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DE69800595T2 - Vorrichtung zur durchführung eines tests, verwendung einer membran zur herstellung dieser vorrichtung, kit mit dieser vorrichtung und analyseverfahren unter verwendung dieses gerätes. - Google Patents

Vorrichtung zur durchführung eines tests, verwendung einer membran zur herstellung dieser vorrichtung, kit mit dieser vorrichtung und analyseverfahren unter verwendung dieses gerätes.

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Publication number
DE69800595T2
DE69800595T2 DE69800595T DE69800595T DE69800595T2 DE 69800595 T2 DE69800595 T2 DE 69800595T2 DE 69800595 T DE69800595 T DE 69800595T DE 69800595 T DE69800595 T DE 69800595T DE 69800595 T2 DE69800595 T2 DE 69800595T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
binding
binding substance
substrate
analyte
channels
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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Application number
DE69800595T
Other languages
English (en)
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DE69800595D1 (de
Inventor
Johannes Kreuwel
Sibolt Van Damme
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PamGene BV
Original Assignee
PamGene BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PamGene BV filed Critical PamGene BV
Publication of DE69800595D1 publication Critical patent/DE69800595D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69800595T2 publication Critical patent/DE69800595T2/de
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines Assays, wobei die Vorrichtung ein Substrat mit durchgehenden ausgerichteten Kanälen umfaßt, die genannten Kanäle sich zu einer Oberfläche hin zum Auftragen von Proben öffnen, die Kanäle zumindest in einem Bereich der Oberfläche zum Auftragen von Proben mit einer ersten bindenden Substanz ausgestattet sind, die fähig ist einen Analyten zu binden.
  • Solch eine Vorrichtung ist in der WO95/11755 für Anwendungen "zum Sequenzieren durch Hybridisierung" offenbart. Die Vorrichtung umfaßt ein mit Kanälen versehenes Substrat, worin die Kanäle im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Substrats angeordnet sind. Drei Typen von Substraten werden offenbart. Der erste Typ umfaßt eine Vielzahl von hohlen Glasfasern. Er wird durch Aufeinanderstapeln von Glasfasern mit einem ätzbaren Kern, durch Versehen des Stapels mit flachen Enden, Polieren dieser Enden und Ätzen des Kerns, gewöhnlich mit Säure, hergestellt. Der zweite Substrat-Typ wird durch elektrochemisches Ätzen von einem kristallinen Silikonwafer hergestellt. Zuerst wird sowohl die Position der Kanäle als auch ihre Größe unter Verwendung standardisierter photolithographischer Verfahren definiert. Anschließend werden die ausgerichteten Kanäle elektrochemisch gebildet. Der dritte Substrat-Typ wird durch nukleares Spurätzen eines anorganischen Substrats hergestellt. Dieses Verfahren, welches die Schritte des Aussetzens des Substrats von schweren, energiegeladenen Partikeln und Naßätzen umfaßt, resultiert in einem Substrat mit zufällig über die Oberfläche des Substrats verteilten Kanälen. Mit höheren Porendichten und Porosität besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit der Fusion von Kanälen, die einen reduzierten Fließwiderstand im Vergleich zu anderen, nichtfusionierten Kanälen aufweisen.
  • Alle drei Substrat-Typen sind aufgrund ihres arbeitsintensiven Herstellungsverfahrens und/oder teuren Ausgangsmaterialien und aufwendigen Verfahren wie Sägen und Polieren und/oder teurer Ausrüstung ziemlich teuer. Außerdem zeichnen sich die Substrate durch eine verhältnismäßig niedrige Porosität von 30% und weniger aus. Vorteilhafter sollen hohe Porositäten bis zu 80% erzielbar sein, jedoch mit nur niedrige Kanaldichten, was den Nachteil mit sich bringt, dass der wirksame Oberflächenbereich der Kanäle eines bestimmten Bereichs des Substrats im Vergleich mit einem Substrat niedriger ist, das eine vergleichbare Porosität, jedoch mit höheren Kanaldichten (und folglich engeren Kanälen) aufweist. Ein weitere Nachteil der auf Silikon basierenden Substrate wie in der WO95/11755 offenbart, ist, dass sie nicht lichtdurchlässig sind. Diese Substrate lassen daher die vorteilhafte Verwendung von optischen Markierungssystemen zum Nachweis eines an das Substrat gebundenen Analyten nicht zu. Beliebte optische Markierungssysteme basieren zum Beispiel auf enzymatisch induzierten Farbreaktionen, auf Bio- oder Chemiluminiszenz oder auf Photoluminiszenz. Im letztgenannten Fall muss sowohl das erregende Licht als auch das emittierte luminiszente Licht das Substratmaterial passieren.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die obengenannten Nachteile zu beseitigen und ein Substrat zur Verfügung zu stellen, das sowohl eine hohe Kanaldichte als auch eine hohe Porosität aufweist, was noch höhere Dichteanordnungen erlaubt, die verschiedene erste Bindungssubstanzen pro Oberflächeneinheit zum Auftragen der Proben umfassen. Außerdem ist das Substrat für sichtbares Licht hochdurchlässig. Es ist insbesondere ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die ein verhältnismäßig billiges Substrat umfaßt, das die Anwendung jeglicher typischer Mikrofabrikationstechnologie entbehrlich macht und das eine verbesserte Kontrolle der Flüssigkeitsverteilung über die Oberfläche des Substrats bietet.
  • Die obengenannten Gegenstände werden mit einer Vorrichtung erreicht, in der das poröse Substrat eine elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembran ist.
  • Metalloxidmembranen mit durchgehenden, ausgerichteten Kanälen können kostengünstig durch elektrochemisches Ätzen eines Metallblatts hergestellt werden. Als Metalle werden unter anderen sowohl Tantal, Titan und Aluminium als auch Verbindungen von zwei oder mehr Metallen und dopierte Metalle und Metallverbindungen betrachtet. Die Metalloxidmembranen sind durchsichtig, insbesondere im nassen Zustand, was die Durchführung von Assays unter Verwendung verschiedener optischer Techniken erlaubt. Solche Membranen haben ausgerichtete Kanäle mit gut kontrolliertem Durchmesser und vorteilhafte chemische Oberflächeneigenschaften.
  • Die Erfindung stellt daher eine Vorrichtung zum Durchführen eines Assays zur Verfügung, wobei die Vorrichtung ein Substrat mit ausgerichteten durchgehenden Kanälen umfaßt, die genannten Kanäle sich zu einer Oberfläche hin zum Auftragen von Proben öffnet, die Kanäle mindestens in einem Bereich der Oberfläche zum Auftragen der Proben mit einer ersten bindenden Substanz ausgestattet sind, die in der Lage ist an einen Analyten zu binden, worin das Substrat eine elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembran ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Bindungssubstanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsäuremarker, einem Antikörper, einem Antigen, einem Rezeptor, einem Hapten und einem Liganden für einen Rezeptor. Assays, in welchen die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, können Sequenzieren durch Hybridisierung, Immunoassays, Rezeptor/Liganden-Assays und ähnliche einschließen.
  • Wenn die Vorrichtung als Werkzeug zum Erhalt von DNA- Sequenzinformation verwendet wird, wird eine ganze Reihe von Bereichen zur Verfügung gestellt, wobei jeder Bereich als eine erste Bindungssubstanz einen Oligonukleotidmarker mit einer unterschiedlichen Basenpaarsequenz umfaßt. Wenn eine Probe, die DNA- oder RNA-Fragmente mit einer(teilweise) unbekannten Sequenz enthält, in Kontakt mit dem Substrat gebracht wird, kann ein spezifischen Hybridisierungsmuster auftreten, von dem die Sequenzinformation der DNA/RNA abgeleitet werden kann. Solche "Sequenzieren durch Hybridisierungs"-Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt (Siehe z. B. Fodor, S. P. A. et al. (1992), Science 251, 767-773 und Southern, E. M. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1368-1373).
  • Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um eine biologische Probe, wie beispielsweise Blut, auf eine große Zahl von Analyten hin zu untersuchen. Die Reihe kann aus Bereichen bestehen, die Oligonukleotidmarker umfassen, die zum Beispiel für E. coli, S. aureus, S. pneumonia etc. spezifisch sind. Ein biologische Probe kann wie in der EP 0.389.063 beschrieben, hergestellt werden. Wenn diese Probe in Kontakt mit dem Substrat gebracht wird, kann das resultierende Hybridisierungsmuster zum Beispiel unter Verwendung einer CCD-Kamera in Kombination mit einem geeigneten optischen Marker gelesen werden.
  • Außer für das Screenen von Bakterien ist die Vorrichtung zum Nachweis von Viren und der Klassifizierung verschiedener Subtypen von zum Beispiel HIV- und HCV-Viren etc. geeignet. Virusklassifikation kann wichtig sein, um eine potentielle Medikamentenresistenz zu bestimmen. Im allgemeinen erfordert dies die Fähigkeit einzelne Punktmutationen in der Virus-RNA zu bestimmen.
  • Die Vorrichtung ist ebenfalls zur Durchführung von Sandwich- Immunoassays geeignet. In diesem Fall wird bevorzugt, dass ein zweiter Antikörper zum Binden an den gebundenen Analyten verwendet wird, wobei der genannte zweite Antikörper für jeden der Analyten von einem dritten markierten Antikörper erkannt wird. Dies kann erreicht werden, indem die zweiten und dritten Antikörper von verschiedenen Spezies stammen und der dritte Antikörper gegen Antikörper der anderen Spezies gerichtet ist. Auf diese Weise wird vermieden, dass der zweite Antikörper für jeden einzelnen Analyten markiert wird.
  • Die Vorrichtung ist ebenfalls geeignet "pepscans" durchzuführen, wie in Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984) offenbart wird. In diesem Fall bestehen die ersten Bindungssubstanzen, die an die verschiedenen Bereiche des Substrats gebunden sind, aus verschiedenen Aminosäuresequenzen. Wenn das Substrat mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, die einen bestimmten Analyten enthält, kann ein Reaktionsmuster auftreten, das die spezifische Affinität des Analyten für verschiedene Aminosäuresequenzen repräsentiert.
  • Es wird bevorzugt, dass die erste Bindungssubstanz kovalent an das Substrat gebunden ist.
  • Dies verringert den Verlust der ersten Bindungssubstanz vom Substrat. Kovalente Bindung einer organischen Verbindung an ein Metalloxid ist im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel die von Chu, C. W, et al., (J. Adhesion Aci. Technol., 7, S. 47-433, 1993) und Fadda, M. B. et al., (Biotchnology and Applied Biochemistry, 16, S. 221-227, 1992) Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Membran ein Aluminiumoxid.
  • Solch eine Membran aus Aluminiumoxid scheint durchgehende Kanäle zu haben, die hydrophil im Vergleich zur Oberfläche der Membran sind. Daher tritt vorteilhafterweise eine hydrophile Flüssigkeit in die Kanäle ein, anstatt sich über die Oberfläche der Membran auszubreiten. Daher können Aluminiumoxidmembranen hohe Dichten in Bereichen beherbergen, die verschiedene erste Bindungssubstanzen umfassen. Aluminiumoxidmembranen mit durchgehenden Kanälen werden von Rigby, W. R, et al. (Trans. Inst. Metal Finish., 68 (3), S. 95, 1990) offenbart und werden von Anotec Separation Ltd., Oxon, GB vermarktet. Diese Membranen wurden verwendet, um Viren zu reinigen und Enzyme für Sensorzwecke aufzubewahren, jedoch gab es keinen Hinweis in Bezug auf ihre Eignung als Substrate zur Durchführung von auf Markern basierenden Assays.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Bindungssubstanz in situ synthetisiert.
  • Zum Beispiel, unter Verwendung einer nur limitierten Anzahl von Reagenzien für eine Vorrichtung, die ein Oligonukleotid als die erste Bindungssubstanz umfaßt, können gewöhnlich vier Nukleotidverbindungen (dA, dT, dC und dG für DNA, A, U, C und T für RNA) und zusätzliche Reagenzien wie blockierende Reagenzien und Schutzgruppen verwendet werden, um ein Substrat mit einer oder einer Anordnung einer Vielzahl von Bereichen mit Oligonukleotidmarkern zu versehen.
  • Reagenzien können einfach auf die durchgehenden Kanäle in einem bestimmten Bereich unter Verwendung der Ink-Jet- Technologie aufgetragen werden. Die Ink-Jet-Technologie erlaubt eine genaue Plazierung eines definierten Volumens einer Flüssigkeit. In situ-Synthese eines Oligonukleotidmarkers auf einem flachen nicht-porösen Substrat ist im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. T. P. Theriault: DNA diagnostic systems based on novel Chem-Jet technologies, IBC Conference on Biochip Array Technologies, Washington D. C., 10. Mai 1995).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleotidverbindungen unter Verwendung elektrostatischer Anziehung aufgetragen. Elektrostatische Anziehung vermindert das Risiko des Verspritzens.
  • Gemäß einem alternativen Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, die durchgehende Kanäle gemäß der Erfindung umfaßt, wird die erste Bindungssubstanz auf die durchgehenden Kanäle eines bestimmten Bereichs unter Verwendung der Ink-Jet- Technologie aufgebracht. Dies erlaubt die Reinigung der ersten Bindungssubstanz und zum Beispiel im Fall eines Oligonukleotidmarkers zur Bestätigung seiner Sequenz vor dem Aufbringen auf da Substrat.
  • Aus den zuvor genannten Gründen wird es wiederum vorgezogen, daß die erste Bindungssubstanz unter Verwendung elektrostatischer Anziehung aufgetragen wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer elektromechanisch hergestellten Metalloxidmembran, vorzugsweise einer Aluminiumoxidmembran, bei der Herstellung irgendeiner der oben beschriebenen Vorrichtungen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Temperaturunterschied zwischen den verschiedenen Bereichen der Membran während der Durchführung des Assays eingestellt, um verschiedene Hybridisierungsbedingungen in verschiedenen Membranbereichen zu erstellen.
  • Die Verwendung umfaßt vorzugsweise einen Nukleinsäurehybridisierungsassay oder einen immunologischen Assay. In einem solchen Assay wird eine Probe, die einen Analyten umfaßt, mit einer erfindungsgemässen Vorrichtung in Kontakt gebracht. Dem Analyten wird anschließend erlaubt an die erste Bindungssubstanz zu binden, die ihrerseits mit dem Substrat verbunden ist. Eine solche Bindung wird sehr erleichtert, indem dem Analyten erlaubt wird, durch das poröse Substrat zu migrieren. Der Nachweis einer Bindung kann durchgeführt werden, indem eine zweite, an einen Marker gebundene Bindungssubstanz zugegeben wird, wobei der genannten zweiten Bindungssubstanz erlaubt wird an den Komplex aus erster Bindungssubstanz und Analyt zu binden und durch Bestimmen ob der Marker an der Stelle vorhanden ist, an der die erste Bindungssubstanz immobilisiert wurde. Als Alternative kann der Analyt bereits mit einer Markierung versehen worden sein, in welchem Fall die Bindung an die erste Bindungssubstanz direkt nachgewiesen werden kann, ohne Zugabe einer zweiten Bindungssubstanz.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Set, das alle oben genannten Vorrichtungen umfaßt, wobei das Set zusätzlich Nachweismittel zur Bestimmung des Auftretens einer Bindung zwischen der ersten Bindungssubstanz und dem Analyten umfaßt. Solch ein Nachweismittel kann vorzugsweise eine zweite, mit einem Marker ausgestattete Bindungssubstanz sein. Der Marker ist vorzugsweise in der Lage eine Farbreaktion auszulösen und/oder zu Bio- oder Chemo- oder Photoluminiszenz fähig.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, welche die Schritte umfaßt:
  • a) In Kontakt bringen der Probe mit irgendeinem der oben beschriebenen Vorrichtungen,
  • b) Stattfindenlassen der Bindung zwischen der ersten Bindungssubstanz und dem Analyten,
  • c) Nachweis, ob eine Bindung zwischen der ersten Bindungssubstanz und dem Analyten aufgetreten ist.
  • In diesem Verfahren kann der Analyt eine Nukleinsäureprobe, ein Antikörper, ein Antigen, ein Rezeptor, ein Hapten und ein Ligand für einen Rezeptor sein.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele illustriert.
    • Beispiel 1
  • Simultaner Nachweis zweier verschiedener Typen eines HIV-1 Amplifikats, einer Wildtyp-RNA (WT) und einer Kalibrator-DNA (Qa) unter Verwendung einer Aluminiumoxidmembran in einer Durchflusszelle.
  • Analyte:
  • Die Wildtyp-RNA und die Qa-RNA-Fragmente repräsentieren einen Teil der GAG-Region des HIV-1-Genorns. Diese Fragmente haben die gleiche Längen (145nt) und identische Sequenzen, außer einer 21nt langen Region im zentralen Teil des Fragments. Die Sequenzen der Fragmente sind:
  • Die Sequenz der Wildtyp- und Qa-spezifischen Teile sind unterstrichen.
  • In diesem Beispiel wurden zwei gepufferte Lösungen verwendet; Ein Phosphatpuffer pH 7,4, der 8 g/l NaCL enthält ("Inkubationspuffer").
  • Ein Phosphatpuffer pH 7,4, der 8 g/l NaCL und 0,05% Polysorbat (Tween 20) enthält, hiernach als "Wasch-Puffer" bezeichnet.
  • Substrat:
  • Aluminiumoxidmembran 60 um dick, Durchmesser 24 mm. Die Kanäle sind 0,2 um im Durchmesser, die Dichte beträgt ungefähr 18 Kanäle/um² ("Anodisc 25", Whatman).
  • Die Membranoberfläche wird mit Streptavidin durch 60 minütiges Eintauchen in 2 g/l Streptavidin enthaltenden Inkubationspuffer überzagen. Anschließend werden die Membranen unter Verwendung des Waschpuffers gewaschen und bei Raumtemperatur luftgetrocknet.
    • Ismobilisierung der ersten Bindungssubstanz:
  • Zwei Oligonukleotidmarker, teilweise komplementär zu den WTund Qa-Fragmenten werden aufgetragen:
  • beide mit einem an das 5'-Ende gekoppelten Biotin-Molekül. Flecken mit einem spezifischen Durchmesser wurden unter Verwendung einer porösen Spitze (Nylon-Feeder) wie sie in den gewöhnlichen "Fineliner"-Schreibstiften (Hauser Schreibtechnik GmbH, Gosheim, Deutschland) verwendet werden, aufgetragen. Während die "Feeder"-Spitze die Membran bespritzt, ist das andere Ende in Flüssigkontakt mit einem Reservoir, das die Markerlösung (Inkubationspuffer, Markerkonzentration 25 umol/l) enthält. Der Transfer der Markerlösung in die Membran wird durch die kapillare Interaktion zwischen Membran und "Feeder" gut kontrolliert: die Markerlösung füllt selbständig solche Kanäle, die in physikalischem Kontakt mit der "Feeder"-Spitze sind. In diesem Beispiel wurden 2 Linien mit 3 Flecken von 0,5 mm Durchmesser verwendet (3 Flecken für jeden Probentyp). Der Abstand zwischen den einzelnen Flecken betrug 1 mm. Nach dem Auftragen und einer In kubationsphase von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde nicht-gebundenes Material unter Verwendung des Waschpuffers weggewaschen.
  • In diesem Beispiel wurden auf diese Weise 4 identische Substrate hergestellt.
    • Hybridisierung
  • Als nächstes wurden die Membranen in eine Durchflusszelle eingeführt und in Kontakt mit dem Inkubationspuffer, der die HIV-RNA-Fragmente enthielt, gebracht.
  • Vier Sets von Hybridisierungsbedingungen wurden in 4 verschiedenen Experimenten angewendet:
  • 1 Volumen 25 ul, die 1,5 · 10¹² Molküle Qa-RNA enthalten, kein Fluss
  • 2 Volumen 25 ul, die I,5 · 10¹² Molküle WT-RNA enthalten, kein Fluss
  • 3 Volumen 25 ul, die 1,5 · 10¹² Molküle Qa-RNA enthalten, kontinuierlicher Fluss
  • Volumen 25 ul, die 1,5 · 10¹² Molküle WT-RNA enthalten, kontinuierlicher Fluss.
  • In den Experimenten 1 und 2 findet kein Transport des Puffers durch die Membran statt.
  • In den Experimenten 3 und 4 fließt die 25 ul· RNA-Lösung kontinuierlich in zwei Richtungen (vor und zurück) mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 ul/min durch die Membran. Um den Fluss zu kontrollieren, wurde ein automatischer Hamilton- Dispenser verwendet.
  • Alle Hybridisierungsexperimente wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.
    • Waschen
  • Nach der Hybridisierung wurden die Membranen unter Verwendung von 5 ml Waschpuffer gewaschen.
    • Markierung und Nachweis
  • Für den Nachweis wurde ein für HIV-RNA (SEQ ID NR. S) generischer Marker mit den Membranen interagieren gelassen. Dieser Marker ist in dem Inkubationspuffer (40 nmol/l) enthalten. Für jedes Experiment wurde ein Volumen von 75 ul, ohne Durchfluss verwendet. Die Marker waren mit Meerettich-Peroxidase (HPR)-Enzym in einem 1 : 1-Verhältnis markiert, unter Verwendung von Maleimid, das heterobifunktionale Cross-Linker enthielt (Hashida, S. et al. (1984) J. Applied Biochem. 56, 56- 63). Bevor die Proben an HPR gebunden wurden, wurden sie thioliert (Carlson, J. et al. (1978), Biochem. J. 173, 723- 737).
  • Nach dem Waschen mit 10 ml Waschpuffer wurde eine Lösung, die 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinwasserstoffperoxid, TMB(Organon Teknika, Art.: 78510) enthielt, mit den Membranen in Kontakt gebracht (kein Fluss).
    • Ergebnis
  • Eine Interpretation der Ergebnisse wurde mit bloßem Auge durchgeführt. In den Experimente 3 und 4 traten blaue Flecken beinahe sofort an den Stellen auf, bei denen eine spezifische Reaktion erwartet wurde (Flecken, die WT-Marker enthielten, wurden bei Verwendung von WT-RNA blau und die Qa-Marker enthielten, wurden bei Verwendung von Qa-RNA blau). Bei den Flecken, die zu der RNA im Puffer nicht komplementär waren, wurde keine Färbung beobachtet, obwohl der Bereich auf der Membran zwischen den Flecken nach einigen Minuten eine leicht bläuliche Verfärbung zeigte, die vermutlich aufgrund von ungenügendem Wasche oder geringfügiger unspezifischer Bindung auftrat. In den Experimenten 1 und 2 wurden ähnlich Ergebnisse beobachtet, jedoch dauerte es in diesen Fällen ungefähr eine Minute, bevor die Flecken sichtbar wurden.
  • Zu der visuellen Auswertung der Flecken während der TMB- Reaktion, wurden die Flecken auf den Membranen in den Experimenten 3 und 4 unter Verwendung eines bildgebenden Densitometers (Biorad GS700) ausgewertet. An diesem Punkt wurden die Membranen aus den Durchflusszellen entfernt (Tabelle 1). Tabelle 1: Dichte der Flecken mit einem Densitometer gemessen
    • Beispiel 2
  • Oligonukleotidmarker wurden kovalent an die Anopore-Membranen unter Verwendung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS) als Linker zwischen dem Aluminium und dem Oligo gebunden. Für die Experimente wurden Anodisc 25-Membranen mit einem Durchmesser von 25 mm und einem Gesamtoberflächenbereich von 0,3 m² verwendet.
  • Die Membranen wurden durch Eintauchen in eine Salpetersäurelösung (0,4 mol/l) während einer Stunde aktiviert. Nach dem Spülen mit Wasser wurden die Membranen getrocknet und in einer 0,25%-igen (V/V)-Lösung aus APS in Wasser 2 Stunden eingetaucht. Überschüssiges APS wurde durch Spülen mit Wasser entfernt. Nach dem Trocknen bei 120ºC unter reduziertem Druck wurden die Membranen aufbewahrt. Die Konzentration der Aminogruppen aufgrund der Bindung der APS-Moleküle betrug typischerweise 2-3 umol/m².
  • Vor dem Koppeln wurden die durch Aminogruppen terminierten Oligonukleotide mit Disuccinimidylsuberat (DDS, siehe z. B. PIERCE BV, Immunotechnology Catalog & Handbook, 1990) aktiviert. Die resultierende Succinimidylgruppe am Ende des Oligos wurde zum Koppeln der APS-aktivierten Membran verwendet. Zur Quantifizierung der Ergebnisse wurde ³²P-Markierung verwendet. Koppeln mit 500 ul Oligolösung an eine Anodisc- Membran während 60 Minuten resultierte in einer Kopplungsausbeute von 1 · 10&supmin;¹&sup0; mol/m² Oligonukleotid.
    • Beispiel 3
  • Definition einer Musterreihe auf einer Al&sub2;O&sub3;-Membran unter Verwendung einer Ink-Jet-Vorrichtung.
  • Bei Anwendung der Ink-Jet-Technologie können kleine Tropfen mit einem Durchmesser von 20-80 um hergestellt und auf einem Substrat mit hoher Durchsatzrate in um-Auflösung aufgebracht werden. Einen im Handel erhältlichen Desk-Jet (HP 660C) in Kombination mit den Al&sub2;O&sub3;-Membranen verwendend, wurden Anordnungen mit hoher Auflösung erhalten. Visuelle Untersuchung mit einem Mikroskop (Vergrößerung: 400x) zeigte perfekt runde Flecken mit sehr scharfen Rändern von ungefähr 60 um Durchmesser. Es wurden keine Anzeichen von Verspritzen beobachtet, wie es normalerweise bei der Verwendung von nicht-porösen Oberflächen beobachtet wurde. Wir führen die hohe Auflösung der Anordnung auf die hohe Porosität des Materials in Kombination mit dem hydrophilen Charakter der durchgehenden Kanäle zurück.
    • Beispiel 4
  • Durchführung eines Sandwich-Immuno-Assays Nachweis menschlichen Choriogonadotrophins (hCG) mit einem Enzymimmuno-Assay unter Verwendung einer Aluminiumoxid- Membran als feste Phase.
    • Überziehen der Membran
  • Kleine Bereiche der Aluminiumoxidmembranen (rund mit einem Durchmesser von 20 mm) wurden mit einer gepufferten Lösung (0,0127 mol/l Phosphat und 0,140 mol/l NaCl bei pH 7,4), 1 ug/ml monoklonalen Maus-Antikörper (OT-hCG-4B) gegen hCG gerichtet enthaltend, überzogen. Die Lösung wurde durch Pipettieren von 10 ul-Tröpchen oder durch Kontaktauftragen mit einem Polyester-"Feeder" auf die Membran aufgebracht. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC waren die Membranen gebrauchsfertig.
    • Inkubation
  • Die positiven Proben waren eine Mischung aus 50 ul hCG in einer Konzentration von 2000 IE/l und 50 ul Maus-anti-hCG (OThCG-3A) mit Meerettich-Peroxidase (HRP)(1 ug/ml) konjugiert.
  • Diese Mischung wurde 15 Minuten vorinkubiert. Für die negative Kontrolle wurden 50 ul Puffer mit 50 ul Konjugatlösung gemischt.
  • Als nächstes wurde die Mischung (100 ul) auf die Membranen pipettiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
    • Waschen und Nachweis
  • Die Membranen wurden gründlich mit einem Waschpuffer (0,131 mol/l) NaCl, 0,0127 mol/l Phosphat und 0,5 ml Polysorbat 20) auf einem Trichter gespült.
  • Schließlich wurden die Membranen in ein Becherglas, das ein Substrat für HRP basierend auf 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthielt, gelegt. Während 30 Minuten Inkubation wurden die Membranen visuell und mit einer Kamera beobachtet.
    • Ergebnisse
  • Klare blaue Flecken wurden bei den positiven Proben innerhalb weniger Minuten an den Stellen sichtbar, an denen die Membranen mit OT-hCG-4B überzogen waren. An anderen Stellen der Membran und mit der negativen Kontrolle konnte nur eine schwache Blaufärbung nach einer verhältnismäßig langen Inkubationszeit beobachtet werden.
  • Auszug aus dem Brief des Anmelders vom 28.07. 1999 (PCT- Verfahren)
    • Zusätzliche Hinweise auf die Erfindungshöhe
  • Darüber hinaus hat die Membran wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einige unerwartete Eigenschaften, die sie außerordentlich gut geeignet zur Verwendung als Substrat für Anordnungen mit hoher Dichte macht.
  • 1. Wie die meisten herkömmlichen Membranen ist die elektrochemisch hergestellte Metalloxid-Membran hydrophil. Ein Fachmann würde daher erwarten, dass ein Tropfen Flüssigkeit, wenn auf die Membran aufgetragen, sich über einen relativ großen Bereich ausbreiten würde, viel größer als der Durchmesser des Tropfens. Überraschenderweise passiert dies mit der elektrochemisch hergestellten Membran nicht. Hier können die Tröpfchen auf einen extrem kleinen Bereich aufgetragen werden, was die Bildung von Anordnungen mit hoher Dichte ermöglicht.
  • 2. Nach dem Befeuchten der elektrochemisch verätzten Membran mit einer wässerigen Lösung wird sie vollständig durchsichtig, gleich einem herkömmlichen Mikroskopierglas. Ein Fachmann würde den Vorteil erkennen, dass solch eine Membran in Kombination mit sichtbaren Markern verwendet werden kann, jedoch würde er sich auch bewusst sein, dass sich eine solche nasse Membran als ein optischer Wellenleiter verhalten könnte. Als Konsequenz daraus wird das Licht, das von einem fluoreszierenden oder luminszierenden Marker ausgestrahlt wird, in der Membran gefangen und breitet sich in der Ebene der Membran über eine beträchtliche Länge aus, bevor es aus der Membran austreten und nachgewiesen werden kann. Dieses Phänomen wird zum Beispiel für Laseranwendungen ausgenützt. Für einen optischen Nachweis bei Reihenanwendungen würde dies die räumliche Auflösung negativ beeinflussen.
  • Überraschenderweise haben die elektrochemisch hergestellten Membranen diesen Nachteil nicht. Wenn sie in Kombination mit einem gewöhnlichen optischen Nachweissystem wie beispielsweise eine CCD-Kamera verwendet werden, ist die räumliche Auflösung des Nachweises extrem gut.
  • 3. Dem Fachmann ist bekannt, dass häufig, wenn eine biologische Probe durch eine Membran fließt, biologisches Material wie beispielsweise DNA, Proteine oder Enzyme in den Poren der Membran eingeschlossen werden, aufgrund der nichtspezifischen Interaktion solcher Einheiten mit dem Membranmaterial. Oft sind, wie zum Beispiel im Fall von porösen Teststreifen, die in manuellen diagnostischen Tests verwendet werden, spezielle Vorsichtsmaßnahmen notwendig, um dieses Problem zu beseitigen. Daher, in Anbetracht der sehr feinen Porenausmasse der elektrochemisch hergestellten Membranen, würde der Fachmann erwarten, dass der Fluss einer DNAenthaltenden Lösung durch die Membran in einem signifikanten Zurückhalten/Einschließen der Nukleinsäurefragmente im Innern der Membran resultieren würde, was wiederum in einem behinderten Fluss und noch schlimmer in einem hohen Anteil unspezifischer Interaktionen resultieren würde.
  • Überraschenderweise passiert dies nicht. Selbst wenn ein sehr empfindliches optisches Nachweissystem verwendet wird, kann ein nicht-spezifisches Zurückhalten von Nukleinsäure in der elektrochemisch verätzten Membran nicht beobachtet werden.

Claims (16)

1. Vorrichtung zur Durchführung eines Assays, wobei die Vorrichtung ein Substrat mit ausgerichteten Durchlasskanälen umfasst, die Kanäle sich zu einer Oberfläche hin zum Auftragen von Proben öffnen, die Kanäle in wenigstens einem Bereich der Ober- fläche zum Auftragen der Proben mit einer ersten Bindungssubstanz ausgestattet sind, die fähig ist einen zu analysierenden Stoff zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembran ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die erste Bindungssubstanz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Nukleinsäureprobe, einem Antikörper, einem Antigen, einem Rezeptor, einem Hapten oder einem Liganden für einen Rezeptor.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin die erste Bindungssubstanz kovalent an das Substrat gebunden ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, worin die Metalloxidmembran Aluminiumoxid umfasst..
5. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, worin die erste Bindungssubstanz in situ synthetisiert wird.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, worin eine Verbindung für die Synthese der ersten Bindungssubstanz auf einen bestimmten reich unter Anwendung eines Ink-Jet-Verfahrens aufgetragen wird.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, worin die Verbindung unter Anwendung elektrostatischer Anziehung aufgetragen wird.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4, worin die erste Bindungssubstanz auf einen bestimmten Bereich unter Anwendung eines Ink-Jet-Verfahrens aufgetragen = wird.
9. Vorrichtung nach Anspruch B, worin die erste Bindungssubstanz unter Anwendung elektrostatischer Anziehung aufgetragen wird.
10. Verwendung einer elektrochemisch hergestellten Metalloxidmembran bei der Herstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4.
11. Set, das eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4 umfasst, wobei das genannte Set zusätzlich ein Nachweismittel zur Bestimmung ob eine Bindung zwischen der ersten bindenden Substanz und dem Analyten stattgefunden hat, umfasst.
12. Set nach Anspruch 11, worin das Nachweismittel eine zweite, mit einem Marker ausgestattete Bindungssubstanz umfasst.
13. Set nach Anspruch 12, worin der Marker in der Lage ist eine Farbreaktion und/oder eine Bio- oder Chemiephotoluminiszenz auszulösen.
14. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, welches die Schritte umfasst:
a) in Kontakt bringen der Probe mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4,
b) die Bindung zwischen der ersten Bindungssubstanz und dem Analyten stattfinden lassen,
c) Nachweisen, ob eine Bindung zwischen der ersten Bindungssubstanz und dem Analyten aufgetreten.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der Analyt eine Nukleinsäure umfasst,
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäure von einem humanen Immundefizienzvirus stammt.
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