DE69835008T2

DE69835008T2 - Zusammensetzungen und verfahren der reversen transkriptase-polymerasekettenreaktion (rt-pcr)

Info

Publication number: DE69835008T2
Application number: DE69835008T
Authority: DE
Inventors: E. Jun North Potomac LEE; Ayoub Gaithersburg RASHTCHIAN
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2018-04-04
Also published as: US20040219595A1; US6495350B1; US9873901B2; EP0975806A4; EP0975806A1; ATE331040T1; EP2354251B1; ES2355739T3; US20030113712A1; US20130164788A1; DE69841990D1; EP1705253B1; DE69835008D1; ATE486961T1; EP1705253A3; US8372604B2; AU7100198A; WO1998044161A1; EP0975806B1; US7883871B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Molekular- und Zellbiologie. Die Erfindung ist insbesondere auf Zusammensetzungen und Verfahren gerichtet, die zur Amplifikation von Nukleinsäure-Molekülen durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) geeignet sind. Insbesondere stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäure-Molekülen in einem vereinfachten Ein- oder Zwei-Schritt-RT-PCR-Verfahren unter Verwendung von Kombinationen von reverser Transkriptase und thermostabilen DNA-Polymerase-Enzymen zusammen mit schwefelhaltigen Molekülen (oder Kombinationen von schwefelhaltigen Molekülen und acetathaltigen Molekülen) und, gegebenenfalls, bovinem Serum-Albumin zur Verfügung. Die Erfindung vereinfacht auf die Weise die schnelle und effiziente Amplifikation von Nukleinsäure-Molekülen und die Detektion und Quantifizierung von RNA-Molekülen. Die Erfindung ist ebenso geeignet zur schellen Produktion und Amplifikation von cDNAs (einzel-strängigen und doppel-strängigen) welche zu verschiedenen industriellen, medizinischen und forensischen Zwecken verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Reverse Tanskription von RNA
Der Ausdruck "reverse Transkriptase" beschreibt eine Klasse von Polymerasen, die als RNA-abhängige DNA-Polymerasen charakterisiert sind. Alle bekannten reversen Transkriptasen erfordern einen Primer zur Synthese eines DNA-Transkripts von einer Template-RNA. Ursprünglich wurde die reverse Transkriptase vor allem dazu verwendet, um mRNA in cDNA umzuschreiben, welche dann in einen Vektor zur weiteren Manipulation kloniert werden kann.
Die reverse Transkriptase des Vogel (Avian)-Myblastose-Virus (AMV) war die erste häufig verwendete RNA-abhängige DNA-Polymerase (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). Das Enzym besitzt eine auf RNA-gerichtete 5'-3'-DNA-Polymerase-Aktivität, eine auf DNA-gerichtete 5'-3'-DNA-Polymerase-Aktivität und eine RNase-H-Aktivität. RNase H ist eine prozessive 5'- und 3'-Ribonuklease, die spezifisch für den RNA-Strang bei RNA-DNA-Hybriden ist (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Fehler bei der Transkription können nicht durch reverse Transkriptase korrigiert werden, da den bekannten viralen reversen Transkriptasen die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, die zum Korrekturlesen notwendig ist, fehlt (Saunders and Saunders, Micribial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). Eine detaillierte Studie der Aktivität von reverser Transkriptase aus dem AMV und ihrer assoziierten RNase-H-Aktivität wurde von Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372 (1983), geliefert.
Eine andere reverse Transkriptase, die intensiv in der Molekularbiologie verwendet wird, ist die reverse Transkriptase, die vom murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV) stammt. Siehe z. B. Gerard, G.R., DNA 5:271-279 (1986) und Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985). Ebenso wurde M-MLV reverse Transkriptase beschrieben, der die RNase-H-Aktivität im Wesentlichen fehlt. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,244,797.
PCR-Amplifikation von RNA
Reverse Transkriptasen werden intensiv zum reversen Umschreiben von RNA vor der PCR-Amplifikation verwendet. Dieses Verfahren, das oftmals als RNA-PCR oder RT-PCR bezeichnet wird, wird häufig zur Detektion und Quantifizierung von RNA verwendet.
Um die technischen Probleme, die oftmals mit der RT-PCR verbunden sind, zu lösen, wurden eine Anzahl von Protokollen entwickelt, welche die drei grundlegenden Schritte des Verfahrens berücksichtigen: (a) die Denaturierung von RNA und die Hybridisierung eines reversen Primers, (b) die Synthese von cDNA und (c) PCR-Amplifikation. In dem sogenannten "nicht gekoppelten" RT-PCR-Verfahren (z. B. Zwei-Schritt-RT-PCR) wird die reverse Transkription als unabhängiger Schritt durchgeführt, wobei optimale Pufferbedingungen für die Aktivität der reversen Transkriptase verwendet werden. Nach der cDNA-Synthese wird die Reaktion verdünnt, um die MgCl₂- und Desoxyribonukleosid-Triphosphat (dNTP)-Konzentrationen herabzusetzen und Bedingungen zu erhalten, die optimal für eine Taq-DNA-Polymerase-Aktivität sind; die PCR wird gemäß den Standardbedingungen durchgeführt (siehe U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202). Im Gegensatz dazu verwenden "gekoppelte" RT-PCR-Verfahren einen gemeinsamen oder "Kompromiss"-Puffer für die Aktivitäten der reversen Transkriptase und der Taq-DNA-Polymerase. In einer Ausführungsform ist das "Annealing" des reversen Primers ein separater Schritt, welcher der Zugabe von Enzymen, die dann in ein einziges Reaktionsgefäß gegeben werden, vorausgeht. In einer anderen Ausführungsform ist die Reverse-Transkriptase-Aktivität eine Komponente der thermostabilen Tth-DNA-Polymerase. Das Annealing und die cDNA-Synthese werden in Gegenwart von Mn⁺⁺ durchgeführt, dann wird die PCR in Gegenwart von Mg⁺⁺ durchgeführt, nachdem Mn⁺⁺ durch einen Chelatbildner entfernt wurde. Somit integriert das "kontinuierliche" Verfahren (z. B. Ein-Schritt-RT-PCR) die drei RT-PCR-Schritte in eine einzige kontinuierliche Reaktion, wobei das Öffnen des Reaktionsgefäßes zur Komponenten- oder Enzymzugabe vermieden wird. Kontinuierliche RT-PCR wurde als Einzel-Enzym-System unter Verwendung der Reversen-Transkriptase-Aktivität thermostabiler Taq-DNA-Polymerase und Tth-DNA-Polymerase und als Zwei-Enzym-System unter Verwendung von AMV-RT und Taq-DNA-Polymerase, wobei der anfängliche RNA-Denaturierungsschritt bei 65 °C weggelassen wurde, beschrieben.
Versuche, das RT-PCR-Verfahren effizienter zu machen, erwiesen sich als nicht einfach; verschiedene Veröffentlichungen dokumentieren eine gegenseitige Behinderung der reversen Transkriptase und der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase, wenn sie zusammen in einem einzigen Gefäß verwendet werden, was zu einer geringen Sensitivität der RT-PCR oder zu gar keinen Ergebnissen führt. Beispielsweise ist eine generelle Inhibition der Taq-DNA-Polymerase, wenn sie mit reversen Transkriptasen in Mischungen zur Ein-Schritt-Ein-Gefäß-RT-PCR gemischt ist, beschrieben (z. B. Sellner, L.N. et al., Nucl. Acids Res 20(7):1487-1490 (1992)). In der gleichen Veröffentlichung ist beschrieben, dass die Inhibition nicht auf einen RT-Typ begrenzt ist: sowohl AMV-RT als auch M-MLV-RT inhibierten die Taq-DNA-Polymerase und limitierten die Sensitivität der RT-PCR. Es stellte sich heraus, dass unter den von Sellner et al. verwendeten Reaktionsbedingungen (67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 17 mM (NH₄)₂SO₄, 1 mM β-Mercaptoethanol, 6 uM EDTA, 0,2 mg/ml Gelatine) der Grad der Taq-DNA-Polymerase-Inhibition mit ansteigender RT-Konzentration erhöht wird, bis zu einem Verhältnis von etwa 3 Einheiten (Units) RT: 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase; jenseits davon wurde die Taq-Polymerase vollständig inaktiviert.
In anderen Veröffentlichungen werden Versuche beschrieben, Bedingungen für Ein-Schritt-RT-PCR-Reaktionen zu entwickeln. Beispielsweise ist die Verwendung von AMV-RT für eine Ein-Schritt-RT-PCR in einem Puffer, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 0,01% Gelatine, beschrieben (Aatsinki, J. T. et al., BioTechniques 16(2): 282-288 (1994)); eine weitere Veröffentlichung zeigte eine Ein-Schritt-RT-PCR unter Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend AMV-RT und Taq-DNA-Polymerase in einem Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,01% Gelatine und 1,5 mM MgCl₂, (Mallet, F. et al., BioTechniques 18(4): 678-687 (1995)). Unter den in der letzten Veröffentlichung verwendeten Bedingungen zeigte eine Substitution der M-MLV-RT (RNase-H⁺- oder RNase-H^--Formen) durch AMV-RT die gleiche Aktivität in der kontinuierlichen RT-PCR-Reaktion.
Gouvea, V. et al., Journal of Clinical Microbiology 28:276-282 (1990), beschreibt die Verwendung von PCR zur Amplifikation eines dsRNA-Virus. Die dsRNA wird als Template für die reverse Transkription unter Verwendung von AMV-RT verwendet; anschließend erfolgt in der gleichen Reaktionsmischung die Amplifikation unter Verwendung der Taq-Polymerase. Die Reaktionsmischung enthält das organische Lösungsmittel DMSO.
Ando, T. et al., Journal of Clinical Microbiology 35:570-577 (1997) beschreibt eine Ein-Schritt-RT-PCR unter Verwendung von M-MLV-RT und der Taq- und Pwo-DNA-Polymerasen.
Das U.S.-Patent Nr. 5,561,058 beschreibt die Replikation und Amplifikation von RNA-Sequenzen unter Verwendung von thermoaktiven DNA-Polymerasen. Das Europäische Patent Nr. 0,736,608 beschreibt die Amplifikation von Nukleinsäure-Fragmenten unter Verwendung einer Kombination thermophiler DNA-Polymerasen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf Zusammensetzungen und Verfahren gerichtet, die für eine Ein-Schritt-Ein-Gefäß-RT-PCR unter Verwendung von M-MLV-RT oder ihrer RNase-H-defizienten ("RNase H^-") Derivate in Kombination mit einer oder mehreren DNA-Polymerasen in Gegenwart von schwefelhaltigen Molekülen oder Kombinationen von schwefelhaltigen Molekülen und acetathaltigen Molekülen geeignet ist, um die Inhibition der PCR, die oftmals bei Verwendung von Zusammensetzungen, die zwei oder mehrere Enzyme mit Reverser-Transkriptase-Aktivität enthalten, beobachtet wird, zu verhindern.
Insbesondere ist die Erfindung auf Verfahren zur Amplifikation eines Nuleinsäure-Moleküls gerichtet, welche (a) das Mischen einer Template-RNA mit einer Zusammensetzung, enthaltend eine reverse Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), weiche bevorzugt eine wesentlich reduzierte RNase-H-Aktivität aufweist und bei der es sich am bevorzugtesten um SUPERSCRIPT I oder SUPERSCRIPT II handelt, in Kombination mit einer oder mehreren DNA-Polymerasen und einem oder mehreren schwefelhaltigen Molekülen, wie beispielsweise einem oder mehreren schwefelhaltigen Puffern, wobei die Schwefelkonzentration wenigstens 18 mM beträgt, zur Bildung einer Mischung und (b) das Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichen, um ein DNA-Molekül, welches zur gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist, zu amplifizieren, umfassen. Außerdem ist die Erfindung auf Verfahren gerichtet, in denen ein oder mehrere acetathaltige Moleküle, wie beispielsweise ein oder mehrere acetathaltige Puffer, mit einem oder mehreren schwefelhaltigen Molekülen oder Puffern in Stufe (a) der oben beschriebenen Verfahren kombiniert werden, wobei die Konzentration des acetathaltigen Moleküls bzw. der acetathaltigen Moleküle etwa 1 mM bis etwa 500 mM beträgt. In bevorzugten derartigen Verfahren handelt es sich bei den verwendeten DNA-Polymerasen um thermostabile DNA-Polymerasen, am bevorzugtesten um Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl oder eine Mutante, Variante oder ein Derivat davon, wobei in dieser Ausführungsform der Erfindung die Taq-DNA-Polymerase am bevorzugtesten ist.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die DNA-Polymerasen eine erste DNA-Polymerase mit 3'-Exonuklease-Aktivität, am bevorzugtesten eine DNA-Polymerase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pfu, Pwo, DEEPVENT, VENT, Tne, Tma, Kod, und Mutanten, Varianten und Derivaten davon, und eine zweite DNA-Polymerase mit wesentlich reduzierter 3'-Exonuklease-Aktivität, am bevorzugtesten eine DNA-Polymerase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Taq, Tfl, Tth und Mutanten, Varianten und Derivaten davon. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beträgt das Verhältnis der Einheiten (Units) von reverser Transkriptase zu den DNA-Polymerasen etwa 0,2:2 bis etwa 500:2; in besonders bevorzugten derartigen Ausführungsformen beträgt das Verhältnis etwa 0,5:2 bis etwa 250:2 oder ist größer als etwa 3:2.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beträgt die Konzentration des schwefelhaltigen Moleküls bzw. der schwefelhaltigen Moleküle wenigstens 18 mM, bevorzugter etwa 20 mM bis etwa 50 mM. Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen die Quelle der schwefelhaltigen Moleküle ein Puffer oder ein schwefelhaltiges Salz ist, wobei es sich um Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, TRIS-sulfat oder Mangansulfat sowie um andere schwefelhaltige Puffer und Salze, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sein dürften, handeln kann.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Konzentration des acetathaltigen Moleküls bzw. der acetathaltigen Moleküle etwa 1 mM bis etwa 500 mM, bevorzugter etwa 5 mM bis etwa 250 mM, etwa 10 mM bis etwa 200 mM, etwa 25 mM bis etwa 150 mM, etwa 50 mM bis etwa 100 mM oder etwa 60 mM. Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen die Quelle der acetathaltigen Moleküle ein Puffer oder ein acetathaltiges Salz ist, bei dem es sich um Ammoniumacetat, Magnesiumacetat, TRIS-acetat oder Manganacetat sowie um andere acetathaltige Puffer und Salze, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sein dürften, handeln kann.
Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen die Mischung außerdem ein oder mehrere Nukleotide, bevorzugt Desoxyribonukleosid-Triphosphate (am bevorzugtesten dATP, dUTP, dTTP, dGTP oder dCTP), Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (am bevorzugtesten ddATP, ddUTP, ddGTP, ddTTP oder ddCTP) oder Derivate davon enthält. Derartige Nukleotide können gegebenenfalls zur Detektion markiert sein (z. B. mit einer radioaktiven oder nichtradioaktiven detektierbaren Markierung).
Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen die Mischung außerdem einen oder mehrere Oligonukleotid-Primer, bei denen es sich bevorzugt um Oligo(dT)-Primer, Zufalls-Primer, arbiträre Primer oder Zielmolekül- (Target)-spezifische Primer, bevorzugter um einen Gen-spezifischen Primer handelt, enthält.
Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen der Inkubationsschritt (a) das Inkubieren der Mischung bei einer Temperatur (am bevorzugtesten bei einer Temperatur von etwa 35 °C bis etwa 60 °C) und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um ein DNA-Molekül komplementär zu der gesamten Template-RNA oder einem Teil davon zu machen, und (b) das Inkubieren des DNA-Moleküls, welches zu der Template-RNA komplementär ist, bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichen, um das DNA-Molekül zu amplifizieren, umfasst; bevorzugt geschieht dies über einen thermozyklischen Schritt (Thermocycling), wobei der thermozyklische Schritt bevorzugter ein abwechselndes Erwärmen und Abkühlen der Mischung, welches ausreicht, um das DNA-Molekül zu amplifizieren, und am bevorzugtesten einen Wechsel zwischen einem ersten Temperaturbereich von etwa 90 °C bis etwa 100 °C und einem zweiten Temperaturbereich von etwa 40 °C bis etwa 75 °C, bevorzugt von etwa 65 °C bis etwa 75 °C, umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das "Thermocycling" mehr als 10-mal, bevorzugter mehr als 20-mal, durchgeführt.
Die Erfindung ist ebenso auf Verfahren gerichtet, in denen die Amplifikation nicht wesentlich inhibiert wird.
Die Erfindung ist des weiteren auf Verfahren zur Amplifikation eines Nukleinsäure-Moleküls gerichtet, welche (a) das Mischen einer Template-RNA mit einer Zusammensetzung, enthaltend eine reverse Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), welche bevorzugt eine wesentlich reduzierte RNase-H-Aktivität aufweist, zusammen mit einer oder mehreren DNA-Polymerasen (am bevorzugtesten ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl und Mutanten, Varianten und Derivaten davon), einem oder mehr schwefelhaltigen Molekül(en) und einem oder mehr kaliumhaltigen Molekül(en), zur Bildung einer Mischung und (b) das Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichen, um ein DNA-Molekül, welches zu der gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist, zu amplifizieren, umfassen. In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf Verfahren gerichtet, in denen ein oder mehr acetathaltige Moleküle, wie beispielsweise ein oder mehr acetathaltige Puffer, mit dem oder den schwefelhaltigen Molekül(en) oder Puffer(n) in Stufe (a) der oben beschriebenen Verfahren kombiniert sind.
Die Erfindung ist ebenso gerichtet auf Zusammensetzungen, welche eine reverse Transktriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), eine oder mehr DNA-Polymerase/n und ein oder mehr schwefelhaltige Molekül/e (wobei die Schwefelkonzentration wenigstens 18 mM ist) oder Kombinationen eines oder mehr schwefelhaltiger Moleküle und eines oder mehr acetathaltiger Moleküle in den obigen Konzentrationen enthalten.
Die Erfindung ist ebenso auf Zusammensetzungen gerichtet, die eine reverse Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), eine oder mehr DNA-Polymerasen, ein oder mehr kaliumhaltige Moleküle und ein oder mehr schwefelhaltige Moleküle (wobei die Schwefelkonzentration wenigstens 18 mM ist) oder Kombinationen eines oder mehr schwefelhaltiger Moleküle und eines oder mehr acetathaltiger Moleküle in den obigen Konzentrationen enthalten.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann anhand der folgenden Zeichnungen und Beschreibung der Erfindung sowie der Ansprüche deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Fotografie eines mit Ethidiumbromid (EtdBr) angefärbten Gels, welches die Inhibition der RT-PCR durch reverse Transkriptase zeigt. Die Spuren 1, 10, 11 und 20 enthalten eine 100-bp-DNA-Größenleiter.
2A ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die schützende Rolle von bovinem Serum Albumin (BSA) bei der RT-PCR einer β-AktinmRNA aus 100 pg HeLa-Gesamt-Template-mRNA zeigt. Spur 1 enthält eine DNA-Größenleiter; der Pfeil zeigt die 1026 by große β-Aktin-Zielsequenz an.
2B ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die schützende Rolle von BSA bei der RT-PCR einer CAT-mRNA aus 10⁵ Kopien einer CAT-Template-mRNA zeigt. Spur 1 enthält eine DNA-Größenleiter; der Pfeil zeigt die 653 by große CAT-Zielsequenz an.
3 ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die Leistung verschiedener RTs in Sulfationen- oder BSA-haltigen Puffern zeigt. Spur 1: 100-bp-DNA-Größenleiter; Spuren 2 bis 5: 5 Units/Reaktion AMV-RT; Spuren 6 bis 9: 5 Units/Reaktion M-MLV-RT; Spuren 10 bis 13: 5 Units/Reaktion M-MLV-RT (RNase H^-). Der Pfeil zeigt die 500 by große CAT-Zielsequenz an.
4 ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die Wirkung der Temperatur bei der reversen Transkriptase-Reaktion auf die Bildung des RT-PCR-Produkts zeigt. Zweifach-Proben von 100 ng (Spuren 1-6) oder 10 ng (Spuren 7-12) HeLa-Gesamt-RNA wurden bei den angegebenen Temperaturen revers transkribiert und eine 606 by große Zielsequenz der ε-Untereinheit der DNA-Polymerase III (Spuren 1-6) oder eine 253 by große β-Aktin-Zielsequenz (Spuren 7-12) durch PCR amplifiziert. M: DNA-Größenmarker.
5 ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die verbesserte Ausbeute an RT-PCR-Produkten, die durch eine RT-Reaktion bei höheren Temperaturen erhalten wird, zeigt. Zweifach-Proben von 10 ng Tabak-Gesamt-RNA (Spuren 1-6) oder 100 ng HeLa-Gesamt-RNA (Spuren 7-12) wurden bei 45 °C (Spuren 1, 2, 7 und 8), 50 °C (Spuren 3, 4, 9 und 10) oder 55 °C (Spuren 5, 6, 11 und 12) revers transkribiert und eine 500 by große GADPH-Zielsequenz (Pfeil; Spuren 1-6) oder eine 1475 by große Zielsequenz der ε-Untereinheit der DNA-Polymerase III (Pfeil; Spuren 7-12) durch PCR amplifiziert. M: DNA-Größenmarker; L: 100-bp-Nukleinsäure-Größenleiter.
6 ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die Sensitivität und Effizienz der Erfindung bei der RT-PCR von großen (2-3 kb) Produkten zeigt. Ein 2,78 kb großes Fragment der tuberösen Sklerose II wurde aus verschiedenen Mengen HeLa-Gesamt-RNA amplifiziert, wobei die RNA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ohne (Spuren 1-6) oder unter (Spuren 7-12) Zugabe von 1 μl ELONGase-Enzym-Mix oder unter Verwendung eines RT-Kits vom Zulieferer A (Spuren 13-18) revers transkribiert wurde. Spuren 1, 2, 7, 8, 13 und 14: 1 ng HeLa-RNA; Spuren 3, 4, 9, 10, 15 und 16: 10 ng HeLa-RNA; Spuren 5, 6, 11, 12, 17 und 18: 100 ng HeLa-RNA; M: DNA-Größenmarker.
7 ist eine Fotografie eines mit EtdBr angefärbten Gels, welches die Sensitivität und Effizienz der Erfindung bei der RT-PCR langer (>3 kb) Produkte zeigt. 100 ng HeLa-Gesamt-RNA wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen unter Zugabe von 1 μl ELONGASE-Enzym-Mix revers transkribiert und Fragmente des adenomatösen Polyposis-Coli-Gens mit einer Größe von 7,3 kb (Spuren 1, 2), 7,7 kb (Spuren 3, 4) oder 8,9 kb (Spuren 5, 6) durch PCR amplifiziert. M: DNA-Größenmarker (HindIII-Verdau von λ-DNA).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Übersicht
Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung bei der Herstellung und Analyse von Nukleinsäuren durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gerichtet. Insbesondere stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur Verfügung, welche eine Anzahl von Komponenten in verschiedenen Kombinationen enthalten. Zu derartigen Komponenten zählen ein oder mehr schwefelhaltige(s) Molekül(e) (oder Kombinationen eines oder mehr schwefelhaltiger Moleküle und eines oder mehr acetathaltiger Moleküle), ein oder mehr Enzyme mit Reverser-Transkriptase-Aktivität, ein oder mehr DNA-Polymerasen, ein oder mehr Primer, ein oder mehr Nukleotide und ein geeigneter Puffer. Diese Zusammensetzungen können in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um Nukleinsäure-Moleküle unter Verwendung eines Ein- oder Zwei-Schritt-RT-PCR-Verfahrens herzustellen, zu analysieren, zu quantifizieren oder auf andere Weise zu manipulieren.
ZUSAMMENSETZUNGEN
Die Puffer in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liefern den Enzymen mit Reverser-Transkriptase-Aktivität und den DNA-Polymerase-Enzymen geeignete pH- und Ionen-Bedingungen. Die in den Zusammensetzungen verwendeten Nukleotide (z. B. Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs)) und die Nukleinsäure-Primer liefern die Substrate für die Synthese oder Amplifikation von Nukleinsäure-Molekülen in Übereinstimmung mit der Erfindung. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können ebenso Inhibitions-reduzierende Reagenzien enthalten, welche dazu beitragen, eine Inhibition in den RT-PCR-Reaktionen zu verhindern.
Puffer- und Ionen-Bedingungen
Die Puffer- und Ionen-Bedingungen der vorliegenden Zusammensetzungen wurden optimiert, um eine RT-vermittelte Inhibition der RT-PCR zu reduzieren. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten ein oder mehr schwefelhaltige Moleküle, welche Schwefel in ionischer Form bereitstellen, wie beispielsweise Sulfat-Ionen, Sulfit-Ionen, Sulfonat-Ionen (z. B. p-Toluolsulfonsäure) und Ähnliches. Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten ein oder mehr acetathaltige Moleküle oder Kombinationen von einem oder mehr schwefelhaltigen Molekülen und einem oder mehr acetathaltigen Molekülen.
Die schwefelhaltigen Moleküle sollten derart in die Zusammensetzungen formuliert sein, dass bevorzugt eine Schwefelkonzentration in der Lösung von wenigstens 18 mM, bevorzugter eine Konzentration von wenigstens 19 mM, am bevorzugtesten eine Konzentration von wenigstens 20 mM bereitgestellt wird. Zu besonders bevorzugten Konzentrationsbereichen für Schwefel in den vorliegenden Zusammensetzungen zählen etwa 18 mM bis etwa 500 mM, etwa 18 mM bis etwa 150 mM, etwa 18 mM bis etwa 100 mM, etwa 18 mM bis etwa 75 mM, etwa 18 mM bis etwa 50 mM oder etwa 18 mM bis etwa 40 mM, am bevorzugtesten etwa 18 mM bis etwa 50 mM.
Die schwefelhaltigen Moleküle sind bevorzugt in den vorliegenden Zusammensetzungen in Form eines oder mehr Salze oder Puffer formuliert. Zu Beispielen für geeignete schwefelhaltige Salze gemäß der Erfindung zählen Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kaliumsulfat, Natriumsulfat und Ähnliches, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Am bevorzugtesten sind Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Mangansulfat. Zu Beispielen für geeignete schwefelhaltige Puffer gemäß der Erfindung zählen TRIS-sulfat und andere Puffer auf Schwefelsäure-Basis sowie Puffer auf Sulfonsäure-Basis, wie beispielsweise AMPSO (3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxy-propansulfonsäure), BES (N,N-bis[2-Hydoxyethyl]-2-aminomethansulfonsäure), MOPS (3-N-Morpholino)-propansulfonsäure), MOPSO (3-N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure), TES (2-{[tris-(Hydroxymethyl)-methyl]-amino}-ethansulfonsäure), HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), NEPPS (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonsäure), HEPPSO (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure), TAPS (TES(3-{[tris-(Hydroxymethyl)-methyl]amino}propansulfonsäure), CHES (2-(N-cyclo-Hexylamino)ethansulfonsäure), MES (2-N-Morpholino)ethansulfonsäure,) PIPES (Piperazin-N,N'-bis-2-ethansulfonsäure), POPSO (Piperazin-N,N'-bis[2-hydroxy]propansulfonsäure), TAPS (N-tris[Hydroxymethyl]methyl-3-aminopropansulfonsäure), TAPSO (3-[N-tris{Hydroxymethyl}methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure), ACES (N-2-Acetamid-2-aminoethansulfonsäure), DIPSO (3-[N,N-bis(2-Hydoxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure), CAPSO (3-[Cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure) und CAPS (3-[Cyclohexy(amino]propansulfonsäure). Weitere schwefelhaltige ionische Salze und Puffer und andere schwefelhaltige Moleküle, die für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet sind, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich.
Die acetathaltigen Moleküle sollten in den Zusammensetzungen bevorzugt derart formuliert sein, dass eine Konzentration an Acetat-Ionen in der Lösung von etwa 1 mM bis etwa 500 mM bereitgestellt wird. Zu besonders bevorzugten Konzentrationsbereichen für die Acetat-Ionen in den vorliegenden Zusammensetzungen zählen etwa 1 mM bis etwa 500 mM, etwa 5 mM bis etwa 250 mM, etwa 10 mM bis etwa 200 mM, etwa 25 mM bis etwa 150 mM, etwa 50 mM bis etwa 100 mM oder etwa 60 mM.
Die acetathaltigen Moleküle sind bevorzugt in den vorliegenden Zusammensetzungen in Form eines oder mehr Salze oder Puffer formuliert. Zu Beispielen für geeignete acetathaltige Salze gemäß der Erfindung zählen Ammoniumacetat, Magnesiumacetat, Manganacetat, Kaliumacetat, Natriumacetat und Ähnliches, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zu Beispielen für geeignete acetathaltige Puffer gemäß der Erfindung zählen TRIS-acetat (Tris[{hydroxymethyl}]aminomethan]acetat), ADA (N-[2-acetamido]-2-iminodiessigsäure) und Imidazolacetat (2-Hydroxy-3-[4-imidazolyl]propionsäure).
Erfindungsgemäß können ein oder mehr kaliumhaltige Moleküle in den vorliegenden Zusammensetzungen formuliert sein, um den Schwefel zu ersetzen und dadurch die erforderliche Konzentration für Schwefel herabzusetzen. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird durch die Zugabe von sowohl schwefelhaltigen Molekülen als auch kaliumhaltigen Molekülen die erforderliche Konzentration für Schwefel um etwa 13 bis 75 %, bevorzugt um etwa 25 bis 50 %, herabgesetzt. Beispielsweise kann, wenn kaliumhaltige Moleküle in die vorliegenden Zusammensetzungen formuliert sind, die Konzentration der schwefelhaltigen Moleküle von etwa 18 mM auf 2 bis 14 mM, bevorzugt auf etwa 4 bis 9 mM, reduziert werden. Selbstverständlich können das oder die Kalium-Ion(en) ebenso in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die ein oder mehr acetathaltige Moleküle anstelle von oder zusätzlich zu den ein oder mehr schwefelhaltigen Molekülen enthalten, verwendet werden.
Die kaliumhaltigen Moleküle sollten in die Zusammensetzungen mit einer bevorzugten Konzentration von wenigsten 2 mM, bevorzugt wenigstens 5 mM, noch bevorzugter wenigstens 10 mM, am bevorzugtesten wenigstens 20 mM, formuliert sein. Zu den besonders bevorzugten Konzentrationsbereichen der kaliumhaltigen Moleküle in den vorliegenden Zusammensetzungen zählen etwa 2 mM bis etwa 500 mM, etwa 2 mM bis etwa 200 mM, etwa 2 mM bis etwa 100 mM, etwa 2 mM bis etwa 75 mM, etwa 2 mM bis etwa 50 mM, etwa 2 mM bis etwa 40 mM, etwa 2 mM bis etwa 30 mM, etwa 2 mM bis etwa 20 mM und etwa 2 mM bis etwa 10 mM.
Die kaliumhaltigen Moleküle sind bevorzugt in die vorliegenden Zusammensetzungen in Form eines oder mehr Salze oder Puffer formuliert. Zu Beispielen für geeignete Kaliumsalze gemäß der Erfindung zählen Kaliumsulfat, Kaliumsulfit, Kaliumchlorid, Kaliumnitrat und Ähnliches, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Am bevorzugtesten sind Kaliumchlorid, Kaliumsulfat und Kaliumacetat. Zu den bevorzugten Kaliumpuffern gemäß der Erfindung zählen Kaliumphosphat (einbasisch), Kaliumphosphat (zweibasisch) und Ähnliches, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere Kaliumsalze und -puffer und andere kaliumhaltige Moleküle, die zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sind, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich.
Schwefelhaltige, acetathaltige oder kaliumhaltige Moleküle und Puffer, die zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sind, sind kommerziell von einer Vielzahl von Anbietern, beispielsweise von Sigma (St. Louis, Missouri), erhältlich.
Reverse-Transkriptase-Enzyme
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten außerdem Enzyme mit Reverse-Transkriptase-Aktivität. Erfindungsgemäß sind die Enzyme mit Reverse-Transkriptase-Aktivität reverse Transkriptasen aus dem murinen Moloney.-Leukämie-Virus (M-MLV). Bevorzugt weisen die in der Erfindung verwendeten Enzyme eine wesentlich reduzierte RNase-H-Aktivität auf. Unter einem Enzym mit "wesentlich reduzierter RNase-H-Aktivität" wird verstanden, dass das Enzym weniger als etwa 20 %, bevorzugter weniger als etwa 15 %, 10 % oder 5 %, am bevorzugtesten weniger als etwa 2 %, der RNase-H-Aktivität eines Wildtyp- oder RNase-H⁺-Enzyms, wie beispielsweise der reversen Transkriptase aus dem Wildtyp-M-MLV, aufweist. Die RNase-H-Aktivität kann durch verschiedene Assays, wie sie beispielsweise in dem U.S.-Patent Nr. 5,244,797, in Kotewicz, M. L. et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988) und in Gerard, G. F. et al., FOCUS 14(5):91 (1992), beschrieben sind, bestimmt werden.
Zu besonders bevorzugten Enzymen zählen beispielsweise die reverse Transkriptase aus dem M-MLV (RNase-H^- oder mit wesentlich reduzierter RNase-H-Aktivität) und RSV-Reverse-Transkriptase (RNase-H^- oder mit wesentlich reduzierter RNase-H-Aktivität). Die Enzyme mit Reverse-Transkriptase-Aktivität sind kommerziell erhältlich (z. B. SUPERSCRIPT^TM, SUPERSCRIPT II^TM und M-MLV, erhältlich von Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland).
DNA-Polymerasen
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen ebenso eine oder mehr DNA-Polymerasen, bei denen es sich bevorzugt um thermostabile DNA-Polymerasen handelt. Diese DNA-Polymerasen können aus natürlichen oder rekombinanten Quellen, durch Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, (siehe WO 92/06200, U.S. Patent Nr. 5,455,170 und 5,466,591, WO 96/10640 und U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/370,190, hinterlegt am 9. Januar 1995), aus verschiedenen kommerziell erhältlichen thermophilen Bakterien (z. B. aus der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) isoliert oder durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden (siehe z. B. WO 96/10640 und U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/370,190, hinterlegt am 9. Januar 1995). Für die Verwendung geeignete Quellen für die thermostabilen Polymerasen oder für deren Gene zur Expression in rekombinanten Systemen sind die thermophilen Bakterien Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woosii und andere Arten der Gattung Pyrococcus, Bacillus sterothermophilus, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum, Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus brockianus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritima und andere Arten der Gattung Thermotoga und Methanobacterium thermoautotrophicum und Mutanten, Varianten oder Derivate davon. Selbstverständlich können auch andere thermostabile DNA-Polymerasen aus anderen Organismen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne dass hierdurch der Gegenstand oder bevorzugte Ausführungsformen verlassen werden. Als Alternative zur Isolierung sind thermostabile DNA-Polymerasen beispielsweise von Life Technologis, Inc. (Rockville Maryland), New England BioLabs (Beverly, Massachusetts), Finnzymes Oy (Espoo, Finnland), Stratagene (La Jolla, California), Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Indiana) und Perkin Elmer Cetus (Norwalk, Conneticut) kommerziell erhältlich.
Zu besonders bevorzugten thermostabilen DNA-Polymerasen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren zählen Taq-, Tne-, Tma-, Tli/VENT^TM-, DEEPVENT^TM-, Pfu-, Pwo-, Tfi- oder Tth-DNA-Polymerasen oder Mutanten oder Derivate davon, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Taq-DNA-Polymerase ist beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland) kommerziell erhältlich oder kann aus ihrer natürlichen Quelle, dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, wie in der Literatur beschrieben, isoliert werden (U.S. Patente Nr. 4,889,818 und 4,965,188). Tne-DNA-Polymerase kann aus ihrer natürlichen Quelle, dem thermophilen Bakterium Thermotoga neapolitana isoliert werden (siehe WO 96/10640 und U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/370,190, hinterlegt am 9. Januar 1995); Tma-DNA-Polymerase kann aus ihrer natürlichen Quelle, dem thermophilen Bakterium Thermotoga maritima isoliert werden (siehe U.S. Patent Nr. 5,374,553). Verfahren zur Herstellung von Mutanten und Derivaten von thermophilen DNA-Polymerase, insbesondere von Tne- und Tma-Polymerasen, sind in der co-anhängigen U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/689,807 von Deb K. Chatterjee und in der co-anhängigen Patentanmeldungen Nr. 08/689,818 von Deb K. Chatterjee und A. John Hughes, beide hinterlegt am 6. September 1996, offenbart. Tfi, Tli/VENT^TM und DEEPVENT^TM sind kommerziell erhältlich (z. B. von New England BioLabs; Beverly Massachusetts) oder können wie in der Literatur beschrieben hergestellt werden (Bej, A.K. und Mahbubani, M.H. in: PCR Technology: Current Innovations, Griffin, H.G. and Griffin A.M., eds., CRC Press, pp. 219-237 (1994) für Tli/VENT^TM; Flaman, J.M. et al., Nucl. Acids Res. 22 (15):3259-3260 (1994) für DEEPVENT^TM). Die thermostabilen DNA-Polymersen werden bevorzugt zu den vorliegenden Zusammensetzungen mit einer Endkonzentration in Lösung von etwa 0,1 bis 200 Units/ml, etwa 0,1 bis 50 Units/ml, etwa 0,1 bis 40 Units/ml, etwa 0,1 bis 36 Units/ml, etwa 0,1 bis 34 Units/ml, etwa 0,1 bis 32 Units/ml, etwa 0,1 bis 30 Units/ml oder etwa 0,1 bis 20 Units/ml, am bevorzugtesten mit einer Konzentration von etwa 20 Units/ml, zugegeben.
Inhibition-reduzierende Reagenzien
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können gegebenenfalls ein oder mehr zusätzliche Inhibition-reduzierende Reagenzien zu den vorliegenden Zusammensetzungen gegeben werden, um dazu beizutragen, die Inhibition der RT-PCR-Reaktionen durch RTs, wie beispielsweise M-MLV-RT, zu verhindern. Zu bevorzugten Inhibition-reduzierenden Reagenzien zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen zählen Peptide, Polypeptide und Proteine, wie beispielsweise (aber nicht ausschließlich) Humanes Serum Albumin, Bovines Serum Albumin, Ovalbumin, Albumax, Casein, Gelatine, Kollagen, Globulin, Lysozym, Transferrin, Myoglobin, Hämoglobin, α-Lactalbumin, Fumarase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), Amyloglukosidase; Carbonanhydrase, β-Lactoglobulin, Aprotinin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Trypsinogen, Phosphorylase b, Myosin, Aktin, β-Galaktosidase, Katalase, tryptischer Soja-Verdau, Tryptose, Lektine und Ähnliches oder Fragmente oder Derivate davon. Besonders bevorzugt werden in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung bovines Serum Albumin, humanes Serum Albumin, Albumax und Casein verwendet. Die Peptide, Polypeptide oder Proteine werden den Zusammensetzungen bevorzugt derart zugegeben, dass eine Endkonzentration in der Lösung von etwa 0,01 bis etwa 100 μg/ml, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 100 μg/ml, bevorzugter etwa 1 bis etwa 50 μg/ml, am bevorzugtesten etwa 2 bis etwa 20 μg/ml, entsteht.
dNTPs
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten außerdem ein oder mehr Nukleotide (z. B. Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs)). Die Nukleotid-Komponenten der vorliegenden Zusammensetzungen dienen als "Bildungsblöcke" für neu synthetisierte Nukleinsäuren, wobei sie in diese durch die Wirkung der reversen Transkriptasen oder DNA-Polymerasen eingebaut werden. Zu Beispielen für Nukleotide, die in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden können, zählen dUTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dITP, 7-deza-dGTP, α-thio-dATP, α-thio-dTTP, α-thio-dGTP, α-thio-dCTP oder Derivate davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt; alle genannten Nukleotide sind beispielsweise von Life Technologies, Inc (Rockville, Maryland), New England BioLabs (Beverly, Massachusetts) und Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri) kommerziell erhältlich. Die dNTPs können unmarkiert sein, oder sie können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren durch Kupplung mit Radioisotopen (z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P oder ³⁵S), Vitaminen (z. B. Biotin), fluoreszierenden Gruppen (z. B. Fluoreszin, Rhodamin, Texas Red oder Phycoerythrin), chemilumineszierenden Markierungen, Dioxigenin und Ähnliches detektierbar markiert sein. Ebenso sind markierte dNTPs beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland) oder Sigma Chemical Company (Saint Louis, Missouri) kommerziell erhältlich. In den vorliegenden Zusammensetzungen werden die dNTPs derart zugegeben, dass eine Arbeitskonzentration für jedes dNTP von etwa 10 bis 1000 μM, etwa 10 bis 500 μM, etwa 10 bis 250 μM oder etwa 10 bis 100 μM, am bevorzugtesten eine Konzentration von etwa 100 μM, entsteht.
Primer
Zusätzlich zu den Nukleotiden enthalten die vorliegenden Zusammensetzungen ein oder mehr Primer, welche die Synthese eines ersten DNA- Moleküls, welches zu der gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist, vereinfachen (z. B. ein einzelsträngiges cDNA-Molekül). Derartige Primer können ebenso verwendet werden, um ein DNA-Molekül zu synthetisieren, welches komplementär zu dem gesamten ersten DNA-Molekül oder einem Teil davon ist, wodurch ein doppelsträngiges cDNA-Molekül gebildet wird. Außerdem können diese Primer bei der Amplifikation von Nukleinsäure-Molekülen gemäß der Erfindung verwendet werden. Zu derartigen Primern zählen Target-spezifische Primer (bei denen es sich bevorzugt um genspezifische Primer handelt), Oligo(dT)-Primer, Zufalls- (Random-) Primer oder arbiträre Primer, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere Primer, die zur Amplifikation von DNA-Molekülen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich.
RT-PCR-Verfahren
Bei der RT-PCR-Reaktion werden die Reaktionsmischungen bei einer Temperatur inkubiert, die ausreicht, um ein DNA-Molekül zu synthetisieren, das zu der gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist. Derartige Bedingungen liegen typischerweise in einem Bereich von etwa 20 °C bis 75 °C, bevorzugter von etwa 35 °C bis etwa 60 °C, am bevorzugtesten von etwa 45 °C bis etwa 55 °C. Nach der reversen Transkriptions-Reaktion wird die Reaktion bei einer Temperatur inkubiert, die ausreicht, um das synthetisierte DNA-Molekül zu amplifizieren. Bevorzugt wird die Amplifikation über eine oder mehr Polymerase-Kettenraktionen (PCRs) erreicht. Bevorzugte Bedingungen für die Amplifikation umfassen einen Thermozyklus, welcher abwechselndes Erwärmen und Abkühlen der Mischung umfassen kann, ausreichend, um das DNA-Molekül zu amplifizieren, und welcher am bevorzugtesten einen Wechsel zwischen einem ersten Temperaturbereich von etwa 90 °C bis 100 °C und einem zweiten Temperaturbereich von etwa 45 °C bis etwa 75 °C, bevorzugter von etwa 50 °C bis etwa 75 °C oder von etwa 55 °C bis etwa 75 °C, am bevorzugtesten von etwa 65 °C bis etwa 75 °C, umfasst. Erfindungsgemäß wird der Thermozyklus so oft wie gewünscht durchgeführt, bevorzugt etwa 5- bis etwa 80-mal, bevorzugter mehr als 10-mal und am bevorzugtesten mehr als 20-mal.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenso zur Herstellung, Analyse und Quantifizierung von großen Nukleinsäure- Molekülen verwendet werden (z. B. durch "lange PCR" oder "lange RT-PCR"); bevorzugt sind die Nukleinsäure-Moleküle größer als etwa 4 bis 8 kb (Kilobasen), bevorzugter größer als etwa 5 bis 7 kb, am bevorzugtesten sind Nukleinsäure-Moleküle mit einer Größe von mehr als etwa 7 kb. In dieser Ausführungsform der Erfindung können Kombinationen von DNA-Polymerasen, bevorzugt Mischungen aus einer oder mehr DNA-Polymerasen, denen die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt (d. h., eine "3'-Exo^-"-Polymerase) und einer oder mehr DNA-Polymerasen mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivitat (d. h., eine "3'-Exo⁺"-Polymerase) zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gegeben werden (siehe U.S.-Patent Nr. 5,436,149; s. auch die co-anhängige U.S.-Patentanmeldung Nr. 08/801,720 von Ayoub Rashtchian und Joseph Solus, hinterlegt am 14. Februar 1997, und die co-anhängige U.S.-Patentanmeldung von Ayoub Rashtchian und Joseph Solus mit dem Titel „Stable Compositions for Nucleic Acid Amplification and Sequencing", hinterlegt am 27. März 1998). Bevorzugte 3'-Exo^-- und 3'-Exo⁺-Polymerasen zur Verwendung in dieser Ausführungsform sind thermostabile 3'-Exo^-- und 3'-Exo⁺-Polymerasen. Zu besonders bevorzugten 3'-Exo^--Polymerasen zählen Taq-, Tne(exo^-)-, Tma(exo^-)-, VENT(exo^-)^TM-, DEEPVENT(exo^-)^TM-, Pfu(exo^-)- und Pwo(exo^-)-Polymerasen oder Mutanten, Varianten oder Derivate davon, sind aber nicht darauf beschränkt; sie werden bevorzugt zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit einer Konzentration in der Lösung von etwa 0,1 bis 200 Units/ml, etwa 0,1 bis 50 Units/ml, etwa 0,1 bis 40 Units/ml, etwa 0,1 bis 36 Units/ml, etwa 0,1 bis 34 Units/ml, etwa 0,1 bis 32 Units/ml, etwa 0,1 bis 30 Units/ml oder etwa 0,1 bis 20 Units/ml, am bevorzugtesten mit einer Konzentration von etwa 20 Units/ml, zugegeben. Zu besonders bevorzugten 3'-Exo⁺-Polymerasen zählen VENT^TM-, Pfu-, Pwo-, Tne-, Kod- und Tma-, am bevorzugtesten DEEPVENT^TM-DNA-Polymerasen, sind jedoch nicht darauf beschränkt; sie sollten zu den Mischungen in einer ausreichenden Menge zugegeben werden, so dass eine Endarbeitskonzentration von etwa 0,0002 bis 200 Units/ml, etwa 0,002 bis 100 Units/ml, etwa 0,002 bis 20 Units/ml, etwa 0,002 bis 2,0 Units/ml, etwa 0,002 bis etwa 1,6 Units/ml, etwa 0,002 bis 0,8 Units/ml, etwa 0,002 bis 0,4 Units/ml oder etwa 0,002 bis 0,2 Units/ml, am bevorzugtesten eine Konzentration von etwa 0,4 Units/ml, entsteht. Diese thermostabilen DNA-Polymerasen sind beispielsweise von Life Technologies, Inc. (Rockville Maryland), New England BioLabs (Beverly, Massachusetts), Finnzymes Oy (Espoo, Finnland), Stratagene (La Jolla, California), Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Indiana) und Perkin Elmer Cetus (Norwalk, Conneticut) kommerziell erhältlich. Die Verwendung der Mischungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und der 3'-exo^-- und 3'-Exo⁺-Polymerasen in den erfindungsgemäßen Verfahren führt zu einer verstärkten Detektions-Sensitivität und Ausbeute von großen RT-PCR-Produkten.
Für einen Fachmann auf dem betreffenden Gebiet ist es offensichtlich, dass weitere geeignete Modifikationen und Adaptationen bezüglich der hierin beschriebenen Verfahren und Anwendungen möglich sind und innerhalb des Gegenstands der Erfindung oder irgendeiner ihrer Ausführungsformen vorgenommen werden können. Nach der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird diese anhand der folgenden Beispiele, welche lediglich der Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken, besser verständlich.
Beispiel 1: Inhibition der RT-PCR durch RT
Um die Inhibition der RT-PCR-Amplifikation durch RT zu untersuchen, wurde CAT-RNA als Template verwendet. Die RT-PCR-Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl in PCR-Puffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl) oder ELONGASE-Puffer (60 mM Tris-SO₄ (pH 9,1), 18 mM (NH₄)₂SO₄; Gesamt-Schwefelkonzentration ungefähr 23 mM), enthaltend 20 Units M-MLV(H^-)RT, 1 mM Dithiothreitol (DTT), jeweils 0,2 mM Sense- und Antisense-Primer, 0,2 mM dNTPs, 1,25 mM MgCl₂, 2 Units Taq und verschiedene Mengen an CAT-mRNAs (0, 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ oder 10' Kopien/Reaktion), durchgeführt. Die RT-PCR-Bedingungen waren folgendermaßen: ein Zyklus bei 45 °C für 30 Minuten und bei 94 °C für 2 Minuten, anschließend 40 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden und bei 60 °C für 30 Sekunden und abschließend bei 72 °C für 5 Minuten.
Nach der Analyse der Amplifikation-Produkte durch 1,5%-ige Agarosegel-Elektrophorese (1) wurde eine signifikante Amplifikation der 500 by großen Zielsequenz bei Reaktionen beobachtet, die in ELONGASE-Puffer unter Verwendung von 10⁶ oder 10⁷ Kopien von CAT-mRNA-Template durchgeführt worden waren (1, Spuren 8 und 9). Im Gegensatz dazu wurde bei allen Template-Konzentrationen kein signifikantes PCR-Produkt bei den Reaktionen beobachtet, die in Standard-PCR-Puffer durchgeführt worden waren (1, Spuren 18, 19). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gegenwart von RT in den PCR-Reaktionsmischungen die Amplifikationsreaktion inhibiert, dass diese Inhibition jedoch wenigstens teilweise durch Verwendung des ELONGASE-Puffers aufgehoben wird.
Beispiel 2: Rolle von Schwefel bei der Reduzierung der RT-Inhibition bei der PCR-Amplifikation
Um zu bestimmen, ob die Sulfationen in dem ELONGASE-Puffer eine Schlüsselkomponente für die in Beispiel 1 beobachtete Reduzierung der RT-Inhibition sein könnten, wurden verschiedene Reaktionsparameter, wie beispielsweise der pH-Wert, die ionischen Bedingungen und die Pufferzusammensetzung, detailliert untersucht. Die RT-PCR Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl, enthaltend 1 mM DTT, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgSO₄, 0,2 mM der jeweiligen Sense- und Antisense-Primer des humanen β-Aktins, 1 pg HeLa-Gesamt-RNA-Template, 2 Units Taq-DNA-Polymerase und 10 Units M-MLV(H^-)RT in gepufferten Salzlösungen, welche verschiedene ionische und Pufferbedingungen aufwiesen, durchgeführt. Die RT-PCR-Bedingungen waren folgendermaßen: 30 Minuten bei 45 °C und 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen bestehend aus 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 90 Sekunden bei 68 °C, eine abschließende Extension für 5 Minuten bei 72 °C. Der Nachweis eines amplifizierten 1026 bp großen RT-PCR-Produkts aus 1 pg HeLa-Gesamt-RNA wurde als Amplifikationserfolg unter den spezifischen Reaktionsbedingungen gewertet.
Nach Analyse der 1026 by großen β-Aktin-RT-PCR-Produkte durch 1 %-ige Agarosegel-Elektrophorese wurden die in den Tabellen 1 bis 7 dargestellten Ergebnisse erhalten.
Tabelle 1: Zusammensetzungen, welche Tris-HCl (pH 8,5-9,3) enthielten, zeigten eine Sensitivität von etwa 1 pg HeLa-Gesamt-RNA, wenn 18 mM (NH₄)₂SOa vorlag. Diese erhöhte Sensitivität wurde jedoch über einen breiteren pH-Bereich erhalten (pH 7,8-9,3), wenn Tris-SO₄-Puffer anstelle von Tris-HCl verwendet wurde.
Tabelle 1. Optimaler pH-Wert in Tris-HCl- und Tris-SO₄-Puffern

¹Der pH-wert in der Tris-HCl-Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von HCl eingestellt. Somit war kein Schwefel an der pH-Einstellung beteiligt; die Schwefelkonzentration bei jedem getesteten pH-Wert betrug etwa 18 mM.
²Der pH-Wert in der Tris-SO₄-Reaktionsmischung wurde unter Verwendung von Schwefelsäure eingestellt. Somit wurde durch Zugabe der Schwefelsäure die Schwefelkonzentration ungefähr auf die angegebenen Werfe angehoben.

Tabelle 2: Um das 1026 by große RT-PCR-Produkt in Zusammensetzungen nachzuweisen, welche Tris-HCl-Puffer enthalten, war das Vorliegen von 20 mM (NH₄)₂SO₄ in den Zusammensetzungen essentiell. Wenn jedoch Tris-SO₄-Puffer (20-80 mM, pH 8,0-9,0) anstelle von Tris-HCl verwendet wurde, war die Gegenwart von (NHa)₂SO₄ nicht erforderlich.
Tabelle 3: Das Erfordernis für Schwefel beim sensitiven Nachweis des 1026 by großen RT-PCR-Produkts wurde durch Verwendung von Taurin (NH₂CH₂SO₃H), welches Schwefel-Ionen enthält, gezeigt. Durch das Taurin wurde die RT-vermittelte Inhibition der RT-PCR etwa genauso wie durch das Ammoniumsulfat reduziert.
Tabelle 3: Erfordernis für Schwefel
Tabelle 4: Die erhöhte Nachweisempfindlichkeit des Tris-SO₄-Puffersystems, welche aus Tabelle 2 hervorgeht (60 mM, pH 8,5-9,0), konnte durch die Zugabe von 20-40 mM KCl weiter verstärkt werden, was zeigt, dass die kaliumhaltigen Moleküle nicht nur geeignete Substituenten für die schwefelhaltigen Moleküle in den vorliegenden Zusammensetzungen sind, sondern auch selbst die Sensitivität der RT-PCR-Reaktion verstärken können.
Tabelle 5: Ähnliche Nachweisempfindlichkeit und weitere Verstärkung durch Zugabe von KCl wurde in dem Tris-Taurin-Puffersystem erhalten.
Tabelle 6: Durch die Zugabe von NH₄Cl anstelle von (NH₄)₂SO₄ in die vorliegenden Zusammensetzungen wurde die RT-vermittelte Inhibition der RT-PCR nicht reduziert, was zeigt, dass schwefelhaltige Moleküle Schlüsselkomponenten für die Reduzierung der RT-Inhibition bei der RT-PCR sind.
Tabelle 6. Erfordernis für Schwefel
Tabelle 7: Das Erfordernis für Schwefel-Ionen zur Reduzierung der RT-vermittelten Inhibition der PCR war in Tris-Acetat-Puffer-Systemem weniger stringent als in Tris-Sulfat-Puffer-Systemen. In dem Tris-Acetat-Puffer-System konnten die RT-PCR-Produkte von 1026 by Größe auch in Abwesenheit von Schwefel-Ionen beobachtet werden.
Tabelle 7. Erfordernis für Schwefel und Wirkung der Puffer
Beispiel 3: Die Rolle von Bovinem Serum-Albumin (BSA) bei der RT-PCR
Um zu untersuchen, ob andere Reaktionskomponenten die RT-vermittelte Inhibition der RT-PCR reduzieren können, wurde BSA zu den vorliegenden Zusammensetzungen gegeben. Die Zusammensetzungen wurden derart formuliert, dass sie ansteigende Mengen an M-MLV(H^-)RT (von 10 Units bis 260 Units) und verschiedene Mengen BSA enthielten, und diese Zusammensetzungen in den RT-PCR-Reaktionen verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 50 μl, enthaltend 60 mM Tris-SO₄ (pH 9,1), 18 mM (NH₄)₂SO₄, 0,2 mM dNTPs, 1,2 mM MgSO₄, 0,02 mM DTT, jeweils 0,2 mM den jeweiligen Sense- und Antisense-Primern der humanen β-Aktin-CAT-mRNA, 2 Units Taq-DNA-Polymerase und 100 pg HeLa-Gesamt-RNA-Template, zur Amplifikation von β-Aktin, oder 10⁵ Kopien HeLa-Gesamt-RNA-Template zur CAT-Amplifikation, durchgeführt. Die RT-PCR-Bedingungen umfassten 30 Minuten bei 45 °C und 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen, bestehend aus 15 Sekunden bei 94 °C/30 Sekunden bei 55 °C/90 Sekunden bei 68 °C, und eine abschließende Extension von 5 Minuten bei 72 °C.
Nach Analyse der 1026 by großen β-Aktin-RT-PCR-Produkte durch 1 %-ige Agarosegel-Elektrophorese (2A) wurde keine RT-Inhibition mit 10 Units RT beobachtet; durch ansteigende Mengen an RT (135 Units bis 260 Units) wurde die RT-PCR jedoch vollständig inhibiert. Jedoch wurde diese RT-Inhibition durch die Zugabe von 200 bis 1000 ng BSA pro Reaktion (d. h., einer BSA-Endkonzentration von etwa 4-20 μg/ml) reduziert. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse der 653 by großen CAT-RT-PCR-Produkte (2B) erhalten, wo nur eine leicht erhöhte Menge an BSA (300-1000 ng pro Reaktion, d. h., eine BSA-Endkonzentration von etwa 6-20 μg/ml) erforderlich war, um die RT-Inhibition zu reduzieren. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass das Einbringen von Proteinen, wie beispielsweise BSA, in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen dazu beiträgt, die durch RT verursachte Inhibition der RT-PCR zu beheben.
Beispiel 4: Leistungsfähigkeit von M-MLV, AMV, M-MLV(H^-) in der RT-PCR in schwefel- und BSA-haltigen Puffern
Um die Leistungsfähigkeit verschiedener RTs bei der RT-PCR zu untersuchen, wurden AMV-RT, M-MLV-RT, und M-MLV(H^-)-RT in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet. Die RT-PCR-Reaktionen für M-MLV-RT und M-MLV(H^-)-RT (SUPEERSCRIPT II) wurden in einem Endvolumen von 50 μl, enthaltend 60 mM Tris-SO₄ (pH 9,1), 18 mM (NH₄)₂SO₄, 0,2 mM dNTPs, 250 ng BSA, 1,0 mM DTT, jeweils 0,2 mM der jeweiligen Sense- und Antisense-CAT-Primer, 2 Units Taq-DNA-Polymerase, 1,5 mM MgSO₄ und verschiedene Mengen CAT-RNA-Template (0, 10³, 10⁴ oder 10⁵ Kopien/Reaktion), durchgeführt. Die AMV-RT-enthaltenden Zusammensetzungen waren die gleichen, mit dem Unterschied, dass sie kein BSA enthielten. Für jede Reaktion wurden jeweils 5 Units AMV-RT, M-MLV-RT oder M-MLV(H^-)-RT verwendet. Der RT-PCR-Zyklus bestand aus 30 Minuten bei 45 °C und 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen, bestehend aus 15 Sekunden bei 94 °C und 30 Sekunden bei 60 °C, und einer abschließenden Extension über 5 Minuten bei 72 °C.
Wie in 3 dargestellt, zeigte die Analyse der 500 by großen CAT-RT-PCR-Produkte durch 1,5%-ige Agarosegel-Elektrophorese, dass die mit AMV-RT, M-MLV-RT und M-MLV(H^-)-RT durchgeführten Reaktionen effiziente und sensitive RT-PCR-Produktausbeuten ergaben, wobei unter keiner der Reaktionsbedingungen eine Inhibition der RT-PCR-Reaktionen festgestellt wurde.
Beispiel 5: RT-PCR-Amplifikation von langen Nukleinsäure-Templates
Nachdem die Einfachheit und Sensitivität der vorliegenden Verfahren bei der RT-PCR-Amplifikation von Templates bis zu einer Größe von 3,5 kb gezeigt worden war, wurde die Wirksamkeit der Erfindung bei der Amplifikation von mRNA bis zu einer Größe von 8,9 kb untersucht.
HeLa-Gesamt-RNA wurde mit TRIzol^®-Reagenz (Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) isoliert und wie oben amplifiziert. Um mögliche Temperatur-Effekte zu untersuchen, wurden identische Reaktionen zusammengenommen und bei 45 °C bis 55 °C in Doppelbestimmungen inkubiert. Die verwendete HeLa-Gesamt-RNA variierte von 1 ng bis 100 ng, in Abhängigkeit der Verfügbarkeit der mRNA. Nach 30-minütiger RT-Inkubation wurden die Reaktionen 2 Minuten bei 94 °C inkubiert; danach wurden 40 Zyklen, bestehend aus 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 60 Sekunden bei 68 °C, und eine abschließende Extension über 5 Minuten bei 68 °C durchgeführt.
Für größere RT-PCR-Produkte wurde die Magnesium-Konzentration von dem 1,5-mM-Standard auf 1,8 mM erhöht und 1 μl ELONGASE-Enzym-Mix (Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland) zu jeder Reaktion gegeben. Die 50 μl Endreaktionsmischung bestanden aus 1 X ELONGASE-Puffer mit 1,8 mM MgSO₄ und anderen Salzen, 200 μM der jeweiligen dNTPs, 2 μg/ml BSA, 0,2 μg der Primer (GIBCO BRL Custom Primers, Life Technologies, Inc, Rockville, Maryland), 100 ng HeLa-Gesamt-RNA, 1 μl RT/Taq-Enzym-Mix und 1 μl ELONGASE-Enzym-Mix. Für die Experimente, in denen die gleichen Templates oder Primer verwendet wurden, wurde eine Stammmischung aus Puffer, Enzymmischungen und Primer oder Template hergestellt, um die Übereinstimmung zu gewährleisten. Die Proben wurden 30 Minuten bei 50 °C und anschließend 2 Minuten bei 94 °C inkubiert. Die Amplifikation wurde über 40 Zyklen, bestehend aus 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 58 °C und 6 bis 9 Minuten (1 Minute/kb) bei 68 °C, durchgeführt. Die RT-PCR-Produkte wurden aufgelöst und auf 0,8- oder 1,0%-igen (w/v) Agarose-TAE-Gelen, enthaltend Ethiduimbromid, sichtbar gemacht.
Temperatur der RT-Reaktion. Die SUPEERSCRIPT-II-RT wies verbesserte Temperatur-Stabilität im Vergleich zu M-MLV-RT auf (Gerard, G., et al. FOCUS 14:91 (1992)). Um die Auswirkung der Temperatur auf die RT-PCR-Produkte zu untersuchen, wurden 36 Primer-Sets (repräsentativ für verschiedene Gene aus dem Menschen, der Ratte, Pflanzen und einem In-vitro-Transkript) untersucht. Wie in 4 dargestellt, wurde bei 45 °C für viele der untersuchten Fragmente eine beträchtliche Produktausbeute und Spezifität beobachtet; eine erhöhte Inkubations-Temperatur führte nicht zu erhöhter Ausbeute oder Spezifität. Dieses Ergebnis war jedoch abhängig von den spezifischen ausgewählten Templates und Primern (5): Bei einigen Template-Primer-Kombinationen verschwand das Verschmieren von Banden, welche durch "Mispriming" verursacht wurde, das charakteristisch für RT-Reaktionen ist, die bei 45 °C durchgeführt werden, mit ansteigender Temperatur (5; Spuren 1-6), während in einigen Fällen ein signifikanter Anstieg der Produktausbeute beobachtet wurde, wenn die RT-Reaktionen bei erhöhten Temperaturen durchgeführt wurden (5; Spuren 7-12).
Lange RT-PCR-Produkte. Zur Untersuchung von kodierenden Sequenzen voller Länge oder zur Amplifikation von langen RNA-Segmenten wurde die Eignung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, supplementiert mit ELONGASE-Enzym-Mix, getestet. Wie in 6 dargestellt, konnte durch das vorliegende System und den Kit von Zulieferer A ein 2,8 kb großes Produkt aus 100 ng, nicht jedoch aus 10 ng, Gesamt-RNA amplifiziert werden. Durch Zugabe von ELONGASE-Enzym-Mix zu dem vorliegenden System wurde nicht nur die Produktausbeute mit 100 ng Gesamt-RNA erhöht, sondern ebenso die Sensitivität, wodurch eine Amplifikation von langen Templates aus 10 ng Gesamt-RNA ermöglicht wird (6; Spuren 7-12). Im Gegensatz dazu war es mit dem Kit von Zulieferer A nicht möglich, das 2,8 kb große Zielmolekül (Target) aus 10 ng Gesamt-RNA zu amplifizieren (6; Spuren 13-18), obwohl er einen Polymerase-Enzym-Mix enthielt, der für lange Templates bestimmt ist.
Es stellte sich heraus, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren ebenso zur Amplifikation von großen (>3-5 kb) RT-PCR-Produkten geeignet sind. Wie in 7 dargestellt, produzierten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, wenn sie mit ELONGASE-Enzym-Mix supplementiert waren, RT-PCR-Produkte bis zu einer Größe von 8,9 kb. Die Leiter von Banden, die bei der Amplifikation mit diesen Zusammensetzungen beobachtet wird, ist für eine lange RT-PCR nicht ungewöhnlich, und die Variationen der Produktausbeuten könnten teilweise auf die Verwendung verschiedener Primer-Sets zurückzuführen sein. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von ELONGASE-Enzym-Mix zu den vorliegenden Zusammensetzungen es ermöglicht, lange und seltene mRNAs direkt von Gesamt-RNA-Präparationen durch die erfindungsgemäßen Verfahren zu amplifizieren. Des weiteren kann die Thermostabilität von SUPEERSCRIPT-II-RT, welche RT-Reaktionen bei Temperaturen von bis zu 55 °C erleichtert, die Spezifität und Produktausbeute für einige Template- und Primer-Sets erhöhen.
Nachdem nunmehr die vorliegende Erfindung zum Zweck des besseren Verständnisses detailliert anhand der Ausführungen und Beispiele beschrieben wurde, ist es für einen Fachmann auf dem betreffenden Gebiet offensichtlich, dass die Erfindung innerhalb eines breiten und äquivalenten Bereichs von Bedingungen, Formulierungen und anderer Parameter modifiziert oder geändert werden kann, ohne dass dadurch der Umfang der Erfindung oder irgend einer ihrer spezifischen Ausführungsformen beeinflusst wird, und dass derartige Modifikationen oder Änderungen innerhalb des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche liegen.

Claims

Verfahren zur Amplifikation eines Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Mischen einer Template-RNA mit einer Zusammensetzung, die eine reverse Transkriptase aus dem murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV) umfasst, eine oder mehr DNA-Polymerase(n) und ein oder mehr schwefelhaltige(s) Molekül(e), welche(s) Schwefel in ionischer Form bereitstellt/bereitstellen, wobei die Schwefelkonzentration in dieser Zusammensetzung mindestens 18 mM beträgt, und (b) Inkubieren dieser Mischung unter Bedingungen, die genügen, um ein DNA-Molekül zu amplifizieren, welches zur gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein oder mehr acetathaltige(s) Molekül(e) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerasen eine erste DNA-Polymerase umfassen, die eine 3'-Exonuklease-Aktivität aufweist, und eine zweite DNA-Polymerase, die eine wesentlich reduzierte 3'-Exonuklease-Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verhältnis der Einheiten („units") von reverser Transkriptase zu DNA-Polymerasen von etwa 0,2:2 bis etwa 500:2 reicht.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Verhältnis von etwa 0,5:2 bis etwa 250:2 reicht.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Verhältnis größer ist als 3:2.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schwefelkonzentration mindestens 19 mM beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schwefelkonzentration etwa 20 mM bis etwa 50 mM beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schwefelquelle ein schwefelhaltiger Puffer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schwefelquelle ein schwefelhaltiges Salz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der schwefelhaltige Puffer ein TRIS-sulfat (Tris[(hydroxymethyl)]aminomethan]sulfat) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das schwefelhaltige Salz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Mangansulfat.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Konzentration des acetathaltigen Moleküls bei etwa 60 mM liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das acetathaltige Molekül ein acetathaltiges Salz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das acetathaltige Molekül ein acetathaltiger Puffer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das acetathaltige Salz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumacetat, Magnesiumacetat, Manganacetat, Natriumacetat und Kaliumacetat.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der acetathaltige Puffer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus TRIS-acetat (Tris[(hydroxymethyl)]aminomethan]acetat), ADA (N-[2-Acetamido]-2-iminodiessigsäure)], und Imidazolacetat (2-Hydroxy-3-[4-imidazolyl]propionsäure).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mischung zusätzlich ein oder mehr Nukleotide umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Nukleotide Deoxyribonukleosidtriphosphate oder Derivate davon, oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate oder Derivate davon sind.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Deoxyribonukleosidtriphosphate ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus dATP, dUTP, dTTP, dGTP und dCTP.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mischung zusätzlich einen oder mehr Oligonukleotidprimer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei der Primer ein Oligo (dT) Primer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei der Primer ein Zielrnolekülspezifischer Primer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei der Primer ein Gen-spezifischer Primer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die reverse Transkriptase eine wesentlich reduzierte Rnase-H-Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerasen thermostabile DNA-Polymerasen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die thermostabilen DNA-Polymerasen ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Tne, Tma, Tag, Pfu, Tth, Tfi; VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl, und Mutanten, Varianten und Derivaten davon.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die DNA-Polymerase, die eine 3'-Exonuklease-Aktivität aufweist, ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Pfu, Pwo, DEEPVENT, VENT, Tne, Tma, Kod, und Mutanten, Varianten und Derivaten davon.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die DNA-Polymerase, die eine wesentlich reduzierte 3'-Exonuklease-Aaktivität aufweist, ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Taq, Tfl, Tth, und Mutanten, Varianten und Derivaten davon.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Inkubationsschritt (b) folgende Schritte umfasst: (a) Inkubieren der Mischung bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, die genügen, um ein DNA-Molekül zu der gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär zu machen; und (b) Inkubieren des DNA-Moleküls, welches zu der Template-RNA komplementär ist, bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, die genügen, um das DNA-Molekül zu amplifizieren.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei der erste Schritt das Inkubieren der Mischung bei einer Temperatur von etwa 35°C bis etwa 60°C umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei der zweite Schritt einen thermozyklischen Schritt („Thermocycling") umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei der thermozyklische Schritt ein abwechselndes Erwärmen und Abkühlen der Mischung umfasst, welches genügt, um das DNA-Molekül zu amplifizieren.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei der thermozyklische Schritt den Wechsel zwischen einem ersten Temperaturbereich von etwa 90 °C bis etwa 100 °C und einem zweiten Temperaturbereich von etwa 45 °C bis etwa 75 °C umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei der zweite Temperaturbereich von etwa 65 °C bis etwa 75 °C reicht.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei der thermozyklische Schritt häufiger als 10 mal durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei der thermozyklische Schritt häufiger als 20 mal durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die reverse Transkriptase SuperScript I oder SuperScript II ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Amplifikation nicht inhibiert wird.
Verfahren zum Amplifizieren eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend folgende Schritte: (a) Mischen einer Template-RNA mit einer Zusammensetzung, umfassend eine reverse Transkriptase des murinen Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), eine oder mehr DNA-Polymerase(n), ein oder mehr schwefelhaltige(s) Molekül(e), welche(s) Schwefel in ionischer Form bereitstelldbereitstellen, und ein oder mehr Kalium-haltige(s) Molekül(e); und (b) Inkubieren dieser Mischung unter Bedingungen, die genügen, um ein DNA-Molekül zu amplifizieren, welches zur gesamten Template-RNA oder einem Teil davon komplementär ist.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei die Zusammensetzung zusätzlich ein oder mehr acetathaltige(s) Molekül(e) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei die reverse Transkriptase eine wesentlich reduzierte Rnase-H-Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei die DNA-Polymerasen ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Tne, Tma, Taq, Pfu, Tth, Tfi; VENT, DEEPVENT, Pwo, Tfl, und Mutanten, Varianten und Derivaten davon.
Zusammensetzung, umfassend eine reverse Transkriptase aus murinem Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), eine oder mehr DNA-Polymerase(n) und ein oder mehr schwefelhaltige(s) Molekül(e), welche(s) Schwefel in ionischer Form bereitstellt/bereitstellen, wobei die Schwefelkonzentration in dieser Zusammensetzung mindestens 18 mM beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 45, weiterhin umfassend ein oder mehr acetathaltige(s) Molekül(e).
Zusammensetzung gemäß Anspruch 46, wobei die Konzentration des einen oder von mehr acetathaltigen Moleküls/Molekülen etwa 1 mM bis etwa 500 mM beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 47, wobei die Konzentration des einen oder von mehr acetathaltigen Moleküls/Molekülen bei etwa 60 mM liegt.
Zusammensetzung, umfassend eine reverse Transkriptase aus murinem Moloney-Leukämie-Virus (M-MLV), eine oder mehr DNA-Polymerase(n), ein oder mehr schwefelhaltige(s) Molekül(e), welche(s) Schwefel in ionischer Form bereitstellt/bereitstellen, und ein oder mehr Kalium-haltige(s) Molekül(e).
Zusammensetzung gemäß Anspruch 49, zusätzlich umfassend ein oder mehr acetathaltige(s) Molekül(e).