WO2004104584A1 - 生体関連物質の検査方法と、そのための流体移送装置と流体移送方法 - Google Patents

Abstract

生体関連物質の検査方法は、流体を流動させて機能性基体と流体とを接触させる複数の工程を有し、それぞれの工程においてその工程に適した流動速度で流体を流動させる。

Description

明 細 書

生体関連物質の検査方法と、 そのための流体移送装置と流体 移送方法

技術分野

本発明は、 生体関連物質の検査方法に する 。 また本発明 は、 そのために流体の移送を制御する壮

衣 mと方法に関する。 背景技術

ヒ 卜ゲノムの解析は、 システマティ ソクな塩基配列決定か t>、 システマティ ックな機能解析へと隹 "、、 占が移つてきている。 遺伝情報の解析方法は、 主と して二つに分類できる。 一つは、 遺伝子自体および遺伝子から発現する m R N Aやタンパク質 が 「どのようなものであるか」 を解析するものである。 もう 一つは、 その m R N Aやタンパク質が Γ如何なる条件下で合 成されるか」 を解析するものである。

前者に属する方法と しては、 サザン • ブ □ ッ 卜法、 ノーザ ン · プロ ッ ト法、 ゥ エスタン · ブロ ッ 卜法等があり、 これら は主に、 注目する D N A 、 R N A、 またはタ ンパク質につい ての解析を行なうためのものである。 従つて、 細胞から抽出 された全ての D N A 、 R N A、 または夕ンパク質を包括的に 解析する方法と しては適さない。

一方、 如何なる条件で合成されるかとい 占に関しては、 タンパク質の合成が転写レベルで制御されているため、 D N

Aにおける転写の制御配列と、 それに対応する制御メカニズ 厶との双方のデータが不足している現状においては、 十分に 解析することが非常に困難である。 ところが 近年、 D N Aチソプゃ D N Aマイク 口ァ レィと

R ばれる 、 1 センチ四方程度の基体表面上に、 a向 度に任思 の才リ ゴヌク レ才チ ドを固定する技術の進歩によつて 、 伝 子の発現情報の解析が飛躍的に進歩する とが期待されてい 0

D N Aチソプは、 シリ コ ンチップをフ 才 卜 リ ソグラフィ ― 技術によつて多く の区画に分割し、 それぞれの区画上にそれ ぞれの特定の塩基配列を持つた一本鎖 D N Aを直接合成した ものである o D N Aマイク ロァ レイは 、 従来メ ンブレン上に プロ ッ 卜されたスポッ 卜サイズが約 3 0 0 mめるいはそれ 以上であ た D N Aマイク ロァ レイを 、 スポッ 卜サィズを約

2 0 0 M mあるいはそれ以下にしてスラィ グラス上にプ □ ッ 卜 したちの め 。

これら D N Aチップや D N Aマィク ロア レィは ib S7C取

Is ¾と； 算ュニッ 卜システムとに がれ、 チップ上、 あるい はマイク Pァ レイ上に供給された 例えば蛍光標識された D

N Aがどのプローブとハイブリ ダィズしたかを知ることがで さるよう になつている。 D N Aチ Vプゃ D Ν Aマイクロア レ ィ上に配 Λされるプローブの種類とその配置次第で、 遺伝子

D N Aの変異解析、 多型解析 基配列解析 発現解析など 様々な用途に用いることが可能な ¾のである o

例えば 特表 2 0 0 0 — 5 1 5 2 5 Ί 号公報と米国特許出 願公開第 2 0 0 2 / 0 0 2 5 5 3 3 A 1 号明細 は、 このよ うな D N Aチップの具体例を開示している。 その D N Aチッ プでは、 酸化アルミニウム製の多孔質基体にプ □ープ D N A が固相化されている。 その D N Aチップを用いた検査では、 その多孔質基体の内部に、 蛍光標識された D N Aを含む溶液 を予め決められた一定速度で行き来させるよラ ,よ /ノ ίί動状態で 移送することによ y 、 高効率かつ高速な八ィ ブリ ダィズ 5Ζ. )心 が得られ 9 0

特表 2 0 0 0 - 5 1 5 2 5 1 号公報には 多孔質基体にプ

□―ブを固相化し 、 圧力差によ り検体液を流動させて 生体 関連物質を検出する方法が開示されている o しかし 、 mi動 is 度に関する具体的な §己威（ ない。

米国特許出願公開第 2 0 0 2 / 0 0 2 5 5 3 3 A 1 明細 書には 、 基体を洗浄した後に検出することが記載されている が、 洗浄時と検出時の溶液の流動 ¾法については示されてい ない。 つま り、 一つの工程では常に唯一の流動条件だけが適 用される。

発明の開示

本発明は、 ひとつには、 遺伝子に限定されない生体関連物 ftを検出する 能性基体か 成る検査チップを用いた生体関 連物質の検査方法に向けられている。 つま り 、 上述した D N

Aチップや他の検査チップを用いた生体関連物質の検查方法 に向けられている 0 言い換えれば 、 遺伝子および遺伝子以外 の生体関連物質の検査のための機能性基体から成る種々の検 査チップを用いた検査方法に向けられている o

本発明の検査方法は、 機能性基体を用いた生体関連物質の 検査方法において 、 流体を流動させて流体と慨能性 体を接 触させる複数のェ程を有し、 それぞれの工程においてそのェ 程に i .した 動速度で流体を流動させる。

本発明の別の検査方法は、 機能性基体を用いた生体関連物 質の検査方法において、 流体を往復流動させて流体と機能性 基体を繰 返し接触させる工程を有し、 その工程において、 往時と復時とで異なる流動速度で流体を流動させる。

本発明の別の検査方法は、 機能性基体を用いた生体関連物 質の検査方法において、 流体を流動させて流体と機能性基体 を接触させる工程を有し、 一定でない流動速度で流体を流動 させる o

本発明の別の検査方法は、 体積型ポンプを用いて流体を流 動させて流体と機能性基体を接触させる複数の工程を有し、 体積型ポンプの体積を変化させる量が流動させる流体の体積 よ ち多い o

本発明の別の検査方法は、 機能性を有しかつ流動可能な基 体を複数のェ程で流体中に保持しながら、 生体関連物質に関 する検査を行なう生体関連物質の検査方法であ り 、 それぞれ のェ程においてその工程に適した流動速度で基体を流動させ o

また本発明は、 ひとつには、 上述した生体関連物質の検査 方法に 用される移送装置に向けられている。

本発明の移送装置は、 流体を移送する移送手段と、 流体の 移送に対して連続的に接触可能な機能性基体を保持する保持 手段と 、 移送手段を制御する手段と、 流体の特性に応じて少 な < とち一 の制御条件を選択的に設定する制御条件設定手 段とを備えている。 また本発明は、 ひとつには、 上述した生体関連物質の検査 方法に適用される移送方法に向けられている。

本発明の移送方法は 、 流体に対し機能する基体を流体と連 続的に接触させる工程と、 流体を少なく とも二つの制御条件 によつて移送する工程と、 制御条件を流体の特性に応じて設 定する工程とを有している。

図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の実施形態において共通に使用される D N

Aチソプ読み取リ装置の概略構成を示している。

図 2 は、 図 1 に示された反応容器の構成を概略的に示す斜 視図でめ 0

図 3 は、 図 1 と図 2 に示された反応容器の横断面を示す図 である o

図 4 は、 本発明の第一実施形態に関連した、 シリ ンジポン プの一般的な駆動パ夕ーンを示している。

図 5 は、 本発明の第二実施形態におけるシリ ンジボンプの 駆動パターンを示している。

図 6 は、 本発明の第三実施形態におけるシリ ンジポンプの 駆動パターンを示している。

図 7 は、 図 6 の駆動パターンの比較例における駆動パ夕一 ンを示している。

図 8 は、 図 6 の駆動パターンに従った駆動において得られ た、 あるプローブの蛍光の輝度の時間的変化の測定例を示し ている o

図 9 は、 図 7 の駆動パターンに従つた駆動において得られ P T/JP2004/007450

6 た、 同じプ □一プの蛍光の輝度の時間的変化の測定例を示し ている。

図 1 0 は 3%明の第四実施形態における反応工程の駆動 パターンを示している

図 1 1 は 、 ¾明の第四実施形態における洗浄工程の駆動 パターンを示している ο

図 1 2 は 明の第五実施形態を実施する装置を不す図

C¹ある。

図 1 3 は 9¾明の第/、芙施形態ないし第九実施形態を実 施 9 る衣置を示す図でめ 。

國 1 4 は 発明に迴用ロ I能なシリ ンジボンプの駆動パ夕 一ンを示している o

図 1 5 は 、 本発明に迴用可能なシリ ンジビス 卜ンポンプの よ り好適な駆動パ夕一ンを示している。

発明を実施するための最良の形態

[生体関連物質の検査 ¾ε Λの基本構造]

図 1 は 後述する本発明の実施形態において基本的に使用 される D N Aチッ ~f =*

ノ nTCみ取り装置の概略構成を示している o 図 1 に示されるよう に、 D N Aチップ読み取リ装置は 、 反 応容器 2 が載置されるステージ 1 を有している 。 ステ一ジ 1 は、 固定板 1 a と 、 固定板 1 a上に Y軸方向に移動可能な Y 移動板 1 b と 、 Y移動板 1 b上に X軸方向に移動可能な X移 動板 1 c とを有してお y 、 これら Y移動板 1 b と X移動板 1 c によ り 反応容器 2 を X— Y軸方向に移動可能にしている。 反応容器 2 は、 図 2 に示されるよう に、 直方体形状の上板 2 0 1 と下板 2 0 2 を重ねて構成されている。 上板 2 0 1 に は、 これに限定されないが 、 例えば 4個の円筒状の孔部 2 0

1 a , 2 0 1 b 、 2 0 1 c 、 2 0 1 d が長手方向に沿って一 列に形成されている た 、 下板 2 0 2 には、 孔部 2 0 1 a

2 0 1 b、 2 0 1 c 、 2 0 1 d に対応する位置に円筒状の孔 部 2 0 2 a 、 2 0 2 b、 2 0 2 c 、 2 0 2 d が長手方向に沿 つて一列に形成されている 。 これら上板 2 0 1 と下板 2 0 2 は重ね合わせられ、 4個の反応室 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d を 形成している

汉応室 3 a、 3 b 、 3 c 、 3 d には、 それぞれ 、 機能性基 体と しての D N Aチップ 4 の反応部 4 a、 4 b 4 c 、 4 d が収納されている D N Aチップ 4 は、 反応室 3 a、 3 b、

3 c 、 3 d 内に供給または収容される各種溶液を通過し得る 微細孔を多数有している 好適な実施の態様において、 D N

Aチップ 4 は、 例えば、 2 5 m m X 7 5 m m程度の基体上に 直径 6 m m程度の 4個の反応部 4 a、 4 b、 4 c 、 4 dが 9 m m ピッチで形成されている。 このような D N Aチップ 4 を 図 3 に示されるよう に上板 2 0 1 と下板 2 0 2 の間に挟み込 むことで、 反応部 4 a、 4 b、 4 c 、 4 d が反応室 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d の各底面から若干上方の位置にそれぞれ収容 される。

反応 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d の上板 2 0 Ί 側の孔部 2 0

1 a、 2 0 1 b , 2 0 1 c 、 2 0 1 d の上部には、 蛍光検出 ュニッ 卜によ り反応部 4 a 、 4 b、 4 c 4 d の反応経過や

¾Π 7¾ ¾1測定するための開口部 3 0 1 a , 3 0 1 b、 3 0 1 c , P T/JP2004/007450

3 0 1 dがそれぞれ形成されている。 これらの開口部 3 0 1 a 、 3 0 1 b , 3 0 1 c , 3 0 I d は、 それぞれ反応に必要 なサンプル溶液と試薬溶液が順次または同時または混合状態 で供給できるよう に開放している。 開口部 3 0 1 a 、 3 0 1 b 、 3 0 1 c , 3 0 I d には、 場合によっては、 サンプルと 試薬以外の液体、 例えば希釈用溶液、 洗浄用溶液、 測定用試 薬 （基質酵素等） も供給される。 開口部 3 0 1 a 、 3 0 1 b 、 3 0 1 c 、 3 0 1 d には、 温湿環境を維持するため、 液体を 供給しない時期に適当な蓋部材が被せられ場合もある。 また、 下板 2 0 2 の孔部 2 0 2 a 2 0 2 b 、 2 0 2 c 、 2 0 2 d 内の側面には 反応容器 2 の目リ側面まで導出される接続口 3

0 2 a , 3 0 2 b 、 3 0 2 c 、 3 0 2 d がそれぞれ形成され ている。

反応容器 2 は 、 図 1 に示されるよう に 、 反応室 3 a 、 3 b

3 c 、 3 dが X軸方向に沿つて一列に配置されるよう に、 ス テージ 1 の X移動板 1 c 上に載置される

、容 #5 2 の接続口 3 0 2 a 、 3 0 2 b 、 3 0 2 c 、 3 0

2 d には、 配 5 a 、 5 b 5 c 、 5 d を介して流路切替手 段と しての切替バルプ 6 が接 feeされている。 また、 切替バル ブ 6 には、 配管 7 を介して移送手段の流動源と して機能する ポンプ 8が接続されている

ポンプ 8 は 、 各反応室 3 a 、 3 b 3 c 、 3 d 中のプロ一 プ溶液に流動を与えるための のでめ y 、 例えばシリ ンジポ ンプ （例えば八ミル 卜ン社 ィク 口ラボ ML510B) で構成さ れる。 切替パ、ルブ 6 は 、 例えば 、 回転式 4方選択バルプ （例 えば、 ハミル 卜ン社 H V D P 4 _ 5 など） で構成される。 操 作軸 a には 、 ピニオン 9 が取り付けられている o

ステージ 1 の X移動板 1 c の X軸方向に沿つた側面、 つま り、 反 )心谷 ¾ 2 の各反応室 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d が並ぶ X 軸方向に沿つた側面には、 ラ ック 1 0が設けられている。 ま た、 Y移動板 1 bの側面には、 保持板 1 1 を介して切替バル ブ 6 が取リ付けられている。

切替バルプ 6 に取り付けられている ピニ才ン 9 は、 ラック

1 0 に嚙み合つている。 従って、 ピニオン 9 は 、 ステーシ 1 の X軸方向の移動によ り、 ラック 1 0 を介して回転される。 ピニオン 9 の回転は操作軸 6 a を回転させる o これによ り 、 配 5 a、 5 b 、 5 c 、 5 d のうちの一つが m択的に配管 7 を介してボンプ 8 に接続され得る。

ピニオン 9 は 、 1 / 4 回転が、 D N Aチップ 4 の反応部 4 a 4 b、 4 c 、 4 d のピッチ （ 9 m m ) に相当するサイズ を有している。 ステージ 1 の移動によ り 、 反応容器 2 が反応 部 4 a、 4 b、 4 c 、 4 d の ピッチ分だけ移動されると、 こ れに応じて、 切替バルブ 6 の操作軸 6 aが 9 0 ° 回転され、 配管 5 a、 5 b、 5 c 、 5 d の切替が行なわれる。

ステージ 1 の X軸方向の移動によ り、 反応室 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d のう ちの所望のひとつが、 後述する蛍光検出ュニ ッ 卜 1 2 の測定位置まで移動されたとき、 測定位置に移動さ れた反応室 3 a、 3 b、 3 c 、 3 d のひとつに対応する配管 5 a、 5 b、 5 c 、 5 d のひとつがポンプ 8 と接続されるよ う に調整されている。 ポンプ 8 は ポンプ制御ュニッ 卜 1 4 を介して演算ュニッ 1 5 に接 feeされており 、 演算ュ一ッ 卜 1 5 によ り 、 溶液の 流動速度を変えることが可能である 。 演算ュニッ 卜 1 5 は、

、

D N Aチップ 4 に流通させる流体浴液の特性に }心して複数の 流動速度の中から好ましい速度条件を設定する流動条件設定 手段と してち機能する。

例えば、 反応室 3 d の反応部 4 d の反応経過や結果を測定 するには、 ステージ 1 を X軸方向の図示左端まで移動し、 反 応部 4 d を蛍光検出ュニッ 卜 1 2 の対物レンズ 1 3 の焦点位 置に移動させる 。 X移動板 1 c の移動に伴いラ ック 1 0 も移 動し、 ピニ才ン 9が回転し、 切替ノ ルプ 6 の操作軸 6 a も回 車 Eし、 JS }心室 3 c とポンプ 8 の流路が切替バルブ 6 を介して 接続される o < の状態で、 演算ュ一ッ 卜 1 5 によ りポンプ制 御ュニッ 卜 1 4 を介してポンプ 8 をコ ン 卜口 ールすることに よ り、 }心室 3 c 中の溶液を流動させることが可能となる。

[生体関連物質の検査方法]

以下 、 生体関連物質の検査方法に関する実施形態について 説明する

生体関連物質の検査方法には色 なェ程があ リ、 それぞれ の工程 1 あいて必要な溶液が用意される。 例えば、 必要な溶 液は、 プロ一プと検査対象の生体関連物質を反応させる反応 工程においては、 プローブと反応する検査対象の生体関連物 質を含む検体液であり、 検査チップに残留する不所望な検体 液を取り 除く洗浄工程においては、 洗浄水である。 以下の説 明では、 それぞれの工程において用意される必要な溶液を総 称して単に溶液とい

本明 書にお一いて、 J"生体関連物 J は 動物 、 植物 、 微 生物等の細胞のみならず 、 し れらに寄生しなければ自 ら増殖 できないウィルスや細菌等に由来する物質をも含む。 生体関 連物質は 、 これらの細胞等よ り直接抽出 · 単離された天然形 態のもののみならず、 遺伝子ェ学的手法を利用 して生産され たもの、 化学的に修飾されたものも む。 よ り具体的には ホルモン類、 酵素、 抗体 、 抗原 、 ァブザィ厶 、 その他の夕ン パク 核酸 （例えば D N A 、 R N A 、 P N A ) 等が含まれ また 「プロ一ブ J は、 上記の生体関 物質に対して特異的 に結合する物質を意味し、 例えば、 ホルモン等のリガン ドと その受容体、 酵素とその基質 、 抗原とその抗体、 特定配列を 有する核酸とこれに相補的な配列を有する核酸等の関係にあ る、 何れかが含まれる。

また Γ D N Aチップ J は、 上記の 「プローブ J を試薬とす る生物学的反応を行なう反応性を有する機能性基体を章味す る。 「機能性基体 J は、 上記生体関連物質に応答して測定可 能な変化を生じるような機能性を有する支持体全般を 味す 勺 。 よって、 本発明の機能性基体は、 上記生体関連物 «と特 的な相互作用を C=lする任意の種類の試薬成分を備える任意の 形状の支持体である o

また 「流体」 は 、 機能性基体と接触して基体に機能させる ような物質を含む流体全般を意味する ο 流体が溶液である場 合に、 上記生体関連物質に対して不活性の気体を含有しても よい。 流体が無数の微小粒である場合に、 上記生体関連物質 に対して不活性の 体中に含有されていてもよい。

また 「流動 J とは 、 液体が基体との接触部位を変化するよ うな動きである o 流動は、 液体の動きを制御する手段によつ て能動的に移動させられる。 液体の動きを制御する手段は、 流動速度の追加 - 減衰 ' 維持 · 停止という動的パラメータ一 を適切な組み合わせで含んでおり 、 選ばれた各動的パラメ一 ターに適切な時間配分を振り分ける機能を有する。

前述の装置において、 溶液は、 シリ ンジポンプ 8 によって 流動され、 D N Aチップ 4 の反応部 4 a 4 b 4 c , 4 d のひとつに行き来させられる。 つま り 、 溶液は往復流動され、 反応部 4 a 4 b 4 c 4 d のひとつを繰り返し通過させ られる。

従って、 本発明に適用され得る基体の好適な態様は、 基体 内を流体が通過でさるような孔を有し、 さ らに好適には多孔 質の材料からなる機能部分を少なく とも一部に有する。 しか し、 本発明の主曰 によれば、 機能性を有し、 かつ機能性表面 に流体が流動状態で接触し得る形状であれぱ、 別の形状を有 する基体であつてちよい。

第一実施形態

図 4 は、 シリ ンンポンプ 8 の一般的な駆動パターンを示し ている。 図 4 において、 X軸は経過時間を示し、 Y軸はシリ ンジポンプ 8 のピス 卜ンの位置を示している。 右下がりの区 間は 「弓 1く」 動作に対応し、 右上がり の区間は 「押す」 動作 に対応している o 傾きの大きさは、 ピス トンの移動速度を表 2004/007450

1 3 しておリ、 従って検体液の流動速度に対応している。

図 4から分かるよう に、 一般に、 シリ ンジポンプ 8のビス 卜ンは、 一定の速度で押され、 一定時間のあいだ停止された 後、 押す動作時と同じ速度で引かれる。 この一連の動作が、 一定時間の間隔を置いて、 繰り返し行なわれる。

本実施形態は、 生体関連物質の検査における複数のそれぞ れの工程において、 その工程に適した流動速度で溶液を流動 させることに向けられている。 つま り、 それぞれの工程にお いて、 シリ ンジポンプ 8 を、 そのピス トンの移動速度が異な る駆動パターンに従って駆動する。 言い換えれば、 シリ ンジ ポンプ 8 のピス トンの移動速度が、 生体関連物質の検査方法 のそれぞれの工程において変更される。

例えば、 反応工程においては、 図 4 の駆動パターンに準じ て、 シリ ンジポンプ 8 のピス トンは、 溶液に 1 0 I Z秒の 流動速度を与える一定の速度で引かれ、 一定時間のあいだ停 止された後、 溶液に 1 0 t I /秒の流動速度を与える速度で 押される。 この一連の動作が、 一定時間の間隔を置いて、 繰 リ返し、 必要な回数だけ行なわれる。 これに対して、 洗浄ェ 程においては、 図 4の駆動パターンに準じて、 シリ ンジボン プ 8のピス トンは、 溶液に 2 0 I Z秒の流動速度を与える 一定の速度で引かれ、 一定時間のあいだ停止された後、 溶液 に 2 0 n I Z秒の流動速度を与える速度で押される。 この一 連の動作が、 一定時間の間隔を置いて、 繰り返し、 必要な回 数だけ行なわれる。

反応工程における溶液 （検体液） の最適な流動速度と洗浄 4 工程における溶液 （洗浄水） の最 ieな ; ι£動速度は異なる 。 従 つて、 このよう に、 それぞれのェ にあいて その工程に適 した流動速度で溶液を流動させることによ U 、 それぞれのェ 程を短時間で終了させる とが可能となる o ま り 、 それぞ れの工程を効率良く行なラ とができる o 結果と して、 生体 関連物質の検査の 卜一夕ルの所要時間を短縮でさるよう にな る o

第二実施形態

本実施形態は 、 溶液を往 流動させて溶液に検査チ Vプを 繰り返し通過させる一つのェ程において 、 そのェ程において 往時と復時とで異なる流動速度で溶液を流動させる < とに向 けられている。

つま り、 本実施形態においては、 生体関連物質の検査の一 つの工程において、 シリ ンンポンプ 8 のビス 卜ンの移動 が、 「引 く」 動作時と Γ押す J 動作時とで変えられる ο つま り 、 シリ ンジポンプ 8 の Γ引 く J 動作時と Γ押す J 動作時と で、 溶液の流動速度が異なる o

図 5 は、 「引 く」 動作時と 「押す」 動作時でピス 卜ンの移 動速度が異なる駆動バタ一ンを示している o 図 5 の駆動パ夕 ーンに従った駆動においては 、 シリ ンジポンプ 8 のピス 卜ン は、 例えば、 溶液に 1 0 At 1 /秒の流動 度を与える一定の 速度で引かれ、 一定時間のあいだ停止された 溶液に 5 μ.

1 Z秒の流動速度を与える速度で押される o この ―連の動作 が、 一定時間の間隔を置いて 、 繰り返し 、 必要な回数だけ行 なわれる。 D Ν Αチップ 4 の反応部 4 a 、 4 b 、 4 c 、 4 d は、 材質 や周辺保持部の形状によ り 、 正圧に対する耐圧特性と負圧に 対する耐圧特性とが異なる。 ここで 、 正圧は、 シリ ンジボン プ 8のピス トンの 「押す」 動作時に反応部 4 d が受ける圧力 であり、 負圧は、 シリ ンジポンプ 8 のビス 卜ンの 「引く」 動 作時に受ける圧力である。 反応部 4 a 、 4 b 、 4 c 、 4 d は 特に正圧に対する耐圧特性が低いため、 シリ ンジポンプ 8 の ピス 卜ンの 「押す」 動作時に、 最悪の場合、 破壊する傾向が 強い

図 5 の駆動パターンに従つた駆動においては、 「押す」 動 作時の ピス トンの移動速度が低く抑えられているため、 「押 す」 動作時に反応部 4 a 、 4 b 、 4 c 、 4 d が受ける圧力が 低く抑えられる。 言い換えれば、 往時と復時の溶液の流動速 度が 、 反応部 4 a 、 4 b 、 4 c 、 4 d の往時と復時の耐圧特 性に合わせて設定されている。 結果と して、 反応部 4 a 、 4 b 、 4 c 、 4 d の破損の発生を減らすことが可能となる。 勿論、 本実施形態においても、 溶液は、 その工程に適した 速度で流動させるとよい。 これにより 、 その工程を短時 間で終了させることが可能となる 結果と して、 生体関連物 質の検査の所要時間を短縮することが可能となる。

第三実施形態

本実施形態は、 溶液を流動させて溶液に検査チップを通過 させる一つの工程において、 一定でない流動速度で溶液を流 動させることに向けられている。 ま り 、 本実施形態では、

「引く 」 動作時の最中や 「押す j 動作時の最中、 ピス トンの 2004/007450

1 6

、、、

移動速度が一定でない駆動パターンに従ってシ U ンンポンプ を駆動する o

本実施形態では、 例えば、 溶液を間欠的に一定の 1し動 is度 で流動させる o すなわち、 生体関連物質の検査方法の一つの 曰

工程内の r引 < J 動作時の最中や 「押す」 動作時の 中、 シ リ ンジポンプ 8のビス トンが間欠的に一定速度で移動される 図 6 は、 Γ引 < J 動作時と 「押す」 動作時でピス 卜ンが間欠 的に移動される駆動パターンを示している。

図 6 の駆動パターンに従った駆動においては 、 シ U ンジポ ンプ 8 のピス 卜ンは、 「引く 」 動作時に、 溶液に 1 0 f I / 秒の流動速度を与える一定の速度で 1 秒間引かれ 1 秒間停 止され、 この一連の動作が 4 回繰り返される 0 その後 、 「押 す」 動作時に 、 溶液に 〗 0 At I /秒の流動速度を与える一定 の速度で 1 秒間押され、 1 秒間停止され、 この一連の動作が

4 回繰 返される 。 この一連の動作が 〗 サイクルを成し、 そ のサィクルが、 繰り返し 、 必要な回数だけ行なわれる 図 6 の駆動バターンに従つた駆動においては、 「引 く J 動 作時と Γ押す」 動作時に それぞれ、 8秒間に 4 0 1 の溶 液が駆動される。

流動速度が一定の流体においては、 流路の壁面近く の流体 が攪拌されないという、 層流と呼ばれる現象が起こる o 図 6 の駆動パ夕ーンに従つた駆動においては、 r引 く J 動 作時と Γ押す」 動作時において 、 ピス トンが間欠的に移動さ れるため 、 層流の発生が効果的に抑制される。 結果と して、 検体液が効率良く攪拌される。 これによ り、 プローブと生体 0

関連物質の反応効率が向上し 、 検出時間を短縮する とか可 能となる。

また、 ピス トンが間欠的に移動されるため、 D N Aチップ

4の反応部 4 a 、 4 b、 4 c 、 4 d の圧力が過度に上昇する ことが抑制される。 結果と して、 反応部 4 a、 4 b 、 4 c、

4 d の破損の発生を減らす < とが可能となる。

図 6 の駆動パターンによる反応効率の向上について比較例 をあげて説明する。 図 7 は 、 比較例における駆動パ夕ーンを 示している。

図 7の駆動パターンに従 た駆動においては、 シ ンジポ ンプ 8 のビス 卜ンは、 溶液に 5 μ, 1 秒の流動速度を与える 一定の速度で 8 秒間引かれ その後、 溶液に 5 At 1 /秒の流 動速度を与える一定の速度で 8秒間押される。 の一連の動 作が、 繰り返し 、 必要な回数だけ行なわれる。

図 7 の駆動パターンに従つた駆動においては、 図 6 の駆動 パターンに従つた駆動と同様に、 「引 く J 動作時と Γ押す」 動作時に、 それぞれ、 8秒間に 4 0 ja 1 の溶液が駆動される。 つま り、 図 7 の駆動パターンに従つた駆動において 図 6 の 駆動パターンに従つた駆動においても、 駆動される浴液の量 は同じである。

図 8 は、 図 6 の駆動パタ ―ンに従つた駆動に対して得られ た、 あるプロ一ブの蛍光の輝度の時間的変化の測定例を示し ている。 また、 図 9 は、 図 7 の駆動パ夕 —ンに従つた駆動に 対して得られた 、 同 じプロ一プの蛍光の輝度の時間的変化の 測定例を示している。 04 007450

Ί 8 図 8 と図 9 を比較して分かるよう に、 駆動される溶液の量 が同じであつてち、 図 7 の駆動パ夕ーンに従つた駆動よ り ち、 図 6 の駆動パタ一ンに従フた駆動の方が反応効率が向い 。 つ ま り、 ピス 卜ンを一定速度で移動させるよ り も 、 ピス 卜ンを 間欠的に一定速度で移動させる方が 、 ι¾い /X ！、効率が得られ つま り 、 刖 Μしたよう に、 図 6 の駆動パ夕一ンに従った駆 動においては、 「引 く 」 動作時と Γ押す J 動作時にビス 卜ン が間欠的に移動されるため、 層流の発生が効果的に抑制され、 検体液が効率良く攪拌される。 これによ プロ一プと生体 関連物質の反応効率が向上し、 in果と して 、 検

時間を短縮 することが可能となる。

層流の発生を抑制する駆動パタ一ンは 、 Γ引 く J 動作時と

「押す」 動作時に、 ビス 卜ンを間欠的に ―定 is度で移動させ る駆動パターンに限定されない o 例えば Γ引 < J 動作時と

「押す」 動作時に、 溶液を脈動的に流動させるよラ にビス 卜 ンを移動させる駆動パ夕一ン、 フま U、 一定 ½度を基準にし て正弦波形的に変化する速度でピス 卜ンを移動させる駆動パ ターンであってもよい。 あるいは、 「引 く 」 動作時と 「押 す」 動作時に、 不規則に変化する速度でピス 卜ンを移動させ る駆動パターンであつてもよい o

勿麵、 本実施形態においても 、 溶液は そのェ程に した 流動速度で流動させるとよい。 < れによ y 、 その工程を短時 間で終了させることが可能となる 0 結果と して 生体 連物 質の検査の所要時間を短縮する < とが可能となる o 第四実施形態

図 1 ひは本実施形-態における反応 I程の駆動パターンを示 し、 図 1 1 は本実施形態における洗浄工程の駆動パターンを 示している。 それぞれの図において、 横軸は経過時間を示し、 縦軸はシリ ンジポンプ 8のピス トンの位置を示している。 右 下がり の区間は 「引 く 」 動作に対応し、 右上がり の区間は

「押す」 動作に対応している。 傾きの大きさは、 ピス トンの 移動速度を表しており 、 従って検体液の流動速度に対応して いる。 さ らに、 「弓 I く 」 動作から 「押す」 動作へと続く 区間

(略水平部） は、 各駆動パターンにおける ピス トン停止位置 を示しており 、 各工程で駆 する液量に対応してい Ό o

シリ ンジポンプ 8 のビス 卜ン停止位置は、 fe. }心 2-程よ り洗 浄工程の方が下方 («- nX At Sれている。 これに伴って 、 検体液 を反応させた後に 、 反応液よ り ち多量の洗浄液を供給して 、 洗浄工程の方がよ り 多く の液厘を駆動する。 これによ り、 反

『心工程において、 反応容器の管路に付着した検体液を、 続 < 洗浄工程で装置のバラツキ等の影響を受けることなく 、 よ 効果的に洗浄することが可能となる

本実施形態は、 生体関連物質の検査における複数のそれぞ れの工程において 、 そのェ程に適した駆動位置で溶液を流動 させることに向けられている 。 つま り 、 それぞれの工程にお いて、 シリ ンジポンプ 8 を 、 そのピス 卜ンの駆動位置が異な る駆動パターンに従って駆動する o 曰 い換えれば、 シリ ンン ポンプ 8のビス 卜ンの駆動里が、 生体関連物質のそれぞれの ェ に <IOいて変更される。 その変更したビス 卜ンの駆動量に 合わせて、 溶液を供給す Ό M t 変更される 0

例えば、 反応工程においては m 1 0 の駆動パ夕一ンに準じ て、 シリ ンジポンプ 8のビス 卜ンは、 溶液に 1 0 t I z秒の 流動速度を与える一定の速度で 5 秒間引かれる とによ り 、

5 0 μ Ι の溶液を流動す o 一方、 図 1 1 の駆動パ夕一ンの 洗浄工程においては、 1 2 iL 1 秒の流動速度を与える一定 の速度で 5 秒間引かれることによ り、 6 0 I の溶液を流動 する。

このとき、 接続口 3 0 2 a〜 3 0 2 d に接続された管路に は、 流動させる液量に応じて溶液が吸い込まれる O 例えば 、 反応工程で 5 の溶液を流動した場合 、 流 ¾·の内径が 1 m mであ り 、 吸い込まれる溶液長さは 6 4 m m程度となり 、 繰り返し流動を行なう ことによ り 、 溶液先端部である 6 4 m m近傍に溶液残りが生じ あてれがある o

これを避けるため、 続く洗浄工程では、 6 0 I の溶液を 供給して、 ポンプを駆動し流動する。 これによ y 吸い込ま れる溶液長さは 7 6 m m程度となリ、 反応ェ程時の溶液残 も十分洗い流すことができる。

[流体の移送制御]

以下、 生体関連物質の検査方法における流体の移送制御に ついて説明する。

本発明の移送制御は、 流体の特性が機能性基体との接触条 件によって反応性に影響を与える点に着目 し 、 流体の特性に 応じて流体の移送の制御条件を変更する 0 れによ 能 性基体の流体に対する機能を最大限に引き出す とを図つて いる。 制御条件は、 流速、 移動時間、 移送回数、 移送方向等 の一つまたは複数の組み合わせから適宜選ばれる。 流体の特 性と しては 、 物理的特性と化学的特性とがある 。 「物理的特 性」 と しては 、 例えば、 粘性、 容積、 蒸 /土、 光屈折率、 磁 性、 拡散定数があげられる。 「化学的特性 J は 、 例えば、 T m値、 反応力一ブ 、 機能性成分 （核酸 、 in,体、 酵素等） があ げられる。

第五実施形態

本実施形態においては、 サンプルまたは 式 ¾または両者の 粘性に応じて D N Aチップへの移送圧力を変化させる。 機能 性基体と しての D N Aチップに適用されるサンプルは、 由来 する個体ごとに異なる粘性を有している 。 この粘性は、 サン プル中の多彩な成分が関係するので、 粘性を一定の値に調節 することは通常困難である 別々のサンプルに存在する同じ 成分は、 異なる粘性条件において基体と接触する 粘性が異 なる液体は同じ表面に対して異なる摩擦抵抗でもつて移動す 従つて 、 本実施形態では 、 粘性レベルに対応してサンプ ルの流動状態を変化させるしとによつて、 基体の m をなる ベく 同じよう に発揮させるよう にシ ンジポンプ 8 を駆動さ せる な 、 本実施形態において 便宜上、 基体の破損や詰 ま りのよラな故障に起因する流動性のばらつきは考慮しない。

図 1 2 は > 本矣施形態を実施するための D N Aチップ読み 取リ装置の概略構成を示している 図 1 2 において 、 図 Ί に 示された部材と同一の参 "昭、、符 C指示された部材は同様の部 材であ り 、 その詳しい St明は省略する 。 この D N Aチップ読 7450

2 2

o み取リ装 o置は 、 図 1 2 に示されるよう に 、 D N Aチップ 4上 のサンプルに Όいて粘性を調べるために 、 シリ ンジポンプ 8 と切替バルプ 6 の間の連結流路に相当する配管 7 に圧力セン サ 1 7 を備えている。 圧力センサ 1 7 を切替バルブ 6 ょリ ポ ンプ側に配置することにより 、 切り替えられた各連結流路に 相当する配管 5 a 、 5 b、 5 c 、 5 d を通じて各反応室 3 a

3 b、 3 c 3 d 内に対応する各反応部 4 a 、 4 b、 4 c 、

4 d における流動抵抗を、 共通の圧力センサ 1 7 によって選 択的に検知でさる 。 圧力センサ 1 7 の値は演算ユニッ ト 1 5 を介してシ ンンポンプ 8のポンプ制御ユニッ ト 1 4 にフィ 一 ド J ック される 。 但し、 圧力センサ 1 7 によるシリ ンジポ ンプ 8 へのフィ 一 ドバック制御は、 D N Aチップ 4 の品質異 常に関係する異常な圧力変化 （例えば、 亀裂、 破損、 詰ま り

) とは連動しないよつ にする。 基体の標準の品質異常に起因 する流動抵抗値は 異な 流体溶液によつても類似の圧力変 動パターンを示すので、 粘性による 、答性の増減パターンと は明らかに区別することが可能であろ う 。 具体例と して、 孔 mないし 0 . 6 μ mの範囲のアルミナ製の多孔 質材料を 0 • 0 5 c mないし 0 . 5 c mの厚さに成形した D

N Aチップ 4 を用いた場合、 標準的な粘性を有するサンプル に ί ¾ ネ示 の /ノ ιΐ速を 3 5 At I /秒とすると、 比較的高い粘 性群のサンプルについては 5 0 n I 秒の流速と し、 比較的 低い粘性群のサンプルについては 2 0 t 1 Z秒の流速とする のが好ま しい o れによ り、 機能性基体に対する機能を最大 限に引き出すことが可能となる。 第六実施形態

本実施形態においては、 検査項目の入力データに基づいて 試薬情報を演算ユニッ ト 1 5 に送出し、 試薬情報に含まれて いる試薬の特性または試薬が作用するサンプル中の成分の特 性またはその両方に応じて異なる流動条件に設定する。 例え ば、 試薬が核酸成分を含んでいるか核酸成分に反応する何ら かの成分を含んでいる場合、 サンプルまたは試薬の T m特性 毎に異なる流動条件となるような変更可能な制御信号をボン プの流速制御部へ送出する。 機能性基体と しての D N Aチッ プに適用されるサンプルまたはこのサンプルと反応するため の試薬は、 温度依存性の成分である核酸を含んでいる。 核酸 の温度依存性は、 D N Aの二本鎖が、 一本鎖同士に解離する 温度と二本鎖に復帰する温度とに関係する。 多く の場合、 一 本鎖へと解離する温度である T m値が核酸の塩基配列によつ て異なる。 異なる温度条件はサンプルおよび試薬の流動に影 響を与えるので、 T m値の違いに対応する流動速度に制御す るのが好ま しい。 各 T m値に対応する温度ごとにサンプルま たは試薬または両者の熱力学的条件を一定に維持するよう に 流動条件を調整することによって、 多数の核酸八ィプリダイ ズ反応が一定の反応条件下で実行され ¾■

向 m度な丁一夕解析 が可能となる

図 1 3 は、 本実施形態を実施するための D N Aチ Vプ αΤΠみ 取り装置の概略構成を示している。 図 1 3 において 、 図 1 に 示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部 材であり 、 その詳しい説明は省略する この D N Aチク ノ e 4 007450

2 4 み取り装置は、 図 1 3 に示されるよう に、 D N Aチップ 4上 のサンプルについての T m値を演算ュニッ 卜 1 5 に認識させ るために、 入力装置 1 8 を備えている。 入力装置 1 8 は、 例 えば、 キーボー ド、 夕 ツチパネル、 マウスを用いて、 使用者 が T m値に関連する情報を入力することができる。

入力 した情報は表示用のディ スプレイ 1 9 によって使用者が 確認する。 入力装置 1 8 の別な態様は、 例えばバーコ ー ド (一次元または二次元模様から成る） のような情報媒体をデ 一夕処理によってコー ド解読するようなコー ド · リ ーダーで ある。 公知のコー ド · リ ーダ一は、 使用者が操作する場合と、 検査システム内に搭載して保持された基体上に自動的にァク セスする場合とが有り得る。 入力装置 1 8 を通じて演算ュニ ッ 卜 1 5 にサンプルごとの T m値が送信されると、 演算ュニ ッ 卜 1 5 は、 T m値の違いに応じて攪拌の強さ又は時間を変 化させる。 特に、 T mが小さ く解離し易いほど、 流速を緩慢 にするよう に制御することによって、 余分な解離を少なく す る。 核酸ハイブリダィズ反応における安定な解離条件は、 反 応結果の信頼性に寄与する。

第七実施形態

試薬が P C R (ポリ メラーゼチェーンリ アクシ ョ ン） 用で ある場合にはサーマルサイクルにおける反応カーブに応じて 攪拌の強さを変化させる。 サ一マルサイクルは、 核酸の二本 鎖に関する解離と復帰に適用される異なる温度条件からなる。 同じサンプルでさえ、 高温時と低温時の流体特性は変化する ので、 同じ D N Aチップに対する接触条件が異なる。 サーマ JP2004/007450

2 5 ルサイクルにおいてなるベく 同じ接触条件に維持するのが好 ま しい。 二本鎖の解離には比較^!強い i動条件が適している。 反対に、 一本鎖からの復帰には比較的 い流動条件が適して いる。 本実施形態では 、 サ一マルサイクル中の！ ¾温過 では 低温過程に比べて相対的に流動 is度 问速にする。 核酸八ィ ブリ ダイズ反応のサィクルが常に同等の接触条件で進行すれ ば、 反応結果と しての R応厘が最高に向か Ό

本実施形態は、 図 1 3 と同様の装置で実施することができ る。 まず、 入力装 Λ 1 8 から送られた検査項目の入力デ一夕 に基づいて試薬情報を演算ュニッ 卜 1 5 に送出し、 P C R用 試薬の特性に関連するサ一マルサイクル毎にポンプの流速制 御部へ制御信号を送る

第八実施形態

本実施形態では、 πϊ 薬の反応感度に応じて洗浄液の流 の 強さを変化させ 问咸度の試薬による J5Z. K> R応糸百果の 測定において精度低下の原因となるような余分な反応の を抑制する必要が有る

本実施形態は 、 図 1 3 と同様の装置で実施することがでさ る ず、 入力装置 1 8 による検査項目の入力データに づ いて試薬情報を 寅 ュ一ッ 卜 1 5 に送出し \ B 薬と しての洗 浄液の強弱の要求に関連する反応感度毎にポンプの流速制御 を行なうようなポンプ制御ュニッ 卜 1 4 へ制御信号を送る。 反応感度が高い試薬を使用 した反応の洗浄については比較的 強力な洗浄を行なう必要があるので、 流動速度や時間、 回数 の数値を高く 設定する。 逆に、 反応感度が比較的低い試薬を 07450

2 6 使用 した反応の洗浄については、 相対的に低い設定値にする 第九実施形態

本実施形態では 、 ポンプ駆動時の D N Αチップ上の水位に 応じて気泡が生じない最速な流動に変化させる 。 特に 、 液体 の移動中に水位が変化する l¾j。■において D N Aチップ上の 水位が低いほど緩慢な速度に 9 る。

本実施形態は、 図 1 と同様の装置で実施することができる が、 演算ユニッ ト 1 5 が、 蛍光検出ュ二ッ 卜 1 2 の励起用 ビ 厶の光吸収または光反射に関する検 ιΔ丁 夕に基づいて、

D N Aチップ上の水面画像を解析して、 水位を算出する点が 異な O まず }心室 3 d の反 )'L、部 4 d の反応経過や結果を 測定するための蛍光検出ュ二ッ 卜 2 をステーン 1 を X軸方 向の図示 2c mまで移動することによつて反応部 4 d の上方に 移動させ ■0 次に上述したよう に X移動板 1 c の移動に伴 いラック 1 0 ち移動し、 ピニ才ン 9 が回転し、 切替バルブ 6 の操作軸 6 a 回転し、 反応 3 c とポンプ 8 の流路が切替 バゾレブ 6 を介して接続される の状態で、 演算ュニッ 卜 1

5 によりポンプ制御ュニ y 卜 1 4 を介してボンプ 8 をコ ン 卜 ロールする とによ り 、 反応室 3 C 中の溶液を流動させるこ とが可能となる 。 本実施形態では 蛍光検出ュ ッ 卜 1 2 の 対物レンズ 1 3 を上下に移動可能とするのが好ま しく 、 隹占 位 を nj'変にすること によつて D N Aチップ上の水位を光 源からの出射ビームによる水面付近における光吸収または光 反射を継続的に検出する。 公知のフォーカシング機構によれ ば、 対物レンズを移動させずに焦点位置を可変にする光学的 2 技術も利用できる。 光検出ユニッ トによる検出データは、 反 ϋ5室 3 c 中の溶液の流動状態をモ二タ リ ングするのに用いら れる 。 このよう にして、 蛍光検出ュ一ッ 卜 1 2 の C C Dで取 得した光吸収 （または光反射） デー夕を演算ユニッ ト 1 5 に 送出して、 ポンプの流速制御部にフィ一 ドバックさせる。

第十実施形態

本実施形態では、 D Ν Αチップにおける測定タイミ ングに 合わせて基体上の流動速度を増減させる。 測定時には流動状 態をなるべく 静的な条件にするととちに、 非測定時には流動 状態をなるベく 動的な条件にする。

本実施形態は、 図 1 と同様の装置で実施することができる。 まず 、 反応室 3 d の反応部 4 d を蛍光検出ュニッ 卜 1 2 の対 物レンズ 1 3 の焦点位置に移動させる 。 次に、 ステージ 1 を

X軸方向の図示左端まで移動することによって反応部 4 d の 上方に移動させる。 次に上述したよ 0 に、 X移動板 1 c の移 動に伴いラック 1 0 も移動し、 ピニ才ン 9 が回転し、 切替バ ルブ 6 の操作軸 6 a も回転し、 反応室 3 c とポンプ 8 の流路 が切替バルブ 6 を介して接続される ο この状態で、 演算ュニ ッ 卜 Ί 5 によ りポンプ制御ュニッ 卜 1 4 を介してポンプ 8 を コ ン 卜ロールすることによ り 、 反応室 3 c 中の溶液を流動さ せることが可能となる。 ここで、 ポンプ 8 による駆動を断続 的に実施しながら蛍光検出ュニッ 卜 1 2 による D N Aチップ 上の反応を連続的に測定する。 この連続的な測定において、 ポンプ 8 による溶液駆動を実質的に静止させるか波を生じな いような一定の低速条件 （例えぱ 5 At 1 /秒） を間欠的に適 用 し この低速に いて得られる蛍光デー夕を実測値と して 採用する 。 このよう に ― 定タイ ミ ングに合わせて基体上の 流動 を増減させることによって、 D N Aチップ上の反応 を促進しながら リ ァル夕ィム測定できるので検査時間を短縮 することが可能となる なお、 この実施例において、 一定の 低速条件とは、 液面の乱れを抑制する流速に減速すること、 あるいは均等な対流状態で測定を行なうよう に液面に応じて 加減速することを意味する。 蛍光検出ュニッ 卜 1 2 は、 励起 用 ビームの光吸収または光反射に関する検出データを用いて、 液体の動的および静的状況をモニタ リ ングするために利用す ることも可能である。

表 1 はサンプルまたは試薬の各特性に対する好適なピス ト ン駆動速度との関係である。

液体の特性とピストン駆動速度の関係

ピストン駆動速度

第五実施形態

问 ^ p性 加速（到達値 50 IZ秒）

低粘性 減速（到達値 20 jW IZ秒）

第六実施形態

高 Tm値 加速（到達値 40 1/秒）

低 Tm値 減速（到達値 秒）

第七実施形態

PCR試薬 (1 )高温時は加速（到達値 40 lZ秒）

(2)低温時は減速（到達値 10 IZ秒） 定温試薬 一定速度（平均値 20 i l/秒） 第八実施形態

高感度試薬 加速（到達値 40 U I 秒）

低感度試薬 減速（到達値 10 U IZ秒）

第九実施形態

高水位 加速（到達値 40 β I 秒）

低水位 減速（到達値 10 μ Iノ秒）

第十実施形態

測定実施中 減速（到達値 10 μ I 秒）

測定非実施中 加速（到達値 40 U Iノ秒）

以上の流体移送の制御においては、 以下のよう にシリ ンン ポンプを駆動することがでさる 図 1 4 は 、 シリ ンジポンプ

8 の一般的な駆動パターンに cfcる 2種類の 動条件を示して いる。 図 1 4 において、 X軸は経過時間を示し 、 Y軸はシリ ンジポンプ 8 のビス 卜ンの位置を示している 右下がリの区 間は 「弓 1く j 動作に対応し 、 右上がりの区間は 「押す」 動作 に対応している 。 傾きの大ささは 、 ビス 卜ンの移動速度を表 T/JP2004/007450

3 0 しており 、 従つて検体液の流動速度に対応している 。 図 1 4 において 実線は相対的に高速の駆動パ夕一ンを示し、 点線 は相対的に低速 （実線の 2分の 〗 の速度） の駆動パターンを 示している o 図から分かるよう に 1 回のポンプ往復に要する 時間は流動 件によって違うので、 高速駆動するほど所定回 数の駆動に する時間は短縮される。

1 4 から分かるよう に、 一般に、 シリ ンジボンプ 8 のピ ス 卜ンは、 一定の速度で連続的に押され、 一定時間のあいだ 停止された後、 押す動作時と同じ速度で連続的に引かれる。 この一連の動作が、 一定時間の間隔を置いて、 繰り返し行な われ Ό。

なお、 ンリ ノ ンホンプ 8の駆動パ夕一ンは、 上述した例に 限定される のではな < 、 本発明の要日を逸脱しない範囲に おいて様々な変形や変更が施されてもよい。 例えば、 他の駆 動パターンと しては 、 ン リ ンンポンプ 8 のビス 卜ンを、 「引 く J 動作時に 、 一定の速度で 1 秒間引かれ、 1 秒間停止され この一連の動作が 4 回繰リ返される。 その後、 「押す」 動作 時に 、 一定の速度で 1 秒間押され 1 秒間停止され、 この一連 の動作が 4 回繰り返される o この一連の間欠的な動作全体が

1 サィクルを成し、 そのサイクルが、 繰り返し、 必要な回数 だけ行なわれる o 流動速度が連続的な一定の流体においては 流路の壁面近 < の流体が攪拌されないという、 層流と呼ばれ る現象が起こる 0 上記の間欠的な駆動パターンに従つた駆動

I おいては、 Γ引く J 動作時と 「押す」 動作時において、 ピ ス 卜ンが間欠的に移動されるため、 層流の発生が効果的に抑 制される。 層流の発生を抑制する駆動パ夕一ンは、 「引く」 動作時—と 「押す」 動作時に、 ピス トンを間欠的に一定速度で 移動させる駆動パターンに限定されない。 例えば、 「引く J 動作時と 「押す」 動作時に、 溶液を脈動的に //it動させるよう にビス 卜ンを移動させる駆動パターン 、 つま 、 一定速度を 基準にして正弦波形的に変化する速度でピス 卜ンを移動させ る駆動パターンであってもよい。 あるいは 、 Γ引 く」 動作時 と 「押す」 動作時に、 不規則に変化する is度でビス 卜ンを移 動させる駆動パターンであってもよい o

また、 上記の実施形態では流体の特性に応じて 2種類の流 速条件を選択的に設定したが、 3 種類以上の条件を設けても よい。 例えば、 サンプルまたは試薬ごとに不特定多数のバラ ツキが有る特性 （粘性、 容積等） については 中間的な流速 に相当する標準条件を設定して、 標準レベル内の特性につい ては標準条件でもって流体移送するよう にしてもよい。

これまで、 図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べ たが、 本発明は、 これらの実施の形態に限定されるものでは なく 、 その要旨を逸脱しない範囲において様 な変形や変更 が施されてもよい。 言い換えれば、 本発明は 発明の要旨と 請求の範囲が及ぼす技術範囲において種々の 更ゃ均等物を 含む。

上述した実施形態では、 機能性基体と して D N Aチップを 用いた遺伝子反応の検査を例にあげて説明したが、 本発明は、 遺伝子以外の生体関連物質の検査のための 能性基体から成 る他の検査チップを用いた他の生体関連物質の検査、 例えば 免疫反応や生化学反応や電気化学反応等の検査に適用されて もよい。 さ らに、 機能性 は、 種々の形態のものを適用す ることが可台 B匕 例 、 シリ コ ンウェハやガラスのよ うな二次元基体、 種々の ズゃ微粒子、 種々の多孔質基体 種々のゲル 種々のキャ リ ー型ア レイ （特開平 1 1 — 7

5 8 1 2 号公報や特開 2 1 一 1 5 3 8 6 0号公報参照） 種々のカラ厶を単独また 宜組み合わせて適用することが 可能であ り 、 機能性を有する基体と機能性を有さない基板と の組み合わせでもあ り得る。 特にキヤ ピラ リ ー型ア レイを基 体と して利用する場合には、 微細流路の内壁に機能性を有す る試薬を必要数量だけ固相化してちよいし、 機能性を有する 試薬を必要個数だけ固相化したビ一ズまたは微粒子を流路内 にポジシ ョニングするよう にしてちよい 。 微細流路における 流体の流動条件は、 上述した D N Aチップと同様のコ ンセプ 卜で適宜最適化を行なうのが好ま しい o また、 複数の検査結 果に対応する複数の基体を統合的に処理する場合には 、 複数 の基体を同じ領域に並べたり 、 共用のポジシ ヨ ンに対して順 香に位置付けた リするよう に搬送するしとができる。 また、 複数の機能性を有する ½体によ 検査を 、 設定すべき '/Μ動条 件ごとに各基体をソ一ティ ングして処理する制御システ厶で 実行させてもよい。 また、 非浸透性の一次元 ¾体 ¾用いる ½ 口に 1よ、 基体全体を囲む扁平な中ェ セルに成形する < とが できる。 扁平な中空型セルにおいては 、 部分的に異なる幅の 分岐通路を設けるとともに、 流体の流 方向または流動 is度 または両者を電気化学的または機械的 制御する機構を適宜 T JP2004/007450

3 3 付加する « とによって、 分岐通路ごとに 動条件を変更する ことが可能となる。 また、 種々のビーズ 、 種々の多孔質基体、 種々のゲルは、 多く の表面積を持つので 溶液を流動させな がら各種ェ程を行なう と効率が向上するが 本発明を適用す るとさ らに効率を向上することが可能となるので好ましい。 種々のビ一ズゃ微粒子を流体中に一緒に mi動させる場合には、 常に粒子沈降が生じない程度の流速に設定されているのが好 ましい o 機能性基体と して、 赤血球のよラな粒子状の細胞ま たはシ ―卜状の細胞膜を用いてもよい。 ビ ―ズや微粒子が磁 性体を含有していれば、 磁気発生手段による磁力でもって、 液体または気体の流動条件に依存せずに 、 磁気的に移動を加 速または減速させたり選択的に静止させた することが可能 となる 0 これによ り 、 本発明は、 磁性体含有の成分を有する 流体の mi動条件を磁気的に制御する方法および装置も包含す る。 磁力の制御は、 電磁石の電力を変化させるか、 永久磁石 との距離を増減することで自動化できる o また、 キヤ ビラ リ ー型ァレィは、 キヤ ピラ リー内壁表面またはキヤ ピラ リ ー内 に導入した複数個の微粒子表面に固相化した試薬に対して流 体と してのサンプルや試薬をポンプ等の圧力供給装置に接続 することによ り流体の往復移送を可能とする 自動化デバイス となり得るので好ま しい。 流体の往復移送中に複数回の測定 を行なうよう にすれば、 流体中の全部分から効率良く反応結 果を得ることができるという利点もある o

また 上述した実施形態では、 蛍光を発する試薬を用いた 蛍光検出を例に説明したが、 蛍光以外の測定可能な信号を発 生する試薬を用いた他の検出ュニッ 卜であ てもよい。 また 検出ュニッ トの検出は、 撮像用の c C Dを用いた広視野領域 に限らず、 例えば共焦点レ一ザー顕微鏡のような狭小領域に 関する測定であってもよい。 狭小領域をスキャニングすれば 複数の測定ポイ ン 卜を効率良く 測定できる o

また 、 上述した実施形態では、 シリ ンンピス 卜ンポンプを 中心に説明したが、 本発明はこれに限定されるものではなく 種々のポンプが適用可能である。 好ま しいポンプの形式は容 積型ポンプでめ "O 0 容積型ポンプと しては 例えば、 往復ポ ンプゃ隔膜ポンプゃ回転ボンプがぁげられる o 往復ポンプと しては 、 例えば、 ピス 卜ンポンプゃブランンャ一ポンプがあ る。 回転ボンプと しては、 例えば、 m卓ポンプゃ仕切リ板ポ ンプゃスク リ ユ ーポンプゃ口一ブポンプがある 。 これらのポ ンプは、 空間容積を周期的に変化させて液体の吸い込みと吐 出を行なうため 、 圧力変化を容易に制御可能であ y 種々の 工程に最迴な溶液の ：ぉ

/ ll動を行なう ことが可能であるので好ま しい o 液体を往復で固相化基体に接触させる場合には 、 特に 往復ポンプが好ま しい 。 例えぱ、 ビス 卜ンポンプやプランジ ャ一ポンプでは 、 ピス 卜ンゃブランジヤーの往復距離と移動 度によ り 、 溶液の駆動量および駆動速度を制御可能である ので 、 精密な溶液の i動を容易に行なう ことが可能でめ o 。

例えば、 往復型ポンプであるシリ ンジピス 卜ンポンプの場 シリ ンジピス 卜ンの移動が停止状態に近づいてい < と、 圧力差が小さ く なリ 溶液の移動速度が遅く なる o 溶液の粘 度が向かった り流路に抵抗があつた リ する場合など 溶液の 移動とシリ ンジビス 卜ンの移動に時間差が発生してしまう場

1=1は 、 この効果が顕著に現れ、 例えば 、 往復型ポンプの体積 の変化量を溶液の体積里 [<- 1¾ U 1<- 9 ると、 溶液の移動が不十 分になる。 そこで、 往復型ポンプの体積の変化量を溶液の体 積里よ り も多く すると 、 溶液の移動とポンプの動作状態に時 間差が発生しても、 溶液の移動が十分に起こ リ、 機能性基体 と溶液の接触が十分に起こる。 例えば 、 図 1 5 に示すよう に シリ ンジビス 卜ンポンプの初期化位置 P (例えば上死点） か ら下げた位置 Aで溶液を D N Aチップに添加する。 次に、 シ リ ンジピス トンを溶液の添加量に相当する体積分に相当する 位置 B まで降下させて溶液を吸引する 。 さ らに、 オフセッ 卜 体積 (吸引） 分に相当する位置 Cまで降下させ、 必要であれ ば一定時間 T 1 のあいだ保持した後、 位置 Dと位置 Eを経由 してシリ ンジビス 卜ンポンプの初期化位置に相当する位置 F

(または溶液を添加した位置よ り高い位置） までシリ ンジピ ス 卜ンを上昇させる。 位置 E と位置 Fの間の体積がオフセッ 卜体積 （排出） に相当する。 e t に、 必要ならば一定時間 τ

2 のあいだ保持した後 、 一連の動作を繰り返す。 図 1 5 で、 ピス トン位置の下向きの動きは溶液の吸引を示し、 上向きの 動さは溶液の排出を示している。

本発明を統括すると 次のよう に発明を捉えることができ る ο 本発明は、 別々のェ程に対応する異種の流体が、 工程ご とに異なる流動条件で |。]じ機能性基体に接触する。 ここで同 じ種類の流体が同時期または別時期に複数の機能性基体と接 触してもよい。 各工程において基体と接触する流体は異なる 目的を有するので、 目的を達成するに適した流動条件を工程 ごとに設定 tることによって生体関連物質に関する検査の質 を取高のものにすることができる。 特に、 実施形 ¾Eで述べた よう に、 生体関連物質と機能性基体との反応工程と測定前の 洗浄工程とをそれぞれ最適な流動条件で組み合わせるのが有 効でめ ^ ) また 、 測定前の洗浄工程の代わリ に、 測定工程と 反応工程とを取適な流動条件で組み合わせるものち同様に有 効でめ o 流動条件を詳細に説明するには、 基体の形状ごと に異なる流体の方向や流量を考慮 しなければならない。 つま

U 、 基体が多孔質フィルターの場合には、 フィ ル夕 を通過 するよう に 方向または双方向に流動させる。 実施形態のよ に試薬と しての複数種類のプローブを同一面上に配置でき るフ口 一スル 型の三次元構造を有する D N Aチップを基体 とする場合には 、 図示されるよう に D N Aチップの面を水平 にして流体と しての液面を上昇 （ポンプは陽圧） させたり下 降 （ポンプは陰圧） させたり する。 基体が溝または管状の微 細流路である場合には 流路に沿って一方向または双方向に 流体を流動させる。 流路の異なる位置に同種または異種の複 数の試薬を不動状態で配置することによ り 多数の反応を同時 に実行でさる 。 基体がビ ズまたは微粒子である場合には、 流動方向は任意であり 例えば円形や螺旋形や線状の流路内 の一方向または双方向であつてよい。 複数のビーズまたは微 粒子にそれぞれ異なる 5式薬を固相化することができ、 必要に

/心し c 敕列させたり 流体の流動に依存せずに停止または 移動させた y することによ り 多様な流動条件を設定できる。 いずれの形状の基体であつても、 上述したよ に一定の連続 的なポンプ圧による層流を M用するょ リ は、 間欠的または断 続的なポンプ圧の付与による脈流を適用する方が 、 流体中の 生体関連物質をよ り 多く基体と接触させることがでさるとい う顕著な作用を有する。 一定の流動条件を維持した検査は、 反応 · 洗浄 · 測定のどのよ うな組み合わせについても検査の 質が低下する。

本発明は、 機能性を有する基体のすべてに m用可能である が、 生体液中 に定常的に均一に存在する液状生体関連物質

(例えば電解質成分や酵素成分 ) にとつてよ り はむしろ、 機 能性基体における高比率で安定的な接触を要求する 、 非定常 的または不均一に存在する不溶性生体関連物質 (例えば核酸 や細胞や腫瘍マーカー蛋白 ) にとって重要である o 特 I -〜 δ 薬と しての不溶性の生体関連物質を固相化した基体は 、 生体 関連物質からなる極微細な突状構造を具備するので 、 その突 起群を動的に誘導するよう cC wit動条件の制御は基体表面全域 との良好な接触に寄与する。 突起群を形成する基体の底面付 近は 、 流体と接触が困難な場所で 、 流体と接触の比率または 確率が低い場所である。 この意味において、 上述した流体の 駆動パターンのうち、 流体の駆動中に任意の夕イ ミ ングで流 動を停止させる条件を付与することは、 突起群と流体との浸 透を顕著に向上させる点で好ま しい 。 突起群と流体との不十 分な接触は、 反応または洗浄またはその m方に不満足な結果 をもたらすだけでなく 、 場合によつては気泡または前工程の 流体の液残り を許してしま う。 測定工程においても、 気泡ま たは液残り による測定ノイズを除去するために流動条件を制 御するのが好ま しい。 反応工程の前段階と して、 サンプルま たは試薬またはその両方と しての生体関連物質を基体の所定 領域に不動化 （i m mo bi l izatio n ) する不動化工程を含む場合 には、 不動化を達成するに十分な流動の停止期間を設けるこ とが好ましい。 不動化工程は、 浮遊した生体関連物質を電気 化学的または有機化学的に直接的に基体に固相化する永久的 不動化処理に限らず、 あらかじめ生体関連物質を固相化した ビーズまたは微粒子を電気的または磁気的に基体のァ ド レス 化された位置に動かなく する可逆的不動化処理を含んでいる。 本発明は、 任意の異なる流体と接触する機能性基体の機能性 を高比率かつ高確率で最大限に発揮させる方法および装置を 提供する。 また、 機能性基体が複数の異なる機能化成分 （例 えば試薬） を有する多項目測定においても、 個々の機能を必 要なタイ ミ ングで確実に発揮させるのに有効である。

Claims

gi 求 の 範 囲

1 . 機能性基体を用いた生体関連物質の検査方法であ y 流体を流動させて流体と機能性基体を接触させる複数のェ程 を有し、 それぞれの工程においてそのェ程に適した流動速度 で流体を流動させる、 生体関連物質の検査方法

2 . 請求項 1 において、 複数の工程 1よ % v 台 性基体と検 査対象の生体関連物質を反応させ o反 、工程と 、 能性基体 に残留する不所望な検体液を取り 除く洗浄工程とを含んでお り 、 反応工程においては、 機能性基体と /5Z. J心する検査対象の 生体関 物質を含む検体液を反応に適し /<- //II.動速度で流動さ せ、 洗浄工程においては、 洗浄水を洗浄に週した流動速度で 流動させる、 生体関連物質の検査 法。

3 • 請求項 1 において、 複数の工程は、 能性基体と検 査対象の生体関連物質を反応させ o反 、工程と 、 機能性基体 を流体の存在下で測定する測定ェ程とを含んでおり、 反応ェ 程においては、 反応を促進するに した流動条件で流体を流 動させ 測定工程においては 、 測定をー定の精度で行なうの に適した流動条件で流体を流動させる、 生体関連物質の検査 方法 o

4 請求項 1 において、 体積型ポンプを用いて流体を流 動させており 、 それぞれのェ程において 、 体積型ポンプの体 積変化里が異なるポンプの駆動パターンに従つて体積型ポン プを駆動する、 生体関連物質の検査方法

5 請求項 1 において、 往復ポンプを用いて流体を流動 させておリ、 それぞれの工程 1 おいて、 往復ポンプを、 その ビス 卜ンの移動速度が異なる駆動パターンに従つて駆動する、 生体関連物質の検査方法。

6 . 機能性基体を用いた生体関連物質の検査方法であ y、 流体を往復流動させて流体と機能性基体を繰り 返し接触させ る工程を有し、 その工程において、 往時と復時とで異なる i 動 is度で流体を流動させる、 生体関連物質の検査/ J法。

7 . 請求項 6 において、 往復ポンプを用いて流体を往復 流動させており 、 往復ポンプの 「押す」 動作時と 「引く J 動 作時でビス 卜ンの移動速度が異なる駆動パターンに従って往 復ポンプを駆動する、 生体関連物質の検査方法

8 . 機能性基体を用いた生体関連物質の検査方法であ u 、 流体を流動させて流体と機能性基体を接触させる工程を有し、 そのェ程において、 一定でない流動速度で流体を流動させる、 生体関連物質の検査方法。

9 . 請求項 8 において、 流体を間欠的に一定の流動速度 で流動させる、 生体関連物質の検査方法。

1 0 . 請求項 8 において、 流体を脈動的に流動させる 、 生体関連物質の検査方法。

1 1 . 1#求項 8 において、 往復ポンプを用いて流体を流 動させてお り 、 往復ポンプの 「押す」 動作時の最中や r引 く J 動作時の最中、 ピス トンの移動速度が一定でない駆動パ ターンに従って往復ポンプを駆動する、 生体関連物質の検査 お , 7k

1 2 . 機能性基体を用いた生体関連物質の検査方法であ リ 、 体積型ポンプを用いて流体を流動させて流体と機能性基 体を接触させる複数の工程を有し、 体積型ポンプの体積を 化させる量が流動させる流体の体積量よ り も多い、 生体関 物質の検査方法。

1 3 . 請求項 1 2 において、 体積型ポンプと して往復 ポンプを用い、 ビス 卜ンまたはプランジャーが、 上スし と下 死点の間に位置しているとさに、 流動させる流体を供給する、 生体関連物質の検査方

1 4 . 機能性を有しかつ流動可能な基体を複数のェ程で 流体中に保持しながら 、 生体関連物質に関する検査を行なう 生体関連物質の検査方法であ り 、 それぞれの工程においてそ

、東

の工程に適した流動 度で基体を流動させる、 生体関連物

質 の検査方法。

1 5 . 請求項 1 4 において、 流動可能な基体が磁 5 応答 性であって、 流体の 動状に依存せずに磁気的に移動させる 工程を有する、 生体関連物質の検査方法。

1 6 . 流体を移送する移送手段と、 流体の移送に対して 連続的に接触可能な 能性基体を保持する保持手段と、 移送 手段を制御する手段と 、 流体の特性に応じて少なく とも一

=π, 中

の制御条件を選択的に る制御条件設定手段とを備えて いる、 流体移送装置 o

1 7 . 請求項 1 6 において、 制御条件設定手段は流体の 特性を認識する特性 心識手段を備えている、 流体移送装置。

1 8 . 請求項 1 7 において、 特性認識手段は基体に対す る流体の流動状態を判別する判別手段を備えている、 流体移 送装置。

1 9 . 請求項 1 7 または請求項 1 8 において、 特性認識 手段は、 流体と気体との動的関係を測定する測定手段をさ ら に有している、 流体移送装置 o

2 0 . 請求項 1 6 において 、 機能性基体が多孔質構造を 有する基板である、 流体移送装置 o

2 1 . 請求項 1 6 において 、 機能性基体が微細流路構造 を有する基板である、 流体移送装置。

2 2 . 流体に対し機能する基体を流体と連続的に接触さ せる工程と 、 流体を少なく とち一つの制御条件によって移送 する工程と 、 流体の特性に応じて制御条件を設定する工程と を有している、 流体移送方法 o

2 3 . 流体が生体関連物質を S主

含む 5月求項 2 2 に記載の 流体移送方 /J o

2 4 . 流体の物理的特性に }心じて制御条件を設定する 、 請求項 2 2 または請求項 2 3 に記載の流体移送方法。

2 5 . 流体の化学的特性に }心じて制御条件を設定する 請求項 2 2 または請求項 2 3 に記載の流体移送 Λ法。