DE69118809T2

DE69118809T2 - Erhöhte Produktion von thermus aquaticus DNA Polymerase in E. coli

Info

Publication number: DE69118809T2
Application number: DE69118809T
Authority: DE
Inventors: Mark A Sullivan
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2011-10-23
Also published as: SG52453A1; NO914191D0; KR920008186A; JPH0759195B2; ATE136932T1; KR940005592B1; IL99852A0; HU913365D0; CS324291A3; JPH05130871A; CA2052827A1; EP0482714A1; ES2086479T3; DE69118809D1; NO914191L; AU8469091A; US6083686A; EP0482714B1; HUT62334A; DK0482714T3

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Veränderung eines nativen Gens, um eine Mutantenform bereitzustellen, die eine verbesserte Expression in E. coli aufweist.
Eine der wichtigsten Errungenschaften in der rekombinanten Technologie ist die Überexpression (Überproduktion) von Fremdproteinen in prokaryontischen Zellen wie beispielsweise Escherichia coli (E. coli). In den letzten Jahren wurde durch diese Technik die Verfügbarkeit von medizinisch und wissenschaftlich bedeutenden Proteinen verbessert, von denen einige bereits für klinische Therapien und wissenschaftliche Forschung verfügbar sind. Die Überproduktion von Protein in prokaryontischen Zellen wird durch direkte Bestimmung der Aktivität des Enzyms mit einem geeigneten Substrat oder durch Messung der physikalischen Menge des erzeugten spezifischen Proteins demonstriert. Eine Proteinproduktion in großen Mengen kann erreicht werden, indem die Expression des Gens verbessert wird, das das Protein codiert. Ein bedeutender Aspekt der Genexpression ist die Effizienz beim Translatieren der Nukleotidsequenz, die das Protein codiert. Man ist sehr daran interessiert, die Produktion von bakteriellen Enzymen zu verbessern, die brauchbare Reagenzien in der Nukleinsäure-Biochemie sind, z. B. DNA-Ligase, DNA-Polymerase usw.
Leider erhält man mit dieser Technologie nicht immer hohe Ausbeuten an Protein. Eine Ursache für eine niedrige Proteinausbeute ist eine ineffiziente Translation der Nukleotidsequenzen, die das Fremdprotein codieren. Die Amplifikation von Proteinausbeuten hängt unter anderem von der Gewährleistung einer effizienten Translation ab.
Durch umfangreiche Untersuchungen in mehreren Laboratorien ist nun anerkannt, daß die Nukleotidsequenz an der das N-Ende codierenden Region eines Gens einer der Faktoren ist, die die Translationseffizienz stark beeinflussen. Es ist ebenfalls anerkannt, daß eine Veränderung der Codons am Anfang des Gens eine schlechte Translation überwinden kann. Eine Strategie ist es, den ersten Teil der codierenden Sequenz umzugestalten, ohne die Aminosäuresequenz des codierten Proteins umzugestalten, indem man die bekannte Degeneration des genetischen Codes zum Ändern der Codonselektion verwendet.
Die Untersuchungen sagen jedoch nicht voraus, lehren nicht oder geben Anleitung, welche Basen von Bedeutung sind oder welche Sequenzen für ein besonderes Protein geändert werden sollten. Der Forscher muß daher einen im wesentlichen empirischen Weg wählen, wenn er versucht, die Proteinproduktion durch Anwenden dieser rekombinanten Techniken zu optimieren.
Ein empirischer Weg ist arbeitsaufwendig. Im allgemeinen wird eine Vielzahl synthetischer Oligonukleotide, die sämtliche potentiellen Codons für die korrekte Aminosäuresequenz enthalten, an der den N-Terminus codierenden Region substituiert. Es kann dann eine Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden, um ein Oligonukleotid auszuwählen oder zu screenen, das ein hohes Maß an Expression ergibt. Ein anderer Weg ist es, eine Reihe von Derivaten durch zufällige Mutagenese der ursprünglichen Sequenz zu erhalten. Umfangreiche Screeningverfahren ergeben hoffentlich ein Klon mit einem hohen Expressionsgrad. Dieser in Frage kommende Klon wird dann analysiert, um die "optimale" Sequenz zu bestimmen, und diese Sequenz wird dazu verwendet, die korrespondierenden Fragmente in dem ursprünglichen Gen zu ersetzen. Diese Schrotschußklonierung ist arbeitsaufwendig.
Diese arbeitsaufwendigen Strategien werden eingesetzt, um die Synthese eines gewünschten Proteins zu amplifizieren, das durch das unveränderte (native) Gen lediglich in geringen Mengen hergestellt wird. Die thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq Pol) ist ein solches Produkt.
Taq Pol katalysiert die Kombination von Nukleotidtriphosphaten, um einen Nukleinsäurestrang zu bilden, der zu einem Nukleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist. Der Einsatz von thermostabiler Taq Pol bei der Amplifikation von Nukleinsäure mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) war der entscheidende Schritt in der Entwicklung von PCR zu ihrer nun dominierenden Stellung in der Molekularbiologie. Das für Taq Pol codierende Gen wurde kloniert, sequenziert und in E. coli exprimiert, wobei man lediglich bescheidene Mengen Taq Pol erhielt.
Das Problem ist, daß Taq Pol, obwohl sie aus verschiedenen Quellen im Handel erhältlich ist, teuer ist, und zwar teilweise aufgrund der bescheidenen Mengen, die mittels der derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren gewonnen werden. Eine gesteigerte Produktion von Taq Pol ist eindeutig erwünscht, um die steigende Nachfrage zu erfüllen und die Produktion ökonomischer zu machen.
FIG. 1, die einzige Zeichnung, zeigt die relevanten genetischen Komponenten eines Vektors, pSCW562, der zur Transformation eines E. coli-Wirtes verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen für Taq-Polymerase bereit, wobei die Sequenz der ersten dreißig Nukleotidbasen in dem nativen Gen, die für die ersten zehn Aminosäuren in dem reifen, nativen Protein codiert, geändert worden ist
A) indem dafür eine modifizierte Nukleotidsequenz eingesetzt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
SEQ ID NO: 2:
ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG , und 33
SEQ ID NO: 4:
ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG 36
CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG , 57 oder
B) indem zwischen den Codon (ATG) für die erste Aminosäure des reifen, nativen Proteins und den Codon (AGG) für die zweite Aminosäure des reifen, nativen Proteins, die Sequenz eingesetzt wird:
SEQ ID NO: 8:
GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG . 24
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Steigerung der Produktion von Taq Pol bereit, in dem die zuvor geänderten Gene verwendet werden.
Die Erfindung stellt Polymerase-Aktivitätsniveaus bereit, die um das 200-fache erhöht sind. Die erfindungsgemäße rekombinante Polymerase ist von nativer Taq Pol funktional nicht unterscheidbar.

1. Einführung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Produktion von Taq- Polymerase in E. coli zu erhöhen, indem ausgewählte Nukleotidsequenzen in der 5'-Region des Gens verändert werden, das für den N-Terminus der Polymerase codiert.
Die Erfindung stellt drei Nukleotidsequenzen bereit, die sich von dem nativen Thermus aquaticus-Polymerase-Gen (Taq Pol-Gen) unterscheiden.
Wenn sie in das native Gen eingeführt und in E. coli transfiziert sind, stellen diese DNA-Sequenzen eine verbesserte Expression des Gens bereit, die sich durch eine erhöhte Aktivität des Enzyms zeigt. Die Steigerung variiert in großem Umfang, je nach den durchgeführten Nukleotidänderungen und auch anderer Faktoren, wie der Induktion mit IPTG, der Inkubationsperiode von E. coli usw.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Gene sind dieselben wie das native Taq Pol-Gen, ausgenommen Änderungen in der nativen Sequenz, die erfindungsgemäß durchgeführt werden. Wo diese Veränderungen durchgeführt werden, sind sie spezifisch beschrieben und in den Beispielen und im Sequenzprotokoll angegeben. Änderungen liegen lediglich in der den N-Terminus des Proteins codierenden Region vor. Spezifischer werden Veränderungen lediglich in dem Bereich stromaufwärts vom elften Codons (AAG) gemacht, der für die elfte Aminosäure (Lysin) in dem reifen, nativen Protein codiert. Der elfte Codon ist nicht verändert, er wird jedoch im Sequenzprotokoll als die Klammer oder der Punkt angegeben, über denen bei der Durchführung der Erfindung Veränderungen durchgeführt werden. Mit Ausnahme dieser identifizierten Veränderungen bleibt die verbleibende Sequenz des Taq Pol-Gens unverändert.
Der hier verwendete Begriff "Taq Pol-Gen" betrifft die Nukleotidsequenz, die für die thermostabile DNA-Polymerase von Thermus aquaticus codiert, und schließt Mutantenformen des nativen Gens mit ein, spontan oder induziert, so lange die Mutationen keine wesentlichen Veränderungen in der essentiellen Aktivität der nativen Polymerase bewirken.
Der hier verwendete Begriff "Taq Pol" bezeichnet die Polymerase, die durch das Taq Pol-Gen codiert wird.
Der hier verwendete Begriff "nativ" bezeichnet die unveränderte Nukleotidsequenz des Taq Pol-Gens oder die unveränderte Aminosäuresequenz der Taq-Polymerase, da dieses Gen oder Enzym in T. aquaticus natürlich vorkommt. Siehe SEQ ID NO: 1.
Ganz allgemein umfaßt die Erfindung die folgenden Schritte:
A) Bereitstellen eines Vektors mit einem Taq Pol-Gen der Erfindung,
B) Transfizieren kompatibler E. coli-Wirtszellen mit dem Vektor von A), wobei transformierte E. coli-Wirtszellen erhalten werden; und
C) Kultivieren der transformierten Zellen von B) unter Wachstumsbedingungen, wobei Taq-Polymerase hergestellt wird, die durch die transformierten Wirtszellen synthetisiert wird.
Die folgenden Bakterienstämme, Plasmide, Phagen und Reagenzien wurden bei der Erfindung verwendet.

2. Bakterienstämme

Thermus aquaticus YT-I, ATCC Nr. 25104, wurde zur Isolierung von nativer DNA verwendet. Der E. coli-Wirtstamm für sämtliche Klonierungs- und Plasmidmanipulationen, DH5α [F-θ80dlacZΔM15 Δ (lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK&supmin;, mK&spplus;) supE44 thil gyrA relA1] wurde von BRL erhalten.
Stamm JM103 [thi&supmin;, strA, supE, endA, sbcB, hsdR&supmin;, D(lac-pro), F'-traD36, proAB, lacIq, lacZDM15] (Yanisch-Perron und andere, Verbesserte M13-Phagen- Klonierungsvektoren und Wirtsstämme: Nukleotidsequenzen der Vektoren M13mp18 und pUC19, Gene 33:103-119 (1985)) wurde ebenfalls für Proteinexpressionsexperimente verwendet.
Der Wirtsstamm für die Herstellung von einzelsträngiger DNA zur Verwendung bei der Mutagenese war CJ236 (pCJ105, dut ung thi relA) (Kunkel und andere, Rasche und effiziente gerichtete Mutagenese ohne Phänotyp-Selektion, Methods Enzymol. 154: 367 - 382, (1987)).
Der f1-Phage R408 (Russel und andere, An Improved Filamentous Helper Phage for Generating Single-stranded DNA, Gene 45: 333 - 338 (1986)) wurde als Helfer verwendet, um einzelsträngige Plasmid-DNA zur Mutagenese zu erzeugen. Das Plasmid, das für sämtliche Klonierungs- und Expressionsarbeit verwendet wurde, war pSCW562 oder sein Derivat pTaq1. Ein Diagramm von pSCW562 ist in Figur 1 angegeben. Wenn das native Taq Pol-Gen in pSCW 562 eingeführt wird, wird das erhaltene Plasmid als pTaq1 bezeichnet. Wenn das native Taq Pol-Gen durch Mutagenese verändert wird, wird das Mutantenplasmid als pTaq3, pTaq4, pTaq5 oder pTaq6 bezeichnet, je nach der Nukleotidsequenz, mit der es mutagenisiert ist.

3. Reagenzien

Chemikalien wurden von Sigma, International Biotechnologies, Inc. oder Eastman Kodak gekauft. LB-Medium wurde von Gibco erhalten. Enzyme wurden von New England Biolabs, IBI, BRL, Boehringer-Mannheim oder U.S. Biochemicals gekauft und wurden nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Sequenase -Kits zur DNA-Sequenzierung wurden von U.S. Biochemicals erhalten. Radioisotope wurden von Amersham gekauft. Taq-Polymerase wurde von Cetus gekauft.

4. Verfahren zum Erhöhen der Produktion von Taq Pol

Schritt A - Bereitstellen eines Vektors mit dem Taq Pol-Gen der Erfindung

Ein Verfahren zum Bereitstellen eines Vektors mit dem Taq Pol-Gen der Erfindung ist es:
- die native DNA aus Thermus aquaticus bereitzustellen;
- die native Taq Pol-DNA zu amplifizieren und Restriktionsstellen an beiden Enden des DNA-Fragments einzubauen,
- die DNA-Fragmente von ii) zu einem geeigneten Vektor zu ligieren,
- gerichtete Mutagenese einzusetzen, um die Nukleotidsequenz der nativen DNA zu verändern, und
- Vektoren zu screenen, die die geänderte Nukleotidsequenz der Erfindung tragen.

i. Bereitstellen des nativen Gens aus T. aquaticus

Sämtliche DNA-Manipulationen wurden mittels Standardvorschriften durchgeführt (Maniatis und andere, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982, und Ausebel und andere, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York, 1987). Die gesamte DNA aus T. aquaticus (Stamm YT-1, [ATCC Nr. 25104]) wurde aus einer 40 ml-Kultur des Organismus isoliert, der über Nacht bei 70 ºC im ATCC-Medium #461 gezüchtet worden war. Die Zellen wurden mittels Zentrifugieren pelletiert, einmal mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) (TE) gewaschen und in 5 ml TE resuspendiert. Lysozym wurde bei einer Konzentration von 1 mg/ml zugefügt, und die Lösung wurde bei 37 ºC 30 Minuten lang inkubiert. EDTA, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Proteinase K wurden bei Konzentrationen von 50 mM, 0,5 % bzw. 100 µg/ml zugegeben, und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 50 ºC inkubiert. Die Probe wurde dreimal mit Phenol-Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert, und die DNA wurde durch Zugabe von Natriumacetat mit 0,3 N und zwei Volumen Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Aufspulen auf einem Glasstab gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gewaschen und in (TE) aufgelöst.

ii. Amplifizieren des nativen Taq Pol-Gens und Einbauen von Restriktionsstellen

Der schnellste Weg zum Erzeugen großer Mengen von Taq Pol-Gen ist es, die veröffentlichte Nukleinsäuresequenz des Gens zu verwenden (Lawyer und andere, Isolation, Characterization and Expression in Escherichia coli of the DNA Polymerase from Thermus aquaticus, Journal of Biological Chemistry, 264: 6427 - 6437, 1989), um Oligonukleotidprimer zu gestalten, die in der PCR zum Amplifizieren von genomischer DNA verwendet werden können. Siehe SEQ ID NO: 1: für die gesamte Gensequenz.
PCR ist eine Amplifikationstechnik, die im Stand der Technik gut bekannt ist (Saiki und andere, Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase, Science 239: 487 - 491 (1988)), die eine Kettenreaktion umfaßt, bei der große Mengen einer spezifischen bekannten Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Bei der PCR ist es erforderlich, daß genügend Einzelheiten der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz bekannt sein müssen, so daß Oligonukleotidprimer hergestellt werden können, die zu den gewünschten Nukleinsäuresequenzen in ausreichendem Maße komplementär sind, um mit ihnen zu hybridisieren und Extensionsprodukte zu synthetisieren.
Primer sind Oligonukleotide, natürlich oder synthetisch, die in der Lage sind, als Initiationspunkte für die DNA-Synthese zu wirken, wenn sie unter Bedingungen eingebracht werden, bei denen die Synthese eines Primerextensionsprodukts, das zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart der vier verschiedenen Nukleotidtriphosphate und thermostabiler Enzyme in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur.
Eine PCR-Amplifikation wurde an der Taq Pol-DNA von i) im wesentlichen wie bei Saiki und anderen beschrieben ist, in einem Ericomp-Thermocycler durchgeführt. Primer wurden auf der Basis der veröffentlichten Sequenz des Taq Pol-Gens (Lawyer und andere) gestaltet. Amplifikationsgemische enthielten etwa 100 ng T. aquaticus-DNA, 1 µM eines jeden der beiden Primer, jeweils 200 µM von dATP, dGTP, dCTP und dTTP, und 2 Einheiten Taq Pol in einem Volumen von 0,05 ml. Die Gemische wurden 10 Sekunden lang auf 97 ºC erhitzt, bei 40 ºC für 30 Sekunden aneliert bzw. hybridisiert und bei 72 ºC für 5 Minuten verlängert, und zwar für 5 Zyklen. Für die folgenden 20 Zyklen wurde die Annealingtemperatur auf 55 ºC erhöht und die Extensionszeit auf 3 Minuten reduziert. Schließlich wurden die Gemische bei 72 ºC für 15 Minuten inkubiert, um die Menge an vollständig doppelsträngigem Produkt zu maximieren. Das gesamte PCR-Reaktionsgemisch wurde auf einem 1,0 %-igem Agarosegel fraktioniert, und das 2,5 kb Taq-Polymerase-Gen wurde herausgeschnitten und extrahiert. DNA-Fragmente wurden aus Agarosegelen mittels einer sogenannten "Freeze-Squeeze-Technik" isoliert. Die Agarosescheiben wurden zerkleinert, auf Trockeneis eingefroren und bei 37 ºC 5 Minuten lang rasch aufgetaut. Die Aufschlämmung wurde durch Zentrifugieren durch eine 0,45 mm Durapore-Membran von Millipore filtriert. Das Filtrat wurde einmal mit mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, einmal mit Phenol-Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Ausfällen mittels Ethanol gewonnen.
Einbauen von Restriktionsstellen: Um eine Excision und Wiedergewinnung des Taq Pol-Gens während der PCR zu ermöglichen und auch ein bequemes Klonen des Taq Pol-Gens in einen Expressionsvektor zu erreichen, werden zwei Restriktionsstellen bei den 5'-Enden beider Stränge des Gens eingeführt. Spezifischer wurde eine Restriktionsstelle benachbart und stromaufwärts vom Startcodon (ATG) eingeführt, und die andere Restriktionsstelle wurde benachbart zu und stromabwärts vom Stopcodon (TGA) eingeführt (SEQ ID NOS: 6 & 7). Die Nukleotide, die die Restriktionsstellen bilden, waren auf dem synthetischen Primer enthalten, der bei der PCR verwendet wurde. In den hier beschriebenen Beispielen war die Nukleotidsequenz GAATTC, die die EcoR1- Restriktionsstelle bildet, auf den Primern enthalten.
Es können auch andere Restriktionsstellen bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß 1) der Expressionsvektor eine korrespondierende Stelle aufweist, wo die Taq-DNA ligiert werden soll, 2) die Restriktionsstelle nicht innerhalb des Taq Pol-Gens auftritt.
Wie in Figur 1 dargestellt ist, ist EcoR1 eine von mehreren Restriktionsstellen in pSCW562. Andere Beispiele für Restriktionsstellen sind XbaI und SphI. Natürlich würden Expressionsvektoren, die andere Restriktionsstellen aufweisen, noch mehr potentielle Restriktionsstellen bereitstellen, die bei der Durchführung dieser Erfindung brauchbar wären.
Wenn sie mit dem geeigneten Enzym gespalten werden, bilden diese Restriktionsstellen klebrige Enden, die auf bequeme Weise an entsprechend gespaltene Restriktionsstellen auf dem Expressionsvektor ligiert werden können. Die Restriktionsstellen beeinflussen die Aminosäuresequenz von Taq Pol nicht.
Alternatives Verfahren: Anstelle der zuvor beschriebenen PCR-Technik kann das native Taq Pol-Gen alternativ durch herkömmliches Klonen des Gens bereitgestellt werden. In diesem Fall können die Restriktionsstellen durch gerichtete Mutagenese eingeführt werden. Die Endergebnisse beider Verfahren sind ununterscheidbar.

iii. Ligieren von DNA-Fragmenten in einen Vektor

Die DNA aus Schritt ii) wird dann an einen geeigneten Expressionsvektor ligiert. Der zum Klonieren gewählte Vektor war pSCW562, der eine EcoR1-Stelle 11 Basenpaare stromabwärts von der Ribosomen-Bindungsstelle und den starken tac-Promotor (trp-lac-Hybrid) (Figur 1) enthält. Das Taq Pol-Gen enthält keine EcoR1-Stellen, deshalb wurden die PCR-Primer mit EcoR1-Stellen nahe ihren 5'-Enden gestaltet (Schritt ii)), um ein direktes Klonieren in die EcoR1-Stelle von pSCW562 zu erlauben.
Zusätzlich zu der EcoR1-Stelle enthält der Vektor pSCW562 1) einen Phagen-Replikationsursprung (F&sub1;), 2) einen Plasmid-Replikationsursprung (ORI), 3) einen Antibiotika-Resistenzmarker (AMP) und 4) eine Transkriptionsterminationssequenz stromabwärts von den Restriktionsstellen. Dieses Plasmid wurde mittels auf dem Gebiet der rekombinanten DNA gut bekannten Techniken konstruiert, wie sie von Maniatis und anderen in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1982), gelehrt werden. Dieses besondere Plasmid ist für die Erfindung jedoch nicht entscheidend. Jeder Vektor, der einen geeigneten Promotor und Restriktionsstellen enthält, ist in diesem Verfahren brauchbar.
Das EcoR1-verdaute PCR-Produkt aus Schritt ii) wurde in einem 1 %-igen Agarosegel fraktioniert und eluiert. Der Vektor, pSCW562, wurde über Nacht mit EcoR1 (10 Einheiten/µg) gespalten und mit alkalischer Phosphatase (1 Einheit/µg) aus Kälberdarm behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in TE resuspendiert. Etwa 200 ng des hergestellten Vektors wurden mit 500 ng gereinigtem PCR-Produkt gemischt und 18 Stunden lang in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, mit 0,5 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Volumen von 20 µl ligiert.

iv. Verwendung von gerichteter Mutagenese, um die Nukleotidsequenz des nativen Taq Pol-Gens zu verändern

Gerichtete Mutagenese ist ein Verfahren zum Verändern der Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments durch spezifisches Substituieren, Insertieren oder Deletieren ausgewählter Nukleotide in der zu verändernden Sequenz. Das Verfahren umfaßt das Primen der DNA-Synthese in vitro mit chemisch synthetisierten Nukleotiden, die eine Nukleotid-Fehlpaarung mit der Sequenz des Matrizenstrangs tragen. Das synthetische Oligonukleotid primed die DNA- Synthese und wird selbst in das resultierende Heteroduplex-Molekül eingebaut. Nach der Transformation von Wirtszellen bewirkt dieser Heteroduplex die Bildung von Homoduplexen, deren Sequenzen die mutagenen Nukleotide tragen. Mutante Klone werden durch Screeningverfahren ausgewählt, die aus der Technik gut bekannt sind, wie Nukleinsäurehybridisierung mit markierten Sonden und DNA-Sequenzierung.
Mittels gerichteter Mutagenese konstruierten wir mutante Gene für Taq-Polymerase, wobei die Sequenz der ersten dreißig Nukleotidbasen in dem nativen Gen, die für die ersten zehn Aminosäuren in dem reifen, nativen Protein codieren, verändert wurden
A) indem dafür eine modifizierte Nukleotidsequenz substituiert wurde, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Beispiel 1 - SEQ ID NO: 2:
ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG , 33 und 33
BEISPIEL 2 - SEQ ID NO: 4:
ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG 36
CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG , 57
oder Beispiel 3,
B) indem zwischen dem Startcodon (ATG) für die erste Aminosäure des reifen, nativen Proteins und dem Codon (AGG) für die zweite Aminosäure des reifen, nativen Proteins die Sequenz insertiert wird:
SEQ ID NO: 8:
GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG . 24
In den vorherigen Beispielen sind Basen, die geändert werden, durch Fettdruck hervorgehoben. Den Effekt, den diese Änderungen auf die Polymeraseaktivität aufweisen, ist in Tabelle I angegeben. Die vorherigen Beispiele sollen lediglich der Veranschaulichung dienen und dem Umfang der beanspruchten Erfindung in keiner Weise einschränken.
In diesen Beispielen wurden sämtliche Genmodifikationen durch gerichtete Mutagenese durchgeführt. In der Technik sind jedoch auch alternative Verfahren bekannt, die zu denselben Ergebnissen führen würden. Die zuvor beschriebenen Änderungen des Taq Pol-Gens hätten beispielsweise während der Amplifikation (PCR) direkt in das Gen eingebaut werden können, indem man den Stromaufwärts-Oligonukleotidprimer in geeigneter Weise derart entwirft, daß er die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthält.
Eine andere Alternative wäre es, gleichartige Restriktionsstellen einzubauen, die die ersten zehn Codons des Gens einschließen. Dies würde ein Entfernen der Sequenzen, die den Aminoterminus codieren, durch Spaltung mittels Restriktionsendonuclease und Ersetzen mittels eines doppelsträngigen, synthetischen Fragments erlauben. Jedes dieser Verfahren kann verwendet werden, um die zuvor dargelegten Nukleotidänderungen zu erreichen.
Die gerichtete Mutagenese wurde im wesentlichen durchgeführt wie bei Kunkel und anderen, Rapid and Effizient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection, Methods Enzymol, 154: 367 - 382, (1987), beschrieben ist, wobei ein Kit verwendet wurde, der von Bio Rad erhalten wurde. Einzelsträngige Plasmid-DNA wurde durch frühe Infektion der exponentiellen Phase von Kulturen von CJ236 (die pTaq1 tragen) mit R408 bei einer Infektionsmultiplizität von etwa 10 - 20 hergestellt. Nach Wachsen über Nacht bei 37 ºC wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und der Phage durch Zugabe von Polyethylenglycol mit 5 % und NaCl mit 0,5 M ausgefällt. Der Phage wurde durch Zentrifugieren pelletiert und die DNA durch Extraktion mit Phenol-Chloroform und Fällen mit Ethanol isoliert. Die mutagenen Oligonukleotide wurden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, und jeweils 9 pmol wurden mit etwa 3 pmol einzelsträngiger Plasmid-DNA aneliert. Das anelierte Gemisch wurde mit T4-DNA-Polymerase verlängert, ligiert und in DH5α oder JM103 transformiert. Plasmid-DNA wurde von den Transformanden durch rasches Kochen isoliert (Holmes und Quigley, A Rapid Boiling Method for the Preparation of Bacterial Plasmids, Anal. Biochem. 114: 193 - 199, 1981) und mit EcoR1 gespalten, wobei Klone nachgewiesen wurden, die eine Mutagenese durchgemacht hatten.

v. Screenen auf Vektoren mit dem Taq Pol-Gen

Um zu verifizieren, daß die Klone von iv) das gewünschte Taq Pol-Gen tragen, wurden Klone auf Nitrocellulosefilter gegeben und durch Kolonie- Hybridisierung als Taq Pol-Transformanden identifiziert.
Kolonie-Hybridisierung: Bei dieser Technik wird eine spezifische Nukleinsäuresequenz identifiziert, indem Bedingungen für Einzelstränge der spezifischen Nukleinsäuresequenz geschaffen werden, um Basenpaare mit komplementären, radioaktiven einzelsträngigen Nukleinsäurefragmenten (Sonden) zu bilden (hybridisieren). Doppelsträngige Regionen bilden sich dort, wo die beiden DNA-Arten komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen, und werden durch ihre Radioaktivität nachgewiesen.
Kolonien, die das Taq Pol-Fragment enthalten, wurden durch Hybridisieren mit einem internen Oligonukleotid:
SEQ ID NO: 10:
GTGGTCTTTG ACGCCAAG,
das am 5'-Ende mit ³²P markiert war, mit T4-Polynukleotidkinase identifiziert. Koloniehybridisierungen wurden, wie in Maniatis und anderen, supra, beschrieben ist, durchgeführt, in 5X SSPE [1XSSPE in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA], 0,1 % Natriumlauroylsarcosin, 0,02 % SDS, 0,5 % Blockierungsmittel (Boehringer-Mannheim), das etwa 5 ng pro ml mit ³²P markiertes Oligonukleotid enthielt. Die Hybridisierung wurde bei 42 ºC für 4 - 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden in 2X SSPE, dreimal bei Raumtemperatur in 0,1 %-igem SDS gewaschen, gefolgt von einem stringenten Waschvorgang bei 42 ºC in derselben Lösung. Positive Kolonien wurden durch Autoradiographie identifiziert.
Sequenzanalyse: Um sicherzustellen, ob die Taq Pol-DNA in der richtigen Richtung bzw. Orientierung eingebaut wurde oder nicht, wurde eine DNA- Sequenzanalyse auf alkalisch denaturierter, superspiralisierter DNA durchgeführt, wie von Zhang und anderen, Double Stranded DNA sequencing as a Choice for DNA Sequencing, Nucleic Acids Research 16: 1220 (1988), beschrieben ist, wobei ein Sequenase -Kit von U.S. Biochemicals und ein (³&sup5;S)dATP verwendet wurde. Normalerweise wurden 1,0 µl superspiralisierte DNA der CsCl-Bande in 20 µl 0,2 M NaOH, 0,2 mM EDTA für 5 Minuten denaturiert. Die Lösung wurde mit 2 µl 2 M Ammoniumacetat (pH 4,6) neutralisiert und mit 60 ml Ethanol ausgefällt. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang zentrifugiert, einmal mit 80 %-igem Ethanol gewaschen, 10 Minuten getrocknet und in 7 ml H&sub2;O resuspendiert. Nach Zugabe von 5 ng Primer und 2 µl 5X Puffer wurden die Proben auf 65 ºC erhitzt und über 30 - 45 Minuten auf < 37 ºC abgekühlt. Die Sequenzierungsreaktionen wurden dann nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Reaktionen wurden dann nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Reaktionen wurden auf 6 %-igen Sequenziergelen einer Elektrophorese unterzogen, wobei gelegentlich ein Natriumacetatsalzgradient verwendet wurde, um die Auflösung nahe dem Boden des Gels zu verbessern (Sheen und andere, Electrolyte Gradient Gels for DNA Sequencing, Bio Techniques 6: 942 - 944, 1989). Alternativ wurde Plasmid DNA hergestellt durch rasches kochen oder es wurden nach Extraktion mit Phenol-Chloroform und Fällen mit Ethanol alkalische Miniprep-Verfahren zum Sequenzieren verwendet, wenn auch mit etwas geringerer Zuverlässigkeit.

Schritt B - Transfektion von Wirtszellen mit dem Vektor von A)

Der Vektor von A) wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transfizieren, und der transformierte Wirt wird unter günstigen Wachstumsbedingungen in Kultur gehalten. Prokaryontische Wirte sind im allgemeinen in gentechnologischen Techniken die effizientesten und bequemsten und sind daher für die Expression von Taq-Polymerase bevorzugt. Prokaryonten werden am häufigsten repräsentiert durch verschiedene Stämme von E. coli, wie DH5a und JM103, die Stämme, die in den folgenden Beispielen verwendet werden. Es können jedoch auch andere Mikrobenstämme verwendet werden, so lange der als Wirt ausgewählte Stamm mit dem Plasmidvektor, mit dem er transformiert wird, kompatibel ist. Kompatibilität von Wirt und Plasmid/Vektor bedeutet, daß der Wirt die Plasmid/Vektor-DNA getreu repliziert und ein richtiges Funktionieren der zuvor genannten Kontrollelemente erlaubt. In unserem System sind DH5α und JM103 mit pSCW562 kompatibel.
Fünf ml des Ligationsgemischs von Schritt B wurden mit 0,1 µl DH5α- oder JM103-Zellen gemischt, die durch CaCl&sub2;-Bebandlung kompetent gemacht wurden, wie von Cohen und anderen, Proc. National Academy of Science, USA, 69: 2110 (1972) beschrieben ist. Nach 15 - 30-minütiger Inkubation auf Eis wurde das Gemisch 90 Sekunden lang bei 42 ºC inkubiert. Nach dem Wärmeschock wurde ein ml LB-Medium zugegeben, und die Zellen wurden eine Stunde lang bei 37 ºC inkubiert.
Auswahl von Transformanden: Nach der einstündigen Inkubation wurden Aliquote des inkubierten Gemischs auf LB-Agar-Platten aufgebracht, die 50 µg/ml Ampicillin enthielten, und 18 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Nur transformierte E. coli, die das AMP-(Marker)-Gen tragen, können auf diesem Medium wachsen. Um Transformanden auszuwählen, die auch das Taq Pol-Gen in der korrekten Orientierung tragen, wurden mittels der zuvor bereits beschriebenen Techniken Koloniehybridisierung und Sequenzanalysen durchgeführt.

Schritt C - Kultivieren des transformierten Wirts

E. coli-Transformanden, von denen nachgewiesen wurde, daß sie das Taq Pol-Gen in der korrekten Orientierung enthalten, wurden in 40 ml LB-Nährflüssigkeit bei 37 ºC bis zur Mid-log-Phase kultiviert und im geeigneten Fall mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induziert. Man ließ die Zellen entweder weitere zwei Stunden lang oder über Nacht wachsen und erntete sie durch Zentrifugieren. Die Zellen wurden in 0,25 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5 µg/ml Leupeptin, 2,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert und schallbehandelt. Das Lysat wurde mit 0,25 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 0,5 % Tween 20, 0,5 %-igem NP-40 verdünnt und 20 Minuten lang auf 74 ºC erwärmt. Nach Kühlen auf Eis für 15 Minuten wurden die Trümmer durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 4 ºC entfernt. Aliquote der Überstandsfraktion wurden auf ihre DNA-Polymerase-Aktivität mittels aktivierter Lachsspermien-DNA als dem Substrat getestet.
DNA-Polymerase-Test: Dieser Test beruht auf der Fähigkeit von DNA- Polymerasen, in doppelsträngiger DNA hergestellte, einzelsträngige Lücken aufzufüllen. Er verwendet die einzelsträngigen Lücken als Matrizenstränge und die freie 3'-Hydroxylgruppe am Rand der einzelsträngigen Lücke als den Primer, bei dem er die Synthese beginnt. Speziell wurden 5 µl Enzympräparat für 10 Minuten bei 74 ºC in insgesamt 50 µl des folgenden inkubiert: 25 mM Tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propansulfonsäure (TAPS) (pH 9,8 bei 22 ºC), 50 mM KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM MgCl&sub2;, 0,30 mg/ml aktivierte Lachshoden-DNA, jeweils 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP und 0,1 mM (200 nCi/nmol) [8-³H]dATP. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl 0,15 M Natriumpyrophosphat, 0,105 M Natrium-EDTA, pH 8,0, gefolgt von der Zugabe eiskalter 10 %-iger Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Sie wurde dann 15 - 30 Minuten lang auf Eis gehalten, bevor es auf einem vorbefeuchteten Filterscheibchen für 25 mm Whatman-Glasfaserfilter (GFC) vakuumfiltriert wurde. Das ausgefällte Reaktionsprodukt wurde von nicht eingebautem ³H auf dem Filter mit insgesamt 12 ml eiskalter 10 %-iger TCA, gefolgt von insgesamt 12 ml eiskaltem 95 %-igem Ethanol freigewaschen. Die Filter wurden vakuumgetrocknet, dann luftgetrocknet und dann direkt in einem Szintillationsfluid gezählt. Enzympräparate, bei denen Verdünnen notwendig war, wurden mit einer Lösung von 10 mM Tris, 50 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1,0 mg/ml Gelatine, 0,5 %-igem Nonidet P40, 0,5 %-igem Tween 20, 1 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0, verdünnt. Eine Einheit der Aktivität ist die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 10 nmol Gesamtnukleotid in 30 Minuten bei 74 ºC einzubauen; Adenin stellt etwa 29,7 % der Gesamtbasen in Lachssperma-DNA dar.
Lachshoden-DNA (Sigma Typ III; Produkt #D1626) wurde aufgelöst in 1,3 mg/ml TM-Puffer (10 mM Tris, 5 mM MgCl&sub2;, pH 7,2) und langsam 24 Stunden lang bei 4 ºC gerührt. Sie wurde dann 2,5-fach mit TM-Puffer verdünnt und die NaCl-Konzentration auf 0,3 M eingestellt, bevor bei Raumtemperatur mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform (1:1::Vol.:Vol.; Phenol gesättigt mit TM-Puffer) extrahiert wurde. Das Gemisch wurde bei 2700 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Phasentrennung zu unterstützen, die wäßrige Phase wurde aufgefangen und mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Das Gemisch wurde wie zuvor zentrifugiert, und die wäßrige Phase wurde wiederum gesammelt. Die aktivierte DNA in der wäßrigen Phase wurde mit zwei Volumen 95 %-igem Ethanol bei -20 ºC ausgefällt; das ausgefällte Gemisch wurde bei -20 ºC für 12 - 18 Stunden aufbewahrt. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugieren bei 13 700 x g für 30 Minuten bei 2 ºC gesammelt. Das Pellet wurde mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet und dann 3 - 6 mg/ml mit TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) unter langsamem Rütteln für 12 - 18 Stunden bei Raumtemperatur wieder aufgelöst. Die Lösung wurde gegen TE dialysiert und dann auf die richtige Konzentration eingestellt, indem die Absorption bei 260 nm geprüft wurde. Aliquote (0,5 - 1,0 ml) wurden bei -20 ºC aufbewahrt; zur Verwendung wurde eine Ampulle aufgetaut und dann bei 4 ºC aufbewahrt, anstatt sie wieder einzufrieren.

5. Ergebnisse des Polymerasetests

Die Ergebnisse des Taq Pol-Tests sind in Tabelle I angegeben. Der Vektor pTaq1 trägt die SEQ ID NO: 1, die die native Taq Pol-Sequenz ist, während die vier anderen Plasmide Sequenzen tragen, die gemäß der Erfindung wie zuvor beschrieben verändert sind.
Tabelle I zeigt unerwarteterweise, daß pTaq3 (SEQ ID NO: 2) eine Taq Pol-Aktivität zeigt, die das bis zu 200-fache derjenigen von pTaq1 ist; pTaq4 (SEQ ID NO: 3) wies eine etwa 10-fache Aktivität von pTaq1 auf; pTaq5 (SEQ ID NO: 4) war etwa 10 - 50-mal größer als pTaq1, je nach dem Experiment, und pTaq6. (SEQ NR: 5) war mindestens 10-mal höher als pTaq1 (SEQ ID NO: 1). Diese Ergebnisse sind unerwartet.
Die kurzen Nukleotidsequenzen in dem Sequenzprotokoll stellen Sequenzänderungen in den ersten 30 Nukleotiden des nativen Gens dar. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Sequenzen lediglich einen kleinen Teil des vollständigen Taq Pol-Gens darstellen, das in seiner Gesamtheit über 2000 Nukleotide enthält. TABELLE I (Einheiten/mg Protein) Wirtsstamm: Erntezeit: Induktion Plasmid Std. pTaq
ND = nicht bestimmt
ON = über Nacht
+ = Einführung
- = keine Einführung
Tabelle I - Test der Aktivität von thermostabiler DNA-Polymerase, die durch die verschiedenen Expressionsplasmide codiert ist. Polymerase-Aktivität wird als eine Reflexion von Genexpression und Polymerase-Produktion interpretiert.

SEQUENZIDENTIFIZIERUNG

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Sullivan, Mark Alan
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Erhöhte Produktion von Thermus aquaticus-DNA-Polymerase in E. coli
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14
(iv) BRIEFADRESSE:
(A) ADRESSAT: Eastman Kodak Company, Patent Department
(B) STRASSE: 343 State Street
(C) STADT: Rochester
(D) STAAT: New York
(E) LAND: U.S.A.
(F) PLZ: 14650-2201
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Diskette, 3,5 Inch, 800 kb Speicher
(B) COMPUTER: Apple Macintosh
(C) BETRIEBSSYSTEM: Macintosh 6.0
(D) SOFTWARE: WriteNow
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG: Keine
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER
(A) NAME: Wells, Doreen M.
(B) VERTRETER NUMMER: 34,278
(C) ZEICHEN/AKTENZEICHEN: 58374D-W1100
(ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (716) 477-0554
(B) TELEFAX: (716) 477-4646
(2) ANGABEN ZUR SEQUENZ ID NR: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 2499
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Thermus aquaticus
(B) ISOLAT: YT1, ATCC 25104
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: amplifiziert aus genomischer DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
(B) LAGE: 1-2496
(C) ERMITTLUNGSMETHODE: Vergleich mit Sequenz in GenBank, Accession Nummer J04639.
(x) ANGABEN ZU PUBLIKATIONEN:
(A) AUTOREN: Lawyer, F.C., Stoffel, S., Saiki, R.K., Myambo, K., Drummond, R., Gelfand, D.H.
(B) TITEL: Isolation, characterization and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.
(C) ZEITSCHRIFT: Journal of Biological Chemistry
(D) BAND: 264
(E) AUSGABE: 11
(F) SEITEN: 6427 - 6437
(G) DATUM: 15. April 1989
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 1 :
(3) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 33
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(4) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 33
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(5) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 57
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(6) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 57
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(7) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 20
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GAATTC ATG AGG GGG ATG CT 20
(8) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 23
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
GGTGGAAT TCA CTC CTT GGC GGA 23
(9) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 24
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(10) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(11) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 18
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GTGGTCTTTG ACGCCAAG 18
(12) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 59
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
AGGGGCAGCA TACCACGCTT GTCATCGTCG TCCTTGTAGT CCATAATTCT 50
GTTTCCTGT 59
(13) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 59
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
AGGGGCAGCA TCCCCCTCTT GTCATCGTCG TCCTTGTAGT CCATGAATTC 50
TGTTTCCTGT 60
(14) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 48
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GCCCTTCGGC TCAAACAGTG GCAGCATACC ACGCATAATT CTGTTTCC 48
(15) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 53
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
CGGCCCTTG GCTCAAAGAG GGGCAGCATC CCACGCATGA ATTCCTGTTT 50
CCT 53

Claims

1. Gen für Taq-Polymerase, bei dem die Sequenz der ersten dreißig Nucleotidbasen in dem nativen Gen, die die ersten zehn Aminosäuren in dem reifen nativen Protein kodieren durch Insertion der Sequenz:

SEQ ID NO: 8

GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24.

zwischen dem Startcodon (ATG) des reifen nativen Proteins und dem Codon (AGG) für die zweite Aminosäure des reifen nativen Proteins geändert worden ist.

2. Gen für Taq-Polymerase, bei dem die Sequenz der ersten dreißig Nucleotidbasen in dem nativen Gen, die die ersten zehn Aminosäuren in dem reifen nativen Protein kodieren, durch Substitution mit der modifizierten Nucleotidsequenz:

SEQ ID NO: 4

ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG 36

CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG, 57.

geändert worden ist.

3. Gen für Taq-Polymerase, bei dem die Sequenz der ersten dreißig Nucleotidbasen in dem nativen Gen, die die ersten zehn Aminosäuren in dem reifen nativen Protein kodieren, durch Substitution mit der modifizierten Nucleotidsequenz:

SEQ ID NO: 2

ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG 33.

geändert worden ist.

4. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine Restriktionsstelle stromaufwärts von dem Startcodon (ATG) und diesem benachbart aufweist und dieselbe Restriktionsstelle stromabwärts von dem Stopcodon (TGA) und diesem benachbart aufweist.

5. Gen nach Anspruch 4, bei dem die Restriktionsstellen durch die Nucleotidsequenz GAATTC kodiert werden.

6. Gen nach Anspruch 3, bei dem die native Sequenz:

SEQ ID NO: 1

ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 33

geändert ist zu der

SEQ ID NO: 2

ATG CGT GGT ATC CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG 33.

7. Thermostabile Thermus aquaticus-DNA-Polymerase, die durch das Gen von Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert wird, die als die erste Aminosäuresequenz in dem reifen Protein SEQ ID NO: 9

aufweist.

8. Verfahren zum Steigern der Produktion von Taq-Polymerase, umfassend die Schritte:

A) Bereitstellen eines Vektors mit dem Gen von einem der Ansprüche 1 bis 3;

B) Transfection eines kompatiblen E. coli-Wirtes mit dem Vektor von A), wobei transformierte E. coli-Wirtszellen erhalten werden; und

C) Kultivieren der transformierten Zellen von B) unter Wachstumsbedingungen, wodurch Taq-Polymerase erzeugt wird, die vom den transformierten Wirtszellen synthetisiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Vektor von Schritt A einen induzierbaren Promotor aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, bei dem die Produktion von Taq-Polymerase mit Isopropyl-β-D-thiogalactosidase (IPTG) induziert wird.

11. Vektor mit dem Gen von einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Vektor aufweist:

i) auswählbare Marker,

ii) einen geeigneten Promotor, und

iii) geeignete Regulatorsequenzen zum Kontrollieren der Genexpression.

12. E. coli-Wirtszelle, die den Vektor von Anspruch 11 umfaßt.