DE69631605T2

DE69631605T2 - Verfahren zur verringerung und zur erhaltung von verringerten blutspiegeln von lipiden mittels zubereitungen von ob-proteinen

Info

Publication number: DE69631605T2
Application number: DE69631605T
Authority: DE
Inventors: Ann Mary PELLEYMOUNTER
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2016-08-03
Also published as: MX9801159A; WO1997006816A1; ZA966798B; DK0865294T3; JPH11511165A; PT865294E; EP0865294B1; US20020147142A1; ES2216055T3; EP0865294A1; AU6688896A; CA2229450A1; DE69631605D1; JP4173913B2; ATE259650T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindung eines OB-Proteins, Analogs oder Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren oder Aufrechterhalten von reduzierten Konzentrationen von Blutlipiden in einem nicht-fettleibigen Patienten. Die vorliegende Erfindung dient zur Behandlung von hohen Konzentrationen an Cholesterin, hohen Konzentrationen an Triglyceriden, arteriellem Plaque, Bluthochdruck und der Verhinderung der Bildung von Gallensteinen.
Hintergrund
Obwohl die molekulare Grundlage für Fettleibigkeit in weiten Teilen unbekannt ist, hat die Identifizierung des „OB-Gens" und des kodierten Proteins („OB-Protein") ein wenig Licht auf die Mechanismen geworfen, die der Körper verwendet, um die Körperfettablagerung zu regulieren. Zhang et al., Nature 372: 425–433 (1994); siehe ebenso die Berichtigung in Nature 374: 479 (1995). Das OB-Protein ist in vivo sowohl in OB/OB-mutanten Mäusen (Mäuse, die aufgrund eines Defekts in der Produktion des OB-Genprodukts fettleibig sind) als auch in normalen Wildtyp-Mäusen aktiv. Die biologische Aktivität manifestiert sich unter anderem in einem Gewichtsverlust. Siehe allgemein Barinaga, „Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475–476 (1995).
Die anderen biologischen Effekte von OB-Protein sind nicht gut charakterisiert. Es ist z. B. bekannt, daß in ob/ob-mutanten Mäusen die Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme an Seruminsulinkonzentrationen und Serumglukosekonzentrationen führt. Es ist ebenso bekannt, daß die Verabreichung von OB-Protein in ob/ob-mutanten Mäusen zu einer Abnahme an Körperfett führt. Pelleymounter et al., Science 269: 540–543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543–546 (1995). Dies wurde sowohl in ob/ob-mutanten Mäusen als auch nicht-fettleibigen normalen Mäusen beobachtet. Halaas et al., supra; siehe ebenso Campfield et al., Science 269: 546–549 (1995) (Periphere und zentrale Verabreichung von Mikrogramm-Dosen von OB-Protein verringerte die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht von ob/ob- und ernährungsinduziert fettleibigen Mäusen, aber nicht in db/db-fettleibigen Mäusen.) In keinem dieser Berichte sind Toxizitäten beobachtet worden, noch nicht einmal in den höchsten Dosen.
Die Aufklärung von anderen biologischen Effekten des OB-Proteins, insbesondere an Tieren, die keinen Vorteil von einer Gewichtsverringerung haben oder diese nicht benötigen, wird zusätzliche Verwendungen für das OB-Protein aufzeigen.
Eine solche Verwendung, wie von der vorliegenden Erfindung vorgesehen, liegt auf dem Gebiet der kardiovaskulären Therapien.
Gegenwärtig haben Arzneien, die dazu verwendet werden, um Blutlipide zu behandeln, Nebenwirkungen in verschiedenem Ausmaß. (Die Zusammenfassung unten wird vollständig erläutert in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Kapitel 41 auf den Seiten 855–859)).
Cholestyramin-Harz und Colestipol-Hydrochlorid werden verwendet, um Gallensäuren im Darm zu binden und daher, um ihre Absorption bei Hypercholesterinämien zu verhindern. Festgestellte Nebenwirkungen schließen Konstipation (20–50%), Sodbrennen und Dyspepsie, Kolik, Aufstoßen, Blähungen, Gallenstase und eingelagerte Gallensteine, Steatorrhoe und Malabsorptionssyndrom (mit Dosen > 24 g/Tag) und darauffolgende Hypovitaminose A, D und K ein. Andere Nebenwirkungen werden ebenfalls festgestellt.
Clofibrat wird verwendet, um Lipoprotein mit sehr geringer Dichte („VLDL") bei Personen mit Hypertriglyceridämie zu verringern. Es wird davon ausgegangen, daß der Wirkungsmechanismus derjenige ist, daß die Freisetzung von freien Fettsäuren aus den Fettzellen unterdrückt wird. Nebenwirkungen schließen Übelkeit, Dyspepsie, Durchfall, Stomatitis und Flatulenz (in 10% der Patienten), Urtikaria, Pruritus und Stomatitis, Alopecie, Kopfschmerzen, Vertigo, Asthenie, Myalgie, Dermatitis, geringe Gewichtszunahme, Brustempfindlichkeit bei Männern, Abnahme der Libido, Impotenz und trockenes und brüchiges Haar bei Frauen treten mit unterschiedlichen Häufigkeitsfrequenzen auf. Es wurde festgestellt, daß die Häufigkeit von Cholesterin-Gallensteinen zweifach ansteigt. Andere Nebenwirkungen werden ebenso bemerkt.
Gemfibrozil wird verwendet, um die Lebersynthese von VLDL zu verringern. Nebenwirkungen schließen Abdominalschmerz, Oberbauchschmerz, Durchfall, Übelkeit, Erbrechen und Flatulenz ein.
Lovastatin wird verwendet, um ein Enzym zu inhibieren, das bei der Synthese von Cholesterin notwendig ist. Nebenwirkungen sind gewöhnlich mild und verübergehend und schließen Kopfschmerz, Flatus, Abdominalschmerz/Krämpfe, Durchfall, Hautausschlag/Pruritis, Konstipation, Übelkeit, Myalgie, Schwindel, verschwommene Sicht, Muskelkrämpfe und Dysgeusie ein. Schlafabnormitäten werden häufig festgestellt.
Probucol wird verwendet, um Lipoprotein mit geringer Dichte („LDL") und Cholesterin im Plasma zu senken, indem die Cholesterin-Synthese auf einer frühen Stufe verringert wird, was den Abbaustoffwechsel von LDL erhöht und die Ausscheidung von Gallensäuren erhöht. Nebenwirkungen schließen Durchfall, vorübergehende Flatulenz, Abdominalschmerz, Übelkeit, Hyperhidrose, übelriechender Schweiß, Erbrechen, Schwindel, Brustschmerzen und Palpitationen ein.
Es wäre deshalb nützlich, eine therapeutische Zusammensetzung zu haben, die die Konzentrationen von Lipiden im Blut, insbesondere in nicht-fettleibigen Patienten, ohne die bei den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Arzneien beobachteten Nebenwirkungen moduliert. Eine solche Zusammensetzung wäre bei der Behandlung von hohen Cholesterinkonzentrationen, hohen Triglyceridkonzentrationen, arteriellem Plaque und, damit zusammenhängend, Bluthochdruck und Gallensteinbildung nützlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Verabreichung von OB-Protein an fettleibige Tiere mit erhöhten Cholesterinkonzentrationen zu einer Verringerung an Serum-Cholesterinkonzentrationen auf normale Konzentrationen führt. Daher hat OB-Protein die Fähigkeit, zusätzlich zu seiner Wirkung als gewichtsreduzierendes Mittel als ein Mittel zu funktionieren, das Blutlipide beeinflußt. Als solches werden zahlreiche kardiovaskuläre Therapien in Erwägung gezogen, sogar für Patienten, die nicht notwendigerweise von einer Gewichtsverringerung profitieren würden.
Es gibt eine positive Beziehung zwischen Blutlipidkonzentrationen, insbesondere Cholesterinkonzentrationen und Triglyceridkonzentrationen, und Arteriosklerose ebenso wie koronarem Verschluß. Zum Beispiel, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Kapitel 41 auf den Seiten 855–859. Einige Studien zeigen, daß eine fettarme Ernährungsweise in Kombination mit Anti-Lipid-Arzneien einen schützenden Effekt bei koronaren Herzkrankheiten hat. Eine Verringerung der Blutlipidkonzentrationen hätte deshalb einen herausragenden therapeutischen Effekt auf dem kardiovaskulären Gebiet, sogar in der Abwesenheit von einem einhergehenden Gewichtsverlust.
Zum Beispiel ist die Verabreichung von OB-Protein (oder Analogen oder Derivaten davon) nützlich, um Serumcholesterin und Triglyceride in Patienten zu senken, die erhöhte Konzentrationen dieser Blutlipide haben.
Daher dient ein Aspekt der vorliegenden Erfindung der Verwendung bei der Behandlung von nicht-fettleibigen Tieren auf erhöhte Blutlipid-Konzentration.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung nützlich zum Verringern des Blut-Cholesterins in einem nicht-fettleibigen Patienten. Später, wenn ein Individuum auf erhöhte Cholesterin-Konzentrationen behandelt wird, insbesondere bei einem Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie, kann das Auftreten von Xanthomen verringert werden.
Die vorliegende Erfindung ist ebenso für die Behandlung zum Reduzieren oder Aufrechterhalten von reduzierten Triglycerid-Konzentrationen in einem nicht-fettleibigen Patienten nützlich.
Im Zusammenhang damit dient ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung der Verwendung bei der Behandlung eines fettleibigen oder nicht-fettleibigen Tieres zur Verringerung oder Verhinderung der Bildung von arteriellem Plaque. Arterieller Plaque umfaßt zu einem großen Teil Fett und Cholesterin. Eine Verringerung der Blutlipid-Konzentrationen, die zu einer Verringerung der Cholesterin-Konzentrationen führt, würde zu einer Verringerung von arteriellem Plaque führen. Eine Verringerung von arteriellem Plaque kann ebenso zu einer Verbesserung der Arteriosklerose führen.
Zusätzlich kann die Verringerung von arteriellem Plaque den Blutfluß erhöhen und deshalb den Blutdruck verringern, wie etwa bei systolischem Bluthochdruck. Daher ist ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von OB-Protein oder Analogen oder Derivaten davon, zur Herstellung eines Medikaments als ein Anti-Bluthochdruckmittel bei der Behandlung von hohem Blutdruck.
Darüberhinaus kann eine Verringerung der Blutlipide für diejenigen, die Gallensteine haben, einen Vorteil bieten. Gallensteine werden als ein Resultat von unzureichender Gallenverarbeitung in der Gallenblase gebildet. Galle ist reich an fetten Substanzen, insbesondere Cholesterin, die aus dem Blut von der Leber extrahiert werden. Galle enthält auch Bilirubin, eine Substanz, die durch den Abbau von Hämoglobin aus alten roten Blutkörperchen gebildet wird. Wenn die Balance dieser Substanzen durcheinander gebracht wird, bildet sich ein kleiner fester Partikel in der Gallenblase. Dieser Partikel kann wachsen, während sich mehr Material darum verfestigt. Daher stellt unter einem anderen Aspekt die vorliegende Erfindung die Verwendung von OB-Protein oder Analogen oder Derivaten davon zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern der Bildung von Gallensteinen oder zum Verringern der Bildung von zusätzlichen Gallensteinen bereit.
Ebenso wird hierin ein Therapieverlauf in Erwägung gezogen, bei dem OB-Protein (oder ein Analog oder Derivat davon) an einen nicht-fettleibigen Patienten in Dosierungen verabreicht werden soll, die zur Verringerung von Blutlipid-Konzentrationen ausreicht (im Vergleich zu Konzentrationen in der Abwesenheit von OB-Protein-Verabreichung), wobei aber solche Dosierungen nicht zu einem Gewichtsverlust führen (oder einem weiteren Gewichtsverlust, wenn dem Patienten zuvor OB-Protein oder ein Analog oder Derivat davon verabreicht worden ist), zur Gewichtsverringerung.
Detaillierte Beschreibung
Die Verwendungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, sind diejenigen, die auf die Behandlung eines nicht-fettleibigen Individuums zur Verringerung von Blutlipid-Konzentrationen gerichtet sind, durch Verabreichung von OB-Protein oder Analogen oder Derivaten davon. Diese Verwendungen schließen Verfahren zum Verringern oder Aufrechterhalten von verringerten Blutcholesterin-Konzentrationen, Blut-Triglycerid-Konzentrationen (d. h. Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) oder Lipoprotein mit sehr niedriger Dichte (VLDL)), und Verfahren zum Verringern von arteriellem Plaque und dessen Bildung ein. Die Verringerung an Blutlipiden wird wahrscheinlich einen vorteilhaften Effekt auf Arteriosklerose haben und möglicherweise den Blutfluß erhöhen und damit Bluthochdruck verringern. Zusätzlich kann die Bildung von Gallensteinen, die hauptsächlich aus Cholesterin bestehen, verhindert werden.
Das OB-Protein kann aus dem rekombinanten murinen Protein (unten dargestellt) (SEQ ID NO: 2), oder aus dem rekombinanten menschlichen Protein, wie dargestellt in Zhang et al., Nature, supra) oder denjenigen Proteinen ausgewählt werden, denen ein Glutaminrest an Position 28 fehlt. (Siehe Zhang et al, Nature, supra, auf Seite 428). Man kann ebenso das rekombinante menschliche OB-Protein-Analog, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4, verwenden, das 1) ein Arginin anstelle von Lysin an Position 35 und 2) ein Leucin anstelle von Isoleucin an Position 74 enthält. (Eine Kurzschreibweisenabkürzung für dieses Analog ist das rekombinante menschliche R → L³⁵, I → L⁷⁴). Die Aminosäuresequenzen für die rekombinanten menschlichen Analog- und rekombinanten murinen Proteine werden unten mit einem Methioninrest an der -1-Position dargestellt, jedoch kann wie bei allen der vorliegenden OB-Proteine und -Analoge der Methioninrest abwesend sein.
Das murine Protein ist im wesentlichen homolog zu dem menschlichen Protein, insbesondere als ein reifes Protein, und weiterhin insbesondere an dem N-Terminus. Man kann ein Analog des rekombinanten menschlichen Proteins durch Verändern (wie etwa Substituieren von Aminosäureresten) der Aminosäuren in der rekombinanten menschlichen Sequenz herstellen, die von der murinen Sequenz divergieren. Da das rekombinante menschliche Protein eine biologische Aktivität in Mäusen hat, wäre ein solches Analog wahrscheinlich auch in Menschen aktiv. Zum Beispiel kann man unter Verwendung eines menschlichen Proteins mit einem Lysin an Rest 35 und einem Isoleucin an Rest 74 gemäß der Numerierung von SEQ ID NO: 4, wobei die erste Aminosäure Valin ist und die Aminosäure an Position 146 Cystein ist, eine oder mehrere der Aminosäuren an Positionen 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure substituieren. Man kann die Aminosäure an der entsprechenden Position des murinen Proteins (SEQ ID NO: 2) oder eine andere Aminosäure wählen.
Man kann weiterhin „Konsensus"-Moleküle auf der Grundlage der Ratten-OB-Proteinsequenz herstellen. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944–952 (1995). Ratten- OB-Protein unterscheidet sich von menschlichem OB-Protein an den folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 und 145. Man kann eine oder mehrere der Aminosäuren an diesen divergierenden Positionen durch eine andere Aminosäure substituieren. Die Positionen in fettem Druck sind diejenigen, bei denen das murine OB-Protein ebenso wie das Ratten-OB-Protein von dem menschlichen OB-Protein divergieren und somit besonders zur Veränderung geeignet sind. An einer oder mehreren Positionen kann man eine Aminosäure von dem entsprechenden Ratten-OB-Protein oder eine andere Aminosäure substituieren.
Die Positionen von sowohl Ratten- als auch murinem OB-Protein, die von dem reifen menschlichem OB-Protein divergieren, sind: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145. Ein OB-Protein gemäß SEQ ID NO: 4 mit einer oder mehreren der obigen Aminosäuren ersetzt durch eine andere Aminosäure, wie etwa die Aminosäure, die in der entsprechenden Ratten- oder murinen Sequenz gefunden wird, kann ebenso wirksam sein.
Andere Analoge können hergestellt werden, indem man ein Teil der Protein-Aminosäuresequenz deletiert. Zum Beispiel fehlt dem reifen Protein eine Leader-Sequenz ( –22 bis –1). Man kann die folgenden trunkierten Formen von menschlichen OB-Protein-Molekülen herstellen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4):

(a) Aminosäuren 98–146
(b) Aminosäuren 1–32
(c) Aminosäuren 40–116
(d) Aminosäuren 1–99 und (verbunden mit) 112–146.
(e) Aminosäure 1–99 und (verbunden mit) 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 zwischen Aminosäuren 99 und 112 gebracht.

Zusätzlich können die trunkierten Formen ebenso eine oder mehrere der Aminosäuren verändert haben, die von dem menschlichen OB-Protein (in dem Ratten- oder murinen humanen OB-Protein) divergieren.
Das Protein (hierin wird der Begriff „Protein" verwendet, um „Peptid"- und OB-Analoge einzuschließen, wie etwa diejenigen, die unten aufgeführt sind, sofern nicht anders dargestellt) kann ebenso durch das Anhängen einer oder mehrerer chemischer Gruppen an die Proteingruppe derivatisiert werden. Die chemisch modifizierten Derivate können weiter für intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intravenöse, orale, nasale, pulmonale, topische oder andere Verabreichungsrouten formuliert werden. Es ist gefunden worden, daß eine chemische Modifizierung von biologisch aktiven Proteinen unter bestimmten Bedingungen zusätzliche Vorteile bereitstellen kann, wie etwa die Erhöhung der Stabilität und der Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und eine Verringerung der Immunogenizität. Siehe US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979. Für einen Übersichtsartikel siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. S. 367–383 (1981)). Ein Übersichtsartikel, beschreibend Proteinmodifizierung und Fusionsproteine, ist Francis, Focus on Growth Factors 3: 4–10 (Mai 1992) veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).
Die chemischen Gruppen, die für die Derivatisierung geeignet sind, können von vielen wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so daß das Protein, an welches es angehängt ist, in einer wäßrigen Umgebung nicht ausfällt, wie etwa einer physiologischen Umgebung. Bevorzugt wird das Polymer für die therapeutische Verwendung der Endproduktzubereitung pharmazeutisch akzeptabel sein. Ein Fachmann wird in der Lage sein, das erwünschte Polymer auf der Grundlage von solchen Überlegungen auszuwählen, wie, ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird und, wenn dies der Fall ist, die erwünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse und andere Überlegungen. Für die vorliegenden Proteine und Peptide kann die Wirksamkeit der Derivatisierung durch Verabreichung des Derivats in der erwünschten Form (d. h. mittels osmotischer Pumpe oder bevorzugter, durch Injektion oder Infusion, oder weiter formuliert für z. B orale, pulmonale oder nasale Abgaben) und durch Beobachten der biologischen Effekte bestätigt werden.
Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus z. B. Polyethylenglycol, Copolymere von Ethylenglycol/Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder statistische Copolymere), und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglycol, Propylenglycolhomopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole und Polyvinylalkohol. Polyethylenglycolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung haben.
Das Polymer kann jedes Molekulargewicht haben, kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglycol ist das bevorzugte Molekulargewicht zwischen ungefähr 2 kDa und ungefähr 100 kDa (wobei der Begriff „ungefähr" darauf hinweist, daß in Zubereitungen mit Polyethylenglycol einige Moleküle mehr, einige weniger als das aufgeführte Molekulargewicht wiegen werden), um die Behandlung und die Herstellung zu erleichtern. Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der erwünschten verzögerten Freisetzung, den Effekten, sofern vorhanden, auf die biologische Aktivität, der Leichtigkeit bei der Handhabung, dem Grad oder Mangel an Antigenizität und anderen bekannten Effekten des Polyethylenglycols auf ein therapeutisches Protein oder Analog).
Die Anzahl an Polymermolekülen, die so angehängt werden, kann variieren, und ein Fachmann wird in der Lage sein, den Effekt auf die Funktion zu bestimmen. Man kann monoderivatisieren oder kann eine di-, tri-, tetra- oder irgendeine Derivatisierungskombination mit denselben oder unterschiedlichen chemischen Gruppen (z. B. Polymeren wie etwa unterschiedliche Gewichte von Polyethylenglycolen) bereitstellen. Das Verhältnis von Polymermolekülen zu Protein- (oder Peptid-) Molekülen wird variieren, ebenso wie ihre Konzentrationen in der Reaktionsmischung. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (hinsichtlich der Reaktionseffizienz dahingehend, daß es kein Überschuß an nicht-umgesetztem Protein oder Polymer gibt) anhand von Faktoren bestimmt werden, wie etwa dem erwünschten Derivatisierungsgrad (z. B. mono-, di-, tri- etc.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder nicht-verzweigt ist, und den Reaktionsbedingungen.
Die Polyethylenglycolmoleküle (oder andere chemischen Gruppen) sollten an das Protein unter Berücksichtigung der Effekte auf die funktionellen oder antigenen Domainen des Proteins angehängt werden. Es gibt eine Vielzahl von Anhängungsmethoden, die Fachleuten zur Verfügung stehen. Z. B. EP 0 401 384 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen (Kopplung von PEG an G-CSF), siehe ebenos Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028–1035 (1992) (Bericht über Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid). Zum Beispiel kann Polyethylenglycol kovalent durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe gebunden werden, wie etwa eine freie Amino- oder Carboxylgruppe. Reaktive Gruppen sind diejenigen, an die ein aktiviertes Polyethylenglycol gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest einschließen. Diejenigen mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenso als eine reaktive Gruppe zum Anhängen des (der) Polyethylenglycolmoleküls (Polyethylenglycolmoleküle) verwendet werden. Bevorzugt für therapeutische Zwecke ist die Anhängung an eine Aminogruppe, wie etwa Anhängung an den N-Terminus oder eine Lysingruppe. Die Anhängung an Resten, die für die Rezeptorbindung wichtig sind, sollte vermieden werden, wenn Rezeptorbindung erwünscht ist.
Möglicherweise ist spezifisch ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein erwünscht. Unter Verwendung von Polyethylenglycol als eine Erläuterung der vorliegenden Zusammensetzungen kann man aus einer Vielzahl von Polyethylenglycolmolekülen (anhand von Molekulargewicht, Verzweigung etc.), das Verhältnis von Polyethylenglycolmolekülen zu Protein- oder Peptid-)Molekülen der Reaktionsmischung, den durchzuführenden Typ der Pegylierungsreaktion und das Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins auswählen. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Zubereitung (d. h. Trennen dieser Gruppe von anderen mono-pegylierten Gruppen, sofern notwendig), kann mittels Aufreinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen erfolgen. Eine selektive N-terminale chemische Modifizierung kann über eine reduktive Alkylierung erzielt werden, die unterschiedliche Reaktivität von verschiedenen Typen von primären Aminogruppen ausnützt (Lysin gegen den N-Terminus), die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppen-enthaltenden Polymer erzielt. Zum Beispiel kann man das Protein selektiv N-terminal pegylieren, indem man die Reaktion bei einem pH durchführt, der es einem ermöglicht, die pK_a-Unterschiede zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und der α-Aminogruppe des N-terminalen Rest des Proteins auszunutzen. Durch eine solche selektive Derivatisierung wird die Anhängung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: Die Konjugation mit dem Polymer findet überwiegend am N-Terminus des Proteins statt, und keine signifikante Modifizierung von anderen reaktiven Gruppen, wie etwa der Lysinseitenkettenaminogruppe, findet statt. Unter Verwendung von reduktiver Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer von dem oben beschriebenen Typ sein und sollte ein einzel nes reaktives Aldehyd zum Koppeln an das Protein haben. Polyethylenglycolpropionaldehyd, enthaltend ein einzelnes reaktives Aldehyd, kann verwendet werden.
Ein N-terminal monopegyliertes Derivat wird aus Gründen der leichten Herstellung eines Therapeutikums bevorzugt. N-terminale Pegylierung stellt ein homogenes Produkt sicher, da die Charakterisierung des Produktes relativ zu di-, tri oder anderen multi-pegylierten Produkten vereinfacht ist. Die Verwendung des obigen reduktiven Alkylierungsprozesses zur Herstellung eine N-terminalen Produkts wird aus Gründen der erleichterten kommerziellen Herstellung bevorzugt. N-terminal mono-pegyliertes menschliches rekombinantes Methionyl-OB-Protein 1-146, unter Verwendung eines Polyethylenglycols von zwischen ungefähr 6 kD und ungefähr 50 kD wird besonders bevorzugt, wenn eine anhaltende Zirkulierungszeit des Proteins erwünscht ist.
Die Medikamente, die durch die hierin offenbarte Herstellung erzeugt werden, sind pharmazeutische Zusammensetzungen der Proteine und Derivate. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Verabreichung mittels Injektion oder für orale, pulmonale, nasale, transdermale oder andere Formen der Verabreichung dienen. Im allgemeinen werden pharmazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen, umfassend wirksame Mengen an Protein- oder Derivatprodukten der Erfindung, zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Löslichkeitsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzstoffe wie etwa Detergenzien und Löslichkeits-vermittelnde Agenzien (z. B. Tween 80, Polysorban 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol), den Einbau des Materials in partikulären Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglycolsäure, etc. oder in Lyposomen ein. Hyaluronsäure kann ebenso verwendet werden, und dies kann den Effekt haben, eine verlängerte Dauer im Kreislauf zu fördern. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, Stabilität, die in-vivo-Freisetzungsrate und die in-vivo-Clearance-Rate der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Edition (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435–1712, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form zubereitet werden oder können in getrockneter Pulverform, wie etwa lyophilisierter Form vorliegen. Implantierbare Formulierungen mit ver zögerter Freisetzung werden ebenso in Erwägung gezogen, ebenso wie transdermale Formulierungen.
Es werden hierin orale Festdosierungsformen in Erwägung gezogen, die allgemein in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Trochiscen oder Pastillen, Cachets oder Pellets ein. Ebenso kann eine Liposomen- oder Protein-Verkapselung verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie z. B. Protein-Mikrospheren, über die in US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wird). Liposomenverkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US Patent Nr. 5,013,556). Eine Beschreibung von möglichen Festdosierungsformen für das Therapeutikum wird von Marshall, K. gegeben in: Modern Pharmaceutics, herausgegeben von G. S. Banker und C. T. Rhodes Kapitel 10, 1979, hierin einbezogen durch Bezugnahme. Im allgemeinen wird die Formulierung das Protein (oder -Analog oder -Derivat) und inerte Inhaltsstoffe einschließen, die einen Schutz gegen die Magenumgebung und eine Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm ermöglichen.
Ebenso spezifisch in Erwägung gezogen werden orale Dosierungsformen der obigen derivatisierten Proteine. Proteine können chemisch modifiziert werden, so daß eine orale Verabreichung des Derivats wirksam ist. Im allgemeinen ist die in Erwägung gezogene chemische Modifizierung das Anhängen von wenigstens einer Gruppe an das Protein- (oder Peptid-) Molekül selbst, wobei besagte Gruppe (a) die Inhibition der Proteolyse und (b) die Aufnahme in den Blutstrom vom Magen oder dem Darm ermöglicht. Ebenso erwünscht ist die Zunahme an Gesamtstabilität des Proteins und die Zunahme an Zirkulationszeit im Körper. Beispiele für solche Gruppen schließen ein: Polyethylenglycol, Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. In: „Enzymes as Drugs", Hocenberg und Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY (1981), Seiten 367–383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185–189 (1982). Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-tioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische Verwendung, wie oben angezeigt, sind Polyethylenglycolgruppen.
Für das Protein (Derivat) kann der Ort der Freisetzung der Magen, der Dünndarm (das Duodenum, das Jejunum oder das Ileum), oder der Dickdarm sein. Ein Fachmann verfügt über Formulierungen, die sich nicht im Magen auflösen werden, jedoch das Material im Duodenum oder anderswo im Darm freisetzen werden. Bevorzugt wird die Freisetzung die nachteiligen Effekte der Magenumgebung vermeiden, entweder durch Schutz des Proteins (oder Derivats) oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials über die Magenumgebung hinaus, wie etwa im Darm.
Um eine vollständige Magenresistenz sicherzustellen, ist eine Beschichtung essentiell, die gegenüber wenigstens pH 5,0 undurchlässig ist. Beispiele für die häufigeren inerten Inhaltsstoffe, die als enterische Beschichtungen verwendet werden, sind Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Celluloseacetaphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.
Eine Beschichtung oder Mischung von Beschichtungen kann ebenso auf Tablette verwendet werden, die nicht zum Schutz gegen den Magen vorgesehen sind. Dies kann Zuckerbeschichtungen oder Beschichtungen einschließen, die die Tablette leichter zu schlucken machen. Kapseln können aus einer harten Schale bestehen (wie etwa Gelatine), zur Abgabe des trockenen Therapeutikums, d. h. Pulvers; für flüssige Formen kann eine weiche Gelatineschale verwendet werden. Das Schalenmaterial von Cachets könnte dicke Stärke oder anderes eßbares Papier sein. Für Pillen, Pastillen, verschmolzene Tabletten oder Tablettentrituraten können Feuchtverarbeitungstechniken verwendet werden.
Das Therapeutikum kann in der Formulierung als feine multipartikuläre Teilchen in der Form von Granula oder Pellets mit einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen sein. Die Formulierung des Materials für die Kapselverabreichung könnte ebenso als ein Pulver, leicht komprimierte Klümpchen oder sogar als Tabletten sein. Das Therapeutikum könnte mittels Kompression zubereitet werden.
Farbstoffe und Aromastoffe können alle eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert werden (wie etwa mittel Liposomen- oder Mikrosphären- Verkapselung) und dann weiterhin innerhalb eines eßbaren Produktes eingebaut werden, wie etwa in einem gekühlt Getränk, enthaltend Farbstoffe und Aromamittel.
Man kann das Volumen des Therapeutikums mit einem inerten Material verdünnen oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel können Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Cellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze können ebenso als Füllmaterialien verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell erhältliche Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Zersetzungsmittel können in die Formulierungen des Therapeutikums in eine feste Dosierungsform eingebaut werden. Materialen, die als Zersetzungsmittel verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Stärke, einschließlich des kommerziellen Zersetzungsmittels, beruhend auf Stärke, Explotab. Natriumstärkeglycolat, Amberlite, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangeschale, Säurecarboxymethylcellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Zersetzungsmittel sind die unlöslichen Kationenaustauschharze. Pulverisierte Gummis können als Zersetzungsmittel und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis, wie etwa Agar, Karaya oder Tragant einschließen. Alginsäure und ihr Natriumsalz sind ebenso als Zersetzungsmittel nützlich.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mittel zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden, und schließen Materialien aus natürlichen Produkten, wie etwa Akazie, Tragant, Stärke und Gelatine ein. Andere schließen Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein reibungsverminderndes Mittel kann in der Formulierung des Therapeutikums eingebaut werden, um ein Zusammenkleben während des Formulierungsprozesses zu verhindern. Schmiermittel können als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Formwand verwendet werden, und diese können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Stearinsäure, einschließlich ihrer Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssi ges Paraffin, pflanzliche Öle und Wachse. Lösliche Schmiermittel können ebenso verwendet werden, wie etwa Natriumlaurysulfat, Magnesiumlaurysulfat, Polyethylenglycol mit verschiedenen Molekulargewichten, Carbowax 4000 und 6000.
Gleitmittel, die die Fließeigenschaften der Arznei während der Formulierung verbessern könnten und um eine Umordnung während der Kompression zu unterstützen, könnten zugegeben werden. Die Gleitmittel können Stärke, Talk, pyrogenes Siliciumdioxid und hydratisiertes Silicoaluminat einschließen.
Um die Auflösung des Therapeutikums in die wäßrige Umgebung zu erleichtern, könnte ein oberflächenaktives Mittel als Feuchthaltemittel zugegeben werden. Oberflächenaktive Mittel können anionische Detergenzien einschließen, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergenzien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid einschließen. Die Liste an potentiellen nicht-ionischen Detergenzien, die in der Formulierung als oberflächenaktive Mittel eingeschlossen werden könnten, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40 Stearat, Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerolmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharose-Fettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktive Mittel könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder allein oder als eine Mischung in unterschiedlichen Verhältnissen vorhanden sein.
Zusatzstoffe, die potentiell die Aufnahme des Protein (oder Derivats) erhöhen, sind z. B. die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung können erwünscht sein. Die Arznei könnte in eine inerte Matrix eingebaut werden, die die Freisetzung mittels entweder Diffusion oder Leckmechanismen ermöglicht, d. h. Gummis. Langsam sich ersetzende Matrizes können ebenso in die Formulierung eingebaut sein. Eine andere Form der kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums ist mit Hilfe eines Verfahrens auf der Grundlage des Oros-Therapeutikum-Systems (Alza Corp), d. h. die Arznei ist in einer semipermeablen Membran eingeschlossen, die einen Wassereintritt ermöglicht und Arznei durch eine einzelne kleine Öffnung aufgrund von Osmoseeffekten hinausdrückt. Einige enterische Beschichtungen haben ebenso einen verzögerten Freisetzungseffekt.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Dieses schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, die in einer Beschichtungspfanne aufgetragen werden könnten. Das therapeutische Mittel könnte ebenso in einer Filmtablette gegeben werden, und die Materialien die in diesem Falle verwendet werden, werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die ersten sind die nicht-enterischen Materialen und schließen Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglycole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die häufig Ester der Phthalsäure sind.
Eine Mischung der Materialen könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Die Filmbeschichtung kann in einem Pfannenbeschichter oder in einem Flüssigbett oder mittels Kompressionsbeschichtung durchgeführt werden.
Ebenso in Erwägung gezogen wird eine pulmonale Abgabe des vorliegenden Proteins (oder Derivate davon). Das Protein (oder Derivat) würde an die Lungen eines Säugetiers bei der Inhalation abgegeben und durchläuft die Lungenschleimhaut in den Blutstrom. (Andere Berichte hierüber schließen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565–569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135–144 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): Seiten 143–146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145–1146 (1989) (α-1-Proteinase); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (rekombinantes menschliches Wachstumshormon); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482–3488 (1988) (Interferon -γ und Tumornekrosefaktor alpha) und Platz et al., U.S. Patent Nr. 5,248,656 (Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor).
Bei der Ausübung dieser Erfindung werden eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen in Erwägung gezogen, die zur pulmonalen Abgabe von therapeutischen Produkten angelegt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Vernebelungsgeräte, Inhalatoren mit abgemessener Dosis und Pulver-Inhalatoren, die alle den Fachleuten bekannt sind.
Einige spezifische Beispiele für kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die für die Ausübung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Vernebeler, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri,; der Acorn II-Vernebeler, hergestellt von Marquest Medical Produkt, Englewood, Colorado; der Ventolin-Inhalator mit abgemessener Dosis, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; und der Spinhaler-Pulver-Inhalator, hergestellt von Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Alle solche Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die für die Abgabe von Protein (oder eines Analogs oder Derivates davon) geeignet sind. Typischerweise ist jeder Formulierung für den Typ verwendeter Vorrichtung spezifisch und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittelmaterials beinhalten, zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei der Therapie nützlich sind.
Das Protein (oder Derivat) sollte am vorteilhaftesten in partikulärer Form zubereitet sein mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Mikron), am bevorzugtesten 0,5 bis 5 μm, für die effektivste Abgabe an die distale Lunge.
Träger schließen Kohlenhydrate, etwa Trehalose, Mannitol, Xylitol, Saccharose, Lactose und Sorbitol ein. Andere Inhaltsstoffe zur Verwendung bei Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC einschließen. Natürliche oder synthetische oberflächenaktive Mittel können verwendet werden. Polyethylenglycol kann verwendet werden (abgesehen von seiner Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analog). Dextrane, wie etwa Cyclodextran, können verwendet werden. Gallensalze und andere verwandte Verstärker können verwendet werden. Cellulose und Cellulosederivate können verwendet werden. Aminosäuren können verwendet werden, wie etwa zur Verwendung in einer Pufferformulierung.
Ebenso wird die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschlußkomplexen oder anderen Typen von Trägern in Erwägung gezogen.
Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Vernebelungsgerät geeignet sind, entweder mit Düse oder Ultraschall, werden typischerweise Protein (oder Derivat) umfassen, aufgelöst in Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg biologisch aktives Protein pro ml Lösung. Die Formulierung kann ebenso einen Puffer und einen einfachen Zucker enthalten (z. B. für die Proteinstabilisierung und Regulierung des osmotischen Drucks). Die Formulierung des Vernebelungsgerät kann ebenso ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um eine Oberflächen-induzierte Aggregation des Proteins zu verringern oder zu verhindern, die durch die Atomisierung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen zur Verwendung mit einem Inhalationsgerät mit abgemessener Dosierung werden im allgemeinen ein fein verteiltes Pulver umfassen, enthaltend das Protein (oder Derivat), suspendiert in einem Treibmittel mit der Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels. Das Treibmittel kann jedes herkömmliche Material sein, das zu diesem Zweck verwendet wird, wie etwa ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Chlorfluorkohlenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan, oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächeaktive Mittel schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann ebenso als ein oberflächenaktives Mittel nützlich sein.
Formulierungen zum Abgeben aus einer Pulverinhalationsvorrichtung werden im allgemeinen ein fein verteiltes trockenes Pulver umfassen, enthaltend Protein (oder Derivat), und können ebenso ein Füllmittel, wie etwa Lactose, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen enthalten, die eine Verteilung des Pulvers von der Vorrichtung erleichtern, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung.
Nasale Abgabe des Proteins (oder -Analogs oder -Derivats) wird ebenso in Erwägung gezogen. Die nasale Abgabe ermöglicht die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichung des therapeutischen Produkts an die Nase, ohne die Notwendigkeit zur Ablagerung des Produkts in der Lunge. Formulierungen für die nasale Abgabe schließen diejenigen mit Dextran oder Cyclodextran ein. Die Abgabe über einen Transport über andere Schleimhäute wird ebenso erwogen.
Ein Fachmann wird in der Lage sein, effektive Dosierungen durch Verabreichung und Beobachten des erwünschten therapeutischen Effektes zu bestimmen. Bevorzugt wird die Formulierung des Moleküls dergestalt sein, daß zwischen ungefähr 0,10 μg/kg/Tag und 10 mg/kg/Tag den erwünschten therapeutischen Effekt ergeben wird. Die effektiven Dosierungen können unter Verwendung von Diagnosewerkzeugen mit der Zeit bestimmt werden. Z. B. kann zuerst ein Diagnosemittel zum Messen der Menge an OB-Protein im Blut (oder Plasma oder Serum) verwendet werden, um endogene Konzentrationen an OB-Protein zu bestimmen. Ein solches Diagnosewerkzeug kann in der Form eines Antikörper-Assay, wie etwa einem Antikörper-Sandwich-Assay sein. Die Menge an endogenem OB-Protein wird anfänglich quantifiziert, und eine Grundlinie wird bestimmt. Die therapeutischen Dosierungen werden bestimmt, während die Quantifizierung am endogenem und exogenem OB-Protein (d. h. das Protein, Analog oder Derivat, das innerhalb des Körpers gefunden wird, entweder selbst produziert oder verabreicht) über den Verlauf der Therapie fortgesetzt wird. Die Dosierungen können deshalb über den Verlauf der Therapie variieren, wobei eine relativ hohe Dosierung anfänglich verwendet wird, bis ein therapeutischer Nutzen beobachtet wird, und geringere Dosierungen werden verwendet, um die therapeutischen Vorteile aufrechtzuerhalten.
Im allgemeinen werden effektive Dosierungen für Menschen, die eine Verringerung hinsichtlich ihrer Blutlipidkonzentrationen wünschen, ausreichen, um die Cholesterinkonzentration oder Triglyceridkonzentrationen zu reduzieren oder reduzierte Cholesterin- oder Triglyceridkonzentration in einem normalen Bereich zu halten. Personen mit Blutcholesterinkonzentrationen oberhalb von ungefähr 200 mg pro 100 ml werden von verringerten Cholesterinkonzentrationen profitieren. Personen mit Triglyceridkonzentrationen oberhalb von ungefähr 250 mg pro 100 ml werden im allgemeinen von einer Verringerung oder Aufrechterhaltung einer verringerten Triglyceridkonzentration profitieren.
Idealerweise wird in Situationen, bei denen nur eine Verringerung der Blutlipidkonzentrationen erwünscht wird oder bei denen eine Aufrechterhaltung der Verringerung von Blutlipidkonzentrationen erwünscht wird, die Dosierung nicht ausreichen, um zu einem Gewichtsverlust zu führen. Daher können während eines anfänglichen Therapieverlaufs einer fettleibigen Person Dosierungen verabreicht werden, durch die einen Gewichtsverlust und eine damit einhergehende Abnahme der Blutlipidkonzentration erzielt wird. Wenn ein ausreichender Gewichtsverlust erzielt wird, kann eine Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um eine Wiederzunahme an Gewicht zu verhindern, die jedoch ausreicht, um die erwünschten Blutlipidkonzentrationen aufrecht zu erhalten. Diese Dosierungen können empirisch bestimmt werden, da die Effekte von OB-Protein umkehrbar sind. Z. B. Campfield et al., Science 269: 546–549 (1995) auf 547. Daher würde man, falls eine Dosierung, die zu einem Gewichtsverlust führt, beobachtet wird, wenn ein Gewichtsverlust nicht erwünscht ist, eine geringere Dosis verabreichen, um die erwünschten Blutlipidkonzentrationen zu erzielen, jedoch das gewünschte Gewicht beizubehalten.
Die vorliegende Erfindung kann zusammen mit anderen Medikamenten verwendet werden, wie etwa diejenigen, die für die Behandlung von Diabetes nützlich sind (z. B. Insulin und möglicherweise Amylin), Cholesterin- und Blutdruck-senkenden Medikamenten (wie etwa diejenigen, die oben aufgeführt sind), und Aktivitäts-erhöhenden Medikamenten (z. B. Amphetaminen). Appetitunterdrücker können ebenso verwendet werden. Eine solche Verabreichung kann zeitgleich oder in Reihe nacheinander erfolgen.
Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung zusammen mit Operationsprozeduren verwendet werden, wie etwa kosmetischen Operationen, die darauf angelegt sind, das Erscheinungsbild eines Körpers insgesamt zu verändern (z. B. Fettabsaugung oder Laser-Operationen, die darauf angelegt sind, die Körpermasse zu reduzieren). Die Gesundheitsvorteile von Herzoperationen, wie etwa Bypass-Operationen oder anderen Operationen, die darauf angelegt sind, einen nachteilhaften Zustand zu erleichtern, der durch die Blockade von Blutgefäßen durch Fettablagerungen, wie etwa arterielle Plaques, verursacht wird, kann durch die zeitgleiche Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren erhöht werden. Verfahren zum Eliminieren von Gallensteinen, wie etwa Ultraschall- oder Laser-Verfahren, können ebenso vor, während oder nach einem Verlauf der vorliegenden therapeutischen Verwendung verwendet werden.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zum Verringern der Konzentration an Blutlipiden in einem nicht-fettleibigen Patienten oder zum Aufrechterhalten einer verringerten Konzentration an Blutlipiden in einem Patienten mit einer erhöhten Konzentration an Blutlipiden bereit, umfassend die Verabreichung einer Menge an OB-Protein, eines Analogs oder -Derivats davon, das ausreicht, um die Blutlipidkonzentration zu verringern oder besagte reduzierte Konzentration aufrechtzuerhalten, das aber nicht ausreicht, um zu einem Gewichtsverlust zu führen, wobei besagtes OB-Protein, -Analog oder -Derivat davon ausgewählt ist aus:

(a) der Aminosäuresequenz 1–146, dargestellt in SEQ ID NO: 2 (unten) oder SEQ ID NO: 4 (unten),
(b) der Aminosäuresequenz 1–146, dargestellt in SEQ ID NO: 4 (unten), mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74;
(c) der Aminosäuresequenz des Teils (b) mit einer unterschiedlichen Aminosäure substituiert an einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung gemäß SEQ ID NO: 4 und unter Beibehaltung der selben Numerierung sogar in der Abwesenheit eines Glutaminrestes an Position 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145;
(d) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b) oder (c), der fakultativ ein Glutaminrest an Position 28 fehlt;
(e) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b), (c) oder (d) mit einem Methionylrest am N-Terminus;
(f) einem trunkiertem OB-Proteinanalog, ausgewählt aus: (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4):
(i) Aminosäuren 98–146
(ii) Aminosäuren 1–32
(iii) Aminosäuren 40–116
(iv) Aminosäuren 1–99 und 112–146
(v) Aminosäuren 1–99 und 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 eingebracht zwischen Aminosäuren 99 und 112; und
(vi) dem trunkierten OB-Analog des Teils (i) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 substituiert durch eine andere Aminosäure;
(vii) dem trunkierten Analog des Teils (ii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4 und 32 substituiert durch eine andere Aminosäure;
(viii) dem trunkierten Analog des Teils (iii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108 und 111 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(ix) dem trunkierten Analog des Teils (iv) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 118, 136, 138, 142 und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(x) dem trunkierten Analog des Teils (v) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(xi) dem trunkierten Analog eines der Teile (i)–(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und
(g) dem OB-Protein oder Analogderivat von einem der Teile (a) bis (f), umfassend eine chemische Gruppe, die an die Proteingruppe geknüpft ist;
(h) einem Derivat des Teils (g), wobei besagte chemische Gruppe eine wasserlösliche Polymergruppe ist;
(i) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe Polyethylenglycol ist; und
(j) einem Derivat des Teils (i), wobei besagte Polyethylenglycolgruppe nur an den N-Terminus besagter Proteingruppe angehängt ist;
(k) einem OB-Protein, Analog oder Derivat der Teile (a) bis (h) in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel wie oben bereit, wobei besagter nicht-fettleibiger Patient eine erhöhte Konzentration an Serumcholesterin hat oder eine solche erhöhte Konzentration gehabt hat, und die Dosierung des OB-Proteins, -Analogs oder -Derivats ausreicht, um die Konzentration zu verringern und/oder die Serumcholesterinkonzentration besagten Patientens auf einem normalen Niveau zu halten. Bevorzugt wird dieses Niveau bei oder unterhalb von 240 mg Cholesterin/100 ml und bevorzugter bei oder unterhalb von 200 mg Cholesterin/100 ml sein.
Unter einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel wie oben bereit, bei dem der nicht-fettleibige Patient eine erhöhte Konzentration an Serumtriglyceriden hat und die Dosierung des OB-Proteins, -Analogs oder -Derivats ausreicht, um die Triglyceridkonzentration zu verringern und/oder die Triglyceridkonzentration des besagten Patienten auf normalem Niveau zu halten. Bevorzugt wird dieses Niveau bei oder unterhalb von 500 mg/100 ml und bevorzugter bei oder unterhalb von 250 mg/100 ml sein. Insbesondere kann ein Individuum mit z. B. familiärer Hypertriglyceridämie erhöhte Triglycerdikonzentrationen und doch normale Cholesterinkonzentrationen haben und kann von der vorliegenden Erfindung profitieren.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel wie oben bereit, bei dem der nicht-fettleibige Patient eine erhöhte Konzentration an arteriellem Plaque hat und die Dosierung des OB-Proteins, -Analogs oder -Derivats ausreicht, um das Niveau an arteriellem Plaque zu verringern oder die Konzentration an arteriellem Plaque des besagten Patienten auf normalen Niveau zu halten. Bevorzugt wird die Dosierung ausreichend, um einen normalen Blutfluß durch die beeinträchtigten Blutgefäße zu ermöglichen oder aufrechtzuerhalten.
Da die Bildung von Gallensteinen in der Gallenblase mit der Blutcholesterinkonzentration in Beziehung steht, stellt die vorliegende Erfindung darüberhinaus ein Mittel wie oben bereit, um die Bildung von Gallensteinen zu verhindern oder zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung des obigen OB-Proteins und von Analogen und Derivaten davon zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von erhöhten Konzentrationen an Blutlipiden bereit, einschließlich der Behandlung von hohen Cholesterinkonzentrationen, erhöhten Konzentrationen an Triglyceriden, Bluthochruck und hohen Konzentrationen an arteriellem Plaque, und bei der Verhinderung oder Verringerung der Bildung von Gallensteinen, wie oben beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um die Erfindung vollständiger zu erläutern, sollen aber nicht als deren Umfang begrenzend ausgelegt werden.
BEISPIEL 1
Diese Beispiel demonstriert, daß in normalen Mäusen, die nicht fettleibig sind und keine erhöhten Blutlipidkonzentrationen haben, die Verabreichung von rekombinantem murinem OB-Protein zu einer Senkung von Cholesterin und Triglyceridkonzentrationen führt. Normalen CD-1-Mäusen wurde rekombinates murines OB-Protein über eine kontinuierliche Infusion verabreicht (siehe Materialen und Methoden unten). Bei den verabreichten Dosierungen verloren die Tiere Gewicht. Wie in Tabelle 1 gezeigt, hatten die Mäuse eine wesentliche Verringerung an Serumcholesterin und Triglyceriden in einer dosisabhängigen Weise:
Tabelle 1
Ähnliche Resultate wurden ebenso für ob/ob-mutante Mäuse gesehen, bei denen ebenfalls beobachtet wurde, daß sie Gewicht verloren (Tabelle 2, unten) obwohl C57 (+/+) mit normalen Blutlipidkonzentrationen keine Veränderungen zeigten:
Tabelle 2
Diese Daten zeigen, daß das OB-Protein oder Analog oder Derivat davon effektive Blutlipidsenkende Mittel sind.
BEISPIEL 2
Ein nicht-fettleibiger menschlicher Patient wird einer koronaren Bypass-Operation oder einer anderen invasiven Behandlung unterzogen, um fortgeschrittene Stadien arterieller Plaquebildung zu erleichtern. Nach der Operation wird dem Patient eine Aufrechterhaltungsdosis an OB-Protein oder -Analog oder -Derivat verabreicht, um die erneute Bildung von arteriellem Plaque zu verhindern. Die verabreichte Dosis ist nicht ausreichend, um zu einem Gewichtsverlust zu führen. Die Verabreichung ist chronisch. Die Konzentration an zirkulierendem OB-Protein oder -Analog oder -Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekits, wie etwa eines Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar), überwacht werden.
BEISPIEL 3
Ein nicht-fettleibiger menschlicher Patient hat Bluthochdruck aufgrund von verringertem Blutfluß wegen verstopfter Arterien. Dem Patienten wird eine Dosis an OB-Protein oder -Analog oder -Derivat davon verabreicht, die ausreicht, um den arteriellen Plaque, der zu den verstopften Arterien führt, zu verringern. Danach wird der Patient auf weitere arterielle Plaquebildung und Bluthochdruck überwacht. Wenn der Zustand wieder auftritt, wird dem Patient wieder eine wirksame Menge an OB-Protein, -Analog oder -Derivat verabreicht, die ausreicht, um den Blutfluß wiederherzustellen, die jedoch nicht dazu ausreicht, um zu einem Gewichtsverlust zu führen. Die Konzentrationen an zirkulierendem OB-Protein oder -Analog oder -Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekit überwacht werden, wie etwa eines Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
BEISPIEL 4
Ein menschlicher Patient hat Gallensteine. Entweder werden die Gallensteine nicht entfernt, und es wird darauf abgezielt, die Bildung von zusätzlichen Gallensteinen zu vermeiden, oder die Gallensteine werden entfernt, aber die Gallenblase bleibt (wie z. B. unter Verwendung von Laser- oder Ultraschall-Operation), und es wird versucht, die Bildung von zusätzlichen Gallensteinen zu vermeiden. Dem Patienten wird eine wirksame Menge an OB-Protein, -Analog oder -Derivat davon verabreicht, um zur Verhinderung der Akkumulation von zusätzlichen Gallensteinen oder der Re-Akkumulation von Gallensteinen zu führen. Die Konzentrationen an zirkulärem OB-Protein oder -Analog oder -Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekits überwacht werden, wie etwa einem Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
MATERIALEN UND METHODEN
Tiere: CD1-Wildtypmäuse wurden für Beispiel 1 verwendet (Daten aus Tabelle 1). Die Tiere wurden unter akzeptablen Bedingungen gehalten. Ebenso wurden C57 +/+- oder ob/ob-Mäuse für Beispiel 1 verwendet (Daten aus Tabelle 2).
Verabreichung von Protein oder Vehikeln. Für Beispiel 1, (Daten aus Tabelle 1) wurde rekombinantes murines Protein (wie unten beschrieben) oder Vehikel (Phosphat-gepufferte Salzlösung, „PBS", pH 7,4) mittels osmotischer Pumpeninfusion verabreicht. Alzetosmotische Minipumpen (Alza, Palo Alto, CA, Modell Nr. 1007D) wurden operativ in jede Maus in einer subkutanen Tasche in dem Gebiet unter dem Schulterblatt eingebracht. Die Pumpen wurden kalibriert, um 0,5 μl Protein in Lösung pro Stunde für die in Tabelle 1 angezeigten Dosierungen abzugeben. Bei der Studie, die zu den Daten aus Tabelle 2 führte, wurde Mäusen einmal täglich die aufgelisteten Dosierungen an rekombinanten murinen OB-Protein, wie unten dargestellt, injiziert.
Protein: Sequenz ID No: 1 und 2 zeigen rekombinante murine OB-DNA und -Protein, und Sequenz ID No: 3 und 4 zeigen eine analoge rekombinate humane OB-DNA und -Protein. Murines rekombinantes Protein wie in SEQ ID NO: 2 wurde in Beispiel 1 verwendet. Wie oben angezeigt, erläutern diese das OB-Protein, das bei den vorliegenden Behandlungs- und Herstellungsverfahren eines Medikaments verwendet werden kann. Andere OB-Proteine oder -Analoge oder -Derivate davon können verwendet werden.
Hierin wird auf die erste Aminosäure der Aminosäuresequenz für rekombinantes Protein als +1 Bezug genommen, und diese ist Valin, und die Aminosäure an Position –1 ist Methionin. Die C-terminale Aminosäure ist 146 (Cystein).
Rekombinante murine met-OB (doppelsträngig) DNA und Aminosäuresequenz (Seq ID. NOs. 1 und 2)
Rekombinante humane met-OB-Analog- (doppelsträngig) DNA und Aminosäuresequenz (Seq ID. No: 3 und 4)
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG
Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um das rekombinante murine Protein (Seq. ID. No: 2), wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, herzustellen.
EXPRESSIONSVEKTOR UND WIRTSSTAMM
Der verwendete Plasmidexpressionsvektor ist pCFM1656, ATCC Hinterlegungsnr. 69576. Die obige DNA wurde in den Expressionsvektor pCFM1656 ligiert, mit XbaI und BamHI linearisiert und in den E. coli Wirtsstamm FM5 transformiert. E. coli FM5-Zellen stammten von Amgen Inc., Thousand Oaks, CA aus E. coli K-12-Stamm (Bachmann, et al., Bacteriol. Rev. 40: 116–167 (1976)) und enthalten das integrierte Lambdaphagen-Repressor-Gen, cI₈₅₇ (Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254: 1517–1579 (1962). Die Vektorproduktion, Zelltransformation und Kolonienauswahl wurde mittels Standardverfahren durchgeführt. Z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Wirtszellen wurden in LB-Medium wachsen gelassen.
FERMENTATIONSPROZESS
Ein dreiphasiges Fermentationsprotokoll, das als Fed-Batch-Verfahren bekannt ist, wurde verwendet. Die Medienzusammensetzungen sind unten dargestellt.
Charge („Batch"): Eine Stickstoff- und Phosphat-Quelle wurden sterilisiert (durch Erhöhen auf 122°C für 35 Minuten, 18–20 psi) im Fermentationsgefäß (Biolafitte, 12 Liter Kapazität). Beim Kühlen wurden Kohlenstoff, Magnesium, Vitamin und Spurenmetallquellen aseptische zugegeben. Eine Übernachtkultur der obigen rekombinantes murines Protein produzierenden Bakterien (16 Stunden oder mehr) von 500 ml (in LB-Medium wachsen gelassen) wurde zu dem Fermentor hinzugegeben.
Zuführung I („Feed I"): Beim Erreichen von 4,0–6,0 OD₆₀₀ wurde den Kulturen Zuführung I zugeführt. Die Glukose wurde bei einer begrenzenden Geschwindigkeit zugeführt, um die Wachstumsrate (μ) zu kontrollieren. Ein automatisiertes System (Verteilungskontrollsystem genannt) wurde instruiert, um die Wachstumsrate auf 0,15 Generationen pro Stunde zu steuern.
Zuführung II („Feed I"): Wenn die OD₆₀₀ 30 erreicht hatte, wurde die Kulturtemperatur langsam auf 42°C erhöht, und die Zuführung auf Zuführung II, unten umgeschaltet. Die Fermenta tion ließ man für 10 Stunden ablaufen, wobei alle zwei Stunden eine Probe genommen wurde. Nach 10 Stunden wurde der Inhalt des Fermentors auf unter 20°C abgekühlt und mittels Zentrifugation geerntet.
Medienzusammensetzung
Vitaminlösung (Charge und Zuführung I): 0,5 g Biotin, 0,4 g Folsäure und 4,2 g Riboflavin wurden in 450 ml H₂O und 3 ml 10 N NaOH aufgelöst und auf 500 ml H₂O gebracht, 14 g Pyridoxin-HCl und 61 g Niacin wurden in 150 ml H₂O und 50 ml 10 N NaOH aufgelöst und auf 250 ml in H₂O gebracht. 54 g Pantothensäure wurde in 200 ml H₂O aufgelöst und auf 250 ml gebracht. Die drei Lösungen wurden kombiniert und auf 10 Liter Gesamtvolumen gebracht.
Spurenmetallösung (Charge und Zuführung I)

Eisenchlorid (FeCl₃·6H₂O): 27 g/l
Zinkchlorid (ZnCl₂·4H₂O): 2 g/l
Kobaltchlorid (CoCl₂·6H₂O): 2 g/l
Natriummolybdat (NaMoO₄·2H₂O): 2 g/l
Calciumchlorid (CaCl₂·2H₂O): 1 g/l
Kupfersulfat (CuSO₄·5H₂O): 1,9 g/l
Borsäure (H₃BO₃): 0,5 g/l
Manganchlorid (MnCl₂·4H₂O): 1,6 g/l
Natriumcitratdihydrat: 73,5 g/l

Aufreinigungsprozeß für murines OB-Protein
Die Aufreinigung wurde mit den folgenden Schritten erzielt (sofern nicht andersweitig dargestellt, wurden die folgenden Schritte bei 4°C durchgeführt):

1. Zellpaste. E. coli Zellpaste wurde in dem 5-fachen Volumen an 7 mM EDTA, pH 7,0 suspendiert. Die Zellen in EDTA wurden weiter aufgebrochen durch zwei Passagen durch einen Mikrofverflüssiger. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 4,2 K upm für 1 Stunde in einer Beckman J6-B-Zentrifuge mit einem JS-4.2-Rotor zentrifugiert.
2. Inclusion Body-Waschung #1. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde mit dem 5-fachen Volumen an 7 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
3. Inclusion body-Waschung #2. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in dem 10-fachen Volumen an 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT und 1% Deoxychloat resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
4. Inclusion body-Waschung #3. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in dem 10-fachen Volumen an destilliertem Wasser resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
5. Rückfaltung. Das Pellet wurde mit 15 Volumina an 10 mM HEPES, pH 8,5, 1% Natriumsarcosin (N-Lauroylsarcosin) bei Zimmertemperatur rückgefaltet. Nach 60 Minuten wurde die Lösung auf 60 μM Kupfersulfat eingestellt und dann über Nacht gerührt.
6. Entfernung von Sarcosin. Die Rückfaltungsmischung wurde mit 5 Volumina 10 mM Tris Puffer, pH 7,5, verdünnt und wie in Schritt 1 zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und unter Rühren für 1 Stunde mit Dowex^® 1-X4-Harz gemischt (Dow Chemical Co, Midland MI), 20–50 Mesh, Chloridform bei 0,066% Gesamtvolumen an verdünnter Rückfaltungsmischung. Siehe WO 89/10932 auf Seite 26 für mehr Information über Dowex^®. Diese Mischung wurde in eine Säule gegossen, und das Elutionsmittel gesammelt. Die Entfernung von Sarcosin wurde mittels Umkehrphasen-HPLC bestätigt.
7. Säurefällung. Das Elutionsmittel aus dem vorherigen Schritt wurde gesammelt und der pH auf pH 5,5 eingestellt und für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
8. Kationenaustauschchromatographie. Der pH des Überstands aus dem vorherigen Schritt wurde auf pH 4,2 eingestellt und auf eine CM-Sepharose-Fast Flow geladen (bei 7% Volumen). 20 Säulenvolumina an Salzgradient wurden bei 20 mM NaOAC, pH 4,2, 0 M bis 1,0 M NaCl durchgeführt.
9. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Der CM-Sepharose-Pool der Spitzenfraktionen (bestätigt anhand der Ultraviolet-Absorption) aus dem obigen Schritt wurde auf 0,2 M Ammoniumsulfat eingestellt. Ein 20-Säulen-Volumen-Umkehrsalzgradient wurde bei 5 mM NaOAC, pH 4,2, mit 0,4 M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt. Dieses Material wurde konzentriert und in PBS diafiltriert.

Fermentation des rekombinanten menschlichen OB-Protein-Analogs: Fermentation der obigen Wirtszellen, um rekombinantes humanes OB-Protein-Analog (SEQ ID NO: 4) zu produzieren, kann unter Verwendung der Bedingungen und Zusammensetzungen, wie oben beschrieben, für rekombinantes murines Material, erzielt werden.
Aufreinigung des rekombinanten humanen OB-Protein-Analogs: Rekombinantes humanes Protein-Analog kann unter Verwendung von Verfahren aufgereinigt werden, die ähnlich denjenigen sind, die zur Aufreinigung von rekombinantem murinem Protein verwendet werden, wie in Beispiel 1, oben. Zur Herstellung von rekombinantem humanem OB-Protein-Analog sollte Schritt 8 durch Einstellen des pHs des Überstands aus Schritt 7 auf pH 5,0 durchgeführt werden und durch Laden hiervon auf eine CM-Sepharose-Fast-Flow-Säule. Der 20-Säulenvolumina-Salzgradient sollte bei 20 mM NaOAC, pH 5,5, 0 M bis 0,5 M NaCl, durchgeführt werden. Schritt 9 sollte durch vierfache Verdünnung mit Wasser des CM-Sepharose-Pools und Einstellen des pHs auf 7,5 durchgeführt werden. Diese Mischung sollte auf 0,7 M Ammoniumsulfat eingestellt werden. 20 Säulenvolumina Umkehr-Salzgradient sollten bei 5 mM NaOAC, pH 5,5, 0,2 M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt werden. Ansonsten sind die obigen Schritte identisch.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines OB-Proteins, Analogs oder Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Konzentration von Lipiden im Blut in einem nicht-fettleibigen Patienten oder zum Aufrechterhalten einer verringerten Konzentration von Lipiden im Blut in einem einem nicht-fettleibigen Patienten mit einer erhöhten Konzentration von Lipiden im Blut, wobei das OB-Protein, Analog oder Derivat davon in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um verringerte Konzentrationen besagter Lipide im Blut zu verringern oder aufrechtzuerhalten, die aber nicht ausreicht, um einen Gewichtsverlust zu verursachen, und wobei besagtes OB-Protein, Analog oder Derivat davon ausgewählt ist aus: (a) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 (b) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4, mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74; (c) der Aminosäuresequenz des Teils (b) mit einer unterschiedlichen Aminosäure substituiert an einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung gemäß SEQ ID NO: 4 und unter Beibehaltung derselben Numerierung sogar in der Abwesenheit eines Glutaminrests an Position 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, und 145; (d) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b) oder (c), der fakultativ ein Glutaminrest an Position 28 fehlt; (e) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b), (c), oder (d) mit einem Methionylrest am N-Terminus; (f) einem trunkierten OB-Proteinanalog, ausgewählt aus: (unter Verwendung der Nume- rierung von SEQ ID NO: 4): (i) Aminosäuren 98–146 (ii) Aminosäuren 1–32 (iii) Aminosäuren 40–116 (iv) Aminosäuren 1–99 und 112–146 (v) Aminosäuren 1–99 und 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 eingebracht zwischen Aminosäuren 99 und 112; (vi) dem trunkierten OB-Analog des Teils (i) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (vii) dem trunkierten Analog des Teils (ii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4 und 32 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (viii) dem trunkierten Analog des Teils (iii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108 und 111 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (vix) dem trunkierten Analog des Teils (iv) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (x) dem trunkierten Analog des Teils (v) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (xi) dem trunkierten Analog eines der Teile (i)–(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und (g) dem OB-Protein oder Analogderivat von einem der Teile (a) bis (f), umfassend eine chemische Gruppe, die an die Proteingruppe geknüpft ist; (h) einem Derivat des Teils (g), wobei besagte chemische Gruppe eine wasserlösliche Polymergruppe ist; (i) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe Polyethylenglycol ist; (j) einem Derivat des Teils (i), wobei besagte Polyethylenglycolgruppe nur an den N-Terminus besagter Proteingruppe angehängt ist; und (k) einem OB-Protein, Analog oder Derivat von einem der Teile (a) bis (h) in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagter Patient eine erhöhte Konzentration an Serum-Cholesterin hat und die Dosierung des besagten OB-Proteins, Analogs oder Derivats ausreicht, um die Konzentration an Serum-Cholesterin von besagtem Patienten auf normalem Niveau zu halten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagter Patient eine erhöhte Konzentration an Serum-Triglyceriden hat und die Dosierung des OB-Proteins, Analogs oder Derivats aus reicht, um die Konzentration an Triglycerid in besagtem Patienten auf normalem Niveau zu halten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagter Patient eine erhöhte Konzentration an arteriellem Plaque hat und die Dosierung des OB-Proteins, Analogs oder Derivats ausreicht, um die Konzentration an arteriellem Plaque in besagtem Patienten auf normalem Niveau zu halten.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei eine Verringerung des arteriellen Plaques zu einer Behandlung von Bluthochdruck führt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagter Patient gegenwärtig oder zuvor Gallensteine gehabt hat und die Dosierung des OB-Proteins, Analogs oder Derivats ausreicht, um die Bildung von zusätzlichen Gallensteinen zu verhindern oder zu verringern.