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KR100421262B1 - 분석 실행 장치, 그 장치의 제조 방법 및 그 장치의 제조에 멤브레인을 사용하는 방법 - Google Patents

분석 실행 장치, 그 장치의 제조 방법 및 그 장치의 제조에 멤브레인을 사용하는 방법 Download PDF

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KR100421262B1
KR100421262B1 KR10-1999-7009885A KR19997009885A KR100421262B1 KR 100421262 B1 KR100421262 B1 KR 100421262B1 KR 19997009885 A KR19997009885 A KR 19997009885A KR 100421262 B1 KR100421262 B1 KR 100421262B1
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binding agent
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헨드릭 지볼트 반다메
헤르마누스 요하네스 마리아 크로이웰
Original Assignee
팸진 비.브이.
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Abstract

본 발명은 분석을 실행하기 위한 장치에 관한 것이며, 상기 장치는 샘플 적용을 위한 표면으로 개구된 배향 관통 채널을 갖춘 지지체를 포함하고, 샘플 적용을 위한 표면의 하나 이상의 부위내 채널은 분석물에 결합할 수 있는 제1 결합 물질을 구비한다. 본 발명의 목적은 고 채널 밀도와 고 다공성을 가진 지지체를 제공하며, 샘플 적용을 위한 지지체의 유니트 당 상이한 제1 결합 물질을 포함하는 보다 높은 밀도 분석도 할 수 있다. 또한, 상기 지지체는 가시광에 대해 매우 투과성이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 통상의 미세 제조 기술을 사용할 필요가 없으며, 지지체의 물질에 대한 액체 분배의 개선된 제어를 제공하는 비교적 저렴한 지지체를 포함하는 장치를 제공하는 것이다. 상기 목적은 다공성 지지체가 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인인 장치로 달성된다.

Description

분석 실행 장치, 그 장치의 제조 방법 및 그 장치의 제조에 멤브레인을 사용하는 방법{A DEVICE FOR PERFORMING AN ASSAY, A METHOD FOR MANUFACTURING SAID DEVICE, AND USE OF A MEMBRANE IN THE MANUFACTURE OF SAID DEVICE}
이러한 장치는 "하이브리드화에 의한 서열화"로서 국제 특허 공개 WO95/11755에 개시된 것이 있다. 상기 장치는 지지체의 표면에 실질적으로 수직 배향된 채널을 구비한 지지체를 포함한다. 이 문헌에는 세 가지 유형의 지지체가 개시되어 있다. 제1 유형은 다수의 중공 유리 섬유로 이루어진다. 이것은 에칭 가능한 코어를 가진 유리 섬유를 적층하고, 그 적층체에 편평한 단부를 제공하며, 이들 단부를 연마하고, 상기 코어를 통상적으로 산으로 에칭함으로써 제조된다. 제2 유형의 지지체는 결정질 규소 웨이퍼의 전기화학적 에칭에 의하여 제조된 것이다. 먼저, 채널의 위치뿐만 아니라 이들의 크기는 표준 사진평판법을 사용하여 구획한다. 이어서, 배향된 채널을 전기화학적으로 형성한다. 제3 유형의 지지체는 무기질 지지체의 핵 트랙 에칭에 의해 제조된다. 이 방법은 지지체를 무겁고 강력하게 하전된 입자에 노출시키는 단계 및 습식 에칭 단계를 포함하는데, 이로 인해서 채널이 지지체의 표면 위에 무작위로 산재된 지지체가 얻어진다. 공극 밀도와 다공도가 높을수록 채널의 융합 가능성이 커지게 되어 다른 비융합 채널에 비하여 내유동성이 감소된다.
세 가지 유형의 지지체는 모두 노동 집약적 제조 방법 및/또는 고가의 출발 물질 및 톱질과 연마와 같은 비경제적인 조작, 및/또는 고가의 장치를 이용함으로 상당히 비싸다. 또한, 지지체들은 다공도가 30% 이상으로 비교적 낮은 것을 특징으로 한다. 보다 유리하게는 80%까지 더 높은 다공도가 달성될 수 있다고는 하지만, 비교적 낮은 채널 밀도에서만 그러할 뿐이며, 필적할 만한 다공도를 갖지만 더 높은 채널 밀도(및 따라서 보다 좁은 채널)를 가진 지지체과 비교하면, 지지체의 특정 부위의 채널의 유효 표면적은 더 작아진다는 단점이 있다. WO95/11755에 개시된 바와 같은 규소계 지지체의 또다른 단점은 이들이 광에 대해 불투과성이라는 것이다. 그러므로, 이들 지지체는 지지체에 결합된 분석물의 검출을 위해 광학 마커 시스템을 유리하게 사용할 수 없다. 널리 보급된 광학 마커 시스템은, 예를 들면 효소 유발 발색 반응, 생물발광 또는 화학발광, 또는 광발광에 기초한다. 후자의 경우, 여기광과 발산 발광 모두가 지지체 재료를 통과해야 한다.
본 발명은 분석을 실행하기 위한 장치에 관한 것이며, 상기 장치는 샘플 적용을 위한 표면으로 개구된 배향 관통(through-going) 채널을 갖춘 지지체를 포함하며, 샘플 적용을 위한 표면의 하나 이상의 부위 내 채널은 분석물에 결합할 수 있는 제1 결합 물질을 구비한다.
본 발명의 목적은 상기 단점들을 극복하고, 고 채널 밀도와 고 다공도를 겸비한 지지체를 제공함으로써, 샘플 적용을 위한 표면의 유니트당 상이한 제1 결합 물질을 포함하는, 보다 높은 밀도 분석이 가능하게 된다. 또한, 상기 지지체는 가시광에 대해 투과성이 크다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 통상의 미세 제조 기술을 사용할 필요가 없으며, 지지체의 표면에 대한 액체 분배의 개선된 제어를 제공하는 비교적 저렴한 지지체를 포함하는 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적은 다공성 지지체가 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인인 장치로 달성된다.
배향 관통 채널을 갖춘 산화금속 멤브레인은 금속 시트를 전기화학적으로 에칭함으로써 저렴하게 제조할 수 있다. 고려되는 금속으로는, 그 중에서도 탄탈륨, 티타늄 및 알루미늄, 뿐만 아니라 둘 이상의 금속의 합금과 도핑된 금속 및 합금이 있다. 산화금속 멤브레인은, 특히 습식인 경우 투과성이며, 여러 가지 광학 기술을 사용하여 분석을 할 수 있다. 이러한 멤브레인은 잘 제어된 직경과 유리한 화학 표면 성질을 가진 배향 채널을 구비한다.
따라서, 본 발명은 분석을 실행하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 샘플 적용을 위한 표면 상에 개구된 배향 관통 채널을 갖춘 지지체를 포함하고, 샘플 적용을 위한 표면의 하나 이상의 영역 내 채널은 분석물에 결합할 수 있는 제1 결합 물질을 구비하며, 상기 지지체는 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인이다.
바람직한 구체예에 따르면, 제1 결합 물질은 핵산 프로브, 항체, 항원, 리셉터, 합텐 및 리셉터에 대한 리간드로 구성된 군 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 장치를 사용할 수 있는 분석은 하이브리드화에 의한 서열화, 면역 분석, 리셉터/리간드 분석 등을 포함할 수 있다.
상기 장치를 DNA 서열 정보를 얻기 위한 도구로 사용하는 경우, 제1 결합 물질로서 상이한 염기쌍 서열의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 각 부위의 대형 배열을 제공한다. (부분적으로) 알려지지 않은 서열을 가진 DNA 또는 RNA 단편을 함유하는 샘플을 지지체에 접촉시키는 경우, 특이적인 하이브리드 패턴이 일어날 수 있으며, 이 패턴으로부터 DNA/RNA의 서열 정보를 도출할 수 있다. 이러한 "하이브리드화에 의한 서열화" 방법은 이 분야에 널리 알려져 있다[Fodor, S.P.A. 등 (1992)Science 251, 767-773 및 Southern, E.M. 등 (1994)Nucleic Acids Res. 22, 1368-1373) 참조].
본 발명에 따른 장치는 다수의 분석물에 대해 혈액과 같은 생물학적 표본을 스크리닝하는 데에도 사용할 수 있다. 상기 배열은, 예를 들면 이. 콜리(E. coli), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 뉴모니아(S. pneumoniae) 등에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 부위로 이루어진다. 생물학적 샘플은 EP 0.389.063호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 이 샘플을 지지체에 접촉시키면, 얻어지는 하이브리드화 패턴은, 예를 들면 적절한 광학 마커와 조합하여 CCD 카메라를 사용하여 판독할 수 있다.
박테리아에 대한 스크리닝과는 별도로, 본 발명의 장치는 바이러스 검출뿐만 아니라, 예를 들면 HIV 바이러스 및 HCV 바이러스 등의 상이한 아류형의 분류에 적합하다. 바이러스 분류는 잠재적인 약제 내성을 결정하는 데 필수적일 수 있다. 일반적으로, 이것은 바이러스 RNA 내 단일점 돌연변이를 검출할 수 있는 능력이 요구된다.
또한, 본 발명의 장치는 샌드위치 면역분석을 실행하는 데에도 적절하다. 이 경우, 제2 항체를 결합된 분석물에 결합시키는 데 사용하는 것이 바람직하며, 각각의 분석물에 대한 상기 제2 항체는 제3 표지된 항체에 의해 인식된다. 이것은 제2 및 제3 항체가 상이한 종으로부터 유도되고 제3 항체가 다른 종의 항체에 대하여 형성된다면 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 특정 분석물에 대해 제2 항체를 표지하지 않아도 된다.
또한, 본 발명의 장치는 문헌[Geysen 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002 (1984)]에 개시되어 있는 바와 같은 "펩스캔(pepscan)"을 실행하는 데 적절하다. 이 경우, 지지체의 여러 부위에 부착된 제1 결합 물질은 아미노산의 여러 가지 서열을 구성한다. 지지체가 특정 분석물을 함유하는 액체와 접촉하면, 여러 가지의 아미노산 서열에 대한 특이적인 친화를 나타내는 반응 패턴이 일어날 수 있다.
제1 결합 물질은 지지체에 공유 결합하는 것이 바람직하다. 이것은 지지체로부터 제1 결합 물질이 손실되는 것을 최소화한다. 산화금속에 대한 유기 화합물의 공유 결합은 이 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 문헌(Chu. C.W. 등,J. Adhesion Sci. Technol., 7, pp.417-433, 1993) 및 문헌(Fadda, M.B. 등,Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, pp.221-227, 1992)에 기재된 방법을 사용한다.
바람직한 구체예에 따르면, 산화금속 멤브레인은 산화알루미늄으로 이루어진다.
이러한 산화알루미늄 멤브레인은 멤브레인의 표면에 비하여 친수성을 갖는 관통 채널을 갖는 것으로 보인다. 따라서, 유리하게는, 친수성 액체를 멤브레인의 표면 위로 확산시키는 대신에 채널로 유입시키는 것이 바람직하다. 그러므로, 산화알루미늄 멤브레인은 각종 제1 결합 물질을 포함하는 고밀도의 부위를 수용할 수 있다. 배향 관통 채널을 갖춘 산화알루미늄 멤브레인은 문헌[Rigby, W.R. 등,Trans. Inst. Metal Finish.,68(3), p.95, 1990]에 개시되어 있으며, 영국 옥슨에 소재하는 아노텍 세퍼레이션스사(Anotec Separations Ltd.)에서 시판하고 있다. 이들 멤브레인은 바이러스를 정화하고, 센서용 효소를 저장하는 데 사용되고 있지만, 프로브 기재 분석을 실행하기 위한 지지체으로서의 그 타당성에 대해서는 시사되어 있지 않았다.
또한, 본 발명은 제1 결합 물질이 동일계에서 합성되는, 본 발명에 따른 배향 관통 채널을 갖춘 멤브레인을 포함하는 장치의 제조 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 한정된 수의 시약만을 사용하여 제1 결합 물질로서 통상 네 개의 뉴클레오티드 화합물(DNA에 대해 dA, dT, dC 및 dG, RNA에 대해 A, U, C 및 G)로 된 올리고뉴클레오티드 및 추가의 시약, 예를 들면 차단 시약 및 보호 시약을 포함하는 장치의 경우, 종래의 고상 합성 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진 하나의 부위 또는, 복수개의 부위의 배열을 제공할 수 있다. 시약은 잉크젯 기술을 사용하여 특정 부위의 관통 채널에 간편하게 적용할 수 있다. 잉크젯 기술을 사용하면, 한정된 부피의 액체를 정확하게 침착시킬 수 있다. 편평하고 비다공성인 지지체 상의 올리고뉴클레오티드 프로브의 동일계 합성은 이 분야에 널리 알려져 있다(예를 들면, T.P.Theriault: 신규한 Chem-Jet 기술에 기초한 DNA 진단 시스템, 바이오칩 배열 기술에 대한 IBC 회의, 워싱턴 DC에서 1995년 5월 10일 개최됨).
바람직한 구체예에 따르면, 뉴클레오티드 화합물은 정전기 인력을 사용하여 적용된다. 정전기 인력은 산재의 위험을 감소시킨다.
본 발명에 따른 관통 채널을 포함하는 장치의 또다른 제조 방법에 따르면, 제1 결합 물질은 잉크젯 기술을 사용하여 특정한 부위의 관통 채널에 적용된다. 이에 의해, 지지체에 적용하기 이전에, 예를 들면 그 서열을 검증하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우 제1 결합 물질을 정제할 수 있다.
전술한 이유로, 제1 결합 물질을 정전기 인력을 사용하여 적용하는 경우가 바람직하다.
또한, 본 발명은 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인, 예를 들면 산화알루미늄 멤브레인을 임의의 전술한 장치들을 제조하는 데 사용하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에 따르면, 분석의 실행 중 멤브레인의 여러 위치 간의 온도차를 조절하여 각종의 멤브레인 위치에서 여러 가지의 하이브리드화 조건을 형성한다.
본 발명의 용도는 핵산 하이브리드 분석 또는 면역 분석을 포함하는 것이 유리하다. 이러한 분석에서, 분석물을 포함하는 샘플을 본 발명에 따른 장치와 접촉시킨다. 이후에 분석물은 지지체에 부착된 제1 결합 물질에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 분석물을 다공성 지지체를 통하여 이동시킴으로써 크게 촉진된다. 결합의 검출은 표지에 부착된 제2 결합 물질을 첨가하고, 상기 제2 결합 물질을 제1 결합 물질과 분석물의 복합체에 결합되도록 하며, 제1 결합 물질을 고정화시킨 위치에서 표지가 존재하는 지를 결정함으로써 실행할 수 있다. 대안으로는, 분석물에 미리 표지가 제공될 수 있으며, 이 경우에서 제1 결합 물질로의 결합은, 제2 결합 물질을 첨가하지 않고 직접 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 임의의 장치를 포함하는 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 제1 결합 물질과 분석물 간에 결합이 생성되었는지를 결정하기 위한 검출 수단을 더 포함한다. 이러한 검출 수단은 표지가 제공된 제2 결합 물질일 수도 있는 것이 바람직하다. 표지는 발색 반응을 유발하거나 생물발광, 화학발광 또는 광발광할 수 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
a) 샘플을 전술한 임의의 장치와 접촉시키는 단계,
b) 제1 결합 물질과 분석물 사이에 결합시키는 단계,
c) 제1 결합 물질과 분석물 간에 결합이 생성되었는 지의 여부를 검출하는 단계
를 포함하는 샘플내 분석물의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서, 분석물은 핵산 프로브, 항체, 항원, 리셉터, 합텐 및 리셉터에 대한 리간드 등이 될 수 있다.
이제, 본 발명은 다음 실시예로 설명하기로 한다.
실시예 1
유동 셀 내 산화알루미늄 멤브레인을 사용한 두 가지 상이한 유형의 HIV-1 증폭물, 야생형 RNA(WT) 및 검정(Calibrator) RNA(Qa)의 동시 검출
분석물
WT-RNA 및 Qa-RNA 단편은 HIV-1 게놈의 GAG 영역으로부터의 일부분을 나타낸다. 단편의 중심 부분 내 21 nt 길이 영역과는 별도로, 이들 단편은 동일한 길이(145 nt)와 동일한 서열을 가진다. 단편들의 서열은 다음과 같다:
(서열 번호 1)
(서열 번호 2)
WT 및 Qa 특이적인 부분의 서열은 밑줄친 부분이다.
이 실시예에서, 두 가지 완충 용액을 사용하였다:
8 g/ℓNaCl을 함유하는 pH 7.4의 인산염 완충액("배양 완충액").
8 g/ℓNaCl 및 0.05% 폴리소르베이트(Tween 20)을 함유하는 pH 7.4의 인산염 완충액, 이하 "세정 완충액"이라고 함.
지지체
산화알루미늄 멤브레인, 두께 60 ㎛, 직경 24 mm. 채널은 직경이 0.2 ㎛이고, 밀도는 약 18 채널/㎛2이다("Anodisc 25", Whatman).
멤브레인 표면은 2 g/ℓ스트렙타비딘을 함유하는 배양 완충액에 멤브레인을 60 분 동안 침지시킴으로써 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 그 후, 멤브레인은 세정 완충액을 사용하여 세정하고 실온에서 공기 건조시켰다.
제1 결합 물질의 고정화
WT 단편 및 Qa 단편에 부분적으로 상보적인, 모두 5' 말단에 비오틴 분자가 결합되어 있는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 적용하였다:
WT-프로브: 5'GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG3'(서열 번호 3)
Qa-프로브: 5'GACAGTGTAGATAGATGACAGTCG3'(서열 번호 4)
통상의 "세선" 필기용 펜에서 찾을 수 있는 바와 같은 다공성 팁(나일론 피더)[독일 고스하임에 소재하는 하우저 슈라이프테크닉사(Hauser schreibtechnik GmbH)]을 사용하여 특정한 직경을 가진 점을 적용하였다. 피더 팁으로 멤브레인에 점을 찍는 한편, 다른 말단은 프로브 용액(배양 완충액, 프로브 농도 25 μmol/ℓ)을 함유하는 저장 용기에 유체 접촉시켰다. 멤브레인으로의 프로브 용액 전달은 멤브레인과 피더의 모세관 상호 작용에 의해 잘 조절하였으며, 즉 프로브 용액은 피더 팁과 물리적으로 접촉하는 이들 채널에 자동적으로 충전되었다. 이 실시예에서, 0.5 mm 직경의 점 3 개씩 두 줄로 사용하였다(각 프로브 유형당 3 개의 점). 각각의 점 간의 거리는 1 mm였다. 실온에서 10 분 동안의 점찍기 및 배양 후에, 미결합 프로브 물질은 세정 완충액으로 세정하였다.
이 실시예에서 4 개의 동일한 물질이 이 방식으로 생성되었다.
하이브리드화
그 다음, 멤브레인은 유동 셀에 도입하고 HIV RNA 단편을 함유하는 배양 완충액과 접촉시켰다.
네 가지 상이한 실험에서 네 가지 세트의 하이브리드화 조건을 적용하였다:
1. 1.5 ×1012분자의 QA RNA를 함유하는 부피 25 ㎕, 유동 없음.
2. 1.5 ×1012분자의 WT RNA를 함유하는 부피 25 ㎕, 유동 없음.
3. 1.5 ×1012분자의 QA RNA를 함유하는 부피 25 ㎕, 연속 유동.
4. 1.5 ×1012분자의 WT RNA를 함유하는 부피 25 ㎕, 연속 유동.
실험 1 및 2에서는 멤브레인을 통하는 완충액의 전달은 없었다. 실험 3 및 4에서는 25 ㎕ RNA 용액을 약 25 ㎕/분의 속도로 두 방향(전후 방향)으로 멤브레인을 통하여 연속으로 유입시켰다. 이 흐름을 조절하기 위하여, 자동화 해밀턴(Hamilton) 디스펜서를 사용하였다. 모든 실험에서 하이브리드화는 실온에서 10 분 동안 실행하였다.
세정
하이브리드화 후, 5 ㎖의 세정 완충액을 사용하여 멤브레인을 세정하였다.
표지화 및 검출
검출을 위하여, HIV RNA에 상보적인 서열을 가진 프로브(서열 번호 5)를 멤브레인과 상호 작용시켰다.프로브: TGTTAAAAGA GACCATCAAT GAGGA(서열 번호 5)이 프로브는 배양 완충액(40 nmol/ℓ)에 포함시켰다. 각각의 실험에서, 유동 없이 75 ㎕의 부피를 사용하였다. 프로브는 말레이미드 함유 헤테로 이작용성 가교 결합제를 사용하여 1:1 비율로 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 효소로 표지화하였다[Hashida, S. 등 (1984)J. Applied Biochem. 56, 56-63]. HRP 커플링 전에 프로브는 티올레이트화하였다[Carlsson, J. 등 (1978)Biochem. J. 173, 723-737].
10 ㎖ 세정 완충액으로 세정한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 과산화수소, TMB(Organon Teknika, art: 78510)를 함유하는 용액을 멤브레인에 접촉시켰다(유동 없음).
결과
결과의 해석은 육안으로 하였다. 실험 3 및 4에서, 특이적인 반응이 예상되었던 위치에서 청색 점이 거의 즉시 나타났다(WT 프로브를 함유하는 점은 WT-RNA를 사용하여 청색으로 변하였으며, Qa 프로브를 함유하는 점은 Qa-RNA를 사용하여 청색으로 변하였다). 완충액 내 RNA에 비상보적인 프로브를 함유하는 점으로는 색변이 관찰되지 않았지만, 점간 멤브레인 상의 영역은 수 분 경과 후 엷은 푸른 빛을 띠었는데, 아마도 이는 불충분한 세정 또는 어떤 비특이적인 결합 때문일 것이다. 실험 1 및 2에서도 유사한 결과가 얻어졌지만, 이 경우에서는 청색 점이 보이기 전까지 약 1 분이 걸렸다.
TMB 반응 동안의 점의 시각적 평가 외에, 밀도계(Biorad GS700)를 사용하여 실험 3 및 4에서 멤브레인 상의 점을 평가하였다. 이 목적을 위해서 멤브레인을 유동 셀에서 제거하였다(표 1).
밀도계로 측정된 점의 밀도
RNA 분석물 WT-프로브를 사용한 점[OD 유니트] Qa-프로브를 사용한 점[OD 유니트] 백그라운드 영역[OD 유니트]
WT-RNA 38 20 20
Qa-RNA 25 35 25
실시예 2
올리고뉴클레오티드 프로브는 알루미나와 올리고뉴클레오티드 간의 링커로서 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APS)을 사용하여 아노포어(Anopore) 멤브레인에 공유 결합시켰다. 이 실험을 위해서, 직경이 25 mm이고 총 표면적이 0.3 ㎡인 아노디스크(Anodisc) 25 멤브레인을 사용하였다.
멤브레인은 질산 용액(0.4 mol/ℓ)에 1 시간 동안 침지시켜서 활성화시켰다. 물로 세정한 후, 멤브레인을 건조시키고 APS의 0.25%(v/v) 수용액에 2 시간 동안 침지시켰다. 과량의 APS는 물로 세정하여 제거하였다. 감압 하에 120℃에서 건조시킨 후, 멤브레인을 저장하였다. APS 분자의 커플링으로 인한 아미노기 농도는 보통 2 내지 3 umol/㎡이었다.
커플링 전에, 아미노기 말단 올리고뉴클레오티드는 디숙신이미딜 수베레이트(DSS, 예를 들면 PIERCE BV, Immuotechnology Catalog Handbook, 1990 참조)와 반응시킴으로써 활성화시켰다. 올리고뉴클레오티드 말단에 생성된 숙신이미딜기는 APS 활성화 멤브레인에 커플링하는 데 사용하였다.32P를 사용한 표지화로 결과를 정량화하였다. 60 분 동안 아노디스크 멤브레인 상의 500 ul 올리고뉴클레오티드 용액으로 커플링하여 1 ×10-10mol/㎡ 올리고뉴클레오티드의 커플링 수율을 얻었다.
실시예 3
잉크젯 장치를 사용한 Al 2 O 3 멤브레인 상의 배열 패턴의 형성
표준 잉크젯 기술을 사용하여 직경이 20 um 내지 80 um인 소적을 생성할 수 있으며, 고 처리율과 um 단위의 해상도로 지지체 상에 위치시켰다. 시판 데스크젯(HP 660C)을 Al2O3 멤브레인과 함께 사용하여 해상도가 매우 높은 배열을 얻었다. 현미경(배율: 400x)으로 육안 검사한 결과, 매우 가파른(sharp) 테두리를 가지며 직경이 대략 60 um인 완전 구형의 점인 것으로 나타났다. 비다공성 표면을 사용할 때 통상 관찰되는 바와 같이, 산재의 조짐은 나타나지 않았다. 본 발명자들은 고 배열 해상도가 관통 채널의 친수성과 함께 재료의 고 다공성에 기인한다고 생각한다.
실시예 4
샌드위치 면역분석 실행
고상으로서 산화알루미늄 멤브레인을 사용하는 효소 면역분석을 이용한 사람 융모막성 생식선 자극 호르몬(hCG)의 검출
멤브레인의 코팅
산화알루미늄 멤브레인의 소영역(직경 20 mm의 원형)은 hCG에 대해 형성되는 1 ug/㎖ 모노클로날 마우스 항체(OT-hCG-4B)를 함유하는 완충 용액(0.0127 mol/ℓ인산염 및 0.140 mol/ℓNaCl, pH 7.4)으로 코팅하였다. 피펫으로 10 uℓ의 소적을 멤브레인으로 옮기거나, 폴리에스테르 피더(하우저)를 사용하여 점을 접촉 스포팅함으로써 용액을 적용하였다. 37℃에서 30 분 동안 배양한 후, 멤브레인을 사용하기 위해 준비하였다.
배양
양성 샘플은 농도가 2000 IU/ℓ인 50 uℓhCG와, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(1 ug/㎖)와 콘쥬게이트된 50 uℓ마우스 항-hCG(OT-hCG-3A)의 혼합물이었다. 이 혼합물을 15 분 동안 예비 배양하였다. 음성 대조군의 경우에는 50 uℓ완충액을 50 uℓ콘쥬게이트 용액과 혼합하였다.
그 다음, 혼합물(100 uℓ)을 멤브레인으로 피펫으로 옮기고 실온에서 15 분 동안 배양하였다.
세정 및 검출
멤브레인을 깔때기 상의 세정 완충액(0.131 mol/ℓNaCl, 0.0127 mol/ℓ인산염 및 0.5 ml/ℓ폴리소르베이트 20)으로 대충 세정하였다. 최종적으로, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 및 과산화수소(오르가논 테크니카)를 기재로 하는 HRP에 대한 기질을 함유하는 비이커에 멤브레인을 넣었다. 30 분 배양 중에 결과를 육안으로, 그리고 카메라로 관찰하였다.
결과
양성 샘플의 경우 멤브레인을 OT-hCG-4B로 코팅한 지점에서 맑은 청색 점이 수 분 이내에 보였다. 멤브레인의 다른 부분과 음성 대조군에서는 비교적 장시간의 배양 후에 단지 희미한 청색 백그라운드 색이 관찰되었다.
서 열 목 록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 악조 노벨 엔.브이.
(B) 거리: 벨페르베그 76
(C) 도시: 아른헴
(E) 국가: 네덜란드
(F) 우편번호: 6824 비엠
(G) 전화: 0412 666380
(H) 팩스: 0412 650592
(ii) 발명의 명칭: 분석 실행 장치, 상기 장치의 제조 방법 및 상기 장치의 제조에 멤브레인을 사용하는 방법
(iii) 서열의 수: 5
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 145 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 유형: RNA (게놈)
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1]
(2) 서열 정보 2에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 145 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 유형: RNA (게놈)
(xi) 서열 번호 2
[서열 2]
(2) 서열 정보 3에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 유형: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3]
(2) 서열 정보 4에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 유형: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4]
(2) 서열 정보 5에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 25 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 유형: DNA (게놈)
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5]

Claims (16)

  1. 샘플 적용을 위한 표면 상에 개구된 배향 관통 채널을 갖춘 지지체를 포함하고, 샘플 적용을 위한 표면의 하나 이상의 부위내 채널은 분석물에 결합할 수 있는 제1 결합 물질을 구비하며, 상기 지지체는 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인인 것인 분석을 실행하기 위한 장치.
  2. 제1항에 있어서, 제1 결합 물질은 핵산 프로브, 항체, 항원, 리셉터, 합텐 및 리셉터에 대한 리간드로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 결합 물질은 지지체에 공유 결합된 것인 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화금속 멤브레인은 산화알루미늄을 포함하는 것인 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 결합 물질을 동일계 내에서 합성하는 것인 장치.
  6. 제5항에 있어서, 제1 결합 물질을 합성하기 위한 화합물은 잉크젯 기술을 사용하여 특정 부위에 적용하는 것인 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 정전기 인력을 사용하여 적용되는 것인 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 잉크젯 기술을 사용하여 제1 결합 물질을 특정 부위에 적용하는 것인 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 결합 물질은 정전기 인력을 사용하여 적용하는 것인 장치.
  10. 지지체가 전기화학적으로 제조된 산화금속 멤브레인인 것인 제1항 또는 제2항에 따른 장치의 제조 방법.
  11. 제1 결합 물질과 분석물 간에 결합이 생성되었는지의 여부를 결정하기 위한 검출 수단을 더 포함하는 제1항 또는 제2항에 따른 장치를 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검출 수단은 표지가 제공된 제2 결합 물질을 포함하는 것인 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표지는 발색 반응을 유발할 수 있고 및/또는 생물발광, 화학발광 또는 광발광을 할 수 있는 것인 키트.
  14. a) 샘플을 제1항 또는 제2항에 따른 장치와 접촉시키는 단계,
    b) 제1 결합 물질과 분석물 사이에 결합이 생성되도록 하는 단계,
    c) 제1 결합 물질과 분석물 간의 결합 생성 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는 샘플내 분석물의 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 분석물은 핵산을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 사람 면역결핍증 바이러스로부터 유도될 수 있는 것인 방법.
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