DE69738184T2

DE69738184T2 - Lösung und verfahren zur wiederbelebung und heilung von ischämisch beschädigtem gewebe

Info

Publication number: DE69738184T2
Application number: DE69738184T
Authority: DE
Inventors: Lauren Albany BRASILE
Original assignee: Breonics Inc
Current assignee: Breonics Inc
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2017-05-17
Also published as: AU723424B2; CA2255657A1; ES2296310T3; US5843024A; CN1226132A; DE69738184D1; EP1021084A4; EP1021084A1; RU2199310C2; HK1021925A1; ATE374526T1; JP2000511531A; EP1021084B9; ES2296310T5; CN1163125C; EP1021084B2; CA2255657C; JP4259614B2; WO1997043899A1; EP1021084B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gewebe- und Organkonservierung, -erhaltung und -reparatur. Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, wobei in einem ischämisch beschädigten Organ oder Gewebe unter Benutzung einer darin bereitgestellten Zusammensetzung die Integrität, Funktion und Lebensfähigkeit wieder instand gesetzt wird.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Es besteht weiterhin ein extremer Mangel an Organen zur Transplantation. Gegenwärtig ist der Haupteinschränkungsfaktor für klinische Transplantation der Mangel an Organen. Zum Beispiel hängt die Nierentransplantation weitgehend von der Verfügbarkeit von Organen ab, welche von Kadaverspendern mit Herzschlag gewonnen werden. Des Weiteren sind eine große und bisher unerschlossene Quelle von Organen zur Transplantation die Kadaver ohne Herzschlag. Kadaver ohne Herzschlag sind Unfallopfer, die am Ort der Verletzung umkommen und jene, die kurze Posttrauma-Überlebenszeiten haben. In derartigen Fällen besteht der Grund, weshalb derartige Organe nicht benutzt werden, darin, dass nachdem das Herz aufhört zu schlagen, der Mangel an kreisender Blutzufuhr (warme Ischämie) in einer Verletzungs-Kaskade resultiert.
Ein Organ, das geringfügig aber funktionsgemäß durch warme Ischämie beschädigt ist, kann keine weitere Beschädigung tolerieren, die durch die Unterkühlung übermittelt wird. Unter den Unterkühlungsbedingungen, die benutzt werden, um Organe zu präservieren, die zur Transplantation bestimmt sind, erfährt die Lipid-Doppelschicht eine Phasenänderung und wird gelartig mit stark reduzierter Fluidität. Das im Wesentlichen gefrorene Lipid in den Zellmembranen negiert die Benutzung von O₂, selbst in Gegenwart einer hohen O₂- Spannung. Die metabolische Konsequenz ist Glykose, die analog zum Zustand von Anoxie ist. Es wurde beschrieben, dass Unterkühlung unter 18°C die tubuläre Aktivität der Niere inhibiert und dass bei 4°C die Benutzung von Sauerstoff ungefähr 5% derjenigen von Normothermie entspricht.
Unterkühlungslagerung kann auch Vasospasmus und ein darauffolgendes Ödem in einem Organ erzeugen. Hypothermisch präservierte Organe können glomeruloendotheliale Zellschwellung und Verlust an vaskulärer Integrität zusammen mit tubulärer Nekrose erfahren; ein Phänomen, das den eingesetzten Unterkühlungsbedingungen zugeschrieben werden kann. Unterkühlung kann auch die von Na/K abhängigen ATPase inhibieren und zum Verlust der Zellvolumen regulierenden Kapazität führen. Genau der Verlust der Volumenregulierung bewirkt die Zellschwellung. Eine ausreichende Zufuhr an Sauerstoff kann die Menge dieser Schwellung aktive herabsetzen. Ohne angemessene Sauerstoffzufuhr führ die Anoxie zur Disintegration der kleineren Gefäße nach mehreren Stunden Perfusion. Der Mangel an Sauerstoff und die anschließende Verarmung an ATP-Vorräten bedeuten, dass die anaerobe Glykose die Hauptquelle an Energie unter traditionellen Präservierungsbedingungen darstellt. Der Mangel an molekularem Sauerstoff zur oxidativen Phosphorylierung, welche bei der Ischämie auftritt, führt zu einer Ansammlung an NADH und der Verarmung an ATP-Vorräten innerhalb der Mitochondrien. Der anschließende Verlust an Nukleosiden ist wahrscheinlich ein sehr wichtiger Faktor beim Versagen von Geweben, die warmer Ischämie und verlängerter Zeiträume kalter Ischämie ausgesetzt wurden, um ATP nach der Wiederherstellung der Blutversorgung zu regenerieren. Die Unfähigkeit, angemessenen Sauerstoff zuzuführen, führte zum routinemäßigen Verlass auf Unterkühlung zur Organpräservierung.
Ischämie (sei es warme Ischämie oder kalte Ischämie) ist daher eine Verletzungskaskade von Ereignissen, die als eine präletale Phase und eine letale Phase charakterisiert werden können. Die präletale Phase produziert auf drei Arten schädliche Auswirkungen: Hypoxie; Mangelernährung; und die Versäumnis, giftige Stoffwechselausscheidungen zu entfernen. Mit dem Mangel an kreisendem Blut geht ein Mangel an molekularem Sauerstoff einher. Die daraus resultierende Hypoxie induziert die Verarmung an Energievorräten, wie etwa die Verarmung an ATP-Vorräten bei den Mitochondrien. Die Verarmung an ATP führt zu Zellveränderungen, umfassend Ödeme, Verlust der normalen Zellintegrität und Verlust von Membranpolarität. Die Zellveränderungen induzieren die letale Phase von Ischämie, was in einer Ansammlung an Stoffwechselausscheidungen, der Aktivierung von Proteasen und Zelltod resultiert.
Die gegenwärtige Perfusatlösung, welche bei der Unterkühlungs-Organpräservierung den Stand der Technik darstellt und unter Unterkühlungsbedingungen optimierte Organpräservation bereitstellt, enthält Komponenten, die Unterkühlung induziertes Gewebeödem; Metaboliten, welche die Organfunktion nach der Transplantation erleichtern; Antioxidantien; Membranstabilisierungsmittel; Kolloiden; Ionen; und Salze verhindern (Southard et al., 1990, Transpl. 49: 251; und Southard, 1989, Transpl. Proc. 21: 1195). Die Formulierung dieses Perfusats ist derart konzipiert, um die Organe durch Unterkühlung induzierte Depression des Stoffwechsels. Während sie das Ödem und den Vasospasmus minimiert, welche normalerweise während der Unterkühlungslagerung angetroffen werden, stellt sie keine Benutzung einer im Wesentlichen erweiterten Spendergemeinschaft bereit.
Dies rührt daher, dass ein Organ oder ein Gewebe, das geringfügig aber funktionsgemäß durch warme Ischämie beschädigt ist, keine weitere Beschädigung tolerieren kann, die durch die Unterkühlung übermittelt wird. Selbst mit lediglich 30 Minuten Ischämie, kann die Nachtransplantationsfunktion eines Organs gefährdet werden. Zum Beispiel wird bei der Benutzung von Organen von Kadavern mit Herzschlag die unmittelbare Nichtfunktionsrate auf 25% geschätzt; und innerhalb von lediglich 30 Minuten Ischämie erhöht sich die unmittelbare Nichtfunktionsrate auf ungefähr 60%. 60% der Nieren von Kadavern ohne Herzschlag funktionieren somit nicht unmittelbar aufgrund der präletalen Ischämieverletzung. Ferner wird angenommen, dass irreversible Ischämiebeschädigung und -verletzung bei Organen vorkommt, die bereits ein paar Stunden oder weniger keine Durchblutung erfuhren (Klatz et al., US-Patentschrift Nr. 5,395,314 ). Sofern keine neuen Organquellen entwickelt werden können, bleibt die Anzahl an Transplantationseingriffen konstant. Des Weiteren kann die Spendergemeinschaft nicht im Wesentlichen erweitert werden, da kein Vorgang/System verfügbar ist, um präletale Ischämiebeschädigung in warmen ischämisch beschädigten Organen oder Geweben zu reparieren.
Neuste Bemühungen konzentrierten sich auf die Prävention ischämischer Beschädigung durch die Wiederbelebung mit einer erneuten Perfusion mit einer Lösung unmittelbar nach Unterbrechung der Blutzufuhr. Zum Beispiel wird eine schützende Lösung, offenbart in der US-Patentschrift Nr. 4,415,556 , während chirurgischer Techniken oder für Organe, die transplantiert werden sollen zur Verhinderung von ischämischer Beschädigung des Organs benutzt. Die schützende Lösung wird als Perfusat benutzt, um den aeroben Stoffwechsel währen der Perfusion des Organs zu verbessern. US-Patentschrift Nr. 5,395,314 beschreibt ein Verfahren zur Wiederbelebung eines Hirns, indem nach der Unterbrechung der Blutzufuhr eine hypothermische Lösung durch das Hirn zirkuliert wird (ungefähr 8–10°C), welche dazu bestimmt ist, den Organstoffwechsel zu mindern, Sauerstoff zuzuführen und freie radikale Beschädigung zu inhibieren.
Obgleich derartige Verfahren und Präservierungslösungen zur Prävention ischämischer Beschädigung in Organen nützlich sind, werden diese nützlichen Wirkungen von praktischen und funktionellen Einschränkungen überschattet. Als Erstes müssen zur Wirksamkeit dieser Verfahren und Lösungen bei der Prävention ischämischer Beschädigung diese unmittelbar (einige Minuten) nach der Unterbrechung der Blutzufuhr angewandt werden. Logistische Einschränkungen, zum Beispiel im Falle eines Unfallopfers als Organspender, können die Benutzung derartiger Verfahren und Lösungen stark schmälern, sodass sie nur in einer Krankenhausumgebung praktisch sind. Als Zweites wird angenommen, dass irreversible ischämische Beschädigung und Verletzung in Organen vorkommt, die innerhalb von Minuten (z. B. Hirn) oder innerhalb lediglich ein paar Stunden (Herz, Niere) keine Blutzufuhr erhalten. Ein Organ oder Gewebe, das geringfügig aber funktionsgemäß durch warme Ischämie beschädigt ist, kann keine weitere Beschädigung tolerieren, die durch die Unterkühlungslagerung vor der Transplantation oder der Wiederinstandsetzung der Durchblutung nach der Transplantation übermittelt wird. Ein Grund dafür besteht darin, dass die Wiederinstandsetzung des Kreislaufes nach der erneuten Ischämie-Perfusion paradoxerweise in weiterer Gewebebeschädigung resultiert (McCord et al., 1985, N Engl J Med 312: 159–163). Die Wiederinstandsetzung des Kreislaufes resultiert in einer erneuten Sauerstoffanreicherung des verletzten Gewebes. Die erneute Sauerstoffanreicherung von ischämisch beschädigtem Gewebe kann in einer weiteren Gewebeverletzung resultieren, die durch die Bildung von sauerstofffreien Radikalen, der Verarmung von freien Radikalfängern und der Freisetzung von chemotaktischen Agenzien bewirkt wird.
Daher besteht der Bedarf an einem Verfahren und einer Lösung, welche die Wirkungen von Ischämie in Organen oder Geweben während der präletalen Phase beseitigen, anstatt lediglich inhibieren, und einen Reparaturvorgang in Organen oder Geweben in den sehr frühen Stadien von letaler Ischämie unterstützen. Ein Verfahren zur Induzierung der Reparatur von ischämisch beschädigten Organen oder Geweben in dem Maße, dass die Beeinträchtigung der Funktion rückgängig werden kann und die Prävention weiterer Gewebebeschädigung während der Wiederinstandsetzung des Kreislaufes dazu führen kann, dass die Organspendergemeinschaft im Wesentlichen erweitert wird.
WO 95/31897 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Überwachung der Lebensfähigkeit von transplantierbaren Organen.
US-Patentschrift 5,395,314 beschreibt eine Hirnwiederbelebungs- und Organpräservierungsvorrichtung und ein Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Induzierung der Reparation eines ischämisch beschädigten Organs in dem Maße, dass eine Beeinträchtigung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann, wobei das Verfahren das Ausspülen des Organs bei einer Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit einer gepufferten physiologischen Lösung, um Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem Organ während des Durchblutungsentzugs angesammelt haben; und das Durchschwemmen des Organs bei einer Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit einer gepufferten physiologischen Lösung umfasst, welches ferner einen Vasodilatator zur Erweiterung der Blutgefäße innerhalb des Organs, Nahrungsfaktoren zur Wiederherstellung der Zellintegrität, wodurch die Organfunktion wieder instand gesetzt wird, und mindestens ein chemisches Energiesubstrat umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid, tri-Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium und -Cocarboxylase ausgewählt ist, um den Oxidationsstoffwechsel im Organ beim neuen Anpassen des Organs an eine sauerstoffhaltige Umgebung wiederherzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Wiederbelebungslösung zur Hemmung ischämischen Schadens und zur Induzierung der Reparation ischämischen Schadens in dem Maße, dass die Beeinträchtigung der Organfunktion in einem Organ, das einer Durchblutung entzogen wurde, rückgängig gemacht wird, wobei die Wiederbelebungslösung eine gepufferte physiologische Lösung umfasst und ferner umfasst: Vasodilatatoren in einer physiologisch wirksamen Menge zur Erweiterung des Gefäßsystems des Organs; mindestens ein chemisches Energiesubstrat, das aus der Gruppe, bestehend aus AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid, tri-Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium und -Cocarboxylase in einer physiologisch wirksamen Menge, um den Oxidationsstoffwechsel wiederherzustellen, der während des Entzugs der Organdurchblutung verloren ging; und Nahrungsfaktoren in einer physiologisch wirksamen Menge, um einen oder mehrerer Zellreparaturvorgänge bereitstellen, um die Zellfunktion, die während des Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren ging, wiederherzustellen.
Die vorliegende Erfindung behandelt, was bis zum Zeitpunkt der Erfindung als irreversible ischämische Beschädigung und Verletzung von Organen oder Geweben, die keine Durchblutung erhalten, angesehen wurde. Das Verfahren und die Zusammensetzungen werden nach ischämischer Beschädigung oder Verletzung benutzt, um die Reparatur von ischämisch beschädigten Organen und Geweben zu induzieren und weitere Beschädigungen am Gewebe während der Wiederherstellung des Kreislaufes zu verhindern. Dies unterscheidet das Verfahren und die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung von gegenwärtig benutzten Methoden und Zusammensetzungen, die auf die Benutzung vor ischämischer Beschädigung und Verletzung, mit dem beabsichtigten Zweck, einen derartigen Schaden zu verhindern oder zu inhibieren, gerichtet sind. Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, womit die Integrität und Funktion eines ischämisch beschädigten Organs oder Gewebes wiederhergestellt werden kann, während mindestens der präletalen Phase der Ischämie, indem eine Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung benutzt wird. Ferner soll das Verfahren und die Lösung nach der vorliegenden Erfindung weitere Gewebebeschädigung, welche während der Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ oder Gewebe, das einem Durchblutungsentzug unterworfen wird, induziert werden kann, verhindern oder inhibieren.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfasst das Ausspülen des Organs durch das arterielle System bei einer warmen Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung, um Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem Organ oder Gewebe während des Durchblutungsentzugs angesammelt haben; und das Durchschwemmen des Organs oder Gewebes mit der Wiederbelebungslösung, um (i) die Blutgefäße, insbesondere die Mikrogefäße, innerhalb des Organs oder des Gewebes zu erweitern, (ii) die Organ- oder Gewebefunktion wieder instand gesetzt wird durch die Zufuhr von trophischen Faktoren, (iii) die Zellintegrität und Funktion hinsichtlich des ischämisch beschädigten Organs oder Gewebes wieder herzustellen und (iv) den Oxidationsstoffwechsel durch das neue Anpassen des ischämisch beschädigten Organs oder Gewebes wiederherzustellen, das mittels anaerober Atmung überlebt, an eine sauerstoffhaltige Wiederbelebungslösung; durch das Organ oder Gewebe, das zur Transplantation und/oder Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes geeignet ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm, das die Organvorgänge zeigt, welche von dem Wiederbelebungsverfahren und der Lösung nach der Erfindung betroffen sind.
2 ist eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Serum Kreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Allotransplantation unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
3 ist eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Harnkreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Allotransplantation unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
4 ist eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Serum Kreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Autotransplantation unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
5 ist eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Harnkreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Autotransplantation unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
„Durchblutungsentzug" ist ein Begriff, der im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt wird, um auf die Einstellung des Blutkreislaufes durch ein Organ oder ein Gewebe in einem beliebigen Umstand, in dem der Blutkreislauf gestoppt werden kann und warme Ischämie auftritt, Bezug zu nehmen. Dies beinhaltet das Anhalten des Herzschlags für chirurgische Eingriffe oder aufgrund natür licher Ursachen, wie etwa einem Herzinfarkt. „Ein Organ oder Gewebe" ist ein Begriff, der im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt wird, um auf ein „Organ" Bezug zu nehmen, umfassend Niere, Herz, Leber, Lunge, Dünndarm, Bauchspeicheldrüse, Hirn, Auge und Haut. „Wiederbelebungslösung" ist ein Begriff, der im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt wird, um auf eine gepufferte physiologische Lösung Bezug zu nehmen, die Mittel zur Wiederherstellung der Integrität und Funktion in ischämisch beschädigten und verletzten Organen, welchen die Durchblutung entzogen wurde, und zur Prävention oder Inhibierung weiterer Gewebebeschädigung, die während der Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ, dem die Durchblutung entzogen wurde, bereitstellt.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in ein Verfahren, wobei die Integrität und Funktion eines ischämisch beschädigten Organs während mindestens der präletalen Phase von Ischämie unter Benutzung einer Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederhergestellt werden kann. Die Wiederherstellung der Organintegrität und Funktion unter Benutzung des Verfahrens und von Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung war unerwartet, da zum Zeitpunkt der Erfindung angenommen wurde, dass ischämische Beschädigung und Verletzung an Organen, denen lediglich ein paar Stunden oder weniger Durchblutung entzogen wurde, nicht rückgängig gemacht werden kann. Ferner sollen das Verfahren und die Lösung nach der vorliegenden Erfindung weitere Gewebebeschädigung, welche während der Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ induziert werden kann, dem die Durchblutung entzogen wurde, verhindern oder inhibieren.
Das Verfahren und die Lösung nach der vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel zur Entfernung von Blut und azidotischen Produkten, welche sich während des Zeitraums des Durchblutungsentzugs des Organs angesammelt haben; ein Mittel zur Wiederherstellung der Zellintegrität und Funktion, wodurch die Organfunktion wieder instand gesetzt wird; und ein Mittel zur Wiederanpassung des Organs an eine sauerstoffangereicherte Umgebung bereit. Die Fähigkeit, die Funktion in einem Organ nach ischämischer Beschädigung und Verletzung wieder herzustellen wurde als möglich festgestellt, vorausgesetzt dass (1) Blut nicht koaguliert, während es mit lebensfähigen endothelialen Zellen in Kontakt ist, und dadurch ischämisch beschädigte Organe erneut durchschwemmt werden können, sofern ein derartiges Endothelium immer noch lebensfähig und intakt ist; (2) die Wiederherstellung der vaskulären Dynamik von der Bereitstellung angemessener endothelialer zellabhängiger Vasodilatation abhängig ist, um das Gewebe angemessen zu durchschwemmen und mit Sauerstoff anzureichern und normale selbsttätige Regulierungsmechanismen bereitzustellen; (3) die Mikrogefäße zur Wiederbelebung angemessen erweitert sind, die normale Durchlässigkeit jedoch nicht verändert werden kann, damit die Zellintegrität wieder hergestellt ist; und (4) trophische Faktoren, die während der Ischämie verloren gingen, wieder instand gesetzt werden und die Zellpolarität hergestellt wird, damit die Funktion wieder erlangt wird.
Das Verfahren und die Lösung nach der vorliegenden Erfindung arbeiten zusammen, um ein ischämisch beschädigtes Organ zum Zwecke der Wiederinstandsetzung der Organfunktion und zur Wiederanpassung des Organs an eine sauerstoffangereicherte Umgebung wiederzubeleben. 1 ist ein Flussdiagramm, das die Organvorgänge zeigt, die durch das Wiederbelebungsverfahren und die Lösung nach der vorliegenden Erfindung betroffen sind.
Die folgenden Beispiele stellen die bevorzugten Ausführungsformen der Umsetzung der Erfindung dar. In den nachfolgenden Ausführungsformen, welche benutzt werden, um die Erfindung darzustellen, ist es wichtig, das folgende Konzept zu beachten. Das Rinder-Kalb-Modell und das Hunde- Modell sind zur Einschätzung der Zusammensetzungen und Verfahren betreffend der Organtransplantation, die für Menschen gedacht ist, validiert worden, da die Modelle gezeigt haben, dass sie eine physiologische Basis aufweisen. Während nun die Zusammensetzung und das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in diesen experimentellen Modellen validiert wurden, sollen die Zusammensetzung und das Verfahren hauptsächlich beim Menschen angewandt werden. Dem Fachmann ist eine physiologische Basis zur Vergrößerung von den experimentellen Modellen zu Menschen bekannt und nimmt auf Unterschiede wie etwa Organvolumen und Organdurchfluss Rücksicht (siehe zum Beispiel Harrison et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66: 1679–1683). Es versteht sich, dass diese Beispiele darstellend und nicht einschränkend sein sollen.
BEISPIEL 1 – Das Verfahren
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Intervenieren während eines Zeitfensters von Durchblutungsentzug in einem Organ, bevor ein wesentlicher Zelltod eintritt. Der Fachmann wird verstehen, dass das Zeitfenster, währenddem das Verfahren benutzt werden kann, je nach der Art von zu behandelndem Organ variiert. Zum Beispiel kann das Zeitfenster zur Behandlung eines Herzens unter Benutzung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung weniger als ungefähr eine Stunde betragen; wohingegen eine Niere unter Benutzung des Verfahrens innerhalb einer Zeitspanne von bis zu ungefähr 4 Stunden Durchblutungsentzug behandelt werden kann. Um die ischämische Verletzungskaskade anzuhalten, dass sie nicht zu Zelltod führt, und auf eine Weise, wie in 1 dargestellt, umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Schritte:

(1) Ausspülen des ischämisch beschädigten Organs durch das Arteriensystem mit der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei einer warmen Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C, um (i) Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem Organ wäh rend des Durchblutungsentzugs angesammelt haben;
(ii) Wiederinstandsetzen der Zellumgebung auf einen physiologischen pH-Wert;
(iii) Erweitern der Mikrogefäße auf angemessene Weise;
(iv) Unterstützen des fortlaufenden anaeroben Stoffwechsels als Rettungsvorgang durch die Bereitstellung von hohen Energieverbindungen und Unterstützen der Glykose mit zusätzlichen Substraten, die Glukose, Pyruvat und Uridin 5'-triphosphat (UTP) umfassen können, sich aber nicht darauf beschränken;
(v) Initiieren einer Umwandlung vom anaeroben Stoffwechsel zum oxidativen Stoffwechsel durch die Bereitstellung von Stoffwechselsubstraten, um die Adeninverbindungsgemeinschaft wieder instand zu setzen, Unterstützen des Zitronensäurezyklus und Wiederherstellen der Kupplung der Elektronentransportkette, wodurch der molekulare Sauerstoff langsam eingeführt wird, um eine erneute Perfusionsverletzung, die durch Sauerstofftoxizität vermittelt wird, zu verhindern;
(vi) Bereitstellen eines Mechanismus zum angemessenen Blutgefäßerweitern des endothelialen Mikrogefäßzellbetts innerhalb eines stark eingeengten, ödematösen, ischämisch beschädigten Organs, ohne dass die Durchlässigkeit des Organs im Wesentlichen verändert wird, und wobei die Blutgefäßerweiterung die angemessene Perfusion des Organgewebes ermöglicht und einen stabilen Perfusionsdruck, stabile Durchflüsse und eine konstante Temperatur, einen konstanten pH-Wert und eine konstante Sauerstoffanreicherung bereitstellt;
(vii) Bereitstellen von trophischen Faktoren, um die Funktion in dem ischämisch beschädigten Organ wieder herzustel len, wodurch Metaboliten zum Wiedergewinnen der Zellintegrität und Funktion bereitgestellt werden; und 2) Durch schwemmen des ischämisch beschädigten Organs durch das Arteriensystem mit der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei einer warmen Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C zum
(i) Normalisieren der Sauerstoffanreicherung, Temperatur und des pH-Wertes;
(ii) Fortfahren mit der Bereitstellung eines Mechanismus zur angemessenen Blutgefäßerweiterung des Gefäßsystems des Organs ohne die Durchlässigkeit des Organs im Wesentlichen zu verändern, was in einem stabilen Perfusionsdruck und stabilen Gefäßsystemdurchflüssen resultiert; und
(iii) Fortfahren mit der Bereitstellung von trophischen Faktoren zur Wiederherstellung der Funktion in dem ischämisch beschädigten Organ, wobei Metaboliten zur Wiedergewinnung der Zellintegrität und Funktion, wie etwa Festigen der Zellverzweigung und Wiederherstellung der Membranpolarität bereitgestellt werden.

Es versteht sich für den Fachmann, dass einer oder mehrere Nutzen, die während des Ausspülungsschritts abgeleitet wurden, auch im Perfusionsschritt fortgeführt werden, da die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung während des ganzen Verfahrens benutzt werden kann, d. h. umfassend sowohl der Ausspül- als auch der Perfusionsschritt.
Zu Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung wird im Ausspülschritt eine ausreichende Menge der Wiederbelebungslösung langsam durch Infusion über eine Kanüle in die Hauptarterien-Blutzufuhr für dieses bestimmte Organ eingeführt, bis der Ausfluss frei von Blut ist. Auf diese Weise werden das ischämische Blut und die azidotischen Produkte, die sich im Gefäßraum während des Zeitraums, während dem das Organ einen Durchblutungsentzug erfährt, aus dem Gefäßraum entfernt. Ferner wird der pH-Wert wieder hergestellt und es wird frisches Substrat zugeführt, um den anaeroben Stoffwechsel und andere Wege, die für die Zellintegrität und Funktion nötig sind, wieder instand zu setzen. Es versteht sich für den Fachmann, dass die Menge an Wiederbelebungslösung, die ausreicht, um in der Ausspülung benutzt zu werden, von der bestimmten Art und Größe des Organs, das ausgespült werden soll, abhängt, sowie der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs. Zur Darstellung aber nicht Einschränkung können 200 bis 600 ml der Wiederbelebungslösung eine ausreichende Menge sein, um eine menschliche Niere auszuspülen, die über einen Zeitraum von 1–3 Stunden einem Durchblutungsentzug unterzogen wurde.
Zu Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung wird im Perfusionsschritt eine ausreichende Menge an der Wiederbelebungslösung langsam durchschwemmt bei einem systolischen Druck, der für das ischämisch beschädigte Organ, das wiederbelebt wird, angemessen ist, bis ein Durchfluss erreicht wird, der annähernd normal für jene bestimmte Art von Organ ist. Darstellend aber nicht einschränkend, kann eine menschliche Niere, die über einen Zeitraum von 1–3 Stunden einem Durchblutungsentzug unterzogen wurde, langsam mit der Wiederbelebungslösung bei einem systolischen Druck von < 80 mmHg durchschwemmt werden, bis ein Durchfluss von > 50 ml/min erreicht wird. Der pH-Wert wird in einen physiologischen Bereich normalisiert, indem langsam über einen Oxygenator oder über eine Sauerstoff transportierende Verbindung als Komponente in der Wiederbelebungslösung molekularer Sauerstoff eingeführt wird. Die Anreicherung des Organs mit Sauerstoff während der Perfusion sowie die Normalisierung der Temperatur und des pH-Wertes geschehen innerhalb ungefähr der ersten 15–30 Minuten der Perfusion. Während der langsamen Blutgefäßerweiterung des Organs beginnen sich die Perfusionsdrücke und die Durchflüsse zu stabilisieren und das Organ schaltet schnell zum oxidativen Stoffwechsel. Es versteht sich für den Fachmann, dass die Zeitdauer, die für die Perfusion nötig ist, von der bestimmen Art und Größe des Organs, das durchschwemmt wird, sowie von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängt. Die Behandlung eines ischämisch beschädigten Organs mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden kann ausreichen zur Wiederbelebung der meisten Organe (z. B. Durchblutungsentzug für zwischen 0,5 und 4 Stunden) zur Wiederaufnahme der Organfunktion. Wenn außerdem das Organ ein Produkt produziert, wie etwa eine Niere, die Urin produziert, kann das Verfahren in der Produktion eines normalen Produkts der Organfunktion resultieren.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wurde entwickelt, um ischämisch beschädigte Organe ex vivo ohne traditionelle Unterkühlung (4°–10°C) zu präservieren und wiederzubeleben. Das Verfahren stellt die notwendige Sauerstoffzufuhr, Nährstoffe zum Stoffwechsel, onkotischen Druck, pH-Wert, Perfusionsdrücke und Durchflüsse zur Unterstützung des Organstoffwechsels ex vivo bereit, am meisten innerhalb oder in der Nähe des jeweiligen Bereichs in vivo. Eine annähernd normale Stoffwechselrate wird hierin als ungefähr 70%–90% des Bereichs der normalen Stoffwechselraten definiert. Ferner unterstützt das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung einen Grad an Stoffwechsel ex vivo, der ausreichend oxidativen Stoffwechsel bereitstellt, damit es in dem normalen funktionellen Produkt des Organs resultiert. Die Entwicklung dieses Verfahrens, das Organe ex vivo unterstützt, ohne traditionelle Unterkühlung, stellt die Möglichkeit dar, eine annähernd normale Stoffwechselrate zu unterstützen und funktionelle Fähigkeiten zu erstellen, die mit dem postoperativen oder Posttransplantations-Ablauf korreliert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung unter Benutzung einer Vorrichtung durchgeführt werden, umfassend ein laminares oder pulsierendes Pumpsystem, um die Wiederbelebungslösung zuzuführen und die Perfusion und den Perfusionsdruck zu steuern; Mittel zur Temperatursteuerung; und Mittel zur Bereitstellung und Steuerung der Einführung und Entlüftung von Atmungsgasen. Eine derartige Vorrichtung ist vom betreffenden Erfinder in US-Patentschrift 5,699,793 beschrieben worden. Eine derartige Vorrichtung kann auch ein Vorrichtungsmittel umfassen, um das Perfusat, das bereits durch das Organ gekreist ist, zu testen und/oder zu sammeln, um eine oder mehrere funktionelle Charakteristiken, wie etwa pH-Wert, verschiedene Drücke, Durchfluss, Gefäßwiderstand, verschiedene chemische Konstituenten, Oxigenierung, Kohlendioxidkonzentration und Sauerstoffverbrauch zu überwachen und messen. Des Weiteren kann das Vorrichtungsmittel oder ein zweites Vorrichtungsmittel zusammen mit der Vorrichtung benutzt werden, um das Organprodukt, das von dem Organ abgelenkt wird, wie etwa Urin von einer Niere, zu messen und/oder zu sammeln, wobei die anschließende Messung der Parameter des Organproduktes mit der Organintegrität und Funktion während oder anschließend an das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehen.
BEISPIEL 2 – Die Wiederbelebungslösung
Organpräservierung und Perfusatlösungen sind auf dem Stand der Technik bekannt, dass sie eine Basislösung umfassen, die aus einer gepufferten physiologischen Lösung, wie etwa einer Salzlösung oder einem Zellkultur ähnlichen Basismedium bestehen, der mehrere definierte Zusätze hinzugefügt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform setzt die Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung auch eine Basislösung ein, welche Aminosäuren, Ionen, physiologische Salze, Impermeanzien, Serumproteine und/oder Faktoren und Zuckerarten enthalten. Zusätzlich zu den Komponenten der Basislösung enthält die Wiederbelebungslösung der vorlie genden Erfindung eine neuartige Kombination aus Zusätzen, die in mindestens 3 Komponentenkategorien unterteilt werden können. Es versteht sich für den Fachmann, dass die Komponenten in jeder Kategorie mit einer funktionell entsprechenden Verbindung ersetzt werden können, um dasselbe Ergebnis zu erhalten. Die folgenden aufgelisteten Spezies der Komponenten in jeder Komponentenkategorie dienen daher der Darstellung und nicht der Einschränkung.
Eine erste Komponentenkategorie, Vasodilatatoren, umfasst eine Kombination aus Komponenten in einer physiologisch wirksamen Menge, welche ein Mittel zur angemessenen Blutgefäßerweiterung großer Gefäße über glatte Muskelzellenentspannung sowie zur angemessenen Erweiterung von Mikrogefäßen bereitstellen. Zur Gewährleistung, dass die normale Durchlässigkeit des Gefäßsystems aufrecht erhalten bleibt, wird der Vasodilatator auf eine endotheliale zellenabhängige Weise gesteuert. Eine derartige Kombination von Komponenten kann umfassen: (i) Substrate zur endothelialen zellenvermittelten Gefäßerweiterung, wie etwa Acetylcholin, Dopamin, Bradykinin und Arginin; (ii) Substrate zur Mikrogefäßerweiterung, wie etwa Prostacyclin (und Analoge, z. B. Carbacyclin) und Mg⁺; und (iii) Adenosin (und Analoge, z. B. Cyclohexyladenosin) und Verapamil für ihre kombinierten Wirkungen auf die Gefäßerweiterung, die durch Kalziumkanalblockierung (andere Kalziumkanalblocker umfassen Flunarizin, Nifedipin, SNX-11, Chlorpromazin, und Diltiazem) vermittelt werden. Das Ergebnis der Benutzung einer derartigen Kombination aus Vasodilatatoren besteht darin, dass das Gefäßsystem gut ausgeweitet ist, während gleichzeitig seine Integrität und normale Grenzfunktion beibehalten wird. Vasodilatatoren umfassen von 1 Vol.-% bis 50 Vol.-% (w/v) der neuartigen Kombination aus Zusätzen, die der Basislösung hinzugefügt werden, zur Bildung der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
Eine zweite Komponentenkategorie, chemische Energiesub strate, umfasst eine Kombination von Komponenten in einer physiologisch wirksamen Menge, welche ein Mittel zur Wiederherstellung des oxidativen Stoffwechsels bereitstellen, die während des Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren gingen. Während des Durchblutungsentzugs führt der resultierende Verlust der Membranintegrität zum Verlust von intrazellulären Komponenten, wie etwa Ionen, Komponenten der Adeninverbindungsgemeinschaft, des Zitronensäurenzyklus und der gekoppelten Elektronentransportkette. Derartige chemische Energiesubstrate, welche der Wiederbelebungslösung hinzugefügt wurden, können Pyruvat; Glukose; ATP; AMP; Coenzym A; β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD*); β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP*); Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD); Thiamin-Pyrophosphat-Chlorid (Cocarboxylase); Uridin 5' Triphosphat (UTP); Chlorid; Adenosin; Magnesium; und eine Kombination daraus umfassen. Wenn die Energiezufuhr in den Gewebezellen vor dem Eintreten des Zelltodes wiederhergestellt wird, können Zellveränderungen während des Durchblutungsentzugszeitraumes rückgängig gemacht werden und das Gewebezellvolumen normalisiert sich wieder. Das chemische Energiesubstrat umfasst 0,01 Vol.-% bis 90 Vol.-% der neuartigen Kombination aus Zusätzen, die der Basislösung beim Bilden der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden.
Eine dritte Komponentenkategorie, trophische Faktoren, umfasst eine Kombination von Komponenten eine einer physiologisch wirksamen Menge, die ein Mittel zur Förderung eines oder mehrerer Zellreparaturvorgänge bereitstellen, um die Zellfunktion, die während es Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren ging, wiederherzustellen. Die Kombination von trophischen Faktoren stellt ein Mittel zur Förderung der Proteinsynthese bereit, welche zur Wiederherstellung engerer Zellverzweigungen und die Regenerierung der Membranpolarität führt, was zur Wiedererlangung der Zellfunktion führt. Derartige trophische Faktoren, die zu der Wiederbelebungslösung hinzugefügt werden, können eine hohe Konzentration an Aminosäuren und Magnesium (z. B. 2 bis 6 Mal die typische Plasmakonzentration), Nukleinsäurederivate und Ribonukleoside; und Wachstumsfaktoren mit Membranverstärkern, wie etwa Säure-Fibroblaswachstumsfaktor (FGF), Grund-FGF, Heparin und Chondroitinsulfat und Kombinationen daraus umfassen. Die trophischen Faktoren umfassen 1 Vol.-% bis 90 Vol.-% der neuartigen Kombination von Zusätzen, die zu der Basislösung hinzugefügt und darin aufgelöst werden zur Bildung der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
Es versteht sich für den Fachmann, dass Komponenten in einer oder mehreren der drei Komponentenkategorien zusätzliche Funktionen aufweisen können, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung zusätzliche wünschenswerte Funktionen aufweisen können. Zum Beispiel funktionieren Magnesiumionen (eingeführt als Teil einer Magnesium tragenden Verbindung) als sowohl Vasodilatator als auch ein chemisches Energiesubstrat; und Glukose funktioniert als sowohl trophischer Faktor als auch chemisches Energiesubstrat. Ferner umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform die in der Wiederbelebungslösung enthaltenen Aminosäuren Cystin und Cystein in Mengen, die nebst dem Funktionieren als trophische Faktoren auch als Antioxidantien bevorzugte freie Radikalfänger funktionieren, welche freie Schadstoffradikale während des Ausspül- und Perfusionsschritts des Verfahrens einfangen. Es können weitere Antioxidantien, wie etwa Glutathion, Cyclodextrin, Superoxiddismutase (SOD), Catalase, Chlorpromazin und Prostacyclin umfasst sein oder als funktionell entsprechende Verbindungen in der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Derartige Antioxidantien umfassen von 0,000 Vol.-% bis 10 Vol.-% der neuartigen Kombination von Zusätzen, die zu der Basislösung hinzugefügt und in dieser aufgelöst werden, zum Bilden der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der das Gewebe, das unter Benutzung der Wiederbelebungslösung nach der Erfindung wiederbelebt werden soll, neurologisches Gewebe (z. B. Hirn) beinhaltet, kann die Wiederbelebungslösung ferner neuroprotektive Arzneimittel wie etwa NMDA Rezeptor blockierende Agenzien (NMDA Rezeptor Ionenkanalblocker, z. B. Aptiganel und Cerestat; NMDA-Rezeptor Glyzinstellenblocker, z. B. ZD 9379 und GV 150-562A), Stickoxidansammlungsblocker (NO) (z. B. Lubeluzol) und Natriumkanalblocker zum Inhibieren des Einflusses von Natrium in die Zellen, welche die Glutamat-Freisetzung auslösen können (z. B. BW619-C89, Fosphenytoin).
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Wiederbelebungslösung, anstatt dass molekularer Sauerstoff über einen Oxygenator im Verfahren eingeführt wird, eine oder mehrere Sauerstoff transportierende Verbindungen („Sauerstoff tragende Agenzien"), welche derart funktionieren, dass sie dem ischämisch beschädigten oder verletzten Organ molekularen Sauerstoff für den oxidativen Stoffwechsel bereitstellen. Dem Fachmann ist bekannt, dass derartige Sauerstoff tragende Agenzien Hämoglobin, stabilisierte Hämoglobinderivate (hergestellt aus hämolysierten menschlichen Erythrozyten wie etwa pyridoxyliertes Hämoglobin), Polyoxethylenkonjugate (PHP), rekombinante Hämoglobinprodukte, perfluorchemische (PFC) Emulsionen und/oder perfluorchemische Mikrobläschen (zusammengefasst als „Perfluorchemikalie" bezeichnet) umfassen, sich aber nicht darauf beschränken. Derartige Sauerstoff tragende Agenzien umfassen 0,000 Vol.-% bis 50 Vol.-% der neuartigen Kombination von Zusätzen, die der Basislösung hinzugefügt und in ihr aufgelöst wurden, zum Bilden der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung; oder 0,000 Vol.-% bis 20 Vol.-% der gesamten Wiederbelebungslösung (v/v).
PFC-Emulsionen, die als Sauerstoff tragende Agenzien nützlich sein sollen, sind zum Beispiel beschrieben in US-Patentschriften Nr. 5,403,575 ; 4,86S,318; 4,866,096 ; 4,865,836 ; 4,686,024 ; 4,534,978 ; 4,443,480 ; 4,423,077 ; 4,252,827 ; 4,187,252 ; 4,186,253 ; 4,110,474 ; und 3,962,439 . Derartige PFC-Emulsionen umfassen Perfluorooctylbromid, Perfluorooctyldibromid, Bromfluorkohlenwasserstoffe, Perfluorether, Fluosol-DA^TM, F-44E, 1,2-bisperfluorobutylethylen, F-4-methyloctahydroquinolidizin, 9 bis 12 Kohlenstoffperfluoramine, Perfluordecalin, Perfluorindan, Perfluortrimethylbicyclo[3,3,1]onan, Perfluormethyladamant, Perfluordimethyladamantan. PFC-Mikrobläschen, die als Sauerstoff tragende Agenzien nützlich sein können, sind zum Beispiel beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,393,524 . PFCs, die als nützlich zur Erzeugung von Mikrobläschen offenbart sind, umfassen Dodecafluorpentan (DDFP), Schwefelhexafluorid, Pentan, Hexafluorpropylen, Octafluorpropan, Hexafluorethan, Octafluor-2-butyn, Hexafluorbuta-1,3-dien, Isopren, Octafluorcyclobutan, Decafluorbutan, Cis-2-penten, Dimethylsulfid, Ethylarsin, Bromchlorfluormethan, Trans-2-penten, 2-Chlorpropan, Hexafluordisulfid, Ethylmercaptan, Diethylether, Ethylvinylether, Valylen, Trisfluorarsin, Furfuylbromid, Cis-propenylchlorid, Butylfluorid, 1,1 Dichlorethan, Isopropylmethylether, Isopropylamin, Methylfomat, 2-Acetyl-furan, Ethylenfluorid, 1-Penten, Isopropylacetylen, Perfluorpentan, Isopentan, Vinylether, 2-Butyn, 1,4-Pentadien, Tetramethylsilan, Dimethylphosphin, Dibromdifluormethan, 2-chlor-propen, Difluriodmethan, Acetaldehyd, Trimethylbor, 3-Methyl-2-buten, 1,1 Dimethylcyclopropan, Aminoethan, Vinylbromid, Disilanmethan, Trichlorfluormethan, Bromfluormethan, Trifluordichlorethan, Perfluorpenten und andere Fluor enthaltende Kohlenwasserstoffe ( US-Patentschrift Nr. 5,409,688 ).

In einem Verfahren zur Herstellung der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wird einer Basislösung eine neuartige Kombination von Zusätzen hinzugefügt und darin aufgelöst, welche in mindestens 3 Komponentenkategorien gruppiert werden können, umfassend Vasodilatatoren, chemische Energiesubstrate und trophische Faktoren. Obgleich die Zusammensetzung der Wiederbelebungslösung zur Benutzung mit dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung von Komponente zu Komponente variieren kann und diese wie vorher beschrieben klassifiziert ist, ist eine bevorzugte Formulierung nachstehend in Tabelle 1 zu Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung dargelegt (es sei bemerkt, dass eine Komponente, die in mehr als einer der mindestens 3 Komponentenkategorien funktionieren kann, der Klarheit halber unten in einer Kategorie platziert ist). Tabelle 1 Zusatz zur Basislösung hinzugefügt (Mengen in Milligramm pro Liter Basislösung)

Vasodilatatoren	Menge
Arginin	140
Acetylcholin	2
Verapamil	0,2
Prostacyclin	0,06
Magnesium	600
Chemische Energiesubstrate
ATP	2
AMP	2
UTP	4
Coenzym A	10
Diphosphopyridinnukleotid	28
FAD	4
Triphosphopyridinnukleotidmononatrium	4
Cocarboxylase	4
Trophische Faktoren
Säure- u./oder Base-FGFs	200
Pyruvat	220
Glukose	2,000
Heparin	180
Insulin	10
(Nukleinsäurederivate)
Deoxyadenosin	40
Deoxyguanosin	40
Deoxycytidin	40
Thymidin	40
(Ribonukleotide)
Adenosin	40
Cytidin	40
Guanosin	40
Uridin	40

Die derart hergestellte Wiederbelebungslösung sollte eine Osmolarität von > 330 mOsm aber vorzugsweise weniger als 600 mOsm aufweisen und in einem bevorzugten Bereich von ungefähr 350 mOsm bis ungefähr 400 mOsm liegen. Der pH-Wert der Wiederbelebungslösung sollte auf einen pH-Wert innerhalb eines pH-Wert-Bereiches von ungefähr 6,5 bis ungefähr 7,5 und vorzugsweise in einem pH-Wert von 7,3 bis 7,45 eingestellt werden.
Wie dargelegt kann die Wiederbelebungslösung in einer anderen Ausführungsform ferner zusätzliche Antioxidantien und eines oder mehrere Sauerstoff tragende Agenzien, wie folgt, umfassen (pro Liter Basislösung):

Antioxidantien Menge

Glutathion 0,1 mg

Cyclodextrin 500 mg

Sauerstoff tragendes Agens

Perfluorchemikalie 20% v/v
BEISPIEL 3 – Wirkung des Durchblutungsentzugs
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkung warmer Ischämie zu zeigen, die durch das Entziehen der Durchblutung von einem Organ für ungefähr 30 Minuten bewirkt wurde.
Eine derartige warme Ischämie führt zur schnellen Verschlechterung der Zellintegrität. Die ischämische Verletzungskaskade beginnt mit dem Verlust der Adeninverbindungsgemeinschaft, was zum Ödem führt. Der Verlust der Zellintegrität und dem Vorkommen von einem Ödem resultiert im Kollaps der Gefäßintegrität und dem Verlust der normalen Durchlässigkeitsfunktion. In einem Organ, wie etwa einer Niere, ist ersichtlich, dass die ischämische Verletzung, die durch den Entzug der Durchblutung von der Niere für lediglich 30 Minuten zu starker Gefäßverengung führen kann. Die starke Gefäßverengung resultiert in unangemessenen Durchflüssen zur angemessenen Durchschwemmung der Niere. Der hohe Gefäßwiderstand in gefäßverengten Gefäßen führt zur weiteren Verschlechterung mit sekundärer Anoxie, wobei dies zu einem Verlust der funktionellen Fähigkeit führt (d. h. Verlust der Erzeugung von Urin). Tabelle 2 stellt einen Vergleich der Perfusionscharakteristiken dar (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und Organfunktion (Erzeugung von Urin) in einem experimentellen Tiermodellsystem, umfassend Rinderkalbsnieren, die keinem Durchblutungsentzug unterzogen wurden („normal") und Rinderkalbsnieren, die lediglich 30 Minuten einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden („ischämisch"). Der Gefäßwiderstand ist mittlerer Druck/mittlerer Durchfluss. Tabelle 2

Parameter Normal Ischämisch

Anzahl Nieren 25 5

mittlerer Druck 50/30 44/40

mittlerer Durchfluss > 95 cc/min 12,9 cc/min

mittlerer Gefäßwiderstand 0,4 3,26

Erzeugung von Urin ja nein
BEISPIEL 4 – Wirkungen des Wiederbelebungsverfahrens und Lösung

Es wurden Experimente durchgeführt, um die Fähigkeit des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen anstatt lediglich zu inhibieren und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass die Beeinträchtigung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann, aufzuzeigen. Es wurden eingeschläferten Rinderkälbern Nieren entnommen. Nach 30 Minuten oder 60 Minuten Durchblutungsentzug wurden die Nieren mittels Mittellinieneinschnitt entfernt. Vor der Entfernung der Nieren wurde keine Behandlung gegeben, wie auch keine Verabreichung von Antikoagulationsstoffen. Bei jeder Kontrolle erfuhr die Niere 30 Minuten Durchblutungsentzug, wodurch während dieses Zeitraums ischämische Verletzung geschah. Die Kontrollnieren wurden nach der Entfernung mit 100 cc eines Basiszellkulturmediums bei einer Temperatur von 32°C ausgespült, sodass die Nieren hinsichtlich des Blutes ausgespült wurden, das in dem jeweiligen Gefäßfach blieb. Jede Testniere erfuhr 60 Minuten Durchblutungsentzug, wobei sie für jenen Zeitraum ischämische Verletzung erlitt. Die Testnieren wurden nach der Entfernung mit 100 cc der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von 32°C ausgespült. Nach dem Ausspülen wurden die jeweiligen Nieren auf einem abgewandelten MOX-100^TM Transportpräservierungssystem gepumpt. Die Kontrollnieren wurden bei 32°C gepumpt, unter Benutzung von früher entwickelter Technologie, um Organe unter Benutzung von warmen Präservierungstechnologien unter Benutzung des Basiszellkulturmediums als Perfusat zu präservieren. Die Testnieren wurden unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei 32°C gepumpt. Ein Vergleich der Perfusionscharakteristiken (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und Organfunktion (Erzeugung von Urin) der Kontrollgruppe (30 Minuten ohne Erfindung) mit der Testgruppe (60 Minuten mit Erfindung) ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Parameter	30' ohne Erfindung	60' mit Erfindung
Anzahl Nieren	5	16
mittlerer Druck	44/40	54/25
mittlerer Durchfluss	12,9 cc/min	97,4 cc/min
mittlerer Gefäßwiderstand	3,26	0,47
Erzeugung von Urin	keine	ja

Die Testnieren welchen dann, nachdem sie über einen Zeitraum von einer Stunde ischämische Beschädigung erlitten haben, dann mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurden, zeigten Perfusionscharakteristiken (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und Organfunktion (Erzeugung von Urin) innerhalb der funktionellen Bereiche der normalen Nieren, die in Tabelle 2 dargestellt sind. Somit ist also die Fähigkeit des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung aufgezeigt, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen anstatt lediglich zu inhibieren, und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass die Behinderung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann.
BEISPIEL 5 – Wirkung mit variierenden Verletzungszeiten

Es wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkungen des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung in Organen, die einem Durchblutungsentzug für Zeiträume von mehr als 1 Stunde unterzogen wurden, gemacht. Rinderkalbsnieren wurden eingeschläferten Kälbern zu verschiedenen Zeitpunkten des Durchblutungsentzugs entnommen, umfassend 60 Minuten, 90 Minuten, 2 Stunden oder 4 Stunden. Es wurde vor der Entfernung der Nieren keine Behandlung gegeben und keine Verabreichung von Antikoagulationsstoffen. Dann wurde jede Niere mit 100 cc der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von 32°C ausgespült. In keinem Fall wurde bei den Nieren geronnenes Blut im Gefäßraum gefunden. Das Blut scheint fluide zu bleiben, solange es mit dem lebensfähigen Gefäßendothelium in Kontakt ist. Nach dem Ausspülen wurden die jeweiligen Nieren mehrere Stunden unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei 30°C gepumpt. Ein Vergleich der mittleren Perfusionscharakteristiken (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und Organfunktion (Urin Creatinin Konzentration – Creatinin Beseitigung; Histologie), der Nieren, die 60 Minuten lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (60'), der Nieren, die 90 Minuten lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (90'), der Nieren, die 2 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (120') und der Nieren, die 4 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (240') ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Parameter	60' (N = 16)	90' (N = 5)	120' (N = 5)	240' (N = 2)
Druck (mmHg)	54/25	58/37	55/37	52/40
Durchfluss (cc/min)	97,4	72	68,6	36,5
Gefäßwiderstand	0,47	0,67	0,73	1,27
Creatinin (mg/dl)	41,8	22,9	18,5	23,5
Histologie	gut präserviert	gut präserviert mit fokaler Abflachung des Epithels	insgesamt gut; fokales Ödem	frühe fokale Nekrose

Die Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung ein ischämisch beschädigtes Organ zu Zeitpunkten von mindestens bis zu 4 Stunden Durchblutungsentzug wiederbelebt werden können. Wenn zum Beispiel eine Niere, die 60 Minuten lang eine warme Ischämieverletzung erfuhr, 2 Stunden lang unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung gepumpt wird, entsprechen die Perfusionscharakteristiken jenen in normalen Nieren, wie in Tabelle 1 aufgelistet. Histologische Schätzungen unterstützen die funktionellen Daten, wie Gewebeteilabschnitte, die untersucht wurden, zeigen, dass die Morphologie und Integrität gut präserviert zu sein scheinen.
Bei 90 Minuten und 120 Minuten Durchblutungsentzug widerspiegeln jene Nieren eine weitgreifendere Zellbehinderung (d. h. erhöhte diastolische Drücke und reduzierte Durchflüsse) als Nieren, die 60 Minuten lang Durchblutungsentzug unterzogen wurden. Trotz einer derartigen Zellbehinderung erzeugten jene Nieren jedoch immer noch Urin; und histologisch gesehen, schienen sie gut präserviert zu sein. Außerdem wurde in diesen Nieren keine Nekrose erfasst.
Nieren, die 4 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden, zeigten im Wesentlichen reduzierte Durchflüsse mit gleichzeitiger Erhöhung der diastolischen Drücke auf, wobei dies die Verengung in den Mikrogefäßbetten umfasst. Es ist jedoch wichtig, anzumerken, dass jene Nieren trotzdem noch Organfunktion aufwiesen. Urin wurde mit einer Urincreatininkonzentration von 23,5 mg/dL erzeugt. Histologisch gesehen, zeigten diese Nieren die ersten Anzeichen von fokaler früher Nekrose. Mitotische Charaktere wurden angrenzend an die Bereiche der fokalen tubulären Nekrose beobachtet, was darauf hindeutet, dass ein aktiver Reparationsvorgang initiiert geworden zu sein scheint. Daher zeigte sich selbst nach 4 Stunden Durchblutungsentzug die Fähigkeit des Verfahrens und der Wiederbe lebungslösung nach der vorliegenden Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen anstatt lediglich zu inhibieren und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass die Beeinträchtigung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann.
Es ist wichtig, anzumerken, dass die Kontrollnieren (ohne Behandlung mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung) nach entweder 2 oder 4 Stunden Durchblutungsentzug histologisch evaluiert wurden, um den relativen Nutzen des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung zu bestimmen. Die histologische Evaluierung der Kontrollnieren, die 2 Stunden warmer Ischämie erlitten, zeigte frühe diffuse Röhrchennekrose. Bei 4 Stunden warmer ischämischer Beschädigung zeigten die Kontrollnieren eine diffuse Zerlegung der tubulären Zellen. Dahingegen zeigten Nieren, die 2 Stunden warme Ischämie erlitten und dann mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, die Wiederherstellung der Zellintegrität. Ferner zeigten Nieren, die 4 Stunden warme Ischämie erlitten und dann mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, lediglich fokale Röhrchennekrose im Vergleich zur weit verbreiteten Röhrchenbeschädigung in den Kontrollnieren. Die histologischen Evaluierungen unterstützen ferner die wesentliche Effizienz des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung beim Rückgängigmachen der Kaskade warmer Ischämieereignisse nach dem Durchblutungsentzug.
BEISPIEL 6 – In-Vivo-Funktion eines wiederbelebten Organs
A. Allotransplantation
Ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, wurde auf die In-vivo-Funktion nach der Wiederbelebung evaluiert. Eine Hunde-Allotransplantation wurde durchgeführt, wobei postmortal ein Zeitraum zum Durchblutungsentzug von 60 Minuten gewährt wurde, wobei eine Niere aus einem Hundespender entfernt wurde; das Organ mit der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung ausgespült wurde; und das Organ 2 Stunden lang durchschwemmt wurde, unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei 30 bis 32°C. Nach dem Wiederbelebungsverfahren wurde die Niere dann in einen Hundeempfänger mit einer gleichzeitigen bilateralen Nephrektomie der Nieren des Empfängers allotransplantiert. Daher war der Hundeempfänger von der wiederbelebten Niere zum Überleben abhängig. Der Vorgang nach der Transplantation des Hundeempfängers ist in 2 u. 3 gezeigt.
Die Niere durchschwemmte sich gut erneut und erzeugte innerhalb von zwei Stunden nach der Transplantation Urin. Die Niere erzeugte weiterhin Urin durch die beobachtete Zeitspanne nach der Transplantation. Wie in 2 gezeigt, erfuhr der Empfänger einen leichten Anstieg im Serum Creatinin zu einem Grad über 2 mg/dl nach 24 Stunden nach der Transplantation. Das Serum Creatinin kehrte zum normalen Bereich innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation zurück. Die Serumchemien blieben normal bis zum zehnten Tag nach der Transplantation, als akute Organablehnung geschah (dem Hundeempfänger wurde unzureichendes Immunsuppressionsschema verabreicht). Wie in 3 gezeigt, stieg der Urin-Creatininwert schnell an und war innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation innerhalb eines normalen Bereiches von ungefähr 70 mg/dl. Diese sehr milde Episode akuter tubulärer Nekrose (ATN), die anfänglich geschah, wurde schnell innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation rückgängig gemacht. Die rückgängig machbare Natur der akuten tubulären Nekrose zusammen mit der Fähigkeit der transplantierten Niere, das fortwährende Überleben des Empfängers zu unterstützen, zeigte die Lebensfähigkeit und In-vivo-Funktion des transplantierten Organs, das mehr als 60 Minuten lang eine warme Ischämie erlitt. Somit kann ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, nach der Wiederbelebung in vivo funktionieren.
B. Autotransplantation
In einer anderen Ausführungsform wurde ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, auf In-vivo-Funktion nach der Wiederbelebung evaluiert. Unter Benutzung zweier Hunde wurde eine Hunde-Autotransplantation durchgeführt, indem die linken Nieren entfernt, welche dann ischämisch beschädigt wurden in einem 37°C salinen Bad für 2 Stunden. Nach der Periode der warmen Ischämie wurden die Nieren kanüliert und mit der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung ausgespült; und 2 Stunden lang unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei 30 bis 32°C durchschwemmt. Nach dem Wiederbelebungsverfahren wurden die Nieren mit einer gleichzeitigen Nephrektomie der unbehandelten, kontralateralen Niere autotransplantiert. Daher war jeder Empfängerhund alleine von der wiederbelebten Niere zum Überleben abhängig. Der Vorgang nach der Transplantation des Empfängerhundes ist in 4 u. 5 gezeigt.
Die Nieren konnten gut erneut durchschwemmt warden und erzeugten innerhalb von Stunden nach der Transplantation Urin während der gesamten beobachteten Periode nach der Transplantation. Wie in 4 gezeigt, erfuhren beide Hunde einen leichten Anstieg an Serum Creatinin, was konsistent mit ATN war. In jedem Fall trat am dritten Tag nach der Transplantation ein Höchstwert an Serum Creatinin auf mit Werten von 3,5 mg/dl bzw. 2,8 mg/dl. Die Serum Creatinin Niveaus normalisierten sich jedoch innerhalb des zehnten Tages nach der Transplantation. Die Serumchemien blie ben für den Rest der beobachteten Periode nach der Transplantation normal. Wie in 5 gezeigt, stieg der Urin-Creatinin-Wert schnell an und war mehrere Tage vor der Normalisierung der Serumchemien innerhalb eines normalen Bereichs. Nach der Einschläferung ergaben sich aus den histologischen Funden im Wesentlichen normale Nieren. Diese Funde deuten auf die Regenerierung des tubulären Epithels hin. Die rückgängig machbare Natur der akuten tubulären Nekrose zusammen mit der Fähigkeit der transplantierten Niere, das kontinuierliche Überleben des Empfängers zu unterstützen, demonstrierte die Lebensfähigkeit und die In-vivo-Funktion des transplantierten Organs, das mehr als 2 Stunden warme Ischämie erlitt. Somit kann ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, in vivo nach der Wiederbelebung funktionieren.
BEISPIEL 7 – Vergleich mit bekannten Präservierungslösungen

Die Organe wurden unter Benutzung entweder des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung oder einer auf dem Stand der Technik bekannten Präservierungslösung (entweder ein Basiskulturmedium RSM-210^TM oder VIASPAN^TM) wiederbelebt und dann hinsichtlich Funktion und Histologie verglichen. Jede Gruppe von Nieren, welche 60 Minuten Durchblutungsentzug erlitten, wurde bei 32°C unter Benutzung der jeweiligen Lösung ausgespült und dann 2 Stunden lang mit der jeweiligen Lösung durchschwemmt: VIASPAN^TM bei 4°C; oder RSM-210^TM oder die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung bei 30–32°C unter Benutzung desselben Verfahrens zur Wiederbelebung. Ein Vergleich der mittleren Perfusionscharakteristiken (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und der Organfunktion (Urin Creatinin Konzentration; Histologie) der Nieren, welche 60 Minuten Durchblutungsentzug unterzogen und mit der jeweiligen Lösung behandelt wurden, ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Parameter	Wiederbelebungslösung	RSM-210^TM	ViaSpan^TM
Druck (mmHg)	54/25	44/40	54/46
Durchfluss (cc/min)	97,4	12,9	27
Gefäßwiderstand	0,47	3,25	1,8
Creatinin (mg/dl)	41,8	kein Urin	kein Urin
HIstologie	gut präserviert	gut präserviert	Glomerula-Schwellung, frühe tubulare Nekrose

Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung eine überstehende Fähigkeit aufweist im Vergleich zu RSM-210^TM und VIASPAN^TM bei der Wiederinstandsetzung der Gefäßcharakteristiken sowie der Funktion in ischämisch beschädigten Organen. Zum Beispiel zeigten die Nieren, die unter Benutzung der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung im Wiederbelebungsverfahren durchschwemmt wurden, wünschenswerterweise reduzierte Gefäßverengung und höhere Durchflüsse im Vergleich zu jenen, die mit RSM-210^TM oder VIASPAN^TM ausgespült und durchschwemmt wurden. Auf ähnliche Weise waren die Nieren, die unter Benutzung der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung ausgespült und durchschwemmt wurden, die einzigen Nieren, in denen die Organfunktion wieder instand gesetzt wurde, was zur Erzeugung von Urin mit gleichzeitiger Ausscheidung von Creatinin führte. Histologisch gesehen, wurden nur die Nieren, die unter Benutzung der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung oder mit RSM-210^TM ausgespült und durchschwemmt wurden, ausreichend wieder instand gesetzt und präserviert, wie durch die gut präservierte renale Archi tektur gezeigt. Dahingegen zeigten die Nieren, die mit VIASPA^TM ausgespült und durchschwemmt wurden, Hinweise auf histologische Beschädigung, umfassend Glomerula-Schwellung und tubuläre Nekrose. Die übergeordnete Fähigkeit im Vergleich zu den Präservierungslösungen, die dem Fachmann bekannt sind, des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass die Beeinträchtigung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann, wird veranschaulicht.
BEISPIEL 8 – Sauerstoffzufuhr im Wiederbelebungsvorgang

Wie vorher in Einzelheiten erläutert, besteht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darin, al seine Komponente in der Formulierung der Wiederbelebungslösung eines oder mehrere Sauerstoff tragende Agenzien einzuschließen. Evaluiert wurden die Wirkungen der verschiedenen Sauerstoff tragenden Agenzien als Komponente in der Wiederbelebungslösung und ihre relative Rolle der molekularen Sauerstoffzufuhr; und die Fähigkeit des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung, den fortlaufenden oxidativen Stoffwechsel zu unterstützen. Die Wiederbelebungslösung, der kein Sauerstoff tragendes Agens zugesetzt wurde (in Tabelle 6 als „RS" bezeichnet), die Wiederbelebungslösung, der gewaschene rote Blutzellen zugesetzt wurde (in Tabelle 6 mit „RS-RBC"; 15% v/v bezeichnet), die Wiederbelebungslösung, der gereinigtes Hämoglobin zugesetzt wurde (in Tabelle 6 als „RS-Hgb"; 60 cc/Liter im Handel erhältlicher Lösung bezeichnet) und die Wiederbelebungslösung, der eine perfluorchemische Emulsion zugesetzt wurde (in Tabelle 6 als „Rs-Pf"; 20% v/v bezeichnet), wurden jeweils benutzt, um Nieren wiederzubeleben, die 60 Minuten warme Ischämie erlitten. Jede Gruppe an Nieren, welche 60 Minuten Durchblutungsentzug erlitten, wurden bei 30 bis 32°C unter Benutzung der jeweiligen Lösung ausge spült und dann bei 30 bis 32°C 2 Stunden lang mit der jeweiligen Lösung unter Benutzung desselben Verfahrens zur Wiederbelebung durchschwemmt. Tabelle 6

Lösung	Druck (mmHg)	Durchfluss (cc/min)	Gefäßwid.	Creatinin	Histologie
RS	54/38	92,3	0,50	8,4	gut präserviert
RS-RBC	56/36	98,2	0,58	8,3	gut präserviert
RS-Hgb	58/42	66,67	0,75	18	gut präserviert
RS-Pf	54/25	97,4	0,47	41,8	gut präserviert

Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass während der Zunahme der Konzentration an molekularem Sauerstoff in der Wiederbelebungslösung über ein wirksameres Sauerstoff tragendes Agens als Komponente in der Wiederbelebungslösung die Organfunktion infolge des Wiederbelebungsverfahrens verbessert wird. Zum Beispiel resultieren wirksame Sauerstoff tragende Agenzien perfluorchemisches oder gereinigtes Hämoglobin in einer höheren Konzentration an molekularem Sauerstoff, der während des Verfahrens zugeführt wird. Die Funktion der Nieren, die mit der Wiederbelebungslösung, die in einem dieser tragenden Agenzien enthalten sind, behandelt wurden, verbesserte sich gegenüber derjenigen von Nieren, die mit der Wiederbelebungslösung, die kein zugesetztes Sauerstoff tragendes Agens oder ein weniger wirksames Sauerstoff tragendes Agens enthalten, behandelt wurden. Die Benutzung der Wiederbelebungslösung mit entweder gereinigtem Hämoglobin oder der Perfluorchemikalie nach der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel, resultierte in einer mittleren Urin Creatinin Konzentration von 18 mg/dl bzw. 41,8 mg/dl. Wenn dahingegen im Wiederbelebungsverfahren nicht ein Oxygenator benutzt wird und die Wiederbelebungslösung kein Sauerstoff tragendes Agens aufweist oder eine niedrige Konzentration an gewaschenen rotten Blutzellen enthält, ist das mittlere Urin Creatinin 8,4 mg/dl bzw. 8,3 mg/dl. Veranschaulicht ist eine andere Ausführungsform der Wiederbelebungslösung, bei der durch die Zugabe von einem oder mehreren wirksamen Sauerstoff tragenden Agenzien als Komponente in der Lösung eine verbesserte Organfunktion in einem ischämisch beschädigten Organ, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, bemerkt wurde.
BEISPIEL 9
Das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Leber unter Durchblutungsentzug zu bewältigen und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass eine Beeinträchtigung der Leberfunktion rückgängig gemacht werden kann. Während die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängig ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Leber mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur Wiederbelebung der meisten Lebern ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte Leberfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie der Leber können durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat und dem Leberprodukt (Galle) bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken der Leber können durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf Gallenkonzentrationen von Gallensalzen, Cholesterol, alkaline Phosphatase; Gallen-pH-Wert; und Lebergefäßdurchfluss, Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden. Gemäß dem Verfahren und den Lösungen, wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Leber behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
BEISPIEL 10
Das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Bauchspeicheldrüse unter Durchblutungsentzug zu bewältigen und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass eine Beeinträchtigung der Bauchspeicheldrüsenfunktion rückgängig gemacht werden kann. Während die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängig ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Bauchspeicheldrüse mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur Wiederbelebung der meisten Bauchspeicheldrüsen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte Bauchspeicheldrüsenfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie der Bauchspeicheldrüse können durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat und der Bauchspeicheldrüse bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken der Bauchspeicheldrüse umfassen Bauchspeicheldrüsenenzymkonzentrationen wie etwa Amylase, Lipase; das Hormon Insulin; Bauchspeicheldrüsenabsonderungs-pH-Wert, Natrium und Kalium; und Bauchspeicheldrüsengefäß-Durchfluss, Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen). Gemäß dem Verfahren und den Lösungen, wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Bauchspeicheldrüse behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
BEISPIEL 11
Das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einem Herz unter Durchblutungsentzug zu bewältigen und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass eine Beeinträchtigung der Herzfunktion rückgängig gemacht werden kann. Während die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängig ist, kann die Behandlung eines ischämisch beschädigten Herzens mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur Wiederbelebung der meisten Herzen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte Herzfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie des Herzens können durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat und des Herzens bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken des Herzens können durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf mechanische und elektrische Arbeit, Herzenzyme, wie etwa Transaminasen (Aspartat-Aminotransferase, AST), Laktatdehydrogenase (LD), Fruktose 1,6-diphosphataldolase (ALS), Malatdehydrogenase (MD), Glutathionreduktase (GR), Creatinphosphokinase (CPK), Hydroxybutyratedehydrogenase (HBD); Herzgefäßdurchfluss, Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden. Gemäß dem Verfahren und den Lösungen, wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit ein ischämisch beschädigtes Herz behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
BEISPIEL 12
Das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einem Dünndarm unter Durchblutungsentzug zu bewältigen und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass eine Beeinträchtigung der Dünndarmfunktion rückgängig gemacht werden kann. Während die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängig ist, kann die Behandlung eines ischämisch beschädigten Dünndarms mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur Wiederbelebung der meisten Dünndärme ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte Dünndarmfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie des Dünndarms können durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat und des Dünndarms bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken des Herzens können durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf funktionelle Assays wie etwa Magensäure-Stimulationstests, und Absorptionsassays unter Benutzung von Tracermolekülen; Dünndarmgefäßdurchfluss, Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden. Gemäß dem Verfahren und den Lösungen, wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit ein ischämisch beschädigter Dünndarm behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
BEISPIEL 13
Das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Lunge unter Durchblutungsentzug zu bewältigen und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass eine Beeinträchtigung der Lungenfunktion rückgängig gemacht werden kann. Es kann wünschenswert sein, zunächst das Lungentransplantat unmittelbar vor der erneuten Durchschwemmung mit einem Tensid zu behandeln (siehe z. B. Erasmus et al., 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153: 665–670). Während die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs abhängig ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Lunge mit dem Verfahren (Ausspülen und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur Wiederbelebung der meisten Lungen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte Lungenfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie der Lunge können durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat, wie etwa Tensidprotein A (SP-A) Niveaus bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken der Lunge können durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf FVC (forcierte Vitalkapazität), FEV1 (forciertes exspiratorisches Volumen in 1 Sekunde), PEFR (höchster exspiratorischer Fluss), VA (mittleres alveoläres Volumen), TLC (totale Lungenkapazität) und DLCO (Transfer für Kohlenmonoxid) eingeschätzt werden. Gemäß dem Verfahren und den Lösungen, wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Lunge behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.

Claims

Verfahren zur Induzierung der Reparation eines ischämisch beschädigten Organs in dem Maße, dass eine Beeinträchtigung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann, wobei das Verfahren das Ausspülen des Organs bei einer Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit einer gepufferten physiologischen Lösung, um Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem Organ während des Durchblutungsentzugs angesammelt haben; und das Durchschwemmen des Organs bei einer Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit einer gepufferten physiologischen Lösung umfasst, welches ferner einen Vasodilatator zur Erweiterung der Blutgefäße innerhalb des Organs, Nahrungsfaktoren zur Wiederherstellung der Zellintegrität, wodurch die Organfunktion wieder instand gesetzt wird, und mindestens ein chemisches Energiesubstrat umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid, tri-Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium und -Cocarboxylase ausgewählt ist, um den Oxidationsstoffwechsel im Organ beim neuen Anpassen des Organs an eine sauerstoffhaltige Umgebung wiederherzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner das Einbringen molekularen Sauerstoffs durch einen Modus, der aus der Gruppe, bestehend aus einem Oxygenator und einem Sauerstoff tragenden Agens ausgewählt ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Perfusion unter Benutzung eines laminaren oder pulsierenden Pumpsystems durchgeführt wird, um die gepufferte physiologische Lösung zu fördern, und wobei die Vorrichtung ferner ein Mittel zur Bereitstellung und Regelung der Perfusion und des Perfusionsdrucks, ein Mittel zur Regelung der Temperatur und ein Mittel zur Bereitstellung und Regelung der Einbringung und Entlüftung von Atmungsgasen und ein Mittel zur Prüfung oder Sammlung zur Prüfung der gepufferten physiologischen Lösung umfasst, die das Organ bereits durchschwemmt hat, um eine oder mehrere funktionelle Charakteristiken zu überwachen oder zu messen, wie etwa pH-Wert, verschiedene Drücke, Durchflussmenge, Gefäßwiderstand, chemische Bestandteile, Sauerstoffanreicherung, Kohlendioxidkonzentration und Sauerstoffzehrung.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Perfusion unter Benutzung einer zweiten Vorrichtung in Verbindung mit der ersten Vorrichtung durchgeführt wird, um ein Organprodukt, das von dem Organ abgelenkt ist, zu prüfen oder zu sammeln zum Prüfen, wobei die nachfolgende Messung der Parameter des Organproduktes die Organintegrität und -funktion betreffen.
Wiederbelebungslösung zur Hemmung ischämischen Schadens und zur Induzierung der Reparation ischämischen Schadens in dem Maße, dass die Beeinträchtigung der Organfunktion in einem Organ, das einer Durchblutung entzogen wurde, rückgängig gemacht wird, wobei die Wiederbelebungslösung eine gepufferte physiologische Lösung umfasst und ferner umfasst: Vasodilatatoren in einer physiologisch wirksamen Menge zur Erweiterung des Gefäßsystems des Organs; mindestens ein chemisches Energiesubstrat, das aus der Gruppe, bestehend aus AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid, tri- Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium und -Cocarboxylase in einer physiologisch wirksamen Menge, um den Oxidationsstoffwechsel wiederherzustellen, der während des Entzugs der Organdurchblutung verloren ging; und Nahrungsfaktoren in einer physiologisch wirksamen Menge, um einen oder mehrere Zellreparaturvorgänge zu fördern, um die Zellfunktion, die während des Entzugs der Organdurchblutung verloren ging, wiederherzustellen.
Wiederbelebungslösung nach Anspruch 5, wobei die Vasodilatatoren eine Kombination von Komponenten umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus Substraten zur endothelialen zellvermittelten Vasodilatation, Substraten zur Vasodilatation von Mikrogefäßen, Kalzium-Kanalblocker, ausgewählt sind.
Wiederbelebungslösung nach Anspruch 6, wobei die Substrate zur endothelialen zellvermittelten Vasodilatation Acetylcholin und Arginin umfassen, wobei die Substrate zur Vasodilatation von Mikrogefäßen Prostacylin und Mg⁺ umfassen und wobei die Kalzium-Kanalblocker Adenosin und Verapamil umfassen.
Wiederbelebungslösung nach Anspruch 5, wobei die Nahrungsfaktoren aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren, Magnesium, Nukleinsäurenderivaten, Ribonukleosiden, saurem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), basischem FGF, Heparin, Chondroitinsulfat und einer Kombination davon ausgewählt sind.
Wiederbelebungslösung nach Anspruch 5, wobei die Lösung ferner eine physiologisch wirksame Menge an einer Komponente umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus einem Antioxidans, einem Sauerstoff tra genden Agens und einer Kombination davon ausgewählt ist.
Wiederbelebungslösung nach Anspruch 5, wobei die Lösung ferner eine pharmazeutisch wirksame Menge an einem neuroprotektivem Arzneimittel umfasst.