DE69737266T2

DE69737266T2 - Ob-fusionsprotein enthaltende zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69737266T2
Application number: DE69737266T
Authority: DE
Inventors: Benjamin Michael Thousand Oaks MANN; Ira Randy Thousand Oaks HECHT
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-12-12
Also published as: NO992779L; NO992779D0; YU27999A; JP4659068B2; NO325096B1; PL334242A1; BG64288B1; AU5606098A; IL130396A; KR20000069617A; SK287578B6; PL194159B1; RS49927B; BR9713755A; EA004791B1; ZA9711239B; IL130396A0; CN1246154A; AR009436A1; EP1835030A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Fc-OB-Fusionsproteinen sowie Verfahren für ihre Herstellung und die Verwendung davon.
Hintergrund der Erfindung
Obwohl die molekulare Grundlage für Adipositas weitestgehend unbekannt ist, hat die Identifizierung des „OB-Gens" und des von ihm kodierten Proteins („OB-Protein" oder „Leptin") etwas zur Aufklärung der Mechanismen beigetragen, die der Körper benutzt, um die Körperfettablagerung zu regulieren. Siehe PCT-Veröffentlichung, WO 96/05309 (12/22/96), Friedman et. al.; Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994); siehe auch die Korrektur in Nature 374: 479 (1995). Das OB-Protein ist in vivo sowohl bei ob/ob-mutierten Mäusen (adipöse Mäuse aufgrund eines Defekts in der Produktion des OB-Genprodukts) als auch bei normalen Mäusen vom Wildtyp aktiv. Die biologische Aktivität zeigt sich unter anderem am Gewichtsverlust. Siehe allgemein, Barrinaga, „Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475-456 (1995). Das OB-Protein, seine Derivate und deren Verwendung als Modulatoren für die Kontrolle von Gewicht und Adipositas bei Tieren, einschließlich Säugetieren und dem Menschen, wird in weiteren Einzelheiten in der PCT-Veröffentlichung WO 96/05309 (12/22/96) offenbart.
Die anderen biologischen Effekte des OB-Proteins sind noch nicht gut charakterisiert. Bekannt ist zum Beispiel, dass in ob/ob-mutierten Mäusen die Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme bei der Seruminsulinkonzentration und der Serumglukosekonzentration führt. Es ist auch bekannt, dass es infolge der Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme des Körperfetts kommt. Beobachtet wurde dies sowohl bei ob/ob-mutierten Mäusen als auch bei nicht adipösen normalen Mäusen. Pelleymounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546 (1995). Siehe auch, Oampfield et al., Science 269: 546-549 (1995) (Periphere und zentrale Verabreichung von Mikrogramm-Dosierungen von OB-Protein senkten die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht bei ob/ob- und nahrungsinduzierten adipösen Mäusen, aber nicht bei db/db-adipösen Mäusen.) Bei keinem dieser Berichte wurde eine Toxizität beobachtet, selbst nicht bei der höchsten Dosierung.
Trotz der viel versprechenden Aussicht auf klinische Anwendung des OB-Proteins ist der Wirkmechanismus des OB-Proteins in vivo nicht eindeutig geklärt. Informationen zu dem OB-Rezeptor zeigen eine hohe Affinitätsbindung für das OB-Protein, das in dem Hypothalamus von Ratten nachgewiesen wurde, was auf eine OB-Rezeptorlokalisierung hindeutet. Stephens et al., Nature 377: 530-532. Die db/db-Maus zeigt den gleichen Phänotyp wie die ob/ob-Maus, d.h. extreme Adipositas und Diabetes Typ II; angenommen wird, dass dieser Phänotyp seine Ursache in einem defekten OB-Rezeptor hat, insbesondere da db/db-Mäuse nicht auf die Verabreichung von OB-Protein ansprechen. Siehe Stephens et al., supra.
Mit dem Fortschritt bei der rekombinanten DNA-Technik, hat die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen für den therapeutischen Nutzen auch zu Fortschritten bei der Proteinformulierung und der chemischen Modifizierung geführt. Ein Ziel einer solchen Modifizierung ist der Schutz für das Protein und der dadurch verringerte Abbau. Fusionsproteine und chemische Bindungen können wirkungsvoll den physikalischen Kontakt eines proteolytischen Enzyms mit dem Proteingerüst selbst blockieren und somit den Abbau verhindern. Zu den zusätzlichen Vorteilen zählen unter bestimmten Umständen erhöhte Stabilität, längere Zirkulationszeit und die biologische Aktivität des therapeutischen Proteins. Ein Übersichtsartikel, welcher die Proteinmodifizierung und die Fusionsproteine beschreibt, ist von Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mai 1992) (publiziert von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, Old, UK).
Eine solche Modifizierung besteht in der Verwendung des Fc-Bereichs von Immunglobulinen. Antikörper umfassen zwei funktionell voneinander unabhängige Teile, eine variable Domäne, bekannt als „Fab", welche sich an das Antigen bindet, und eine konstante Domäne, die als „Fc" bekannt ist, welche die Verbindung zu den Effektorfunktionen, wie beispielsweise Komplement oder Phagozytosezellen bereitstellt. Die Fc-Komponente eines Immunglobulins hat eine lange Plasmahalbwertszeit, wohingegen die Fab-Komponente kurzlebig ist. Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989).
Unter Verwendung der Fc-Domäne wurden therapeutische Proteinprodukte konstruiert, um eine längere Halbwertszeit bereitzustellen oder um Funktionen, wie beispielsweise FC-Rezeptorbindung, Protein-A-Bindung, Komplementfixierung und Plazentatransfer miteinzubinden, welche alle in den Fc-Proteinen der Immunglobuline vorhanden sind. Id. Zum Beispiel wurde der Fc-Bereich eines IgG1-Antikörpers an dem N-terminafen Ende von CD30-L fusioniert, einem Molekül, welches CD30-Rezeptoren bindet, die von Tumorzellen bei der Hodgkin-Krankheit, anaplastischen Lymphomzellen, T-Zell-Leukämiezellen und anderen malignen Zelltypen exprimiert werden. Siehe, US-Patent Nr. 5,480,981. IL-10, ein antiinflammatorisches und immunsuppressives Agens, wurde an den murinen Fcγ2a-Teil fusioniert, um die kurze Halbwertszeit des zirkulierenden Zytokins zu verlängern. Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995). In Studien wurde ebenfalls die Verwendung von Tumornekrosefaktor-Rezeptor, der mit dem Fc-Protein von humanem IgG1 verbunden ist, bewertet, um Patienten mit septischem Schock zu behandeln. Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334: 1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996). Fc wurde auch mit dem CD4-Rezeptor fusioniert, um ein therapeutisches Protein für die Behandlung von AIDS herzustellen. Siehe, Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989). Zusätzlich dazu wurde auch der N-Terminus von Interleukin 2 mit der Fc-Komponente von IgG1 oder IgG3 fusioniert, um die kurze Halbwertszeit von Interleukin 2 und seine systemische Toxizität zu umgehen. Siehe, Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105 (1995).
Aufgrund der Identifikation des OB-Proteins als einem viel versprechenden therapeutischen Protein, besteht die Notwendigkeit, Zusammensetzungen von OB-Analoga für die klinische Anwendung in Verbindung mit oder anstelle der OB-Proteinverabreichung zu entwickeln. Zu solchen Entwicklungen würden auch Zusammensetzungen von OB-Analoga gehören, bei denen die Proteinformulierungen und chemischen Modifizierungen zu einem verringerten Abbau, erhöhter Stabilität und längerer Zirkulationszeit des Proteins führen. Die vorliegende Erfindung stellt solche Zusammensetzungen bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Fc-OB-Fusionsprotein, Verfahren für die Herstellung solcher Zusammensetzungen und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein genetisches Fusionsprotein, welches den Fc-Bereich von Immunglobulinen umfasst, der an dem N-terminalen Anteil des OB-Proteins oder den Analoga fusioniert ist. Das Fc-OB-Fusionsprotein ist über die Cysteinreste des Fc-Bereichs zu einer Dimerisation in der Lage. Die genetische Fusionsmodifizierung mit Fc an dem N-Terminus des OB-Proteins zeigt unerwartet Vorteile bezüglich der Stabilität, der Clearancerate und des verringerten Abbaus, was bei dem OB-Protein oder bei der Fusion von Fc an dem C-Terminus des OB-Proteins nicht beobachtet wird. Überraschenderweise und wichtig zugleich schützt die N-Terminus-Modifizierung unerwartet das Protein davor, abgebaut zu werden und erhöht die Zirkulationszeit und die Stabilität im Vergleich zu der OB-Protein- oder Fc-Modifizierung an dem C-Terminus des OB-Proteins. Solche unerwarteten Vorteile aus der Fc-Modifizierung an dem OB-Protein wären für diejenigen, die OB-Protein einnehmen, insofern vorteilhaft, als dass diese Veränderungen eine niedrigere Dosierung oder eine weniger häufige Dosierung erfordern würden. Somit weist, wie unten detaillierter beschrieben, die vorliegende Erfindung eine Reihe von Aspekte auf, die sich auf die genetische Modifizierung von Proteinen über die Fusion des Fc-Bereichs an dem OB-Protein beziehen als auch auf spezifische Modifizierungen, Herstellungen und Verfahren für die Verwendung derselben.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Fc-OB-Fusionsprotein bereit, in welchem Fc genetisch an dem N-Terminus des OB-Proteins fusioniert ist. Zusätzlich dazu kann die Fc-Komponente auch an den N-Terminus des OB-Proteins über Peptid- oder chemische Linker gebunden sein, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Wie oben bereits erwähnt und unten detaillierter beschrieben, weist das Fc-OB-Fusionsprotein unerwarteten Schutz vor Abbau auf sowie eine erhöhte Zirkulationszeit und Stabilität im Vergleich zu dem OB-Protein oder den C-terminalen OB-Fc-Fusionsproteinen. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten daher nicht nur Zusammensetzungen von Fc- OB-Fusionsproteinen, sondern auch DNA-Sequenzen, die für solche Proteine kodieren, verwandte Vektoren und Wirtszellen, die solche Vektoren enthalten, welche beide hilfreich für die Herstellung von Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung sind.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung des Fc-OB-Fusionproteins bereit. Solche Verfahren enthalten rekombinante DNA-Techniken für die Herstellung von rekombinanten Proteinen. Des Weiteren beinhalten solche Aspekte auch Verfahren für die Fermentation und Reinigung.
Hierin beschrieben werden Verfahren für die Behandlung von Übergewicht bei einer Person oder bei Tieren, einschließlich der Veränderung des Fettanteils und/oder der Fettablagerungen durch die Verabreichung von Fc-OB-Fusionsproteinen. Aufgrund der Merkmale des Fc-OB-Fusionsproteins werden hierin Verfahren beschrieben, welche die Menge und/oder Häufigkeit der Dosierung von OB-Protein durch die Verwendung des Fc-OB gewichtsreduzierenden Agens verringern.
Hierin beschrieben werden Therapien für die Behandlung von mit übermäßigem Fett assoziierten Co-Morbiditäten, wie beispielsweise Diabetes, Dys- oder Hyperlipidämie, Arteriosklerose, arterielle Plaques, die Verringerung oder Verhinderung von Gallensteinbildung, Schlaganfall und ebenso für einen Anstieg bei der Insulinsensitivität und/oder für eine Zunahme an fettfreier Körpermasse.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch verwandte pharmazeutische Zusammensetzungen der Fc-OB-Proteine für die Verwendung in den oben genannten Therapien bereit.
Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung ein Protein bereit mit einer Formel, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: R₁ - R₂ und R₁ - L - R₂ besteht, wobei R₁ ein Fc-Protein ist, R₂ ein OB-Protein ist und L ein Linker ist und wobei das Fc-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht:

(a) den Aminosäuren 1-233 der SEQ. ID. NRN.: 9 und 12 und den Aminosäuren 1-228 der SEQ. ID. NRN.: 15 und 18;
(b) den Aminosäuren 1-233 der SEQ. ID. NR.: 9 mit einer anderen Aminosäure, die an einer oder mehreren der folgenden Positionen ersetzt oder entfernt wurde; (i) ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt durch einen Alanin- oder Serinrest; (ii) ein oder mehrere Tyrosinreste ersetzt durch einen Phenylalaninrest; (iii) die Aminosäure an Position 5 ersetzt durch ein Alanin; (iv) die Aminosäure an Position 20 ersetzt durch Glutamat; (v) die Aminosäure an Position 103 ersetzt durch ein Alanin; (vi) die Aminosäure an Position 105 ersetzt durch ein Alanin; (vii) die Aminosäure an Position 107 ersetzt durch ein Alanin: (viii) die Aminosäuren an Positionen 1, 2, 3, 4 und/oder 5 entfernt oder ersetzt, und (ix) eine Kombination aus den Teilen i bis viii;
c) der Aminosäuresequenz der Teile (a) oder (b) mit einem Methionylrest am N-Terminus;
d) dem Fc-Protein aus einem beliebigen der Teile (a) bis (c), die aus einer chemische Komponente besteht, die mit der Proteinkomponente verbunden ist, und wobei die chemische Komponente Polyethylenglykol ist und
e) einem Derivat von Teil (d), wobei das Polyethylenglykol ausschließlich am N-Terminus der Proteinkomponente befestigt ist,

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(a) den Aminosäuren 1-233 der SEQ. ID. NRN.: 9 und 12 und den Aminosäuren 1-228 der SEQ. ID. NRN.: 15 und 18;
b) den Aminosäuren 1-233 der SEQ. ID. NR. 9 mit einer anderen Aminosäure, die an einer oder mehreren der folgenden Positionen ersetzt oder entfernt wurde: (i) ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt durch einen Alanin- oder Serinrest; (ii) ein oder mehrere Tyrosinreste ersetzt durch einen Phenylalaninrest; (iii) die Aminosäure an Position 5 ersetzt durch ein Alanin; (iv) die Aminosäure an Position 20 ersetzt durch Glutamat; (v) die Aminosäure an Position 103 ersetzt durch ein Alanin; (vi) die Aminosäure an Position 105 ersetzt durch ein Alanin; (vii) die Aminosäure an Position 107 ersetzt durch ein Alanin; (viii) die Aminosäuren an Positionen 1, 2, 3, 4 und/oder 5 entfernt oder ersetzt, und (xi) eine Kombination von Teilen i-vii, und
(c) die Aminosäuresequenz der Teile (a) oder (b) mit einem Methionylrest an dem N-Terminus,

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 Rekombinante murine metOB (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 1 und 2) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 3).
2 Rekombinante humane metOB analoge (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 4 und 5) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 6).
3(A-C) Rekombinante humane metFc-OB (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 7 und 8) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 9).
4(A-C) Rekombinante humane metFc-OB abweichende (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 10 und 11) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 12).
5(A-C) Rekombinante humane metFc-OB abweichende (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 13 und 14) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 15).
6(A-C) Rekombinante humane metFc-OB abweichende (doppelsträngige) DNA (SEQ. ID. NRN.: 16 und 17) und die Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NR. 18).
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Fc-OB-Fusionsproteinen, Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die genetische oder chemische Fusion des Fc-Bereichs von Immunglobulinen an dem N-terminalen Anteil des OB-Proteins. Unerwartet zeigt die Fusion von Fc an dem N-Terminus des OB-Proteins Vorteile, welche bei dem OB-Protein oder bei der Fusion von Fc an dem C-Terminus des OB-Proteins nicht beobachtet werden. Das am N-Terminus veränderte Fc-OB-Protein stellt überraschend einen Schutz für das Protein vor Abbau dar und führt zu erhöhter Zirkulationszeit und erhöhter Stabilität. Demgemäß werden das Fc-OB-Protein und Analoga oder Derivate davon sowie verwandte Verfahren für die Verwendung und Herstellung unten detaillierter beschrieben.
Zusammensetzungen
Die Fc-Sequenz der rekombinanten humanen Fc-OB-Sequenz, die in SEQ. ID. NR. 9 (siehe 3) angeführt ist, kann unter der schweren Kette des humanen Immunglobulin IgG-1, siehe Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982) oder einer beliebigen anderen Fc-Sequenz, die auf dem Gebiet bekannt ist (z. B. andere IgG-Klassen einschließlich IgG-2, IgG-3 und IgG-4 oder andere Immunglobuline, jedoch nicht darauf beschränkt) ausgewählt werden.
Varianten, Analoga oder Derivate des Fc-Bereichs können zum Beispiel konstruiert werden, indem verschiedene Reste oder Sequenzen ausgetauscht werden.
Cysteinreste können entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von Disulfidquervernetzungen der Fc-Sequenzen zu verhindern. Insbesondere ist die Aminosäure an Position 5 der SEQ. ID. NR. 9 ein Cysteinrest. Die rekombinante Fc-OB-Sequenz der SEQ. ID. NR. 9 ist ein 378 Aminosäuren umfassendes Fc-OB-Protein (den Methioninrest nicht mitgezählt). Auf die erste Aminosäuresequenz für das rekombinante Fc-OB-Protein von 3 wird als +1 Bezug genommen mit dem Methionin an der Position -1.
Der Cysteinrest kann an Position 5 entfernt oder durch eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt werden. Ein Alaninrest kann durch einen Cysteinrest an Position 6 ersetzt werden und führt zu der abweichenden Aminosäuresequenz von 4 (SEQ. ID. NR. 12). Das rekombinante Fc-OB-Protein von 4 ist ein aus 378 Aminosäuren bestehendes Fc-OB-Protein (den Methioninrest nicht mitgezählt). Auf die erste Aminosäuresequenz für das rekombinante Fc-OB-Protein von 4 wird mit +1 Bezug genommen mit dem Methionin an der Position -1.
Auf ähnliche Weise könnte das Cystein an Position 5 von SEQ. ID. NR. 9 durch ein Serin oder einen anderen Aminosäurerest ersetzt oder entfernt werden. Es kann eine Variante oder ein Analogon hergestellt werden, indem Aminosäuren an den Positionen 1, 2, 3, 4 und 5 hergestellt werden sowie mit der Variante in SEQ. ID. NR. 15 (siehe 5). Auch an diesen Positionen können Austauschvorgänge durchgeführt werden und liegen im Anwendungsbereich dieser Erfindung. Das rekombinante Fc-OB-Protein von 5 ist ein aus 373 Aminosäuren bestehendes Fc-OB-Protein (den Methioninrest nicht mitgezählt). Auf die erste Aminosäuresequenz für das rekombinante Fc-OB-Protein von 5 wird als +1 Bezug genommen mit dem Methionin an Position -1.
Modifizierungen können auch durchgeführt werden, um vier Aminosäureersetzungen vorzunehmen, damit die Fc-Rezeptorbindungsstelle und die Komplement(C1q)bindungsstelle abladiert werden können. Diese von der SEQ. ID. NR. 15 abweichenden Modifizierungen würden auch miteinschließen, dass Leucin an Position 15 ersetzt wird durch Glutamat, Glutamat an Position 98 ersetzt wird durch Alanin und die Lysine an den Positionen 100 und 102 ersetzt werden durch Alanine (siehe 6 und SEQ. ID. NR. 18). Das rekombinante Fc-OB-Protein von 6 ist ein aus 373 Aminosäuren bestehendes Fc-OB-Protein (den Methioninrest nicht mitgezählt). Auch die erste Aminosäuresequenz für das rekombinante Fc-OB-Protein von 6 wird als +1 Bezug genommen mit dem Methionin an Position -1.
Auf ähnliche Weise kann ein Tyrosinrest oder können mehrere Tyrosinreste auch durch Phenylalaninreste ersetzt werden. Zusätzlich dazu wird in Betracht gezogen, andere abweichende Aminosäuren einzufügen, zu entfernen und/oder zu ersetzen. Des Weiteren können Veränderungen in der Form von veränderten Aminosäuren, wie beispielsweise Peptidomimetika oder D-Aminosäuren vorgenommen werden. Das Fc-Protein kann auch mit den OB-Proteinen des Fc-OB-Proteins verlinkt sein durch „Linker"-Komponenten ganz gleich, ob durch chemische oder durch Aminosäuren mit unterschiedlichen Längen. Solche chemischen Linker sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Aminosäure-Linkersequenzen können die Folgenden enthalten, ohne auf diese beschränkt zu sein:

(a) ala-ala-ala;
(b) ala-ala-ala-ala;
(c) ala-ala-ala-ala-ala;
(d) gly-gly;
(e) gly-gly-gly;
(f) gly-gly-gly-gly-gly;
(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;
(h) gly-pro-gly;
(i) gly-gly-pro-gly-gly, und
(j) jede Kombination von Teilen (a) bis (i).

Der OB-Anteil des Fc-OB Fusionsproteins kann unter dem rekombinaten murinen Protein, das in SEQ. ID. Nr. 3 (siehe 1) angeführt ist, oder dem rekombinanten humanen Protein, wie von Zhang et al., in Nature, supra aufgeführt, oder denjenigen, bei denen der Glutaminylrest an Position 28 fehlt, ausgewählt werden. Siehe Zhang et al., Nature supra, auf Seite 428). Es kann auch das rekombinante humane OB-Proteinanalogon, wie in SEQ. ID. NR. 6 (siehe 2) ausgeführt, verwendet werden, welches enthält: (1) ein Arginin anstelle von Lysin an Position 35; und (2) ein Leucin anstelle von Isoleucin an Position 74. (Eine Kurzschreibweise für dieses Analogon ist das rekombinante humane R→L³⁵, I→L⁷⁴). Die Aminosäuresequenzen für die rekombinanten humanen und rekombinanten murinen Proteine oder Analoga mit oder ohne die fusionierte Fc-Komponente an dem N-Terminus des OB-Proteins sind unten mit einem Methionylrest an der Position -1 angeführt; allerdings kann wie bei allen OB-Proteinen und Analoga der Methionylrest fehlen.
Das murine Protein ist im Wesentlichen homolog zu dem humanen Protein, insbesondere als ein reifes Protein und ferner insbesondere an dem N-Terminus. Ein Analogon des rekombinanten humanen Proteins kann hergestellt werden, indem die Aminosäuren in der rekombinanten humanen Sequenz geändert werden (wie beispielsweise durch Ersetzen von Aminosäureresten), die von der murinen Sequenz abweichen. Da das rekombinante humane Protein bei Mäusen biologische Aktivität besitzt, wäre ein solches Analogon möglicherweise auch beim Menschen aktiv. Zum Beispiel könnte unter Verwendung eines humanen Proteins mit einem Lysin an Rest 35 und einem Isoleucin an Rest 74 entsprechend der Nummerierung von SEQ. ID. NR. 6, wobei die erste Aminosäure Valin ist und die Aminosäure an Position 146 Cystein ist, diese auch durch eine andere Aminosäure oder eine oder mehrere Aminosäuren an den Positionen 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 ersetzt werden. Es ist möglich, die Aminosäure an der entsprechenden Position des murinen Proteins (SEQ. ID. NR. 3) oder eine andere Aminosäure auszuwählen.
Ferner können „Konsensus"-Moleküle hergestellt werden basierend auf der OB-Proteinsequenz von Ratten. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944-952 (1995). Das OB-Protein von Ratten weicht von dem humanen OB-Protein an den folgenden Positionen ab (unter Verwendung der Nummerierung von SEQ. ID. NR. 6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 und 145. An diesen abweichenden Positionen kann eine Aminosäure durch eine oder mehrere der Aminosäuren ersetzt werden. Die gekennzeichneten Positionen sind diejenigen, bei denen das murine OB-Protein sowie das OB-Protein von Ratten von dem humanen OB-Protein abweichen und welche somit besonders gut für eine Veränderung geeignet sind. An einer oder an mehreren Positionen kann eine Aminosäure aus dem entsprechenden Ratten-OB-Protein oder eine andere Aminosäure ersetzt werden.
Die Positionen sowohl von Ratten- als auch Mäuse-OB-Protein, welche von reifem humanem OB-Protein abweichen, sind: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145. Ein OB-Protein gemäß der SEQ. ID. NR. 6, bei welchem eine Aminosäure oder mehrere der oben erwähnten Aminosäuren durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden, wie beispielsweise die Aminosäure, die in der entsprechenden Ratten- oder Mäusesequenz gefunden wurde, kann ebenso wirksam sein.
Zusätzlich dazu sind die Aminosäuren, die in dem OB-Protein von Rhesusaffen gefunden wurden, und welche von dem reifen humanen OB-Protein abweichen (mit Kennungen, die in Klammer in Form eines Buchstabens für das Aminosäurekürzel angegeben sind): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) und 118 (L). Da das rekombinante humane OB-Protein in Cynomologus-Affen aktiv ist, kann auch ein humanes OB-Protein gemäß SEQ. ID. NR. 6 (mit Lysin an Position 35 und Isoleucin an Position 74) aktiv sein, bei dem eine Aminosäure oder mehrere der Aminosäuren, die von den Aminosäuren von Rhesusaffenaffen abweichen, durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden, wie beispielsweise die Aminosäuren in Klammern. Zu beachten ist, dass bestimmte vom Rhesusaffen abweichende Aminosäuren auch diejenigen sind, die in den oben erwähnten Mäusespezies (Positionen 35, 68, 89, 100 und 112) zu finden sind. Demzufolge kann ein Mäuse/Rhesusaften-/humanes Konsensusmolekül hergestellt werden (unter Verwendung der Nummerierung von SEQ. ID. NR. 6 mit einem Lysin an Position 35 und einem Isoleucin an Position 74) mit einer Aminosäure oder mit mehreren der Aminosäuren an Positionen, die durch eine andere Aminosäure ersetzt werden: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145.
Es können andere Analoga hergestellt werden, indem ein Teil der Aminosäuresequenz des Proteins entfernt wird. Zum Beispiel fehlt dem reifen Protein eine Führungssequenz (-22 bis -1). Die folgenden verkürzten Formen von humanen OB-Proteinmolekülen (unter Verwendung der Nummerierung von SEQ. ID. NR. 6) können hergestellt werden:

(a) Aminosäuren 98-146
(b) Aminosäuren 1-32
(c) Aminosäuren 40-116
(d) Aminosäuren 1-99 und (verbunden mit) 112-146
(e) Aminosäuren 1-99 und (verbunden mit) 112-146 mit einer oder mehreren Aminosäuren 100-111 positioniert zwischen den Aminosäuren 99 und 112.

Zusätzlich dazu können die verkürzten Formen auch eine oder mehrere veränderte Aminosäuren aufweisen, welche vom humanen OB-Protein abweichen (OB-Protein von Ratte, Maus oder Rhesusaffen). Des Weiteren können alle Veränderungen in der Form von veränderten Aminosäuren, wie beispielsweise Peptidomimetika oder D-Aminosäuren auftreten.
Hierin wird auch ein Fc-OB-Fusionsprotein beschrieben, bei welchem das OB-Protein ausgewählt wird unter:

(a) der Aminosäuresequenz 1-146, wie in SEQ. ID. NR. 3 (unten) oder SEQ. ID. NR. 6 ausgeführt;
(b) der Aminosäuresequenz 1-146, wie in SEQ. ID. NR. 6 (unten) ausgeführt, mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74;
(c) der Aminosäuresequenz von Teil (b), bei der eine andere Aminosäure in einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Nummerierung gemäß SEQ. ID. NR. 6 und Beibehalten der gleichen Nummerierung selbst bei fehlendem Glutaminylrest an Position 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 ersetzt wird;
(d) der Aminosäuresequenz von Teil (a), (b) oder (c), bei welcher optional ein Glutaminylrest an Position 28 fehlt;
(e) der Aminosäuresequenz von Teil (a), (b), (c) oder (d) mit einem Methionylrest an dem N-Terminus;
(f) ein verkürztes OB-Proteinanalogon ausgewählt unter: (unter Verwendung der Nummerierung von SEQ. ID. NR. 6): (i) Aminosäuren 98-146 (ii) Aminosäuren 1-32 (iii) Aminosäuren 40-116 (iv) Aminosäuren 1-99 und 112-146 (v) Aminosäuren 1-99 und 112-146 mit einer oder mehreren Aminosäuren 100-111, welche zwischen den Aminosäuren 99 und 112 positioniert sind, und (vi) das verkürzte OB-Proteinanalogon von Teil (i) mit einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145, die durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden. (vii) das verkürzte OB-Proteinanalogon von Teil (ii) mit einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 4, 8 und 32, welche durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden; (viii) das verkürzte OB-Proteinanalogon von Teil (iii) mit einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 und 112, welche durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden. (vix) das verkürzte OB-Proteinanalogon von Teil (iv) mit einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 und 145, welche durch eine andere Aminosäure ersetzt wird/werden; und (x) das verkürzte OB-Proteinanalogon von Teil (v) mit einer oder mehreren Aminosäuren an den Positionen 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145, welche mit einer anderen Aminosäure ersetzt wird/werden. (xi) das verkürzte Analogon von beliebigen Teilen (i)-(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und
(g) das OB-Protein oder Analogderivat von beliebigen Teilen (a) bis (f), welches aus einer chemischen Komponente besteht, die an die Proteineinheit gebunden ist;
(h) ein Derivat von Teil (g), wobei die chemische Komponente eine wasserlösliche Polymerkomponente ist;
(i) ein Derivat von Teil (h), wobei die wasserlösliche Polymerkomponente ein Polyethylenglykol ist;
(j) ein Derivat von Teil (h), wobei die wasserlösliche Polymerkomponente eine Polyaminosäurekomponente ist;
(k) ein Derivat von Teil (h) bis (j), wobei die Komponente ausschließlich an dem N-Terminus der Proteinkomponente befestigt ist, und
(l) ein OB-Protein, ein Analogon oder Derivat von beliebigen Teilen (a) bis (k) in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff.

Derivate
Die vorliegenden Fc-OB-Fusionsproteine (der hierin verwendete Begriff „Protein" bezieht sich auch auf „Peptid", Fc, OB oder Analoga, wie solche, die, falls nicht anders angegeben, als infra bezeichnet werden) werden derivatisiert, indem eine oder mehrere chemische Komponenten an der Fc-OB-Fusionsproteinkomponente befestigt werden. Diese chemisch modifizierten Derivate können ferner für intraarterielte, intraperitoneale, intramuskulär-subkutane, intravenöse, orale, nasale, pulmonale, topische oder andere Verabreichungswege, wie unten diskutiert, formuliert werden. Chemische Modifizierungen von biologisch aktiven Proteinen haben unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile geschaffen, wie beispielsweise die Erhöhung der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und der Senkung der Immunogenität. Siehe US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., erteilt Dezember 18, 1979. Für einen Übersichtsartikel, siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg. Seiten 367-383 (1981)); Francis et al., supra.
Die chemischen Komponenten, die für solch eine Derivatisierung geeignet sind, können ausgewählt werden unter verschiedenen wasserlöslichen Polymeren. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein derart, dass das Protein, an welchem es befestigt wird, nicht in wässriger Umgebung, wie beispielsweise einer physiologischen Umgebung präzipitiert. Vorzugsweise wird das Polymer für die therapeutische Nutzung der Endproduktpräparation pharmazeutisch annehmbar sein. Ein Fachmann wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer auszuwählen basierend auf solchen Überlegungen, ob das Polymer/Proteinkonjugat therapeutisch eingesetzt wird, und falls dem so ist, wird er die gewünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Resistenz gegenüber Proteolyse erwägen sowie andere Überlegungen anstellen. Für die Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung kann die Wirksamkeit der Derivatisierung durch die Verabreichung des Derivates in der gewünschten Form (d.h. über osmotische Pumpe oder insbesondere durch Injektion oder Infusion oder beispielsweise ferner für orale, pulmonale oder nasale Verabreichung formuliert werden) und durch Beobachten der biologischen Effekte, wie hierin beschrieben, sichergestellt werden.
Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die zum Beispiel aus Polyethylenglykol, Copolymeren von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykol-Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole und Polyvinylalkohol besteht. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann Vorteile bei der Herstellung aufgrund seiner Stabilität in Wasser haben. Auch Succinat und Styrol können verwendet werden.
Die OB- oder Fc-Proteine, die für die Formulierung des Fc-OB-Fusionsproteins formuliert werden, können hergestellt werden, indem Polyaminosäuren oder Aminosäuren am Verzweigungspunkt an der Fc- oder OB-Proteinkomponente befestigt werden. Zum Beispiel kann die Polyaminosäure ein zusätzliches Trägerprotein sein, welches, ähnlich wie die an dem OB-Protein fusionierte Fc-Komponente der vorliegenden Erfindung dazu dient, ebenfalls die Halbwertszeit des zirkulierenden Proteins zu erhöhen zusätzlich zu den Vorteilen, die durch das Fc-OB-Fusionsprotein oben erreicht werden. Für den aktuellen therapeutischen oder kosmetischen Zweck der vorliegenden Erfindung sollten solche Polyaminosäuren diejenigen sein, welche keine neutralisierende antigene Reaktion aufweisen oder eine solche hervorrufen oder zu anderen Nebenwirkungen führen. Solche Polyaminosäuren können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Serumalbumin (wie beispielsweise humanem Serumalbumin), einem zusätzlichen Antikörper oder einem Anteil davon (z. B. dem Fc-Bereich) oder anderen Polyaminosäuren, z. B. Lysine besteht. Wie unten angeführt, kann die Befestigung der Polyaminosäure an dem N-Terminus der Fc-OB-Proteinkomponente oder dem C-Terminus oder an anderen Stellen dazwischen lokalisiert sein, und sie kann auch über eine chemische „Linker"-Komponente an das Fc-OB-Protein gebunden sein.
Das Polymer kann jedes beliebige Molekulargewicht aufweisen und sowohl verzweigt als auch unverzweigt sein. Für Polyethylenglykol liegt aus Gründen der einfachen Handhabung und Herstellung das bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa und etwa 100 kDa (der Begriff „etwa" bedeutet, dass bei den Präparationen von Polyethylenglykol manche Moleküle mehr wiegen und andere weniger, als das angegebene Molekulargewicht). Es können andere Größenordnungen verwendet werden in Abhängigkeit von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. die gewünschte Dauer der kontinuierlichen Freisetzung, die Wirkungen, falls vorhanden, auf die biologische Aktivität, die einfache Handhabung, das Ausmaß oder das Fehlen von Antigenität sowie andere bekannte Effekte des Polyethylenglykols gegenüber einem therapeutischen Protein oder einem Analogon).
Die Anzahl der Polymermoleküle, die auf diese Weise befestigt werden, kann unterschiedlich sein, und ein Fachmann wird dazu in der Lage sein, die Wirkung basierend auf der Funktion sicherzustellen. Es kann ein Monoderivat verwendet oder eine di-, tri-, tetra-Derivatisierung oder einige Kombinationen von Derivatisierungen bereitgestellt werden mit der gleichen oder einer anderen Anzahl von chemischen Komponenten (z. B. Polymere, wie beispielsweise unterschiedliche Gewichte von Polyethylenglykolen). Der Anteil von Polymermolekülen zu Proteinmolekülen (oder Peptidmolekülen) wird genauso wie ihre Konzentrationen in der Reaktionsmischung variieren. Im Allgemeinen wird das optimale Verhältnis (in Bezug auf Wirksamkeit der Reaktion derart, dass es keinen Überschuss an nicht reagiertem Protein oder Polymer gibt) anhand von Faktoren bestimmt, wie beispielsweise dem gewünschten Grad an Derivatisierung (z. B. mono-, di-, tri-, usw.), dem Molekulargewicht von dem ausgewählten Polymer, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und den Reaktionsbedingungen.
Die chemischen Komponenten sollten an dem Protein befestigt werden unter Berücksichtigung von Wirkungen auf die funktionellen und antigenen Domänen des Proteins. Für den Fachmann steht eine Reihe von Befestigungsverfahren zur Verfügung. Z. B. EP 0 401 384 (Koppeln von PEG an G-CSF), siehe auch Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (berichtet über Pegylation von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol kovalent durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie beispielsweise eine freie Amino- oder Carboxylgruppe, gebunden werden. Reaktive Gruppen sind diejenigen, an welche ein aktiviertes Polyethylenglykolmolekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest enthalten. Diejenigen mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest enthalten. Sulfhydrylgruppen können auch als reaktive Gruppe für die Befestigung des Polyethylenglykolmoleküls/der Polyethylenglykolmoleküle eingesetzt werden. Für therapeutische Zwecke wird die Befestigung an einer Aminogruppe bevorzugt, wie beispielsweise die Befestigung an dem N-Terminus oder der Lysingruppe. Falls eine Rezeptorbindung gewünscht wird, sollte die Befestigung an den Resten, welche wichtig für die Rezeptorbindung sind, vermieden werden.
Speziell kann ein N-terminales chemisch verändertes FC-OB-Fusionsprotein gewünscht werden. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als einem Erläuterungsbeispiel für die vorliegenden Zusammensetzungen, kann der Anteil von Polyethylenglykolmolekülen zu Proteinmolekülen (oder Peptidmolekülen) für die Reaktionsmischung unter zahlreichen Polyethylenglykolmolekülen (anhand von Molekulargewicht, Verzweigung usw.) sowie der Typ der Pegylationsreaktion, die durchgeführt werden soll, und das Verfahren mit dem das gewählte N-terminale pegylierte Protein hergestellt wird, ausgewählt werden. Das Verfahren für den Erhalt der N-terminalen pegylierten Zubereitung (d.h., falls nötig, Trennen dieser Komponente von anderen monopegylierten Komponenten) kann aus der Reinigung des N-terminalen pegylierten Materials aus der Population von pegylierten Proteinmolekülen bestehen. Ausgewählte N-terminale chemische Modifizierungen können erreicht werden durch reduktive Alkylierung, welche sich die unterschiedliche Reaktivität von unterschiedlichen Typen von primären Aminogruppen (Lysin gegenüber dem N-Terminus), welche für die Derivatisierung in einem bestimmten Protein verfügbar sind, zu Nutze macht. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine selektive Derivatisierung des Proteins an dem N-Terminus mit einem Polymer, welches eine Carbonylgruppe enthält, erreicht. Zum Beispiel kann das Protein selektiv N-terminal pegyliert werden, indem die Reaktion bei einem pH-Wert durchgeführt wird, welcher es erlaubt, Vorteile aus den pK_a-Differenzen zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminaten Rests des Proteins zu ziehen. Durch eine solche ausgewählte Derivatisierung wird die Befestigung eines wasserlöslichen Polymers an einem Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich an dem N-Terminus des Proteins statt, und es erfolgt keine Modifizierung der anderen reaktiven Gruppen, wie sie beispielsweise bei den Lysinseitenkettenaminogruppen auftritt. Beim Einsatz der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer von dem oben beschriebenen Typ sein und sollte ein einziges reaktives Aldehyd für die Kopplung an das Protein aufweisen. Dazu kann Polyethylenglykolpropionaldehyd, welches ein einziges reaktives Aldehyd enthält, benutzt werden.
Aus Gründen der problemlosen Handhabung bei der Produktion eines Therapeutikums wird ein N-terminates monopegyliertes Derivat bevorzugt. Durch die N-terminale Pegylierung wird ein homogenes Produkt gewährleistet, da die Charakterisierung des Produkts in Bezug auf di-, tri- oder andere multi-pegylierte Produkte vereinfacht ist. Der Einsatz des oben genannten reduktiven Alkylierungsvprozesses für die Zubereitung eines N-terminaten Produkts wird wegen der problemlosen kommerziellen Herstellung bevorzugt.
Komplexe
Das Fc-OB-Fusionsprotein kann komplexiert an eine Bindungszusammensetzung verabreicht werden. Solch eine Bindungszusammensetzung kann bewirken, dass die Zirkulationszeit noch weiter verlängert wird als es mit dem Fc-OB-Fusionsprotein ohnehin schon erreicht wird. Eine solche Zusammensetzung kann ein Protein (oder synonym ein Peptid) sein. Ein Beispiel für ein Bindungsprotein ist der OB-Proteinrezeptor oder ein Anteil davon, wie beispielsweise ein löslicher Anteil davon. Weitere Bindungsproteine können sichergestellt werden, indem auf OB-Protein oder Fc-OB-Protein im Serum geprüft wird oder durch empirisches Screenen auf Anwesenheit von Bindung. Die verwendeten Bindungsproteine werden typischerweise nicht mit der Fähigkeit des OB-Proteins oder der Fc-OB-Fusionsproteine in Wechselwirkung treten, um an einen endogenen OB-Rezeptor zu binden und/oder die Signaltransduktion herbeizuführen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Hierin sind Verfahren für die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen der Fc-OB-Fusionsproteine und deren Derivate beschrieben. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Verabreichung in Form von Injektion oder über den oralen, pulmonalen, nasalen und transdermalen Weg oder für andere Verabreichungsformen sein. Im Allgemeinen werden unter der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen verstanden, welche wirksame Mengen an Protein der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch anerkannten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen umfassen. Solche Zusammensetzungen enthalten Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat) und unterschiedlicher pH- und Ionenstärke; Additive, wie beispielsweise Detergenzien und Lösungsmittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidanzien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Quellsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol), sowie das Einbringen des Materials in partikulierte Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure usw. oder in Liposomen. Auch Hyaluronsäure kann benutzt werden, und diese kann so wirken, dass sie die dauerhafte Verweilzeit in der Zirkulation fördert. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Status, die Stabilität, die Rate der Freisetzung in vivo und die Clearancerate der Proteine und Derivate der vorliegenden Erfindung in vivo beeinflussen. Siehe, z. B. Remington's Pharmceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435-1712. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden oder als getrocknetes Pulver, wie beispielsweise in lyophilisierter Form. Implantierbare dauerhafte Freisetzungsformulierungen werden ebenfalls in Betracht gezogen genauso wie transdermale Formulierungen.
Für die Verwendung werden hierin auch orale feste Dosierungsformen in Erwägung gezogen, welche allgemein in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden. Feste Dosierungsformen enthalten Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Lutschtabletten, Kapseln aus Stärkemasse oder Pellets. Auch Liposomen oder Proteinoide können verkapselt verwendet werden, um die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu formulieren (wie zum Beispiel Proteinoid-Mikrokügelchen, von denen in dem US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wird). Liposomen in Kapseln können verwendet und die Liposomen mit verschiedenen Polymeren (z. B. US-Patent Nr. 5,013,556) derivatisiert werden. Eine Beschreibung von möglichen festen Dosierungsformen für die therapeutische Anwendung wird von Marshall. K. in: Modem Pharmaceutics, herausgegeben von G. S. Banker und C. T. Rhodes in Kapitel 10, 1979 gegeben. Im Allgemeinen wird die Formulierung das Fc-OB-Fusionsprotein und inerte Inhaltsstoffe enthalten, welche einen Schutz vor der Magenumgebung ermöglichen sowie die Freisetzung des biologisch aktiven Materials in den Därmen.
Speziell in Erwägung gezogen werden auch orale Dosierungsformen der oben erwähnten derivatisierten Proteine. Fc-OB-Fusionsproteine können chemisch so verändert werden, dass die orale Zufuhr des Derivats wirksam ist. Allgemein besteht die erwogene chemische Modifizierung in der Befestigung von mindestens einer Komponente an dem Proteinmolekül (oder Peptidmolekül) selbst, wobei die Komponente (a) die Hemmung der Proteolyse und (b) die Aufnahme aus dem Magen oder dem Darm in den Blutstrom ermöglicht. Wünschenswert sind auch der Anstieg bei der Stabilität des Proteins insgesamt und die verlängerte Zirkulationszeit im Körper. Beispiele für solche Komponenten enthalten: Polyethylenglykol, Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. In: „Enzymes as Drugs", Hocenberg und Roberts, Herausgeber: Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), Seiten 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-tioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische Benutzung werden, wie oben angegeben, Polyethylenglykolkomponenten.
Für das Fc-OB-Fusionsprotein kann der Freisetzungsort der Magen, der Dünndarm (z. B. der Zwölffingerdarm, das Jejunum oder das Ileum) oder der Dickdarm sein. Ein Fachmann auf diesem Gebiet verfügt über Formulierungen, welche sich nicht im Magen auflösen, jedoch das Material im Zwölffingerdarm oder anderswo im Darm freisetzen. Vorzugsweise werden bei der Freisetzung die schädlichen Wirkungen des Magens umgangen und zwar entweder durch Schutz des Fc-OB-Fusionsproteins oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials außerhalb der Magenumgebung, wie beispielsweise im Darm.
Um eine vollständige Magensaftresistenz sicherzustellen, ist ein Überzug essenziell, der einem pH-Wert von mindestens 5,0 widersteht. Beispiele für häufigere inerte Inhaltsstoffe, welche als enterische Überzüge verwendet werden, sind: Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat (HPMCP). HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Celluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Überzüge können als gemischte Filme verwendet werden.
Auch können Tabletten mit einem Überzug oder einer Mischung von Überzügen behandelt sein, welche nicht zum Schutz vor Magensäure gedacht sind. Dazu können gehören: Zuckerüberzüge oder Überzüge, welche das Schlucken der Tablette erleichtern. Kapseln können zur Verabreichung von trockenen Therapeutika, d. h. Pulver, aus einer harten Schale (wie beispielsweise Gelatine) bestehen; für flüssige Formen kann eine Weichgelatinekapsel benutzt werden. Das Schalenmaterial von Kapseln aus Stärkemasse könnte aus dicker Stärke oder anderem essbaren Papier bestehen. Für Pillen, Lutschtabletten, Formtabletten oder Tablettenpulver werden Techniken für feuchte Masse eingesetzt.
Das Therapeutikum kann in der Formulierung als feine Multipartikel in Form von Granulaten oder Pellets mit einer Partikelgröße von etwa 1 mm enthalten sein. Die Formulierung des Materials für die Verabreichung in Form einer Kapsel könnte ebenso ein Pulver, oder es könnten leicht gepresste Plugs oder sogar Tabletten sein. Das Therapeutikum könnte durch Kompression hergestellt werden.
Auch Farbstoffe und Geschmacksstoffe können miteingeschlossen sein. Zum Beispiel kann das Protein formuliert werden (wie beispielsweise durch Liposomen- oder Mikrokügelchen-Verkapselung) und dann ferner in einem verzehrbaren Produkt enthalten sein, wie beispielsweise einem gekühlten Getränk, welches Farbstoffe und Geschmacksstoffe enthält.
Mit einem inerten Material kann das Therapeutikum verdünnt oder das Volumen des Therapeutikums erhöht werden. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, hauptsächlich Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Cellulose, Sucrose, modifizierte Dextrane und Stärke enthalten. Bestimmte anorganische Salze können auch als Füllstoffe benutzt werden, einschließlich Kalziumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Zu einigen der kommerziell erhältlichen Verdünnungsmitteln zählen Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Encompress und Avicell.
Für die Formulierung des Therapeutikums in einer festen Dosierungsform können Zerfallsstoffe enthalten sein. Materialien, die als Zerfallsstoffe verwendet werden, enthalten Stärke, einschließlich den kommerziellen, auf Stärke basierenden Zerfallsstoffen, Explotab, ohne dabei darauf beschränkt zu sein. Es kann Natriumstärkeglykolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopektin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschalen, saure Carboxymethylcellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit verwendet werden. Eine weitere Form der Zerfallsstoffe sind die unlöslichen Kationenaustauscherharze. Pulverisierte Gummis sind auch als Zerfallsstoffe und als Bindemittel einsetzbar und dazu können pulverisierte Gummis gehören, wie beispielsweise Agar, Karaya oder Tragant. Alginsäure und ihre Natriumsalze sind ebenfalls als Zerfallsstoffe hilfreich.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Agens zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden; sie enthalten Materialien aus natürlichen Produkten, wie beispielsweise Akazien, Tragant, Stärke und Gelatine. Andere beinhalten Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) können beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein Agens gegen das Verklumpen kann in der Formulierung des Therapeutikums enthalten sein, um das Zusammenkleben während des Formulierungsverfahrens zu verhindern. Lubrikanzien können als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Pressform eingesetzt werden, dazu gehören, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein: Stearinsäure, einschließlich ihrer Magnesium- und Kalziumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, pflanzliche Öle und Wachse. Lösliche Lubrikanzien können auch als Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol mit verschiedenen Molekulargewichten, Carbowax 4000 und 6000 verwendet werden.
Gleitmittel, welche die Fließeigenschaften des Wirkstoffs während der Formulierung verbessern und bei der Neuausrichtung während der Kompression hilfreich sind, könnten zugefügt werden. Zu den Gleitmitteln können Stärke, Talk, pyrogenes Silika und hydriertes Silikoaluminat gehören.
Um die Auflösung des Therapeutikums in der wässrigen Umgebung zu unterstützen, könnte ein oberflächenaktives Agens als Benetzungsagens zugegeben werden. Oberflächenaktive Agenzien können anionische Detergenzien, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat beinhalten. Es könnten kationische Detergenzien benutzt werden und diese könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethomiumchlorid enthalten. Die Liste der potenziellen nicht organischen Detergenzien, welche in die Formulierung als oberflächenaktive Agenzien miteingeschlossen werden könnten, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethylen-hydrogeniertes Rhizinusöl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Sucrosefettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Agenzien könnten in der Formulierung des Proteins oder des Derivats entweder allein oder als eine Mischung in verschiedenen Verhältnissen vorliegen.
Additive, welche potenziell die Aufnahme des Proteins verstärken, sind zum Beispiel die Fettsäuren: Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Wünschenswert können Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung sein. Der Wirkstoff könnte in eine inerte Matrix eingeschlossen werden, welche die Freisetzung entweder durch Diffusion oder durch Auswaschmechanismen, z. B. Gummis, ermöglicht. Es können auch langsam zerfallende Matrizes in die Formulierung mitaufgenommen werden, z. B. Alginate, Polysaccharide. Eine weitere Form einer kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums beruht auf einem Verfahren, welches auf dem therapeutischen System von Oros (Alza Corp.) basiert, d. h., bei welchem der Wirkstoff von einer semipermeablen Membran umschlossen wird, welche es zulässt, dass Wasser eintritt und den Wirkstoff durch eine einzige kleine Öffnung aufgrund von osmotischen Effekten herausdrückt. Manche enterische Überzüge weisen auch einen verzögerten Freisetzungseftekt auf.
Andere Überzüge können für die Formulierung benutzt werden. Diese enthalten mehrere Zucker, welche in einer Überzugspfanne (Pan Coater) angewendet werden können. Das therapeutische Agens könnte auch in einer mit einem Film überzogenen Tablette enthalten sein und die in diesem Beispiel verwendeten Materialien sind in 2 Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe besteht aus den nicht enterischen Materialien und enthält Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxylethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglykole. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die häufig Ester von Phthalsäure sind.
Es kann eine Mischung von Materialien benutzt werden, um den optimalen Filmüberzug bereitzustellen. Ein Filmüberzug kann in einem Pan-Coater oder in einem Flüssigbett oder durch Kompressionsüberzug aufgebracht werden.
Auch wird die pulmonale Verabreichung des Proteins der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. Das Protein wird der Lunge eines Säugetiers während des Inhalierens zugeführt und über den Lungenepithelschleim in den Blutstrom transportiert. (Zu weiteren Berichten darüber zählen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): siehe S. 143-146 (1989) (Endothelin-1 ); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (α-1-Proteinase); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, März 1990 (rekombinantes humanes Wachstumshormon); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α) und Platz et al., US-Patent Nr. 5,284,656 (Granulozytenkolonie stimulierender Faktor).
Für die Verwendung in der praktischen Anwendung dieser Erfindung wird ein breites Spektrum an mechanischen Vorrichtungen in Betracht gezogen, welche für die pulmonale Zufuhr von therapeutischen Produkten konzipiert sind, welche Vernebler, Inhalationsvorrichtungen mit Dosieraerosol, Pulver-Inhalationsvorrichtungen, welche alle dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, beinhalten, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein.
Einige spezielle Beispiele von kommerziell erhältlichen Vorrichtungen, die für die praktische Anwendung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Vernebler „Ultravent", hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Vernebler „Acorn II", hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; das Inhalationsgerät mit Dosieraerosol „Ventolin", hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, und die Pulverinhalationsvorrichtung „Spinhaler", hergestellt von Fisons Corp., Bedford, Massachussetts.
Alle solche Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die für die Abgabe von Protein geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für den Typ der verwendeten Vorrichtung spezifisch und kann den Einsatz eines entsprechenden Treibmittels zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen, welche für die Therapie hilfreich sind, mit sich bringen.
Das Protein sollte am vorteilhaftesten in Partikelform mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Mikrometer), am bevorzugtesten mit 0,5 bis 5 μm hergestellt werden, um die wirksamste Zufuhr über die distale Lunge zu erreichen.
Zu den Trägerstoffen zählen Kohlenhydrate, wie beispielsweise Trehalose, Mannitol, Xylitol, Sucrose, Lactose und Sorbitol. Andere Inhaltsstoffe für die Verwendung in Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC enthalten. Es können natürliche oder synthetische oberflächenaktive Agenzien eingesetzt werden. Polyethylenglykol kann verwendet werden (sogar unabhängig von seiner Verwendung bei der Derivatisierung des Proteins). Dextrane, wie beispielsweise Cyclodextran, können eingesetzt werden. Gallensalze und andere verwandte Verstärkerstoffe sind einsetzbar. Cellulose und Cellulosederivate können verwendet werden. Der Einsatz von Aminosäuren ist möglich, wie beispielsweise bei der Pufferformulierung.
Auch wird in Erwägung gezogen, Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrokügelchen, Einschlusskomplexe oder andere Typen von Trägerstoffen zu verwenden.
Formulierungen, die für die Verwendung mit Verneblern geeignet sind, entweder Jet oder Ultraschall, werden typischerweise Fc-OB-Protein, Analoga oder Derivate davon umfassen, welche in Wasser in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 25 mg an biologisch aktivem Protein pro ml Lösung gelöst werden. Die Formulierung kann auch einen Puffer und einen einfachen Zucker (z. B. für die Proteinstabilisierung und Regulation von osmotischem Druck) enthalten. Die Formulierung für den Vernebler kann auch ein oberflächenaktives Agens beinhalten, um die oberflächeninduzierte Aggregation des Proteins, verursacht durch die Atomisierung der Lösung bei der Bildung des Aerosols zu verringern oder zu verhindern.
Formulierungen für die Verwendung mit einer Inhalationsvorrichtung mit Dosieraerosol werden im Allgemeinen ein fein verteiltes Pulver umfassen, welches das Protein enthält, das mithilfe eines oberflächenaktiven Agens in einem Treibmittel suspendiert ist. Das Treibmittel kann aus einem beliebigen konventionellen Material sein, welches für diesen Zweck eingesetzt wird, wie beispielsweise Fluorchlorkohlenwasserstoff, ein Hydrofluorchlorkohlenwasserstoff, ein Hydrofluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Zu den geeigneten oberflächenaktiven Agenzien zählen Sorbitantrioleat und Sojalezithin. Auch Ölsäure kann als oberflächenaktives Agens nützlich sein.
Formulierungen, die über eine Pulver-Inhalationsvorrichtung abgegeben werden, umfassen ein fein verteiltes trockenes Pulver, welches Protein enthält, und welches auch ein Quellagens wie beispielsweise Lactose, Sorbitol, Sucrose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen enthalten kann, die die Verteilung des Pulvers durch die Vorrichtung erleichtern, z. B. 50 bis 90 Gew.% der Formulierung.
Ebenso erwogen wird die Zufuhr des Proteins über die Nase. Die nasale Abgabe ermöglicht den Übergang des Proteins in den Blutstrom direkt nach der Verabreichung des therapeutischen Agens an die Nase, ohne dass es dabei zur Ablagerung des Produkts in der Lunge kommt. Die Formulierungen für die Verabreichung über die nasale Route beinhalten diejenigen mit Dextran oder Cyclodextran. Eine Zufuhr mithilfe des Transports über andere Schleimhautmembranen wird ebenfalls in Betracht gezogen.
Dosierung
Der Fachmann wird dazu in der Lage sein, effektive Dosierungen durch die Verabreichung und durch Beobachtung der gewünschten therapeutischen Wirkung sicherzustellen. Auf Grund der Modifizierung am N-Terminus des OB-Proteins stellt die vorliegende Erfindung einen unerwarteten Schutz für das Protein vor Abbau bereit und erhöht die Zirkulationszeit und die Stabilität im Vergleich zum OB-Protein oder der Modifizierung am C-Terminus des OB-Proteins. Der Fachmann wird daher in der Lage sein, aus diesen Veränderungen abzuleiten, dass für eine wirksame Dosierung niedrigere Dosen oder weniger häufigere Dosen erforderlich sein können.
Die Formulierung des Moleküls wird vorzugsweise zwischen etwa 0,10 μg/kg/Tag und 10 mg/kg/Tag liegen und die erwünschte therapeutische Wirkung hervorrufen. Die effektiven Dosierungen können mithilfe von diagnostischen Instrumenten über die Zeit bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein diagnostisches Instrument für das Messen der Menge von OB-Protein oder Fc-OB-Fusionsprotein im Blut (oder Plasma oder Serum) zuerst dazu benutzt werden, die endogene Konzentration des Proteins festzulegen. Solche diagnostischen Tools können in Form eines Antikörper-Assays, wie beispielsweise einem Antikörper-Sandwich-Assay zur Verfügung stehen. Die Menge an endogenem OB-Protein wird anfänglich quantifiziert und eine Basislinie bestimmt. Die therapeutischen Dosierungen werden anhand der Quantitätsbestimmungen von endogenem und exogenem OB-Protein oder von Fc-Fusionsprotein (d. h. Protein, welches im Körper gefunden wird, entweder durch den Körper selbst produziert oder durch Verabreichung) festgelegt und über den Verlauf der Therapie gegeben. Die Dosierungen können daher während des Therapieverlaufs variieren mit einer relativ hohen Dosierung, die anfänglich eingesetzt wird, bis der therapeutische Nutzen zu beobachten ist, und niedrigeren Dosierungen, die gegeben werden, um den therapeutischen Nutzen aufrechtzuerhalten.
In Situationen, in denen nur eine Senkung der Blutlipidkonzentrationen, Beibehalten der gesenkten Blutlipidkonzentrationen oder ein Anstieg in der fettfreien Körpermasse gewünscht ist, wird die Dosierung idealerweise nicht ausreichen, um zu einem Gewichtsverlust zu führen. Somit können über den anfänglichen Verlauf der Therapie für eine adipöse Person Dosierungen gegeben werden, mit denen Gewichtsverlust und die damit einhergehende Senkung der Blutlipidkonzentration oder damit einhergehender Rückgang von Fettgewebe sowie ein Anstieg in der fettfreien Körpermasse erzielt werden. Sobald ein ausreichender Gewichtsverlust erreicht ist, kann eine Dosierung verabreicht werden, welche einerseits ausreicht, um zu verhindern, dass an Gewicht wieder zugelegt wird, und welche auch andererseits ausreicht, um die gewünschten Blutlipidkonzentrationen beizubehalten oder die fettfreie Körpermasse zu erhöhen (oder um zu verhindern, dass fettfreie Körpermasse abgebaut wird). Bestimmt werden können diese Dosierungen empirisch, da die Wirkungen von OB- oder Fc-OB-Protein reversibel sind (z. B. Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) auf Seite 547). Demzufolge würde, falls beobachtet wird, dass eine Dosierung zu unerwünschtem Gewichtsverlust führt, eine niedrigere Dosis verabreicht werden, um die gewünschten Blutlipidkonzentrationen oder den Zuwachs an fettfreier Körpermasse zu erreichen und dabei gleichzeitig das gewünschte Gewicht zu hatten.
Um die Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber Insulin zu erhöhen, können ähnliche Dosierungsüberlegungen in Betracht gezogen werden. Eine Zunahme an fettfreier Körpermasse ohne Gewichtsverlust kann in einem Ausmaß erreicht werden, welches genügt, um die Menge an Insulin (oder möglicherweise Amylin, Thiazolidinedionen oder anderen möglichen Medikamenten für die Behandlung von Diabetes) zu verringern, die einer Person für die Behandlung des Diabetes verabreicht werden.
Für die Erhöhung der Körperkraft insgesamt können ähnliche Dosisüberlegungen erwogen werden. Die Erhöhung der fettfreien Körpermasse mit begleitendem Anstieg in der Körperkraft insgesamt kann erreicht werden mit Dosierungen, welche nicht ausreichend sind, um zur Gewichtsabnahme zu führen. Andere Vorteile, wie beispielsweise ein Anstieg bei den Erythrozyten (und dem Sauerstoffgehalt im Blut) sowie ein Rückgang bei der Knochenresorption oder Osteoporose kann beim Ausbleiben von Gewichtsverlust erzielt werden.
Kombinationen
Die hierin beschriebenen Verfahren können in Verbindung mit anderen Medikationen eingesetzt werden, wie beispielsweise mit solchen Medikamenten, welche nützlich für die Behandlung des Diabetes (z. B. Insulin, möglicherweise Thiazolidinedione, Amylin oder Antagonisten davon), Medikamenten, die die Cholesterinkonzentration und den Blutdruck senken (solche wie beispielsweise diejenigen, welche die Blutlipidkonzentration senken oder andere kardiovaskuläre Medikamente) sowie mit Medikamenten, die die Aktivität erhöhen (z. B. Amphetamine). Auch Appetitzügler können verwendet werden (wie solche beispielsweise, die die Konzentration von Serotonin oder Neuropeptid Y beeinflussen). Solche Verabreichungen können gleichzeitig oder einzeln erfolgen.
Zusätzlich können die hierin beschriebenen Verfahren in Verbindung mit chirurgischen Verfahren, wie beispielsweise kosmetischer Chirurgie, welche dazu konzipiert ist, das gesamte Erscheinungsbild des Körpers zu verändern (z. B. Fettabsaugung oder Laserchirurgie, welche eingesetzt wird, um die Körpermasse zu reduzieren) angewandt werden. Die gesundheitlichen Vorteile von kardiochirurgischen Eingriffen, wie beispielsweise Bypasschirurgien oder anderen chirurgischen Interventionen, die dafür konzipiert sind, einen schädlichen Zustand zu verbessern, der durch die Blockade von Blutgefäßen durch Fettablagerungen, wie arterielle Plaques, verursacht wird, können mithilfe der begleitenden Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung erhöht werden. Verfahren zur Beseitigung von Gallensteinen, wie beispielsweise Ultraschall- oder Laserverfahren, können auch entweder vor oder während oder nach einer Anwendung der therapeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Ferner können die hierin beschriebenen Verfahren als eine zusätzliche Maßnahme zu chirurgischen Eingriffen oder Therapien von Knochenbrüchen, beschädigten Muskeln oder anderen Therapien, welche durch eine Zunahme an fettfreier Körpermasse verbessert würden, verwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Erfindung umfassender zu veranschaulichen, sind aber nicht dazu gedacht, den Anwendungsbereich der Erfindung einzuschränken.
BEISPIEL 1: Verwendung von murinem Fc-OB-Protein über subkutane Injektion
Dieses Beispiel zeigt, dass die subkutane Injektion von murinem Fc-OB-Protein bei normalen Mäusen zu Gewichtsverlust führt. An normale (nicht adipöse) CD1-Mäuse wurde murines Fc-OB-Protein über subkutane Injektion über einen Zeitraum von 22 Tagen verabreicht. Eine Dosierung von 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag resultierte in einem 14 %igen (+/-1,1 %) Verlust an Baseline-Gewicht am Tag 22 der Injektionen. Eine Dosierung von PBS führte zu einem 3,9 %igen (+/- 3,3 %) Verlust an Baseline-Gewicht am Tag 22 der Injektionen. Der Gewichtsverlust bei der Verwendung von 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag an Fc-OB-Protein an adipöse CD1 Mäuse führte zu einem 10 %igen (+/- 4,3 %) Verlust an Baseline-Gewicht, und eine Dosierung von PBS resultierte in einem 8,7 %igen (+/- 1,3 %) Verlust an Baseline-Gewicht, in beiden Fällen am Tag 22 der Injektionen.
Unten dargestellt sind die prozentualen (%) Unterschiede an Baseline-Gewicht in CD1 Mäusen (8 Wochen alt): Tabelle 1 Gewichtverlust bei subkutaner Injektion
Wie zu sehen ist, kam es bei den Tieren, die Fc-OB-Protein erhielten, am Ende der 22-tägigen subkutanen Therapie zu einem Verlust an Körpergewicht von 14,1 % bei den mageren und 10 % bei den adipösen Mäusen im Vergleich zu Tieren, die nur das PBS-Vehikel erhielten und im Vergleich zur Basislinie.
Überraschenderweise verloren die Tiere, die Fc-OB-Protein bis zu 22 Tagen erhielten, weiterhin bis zum 28. Tag, 4 Tage nach der letzten Injektion, an Gewicht. Bei normalen (nicht adipösen) CD1 Mäusen, denen 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag an murinem Fc-OB-Protein über subkutane Injektionen, die am Tag 22 gestoppt wurden, verabreicht wurde, kam es zu einem 21 %igen Verlust von Baseline-Gewicht am Tag 28 im Vergleich zu einem 14 %igen Verlust am Tag 22. Ähnlich resultierte die Verabreichung von 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag an murinem Fc-OB-Protein, die am Tag 22 gestoppt wurde, in einem 13 %igen Verlust an Baseline-Gewicht am Tag 28 verglichen mit einem 10 %igen Verlust am Tag 22. Am Tag 34 wurde der Gewichtsverlust bei adipösen Mäusen auf 10 % gehalten, während die mageren Mäuse wieder zunahmen und nur noch einen 5 %igen Verlust zeigten. Kontrollen in jedem System von Tag 22 an bis Tag 34 beliefen sich auf eine durchschnittlich Zunahme von 4 % bei adipösen Mäusen und 7 % bei mageren Mäusen.
BEISPIEL 2: Verwendung von humanem Fc-OB-Protein über subkutane Injektion bei C57 Mäusen
Dieses Beispiel zeigt, dass die subkutane Injektion von humanem Fc-OB-Protein zu einem Gewichtsverlust bei normalen Mäusen führt. An normale (nicht adipöse) C57 Mäuse wurde humanes Fc-OB-Protein über subkutane Injektionen über einen Zeitraum von 7 Tagen verabreicht. Eine Dosierung von 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag resultierte in einem 12 %igen (+/- 1,3 %) Verlust an Baseline-Gewicht am Tag 7 der Injektionen. Eine Dosierung von 1 mg Proteinlkg Körpergewicht/Tag führte zu einem 8,9 %igen (+/- 1,5 %) Verlust an Baseline-Gewicht am Tag 7 der Injektionen. Der Gewichtsverlust durch die Anwendung von 10 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag an humanem OB-Protein bei adipösen C57 Mäusen resultierte in einem 1,1 %igen (+/- 0,99 %) Verlust an Baseline-Gewicht, und eine Dosierung von 1 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag führte zu einem 2,5 %igen (+/- 1,1 %) Verlust an Baseline-Gewicht, in beiden Fällen am Tag 7 der Injektionen.
Ergebnisse
Unten dargestellt sind die prozentualen (%) Unterschiede an Baseline-Gewicht in C57 Mäusen (8 Wochen alt): Tabelle 2 Gewichtsverlust bei subkutaner Injektion
Wie zu sehen ist, führte die Verabreichung nach einer 7-tägigen subkutanen Verabreichung von 10 mg/kg Körpergewicht/Tag am Ende von Tag 17 bei den Tieren, die das Fc-OB-Protein erhielten dazu, dass sie 8 % ihres Körpergewichts wieder zunahmen. Tiere, die Dosierungen von 1 mg/kg/Tag erhielten, erreichten nach einer 7-tägigen Verabreichung wieder eine Zunahme von 6,4 % ihres Körpergewichts nach 12 Tagen.
Diese Studien zeigen auch, dass nach der letzten Injektion am Tag 7 während der Erholungsphase von Tag 7 bis Tag 22 das Körpergewicht bei den mit Fc-OB behandelten C57 Mäusen langsamer zunimmt als bei den mit OB behandelten Mäusen. Daher lässt sich vermuten, dass das Fc-OB-Protein nicht so rasch ausgeschieden wird und dadurch den vermehrten Gewichtsverlust bewirkt.
BEISPIEL 3: Dosisreaktion von CF7 Mäusen die mit Fc-OB-Fusionsprotein behandelt wurden
Eine zusätzliche Studie zeigte, dass es eine Dosisreaktion auf die kontinuierliche Verabreichung von Fc-OB-Protein gab. In dieser Studie wurde adipösen CF7 Mäusen, welche 35-40 g wogen, rekombinantes humanes Fc-OB-Protein mithilfe von Verfahren verabreicht, die ähnlich denjenigen in dem oben genannten Beispiel waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3, unten, aufgeführt (mit Verlust an % Körpergewicht im Vergleich zur Basislinie, wie oben gemessen): Tabelle 3 Dosisreaktion bei kontinuierlicher Verabreichung
Wie zu sehen ist, führte die Erhöhung der Dosis von 0,25 mg/kg/Tag auf 1 mg/kg/Tag zu einem verstärkten Gewichtsverlust von 4 % bis 16 %. Es ist auch bemerkenswert, dass am Tag 5 die Dosierung von 1 mg/kg/Tag zu einer 16 %igen Reduktion des Körpergewichts führte. Diese Studien zeigten auch langsame Gewichtszunahmeraten bis zu 0 %, was vermuten lässt, dass das Fc-Ob-Protein nicht rasch ausgeschieden wird und dadurch den vermehrten Gewichtsverlust bewirkt.
BEISPIEL 4: Pharmakokinetik von rekombinantem humanem Fc-OB-Protein bei CD1 Mäusen und Hunden
Diese Studie zeigte die pharmakokinetischen Eigenschaften von rekombinantem humanem met Fc-OB-Protein bei CD1 Mäusen und Hunden. Im Anschluss an die intravenöse oder subkutane Dosierung von 1 mg/kg Körpergewicht/Tag wurden die Serumkonzentrationen von rekombinantem humanem met Fc-OB-Protein und humanem met Fc-OB-Protein durch einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) bestimmt.
Bei beiden Spezies wurde, wie anhand höherer Peak-Serumkonzentrationen und größeren Areas under the Curve (AUC) bei der Serum-Konzentration quantifiziert, eine längere Exposition im Vergleich zu rekombinantem met-humanem OB-Protein beobachtet. Fc-OB hat eine niedrigere systemische Clearance als rekombinantes met-humanes OB-Protein. Dies zeigt sich in der niedrigeren Clearance und der längeren Halbwertszeit von Fc-OB gegenüber dem OB-Protein. Die Zunahme an Größe führt nicht nur zu einem Anstieg bei der Proteinstabilität, sondern auch zu einer Abnahme bei der effizienten Clearance durch die Nieren. Infolgedessen wird Fc-OB-Protein langsamer aus dem Blutkreislauf entfernt. Der Anstieg in der Peak-Zeit, der Peak-Serumkonzentration und der AUC für das Fc-OB-Protein stimmt mit der niedrigeren Clearance überein. Das Fc-OB-Protein wird im Vergleich zu dem OB-Protein im Wesentlichen eine höhere systemische Exposition zeigen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4, unten, dargestellt. Tabelle 4 Pharmakokinetische Eigenschaften
BEISPIEL 5:
Dieses Beispiel zeigt, dass bei normalen Mäusen, welche nicht adipös sind und keine erhöhten Blutlipidkonzentrationen aufweisen, die Verabreichung von rekombinantem Fc-OB-Protein zu einer Senkung von Cholesterin-, Glukose- und Triglycerid-Konzentrationen führt. Zusätzlich zeigt dieses Beispiel, dass diese Konzentrationen über einen Erholungszeitraum von drei Tagen niedrig bleiben.
An normale CD1 Mäuse wurde rekombinantes humanes Fc-OB-Protein über subkutane Injektionen verabreicht. Blutproben wurden 24 Stunden nach Tag 23, dem letzten Tag der Injektion, genommen. Wie oben diskutiert, verloren die Tiere bei der gegebenen Dosierung an Gewicht. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wiesen die Mäuse im Vergleich zu Kontrolltieren eine wesentliche Senkung von Serumcholesterin, Glucose und Triglyceriden in einer dosisabhängigen Weise auf: Tabelle 5
Diese Daten zeigen, dass das Fc-OB-Protein ein effektives Agens für die Senkung von Blutlipiden ist.
BEISPIEL 6:
Einem adipösen menschlichen Patienten wird humanes Fc-OB-Protein verabreicht mit dem Ziel der Gewichtsreduktion. Der adipöse Patient hat auch eine erhöhte Konzentration an Blutfetten, einschließlich einem erhöhten Cholesterinwert, über 200 mg/100 ml. Der Patient erreicht eine zufrieden stellende Gewichtsabnahme über den Verlauf der Fc-OB-Therapie. Eine Erhaltungsdosis an Fc-OB-Protein wird an den nicht mehr adipösen Patienten verabreicht, um die niedrigere Blutlipidkonzentration unter 200 mg/100 ml beizubehalten. Die gegebene Dosis ist nicht ausreichend, um zu weiterem Gewichtsverlust zu führen. Die Verabreichungen werden dauerhaft gegeben. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder mithilfe anderer antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden.
BEISPIEL 7
Ein nicht adipöser menschlicher Patient unterzieht sich einer koronaren Bypass-Chirurgie oder einer anderen invasiven Behandlung, um die fortgeschrittenen Stadien der arteriellen Plaquebildung zu verbessern. Nach der Operation wird dem Patienten eine Erhaltungsdosis von Fc-OB-Protein gegeben, um die Neubildung von arterieller Plaque zu verhindern. Die verabreichte Dosis ist nicht ausreichend, um zu Gewichtsverlust zu führen. Die Verabreichungen werden dauerhaft gegeben. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder mihilfe anderer antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden.
BEISPIEL 8:
Ein nicht adipöser menschlicher Patient leidet an Hypertonie aufgrund von verminderter Durchblutung bedingt durch verstopfte Arterien. Dem Patienten wird eine Dosis von Fc-OB-Protein gegeben, welche ausreicht, um die arteriellen Plaques, die zur Verstopfung der Gefäße führen, zu reduzieren. Danach wird der Patient auf weitere Bildung von arterieller Plaque und Hypertonie überwacht. Falls die Situation wieder eintritt, wird dem Patienten erneut eine effektive Menge an Fc-OB-Protein verabreicht, die zwar ausreichend ist, um den Blutfluss wieder herzustellen, aber nicht ausreichend ist, um zu Gewichtsverlust zu führen. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder anderer antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden.
BEISPIEL 9:
Ein menschlicher Patient leidet an Gallensteinen. Entweder werden die Gallensteine nicht entfernt, und es wird versucht, die Bildung zusätzlicher Gallensteine zu verhindern, oder die Gallensteine werden entfernt, die Gallenblase aber wird erhalten (wie zum Beispiel mithilfe der Anwendung von Laser- oder Ultraschallchirurgie) und die Bildung von zusätzlichen Gallensteinen zu verhindern versucht. Dem Patienten wird eine wirksame Menge an Fc-OB-Protein gegeben, die vorbeugend vor Anhäufung zusätzlicher Gallensteine oder Neuanhäufung von Gallensteinen wirken soll. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder mithilfe anderer antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden.
BEISPIEL 10:
Ein menschlicher Patient mit Diabetes möchte niedrigere Insulindosierungen für die Behandlung seines Diabetes. Dem Patienten wird eine wirksame Menge an Fc-OB-Protein gegeben, die zu einem Anstieg der fettfreien Körpermasse führen soll. Die Empfindlichkeit des Patienten gegenüber Insulin steigt, und die Dosierung an Insulin, die erforderlich ist, um die Symptome von Diabetes zu verbessern, ist entweder hinsichtlich der erforderlichen Einheiten an Insulin oder in Bezug auf die Anzahl der erforderlichen Insulininjektionen pro Tag reduziert. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder mithilfe anderer antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden.
BEISPIEL 11:
Ein nicht adipöser menschlicher Patient wünscht aus therapeutischen Zwecken, wie beispielsweise bei der Rekonvaleszenz nach einer Krankheit, welche die fettfreie Körpermasse aufzehrte, eine vermehrte fettfreie Körpermasse. Dem Patienten wird eine wirksame Menge an Fc-OB-Protein gegeben, die zu dem gewünschten Anstieg der fettfreien Körpermasse führen soll. Überwacht wird die Zunahme an fettfreier Körpermasse mithilfe eines DEXA-Scans. Die Konzentrationen an zirkulierendem Fc-OB-Protein können mithilfe eines diagnostischen Kits, beispielsweise einem Assay mit Antikörpern gegen das OB-Protein (oder anderer mithilfe antigener Quellen, falls anwendbar) überwacht werden
MATERIALIEN UND METHODEN
Tiere. Für die oben angeführten Beispiele wurden Wildtyp CD1 Mäuse und (+/+) C57B16 Mäuse benutzt. Das Alter der Mäuse zum initialen Zeitpunkt betrug 8 Wochen und die Tiere wurden gewichtsstabilisiert.
Fütterung und Gewichtsmessung. Die Mäuse wurden mit gemahlenem Nagerfutter (PMI Feeds, Inc) über Futterspender für Pulverfutter (Allentown Caging and Equipment), welche eine präzisere und empfindlichere Messung ermöglichten als die regulären Futterblöcke, gefüttert. Das Gewicht wurde jeden Tag zur selben Zeit (14:00) über den gewünschten Zeitraum gemessen. Das an dem Tag vor der Injektion gemessene Körpergewicht wurde als Baseline-Gewicht festgelegt. Die Mäuse wogen 18-22 Gramm.
Behausung. Die Mäuse wurden einzeln und unter humanen Bedingungen gehalten.
Verabreichung von Protein oder Vehikel. Es wurde Protein (wie unten beschrieben) oder Vehikel (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4) durch subkutane Injektion oder intravenös verabreicht.
Kontrollen. Kontrolltiere waren diejenigen, denen Vehikel allein ohne Zugabe von Fc-OB-Fusionsprotein oder OB-Protein injiziert wurde.
Protein. Sequenz ID Nrn. 1, 2 und 3 stellen murine rekombinante OB-DNA und Protein (1) dar und die Sequenz ID Nrn. 4, 5 und 6 stellen eine analoge rekombinante humane OB-DNA und Protein (2) dar. Wie oben bemerkt, weist rekombinantes humanes OB-Protein wie in SEQ. ID. Nr. 6 einen Lysinrest an Position 35 auf und einen Isoleucinrest an Position 74. Ferner sind das rekombinante humane Protein, dargestellt von Zhang et al., in Nature, supra, und in der PCT-Veröffentlichung WO 96/05309 (12/22/96) sowie die murinen und humananalogen rekombinanten Proteine von 1 und 2, veranschaulichend für das OB-Protein, welches bei der Bildung des Fc-OB-Fusionsproteins der Verfahren für die Behandlung und die Herstellung eines Medikaments der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Andere OB- oder Fc-Proteine können auch dazu verwendet werden, das Fc-OB-Protein zu bilden.
Hierin wird auf die erste Aminosäure der Aminosäuresequenz für rekombinantes OB-Protein Bezug genommen als +1, und es handelt sich dabei um Valin, und die Aminosäure an Position -1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist Nummer 146 (Cystein) (siehe 1 und 2). Auf die erste Aminosäuresequenz für rekombinantes humanes Fc-OB-Protein von 3 wird Bezug genommen als +1, und es handelt sich dabei um Glutamat, und die Aminosäure an Position -1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist Nummer 378 (Cystein). Auf die erste Aminosäuresequenz für die rekombinante humane Fc-OB-Proteinvariante von 4 wird Bezug genommen mit +1, und es handelt sich dabei um Glutamat, und die Aminosäure an Position -1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist Nummer 378 (Cystein). Auf die erste Aminosäuresequenz für die rekombinante humane Fc-OB-Proteinvariante von 5 wird Bezug genommen mit +1, und es handelt sich dabei um Asparaginsäure, und die Aminosäure an Position -1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist Nummer 373 (Cystein). Auf die erste Aminosäuresequenz für die rekombinante humane Fc-OB-Proteinvariante von 6 wird Bezug genommen mit +1, und es handelt sich dabei um Asparaginsäure, und die Aminosäure an Position -1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist Nummer 373 (Cystein).
Expression von Vektor und Wirtsstamm
Der verwendete Plasmidexpressionsvektor ist pAMG21 (ATCC Accession Number 98113), welcher ein Derivat von pCFM1656 (ATCC Accession Number 69576) ist und entsprechende Restriktionsseiten für die Insertion von Genen abwärts von dem lux PR-Promotor (siehe US-Patent Nr. 5,169,318 für eine Beschreibung des lux Expressionssystems) enthält. Die Fc-OB DNA, die unten beschrieben und in den 3-6 dargestellt wird, wurde hergestellt und in dem Expressionsvektor pAMG21 gebunden, mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI linearisiert und in den Wirtsstamm E.coli, FM5, transformiert. E. coli FM5-Zellen wurden von Amgen Inc., Thousand Oaks, CA aus E. coli K-12-Stämmen (Bachmann, et al., Bacterial. Rev. 40: 116-167 (1976)) abgeleitet und enthalten das integrierte Lamda-Phagen-Repressorgen, C1857 (Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254: 1517-1579 (1962)). Vektorherstellung, Zelltransformation und Kolonieauswahl wurden mittels Standardverfahren ausgeführt (z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) Wirtszellen wurden in LB-Medium gezüchtet.
Fc-OB DNA-Konstruktion
Das Plasmid pFc-A3 (unten beschrieben) diente als Ursprung für die Sequenz für die schwere Kette des humanen Immunglobulins IgG-1 aus Aminosäurenummer 99 (Glu) an dem natürlichen Carboxylterminus. Die humane IgG-1-Sequenz ist von Genebank (P01857) erhältlich.
Die humane OB-Sequenz ist oben offenbart und ebenso von Zhang et al., in Nature supra, und in der PCT-Veröffentlichung WO 96/05309. Die OB-DNA wurde in den Expressionsvektor pCFM1656 gebunden und mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI mithilfe von standardmäßigen Klonierungsverfahren, z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., linearisiert. Das Plasmid pCFM1656, welches die OB-DNA-Sequenz trägt, diente als Ursprung für die Sequenz für das rekombinante humane OB-Gen.
Das genetische Verschmelzen dieser beiden Sequenzen wurde durchgeführt mit dem Verfahren Overlap-Extension-PCR (Ho, S.N., et al., Site Directed Mutagenesis By Overlap Extension Using The Polmerase Chain Reaction, Gene 77: 51-59 (1989)). Das Produkt der PCR wurde mit Restriktionsendonuklease NdeI gespalten, um ein 5'-kohäsives Ende zu erzeugen und mit der Restriktionsendonuklease BamHI gespalten, um einen 3'-kohäsiven Terminus zu erzeugen. Auf ähnliche Weise wurde der Vektor pAMG21 gespalten. Mit dem Fusionsfragment und dem linearisierten Vektor wurde eine Bindung hergestellt. Durch Elektroporation wurde gebundene DNA in den E. coli-Wirtsstamm transformiert. Klone, die auf Kanamycin (50 μg/ml) Selektivagarplatten überlebten, wurden auf Expression von Fc-OB-Protein geprüft. Aus einzelnen Klonen wurde Plasmid isoliert und die Sequenz des genkodierenden Bereichs überprüft.
Wenn zusätzliche Modifizierungen des Fc-OB-Gens gewünscht waren, wurde die PCR-Technik nochmals eingesetzt, um die Änderungen zu konstruieren. Es wurden zwei Reihen von Änderungen an dem N-Terminus des Fc-Anteils des Fusionsproteins (SEQ. ID. NR. 9) durchgeführt, um die Varianten SEQ. ID. NRN. 12 und 15 zu erzeugen. Eine weitere Variante wurde konstruiert, um vier Aminosäuresubstitutionen einzuführen, damit die Fc-Rezeptor-Bindungsseite (Leucin an Position 15 ersetzt durch Glutamat) und die Komplement(C1q)-Bindungsseite (Glutamat an Position 98 ersetzt durch Alanin, Lysin an Position 100 ersetzt durch Alanin und Lysin an Position 102 ersetzt durch Alanin (Siehe, Xin Xiao Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-5600 (1995)) abladiert werden. Das Template für dieses Konstrukt war SEQ. ID. NR. 15 und die resultierende Variante war SEQ. ID. NR. 18.
pFC-A3 Vektorkonstruktion
Ein Plasmid, pFc-A3, welches den Bereich enthält, der für den Fc-Anteil der schweren Kette des humanen Immunglobulins IgG-1 kodiert (Siehe Ellison, J. W. et. al. Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982)), wurde, ausgehend von der ersten Aminosäure Glu-99 der Verbindungsdomäne „hinge domain" bis zum Carboxyl-Terminus plus einer 5'-NotI-Fusionsseite und 3'-SalI- und XbaI-Seite, mithilfe der PCR Amplifikation aus der cDNA-Bibliothek von menschlichen Milzzellen hergestellt. Die PCR-Reaktionen liefen in einem Endvolumen von 100 ml ab, und es wurden 2 Einheiten von Vent DNA-Polymerase in 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100 mit je 400 mM dNTP sowie 1 ng aus der cDNA-Bibliothek eingesetzt, um zusammen mit 1 μM von jedem Primer amplifiziert zu werden. Initiiert wurden die Reaktionen durch Denaturierung bei 95 °C für 2 min., gefolgt von 30 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 73 °C für 2 min. Der 5'-Primer hat eine NotI Seite sofort an 5' an dem ersten Rest (Glu-99) der Verbindungsdomäne von IgG-1 gebunden. Der 3'-Primer hat SalI- und XbaI-Seiten gebunden. Das 717 Basenpaare umfassende PCR-Produkt wurde mit NotI und SalI verdaut, das entstandene DNA-Fragment wurde mittels Elektrophorese mit 1 % Agarose isoliert und gereinigt und in den NotI-, SalI-verdauten Vektor pBluescript II KS (Stratagene) kloniert. Das Insert in dem entstandenen Plasmid, pFc-A3, wurde sequenziert, um die Genauigkeit der PCR-Reaktion zu bestätigen.
Verfahren für die Herstellung
Die unten stehenden Verfahren für die Herstellung wurden benutzt, um biologisch aktives rekombinantes Methionyl-Maus- oder humananaloges OB-Protein und Fc-OB-Fusionsproteine herzustellen. Ähnliche Verfahren können für die Herstellung von biologisch aktivem Methionyl-Human-OB-Protein verwendet werden.
Fermentationsverfahren
Es wurde ein Batch-Fermentationsverfahren verwendet. Die Medienzusammensetzungen sind unten aufgeführt.
Ein Teil der Medien, der hauptsächlich aus Stickstoffquellen besteht, wurde in dem Fermentationsbehälter sterilisiert (durch Erhöhen der Temperatur bis auf 120~123 °C für 25~35 Minuten). Nach dem Abkühlen wurden steril Kohlenstoff, Magnesium, Phosphat und Spurenmetallquellen zugegeben. Eine Übernacht-Kultur des oben genannten Bakteriums, welches das murine rekombinante Protein herstellt, von 500 ml (angezogen in LB-Nährmedium) wurde zu dem Fermenter hinzugegeben. Als die optische Dichte der Kultur (gemessen bei 600 nm als einem Indikator für die Zelldichte) 1525 Absorptionseinheiten erreichte, wurde eine Autoinducer-Lösung (0,5 mg/ml Homoserinlakton) zu der Kultur hinzugegeben (1 ml/l), um die rekombinante Genexpression zu induzieren. Der Fermentationsprozess wurde für zusätzliche 10 bis 16 Stunden weitergeführt, gefolgt vom Abernten des Nährmediums durch Zentrifugation. Medienzusammensetzung:
Spurenmetalllösung:

Eisenchlorid (FeCl₃·6H₂O): 27 g/l
Zinkchlorid (ZnCl₂·4H₂O): 2 g/l
Cobaltchlorid (CoCl₂·6H₂O): 2 g/l
Natriummolybdat (NaMoO₄·2H₂O): 2 g/l
Kalziumchlorid (CaCl₂·2H₂O): 1 g/l
Kupfersulfat (CuSO₄·5H₂O): 1,9 g/l
Borsäure (H₃BO₃): 0,5 g/l
Manganchlorid (MnCl₂·4N₂O): 1,6 g/l
Natriumcitratdihydrat: 73,5 g/l

Reinigungsverfahren für humanes Fc-OB-Fusionsprotein
Die Reinigung für humanes Fc-OB-Fusionsprotein wurde mit den unten genannten Schritten (falls nicht anders angegeben, wurden die folgenden Schritte bei 4 °C durchgeführt) erreicht. Die Reinigung für murines und humanes OB-Protein ist in der PCT-Veröffentlichung WO 96/05309 offenbart.

1. Zellpaste. E. coli-Zellpaste wurde im 5fachen Volumen von distilliertem Wasser suspendiert. Die Zellen in dem Wasser wurden über zwei Durchgänge durch einen Microfluidizer weiter aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden bei 4,2k U/min für 1 Stunde in einer Zentrifuge vom Typ Beckman JB-6 in einem J5-4.2 Rotor zentrifugiert.
2. Auswaschen der Einschlusskörper. Der Überstand von oben wurde entfernt und das Pellet mit dem fünffachen Volumen an destilliertem Wasser resuspendiert. Die Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
3. Auflösung. Das Pellet wurde mit dem 10fachen Volumen an 50 mM Tris, pH 8,5, 8 M Guanidinhydrochlorid, 10 mM Dithiothreitol aufgelöst und für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf 40 mM Cystaminhydrochlorid eingestellt und für 1 Stunde gerührt.
4. Die Lösung aus Schritt 3 wird zu 20 bis 30 Volumen der folgenden Lösung für erneutes Falten hinzugegeben: 50 mM Tris, pH 8,5, 0,8 M Arginin, 2 M Harnstoff und 4 mM Cystein. Die Lösung mit dem neu gefalteten Protein wird für 16 Stunden bei 8 °C gerührt.
5. Pufferwechsel. Die Lösung aus Schritt 4 wird in 10 mM Tris, pH 8,5 aufkonzentriert und diafiltriert.
6. Säurepräzipitation. Die Lösung aus Schritt 5 wird mit 50 % eisgekühlter Säure auf pH 4,75 eingestellt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird filtriert.
7. Chromatographie mit Kationenaustauscher. Die Lösung aus Schritt 6 wird auf pH 7,0 eingestellt und auf eine Säule mit CM Sepharose Fast Flow bei 10 °C aufgetragen. Eluiert wird mithilfe eines Gradienten mit dem zwanzigfachen des Säulenvolumens mit 10 mM Phosphat, pH 7,0 von 0 bis 0,1 M NaCl.
8. Chromatographie mit Anionenaustauscher. Der CM-Elutionspool aus Schritt 7 wird um das 5fache mit 5 mM Tris, pH 7,5 verdünnt und auf eine Säule mit Q-Sepharose Fast Flow bei 10 °C aufgetragen. Eluiert wird mithilfe eines Gradienten mit dem zwanzigfachen des Säulenvolumens mit 10 mM Tris, pH 7,5 von 0 bis 0,2 M NaCl.
9. Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung. Der Q-Sepharose-Pool wird auf 0,75 M Ammoniumsulfat eingestellt und auf eine Säule mit Methyl-Macropep für hydrophobe Wechselwirkung bei Raumtemperatur aufgegeben. Eluiert wird mithilfe eines Gradienten mit dem zwanzigfachen des Säulenvolumens mit 10 mM Phosphat, pH 7,0 von 0,75 bis 0 M Ammoniumsulfat.
10. Pufferwechsel. Der Pool aus Schritt 9 wird nach Bedarf aufkonzentriert und gegen PBS-Puffer dialysiert.

Claims

Protein mit einer Formel, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus R₁ – R₂ und R₁ – L – R₂ besteht, wobei R₁ ein Fc-Protein ist, R₂ ein OB-Protein ist und L ein Linker ist und wobei das Fc-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) den Aminosäuren 1 bis 233 der Sequenz Nrn. 9 und 12 und den Aminosäuren 1 bis 228 der Sequenz Nrn. 15 und 18; (b) den Aminosäuren 1 bis 233 der Sequenz Nr. 9 mit einer anderen Aminosäure, die an einer oder mehreren der folgenden Positionen ersetzt oder entfernt wurde (i) ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt durch einen Alanin- oder Serinrest; (ii) ein oder mehrere Tyrosinreste ersetzt durch einen Phenylalaninrest; (iii) die Aminosäure an Position 5 ersetzt durch ein Alanin; (iv) die Aminosäure an Position 20 ersetzt durch Glutamat; (v) die Aminosäure an Position 103 ersetzt durch ein Alanin; (vi) die Aminosäure an Position 105 ersetzt durch ein Alanin; (vii) die Aminosäure an Position 107 ersetzt durch ein Alanin; (viii) die Aminosäuren an Positionen 1, 2, 3, 4 und/oder 5 entfernt oder ersetzt; und; (ix) eine Kombination aus den Teilen i bis viii; (c) der Aminosäuresequenz der Teile (a) oder (b) mit einem Methionylrest am N-Terminus; (d) dem Fc-Protein aus einem beliebigen der Teile (a) bis (c), das aus einer chemischen Komponente besteht, die mit der Proteinkomponente verbunden ist, und wobei die chemische Komponente Polythylenglykol ist und (e) einem Derivat von Teil (d), wobei das Polyethylenglykol ausschließlich am N-Terminus dieser Proteinkomponente befestigt ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei die Linkersequenz eine Aminosäure ist oder mehrere Aminosäuren sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Glycin, Asparagin, Serin, Threonin und Alanin besteht.
Protein nach Anspruch 1, wobei der Linker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) ala-ala-ala; (b) ala-ala-ala-ala; (c) ala-ala-ala-ala-ala; (d) gly-gly; (e) gly-gly-gly; (f) gly-gly-gly-gly-gly; (g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly-gly-pro-gly-gly und (j) jede Kombination der Teile (a) bis (i).
Nukleinsäuresequenz, die ein Protein mit der Formel kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus R₁ - R₂ und R₁ - L - R₂ besteht, wobei R₁ ein Fc-Protein ist, R₂ ein OB-Protein ist und L ein Linker ist und wobei das Fc-Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) den Aminosäuren 1 bis 233 der Sequenz Nrn. 9 und 12 und den Aminosäuren 1 bis 228 der Sequenz Nrn. 15 und 18; (b) den Aminosäuren 1 bis 233 der Sequenz Nr. 9 mit einer anderen Aminosäure, die an einer oder mehreren der folgenden Positionen ersetzt oder entfernt wurde (i) ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt durch einen Alanin- oder Serinrest; (ii) ein oder mehrere Tyrosinreste ersetzt durch einen Phenylalaninrest; (iii) die Aminosäure an Position 5 ersetzt durch ein Alanin; (iv) die Aminosäure an Position 20 ersetzt durch Glutamat; (v) die Aminosäure an Position 103 ersetzt durch ein Alanin; (vi) die Aminosäure an Position 105 ersetzt durch ein Alanin; (vii) die Aminosäure an Position 107 ersetzt durch ein Alanin; (viii) die Aminosäuren an Positionen 1, 2, 3, 4 und/oder 5 entfernt oder ersetzt; und; (ix) eine Kombination aus den Teilen i bis viii; und (c) der Aminosäuresequenz der Teile (a) oder (b) mit einem Methionylrest am N-Terminus.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4, die ein Protein mit einer Linkersequenz aus einer oder mehreren Aminosäuren kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Gly, Asn, Ser, Thr und Ala besteht.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4, die ein Protein mit einem Linker kodiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) ala-ala-ala; (b) ala-ala-ala-ala; (c) ala-ala-ala-ala-ala; (d) gly-gly; (e) gly-gly-gly; (f) gly-gly-gly-gly-gly; (g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly-gly-pro-gly-gly und (j) jede Kombination der Teile (a) bis (i).
Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 7, wobei der Vektor pAMG21 (ATCC 98113) ist und die Nukleinsäuresequenz Anspruch 4 entspricht.
Prokaryonten- oder Eukaryontenwirtszelle, die den Vektor von Anspruch 7 enthält.
Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach Anspruch 1, das die Schritte des Züchtens der Wirtszelle gemäß Anspruch 9 unter geeigneten Bedingungen und das Isolieren des hergestellten Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, das ferner den Schritt des Reinigens des hergestellten Proteins umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Proteins nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Zusatzstoff oder Trägerstoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Übergewicht, Diabetes, hohen Bluttfettwerten, Arteriosklerose, Arterienablagerungen, Verminderung oder Verhinderung der Bildung von Gallensteinen, unzureichender fettfreier Körpermasse, unzureichender Insulinempfindlichkeit und Schlaganfall besteht.