DE69725076T2

DE69725076T2 - Modifizierte thermostabile DNA Polymerase und eine DNA Polymerasezusammensetzung zur Amplifikation von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69725076T2
Application number: DE69725076T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Komatsubara; Masao Kitabayashi; Hideki Kamimura; Bunsei Kawakami; Yoshihisa Kawamura; Masahiro Takagi; Tadayuki Imanaka
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: US6008025A; EP0822256A3; DE69725076D1; EP0822256A2; EP0822256B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase, eine DNA-Polymerasezusammensetzung zur Nukleinsäureamplifikation und ein Reagenz zur Nukleinsäurenamplifikation, das das Enzym oder die Zusammensetzung enthält, sowie ein Verfahren zur Nukleinsäurenamplifikation unter Verwendung des Reagenz.
Üblicherweise wurde eine große Anzahl von Untersuchungen bezüglich thermostabiler DNA-Polymerasen zur Verwendung für Nukleinsäureamplifikationstechniken, wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR) usw. durchgeführt. Beispiele thermostabiler DNA-Polymerasen, die in der PCR verwendet werden, sind DNA-Polymerase (Tth-Polymerase), die hauptsächlich von Thermus thermophilus abstammt, und DNA-Polymerase (Taq-Polymerase), die von Thermus aquaticus abstammt. Andere bekannte Beispiele sind DNA-Polymerasen, die von einem thermophilen Archaeon-Stamm abstammen, wie zum Beispiel von Pyrococcus furiosus (Pfu-Polymerase, WO92/09689, ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 328,969/1993) abstammende thermostabile DNA-Polymerase und die von Thermococcus litoralis (Tli-Polymerse), ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 7160/1994) abstammende thermostabile DNA-Polymerase.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben früher eine thermostabile DNA-Polymerase mit ausgezeichneter Thermostabilität und DNA-Verlängerungsrate gefunden, die von Pyrococcus sp. KODI abstammt (KOD-Polymerse, ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 298,879/1995). Die US-5 489 523 beschreibt eine rekombinante Pyrocococcus furiosus DNA-Polymerase, die frei von einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität ist und die in DNA-Zyklussequenzierungsreaktionen verwendbar ist. Die EP-0 745 675 beschreibt eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer DNA-Verlängerungsrate von mindestens 30 Basen/Sekunde und einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität, die von einem hyperthermophilen Archaeon-Stamm KODI abstammt.
Diese thermostabilen DNA-Polymerasen haben jedoch Nachteile, wie zum Beispiel die unzureichende Nukleinsäureamplifikation. Weitere Nachteile von Polymerasen, die von einem hyperthermophilen Archaeon-Stamm, wie zum Beispiel Pyrococcus sp. KODI abstammen, sind, dass sie eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist und es gibt eine Einschränkung der PCR-Bedingungen, die die Reaktionszeit, die Enzymmenge, Primerkonzentration usw. umfassen. Es gibt daher einen Bedarf für eine neuartige thermostabile DNA-Polymerase.
Als Ergebnis ihrer eifrigen Forschung waren die Erfinder erfolgreich bei der Erzeugung eines von Pyrococcus sp. KODI abstammenden modifizierten Enzyms, wobei das Enzym eine auf 5% oder weniger verringerte 3'-5'-Exonukleaseaktivität der ursprünglichen Polymerase vor der Modifikation aufwies, während es die DNA-Verlängerungsrate und Thermostabilität der ursprünglichen Polymerase beibehielt.
Die Erfinder haben weiterhin festgestellt, dass die Leistungsfähigkeit der Amplifikation bei der Verwendung einer Polymerase vor der Modifikation durch die Verwendung ihrer modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase verbessert wird, wobei sie eine DNA-Verlängerungsrate von mindestens 30 Basen/Sekunde aufweist und in der Lage ist, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C, weil die Messung des pH-Werts bei 95°C schwierig war) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten, wobei das modifizierte Enzym eine auf 5% oder weniger verringerte 3'-5'-Exonukleaseaktivität der Polymerase vor der Modifikation aufweist und die Erfinder der vorliegenden Erfindung dadurch die vorliegende Erfindung vervollständigten.

Das heißt die vorliegende Erfindung besteht in einer modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktütät auf und weist 5% oder weniger der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf;
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde; und
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten;
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa; und
Aminosäuresequenz	wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.

Weiterhin besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend das Umsetzen von DNA als eine Matrize, Primern, dNTP und der thermostabilen DNA-Polymerase nach den Ansprüchen 1 bis 10, um dadurch die Primer zur Herstellung eines DNA-Primer-Verlängerungsprodukts zu verlängern.
Weiterhin besteht die vorliegende Erfindung aus einem Reagenz zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend 2 Arten von Primern, wobei einer davon komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist, dNTP, die thermostabile DNA-Polmerase nach den Ansprüchen 1 bis 10 und eine Pufferlösung.
Für eines der Verfahren zur Amplifikation einer langkettigen Nukleinsäure gibt es einen Bericht über PCR, wobei sowohl von Taq-Polymerase (KlenTaq-278), die frei von 3'-5'-Exonukleaseaktivität ist, als auch von Pfu-Polymerase (oder Tli-Polymerase) mit 3'-5'-Exonukleaseaktivität, oder von einer DNA-Polymerasezusammensetzung Gebrauch gemacht wird, die eine Mischung ihrer mutierten Enzyme enthält (Barns, W. M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216–2220).
Es gibt einen weiteren Bericht über PCR, wobei von einer Polymerasezusammensetzung Gebrauch gemacht wird, die eine Mischung aus Tth-Polymerase, die frei von 3'-5'-Exonukleaseaktivität ist, Pfu-Polymerase (oder Tli-Polymerase) mit 3'-5'-Exonukleaseaktivität und thermostabiler DNA-Polymerase enthält, die von Thermotoga maritima abstammt (nichtgeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 38198/1996).
Durch eine solche Zusammensetzung kann eine höhere Leistungsfähigkeit erreicht werden, als durch eine DNA-Polymeraseart, jedoch ist sie noch nicht ausreichend, weil 2 Arten von DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften in der Thermostabilität und in DNA-Verlängerungsraten verwendet werden. Es gibt daher einen Bedarf an einem Verfahren das sich darüberhinaus in der Leistungsfähigkeit der Amplifikation auszeichnet.
Unter diesen Umständen stellten die Erfinder als ein Ergebnis ihrer eifrigen Forschung fest, dass eine in der Leistungsfähigkeit der Amplifikation ausgezeichnete PCR durch Verwendung einer DNA-Polymerasezusammensetzung zur Nukleinsäureamplifikation durchgeführt werden kann, die aus einer Kombination von einer ersten und zweiten DNA-Polymerase besteht, die in Bezug auf Thermostabilität und DNA-Verlängerungsrate beinahe zueinander identisch sind, wobei die Aktivität der zweiten DNA-Polymerase in einem niedrigeren Gehalt vorhanden ist, als diejenige der ersten DNA-Polymerase, inbesondere durch Verwendung einer DNA-Polymerasezusammensetzung, umfassend DNA-Polymerasen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einer modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase (erste Polymerase) mit 0 bis 5% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des natürlich vorkommenden Enzyms vor der Modifikation und einer modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase (zweite Polymerase) mit 100 bis 6% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität einer natürlich vorkommenden DNA-Polymerase oder deren ursprünglich natürlich vorkommendes Enzym vor der Modifikation.
Das heißt, die vorliegende Erfindung ist eine DNA-Polymerasezusammensetzung zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit 0 bis 5% der 3'-5'-Exonucleaseaktivität des ursprünglichen Enzyms vor der Modifikation (erste Polymerase) und das ursprüngliche Enzym oder eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit 100 bis 6% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität von ihrem ursprünglichen thermostabilen Enzym vor der Modifikation (zweite Polymerase) wobei die erste und die zweite DNA-Polymerase eine DNA-Verlängerungsrate von mindestens 30 Basen/Sekunde aufweisen und befähigt sind (10% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C für 6 Stunden aufrechtzuerhalten.
Weiterhin besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend das Umsetzen von DNA als Template, Primer, dNTP und der DNA-Polymerasezusammensetzung, um dadurch die Primer zur Herstellung eines DNA-Primer-Verlängerungsprodukts zu verlängern.
Weiterhin besteht die vorliegende Erfindung in einem Reagenz zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend 2 Arten von Primern, wobei einer davon komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist, dNTP, die thermostabile DNA-Polymerasezusammensetzung, zweiwertige Ionen, einwertige Ionen und eine Pufferlösung.
1 zeigt die Polymeraseaktivität der modifizierten DNA-Polymerase und den DNA-Zersetzungsgrad.
2 zeigt die Thermostabilität der modifizierten DNA-Polymerase.
3 zeigt das Ergebnis der PCR durch Verwendung der modifizierten DNA-Polymerase (für Plasmid).
4 zeigt das Ergebnis der PCR durch Verwendung der modifizierten DNA-Polymerase (für das menschliche Genom).
5 zeigt das Ergebnis der PCR durch Verwendung der DNA-Polymerasezusammensetzung (für das menschliche Genom).
6 zeigt die Aminosäuresequenzen der exo-Bereiche der thermostabilen DNA-Polymerase.
7 zeigt die Polymeraseaktivität der modifizierten DNA-Polymerse und den DNA-Zersetzungsgrad.
8 zeigt die Polymeraseaktivität in Bezug auf die natürlich vorkommende KOD-Polymerase.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich die DNA-Polymeraseaktivität auf eine katalytische Aktivität zur Matrix-abhängigen Einführung von Desoxyribonukleosid-5'-monophosphat in Desoxyribonukleinsäure durch kovalente Bindung des α-Phosphats von Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat an die 3'-Hydroxylgruppe eines Oligonukleotids oder Polynukleotids, das an eine DNA-Matrize annealed wurde.
Bei einer hohen Enzymaktivität in einer Probe, soll die Aktivitätsmessung ausgeführt werden, nachdem die Probe mit einer konservierenden Pufferlösung verdünnt worden ist. In der vorliegenden Erfindung werden 25 μl der untenstehenden Lösung A, je 5 μl der untenstehenden Lösungen B und C und 10 μl sterilisiertes Wasser in ein Eppendorfröhrchen gegeben, dann gerührt und gemischt und 5 μl der vorstehenden Enzymlösung werden zugegeben und bei 75°C während 10 Minuten umgesetzt. Danach wird die Probe auf Eis abgekühlt und 50 μl der untenstehenden Lösung E und 100 μl der untenstehenden Lösung D werden zugegeben, dann gerührt und auf Eis während 10 Minuten abgekühlt. Die Lösung wird durch ein Glasfilter (Wattman GF/C Filter) filtriert und der Filter wird gründlich mit Lösung D und Ethanol gewaschen und die Radioaktivität des Filters wird in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Packard) zur Bestimmung des Nukleotideinbaus in die DNA-Matrize gezählt. In der vorliegenden Erfindung wird 1 Einheit der Enzymaktivität als die Menge des Enzyms definiert, die bewirkt, dass unter diesen Bedingungen 10 nmol Nukleotid in je 30 Minuten in das säureunlösliche Fragment eingebaut werden.
In der vorliegenden Erfindung; bezieht sich die 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf die Aktivität zur Deletion einer 3'-terminalen DNA-Region, um 5'-Mononukleotid an eine Matrize abzugeben.
Das Aktivitätsmeßverfahren ist folgendes: 50 μl Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25°C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 1 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 5 μg Tritium markierte E. coli-DNA) werden in ein 1,5 ml Eppendorfröhrchen pipettiert, danach wird DNA-Polymerase dazu gegeben. Nach dem Umsetzen der Mischung bei 75°C während 10 Minuten wird die Reaktion durch Abkühlen auf Eis beendet. Dann werden 50 μl 0,1% BSA als Träger und dann 100 μl einer 10% Trichloressigsäure-enthaltenden Lösung dazu gegeben und 2% Natriumpyrophosphat werden damit gemischt. Nach dem Stehenlassen der Mischung während 15 Minuten auf Eis, wird sie mit 12000 r. p. m. während 101 Minuten zur Abscheidung der Niederschläge zentrifugiert. 100 μl des Überstandes wird bezüglich Radioaktivität in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Packard) gezählt, wobei die Menge des an das säurelösliche Fragment abgegebenen Nukleotids bestimmt wird.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich die DNA-Verlängerungsrate auf der Anzahl der pro Einheitszeit verlängerten DNAs. Das Messverfahren ist folgendes: Eine Reaktionslösung mit DNA-Polmerase (20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 8 mM Magnesiumchlorid, 7,5 mM Dithiothreitol, 100 μg/ml BSA, 0,1 mM dNTP, 0,2 μCi [α^–32P]dCTP) wird bei 75°C mit einer Einzelstrangkette einer M13mp18-DNA umgesetzt, an die ein Primer annealed worden war. Die Reaktion wird durch Zugeben eines gleichen Volumens einer Reaktions-beendenden Lösung (50 mM Natriumhydroxid, 10 mM EDTA, 5% Ficoll, 0,05 Bromphenolblau) beendet. Die durch die Reaktion verlängerte DNA wird durch Elektrophorese auf Alkaliagarosegel fraktioniert und das Gel wird getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen. Als DNA-Größenmarkierung wird markiertes λ/HindIII verwendet. Die DNA-Verlängerungsrate wird auf der Basis der DNA-Größe bestimmt, die durch eine Bande dieser Markierung als Indikator bestimmt wird.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet Thermostabilität die Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (der pH-Wert wurde bei 25°C bestimmt) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 5% oder weniger der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des ursprünglichen Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa, und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und ist frei von einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa, und
Aminosäuresequenz	eine; wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.

Die thermostabile DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung vor der Modifikation ist ein Enzym, das von Pyrococcus sp. KOD, ein auf der Kodakara Insel, Kagoshima-Präfektur, Japan, isolierter hyperthermophiler Archaeon-Stamm. Die mikrobiellen Eigenschaften von KOD, das dieses Enzym produziert, werden in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 298,879/1995 beschrieben. Dieses Enzym wird durch die Kultivierung dieses Stamms hergestellt.

Dieses Enzym weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf:

Wirkung	es weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 120 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	es ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa und
Aminosäuresequenz	die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2.

Die thermostabile DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung weist eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz auf, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde. Ein Beispiel ist das Enzym bei dem in SEQ ID Nr: 2 Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin; Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparaginsäure an der 141-Position beziehungsweise Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure; oder Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde.
Zur Herstellung dieser modifizierten Enzyme gibt es ein Verfahren, bei dem ein für eine natürlich vorkommende KOD-Polymerase kodierendes Gen so mutiert wird, dass ein neuartiges Enzym mit einer geringeren 3'-5'-Exonukleaseaktivität, als bei der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase durch gentechnische Proteinherstellung erzeugt wird.
Obwohl das zu mutierende die KOD-Polymerase-kodierende Gen nicht sonderlich beschränkt ist, wurde das in SEQ ID Nr: 3 in der Sequenzauflistung definierte Gen, das von Pyrococcus sp. KOD abstammt, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet.
Ein DNA-Polymerasegen, das von dem KODI-Stamm abstammt, enthält 2 dazwischenliegende Sequenzen (1374 bis 2453 bp und 2708 bis 4316 bp) und daher kann eine modifizierte DNA-Polymerase, die eine verringerte 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist, zum Beispiel durch Herstellung eines mit einem PCR-Fusionsverfahren hergestellten gereiften Gens mit einer wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigten Nucleotidsequenz von einem wie in SEQ m Nr: 1 gezeigten Gen und durch Verwendung des somit hergestellten Gens erhalten werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges Enzym mit einer 3'-5'-Exonukleaseaktivität, die geringer ist als bei der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase, durch Mutieren eines Gens hergestellt, das für die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 1 kodiert.
Zur Mutation des natürlich vorkommenden KOD-Polymerasegens kann jedes der bekannten Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können Verfahren verwendet werden, die das Inkontaktbringen eines Arzneimittels als Mutagen mit dem natürlich vorkommenden KOD-Polymerasegen oder die Bestrahlung des Gens mit UV-Strahlen betreffen oder es können gentechnische Mittel zur Proteinherstellung verwendet werden, wie zum Beispiel die PCR-Technik oder die ortsspezifische Mutagenese. E. coli, dessen Gen häufig Muationen erfährt, weil dessen Reparatur für fehlende Übereinstimmung zerstört ist, kann ebenfalls für eine in vivo Mutation verwendet werden.
Das Chamäleon ortsgerichtete Mutagenese-Kit (Stratagene), das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwendet die folgenden Schritte: (1) Denaturieren eines Plasmids, das ein darin eingeschobenes Zielgen aufweist und dann Annealen eines Mutagenese-Primers und einer selektiven Markierung an das Plasmid, (2) DNA-Verlängerung durch DNA-Polymerase und dann Durchführen einer Ligationsreaktion unter Verwendung von Ligase, (3) Spalten des Plasmid mit einem Restriktionsenzym, dessen Restriktionsort in dem selektiven Primer nicht vorhanden ist, aber in dem als Matrize dienenden Plasmid vorhanden ist, wodurch DNA, die nicht mutiert worden ist, gespalten wird, (4) Transformieren von E. coli mit dem Restplasmid, (5) Herstellen des mutierten Plasmids aus der Transformante, anschließend wiederholtes Durchführen von (3) und (4), so dass ein Plasmid erhalten wird, das wird gewünscht mutierte.
Das modifizierte Polymerasegen, das wie vorstehend beschrieben ist erhalten wurde, wird in zum Beispiel E. coli transformiert und dann auf ein Agarmedium, das ein Arzneimittel wie zum Beispiel Ampicillin enthält, zur Bildung einer Kolonie ausgestrichen. Die Kolonie wird auf ein Nährmedium, wie zum Beispiel LB Medium oder 2 × YT Medium, geimpft und dann bei 37°C während 12 bis 20 Stunden kultiviert und so zerstört, dass eine Rohenzymlösung daraus extrahiert wird.
Zur Zerstörung des Mikroorganismus kann jedes der bekannten Mittel mit physikalischer Zerstörung, Ultraschallbehandlung oder Glasperlen oder mit lytischem Enzym, wie zum Beispiel Lysozym verwendet werden. Das Rohenzym wird thermisch behandelt, zum Beispiel bei 80°C während 30 Minuten, um die aus dem Wirt stammenden Polymerasen zu inaktivieren. Dann wird seine DNA-Polymeraseaktivität bestimmt und seine 3'-5'-Exonukleaseaktivität bestimmt und das Aktivitätsverhältnis daraus bestimmt. Dann wird dieses Verhältnis mit demjenigen der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase verglichen, um das Enzym bezüglich einer verringerten 3'-5'-Exonukleaseaktivität zu screenen.
Von dem auf diese Art ausgewählten Stamm kann die DNA-Polymerase unter Verwendung bekannter Mittel gereinigt werden, wie zum Beispiel folgendermaßen:
Der in einem Nährmedium kultivierte Mikroorganismus wird zurückgewonnen und enzymatisch oder durch physikalische Mittel zerstört, so dass ein Rohenzym extrahiert wird. Das Rohenzymextrakt wird einer Wärmebehandlung, zum Beispiel bei 80°C während 30 Minuten unterzogen und danach wird die KOD-Polymerasefraktion durch Fällung mit Ammoniumsulfat zurückgewinnen. Diese Rohenzymfraktion kann durch zum Beispiel Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) entsalzt werden.
Nach diesem Verfahren kann ein gereinigtes Enzympräparat durch zum Beispiel Q-Sepharose-, Heparin-Sepharose- usw. Chromatographie erhalten werden. In diesem Verfahren kann das Enzympräparat auf einen solchen Reinheitsgrad gereinigt werden, dass es beinahe eine einzige Bande in SDS-PAGE zeigt.
Ein DNA-Primerverlängerunsprodukt kann unter Verwendung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem Primer und dNTP mit DNA als Matrize zur Verlängerung der Primer umgesetzt werden. Die Primer sind 2 Arten von Oligonucleotiden, wobei eines davon vorzugsweise ein zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers komplementärer Primer ist. Erhitzen und Abkühlen werden wiederholt durchgeführt.
Magnesiumionen und Ammoniumionen und/oder Kaliumionen sind für die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung vorzugsweise gleichzeitig vorhanden, um deren Aktivität aufrechtzuerhalten. Die PCR-Reaktionslösung kann weiterhin eine Pufferlösung und diese Ionen zusammen mit BSA und einem nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel, wie zum Beispiel Triton X-100 in der Pufferlösung enthalten.
Da die 3'-5'-Exonukleaseaktivität der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu dem Enzym vor der Modifikation verringert ist, kann die PCR mit höherer Leistungsfähigkeit bezüglich der Amplifikation durch die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase ausgeführt werden, als durch das Enzym vor der Modifikation.
Nachfolgend wird hier die Zusammensetzung von mindestens 2 Arten thermostabiler DNA-Polymerasen beschrieben, die sich in ihrer 3'-5'-Exonukleaseaktivität unterscheiden.
Eine erste DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym mit einer auf 0 bis 5% vorzugsweise auf 1% oder weniger verringerten 3'-5'-Exonukleaseaktivität der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation.
Die erste DNA-Polymerase umfaßt ein Enzym mit einer wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 142-, 143-, 210- und 311 Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde. Ein Beispiel ist ein Enzym mit einer wie in SEQ ID Nr: 2, gezeigten Aminosäuresequenz, wobei Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin; Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparaginsäure an der 141-Position beziehungsweise Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure oder Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde. Weiterhin umfaßt sie das Enzym, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Arginin ersetzt wurde

Die erste DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 0 bis 5% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa, und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 142-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.

Die erste DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 0 bis 5% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, Restaktivität von 60% oder mehr bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa, und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin, Isoleucin an der 142-Position gegen Arginin; Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparaginsäure an der 141-Position beziehungsweise Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin; Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure oder Tryrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde.

Die zweite DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt eine modifizierte thermostabile Polymerase, die 100 bis 6% vorzugsweise 90 bis 30% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität einer thermostabilen DNA-Polymerase mit 3'-5-Exonukleaseaktivität oder der ursprünglichen nicht modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase mit 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist. Die zweite DNA-Polymerase umfaßt zum Beispiel das Enzym mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 oder mit einer wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuren an den 140-, 142- oder 144-Positionen gegen andere Aminosäuren ersetzt wurden. Ein Beispiel ist das Enzym mit einer wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin oder Lysin, oder Threonin an der 144-Position gegen Valin ersetzt wurde.

Die zweite DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa, und
Aminosäuresequenz	die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2.

Die zweite DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin eine modifizierte thermostabile Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 100 bis 6% vorzugsweise 90 bis 30% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei mindestens eine der Aminosäuren X₁, X₂ und X₃ in einem X₁DX₂EX₃-Motif, das in EXO 1 vorhanden ist, gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.

In der Aminosäuresequenz der DNA-Polymerase mit 3'-5'Exonukleaseaktivität sind hoch konservierende Aminosäureregionen für diese Exonukleaseaktivität bekannt (EXO I, EXO II und EXo III, 6). Die EXO I Region enthält ein X₁DX₂EX₃-Motif und die Aminosäuren D (Asparaginsäure) und E (Glutaminsäure) sind als wesentlich für die Exonukleaseaktivität bekannt.

Die zweite DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 100 bis 6% vorzugsweise 90 bis 30% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuren an den 140-, 142- oder 144-Positionen gegen andere Aminosäuren ersetzt wurden.

Wirkung	sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 100 bis 6% vorzugsweise 90 bis 30% der 3'-5'-Exonukleaseaktivität des Enzyms vor der Modifikation auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 30 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert vor 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa und
Aminosäuresequenz	eine wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigte Aminosäuresequenz, wobei Oleucin an der 142-Position gegen Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin oder Lysin, oder Threonin an der 144-Position gegen Valin ersetzt wurde.

Die DNA-Verlängerungsrate der ersten und zweiten DNA-Polymerasen beträgt mindestens 30 Basen/Sekunde, vorzugsweise 100 bis 120 Basen/Sekunde und sie sind thermostabile DNA-Polymerasen, die befähigt sind 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten.
Die ersten und zweiten DNA-Polymerasen sind vorzugsweise KOD-Polymerasen oder ihre Mutanten.
In der vorliegenden Erfindung ist die Aktivität der zweiten DNA-Polymerase geringer als diejenige der ersten DNA-Polymerase und die zweite Polymerase ist vorzugsweise 0,02 bis 0,1 Einheiten je 2,5 Einheiten der ersten DNA-Polymerase.
Zur Herstellung dieser modifizierten Enzyme gibt es ein Verfahren, wobei ein Gen für zum Beispiel natürlich vorkommende KOD-Polymerase so mutiert wird, dass die neuartigen Enzyme, die eine im Vergleich zu der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase verringerte 3'-5'-Exonukleaseaktvität aufweisen, durch gentechnische Mittel zur Proteinherstellung erzeugt werden.
Das zu mutierende KOD-Polymerase-kodierende Gen ist nicht sonderlich eingeschränkt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde das in SEQ ID Nr: 3 in der Sequenzauflistung gezeigte Gen verwendet, das von Pyrococcus sp. KOD abstammte.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein für die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 1 kodierendes Gen mutiert, um das neuartige Enzym herzustellen, das eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist, die im Vergleich zu derjenigen der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase verringert ist.
Die thermostabile DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ist vor der Modifikation ein Enzym, das von Pyrococcus sp. KOD als 1 Art des hyperthermophilen Archaeon-Stamms abstammt, der auf der Kodakara Insel, Kagoshima-Präfektur, Japan isoliert wurde. Die mikrobiellen Eigenschaften des KOD-herstellenden Enzyms sind in der nichtgeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 298,879/1995 beschrieben. Das Enzym wird durch Kultivierung dieses Stamms hergestellt.

Dieses Enzym weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf:

Wirkung	es weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität auf,
DNA-Verlängerungsrate	mindestens 120 Basen/Sekunde,
Thermostabilität	es ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei einem pH-Wert von 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden aufrechtzuerhalten,
Optimaltemperatur	ungefähr 75°C,
Molekulargewicht	88 bis 90 kDa und
Aminosäuresequenz	die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 2

Das erfindungsgemäße Nukleinsäureamplifikationsverfahren umfaßt das Umsetzen von DNA als Matrize, Primern und 4 Arten von Desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP), um durch die Verwendung der DNA-Polymerasezusammensetzung die Primer zur Herstellung eines DNA-Primer-Verlängerungsprodukts zu verlängern.
In der PCR-Technik, als eine der erfindungsgemäßen Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, wird bei einer besonders langen und doppelsträngigen Zielnukleinsäure in einer Probe, die Zielnukleinsäure durch Erhitzen denaturiert, damit sie in zwei Einzelstrangketten getrennt wird. Falls die Trennung der langkettigen Nukleinsäure in Einzelstrangketten unzulänglich ist, wird eine nachfolgende Annealing- und Verlängerungsreaktion der Primer verhindert. Dann werden die Einzelstrangketten als Matrize, zu der Matrize komllementäre Primer, die vorzugsweise Primer sind, wobei einer davon zu einem anderen DNA-Verlängerungsprodukt komplementär ist, und dNTP in einer PCR-Reaktionslösung unter Verwendung der DNA-Polymerasezusammensetzung der vorliegenden Erfindung umgesetzt.
Diese Reaktion wird unter Verwendung eines 2-Stufen-Temperaturzyklus durchgeführt, das heißt eine hohe Temperaturstufe zur Denaturierung der zu amplifizierenden Nukleinsäure und eine niedrige Temperaturstufe für das Annealing der Primer an die denaturierte Nukleinsäure zur Initiierung der Primerverlängerung, und dieser Zyklus wird 25 bis 40 mal wiederholt. Normalerweise besteht 1 Zyklus aus einer Reaktion bei 94°C während 0,5 bis 1 Minute und dann bei 68°C während 0,5 bis 10 Minuten. Die 2 Primer werden an entgegengesetzte Stränge der Matrizen-Nukleinsäuresequenz annealed, und ein an jedem Primer anfangendes Verlängerungsprodukt ist eine zu der Matrizennukleinsäure komplementäre Kopie und das Produkt ist so ausgerichtet, dass es an einen anderen Primer bei Trennung von der resultierenden Doppelstrangkette hybridisieren kann.
Die Reaktion wird vorzugsweise während einer ausreichenden Zeitdauer durchgeführt, bis die die Verlängerungsreaktion die Kettenverlängerung vervollständigt. Zur Amplifikation von 20 kb oder mehr Nukleinsäure wird eine Annealing- und Verlängerungszeit von mindestens 10 bis 20 Minuten bevorzugt.
Eine langkettige Nukleinsäure wird vor dem Abbau während der Amplifikation vorzugsweise durch Verwendung von zum Beispiel Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO) usw. geschützt.
Das Vorhandensein eines falsch eingebauten Nukleotids wird die Kettenverlängerung früher beenden und die Anzahl an Matrizenketten für nachfolgende Amplifikation wird geringer sein, woraus eine Verminderung der Leistungsfähigkeit der Amplifikation einer langkettigen Nukleinsäure folgt. In der vorliegenden Erfindung wird das während der Primerverlängerungsproduktsynthese falsch eingebaute Nukleotid entfernt werden, weil die 3'-5'-Exonukleaseaktivität neben der DNA-Polymeraseaktivität zu einem geringen Grad in der Reaktionslösung vorhanden ist und die dominante Polymeraseaktivität eine vollständige Kettenverlängerung ermöglicht.
Der pH-Wert und die Zusammensetzung, Salze (zweiwertige und einwertige Ionen) und das Design der Primer sind für die Leistungsfähigkeit der langkettigen Nukleinsäureamplifikation wichtig.
Da das PCR-Reagenz normalerweise bei Raumtemperatur vor dem Denaturierungsschritt hergestellt wird, kann eine Bindung der Primer an andere Primer oder an einen homologen Teil einer Nukleinsäuresequenz verursacht werden. Falls ein Verlängerungsprodukt ebenfalls durch unspezifisches Binden von Primern gebildet wird, wird die Leistungsfähigkeit der Amplifikation des gewünschten langkettigen Produkts verringert. Zur Verhinderung des unspezifischen Bindens wird vorzugsweise das „Heiß-Startverfahren", dass heißt die Zugabe des Enzyms nachdem die Reaktionslösung eine hohe Temperatur erreicht hat, verwendet.
Vorzugsweise wird das gleichzeitige Vorhandensein zweiwertiger Ionen, zum Beispiel Magnesiumionen, und einwertiger Ionen, zum Beispiel Ammonium- und/oder Kaliumionen, gestattet, um die DNA-Polymeraseaktivität der vorliegenden Erfindung aufrechtzuerhalten. Weiterhin können eine Pufferlösung, solche Ionen, BSA, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel (zum Beispiel Triton X-100) und Pufferlösung in der Reaktionslösung zur Nukleinsäureamplifikation vorhanden sein.
Das erfindungsgemäße Reagenz zur Nukleinsäureamplifikation enthält 2 Primer, wobei einer davon komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist, dNTP, die DNA-Polymerasezusammensetzung, Magnesiumionen, Ammoniumionen und/oder Kaliumionen, BSA, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und eine Pufferlösung.
In der vorliegenden Erfindung ist die Aktivität der zweiten DNA-Polymerase vorzugsweise geringer als diejenige der ersten DNA-Polymerase und es wird bevorzugt, dass die zweite DNA-Polymerase in 0,02 bis 0,1 Einheiten je 2,5 Einheiten der ersten DNA-Polymerase vorhanden ist.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung kann ein Lösungshilfsmittel, wie zum Beispiel Glycerin, DMSO, Polyethylenglycol usw. enthalten.
Die verwendete Pufferlösung umfaßt eine Tris-Puffer, Tris(hydroxymethyl)methylglycin (Tricin-Puffer), N-bis(hydroxyethyl)glycin (Bicin-Puffer) usw. Die optimale Pufferlösung und der pH-Wert hängen von der verwendeten DNA-Polymerase ab. Falls KOD-Polymerase oder deren Mutante in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird eine Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,2 (bei 25°C) bei einer Konzentration von 10 bis 50 mM, vorzugsweise 20 bis 120 mM verwendet. Als zweiwertige Kationen werden vorzugsweise Magnesiumionen, und Magnesiumchlorid usw. verwendet. Ihre Konzentration beträgt vorzugsweise 1 bis 2 mM. Als einwertige Kationen werden vorzugsweise Ammoniumionen oder Kaliumionen, und Ammoniumsulfat, Kaliumglutamat, Kaliumacetat usw. verwendet. Ihre Konzentration beträgt vorzugsweise 2 bis 50 mM. Die verwendeten Primer sind 2 Arten von Oligonukleotiden, wobei einer davon ein zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers komplementärer Primer ist. Ihre Konzentration beträgt vorzugsweise 0,2 bis 1 μM.
Die vorliegende Erfindung wird hier nachstehend unter Bezugnahme auf die Beispiele genau beschrieben.
Referenzbeispiel 1.
Klonierung des vom hyperthermophilen Archaeon-Stamm KOD abstammenden DNA-Polymerasegens
Der auf der Kodakara Insel, Kagoshima-Präfektur, Japan isolierte hyperthermophile Archaeon-Stamm wurde bei 95°C kultiviert und dann zurückgewonnen. Die genomische DNA des hyperthermophilen Archaeon-Stamms KOD wurde auf gewöhnliche Art aus dem Mikroorganismus präpariert. Zwei Primer wurde auf der Basis der konservierenden Regionen in der Aminosäuresequenz der DNA-Polymerase (Pfu-Polymerase), die von Pyrococcus furiosus abstammt, synthetisiert. PCR wurde unter Verwendung der 2 Primer und der genomischen DNA als Matrize durchgeführt.
Das somit durch PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde sequenziert und von der somit bestimmten Nucleotidsequenz wurde dessen Aminosäuresequenz abgeleitet. Dann wurde die genomische DNA von dem KOD1-Stamm mit einem Restriktionsenzym behandelt und der Verdau wurde einer Souther-Hybridisierung mit dem vorstehenden Amplifikations-DNA-Fragment als Sonde zur Bestimmung der Größe eines für die DNA-Polymerase kodierenden Fragments (ungefähr 4 bis 7 kbp) unterzogen. Ferner wurde das DNA-Fragment dieser Größe von dem entsprechenden Agarosegel zurückgewonnen und in das Plasmid pBS (Stratagene) eingeschoben. Die so erhaltende Mischung wurde in E. coli JM109 zur Herstellung einer Bibliothek transformiert. Mit derselben Sonde wie bei der Southern-Hybridisierung wurde eine Koloniehybridiseriung durchgeführt, so dass ein Klonstamm (E. coli JM109/pSBKOD1) erhalten wurde, von dem angenommen wurde, dass er das von dem KOD1-Stamm abstammende DNA-Polymerasegen enthielt.
Das Plasmid pSBKOD1 wurde von dem Klonstamm E. coli JM109/pSBKOD1) zurückgewonnen und auf herkömmliche Weise sequenziert. Seine Aminosäuresequenz wurde von der somit bestimmten Nucleotidsequenz abgeleitet. Das von dem KOD1-Stamm stammende DNA-Polymerasegen bestand aus 5010 Basen und kodierte für 1670 Aminosäuren (SEQ ID Nr: 1).
Zur Herstellung eines vollständigen Polymerasegens wurden 2 dazwischenliegende Sequenzen (1374 bis 2453 bp und 2708 bis 4316 bp) durch ein PCR-Fusionsverfahren entfernt. In dem PCR-Fusionsverfahren wurden drei Primerpaare verwendet und jedes Paar wurde in einer PCR verwendet, wobei das von dem klonierten Stanzen zurückgewonnene Plasmid als Matrize verwendet wurde, so dass 3 Fragmente amplifiziert wurden, die frei von den dazwischenliegenden Sequenzen waren. Die in der PCR verwendeten Primer wurden so ausgelegt, dass sie dieselbe Frequenz wie eine an den Zielort bindende Sequenz aufweisen, und dass sie verschiedene Reatriktionsenzymorte an den terminalen Orten aufwiesen, das heißt, dass sie eine EcoRV-Stelle am N-Terminal und eine BamHI-Stelle am C-Terminal aufwiesen. Dann wurde ein Fragment, das sich in der Mitte des PCR-Amplifikationsfragments befand, mit einem an der N-terminalen Seite befindlichen Fragment gemischt und die PCR wurde unter Verwendung der entsprechenden Fragmente als Primer durchgeführt. Weiterhin wurde ein Fragment, das sich in der Mitte des PCR-Amplifikationsfragments befand, mit einem an der C-terminalen Seite befindlichen Fragment gemischt und die PCR wurde unter Verwendung der entsprechenden Fragmente als Primer durchgeführt. PCR wurde wiederum unter Verwendung der so erhaltenen 2 Fragmentarten durchgeführt, woraus sich ein vollständiges Genfragment ergab, das frei von den dazwischenliegenden Sequenzen war, eine EcoRV-Stelle am N-Terminal und eine BamHI-Stelle am C-Terminal aufwies und für die vom KOD1-Stamm abstammende DNA-Polymerase kodierte. Weiterhin wurde dieses Gen in den Expressionsvektor PET-8c subkloniert, der befähigt ist die Expression des Gens unter dem T7-Promotor zu induzieren. Für diese Subklonierung wurden die NcoI/BamHI-Stellen auf PET-8c und die vorstehend erzeugten Restriktionsenzymstellen verwendet. Auf diese Weise wurde ein rekombinanter Expressionsvektor (pET-pol) erhalten. E. coli BL21 (DE3)/pET-pol wurde als FERM BP-5513 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
Beispiel 1.
Subklonierung des KOD-Polymerasegens
Zur Modifikation der thermostabilen DNA-Polymerase wurde das KOD-Polymerasegen aus dem Plasmid pET-pol entfert und in das Plasmid pBluescript folgendermaßen subkloniert:
Das KOD-Polymerasegen mit ungefähr 2,3 kb Länge wurde durch Verdau des Plasmids pET-pol mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI (Toyobo Co., Lt.) entfernt. Dann wurde für die Ligation dieses DNA-Fragments in das Plasmid pBluescript SK(–), das vorher mit XbaI und BamHI verdaut worden war, ein Ligationskit (hohe Ligation, ein Produkt von Toyobo Co., Ltd.) verwendet. Dann wurde das resultierende Plasmid in die handelsüblichen kompetenten Zellen (hoch kompetente JM109, beziehbar von Toyoba Co., Ltd.) transformiert.
Die Transformante wurde bei 35°C während 16 Stunden in einem LB Agar-Medium kultiviert, das 100 μg/ml Ampicillin (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 1,5% Agar, hergestellt von Gibco) enthielt, und ein Plasmid wurde aus den resultierenden Kolonien hergestellt. Aus einem Teil der Nucleotidsequenz wurde bestätigt, dass dieses Plasmid das KOD-Polymerasegen trägt und es wurde als Plasmid pKOD1 bezeichnet.
Beispiel 2.
Herstellung eines modifizierten Gens (DA) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Das in Beispiel 1 erhaltene Plasmid pKOD1 wurde zur Herstellung eines Plasmids (pKODDA) verwendet, das ein Gen für eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase der KOD-Polymerase von SEQ ID Nr: 2 trägt, wobei Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin ersetzt wurde.
Für diese Herstellung wurde ein Chamäleon ortsgerichtetes Mutagenesekit (Stratagene) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 7 gezeigter Primer. Die Mutante wurde durch Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz bestätigt. E. coli JM109 wurde mit dem resultierenden Plasmid transformiert, woraus sich JM109 (pKODDA) ergab.
6 l sterilisiertes TB Medium (beschrieben in p.A. 2 in Molecular Cloning), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde in ein 101 Fermentorgefäß gegeben. In dieses Medium wurde E. coli JM109 (pKODDA) eingeimpft, die bei 30°C während 16 Stunden in 50 ml LB Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, hergestellt von Gibco) kultiviert worden waren, das 200 μg/ml Ampicillin in einem 500 ml Kolben enthielt, und der Mikroorganismus wurde durch Schüttelkultur bei 35°C während 12 Stunden unter Belüftung vermehrt. Der Mikroorganismus wurde durch Zentrifugierung von der Kultur zurückgewonnen, dann in 400 ml Puffer (10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 80 mM KCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung zerstört, woraus sich ein Zelllysat ergab.
Das Zelllysat wurde bei 85°C während 30 Minuten erhitzt und zur Entfernung unlöslicher Feststoffe zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Polyethylenimin zur Entfernung von Nukleinsäuren behandelt, dann mit Ammoniumsulfat fraktioniert und einer Chromatographie auf Heparin-Sepharose unterzogen. Schließlich wurde die Pufferlösung gegen eine Konservierungspufferlösung (50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 50 mM Kaliumchlorid, 1 mM Dithiothreitol, 0,1% Tween 20, 0,1% Nonidet^TM P40, 50% Glycerin) ersetzt, so dass die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (DA) erhalten wurde.
In der vorstehend beschriebenen Reinigung wurde die Messung der DNA-Polymeraseaktivität auf folgende Weise durchgeführt. Bei hoher Enzymaktivität wurde die Probe nach Verdünnung mit der Konservierungspufferlösung gemessen.
(Reagenz)
25 μl Lösung A, je 5 μl der Lösungen B und C und 10 μl sterilisiertes Wasser werden in ein Eppendorfröhrchen gegeben und unter Rühren gemischt. Dann werden 5 μl der Enzymlösung zu der Mischung gegeben und bei 75°C während 10 Minuten umgesetzt. Danach wird sie auf Eis während 10 Minuten abgekühlt und anschließend werden 50 μl Lösung E und 100 μl Lösung D dazu gegeben. Die Mischung wurde gerührt und auf Eis während 10 Minuten abgekühlt. Diese Lösung wird. durch ein Glasfilter (Wattman GF/C Filter) filtriert und danach wird der Filter gründlich mit Lösung D und Ethanol gewaschen und die Radioaktivität des Filters wird in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Packard) zur Bestimmung des Nukleotideinbaus in die DNA-Matrize gezählt.
Es wird angenommen, dass 1 Einheit des Enzyms die Menge des Enzyms ist, die bewirkt, dass unter diesen Bedingungen 10 nmol Nucleotid in je 30 Minuten in das säureunlösliche Fragment eingebaut werden.
Beispiel 3.
Herstellung eines modifizierten Gens (EA) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein Plasmid (pKODEA), das ein Gen für eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase der KOD-Polymerase von SEQ ID Nr: 2 trägt, wobei Glutamin an der 143-Position gegen Alanin ersetzt worden war, wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 2 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 5 gezeigt ist. Der verwendete Mutageneseprimer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 8 gezeigt ist. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (EA) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 2 erhalten.
Beispiel 4.
Herstellung eines modifizierten Gens (DEA) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein Plasmid (pKODEA), das ein Gen für eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase der KOD-Polymerase von SEQ ID Nr: 2 trägt, wobei Asparaginsäure an der 141-Position beziehungsweise Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin ersetzt worden waren, wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 2 hergestellt. Der verwendete selektive Primer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 4 gezeigt ist. Der verwendete Mutageneseprimer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 6 gezeigt ist. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (DEA) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 2 erhalten.
Beispiel 5.
Herstellung eines modifizierten Gens (ND) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein Plasmid (pKODND), das ein Gen für eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase der KOD-Polymerase von SEQ ID Nr: 2 trägt, wobei Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure ersetzt worden war, wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 2 hergestellt. Der verwendete selektive Primer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 4 gezeigt ist. Der verwendete Mutageneseprimer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 9 gezeigt ist. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (ND) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 2 erhalten.
Beispiel 6.
Herstellung eines modifizierten Gens (YF) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein Plasmid (pKODYF), das ein Gen für eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase der KOD-Polymerase von SEQ ID Nr: 2 trägt, wobei Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt worden war, wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 2 hergestellt. Der verwendete selektive Primer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 4 gezeigt ist. Der verwendete Mutageneseprimer war ein Primer, wie er in SEQ ID Nr: 10 gezeigt ist. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (YF) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 2 erhalten.
Beispiel 7.
Bestätigung der Exonukleaseaktivität modifizierter thermostabiler DNA-Polymerase
Die Exonukleaseaktivitäten der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen (DA, EA, DEA, ND und YF), die in der Beispielen 2 bis 6 erhalten wurden, wurden auf die folgende Art bestimmt. Als Kontrolle wurde die natürlich vorkommende KOD-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) verwendet. 50 μl einer Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25 °C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 1 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 5 μg Tritium-markierte E. Coli DNA) wurde in ein 1,5 ml Eppendorfröhrchen gegeben und die DNA-Polymerase wurde in Mengen von 25, 50 beziehungsweise 100 Einheiten zugegeben. Die natürlich vorkommende KOD-Polymerase wurde in Mengen von 0,25, 0,5 beziehungsweise 1 Einheiten verwendet. Nachdem die Mischung bei 75°C während 10 Minuten umgesetzt worden war, wurde die Reaktion durch Abkühlen auf Eis beendet. Dann wurden der Mischung 50 μl 0,1% BSA als Träger zugegeben und dann wurde sie mit einer Lösung aus 10% Trichloressigsäure und 2% Natriumpyrrophosphat gemischt. Nachdem die Mischung 15 Minuten auf Eis gelassen wurde, wurde sie mit 12000 r. p. m. während 10 Minuten zur Trennung der vorhandenen Niederschläge zentrifugiert. 100 μl des Überstandes wurde bezüglich der Radioaktivität in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard) gemessen, wobei die in das säurelösliche Fragment abgegebene Nukleotidmenge bestimmt wurde.
1 zeigt die Polymeraseaktivität und die DNA-Abbaugeschwindigkeit. Bei diesem Ergebnis konnte die Exonuklceaseaktivität der 3 modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen (DEA, DA und EA) nicht nachgewiesen werden. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (ND) wies ungefähr 0,1%, und die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (YF) wies ungefähr 0,01% der Aktivität der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase auf.
Beispiel 8.
Bestätigung der Thermostabilität
Die Thermostabilität der in den Beispielen 2 bis 6 erhaltenen modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen (DA, EA, DEA, ND und YF) wurde auf die folgende Art bestimmt. Von jeder gereinigten modifizierten DNA-Polymerase wurden je 5 Einheiten mit 100 μl Pufferlösung (20 mM Tris-HCl pH-Wert 8,8 bei 25°C, 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 2 mM Magnesiumsulfat, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 5 mM 2-Mercaptomethanol) gemischt und dann bei 95°C vorinkubiert. Mit der Zeit wurde von dieser Mischung eine Probe gewonnen und mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde deren Polymeraseaktivität bestimmt.
Zum Vergleich wurden Taq-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) und die natürlich vorkommende KOD-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) ebenfalls demselben Verfahren unterworfen. Wie in 2 gezeigt wird, wies jede der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen, ähnlich zu der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase, eine Restaktivität von 60% oder mehr auf nach Behandlung bei 95°C während 6 Stunden. Andererseits wies Taq-Polymerase eine Restaktivität von 15% oder weniger auf.
Beispiel 9.
Messung der DNA-Verlängerungsrate
Die in den Beispielen 2 bis 6 erhaltenen modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen (DA, EA, DEA, ND und YF) wurden bezüglich ihrer DNA-Verlängerungsrate auf die folgende Art untersucht. 0,2 μg Primer (SEQ ID Nr: 15) wurden an eine Einzelstrangkette der M13mp18 DNA annealed und dann wurden je eine Einheit von jeder gereinigten modifizierten DNA-Polymerase mit der Einzelstrangkette bei 75°C während 20, 40 beziehungsweise 60 Sekunden in 10 μl Reaktionslösung (20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 8 mM Magnesiumchlorid, 7,5 mM Dithiothreitol, 100 μg/ml BSA, 0,1 mM dNTP, 0,2 μCi [α^– ³²P]dCTP) umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens einer Reaktions-beendenden Lösung (50 mM Natriumhydroxid, 10 mM EDTA, 5% Ficoll, 0,05 Bromphenolblau) beendet. Zum Vergleich wurden Taq-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) und natürlich vorkommende KOD-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) ebenfalls demselben Verfahren unterzogen.
Die durch die Reaktion verlängerte DNA wurde durch Elektrophorese auf Alkaliagarosegel fraktioniert und das Gel wurde getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen. Als DNA-Größenmarkierung wird markiertes λ/HindIII verwendet. Die DNA-Verlängerungsrate wurde unter Verwendung der Größe der verlängerten DNA bestimmt, wobei eine Bande dieser Markierung als Indikator verwendet wurde. Das Ergebnis wie darauf hin, dass ähnlich zu der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase, jede der modifizierten Polymerasen eine Verlängerungsrate von ungefähr 120 Basen/Sekunde aufwies, während Taq-Polymerase eine Verlängerungsrate von ungefähr 60 Basen/Sekunde aufwies.
Beispiel 10.
Herstellung des Mutantengens (IN) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Das in Beispiel 1 erhaltene Plasmid pKOD1 wurde zur Herstellung eines Flasmids (pKODIN) verwendet, das ein Gen für die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase trägt, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Asparagin ersetzt worden war.
Dieses Plasmid wurde unter Verwendung eines Chamäleon ortsgerichteten Mutagenesekits (Stratagene) entsprechend den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 17 gezeigter Primer. Die Mutante wurde durch Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz bestätigt. E. coli JM109 wurde mit dem Plasmid transformiert, woraus sich JM109 (pKODIN) ergab.
Beispiel 11.
Herstellung des Mutantengens (IE) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODIE) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX ₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Glutaminsäure ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 18 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (IE) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 12.
Herstellung des Mutantengens (IQ) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODIQ) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Glutaminsäure ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 19 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (IQ) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 13.
Herstellung des Mutantengens (ID) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODID) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Asparaginsäure ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 20 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (ID) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 14.
Herstellung des Mutantengens (TV) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODTV) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Threonin bei X₃ gegen Valin ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 21 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (TV) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 15.
Herstellung des Mutantengens (IK) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODIK) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Lysin ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 23 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (IK) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 16.
Herstellung des Mutantengens (IR) und Reinigung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase
Ein thermostabiles Polymerasegen (pKODIR) für KOD-Polymerase, wobei in dem in der EXO1 Region befindlichen X₁DX₂EX₃-Motif Isoleucin bei X₂ gegen Arginin ersetzt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 10 hergestellt.
Der verwendete selektive Primer war ein wie in SEQ ID Nr: 16 gezeigter Primer. Der verwendete Mutageneseprimer war ein wie in SEQ ID Nr: 22 gezeigter Primer. Die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (IR) wurde unter Verwendung desselben Reinigungsverfahrens wie in Beispiel 10 erhalten.
Beispiel 17.
Bestätigung der Exonukleaseaktivität modifizierter thermostabiler DNA-Polymerase
Die in den Beispielen 10 bis 16 erhaltenen modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen (IN, IE, IQ, ID, YV, IK und IR) wurden bezüglich der Exonukleaseaktivität auf die folgende Art untersucht. Als Kontrolle wurde die natürlich vorkommende KOD-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) verwendet. 50 μl einer Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25 °C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 1 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 5 μg Tritium-markierte E. Coli DNA) wurde in ein 1,5 ml Eppendorfröhrchen pipettiert und anschliessend jede DNA-Polymerase in Mengen von 0,5, l beziehungsweise 1,5 Einheiten zugegeben. Nachdem die Mischung bei 75°C während 10 Minuten umgesetzt worden war, wurde die Reaktion durch Abkühlen auf Eis beendet. Dann wurden der Mischung 50 ml 0,1% BSA als Träger zugegeben und dann wurde sie mit 100 μl einer Lösung aus 10% Trichloressigsäure und 2% Natriumpyrophosphat gemischt. Nachdem die Mischung 15 Minuten auf Eis gelassen wurde, wurde sie mit 12000 r. p. m. während 10 Minuten zur Trennung der vorhandenen Niederschläge zentrifugiert. 100 μl des Überstandes wurde bezüglich der Radioaktivität in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Packard) gemessen, wobei die in das säurelösliche Fragment abgegebene Nukleotidmenge bestimmt wurde.
7 zeigt die Polymeraseaktivität von jeder DNA-Polymerase und die DNA-Abbaugeschwindigkeit. 8 zeigt ihre Exonukleaseaktivitäten in Bezug auf diejenigen der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase auf. Wie vorliegend gezeigt wird, können entsprechend der vorliegenden Erfindung thermostabile DNA-Polymerasen mit verschiedenen 3'-5'-Exonukleaseaktivitätsgehalten erhalten werden.
Im Vergleich zur natürlich vorkommenden KOD-Polymerase wiesen die modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen folgende 3'-5'-Exonukleaseaktivitätsgehalte auf: IN wies ungefähr 95%; IE ungefähr 76%; IQ ungefähr 64%; ID ungefähr 52%; TV ungefähr 48%; IK ungefähr 30% und IR ungefähr 0% auf.
Beispiel 18.
Messung der DNA-Verlängerungsgenauigkeit in PCR durch modifizierte DNA-Polymerase
Die natürlich vorkommende KOD-Polymerase, die modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen IE, ID, IK und IR und Taq-Polymerase wurde bezüglich der DNA-Verlängerungsgenauigkeit in der PCR folgendermaßen untersucht:
Plasmid pUR288 (beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology 1.5.6) wurde mit dem Restriktionsenzym ScaI gespalten. PCR wurde unter Verwendung von 1 ng dieses Plasmids und den Primern der SEQ ID Nr: 13 und 14 durchgeführt. Nach der Beendigung der Reaktion wurden 5 μl der Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und die Amplifikation des Targets mit ungefähr 5,3 kb wurde bestätigt. Die restliche Reaktionslösung wurde mit Phenol/Chloroform behandelt und dann wurde mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde getrocknet und in 50 μl High-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) gelöst. Weiterhin wurden 10 Einheiten Restriktionsenzym ScaI (Toyobo Co., Ltd.) dazugegeben und die Mischung bei 37 °C während 16 Stunden umgesetzt. Das Targetamplifikationsprodukt wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und das dem Targetamplifikationsprodukt entsprechende Agarosegel wurde von dem Gel abgetrennt. Aus der Agarose wurde die Ziel-DNA unter Verwendung von Gene Clean 2 (BIO101) gereinigt. 10 ng der auf diese Weise gereinigten DNA wurden mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA) auf 10 μl verdünnt. Zu dieser Lösung wurden 10 μl einer Reaktionslösung aus einem Ligationskit (hohe Ligation Toyobo Co., Ltd.) gegeben und die Mischung wurde bei 16°C während 30 Minuten umgesetzt. Dann wurde die resultierende DNA in handelsübliche kompetente Zellen transformiert (hoch Kompetente JM109, Toyobo K. K.).
Die Transformante wurde bei 35°C während 16 Stunden in einem LB Agar-Medium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 1,5% Agar, hergestellt von Gibco) kultivieri, das 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM Isopropylthio-(β-galactosid (IPTG, Nakarai Tesque), 0,7% 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-(β-galactosid (X-gal (Nakarai Tesque)) enthielt, dann wurden ihre Kolonien gezählt. pUR288 trägt das lacZ-Gen (β-D-Galactosidase). Daher bilden sich bei einem präziser Fortschreiten der DNA-Verlängerung während der PCR blaue Kolonien auf dem Agarmedium. Fand im Gegensatz dazu während der DNA-Verlängerung ein Fehleinbau statt, so ist die durch das lacZ-Gen kodierie (β-Galactosidaseaktivität verringert oder verloren, wodurch blassblaue oder weiße Kolonien auftreten. Vorrausgesetzt, diese blauen Plattenkolonien und weiße Kolonien sind mutierie Kolonien, dann wurde die Mutantenfrequenz (%) bei Verwendung jedes Enzyms bestimmt, und die Ergebnisse sind in der unterstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 ersrchtlich ist, waren die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen IE, ID, IK und IR der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase unterlegen, jedoch zeigten sie geringere Mutationsgrade als Taq-Polymerase, das heißt, sie zeigten eine höhere Genauigkeit in der DNA-Verlängerung.
Beispiel 19.
PCR durch Verwendung modifizierter DNA-Polymerase (für Plasmid)
Die PCR wurde unter Verweudung der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase (beschrieben in der nicht geprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 298, 879/1955) und der modifizieren thermostabilen DNA-Polymerase (beschrieben in Beispiel 5) folgendermaßen durchgeführt: 2,5 Einheiten jedes Enzyms wurden 50 μl einer Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0 bei 25°C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 1 ng Plasmid pBR322, das mit denn Restriktionsenzym ScaI linearisiert wurde und 10 pmol von den in SEQ ID Nr: 13 und 14 gezeigten Primern) zugegeben und die PCR wurde durchgeführt. Der verwendete Temperaturwechsler war das Modell PJ2000 (Perkin Elmer). Die Reaktionsbedingungen waren 94°C, 30 Sekunden → 68°C, 2,5 Minuten und dieser Zyklus wurden 25 mal wiederholt. Taq-Polymerase (Toyobo K. K) wurde auf dieselbe Art der PCR unterzogen, abgesehen davon, dass die Reaktionslösung 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25 °C) war, die 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1% Triton X-100, 1 ng Plasmid pBR322, das mit dem Restriktionsenzym ScaI linearisiert wurde, und 10 pmol von den in SEQ ID Nr: 13 und 14 gezeigten Primern enthielt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 5 μl der Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und es wurde eine Amplifikation des Targets mit ungefähr 4,3 kb bestätigt.
3 zeigt das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die PCR-Amplifikation durch die modifizierte DNA-Polymerase besser war, als diejenige durch die natürlich vorkommende KOD-Polymerase. Weiterhin war diese Amplifikation besser als diejenige durch die Taq-Polymerase.
Beispiel 20.
PCR durch Verwendung modifizierter DNA-Polymerase (für das menschliche Genom)
Die PCR wurde unter Verwendung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase (beschrieben in Beispiel 5) folgendermaßen durchgeführt: 2,5 Einheiten des Enzyms wurden 50 μl einer Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0 bei 25°C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsuifat, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 100 ng von menschlicher Plazenta stammender genomischer DNA (Clontech), und 10 pmol von den in SEQ ID Nr: 11 und 12 gezeigten Primern) zugegeben und die PCR wurde durchgeführt. Der verwendete Temperaturwechsler war das Modell PJ2000 (Perkin Elmer). Die Reaktionsbedingungen waren 94°C, 30 Sekunden → 68°C, 3 Minuten und dieser Zyklus wurden 25 mal wiederholt.
Zum Vergleich wurde Taq-Polymerase (Toyobo K. K) auf dieselbe Art der PCR unterzogen, abgesehen davon, dass die Reaktionslösung 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25°C) war, die 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1% Triton X-100, 100 ng von menschlicher Plazenta stammender genomischer DNA (Clontech), und 10 pmol von den in SEQ ID Nr: 11 und 12 gezeigten Primern enthielt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 5 μl der Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und es wurde eine Amplifikation des Targets mit ungefähr 4 kb bestätigt. 4 zeigt das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die PCR-Amplifikation durch die modifizierte DNA-Polymerase besser war, als diejenige durch die Taq-Polymerase.
Beispiel 21.
PCR durch Verwendung einer DNA-Polymerasezusammensetzung (für das menschliche Genom
Die PCR wurde unter Verwendung einer Mischung der modifizierten thermostabilen DNA-Polymerase (DA, EA, DEA, ND oder YF) und der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase folgendermaßen durchgeführt: 2,5 Einheiten ND und 0,05 Einheiten KOD-Polymerase wurden 50 μl einer Reaktionslösung (120 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8 bei 25°C), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 0,1% Triton X-100, 0,001% BSA, 30 ng von menschlicher Plazenta stammender genomischer DNA (Clontech), und 10 pmol von den in SEQ ID Nr: 11 und 12 gezeigten Primern) zugegeben. Der verwendete Temperaturwechsler war das Modell PJ2000 (Perkin Elmer). Die Reaktionsbedingungen waren 94°C, 30 Sekunden → 68°C, 3 Minuten und dieser Zyklus wurden 30 mal wiederholt.
Zum Vergleich wurden die modifizierte thermostabile DNA-Polymerase (ND), Taq-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.), eine kommerzielle DNA-Polymerasemischung (ExTaq (Takara Shuzo Co., Lt.) beziehungsweise Advantage Tth (Clontech) unter Verwendung derselben Mengen genomischer DNA und Primern auf dieselbe Art der PCR unterzogen, abgesehen davon, dass die Reaktionslösung der Puffer war, der dem kommerziellen Produkt beigefügt war. Nach Beendigung der Reaktion wurden 5 μl der Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und es wurde eine Amplifikation des Targets mit ungefähr 4 kb bestätigt. 5 zeigt das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die PCR-Amplifikation durch eine Mischung aus der modifizierten DNA-Polymerase (ND) und der natürlich vorkommenden KOD-Polymerase besser war, als diejenige durch die kommerzielle Polymerasemischung.
Eine in ihrer Leistungsfähigkeit ausgezeichnete Nukleinsäureamplifikation kann durch eine Mischung aus 2 oder mehr DNA-Polymerasen bewirkt werden, die bezüglich der Thermostabilität und DNA-Verlängerungsrate beinahe identisch, jedoch in ihrer 3'-5'-Exonukleaseaktivität unterschiedlich sind.
SEQUENZIERUNG

Claims

Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: Wirkung sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 5% oder weniger der 3'-5'-Exonucleaseaktivität des Enzyms vor Modifikation auf; DNA-Verlängerungsrate mindestens 30 Basen/Sekunde; und Thermostabilität sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei pH 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C für 6 Stunden aufrechtzuerhalten; Optimaltemperatur etwa 75°C; Molekulargewicht 88 bis 90 kDa; und Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1, welche frei von einer 3'-5'-Exonucleaseaktivität ist.
Thermostabile DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die DNA-Verlängerungsrate nicht weniger als 60 Basen/Sekunde ist.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die 3'-5'-Exonucleaseaktivität auf etwa 1% oder weniger verringert ist.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei in SEQ ID Nr: 2 Asparaginsäure an der 141-Position und/oder Glutaminsäure an der 143-Position gegen andere Aminosäuren ersetzt wurden.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 5, wobei Asparaginsäure an der 141-Position und/oder Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin ersetzt wurden.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei in SEQ ID Nr: 2 Asparagin an der 210-Position gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 7, wobei Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure ersetzt wurde.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei in SEQ ID Nr: 2 Tyrosin an der 311-Position gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 9, wobei Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde.
Verfahren zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend das Umsetzen von DNA als eine Matrize, Primer, dNTP und thermostabile DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 10, um dadurch die Primer zur Herstellung eines DNA-Primer-Verlängerungsprodukts zu verlängern.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Primer 2 Arten von Oligonucleotiden sind, wobei einer davon komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei ein Erwärmen und Abkühlen wiederholt durchgeführt werden.
Reagens zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend 2 Arten von Primern, wobei einer davon komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist, dNTP, die thermostabile DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und eine Pufferlösung.
Reagens nach Anspruch 14, ferner umfassend Magnesiumionen, Ammoniumionen und/oder Kaliumionen, BSA und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit 0 bis 5% der 3'-5'-Exonucleaseaktivität des Enzyms vor Modifikation (erste Polymerase) und eine thermostabile DNA-Polymerase mit der 3'-5'-Exonucleaseaktivität oder eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit 100 bis 6% der 3'-5'-Exonucleaseaktivität einer thermostabilen DNA-Polymerase vor Modifikation (zweite Polymerase), wobei die erste und die zweite DNA-Polymerase eine DNA-Verlängerungsrate und eine Thermostabilität, wie in Anspruch 1 definiert, aufweisen.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Aktivität der zweiten DNA-Polymerase niedriger als die Aktivität der ersten DNA-Polymerase ist.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die zweite DNA-Polymerase in 0,02 bis 0,1 Einheiten bezogen auf alle 2,5 Einheiten der ersten DNA-Polymerase vorhanden ist.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die 3'-5'-Exonucleaseaktivität der ersten DNA-Polymerase auf etwa 1% oder weniger der 3'-5'-Exonucleaseaktivität der thermostabilen DNA-Polymerase vor Modifikation verringert ist.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die erste DNA-Polymerase eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase ist, die ferner die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: Optimaltemperatur und Molekulargewicht sind wie in Anspruch 1 definiert und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 141-, 142-, 143-, 210- und 311-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei in der Aminosäuresequenz Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin, Isoleucin an der 142-Position gegen Arginin, Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin, Asparaginsäure an der 141-Position bzw. Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin, Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure oder Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die erste DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, ist, wobei Asparaginsäure an der 141-Position gegen Alanin und/oder Isoleucin an der 142-Position gegen Arginin und/oder Glutaminsäure an der 143-Position gegen Alanin und/oder Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure und/oder Tyrosin an der 311-Position gegen Phenylalanin ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist, welche ferner die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: Wirkung: sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist eine 3'-5'- Exonucleaseaktivität auf; und Optimaltemperatur und Molekulargewicht sind wie in Anspruch 1 definiert ind die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite Polymerase eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften ist: Wirkung 6% der 3'-5'-Exonucleaseaktivität des Enzyms vor Modifikation auf; sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 100 bis

und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei mindestens eine der Aminosäuren X₁, X₂ und X₃ an einem X₁D₂X₂EX₃-Motiv, welches in EXO 1 vorhanden ist, gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite DNA-Polymerase eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften ist: Wirkung, DNA-Verlängerungsrate und Thermostabilität sind wie in Anspruch 24 definiert und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei die Aminosäuren an den 140-, 142- und 144-Positionen gegen andere Aminosäuren ersetzt wurden.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite DNA-Polymerase eine modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften ist: Wirkung, DNA-Verlängerungsrate und Thermostabilität sind wie in Anspruch 25 definiert, die Optimaltemperatur und das Molekulargewicht sind wie in Anspruch 1 definiert, und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin oder Lysin, oder Threonin an der 144-Position gegen Valin ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, ist, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Asparaginsäure oder durch Glutaminsäure oder durch Asparagin oder durch Glutamin oder durch Lysin ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die zweite DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, ist, wobei Threonin an der 144-Position gegen Valin ersetzt wurde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend die folgenden ersten und zweiten DNA-Polymerasen: die erste Polymerase ist wie in Anspruch 22 definiert, die zweite Polymerase: Wirkung, Thermostabilität, Optimaltemperatur, Molekulargewicht und Aminosäuresequenz sind wie in Anspruch 23 definiert, und die DNA-Verlängerungsrate beträgt mindestens 120 Basen/Sekunde, oder Wirkung, Thermostabilität, Optimaltemperatur, Molekulargewicht und Aminosäuresequenz sind wie in Anspruch 26 definiert und die DNA-Verlängerungsrate beträgt mindestens 120 Basen/Sekunde.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend die folgenden ersten und zweiten DNA-Polymerasen: die erste Polymerase: Wirkung, DNA-Verlängerungsrate, Thermostabilität, Optimaltemperatur und Molekulargewicht sind wie in Anspruch 20 definiert, und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei Asparagin an der 210-Position gegen Asparaginsäure ersetzt wurde, die zweite Polymerase: Wirkung, Thermostabilität, Optimaltemperatur, Molekulargewicht und Aminosäuresequenz sind wie in Anspruch 23 definiert, und die DNA-Verlängerungsrate beträgt mindestens 120 Basen/Sekunde.
Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, umfassend das Umsetzen von DNA als eine Matrize, Primer, dNTP und die DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 30, um dadurch die Primer zur Herstellung eines DNA-Primer-Verlängerungsprodukts zu verlängern.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Primer 2 Arten von Oligonucleotiden sind, wobei einer komplementär zu dem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei ein Erwärmen und Abkühlen wiederholt durchgeführt wird.
Reagens zur Nucleinsäureamplifikation, umfassend die DNA-Polymerase-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 30, zweiwertige Ionen, einwertige Ionen, Primer, dNTP und eine Pufferlösung.
Reagens nach Anspruch 34, umfassend Magnesiumionen, Ammoniumionen und/oder Kaliumionen, 2 Arten von Primern, wobei einer komplementär zu einem DNA-Verlängerungsprodukt eines anderen Primers ist, BSA und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel.
Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: Wirkung sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 100 bis 6% der 3'-5'-Exonucleaseaktivität des Enzyms vor Modifikation auf; DNA-Verlängerungsrate mindestens 30 Basen/Sekunde; Thermostabilität sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei pH 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C für 6 Stunden aufrechtzuerhalten; und Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei mindestens eine der Aminosäuren an den 140-, 142- und 144-Positionen gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 36, welche ferner die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: Wirkung, DNA-Verlängerungsrate und Thermostabilität sind wie in Anspruch 36 definiert, Optimaltemperatur und Molekulargewicht sind wie in Anspruch 1 definiert und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin oder Lysin, oder Threonin an der 144-Position gegen Valin ersetzt wurde.
Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: Wirkung sie weist eine DNA-Polymeraseaktivität auf und weist 5% oder weniger 3'-5'-Exonucleaseaktivität des Enzyms vor Modifikation auf; DNA-Verlängerungsrate mindestens 30 Basen/Sekunde; Thermostabilität sie ist befähigt, 60% oder mehr Restaktivität bei pH 8,8 (bestimmt bei 25°C) nach Behandlung bei 95°C für 6 Stunden aufrechtzuerhalten; und Aminosäureseguenz eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei die Aminosäure an der 142-Position gegen eine andere Aminosäure ersetzt wurde.
Modifizierte thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 38, welche ferner die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: Wirkung, DNA-Verlängerungsrate und Thermostabilität sind wie in Anspruch 38 definiert, Optimaltemperatur und Molekulargewicht sind wie in Anspruch 1 definiert und die Aminosäuresequenz ist wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, wobei Isoleucin an der 142-Position gegen Arginin ersetzt wurde: