wurde, führten die Reaktionen mit 3 DNA-Polymerasen (T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase) zur höchsten (>50 %) Radioaktivität bei den Primern, die verlängert worden waren, die zur Spitze des Gels wanderten, entsprechend Fragmenten mit einer Länge von mehr als 300 Basen. Auf Basis der vorhergesagten exponentiellen Abnahme des Signals mit ansteigender Fragmentgröße entspricht dies einer Benachteiligung aller 4 ddNTPs durch diese drei DNA-Polymerasen um mehr als das Hundertfache. Eine genauere Messung der Benachteiligung der ddNTPs durch diese drei DNA-Polymerasen wird erhalten unter Verwendung des Tests von Beispiel 7 unten.

Für die anderen drei DNA-Polymerasen (T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y) zeigte das Autoradiogramm eine Reihe von Fragmenten mit Didesoxyende bei allen Reaktionen. Im allgemeinen war die durchschnittliche Länge der markierten synthetisierten Fragmente am geringsten für Taq-DNA-Polymerase F667Y, mit nur etwa 6 radioaktiv markierten Fragmenten mit Didesoxyende, die sichtbar waren, sogar nach einer mehrtägigen Belichtung des Films. Die durchschnittliche Länge der markierten Fragmente mit E. coli DNA-Polyraerase I F762Y war etwas langer als die mit Taq-DNA-Polymerase F667Y, während die durchschnittlichen Längen signifikant langer sind bei T7-DNA-Polymerase. Die Fragmente sind gleichmäßiger in der Intensität, wenn sie von E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y synthetisiert wurden, als mit T7-DNA-Polymerase.

• · O ·

Die Verteilung der Radioaktivität in den Fragmenten wurde mit Phosphorimager-Analyse (Molecular Dynamics) quantitativ ausgewertet. Die Gesamtmenge von markierten Primern in jeder Bahn wurde bestimmt, indem drei Kontrollreaktionen, bei denen keine DNA-Polymerase vorhanden war, laufen gelassen wurden und die Radioaktivität in jeder der entsprechenden radioaktiven Banden auf dem Gel an der Position des nicht verlängerten Primers bestimmt wurde. Bei einigen Präparaten von radioaktiv markierten Primern wird ein bestimmter Prozentsatz (<10 %) von keiner der DNA-Polymerasen verlängert, unabhängig von der Konzentration der verwendeten DNA-Polymerase; dieses Hintergrundrauschen wird bestimmt, indem der Prozentanteil der Radioaktivität gemessen wird, der an der Position des nicht verlängerten Primers zurückbleibt bei einer Reihe von vier Reaktionen, die ddNTPs enthalten, und der Durchschnitt dieser vier Werte von der Gesamtanzahl der Zählimpulse, die vorher bestimmt wurden, abgezogen wird. Dieser Wert wird definiert als die Gesamtzahl von Zählimpulsen bei Primern, die mit einer DNA-Polymerase verlängert werden können.

Die Gesamtzahl der Zählimpulse (d.h. Radioaktivität) in den ersten drei Fragmenten mit Didesoxyenden wurden bestimmt für T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y für jede der vier ddNTP-Reaktionen. Die Werte sind in der Tabelle unten angegeben als Prozentanteil Zählimpulse bei den ersten drei Fragmenten mit Didesoxyende von der Gesamtzahl der Zählimpulse bei den Primern, die mit einer DNA-Polymerase verlängert werden können.

Polymerase Reaktion

ddGTP ddATP ddTTP ddCTP

T7DNA

Polymerase 67% 66% 76% 61%

E. coli DNA

Polymerase I F762Y 95% 92% 96% 92%

Taq DNA

Polymerase F667Y 97% 95% 95% 99%

Als weiterer Test für die Effizienz jeder DNA-Polymerase zum Einbau von Didesoxynucleotiden wurde die Anzahl der Zählimpulse in jedem Fragment mit einem wesentlichen Signal für jede Reaktion bestimmt und die Daten wurden aufgetragen als Funktion der Fragmentzahl unter Verwendung des Macintosh-Programms Kaleidograph Version 3.0 (Synergy Software). Von den entstehenden Punkten wurde eine Kurve mit exponentiellem Abfall aufgezeichnet unter Verwendung des Kaleidograph-Bibliotheksprogramm (library routine) für diese Funktion. Die Abfallkurve wird angegeben durch die Gleichung:

Y _ _eM-:X

worin:

1- (Anteil der markierten Primer in den Fragmenten l bis X verglichen mit der Gesamtzahl von Primern, die verlängert werden können)

Fragmentzahl (das erste Fragment mit Didesoxyende ist 1)

4 ·

M = Funktion des exponentiellen Abfalls berechnet für die Daten mit dem Kaleidograph-Bibliotheksprogramm.

In der Tabelle unten werden die folgenden Daten für jede der vier ddNTP-Reaktionen unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y angegeben:

N die Anzahl der Fragmente, die für jede Exponentialkurve verwendet wird

M die berechnete Funktion des exponentiellen Abfalls, wie oben beschrieben

D der Benachteiligungsfaktor angegeben als das Verhältnis der Verwendung eines spezifischen dNTPs zu der Verwendung des vergleichbaren ddNTPs, wenn beide Nucleotide in gleichen Konzentrationen vorhanden sind. D wird aus der Gleichung oben berechnet unter Verwendung des berechneten Werts von M, um Y zu bestimmen, wenn X = I und zur Definition von D, dem Verhältnis der Bevorzugung von dNTP gegenüber ddNTP als Y/(l-Y).

R² der Korrelationsindex für die Daten, wurde berechnet mit dem Kaleidograph-Bibliotheksprogramm. Dies ist ein Maß der Variabilität der Bandenintensitäten oder der sequenzspezifischen Variabilität bei der Fähigkeit einer DNA-Polymerase, das spezifische Didesoxynucleotid einzubauen.

Polymerase	ddNTP	4 ddNTP	N	M	D	R²
&Tgr;7 DNA	ddGTP		8	-0.375	2.2	0.813
Polymerase		4 ddNTP
	ddATP		6	-0.356	2.3	0.996
	ddTTP		5	-0.450	1.8	0.997
	ddCTP	4 ddNTP	8	-0.317	2.7	0.889
E. colt DNA	ddGTP		5	-1.03	0.56	0.999
P olymerase I
F762Y
	ddATP	5	-0.860	0.72	0.998
	ddTTP	5	-1.06	0.54	1.000
	ddCTP	6	-0.842	0.75	LOOO
Taq DNA	ddGTP	5	-1.18	0.45	0.995
Polymerase
F667Y
	ddATP	6	-0.997	0.59	0.997
	ddTTP	6	-1.01	0.56	0.996
	ddCTP	4	-1.44	0.32	0.996
Durchschnittswerte
T7DNA			2.3	.924
P olymerase
E. coii DNA			0.64	.999
Polymerase I
F762Y
Taq DNA			0.48	.996
P olymerase
F667Y

Zusammenfassend benachteiligt die T7-DNA-Polymerase die ddNTPs durchschnittlich 2,3fach, während E. coli DNA-PoIymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y tatsächlich ddNTPs gegenüber dNTPs um durchschnittlich das l,6fache (1/0,64) bzw. das 2,Ifache (1/0,48) bevorzugen- Ein Vergleich von R² zeigt, daß die Intensität benachbarter Fragmente gleichmäßiger ist bei E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y, als bei T7-DNA-Polymerase. Für eine genauere Messung der Einheitlichkeit könnte eine größere Anzahl von Fragmenten in der Analyse enthalten sein, indem der Anteil der ddNTPs verringert wird (z.B. um das 5fache) bei jeder Reaktion, wodurch die Abnahme der Intensität an jeder Position vermindert wird (siehe Beispiel 13).

Um den Anteil an Benachteiligung von ddNTPs bei einer neuen DNA-Polymerase zu bestimmen, würden Reaktionen, analog zu den oben beschriebenen durchgeführt und identische Reaktionen würden parallel dazu durchgeführt unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase (SEQUENASE Version 2.0, United States Biochemical Corporation), wobei alle Reaktionen auf dem gleichen Gel analysiert würden. Ein Anfangsvergleich der Verteilung der Banden mit Didesoxyenden, die mit der neuen PoIymerase erhalten werden verglichen mit solchen, die mit T7-DNA-Polymerase erhalten werden, würde anzeigen, ob eine neue DNA-Polymerase ddNTPs mehr oder weniger benachteiligt, als T7-DNA-Polymerase. Zum Beispiel zeigt eine solche visuelle Untersuchung unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase I F726Y klar, daß für Reaktionen mit jedem der vier ddNTPs die Anzahl von Fragmenten, die auf dem Gel sichtbar sind, bei Reaktionen unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase I F762Y geringer ist (und die durchschnittliche Größe kleiner) als die bei Verwendung von T7-DNA-Polymerase. Eine quantitativere Analyse könnte dann durchgeführt werden analog, wie oben beschrieben, um den Faktor des exponentieIlen Abfalls (M), die durchschnittliche relative Rate der Verwendung von

dNTPs gegenüber ddNTPs (D) und die Variabilität der Intensität (R²) für die neue DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, -zu berechnen.

Eine Komplikation kann bei diesem Test auftreten, wenn die DNA-Polymerase eine damit verbundene Exonuclease-Aktivität aufweist, z.B. die mit der Taq-DNA-Polymerase verbundene 5' ->■ 3'-Exonuclease-Aktivität und die 3' -* 5'-Exonuclease-Aktivität, die mit E. coli DNA-Polymerase I und nativer T7-DNA-Polymerase verbunden ist (nicht die in den Versuchen oben verwendete _28-T7-DNA-Polymerase-Deletionsmutante). Eine 5'-+3'-Exonuclease-Aktivität ist schädlich, da sie die Markierung am 5'-Ende des Primers entfernen kann, was das Radioaktivitätssignal, das nachgewiesen werden soll, vermindert. Dieses Problem kann teilweise vermieden werden, indem die Menge an DNA-Polymerase in der Reaktionsmischung verringert wird. Im Beispiel oben führten 0,025 Einheiten Taq-DNA-Polymerase bei praktisch allen Primern dazu, daß sie verlängert wurden, bis sie durch Einbau eines Didesoxynucleotids abgebrochen wurden, ohne wahrnehmbaren Verlust der Radioaktivität aufgrund einer 5'-»3'-Exonuclease-Aktivität, wohingegen ein 4Ofacher Anstieg der Taq-DNA-Polymerase-Aktivität, oder eine Einheit pro Reaktion, zu einem Verlust praktisch aller ³²P an den 5'-Enden des Primers führte. Ein alternativer Ansatz, um den Grad der Benachteiligung für eine DNA-Polymerase mit 5'-*3'-Exonuclease-Aktivität zu messen, besteht darin, einen anderen Test zu verwenden, z.B. einen, der in den Beispielen 8 bis 10 beschrieben wird.

Eine 3'-»-5'-Exonuclease-Aktivität kann den oben beschriebenen Test komplizierter machen, indem sie die DNA-Polymerase mehr die ddNTPs benachteiligend erscheinen läßt, als sie es tatsächlich tut (siehe z.B. Tabor und Richardson, 86 Proc. Natl. Acad. Sei. 4076, 1987). Dies beruht darauf, daß dann, wenn einmal ein Didesoxynucleotid eingebaut wurde, die Exonuclease-Aktivität bevorzugt das Didesoxynucleotid entfernen

- 71 -

kann, so daß die DNA-Synthese fortschreiten kann, was zu einer Erhöhung der Länge des Fragmentes führt. Bevorzugt haben die im oben beschriebenen Test untersuchten Enzyme keine solche 3'-+5'-Exonuclease-Aktivität; Beispiele sind die modifizierte T7-DNA-Polymerase (Sequenase^R, United States Biochemical Corporation), Taq-DNA-Polymerase, Exonuclease-defiziente Vent (Thermococcus litoralis) DNA-Polyiaerase (New England Biolabs Katalog Nr. 257), Exonuclease-defiziente Deep Vent (Pyrococcus GB-I) DNA-Polymerase (New England Biolabs Katalog Nr. 259), Exonuclease-defiziente Pfu (Pyrococcus furiosus) DNA-Polymerase (Stratagene Katalog Nr. 600163) und Exonuclease-defizientes Klenow-Fragment (E. coli DNA-Polymerase I, United States Biochemical Corporation, Katalog Nr. 70057). In einigen Fällen, z.B. bei E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) ist die S'-^S'-Exonuclease-Aktivität schwach und stört den Test nicht wesentlich (siehe z.B. Tabor und Richardson 264 J. Biol. ehem. 6447, 1989). Ein Verfahren, um zu bestimmen, ob eine neue DNA-Polymerase, die getestet werden soll, eine 3'-*-5'-Exonuclease-Aktivität aufweist, d.h. die Fähigkeit, die Benachteiligung von ddNTPs genau zu messen, stört, besteht darin, den oben beschriebenen Test durchzuführen, Aliquots zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 60 Minuten zu entnehmen. Wenn die Größenverteilung der Fragmente mit Didesoxyenden mit der Zeit ansteigt, dann ist es wahrscheinlich, daß eine solche 3'->5'-Exonuclease-Aktivitat den Test stört, während dann, wenn die Verteilung der Fragmente mit der Zeit konstant bleibt, eine solche Aktivität keinen wesentlichen Einfluß hat. Wenn die durchschnittliche Fragmentlänge mit der Zeit ansteigt, sollte man eine kürzere Inkubationszeit und/oder eine kleinere DNA-Polymerase-Konzentration verwenden bis zu einem Bereich, in dem die Fragmentgrößen mit der Zeit konstant bleiben.

Die Pyrophosphorolyse oder die Umkehr der Polymerase-Reaktion kann eine ähnliche Wirkung wie die 3'->5'-Exonuclease-Aktivität haben, was zuläßt, daß die DNA-Polymerase das Ketten ab-

brechende Didesoxynucleotid entfernt und die Länge der Fragmente weiter ansteigt (siehe Tabor und Richardson, 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Diese Aktivität kann leicht vermieden werden, indem Pyrophosphatase der Reaktionsmischung zugesetzt wird, um das Pyrophosphat, das sich während der DNA-Synthese ansammelt, und ein notwendiges Substrat für die Pyrophosphorolyse ist, zu entfernen.

Beispiel 7

Bestimmung der Einbaurate von Didesoxynucleotiden im Vergleich zu Desoxynucleotiden auf Basis von Gelelektrophorese, indem das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs variiert wird

Dieses Beispiel ist ähnlich dem in Beispiel 6 beschriebenen. Obwohl es der bevorzugte Test für DNA-Polymerasen ist, die den Einbau von Didesoxynucleotiden stark benachteiligen (z.B. T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase) arbeitet es auch gut bei DNA-Polymerasen, die wirksam ddNMPs einbauen (z.B. T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I Mutante F762Y und Taq-DNA-Polymerase Mutante F667Y). Bei diesem Test wird das Verhältnis von ddNTP zu dNTP für zwei verschiedene DNA-Polymerase-Präparate variiert, wobei alle anderen Bedingungen der Reaktionen identisch gehalten werden und die Verteilungen der radioaktiv markierten Fragmente mit Didesoxyende werden verglichen, um das Verhältnis zu bestimmen, das für die zwei zu testenden DNA-Polymerasen erforderlich ist, um Fragmente mit vergleichbarer durchschnittlicher Länge zu erhalten.

Die durchschnittliche Länge einer Reihe von Fragmenten wird bestimmt auf einem von zwei Wegen. Beim ersten Weg, der am besten für DNA-Polymerasen geeignet ist, die ddNMPs effizient einbauen, untersucht man das Autoradiogramm und bestimmt die Position des größten Fragments, das sichtbar ist bei einer gegebenen Belichtung für eine Reihe von Reaktionen, die Ver-

hältnisse von ddNTP zu dNTP enthalten, die in Stufen um jeweils das 2fache variieren, unter Verwendung einer DNA-Polymerase und vergleicht dies mit einer analogen Reihe unter Verwendung der zweiten DNA-Polymerase, um die Verhältnisse zu bestimmen, die erforderlich sind, um Fragmente mit vergleichbarer Größe für die zwei DNA-Polymer as en zu erzeugen. Die Position der Front, die das Auftreten sichtbarer radioaktiver Banden markiert, ist gewöhnlich relativ scharf und leicht mit dem Auge zu sehen. Es ist jedoch auch möglich, solche Positionen genauer zu bestimmen unter Verwendung des Phosphorimagers, um die Position in jeder Bahn zu lokalisieren, wo eine bestimmte Schwelle der Radioaktivität pro Flächeneinheit auftritt, wobei an der Spitze des Gels begonnen wird und nach unten durch das Gel gewandert wird.

Einige DNA-Polymerasen benachteiligen den Einbau von Didesoxynucleotiden sehr stark, wobei es dann schwierig ist, ausreichend ddNTPs zu der Reaktion zuzugeben, um klar die Position der größten Fragmente mit Didesoxyende auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel nachzuweisen. Für solche DNA-Polymerasen kann man eine alkalische Agarose-Gelelektrophorese verwenden, um die Längen der Fragmente mit Didesoxyenden in verschiedenen Serien zu vergleichen. Wenn man ein denaturierendes Polyacrylamidgel verwendet, dann besteht ein alternatives Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses von ddNTP zu dNTP, das erforderlich ist, damit die zwei DNA-Polymerasen Fragmente mit Didesoxyenden mit vergleichbaren durchschnittlichen Längen erzeugen, darin, sich auf eine oder mehrere Banden zu konzentrieren und das Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs zu bestimmen, das erforderlich ist, um für die zwei zu testenden DNA-Polymerasen einen spezifischen Grad an Radioaktivität für solche Fragmente zu erhalten, wie es mit dem Phosphorimager analysiert wird.

• &ogr; · ·

Diese Tests wurden durchgeführt unter Verwendung der in Beispiel 6 beschriebenen DNA-Polymeräsen. Die Reaktionsbedingungen waren identisch mit denen in Beispiel 6 beschriebenen mit Ausnahme der Konzentrationen von dNTPs und ddNTPs. Alle Reaktionsmischungen enthielten 10 &mgr;&Mgr; 4 dNTPs. Jede der vier ddNTP-Konzentrationen wurde variiert bei einer Erhöhung jeweils um das Zweifache im folgenden Bereich für die 6 DNA-Polymerasen: T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y 0,02 &mgr;&Mgr; bis 1 &mgr;&Mgr; und T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase 100 bis 2-000 &mgr;&Mgr;. Die Reaktionen wurden durchgeführt und die Proben mit denaturierender PoIyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Das Trocknen des Gels, die Autoradiographie und die Phosphorimager-Analyse waren wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Tabelle unten faßt die Ergebnisse dieses Versuchs zusammen; die für T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y gezeigten Werte sind die absoluten Verhältnisse, die in Beispiel 6 erhalten wurden durch statistische Analyse der Rate des exponentiellen Abfalls der Intensität von Fragmenten mit Didesoxyende, unter Verwendung eines Verhältnisses von dNTP zu ddNTP von 1:1. Die für T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase erhaltenen Werte wurden erhalten, indem die Verhältnisse von ddNTP zu dNTP bestimmt wurden, die erforderlich waren, um eine Reihe von Fragmenten mit Didesoxyende zu erzeugen mit vergleichbarer durchschnittlicher Länge zu einer Reihe, die erzeugt wurde unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y, d.h. für jedes Paar von Wildtyp- und Mutanten-DNA-Polymeräsen wurden die Verhältnisse von ddNTPs zu dNTPs bestimmt, die eine vergleichbare Verteilung von Fragmenten mit Didesoxyenden ergeben. Das in der Reaktion mit dem stark benachteiligenden Enzym (d.h. eines, das Phenylalanin an der kritischen Position enthält) verwendete Verhältnis von ddNTP zu dNTP geteilt durch das Verhältnis von

ddNTP zu dNTP, das verwendet wurde, um eine vergleichbare Verteilung von Fragmenten mit Didesoxyenden zu erhalten mit "dem relativ nicht benachteiligenden Enzym (d.h. das Enzym, das Tyrosin an der kritischen Position enthält) ergibt einen Faktor, der der Differenz in der Effizienz zwischen den zwei DNA-Polymerasen bei ihrer Verwendung von ddNTPs bezogen auf vergleichbare dNTPs entspricht. Dieser Faktor wurde multipliziert mit den absoluten Verhältnissen, die für T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y in Beispiel 6 erhalten wurden, um die Werte zu erhalten, die unten für T7-DNA-Polymerase Y526F, E. coli DNA-Polymerase I bzw. Taq-DNA-Polymerase gezeigt sind.

Polymerase Verhältnis der Einbauraten

	dG/ddG	dA/ddA	dT/ddT	dC/ddC
T7 DNA
P olymerase	3.2	3.3	2.8	3.7
T7DNA
Polymerase Y526F 6,400	7,300	8,400	11,000
E. coli DNA
Polymerase I	140	720	1,100	250
E. coli DNA
Polymerase I F762Y	0.56	0.72	0.54	0.75
Taq DNA
Polymerase	1,400	4,700	4,500	2,600
Taq DNA
Polymerase F667Y	0.45	0.59	0.56	0.32

Die Tabelle unten faßt die Wirkung zusammen, die Tyrosin anstelle von Phenylalanin an dem kritischen Selektivitätsrest der T7-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I und Taq-DNA-Polymerase auf die Verwendung von ddNTPs bezogen auf dNTPs hat.

- 76 -

Rest	durchschnittliche Rate	Verbesserung in dN/ddN	Verwendung von ddNTPs
T7-DNA Polymerase	Tyrosin (WT) Phenylalanin	3,0 8.000	3.000 X
E. coli DNA Polymerase	Phenylalanin (WT) I Tyrosin	600 0,6	1.000 X
Taq DNA Polymerase	Phenylalanin (WT) Tyrosin	3.000 0,5	6.000 X

Um diesen Test zu verwenden, um das Ausmaß der Benachteiligung für eine neue DNA-Polymerase zu bestimmen, würden Reaktionen, wie oben beschrieben, durchgeführt, wobei anfangs ein weiter Bereich von Verhältnissen von ddNTPs zu dNTPs verwendet würde und die Verteilung der Fragmente mit Didesoxyenden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel verglichen würde mit denen eines Standards, z.B. T7-DNA-Polymerase. Zur Anpassung der Bahnen, die vergleichbare durchschnittliche Längen der DNA-Fragmente haben, wird das Verhältnis der ddNTPs zu dNTPs der neuen DNA-Polyinerase dividiert durch das Verhältnis, das bei T7-DNA-Polymerase verwendet wurde, was den Benachteiligungsgrad für ddNTPs der neuen DNA-Polymerase bezogen auf die T7-DNA-Polymerase ergibt.

Um diesen Test zu verwenden, um zu bestimmen, ob die Modifikation einer DNA-Polymerase zu einer Abnahme ihrer Fähigkeit, ddNTPs zu benachteiligen, führt (d.h. Didesoxynucieotide effizienter einzubauen), würde eine identische Anzahl von Einheiten der modifizierten und unmodifizierten DNA-Polymerasen in einer Reihe von Reaktionen verwendet, die unterschiedliche Verhältnisse von ddNTPs zu dNTPs, wie oben beschrieben, enthalten. Die durchschnittliche Länge der Fragmente mit Didesoxyenden wird verglichen mit identischen Verhältnissen von ddNTPs zu dNTPs für die zwei Enzyme. Wenn die Modifikation zu einer DNA-Polymerase geführt hat, die Didesoxynucieotide effizienter einbaut, wird die durchschnittliche

Länge der Fragmente mit Didesoxyende kürzer sein bei Reaktionen unter Verwendung der modifizierten DNA-Polymerase verglichen mit solchen unter Verwendung der unmodifizierten DNA-Polymerase bei gleichen Verhältnissen von ddNTP zu dNTP, während die durchschnittliche Länge länger ist für Reaktionen unter Verwendung der modifizierten DNA-Polymerase, wenn die Modifikation zu einer DNA-Polymerase führte, die stärker die ddNTPs benachteiligt.

Dieser Test kann auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Modifikation einer DNA-Polymerase zu einer Abnahme der Fähigkeit, Analoge von ddNTPs, z.B. mit Fluoreszenzmarker versehene ddNTPs, zu benachteiligen, führt. Dies ist sogar möglich, wenn man die Konzentration der zu testenden Analoge nicht kennt. Als Beispiel wurde die Fähigkeit der Taq-DNA-Polymerase und der Taq-DNA-Polymerase F667Y verglichen, jeden der vier DyeDeoxy-Terminatoren, die von Applied Biosystems hergestellt werden (Nr. 401150) zu verwenden. Diese DyeDeoxy-Terminatoren haben vier verschiedene fluoreszierende Einheiten, die jeweils kovalent an jede der vier ddNTPs gebunden sind (siehe Beispiel 12 für weitere Details). Für jeden der DyeDeoxy-Terminatoren wurde das Verhältnis von dNTPs zu DyeDeoxy-Terminatoren über einen Bereich bis zum 16.000fachen in Intervallen mit jeweils dem 2fachen variiert und das Muster der Fragmente mit Didesoxyende wurde in dem Autoradiogramm verglichen, um die Verhältnisse zu bestimmen, die für jedes der zwei Enzyme erforderlich waren, um die gleiche durchschnittliche Länge der Fragmente mit Didesoxyende zu erhalten. Die Tabelle unten faßt diese Ergebnisse zusammen. Für jeden Terminator zeigt die mit "Verhältnis" markierte Spalte das Verhältnis der Verhältnisse von ddNTP zu dNTP, das erforderlich ist, um Fragmente mit identischer durchschnittlicher Länge zu ergeben für Taq-DNA-Polymerase gegenüber Taq-DNA-Polymerase F667Y. Wie bei normalen ddNTPs baut die Taq-

- 78 -

DNA-Polymerase F667Y die fluoreszierenden ddNTP-Derivate viel effizienter ein, als dies die unmodifizierte Taq-DNA- -Polymerase tut, mindestens um den Faktor 400.

DyeDeoxy-Terminator Verhältnis G-Terminator > 400

A-Terminator > 2.0 0 0

T-Terminator >2.000

C-Terminator >2.000

Wie vorher diskutiert, kann eine Komplikation bei der Verwendung in diesem Test auftreten, wenn die zu testende DNA-Polymerase eine zugehörige Exonuclease-Aktivität aufweist. Die Probleme, die 5'->-3'- und 3'-*5'-Exonucleasen verursachen können und Wege, um ihre Wirkungen zu minimieren, falls sie vorhanden sind, werden in Beispiel 6 diskutiert. Wenn man einen Test durchführt, um zu bestimmen, ob die Modifikation einer Polymerase die Fähigkeit, Didesoxynucleotide einzubauen, vermindert, ist eine Klasse von Mutanten, die diese Wirkung haben kann, eine solche, die eine normalerweise sehr aktive 3'->-5'-Exonuclease-Aktivität inaktiviert (siehe z.B. Tabor und Richardson 84, Proc. Natl. Acad. Sei. 4767, 1987). Diese Klasse von Mutanten wird in diesem Patent nicht beansprucht. Wenn man eine modifizierte DNA-Polymerase hat, die einen scheinbaren Anstieg der Fähigkeit der DNA-Polymerase, Didesoxynucleotide einzubauen, zeigt und man bestimmen möchte, ob dies auf der Polymerasedomäne oder der Exonucleasedomäne beruht, ist es notwendig, einen Exonucleasetest an den modifizierten und nicht modifizierten Formen des Enzyms durchzuführen; eine Mutation, die hauptsächlich die Exonuclease-Aktivität des Enzyms beeinflußt, hat eine größere Wirkung auf die Exonuclease-Aktivität des Enzyms als auf die Polymerase-Aktivität. Bevorzugt würde man die Exonuclease-Aktivität an einem DNA-Substrat messen, das an seinem 3'-Ende mit 32p-ddAMP (siehe Beispiel 21) markiert ist. Wie in Beispiel 6 ist es wichtig, die Pyrophosphorolyse bei diesen

. ₇₉ _

Reaktionen zu hemmen, um zu vermeiden, daß sie die scheinbare Benachteiligung von ddNTPs durch eine DNA-Polymerase erhöht. -Dies wird leicht erreicht, indem dem Ansatz Pyrophosphatase zugesetzt wird.

Beispiel 8

Bestimmung der Effizienz des Einbaus von Didesoxynucleotiden durch Hemmung der DNA-Synthese an einem Komplex aus einzelsträngiger Ml3-DNA - unmarkiertem 40-mer Primer

Bei diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit einer PoIy-DNA-Polymerase gegenüber einem ddNTP bestimmt, indem die Fähigkeit verschiedener Konzentrationen des ddNTPs gemessen wird, eine Standard-DNA-Synthesereaktion zu hemmen. Der DNA-Synthesetest ist eine Modifikation des von Tabor und Richardson in 264 J. Biol. Chem. 6447, 1989 beschriebenen. Der 40-mer Primer und die Ml 3 mGPl-2-Matrize sind in Beispiel 3 beschrieben. Der Primer wird mit der einzelsträngigen M13 mGPl-2-DNA-Matrize in einer Reaktionsmischung (IX = 25 &mgr;&idiagr;) hybridisiert, die 2 &mgr;g Ml3 mGPl-2-DNA, 6 pmol Primer (ein 1Ofacher molarer Überschuß gegenüber der Matrize), 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Mischung wird 2 Minuten bei 65°C inkubiert und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur gekühlt. Die Standard-Reaktionsmischung (45 &mgr;&idiagr;) enthielt 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl₂, 55 mM NaCl, 300 &mgr;&Mgr; dGTP, dATP, dCTP und [³H]TTP (30 cpm/pmol) und variierende Konzentrationen eines der vier oder alle vier ddNTPs. Die Reaktionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Die Mischungen werden 1 Minute lang bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert und die Reaktionen werden initiiert durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; Aliquots von Verdünnungen (0,01 bis 1 Einheit) der zu analysierenden

DNA-Polymerase, verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin. Die Reaktionsmischungen werden weiter 10 Minuten lang bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; 100 raM EDTA und 45 &mgr;&idiagr; werden auf Whatman DE81-Filterscheiben getupft. Die Scheiben werden in vier Austauschlösungen mit 150 ml 0,3 M Ammoniumformiat, pH 8,0 und anschließend zwei Austauschlösungen mit 150 ml 90 % Ethanol, jeweils 5 bis 10 Minuten lang gewaschen. Die Scheiben werden dann unter einer Wärmelampe getrocknet und in einen Szintillationszähler in Gegenwart von 5 ml Fluor (Opti-Fluor O, Packard) ausgezählt. Aus dem Anteil der Radioaktivität auf jeder Scheibe wird der Anteil der Gesamt-DNA-Synthese berechnet.

Spezifische zu testende DNA-Polymerasen können optimale Bedingungen bezüglich Puffer, pH, Salz oder Temperatur haben, die sich von den oben angegebenen unterscheiden. Jede DNA-Polymerase sollte unter solchen Bedingungen getestet werden, die für jedes Enzym die optimale spezifische Polymerase-Aktivität ergeben.

Um zu bestimmen, ob eine Modifikation einer gegebenen DNA-Polymerase zu einer Abnahme der Fähigkeit, Didesoxynucleotide zu benachteiligen, führt, wird zuerst eine Reihe von Reaktionen in Abwesenheit von ddNTPs durchgeführt, wobei die DNA-Polymerase-Konzentration variiert wird, um den Bereich zu bestimmen, wo die Aktivität ungefähr linear mit der Enzymkonzentration variiert, sowohl für die modifizierten als auch unmodifizierten Formen des Enzyms. Eine Enzym-Konzentration wird ausgewählt, die im linearen Bereich für beide Formen des Enzyms liegt, z.B. ist eine Enzym-Konzentration, bei der etwa 30 % der Matrize in 10 Minuten repliziert werden, wahrscheinlich in einem solchen linearen Bereich.

Sobald die richtige Enzym-Konzentration ausgewählt ist, werden eine Reihe von Reaktionen durchgeführt, wobei die Mengen entweder eines ddNTPs oder bevorzugt aller vier ddNTPs in der Mischung variiert werden, um die Konzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um 50 % der DNA-Synthese zu hemmen. Zum Beispiel sind unter den oben angegebenen Bedingungen (300 &mgr;&Mgr; 4 dNTPs) die folgenden Konzentrationen einer Mischung von 4 ddNTPs erforderlich, um 50 % der DNA-Synthese bei den folgenden 6 DNA-Polymerasen zu hemmen:

Polymerase	[4ddNTP] für 50	% Hemmung
T7-DNA-Polymerase	0,1	&mgr;&Mgr;
T7-DNA-Polymerase Y526F	300	&mgr;&Mgr;
E. coli DNA-Polymerase I	20	&mgr;&Mgr;
E. coli DNA-Polymerase I F762Y	0,04	&mgr;&Mgr;
Taq-DNA-Polymerase	150	&mgr;&Mgr;
Taq-DNA-Polymerase F667Y	0,4	&mgr;&Mgr;

Dieser Test kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Modifikation einer neuen DNA-Polymerase zu einer Abnahme der Fähigkeit, ddNTPs zu benachteiligen, führt; wenn die Mutation diese Wirkung hat, dann wird eine höhere Konzentration der 4ddNTPs erforderlich sein, um 50 % der DNA-Synthese in dem oben beschriebenen Test zu hemmen.

Beispiel 9

Bestimmung der Wirksamkeit des Einbaus von Didesoxynucleotiden, indem der Einbau von [a-³²PJdAMP in synthetische Primer-Matrizen-Komplexe gemessen wird

In diesem Beispiel wird die Konkurrenz zwischen einem dNTP und einem ddNTP untersucht zur Verwendung an einer einzigen Stelle in einer synthetischen Primer-Matrize. Dieser Test unterscheidet sich von den anderen darin, daß er den Ver-

gleich auf die Verwendung von zwei Substraten an einer einzelnen Stelle begrenzt, wobei die Komplikation einer sequenz spezifischen Variabilität bei der Benachteiligung vermieden wird. Obwohl dieser relativ einfache Test für ein vorläufiges Screening von DNA-Polymerasen bezüglich ihrer Fähigkeit, ddNTPs zu benachteiligen, geeignet ist, sollte er nicht unter Ausschluß der in den Beispielen 6 bis 8 gezeigten Tests verwendet werden, da oft die Benachteiligung der ddNTPs stark beeinflußt wird von benachbarten Sequenzen, einem wichtigen Problem für die DNA-Sequenzanalyse (siehe z.B. Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990).

Die beiden Primer-Matrizen, die unten gezeigt sind, werden in diesem Beispiel verwendet. Die erste wird verwendet, um die Benachteiligung von dATP gegenüber ddATP zu bestimmen, während die zweite verwendet wird, um die Benachteiligung von dCTP gegenüber ddCTP, dTTP gegenüber ddTTP und dGTP gegenüber ddGTP zu bestimmen.

Primer-Matrize A:

5' GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3'

3' GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC 5' Primer-Matrize B:

5' GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3'

3' GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTCAGTTTT 5'

Jede Reaktionsmischung enthält 25 pmol von jedem Primer und jeder Matrize. Primer und Matrize werden miteinander vermischt und in einer Reaktionsmischung (IX = 10 &mgr;&idiagr;) hybridisiert, die 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Mischung wird 2 Minuten lang bei 65⁰C inkubiert und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur gekühlt. Die Standard-Reaktionsmischung (45 &mgr;&idiagr;) für die Reaktionen, die mit der Primer-Matrize A durchgeführt werden, enthält 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl₂, 55 mM NaCl, 25 pmol

Primer-Matrize A-Komplex, 5 &mgr;&Mgr; [a-³²PJdGTP (4.000 cpm/pmol) und variierende Konzentrationen von dATP und ddATP. Die Reak- -tionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-PoIymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chero. 8322, 1990). Die Mischungen werden eine Minute lang bei 37°C (70°C bei thermophilen DNA-Polymerasen) inkubiert und die Reaktionen werden initiiert durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; Aliquots (0,01 bis 1 Einheit) der zu analysierenden DNA-PoIymerase, verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 M 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin. Die Reaktionsmischungen werden weiter 10 Minuten lang bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; 100 mM EDTA und 45 &mgr;&idiagr; werden auf Whatman DE81 Filterscheiben aufgetupft. Die Scheiben werden mit vier Austauschlösungen mit 150 ml 0,3 M Ammoniumformiat, pH 8,0 und anschließend zwei Austauschlösungen mit 150 ml 90 % Ethanol jeweils 5 bis 10 Minuten lang gewaschen. Die Scheiben werden dann unter einer Wärmelampe getrocknet und in einem Szintillationszähler in 5 ml Fluor (Opti-Fluor O, Packard) ausgezählt. Aus dem Anteil an Radioaktivität auf jeder Scheibe wird der Anteil an eingebautem [³²P]dGMP bestimmt. Es wird davon ausgegangen, daß wenn einmal ein einzelner dAMP-Rest eingebaut wurde, um die Blockierung für dGMP-Reste aufzuheben, vier [³²P]dGMPs pro Primer eingebaut werden und somit die Anzahl der dAMPs, die eingebaut werden, 1/4 der Anzahl der eingebauten dGMPs ist.

Alle Reaktionen werden mit einer konstanten Menge der zu analysierenden DNA-Polymerase durchgeführt; die Menge der DNA-Polymerase sollte ausreichend sein, um 50 % aller dCMP-Reste im einzelsträngigen Bereich der Matrize während der lOminütigen Inkubation in Gegenwart von 10 &mgr;&Mgr; dATP und in Abwesenheit von ddATP zu replizieren. Spezifische zu testende DNA-Polymerasen können optimale Bedingungen bezüglich Puffer, pH, Salz

oder Temperatur haben, die sich von den oben vorgeschlagenen unterscheiden. Jede DNA-Polymerase sollte unter den Bedingungen getestet werden, die eine optimale spezifische Polymerase-Aktivität für dieses Enzym ergeben. Kontrollreaktionen sollten auch durchgeführt werden, in denen weder dATP noch ddATP vorhanden sind; dies definiert den Hintergrund der DNA-Synthese, der von jeder Probe abgezogen werden sollte. Im allgemeinen ist dies weniger als 10 % der DNA-Synthese, die erhalten werden, wenn dATP vorhanden ist.

Es werden dann Reaktionen durchgeführt mit 10 &mgr;&Mgr; dATP und verschiedenen Konzentrationen von ddATP, um die Menge an ddATP zu bestimmen, die erforderlich ist, um die DNA-Synthese um 50 % zu hemmen. Beispiele sind in der Tabelle unten für die Konzentration von ddATP gezeigt, die erforderlich ist, um 50 % der DNA-Synthese in Anwesenheit von 10 &mgr;&Mgr; dATP zu hemmen. Die Polymerasen sind die in Beispiel 6 definierten.

Polymerase	[ddATP] für	50 % Hemmung
T7-DNA-Polymerase	^30	&mgr;&Mgr;
T7-DNA-Polymerase Y526F	>500	&mgr;&Mgr;
E. coli DNA-Polymerase I	>500	&mgr;&Mgr;
E. coli DNA-Polymerase I	F762Y ^6	&mgr;&Mgr;
Taq-DNA-Polymerase	>500	&mgr;&Mgr;
Taq-DNA-Polymerase F667Y	~5	&mgr;&Mgr;

Um einen analogen Test durchzuführen, bei dem die Benachteiligung gegenüber ddGTP, ddTTP oder ddCTP gemessen wird, werden Reaktionen durchgeführt, die identisch mit den oben beschriebenen sind, außer daß die Primer-Matrize B anstelle der Primer-Matrize A verwendet wird und die Ansätze 10 &mgr;&Mgr; dGTP, dTTP und dCTP und 5 &mgr;&Mgr; [a-³²P]dATP (4.000 cpm/pmol) und verschiedene Konzentrationen von ddGTP, ddTTP bzw. ddCTP enthalten.

Wie bei den anderen Beispielen können DNA-Polymerasen mit 3'->-5'-Exonuclease-Aktivität diesen Test stören, indem sie ein ■Enzym die ddNTPs mehr benachteiligend erscheinen lassen, als dies aufgrund der Benachteiligung des Einbaugrads des Analogons der Fall ist. Außerdem können Enzyme mit hohem Anteil an Exonuclease-Aktivität alle dNTPs in der Reaktionsmischung aufbrauchen (insbesondere bei dem relativ geringen Gehalt an dNTPs, die bei diesen Reaktionen vorhanden sind), was zu keiner Netto-DNA-Synthese führt (z.B. die native T7-DNA-Polymerase, siehe Tabor und Richardson 264 J. Biol. Chem. 6447, 1989). In diesen Fällen sollten die Konzentration der DNA-Polymerase und die Inkubationszeit der Reaktion so eingestellt werden, daß der maximale Grad an DNA-Synthese in Abwesenheit der ddNTPs erreicht wird.

Beispiel 10

Bestimmung der Effizienz des Einbaus von [a~³²P]ddNMPs in einen synthetischen Primer-Matrizen-Komplex

In diesem Beispiel wird die Konkurrenz zwischen einem dNMP und einem ddNMP um den Einbau an einer einzigen Stelle in einer synthetischen Primer-Matrize getestet. Dieser Test unterscheidet sich von dem von Beispiel 9 darin, daß die Markierung [a-³²P]ddATP ist und somit der Einbau von ddAMP gemessen wird. Dieser Test kann verwendet werden, um zu testen, ob ein ddNTP eine DNA-Polymerase hemmt, indem es als Kettenabbruchmittel wirkt, indem es am 3'-Ende des Primers eingebaut wird, oder einfach dadurch, daß es die DNA-Polymerase bindet und eine weitere DNA-Synthese verhindert, ohne tatsächlich in den Primer eingebaut zu werden.

In dem Beispiel unten wird der Einbau von ddAMP gemessen unter Verwendung von [a-³²P]ddATP und Primer-Matrize A (Beispiel 9):

MS ·

Primer-Matrize A:

5' GGCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA 3'

3' GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCCCC 5'

Der Einbau von [a-³²P]ddGMP, [a-³²P]ddCMP und [a-³²P]ddTMP könnte in ähnlicher Weise an der geeigneten Matrize getestet werden (z.B. Primer-Matrize B in Beispiel 9).

Jede Reaktionsmischung enthält 25 pmol jedes Primers und jeder Matrize (Primer-Matrize A siehe oben). Der Primer und die Matrize werden miteinander vermischt und in einer Reaktionsmischung (IX = 10 &mgr;&idiagr;) hybridisiert, die 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Mischung wird 2 Minuten lang bei 65°C inkubiert und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Standard-Reaktionsmischung (45 &mgr;&idiagr;) enthält 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl₂, 55 mM NaCl, 25 pmol Primer-Matrize A-Komplex, 2,5 &mgr;&Mgr; [a-³²P]ddATP (Amersham PB10235, >5.000 Ci/mmol verdünnt mit kaltem ddATP auf eine spezifische Aktivität von 4.000 cpm/pmol) und verschiedene Konzentrationen von dATP. Die Reaktionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Die Mischungen werden bei 37°C eine Minute lang inkubiert (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) und die Reaktionen initiiert durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; Aliquots (0,01 bis 1 Einheit) der zu analysierenden DNA-Polymerase verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin. Die Reaktionsmischungen werden weiter 10 Minuten lang bei 37° C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert. Die Reaktionen werden gestoppt durch Zugabe von 5 &mgr;&idiagr; 100 mM EDTA und 45 &mgr;&idiagr; werden auf Whatman DE81 Filterscheiben getupft. Die Scheiben werden in vier Austauschlösungen mit je 150 ml 0,3 M Ammoniumformiat, pH 8,0 und anschließend zwei Austauschlösun-

gen mit 150 ml 90 % Ethanol jeweils 5 bis 10 Minuten lang gewaschen. Die scheiben werden dann unter einer Wärmelampe getrocknet und in einem Szintillationszähler mit 5 ml Fluor (Opti-Fluor 0, Packard) ausgezählt. Aus dem Anteil an Radioaktivität auf jeder Scheibe wird die Menge an eingebautem [³²P]ddAMP bestimmt.

Alle Reaktionen werden mit einer konstanten Menge der zu testenden DNA-Polymerase durchgeführt; die Menge an DNA-PoIymerase sollte die Konzentration sein, die den höchsten Einbaugrad an [³²P]ddAMP in die Primer-Matrize A bei der lOminütigen Inkubation in Abwesenheit von dATP ergibt. Spezifische zu testende DNA-Polymeräsen können optimale Bedingungen bezüglich Puffer, pH, Salz oder Temperatur haben, die sich von den oben vorgeschlagenen unterscheiden. Jede DNA-Polymerase sollte unter den Bedingungen getestet werden, die eine optimale spezifische Polymerase-Aktivität für dieses Enzym liefern.

Um diesen Test zu verwenden, um den Benachteiligungsgrad eines ddNTPs zu bestimmen, werden die Reaktionen mit einer konstanten Menge der DNA-Polymerase und [³²P]ddATP in Gegenwart oder Abwesenheit von 2,5 &mgr;&Mgr; dATP (einer äquimolaren Konzentration zu [³²P]ddATP) durchgeführt und die Wirkung, die die Gegenwart von dATP auf den Einbau von [³²P]ddAMP hat, wird bestimmt. Wenn eine DNA-Polymerase nicht zwischen dem Einbau von ddAMP und dAMP unterscheidet und keine 3'-^5'-ExO-nuklease-Aktivität hat, dann wird die Zugabe von dATP den Einbau von [³²P]ddAMP um 50 % hemmen.

Dieser Test ist am besten geeignet für eine DNA-Polymerase, die ddNMPs wirksam einbaut, z.B. Taq-DNA-Polymerase F667Y. Für DNA-Polymerasen, die ddNMPs stark benachteiligen, ist der vorherige Test bevorzugt, in dem die Markierung an dem dNTP

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eine andere ist als die, die in Konkurrenz mit dem ddNTP verwendet wird, da in diesem Fall viel höhere Konzentrationen des ddNTPs verwendet werden können.

Wenn man jedoch daran interessiert ist, bei DNA-Polymerasen, die ddNMPs stark benachteiligen, zu testen, ob eine gegebene Mutation den Benachteiligungsgrad gegenüber ddNMPs vermindert, könnte dieser Test verwendet werden, indem die unmodifizierte DNA-Polymerase an diesem Substrat in Abwesenheit von dATP getestet wird (wobei der Einbau von [³²P]ddAMP als Funktion der DNA-Polymerase-Konzentration gemessen wird) und die Einbaurate mit der der Enzymmutante vergleicht. Wenn die Mutation die Benachteiligung der ddATPs verringert, dann sollte die Enzymmutante eine höhere spezifische Aktivität für den Einbau von [³²P]ddAMP haben.

Wie bei den anderen Beispielen können DNA-Polymerasen mit einer 3'-+5'-Exonuclease-Aktivität diesen Test stören und ein Enzym die ddNPTs mehr benachteiligt erscheinen lassen, als dies aufgrund des Benachteiligungsgrades für den Einbau des Analogons der Fall wäre. Wie im Beispiel 9 können Enzyme mit hohem Grad an Exonuclease-Aktivität alle dNTPs abreichern, was zu keinem Nettoeinbau von [³²P]ddAMP führt. In diesen Fällen sollten die Konzentration der DNA-Polymerase und die Inkubationszeit der Reaktion so eingestellt werden, daß der maximale Einbaugrad an [³²P]ddAMP durch die zu testende DNA-Polymerase erreicht wird.

Alle obigen Methoden basieren auf der Radioaktivität, um entweder die Länge des verlängerten Primers oder den Anteil der DNA-Synthese des Primers nachzuweisen. Die Effizienz des Einbaus von Didesoxynucleotiden durch eine DNA-Polymerase kann auch nicht-radioaktiv gemessen werden. Zwei Beispiele werden unten angegeben, die entweder fluoreszierende Primer oder

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fluoreszierende Farb-Didesoxy-Abbruchmittel verwenden, die auf einem Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierungs- -system nachgewiesen werden.

Beispiel 11

Bestimmung der Effizienz des Einbaus von Didesoxynucleotiden unter Verwendung eines fluoreszierenden Primers, der mit einer einzelsträngigen DNA hybridisiert ist, und unter Verwendung von Gelelektrophorese

In dem Beispiel wird ein fluoreszierend markierter Primer mit einer einzelsträngigen DNA hybridisiert und die DNA-Synthese-Reaktionen werden durchgeführt unter Verwendung verschiedener Verhältnisse von dNTPs zu ddNTPs. Die Proben werden dann auf ein Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierungssystem geladen und die Länge jedes fluoreszierenden Fragmentes wird bestimmt durch den direkten Fluoreszenznachweis während der Gelelektrophorese. Die Reaktionen werden durchgeführt, wie von Tabor und Richardson in 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990 beschrieben. Der verwendete Fluoreszenz-Primer ist "Farn"-Primer (Applied Biosystems). Die verwendete DNA ist einzelsträngige DNA aus M13 mGPl-2, wie in Beispiel 3 beschrieben. Der Primer wird mit der einzelsträngigen DNA-Matrize aus M13 mGPl-2 in einer Reaktionsmischung hybridisiert (IX = 10 &mgr;&idiagr;), die 2 &mgr;g M13 mGPl-2 DNA, 5 ng Primer, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Mischung wird 2 Minuten lang bei 65°C inkubiert und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Standard-Reaktionsmischung (18 &mgr;&idiagr;) enthält 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl₂, 55 mM NaCl und verschiedene Konzentrationen der 4dNTPs und eines der vier ddNTPs. Die Reaktionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Die Mischungen werden eine Minute

bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerase) inkubiert und die Reaktionen initiiert durch Zugabe von 2 &mgr;&idiagr; Aliquots (0,01 bis 1 Einheit) der zu analysierenden DNA-Polymerase, verdünnt mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin. Die Reaktionsmischungen werden weiter 10 Minuten lang bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert. Die Reaktionen erfolgen durch Zugabe von 8 &mgr;&idiagr; 20 mM DTPA, 1 M Kaliumacetat, pH 5,0 und 60 &mgr;&idiagr; Ethanol. Nach dem Zentrifugieren wird die DNA in 6 &mgr;&idiagr; 80 % Formamid, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA resuspendiert und 2 Minuten lang auf 80° C erhitzt direkt bevor sie auf das Polyacrylamidgel des Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzierungssystems gemäß den Vorschriften des Herstellers, geladen wird.

Spezifische zu testende DNA-Polymerasen können optimale Bedingungen bezüglich Puffer, pH, Salz oder Temperatur haben, die sich von den oben vorgeschlagenen unterscheiden. Jede DNA-Polymerase sollte unter den Bedingungen getestet werden, die eine optimale spezifische Polymerase-Aktivität für dieses Enzym ergeben. Die Konzentration der DNA-Polymerase sollte ausreichend sein, um die meisten Primer um mindestens mehrere 100 Nucleotide zu verlängern oder bis ein Didesoxynucleotid innerhalb der lOminütigen Reaktion eingebaut wurde.

Das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs wird so eingestellt, daß optimale Spitzenintensitäten für ungefähr 300 Basen erhalten werden. Zum Beispiel sind für Taq-DNA-Polymerase ungefähr 10 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 200 bis 600 &mgr;&Mgr; ddNTPs optimal, während für Taq-DNA-Polymerase F667Y ungefähr 300 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 0,5 bis 5 &mgr;&Mgr; ddNTPs optimal sind.

Um zu bestimmen, ob eine Modifikation einer gegebenen DNA-Polymerase zu einer Abnahme der Fähigkeit, Didesoxynucleotide zu benachteiligen, führt, sollten Reaktionen durchgeführt werden, bei denen das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs sowohl

für die uratiodifizierten als auch modifizierten DNA-Polymerasen variiert wird und die Intensitäten der Fragmente mit Didesoxyenden mit verschiedenen Längen verglichen werden, um zu bestimmen, ob genug modifizierte DNA-Polymerase die ddNTPs effizienter verwertet als das unmodifizierte Enzym.

Beispiel 12

Bestimmung der Effizienz des Einbaus von fluoreszierenden Dxdesoxynucleotiden mit Gelelektrophorese

In diesem Beispiel wird ein nicht fluoreszierender Primer mit einer einzelsträngigen DNA hybridisiert und die DNA-Synthese-Reaktionen werden durchgeführt unter Verwendung verschiedener Verhältnisse von dNTPs zu einem einzelnen fluoreszierend markierten ddNTP. Die Proben werden dann auf ein Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierungssystem geladen und die Länge jedes fluoreszierenden Fragmentes wird bestimmt durch direkte Detektion der Fluoreszenz während der Gelelektrophorese. Der in diesem Beispiel verwendete Primer ist das 40-mer, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, und die Matrize ist die in Beispiel 3 beschriebene einzelsträngige M13 mGPl-2. Der Primer wird mit der einzelsträngigen DNA-Matrize aus M13 mGPl-2 in einer Reaktionsmischung (IX — 10 &mgr;&idiagr;) hybridisiert, die 2 &mgr;g Ml3 mGPl-2-DNA, 6 pmol Primer (ein zehnfacher molarer Überschuß gegenüber der Matrize), 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂ und 100 mM NaCl enthält. Die Mischung wird 2 Minuten lang bei 65°C inkubiert und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur gekühlt. Die Standard-Reaktionsmxschung (18 &mgr;&idiagr;) enthält 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl₂, 55 mM NaCl und verschiedene Konzentrationen der 4dNTPs plus eines der vier fluoreszierend markierten ddNTPs. Die vier fluoreszierend markierten ddNTPs stammen von Applied Biosystems (Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Nr. 401150) und werden als G, A, T oder C "DyeDeoxy Terminators" bezeichnet (Handbuch für Taq-DyeDeoxy Terminator Cycle

Sequencing Kit, Nr. 901497, Rev. E). Die Reaktionsmischungen enthielten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase erhöhen könnte (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Die Mischungen werden 1 Minute bei 37⁰C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von 2 &mgr;&idiagr; Aliquots (0,01 bis 1 Einheit) der zu analysierenden DNA-Polymerase, verdünnt in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,05 % Rinderserumalbumin initiiert. Die Reaktionsmischungen werden weiter 10 Minuten bei 37°C (70°C für thermophile DNA-Polymerasen) inkubiert. Die Reaktionen erfolgen dann durch Zugabe von 8 &mgr;&idiagr; 20 mM EDTA, 1 M Kaliumacetat, pH 5,0 und 60 &mgr;&idiagr; Ethanol. Nach der Zentrifugation wird die DNA in 6 &mgr;&idiagr; 80 % Formamid, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM DTPA resuspendiert und 2 Minuten auf 80°C erhitzt, direkt bevor sie auf das Polyacrylamid-Gel des Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzierungssystems geladen werden, gemäß den Vorschriften des Herstellers.

Spezifische zu testende DNA-Polymerasen können optimale Bedingungen bezüglich Puffer, pH, Salz oder Temperatur haben, die sich von den oben Vorgeschlagenen unterscheiden. Jede DNA-Polymerase sollte unter den Bedingungen getestet werden, die eine optimale spezifische Polymerase-Aktivität für dieses Enzym ergeben. Die Konzentration der verwendeten DNA-Polymerase in diesen Reaktionen sollte so sein, daß die Konzentration ausreicht, um die meisten Primer um mindestens mehrere 100 Nucleotide zu verlängern oder bis ein Didesoxynucleotid in der lOminütigen Reaktion eingebaut wurde. Für DNA-Polymerasen, die eine S'-O'-Exonuclease-Aktivität aufweisen, z.B. Taq-DNA-Polymerase, muß die DNA-Polymerase-Konzentration gering genug gehalten werden, um diese Aktivität zu vermeiden, die einen wesentlichen Prozentanteil der 5'-Enden der Fragmente abbaut.

Um zu bestimmen, ob eine DNA-Polymerase ein fluoreszierendes ddNTP stark oder schwach benachteiligt, werden Reaktionen durchgeführt unter Verwendung von 20 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 0,01 &mgr;&idiagr; jedes DyeDeoxy Terminators, der von Applied Biosystems geliefert wird (Nr. 401150). Wenn Taq-DNA-Polymerase unter diesen Bedingungen verwendet wird, wird sich der größte Anteil der Fluoreszenz entweder in nicht eingebauten Farb-ddNTPs an der führenden Front des Gels oder in Fragmenten, die mehr als mehrere hundert Basen lang sind, finden. Im Gegensatz dazu findet sich bei der Taq-DNA-Polymerase-Mutante F667Y unter diesen Bedingungen der größte Anteil der Fluoreszenz in Fragmenten, die weniger als mehrere hundert Basen lang sind und ein signifikant geringerer Prozentanteil der gesamten Fluoreszenz ist in den nicht eingebauten Farb-ddNTPs an der führenden Front des Gels.

Um zu bestimmen, ob eine Modifikation einer gegebenen DNA-Polymerase zu einer Abnahme der Fähigkeit, Didesoxynucleotide zu benachteiligen, führt, werden Reaktionen durchgeführt mit verschiedenen Verhältnissen von dNTPs zu DyeDeoxy Terminators sowohl für die unmodifizierten als auch für die modifizierten DNA-Polymerasen und die durchschnittliche Länge der entstehenden fluoreszierenden Fragmente wird verglichen, um zu bestimmen, ob die modifizierte DNA-Polymerase die DyeDeoxy Terminators effizienter verwendet, als das unmodifizierte Enzym.

Die folgenden Beispiele liefern Tests, um die Gleichmäßigkeit der Bandenintensitäten, die von den Fragmenten mit Didesoxyenden gebildet werden, die mit verschiedenen DNA-Polymeräsen synthetisiert wurden, zu bestimmen.

Beispiel 13

-Bestimmung der Gleichmäßigkeit des Einbaus von Didesoxynucleotxden unter Verwendung eines Komplexes aus einzelsträngiger M13-DNA - 5^/32P-markiertem 40-mer Primer und Gelelektrophorese

In diesem Beispiel wird die Gleichmäßigkeit des Didesoxynucleotideinbaus an einem am 5'-Ende mit ³^P markierten Primer, der an einer einzelsträngigen Ml3-DNA-Matrize verlängert wird, gemessen- Drei Aktivitäten können eine Variabilität der Bandenintensität von Fragmenten mit Didesoxyenden verursachen. Ein Grund ist die Exonuclease-Aktivität, die an einigen Sequenzen vorherrschen kann; diese wird vermieden, indem die Aktivität selektiv entweder durch chemische oder genetische Maßnahmen entfernt wird (siehe z.B. Tabor und Richardson 264, J. Biol. Chem. 6447, 1989). Der zweite Grund ist die Pyrophosphorolyse; diese wird leicht vermieden, indem der Reaktionsmischung Pyrophosphatase zugegeben wird, die das Pyrophosphat abbaut, das sich während der DNA-Synthese ansammelt und ein notwendiges Substrat für die Pyrophosphorolyse ist. Der dritte Grund ist die sequenzspezifische Variabilität beim Einbau der Didesoxynucleotide. Die Variabilität der Bandenintensität ist schädlich für die DNA-Sequenzanalyse, was zu einer Verminderung der Genauigkeit der zu bestimmenden DNA-Sequenz führt. Dieser Test dient dazu, den Variabilitätsgrad der Bandenintensitäten bei Fragmenten, die von verschiedenen DNA-Polymerasen synthetisiert wurden, einschließlich DNA-Polymerase-Mutanten, die Didesoxynucleotide effizienter einbauen können, zu vergleichen.

Der Primer, die Matrize und die Reaktionsbedxngungen in diesem Beispiel waren identisch mit den in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen. Die Matrize ist einzelsträngige DNA aus M13 mGPl-2, wie in Beispiel 3 beschrieben, und der Primer ist das 40-mer, das auch in Beispiel 3 beschrieben wurde. Die ver-

wendeten Reaktionsbedingungen waren die, die für die zu testende DNA-Polymerase optimal waren im Hinblick auf Puffer, pH, Salze und Temperatur der Reaktion. Es ist bevorzugt, daß Magnesium das einzige Metallion ist, das in der Reaktionsmischung vorhanden ist (d.h. die Reaktionen werden in Abwesenheit von zugegebenen Manganionen durchgeführt). Es wird eine Konzentration der DNA-Polymerase ausgewählt, bei der die meisten Primer in einer lOminütigen Reaktion verlängert werden und durch den Einbau von Didesoxynucleotiden abgebrochen werden. Die Verhältnisse von dNTPs zu ddNTPs werden für die spezifische zu testende DNA-Polymerase so eingestellt, daß die durchschnittliche Fragmentgröße ungefähr 100 bis 300 Nucleotide ist. ddCTP ist das bevorzugte ddNTP zur Verwendung für den Test auf Gleichmäßigkeit, da Fragmente, die mit diesem Didesoxynucleotid enden, dazu neigen, die größte Variabilität in der Intensität zu haben (siehe z.B. Tabor und Richardson 86 Proc. Natl. Acad. Sei. 4076, 1989). Gel-Elektrophorese, Autoradiographie und Analyse der Bandenintensitäten entweder durch ein Scannen des Gels oder mit Phosphorimager-Analyse sind wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Elektrophorese wird durchgeführt, bis Fragmente, die ungefähr 55 Nucleotide lang sind, am Boden des Gels ankommen (der Farbstoff Bromphenolblau ist unten aus dem Gel herausgelaufen und der Farbstoff Xylolcyanol ist ungefähr 8 cm vom Boden des Gels entfernt).

Für eine gegebene Reihe von Fragmenten mit ddNMP-Ende, z.B. eine Reihe von Fragmenten mit ddCMP-Ende, werden die Intensitäten der ersten 20 Fragmente vom Boden des Gels bestimmt, vorzugsweise mit Phosphoimager-Analyse. Alternativ kann das Autoradiogramm mit einem Bilddensitometer gescannt werden, um die relativen Intensitäten der ersten 20 Fragmente zu bestimmen. Diese Intensitäten werden statistisch analysiert, wie in Beispiel 6 beschrieben, um ihre Variabilität zu bestimmen. Zum Beispiel können die Werte aufgetragen werden unter Verwendung des Macintosh-Programms Kaleidograph Version 3.0

(Synergy Software). Die entstehenden Punkte werden auf eine exponentiell abnehmende Kurve aufgetragen unter Verwendung des Kaleidograph-Bibliotheksprogramms für diese Funktion. R², der Korrelationsindex für die Daten, wird berechnet mit dem Kaleidograph-Bibliotheksprogramm. Dies ist ein Maß für die Variabilität der Banden-Intensitäten. Die für R² unter Verwendung einer neuen DNA-Polymerase erhaltenen Werte werden verglichen mit denen, die erhalten wurden unter Verwendung bekannter DNA-Polymerasen, z.B. _28 T7-Dna-Polymerase (Sequenase Version 2.0, United States Biochemical Corporation) in Gegenwart von Magnesium oder Mangan (siehe Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990), E. coli DNA-Polymerase I (entweder Klenow-Fragment oder Klenow-Fragment mit der Mutation F762Y) oder Taq-DNA-Polymerase (entweder Wildtyp oder Mutante F667Y). Die mit diesen bekannten DNA-Polymerasen erhaltenen Werte für R² werden verwendet als Standards, mit denen eine neue DNA-Polymerase bezüglich der Gleichmäßigkeit verglichen wird.

Beispiel 14

Bestimmung der Gleichmäßigkeit des Einbaus von [a--*2p]ddNMPs unter Verwendung eines Komplexes aus einzelsträngiger M13-DNA - unmarkiertem Primer und Gelelektrophorese

In diesem Beispiel wird die Gleichmäßigkeit des Didesoxynucleotid-Einbaus gemessen unter Verwendung eines unmarkierten Primers, der mit einer einzelsträngigen Ml3-DNA-Matrize hybridisiert ist, wobei die DNA-Synthese in Gegenwart von [^a~³²P]ddATP durchgeführt wird. Der in Beispiel 13 beschriebene Test ist bevorzugt gegenüber einem, der die Gleichmäßigkeit der Fragmente mit Didesoxynucleotid-Enden mißt, da er besser geeignet ist für die Verwendung hoher Konzentrationen von ddNTPs, die erforderlich sind zur Verwendung mit Enzymen, die ddNTPs stark benachteiligen, z.B. E. coli DNA-Polymerase I, Taq-DNA-Polymerase und T7-DNA-Polymerase Y526F. Der Test

in diesem Beispiel ist am besten geeignet zur Verwendung mit Enzymen, die Didesoxynucleotide effizient einbauen, z.B. T7-•DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I F762Y und Taq-DNA-Polymerase F667Y.

Der Primer, die Matrize und die allgemeinen Reaktionsbedingungen in diesem Beispiel sind ähnlich den in Beispiel 8 beschriebenen, mit den folgenden Ausnahmen. Die Matrize ist einzelsträngige M13 mGPl-2-DNA, wie in Beispiel 3 beschrieben und der Primer ist das auch in Beispiel 3 beschriebene 40-mer. Die verwendeten Reaktionsbedingungen sind so, daß sie optimal sind für die zu testende DNA-Polymerase im Hinblick auf Puffer, pH, Salze und Temperatur der Reaktion. Es ist bevorzugt, daß Magnesium das einzige in der Reaktionsmischung vorhandene MetalIion ist (d.h. die Reaktionen werden in Abwesenheit von zugegebenen Manganionen durchgeführt). Die Reaktionen werden durchgeführt mit 50 &mgr;&Mgr; dGTP, dCTP und dTTP und verschiedenen Konzentrationen von dATP und [a-³²P]ddATP. Die Konzentrationen von dATP und [a-³²P]ddATP werden so ausgewählt, daß der Anteil an Radioaktivität in Fragmenten, die ungefähr 100 Nucleotide lang sind, maximiert ist. Alle anderen Aspekte bezüglich der Gelelektrophorese und Analyse der radioaktiven Fragmente sind wie in Beispiel 13 beschrieben.

Beispiel 15

Bestimmung der Gleichmäßigkeit des Einbaus von Didesoxynucleotiden unter Verwendung eines Komplexes aus einzelsträngiger M13-DNA - fluoreszierend markiertem Primer und Gelelektrophorese

In diesem Beispiel werden Reaktionen durchgeführt, wie in Beispiel 11 beschrieben. Die Matrize ist einzelsträngige M13 mGPl-2-DNA, wie in Beispiel 3 beschrieben und der Primer ist das 40-mer, das auch im Beispiel 3 beschrieben wurde. Die verwendeten Reaktionsbedingungen sind so, daß sie für die zu

testende DNA-Polymerase bezüglich Puffer, pH, Salzen und Temperatur der Reaktion optimal sind. Es ist bevorzugt, daß Magnesium das einzige in der Reaktionsmischung vorhandene Metallion ist (d.h. die Reaktionen werden durchgeführt in Abwesenheit von zugegebenen Manganionen). Es wird eine solche Konzentration der DNA-Polymerase ausgewählt, bei der die meisten Primer in einer lOminütigen Reaktion verlängert werden und durch den Einbau von Didesoxynucleotiden abgebrochen werden. Die Verhältnisse von dNTPs zu ddNTPs werden für die spezifische zu testende DNA-Polymerase so eingestellt, daß die durchschnittliche Fragmentgröße ungefähr 100 bis 200 Nucleotide ist. ddCTP ist das bevorzugte zu verwendende ddNTP, da Fragmente, die mit diesen Didesoxynucleotid enden, die höchste Variabilität der Intensitäten zu haben pflegen (siehe z.B. Tabor und Richardson 86, Proc. Natl. Acad. Sei. 4076, 1989). Die Intensitäten bis zu den ersten 50 Fragmenten mit Didesoxyende des Primers (ungefähr 200 Nucleotide) werden bestimmt und sie werden statistisch analysiert, wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Korrelationsindex R² wird für die zu testende DNA-Polymerase bestimmt und verglichen mit dem, der erhalten wird mit bekannten DNA-Polymerasen, wie den in Beispiel 13 beschriebenen. Alternativ wird die Höhe der ersten 50 Banden bestimmt und das Verhältnis der Höhen von benachbarten Banden wird berechnet und als Maß der Variabilität verwendet; der maximale Wert und der Durchschnittswert dieser Verhältnisse, die aus Reaktionen erhalten wurden, die mit der zu testenden DNA-Polymerase durchgeführt wurden, werden verglichen mit den für Reaktionen erhaltenen Werten, die durchgeführt wurden unter Verwendung bekannter DNA-Polymerasen, wie den in Beispiel 13 beschriebenen.

Beispiel 16

Bestimmung der Gleichmäßigkeit des Einbaus von fluoreszierenden Didesoxynucleotiden durch Gelelektrophorese

In diesem Beispiel werden Reaktionen durchgeführt, wie in Beispiel 12 beschrieben. Um die Gleichmäßigkeit des Einbaus der DyeDeoxy Terminators für eine spezifische DNA-Polymerase zu bestimmen, werden die Konzentrationen der dNTPs und des spezifischen DyeDeoxy Terminators so ausgewählt, daß fluoreszierend markierte Fragmente erhalten werden, die im Durchschnitt 100 bis 200 Nucleotide lang sind. Die Intensität der Fluoreszenz wird bestimmt für Fragmente 10 bis 40 ab dem Primer (die ersten 10 Fragmente in der Nähe des fluoreszierend markierten Primers werden ignoriert). Diese Fragmente werden statistisch analysiert, wie in Beispiel 13 beschrieben und die durchschnittliche Variabilität wird definiert durch R², den Korrelationsindex für die Daten, die als eine exponentiell abnehmende Kurve gezeichnet werden. Die Werte, die für R² erhalten werden, werden verglichen, mit denen, die erhalten wurden unter Verwendung bekannter DNA-Polymerasen, wie in Beispiel 13 beschrieben. Um zu bestimmen, ob eine spezifische Mutation in einer DNA-Polymerase dazu führt, daß die DNA-Polymerase Banden erzeugt, die eine geringere Variabilität haben, wird der für die DNA-Polymerase-Mutante erhaltene Wert für R² verglichen mit dem für die unmodifizierte DNA-Polymerase .

Beispiel 17

DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung einer DNA-Polymerase, die Didesoxynucleotide effizient einbaut

Die DNA-Sequenzanalyse mit einer DNA-Polymerase der Erfindung wird durchgeführt unter Verwendung von Standardverfahren, wobei das Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs so eingestellt wird,

daß Fragmente rait Didesoxyenden erhalten werden mit einer durchschnittlichen Länge, die geeignet ist zur Auftrennung durch Elektrophorese. Für die Mutante des großen Fragments der E. coli DNA-Polymerase I, "Klenow-Fragment F762Y", werden die Reaktionen im wesentlichen durchgeführt, wie mit der modifizierten T7-DNA-Polymerase und wie von Tabor und Richardson in US-Patent Nr. 4,795,699, Tabor und Richardson 84, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 4767, 1987 und dem SEQUENASE Handbuch "Step-By-Step Protocols For DNA Sequencing With SEQUENASE", 3. Ausgabe, United States Biochemical Corporation beschrieben. Da das Klenow-Fragment F762Y Didesoxynucleotide ungefähr 5mal effizienter einbaut, als modifizierte T7-DNA-Polymerase, sollte die Konzentration der ddNTPs in den Verlängerungs-Abbruchmischungen um einen Faktor von 5 vermindert werden, verglichen mit den Standardmischungen, die für modifizierte T7-DNA-Polymerase empfohlen werden (Sequenase Handbuch, oben).

Die DNÄ-Sequenzanalyse mit einer thermostabilen DNA-Polymerase, wie Taq-DNA-Polymerase F667Y erfolgt wie von Innis et al. in 85, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9436, 1988 beschrieben, mit der folgenden Modifikation. Während Innis et al. Verhältnisse von dNTP/ddNTP für dGTP:ddGTP von 1:6, dATP:ddATP von 1:32, dTTP:ddTTP von 1:48 und dCTP:ddCTP von 1:16 empfiehlt, müssen diese Verhältnisse so eingestellt werden, daß die 3.000- bis 8.000mal effizientere Verwendung der 4ddNTPs durch die Taq-DNA-Polymerase F667Y verglichen mit der Wildtyp Taq-DNA-Polymerase in Betracht gezogen wird. So sollten Verlängerungs-Abbruchreaktionen mit Taq-DNA-Polymerase F667Y 100 &mgr;&Mgr; 4dNTPs und 0,1 bis 5 &mgr;&Mgr; jeder der 4 ddNTPs enthalten; die genaue Menge jedes ddNTPs sollte eingestellt werden auf Basis der gewünschten durchschnittlichen Fragmentgröße für die optimale Bestimmung der DNA-Sequenz. Alle anderen Aspekte der DNA-Sequenzierungs-Reaktionen und der denaturierenden Gelelektrophorese sind wie von Innis et al. (oben) beschrieben.

Beispiel 18

Cyclische DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, die Didesoxynucleotide effizient einbaut

Die cyclische DNA-Sequenzierung mit einer thermostabilen DNA-Polymerase wie Taq-DNA-Polymerase F667Y wird durchgeführt, wie von Carothers et al. in 7 BioTechniques 494, 1989 beschrieben , mit der Ausmahme, daß (1) die vier Desoxy/Didesoxy-NTP-Mischungen 250 &mgr;&Mgr; aller 4 dNTPs und 0,1 bis 10 &mgr;&Mgr; ddGTP, ddATP, ddTTP oder ddCTP enthalten, wobei die exakte Menge jedes ddNTPs empirisch eingestellt wird auf Basis der gewünschten durchschnittlichen Fragmentgröße für die optimale Bestimmung der DNA-Sequenz. (2) Taq-DNA-Polymerase F667Y anstelle von Taq-DNA-Polymerase verwendet wird, wobei die gleiche Anzahl von Einheiten von DNA-Polymerase verwendet wird, wie von Carothers et al. (oben) empfohlen. (3) Die Reaktionsmischungen enthalten 10 ng anorganische Pyrophosphatase, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase bei spezifischen Sequenzen erhöhen könnte, wodurch die Gleichmäßigkeit der Bandenintensitäten vermindert wird (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Bevorzugt wird die Pyrophosphatase aus einem thermophilen Organismus gereinigt, z.B. aus Thermus thermophilus (Hohne et al. 47 Biomed. Biochim. Acta 941, 1988).

Beispiel 19

Automatische cyclische DNA-Sequenzierung unter Verwendung von modifizierter Taq-DNA-Polymerase und von fluoreszierenden Primern

Eine cyclische DNA-Sequenzierung mit einer thermostabilen DNA-Polymerase wie Taq-DNA-Polymerase F667Y und den Applied

• ■

Biosysteitts Farb-Primern ist eine Modifikation des in dem Applied Biosystems Handbuch beschriebenen Verfahren (Nr. 901482, Rev. B). Das Verfahren ist identisch mit dem in dem Handbuch beschriebenen, mit den folgenden Modifikationen: (1) Die dNTP/ddNTP-Mischungen müssen modifiziert werden, um die effizientere Verwendung von ddNTPs durch Taq-DNA-Polymerase F667Y verglichen mit Taq-DNA-Polymerase in Betracht zu ziehen. Die neuen Mischungen, die anstelle der in dem Applied Biosystems Handbuch aufgelisteten verwendet werden, sollten sind die folgenden:

dG/ddG-Mi schung
0,05 &mgr;&Mgr; ddGTP
dA/ddT-Mischung
0,3 &mgr;&Mgr; ddATP
dT/ddT-Mischung
0,25 &mgr;&Mgr; ddTTP
dC/ddC-Mischung
0,15 &mgr;&Mgr; ddCTP.

= 100 &mgr;&Mgr; c⁷dGTP, dATP, dTTP und dCTP und

Die Konzentrationen der ddNTPs sollten variiert werden, um die Intensität der Fluoreszenz bei Fragmenten mit spezifischen Größenbereichen abhängig von der Anwendung zu optimieren. Zum Beispiel wird die Erhöhung der Konzentration der ddNTPs die Fluoreszenz der Fragmente mit kürzerer Länge erhöhen. (2) Taq-DNA-Polymerase F667Y wird anstelle von Taq-DNA-Polymerase verwendet. Die gleiche Anzahl von Enzymeinheiten wird in beiden Fällen verwendet, wenn unter den Standard-DNA-Polymerase-Testbedingungen getestet wird. Alternativ kann die gleiche Anzahl von DNA-Polymerase-Molekülen verwendet werden. (3) Die Reaktionsmischungen enthalten 10 ng anorganische Pyrophosphatase, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase bei spezifischen Sequenzen erhöhen könnte, was die Gleichmäßigkeit der Bandenintensitäten vermindert (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Bevorzugt wird

diese Pyrophosphatase aus einem thermophilen Organismus, z.B. Thermus thermophilus gereinigt (Hohne et al. 47 Biomed. Biochim. Acta 941, 1988). Alle anderen Aspekte der Verfahren sind identisch mit den in dem Applied Biosystems Handbuch (oben) beschriebenen.

Beispiel 20

Automatisierte cyclische DNA-Sequenzierung unter Verwendung von modifizierter Taq-DNA-Polymerase und fluoreszierenden Farb-Abbruchmi tte1&eegr;

Cyclische DNA-Sequenzierung mit einer thermostabilen DNA-Polymerase, wie Taq-DNA-Polymerase F667Y und den Applied Biosystems DyeDeoxy-Terminators ist eine Modifikation des Verfahrens in dem Applied Biosystems Handbuch (Nr. 901497, Rev. E). Das Verfahren ist identisch mit dem in dem Handbuch beschriebenen, mit den folgenden Modifikationen: (1) Das Handbuch fordert die Verwendung von je 1 &mgr;&idiagr; jedes der vier DyeDeoxy-Terminatoren unverdünnt für jede Sequenzierungsreaktion (20 &mgr;&idiagr; Ansatz). In diesem Beispiel sollten die Terminatoren vor der Zugabe zu der Sequenzierungs-Reaktionsmischung verdünnt werden, da sie mehr als mehrhundertfach effizienter mit Taq-DNA-Polymerase F667Y als mit Taq-DNA-Polymerase eingebaut werden. 1 &mgr;&idiagr; jeder der folgenden Verdünnungen wird zu jeder Sequenzierungsreaktion anstelle von 1 &mgr;&idiagr; unverdünnter Terminatorlösung zugegeben:

DyeDeoxy-G-Terminator, 1 bis 500 in H₂O

DyeDeoxy-A-Terminator, 1 bis 1.500 in H₂O

DyeDeoxy-T-Terminator, 1 bis 1.500 in H₂O

DyeDeoxy-C-Terminator, 1 bis 1.000 in H₂O

Diese Verdünnungen sind nur Annäherungen; die genaue Verdünnung jedes DyeDeoxy-Terminators sollte empirisch bestimmt werden abhängig von der Anzahl der Basen in der zu bestimmen-

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den DNA-Sequenz des Primers. (2) Taq-DNA-Polymerase F667Y wird anstelle von Taq-DNA-Polymerase verwendet. Die gleiche -Anzahl von Enzymeinheiten wird in beiden Fällen verwendet, wenn unter Standard-DNA-Polymerase-Testbedingungen getestet wird. Alternativ kann dieselbe Anzahl von DNA-Polymerase-Molekülen verwendet werden. (3) Die Reaktionsiriischungen enthalten 10 ng anorganische Pyrophosphatase, um die Pyrophosphorolyse zu hemmen, die ansonsten die scheinbare Benachteiligung durch die DNA-Polymerase an spezifischen Sequenzen erhöhen könnte, was die Gleichmäßigkeit der Bandenintensitäten vermindert (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Bevorzugt wird diese Pyrophosphatase aus einem thermophilen Organismus, z.B. Thermus thermophilus gereinigt (Hohne et al. 47 Biomed. Biochim. Acta 941, 1988).

Da bei diesem Verfahren mehr als 500mal weniger DyeDeoxy-Terminatoren verwendet werden, als bei bisherigen Verfahren, besteht ein viel geringeres Problem mit den nicht eingebauten DyeDeoxy-Terminatoren, nachdem die Reaktionen abgeschlossen sind. So ist es nicht notwendig, nicht eingebaute DyeDeoxy-Terminatoren zu entfernen, indem die Probe über eine Spinsäule geleitet wird, wie in dem Applied Biosystems Handbuch (oben) empfohlen. Statt dessen kann die Probe mit Ethanol ausgefällt werden, in 5 &mgr;&idiagr; deionisiertem Formamid und 1 &mgr;&idiagr; 50 inM EDTA, pH 8,0 aufgenommen werden, 2 Minuten auf 90⁰C erhitzt werden und auf das Applied Biosystems 37 3A DNA-Sequenzierungssystem nach den Anleitungen in dem Handbuch für Verwender von 373A aufgegeben werden. Es ist möglich, daß bei einer DNA-Polymerase, die DyeDeoxy-Terminatoren effizient einbaut (z.B. Taq-DNA-Polymerase F667Y) diese Konzentration der DNA-Sequenzierungsreaktion durch Ausfällung mit Ethanol nicht notwendig ist; die DNA-Cyclus-Sequenzierungsreaktionen, die bevorzugt mit hohen Primer-Konzentrationen und hohen Konzentrationen der dNTPs (siehe unten) durchgeführt werden, können gestoppt werden, indem ein gleiches Volumen von deionisiertem Formamid zugegeben wird, 2 Minuten auf 90°C

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erhitzt wird und sofort auf das Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzierungssystem gebracht wird. Dies bedeutet eine große Zeitersparnis für den Forscher, der die Proben für die DNA-Sequenzbestimmung vorbereitet.

Das oben beschriebene Verfahren verwendet eine relativ geringe Konzentration der dNTPs zu Beginn (7,5 &mgr;&Mgr; dATP, dTTP und dCTP und 37,5 &mgr;&Mgr; dITP). Die Konzentration der dNTPs nimmt während der cyclischen DNA-Sequenzierungsreaktion ab, wenn die dNTPs verbraucht werden. Diese Konzentration der dNTPs (weniger als 7,5 &mgr;&Mgr;) ist geringer als es optimal ist für eine maximale DNA-Polymerase-Aktivität der meisten DNA-PoIymerasen. Diese geringe Konzentration war notwendig bei früheren Durchführungen, da die DNA-Polymerase, die verwendet wurde, die ddNTPs stark benachteiligte, was ein hohes Verhältnis von ddNTPs zu dNTPs erforderte. Die Verwendung einer DNA-Polymerase der Erfindung, die die DyeDeoxy-Terminatoren viel weniger benachteiligt, läßt nun die Verwendung höherer Konzentrationen von dNTPs zu. Zum Beispiel könnte in dem oben beschriebenen Versuchsablauf eine 10fach höhere Konzentration von dNTPs und DyeDeoxy-Terminatoren verwendet werden, d.h. 75 &mgr;&Mgr; dATP, dTTP und dCTP, 375 &mgr;&Mgr; dITP und die folgenden Verdünnungen jedes der vier DyeDeoxy-Terminatoren: DyeDeoxy-G-Terminator 1 bis 50 in H2O; DyeDeoxy-A-Terminator 1 bis 150 in H₂O; DyeDeoxy-T-Terminator 1 bis 150 in H₂O; DyeDeoxy-C-Terminator 1 bis 100 in H₂O. So sind in diesem Beispiel die Konzentrationen der DyeDeoxy-Terminatoren immer noch geringer als die in vorherigen Versuchsabläufen um einen Faktor von mindestens 50.

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Beispiel 21

Exonuclease-Test unter Verwendung eines DNA-Substrats mit [³²P]ddAMP-Ende

Das DNA-Substrat mit einem 3'[³²P]ddAMP-Ende wird hergestellt, indem native Kälber-Thymus-DNA mit Hindlll in einer Reaktionsmischung (50 &mgr;&idiagr;), die 10 &mgr;g doppelsträngige Kälber-Thymus-DNA, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 50 &mgr;g/ml Rinderserumalbumin und 10 Einheiten Hindlll enthält, verdaut wird. Nach 60minütiger Inkubation bei 37°C werden 5 &mgr;&idiagr; [a-³²P]ddATP (Amersham PBlO235, >5.000 Ci/mmol) und 5 Einheiten Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical Corporation, Katalog Nr. 70775) zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang bei 20 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird einmal mit einem gleichen Volumen Phenol!Chloroform:Isoamylalkohol (24:24:1) extrahiert und auf einer 1 ml Säule Sephadex GlOO (Pharmacia) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl fraktioniert. Die 3'³²P-markierte DNA, die mit dem Leervolumen eluiert, hat eine spezifische Aktivität von ungefähr 500 cpm/ng Gesamt-DNA.

Reaktionsmischungen für Exonuclease-Tests (90 &mgr;&idiagr;) enthalten 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 50 mM KCl und 1 nmol 3' ³²P-markierte DNA. Die Reaktionsmischungen enthalten auch 10 ng anorganische Pyrophosphatase aus Hefe, um Spurenmengen von Pyrophosphat zu entfernen und damit eine Pyrophosphorolyse zu verhindern (Tabor und Richardson 265 J. Biol. Chem. 8322, 1990). Diese Mischung wird eine Minute bei 20°C vorinkubiert, dann werden 10 &mgr;&idiagr; der geeigneten Enzym-Verdünnung zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C über die angegebenen Zeiten wird die Reaktion gestoppt durch Zugabe von 30 &mgr;&idiagr; Rinderserumalbumin (10 mg/ml) und 30 &mgr;&idiagr; Trichloressigsäure (100 % G/V). Die ausgefällte DNA wird bei 0°C 15 Minuten lang inkubiert und dann durch Zentrifugation mit 12.000 g 30 Minuten lang pelletisiert. Die

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säurelösliche Radioaktivität wird gemessen in 100 &mgr;&idiagr; des Überstands. Eine Einheit 3'[³²P]ddAMP-DNA-Exonuclease-Aktivität katalysiert die saure Solubilisierung eines pmols [³²P]ddAMP in 15 Minuten.

Weitere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen enthalten.

Claims

SCHUTZANSPRÜCHE

1. Modifizierte Theritius aquaticus DNA-Polymerase, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure, als die, die an der entsprechenden Stelle in der natürlich vorkommenden Taq-Polymerase vorhanden ist, ersetzt ist, wodurch die Fähigkeit der Taq-Polymerase, ein Didesoxynucleotid im Verhältnis zu dem entsprechenden Desoxynucleotid einzubauen, verglichen mit der Fähigkeit, der entsprechenden natürlich vorkommenden DNA-Polymerase mindestens 2Ofach erhöht ist.

2. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 1, die weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNA-Polymerase an einer oder mehreren Aminosäurestellen in einem Bereich modifiziert ist, der ausgewählt ist aus einem Bereich der den Bereichen 666 bis 682, 710 bis 755, 755 bis 784, 798 bis 867 und 914 bis 928 der DNA-Polymerase I von E. coli entspricht.

3. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, weiter dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Polymerase an einer Stelle modifiziert ist, die die Aminosäuresequenz K N₁ N₂ N₃ N₄ N₅ N₆ N₇ Y G umfaßt, worin jedes N unabhängig eine Aminosäure ist.

4. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter dadurch gekennzeichnet , daß die Polymerase modifiziert ist, indem der Aminosäurerest an der Position, die dem Phenylalanin 667 der natürlich vorkommenden Taq-Polymerase entspricht, ersetzt ist.

5. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 4, weiter dadurch gekennzeichnet , daß der Aminosäurerest an der Position, die Position 667 der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase entspricht, ein Tyrosinrest ist.

6. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter dadurch gekennzeichnet , daß der Polymerase ein oder mehrere Aminosäuren an anderen Stellen als der, die dem Aminosäurerest 667 der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase entspricht, fehlen.

7. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter dadurch
gekennzeichnet , daß die Polymerase weiter modifiziert ist, indem die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität, die in der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase vorhanden ist, entfernt oder verändert ist.

8. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Polymerase Klentaq-DNA-Polymerase mit einem Tyrosinrest an der dem Rest 667 der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase entsprechenden Position ist.

9. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Polymerase das Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase ist mit einem Tyrosinrest an der dem Rest 667 der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase entsprechenden Position.

10. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Polymerase Delta-Taq-DNA-Polymerase ist mit einem Tyrosinrest an der dem Rest 667 der natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase entsprechenden Position.

11. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Fähigkeit der DNA-Polymerase, ein Didesoxynucleotid im Verhältnis zu dem entsprechenden Desoxynucleotid einzubauen, mindestens 25fach erhöht ist, verglichen mit der entsprechenden natürlich vorkommenden Taq-DNA-Polymerase.

12. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Fähigkeit mindestens 50fach erhöht ist.

13. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Fähigkeit mindestens lOOfach erhöht ist.

14. Modifizierte Thermus aquaticus DNA-Polymerase nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Fähigkeit mindestens 500fach erhöht ist.