JP2001501177A

JP2001501177A - Ｏｂタンパク質受容体をアップレギュレートすることによりｏｂタンパク質に対する個体の感受性を増加させる方法

Info

Publication number: JP2001501177A
Application number: JP10511882A
Authority: JP
Inventors: ペリマウンター，メアリー・アン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2001-01-30
Also published as: WO1998008512A1; EP1001768A1; CA2263826A1; AU4237797A

Abstract

(57)【要約】機能的OBタンパク質受容体の感受性を増加させるための方法およびその用途を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】OB タンパク質受容体をアップレギュレートすることによりOBタンパク質に対する個体の感受性を増加させる方法発明の分野本発明は、OBタンパク質に対する感受性または機能的OBタンパク質受容体に対する親和性もしくは利用能を増加させる物質の使用により、所望の治療効果または美容効果を得るためのOBタンパク質組成物の投与量を減少させる方法に関する。背景肥満の分子的基礎はほとんど知られていないが、「OB遺伝子」およびコードされるタンパク質（「OBタンパタ質」または「レプチン」）の同定により、身体の脂肪沈着を調節するために身体が用いているメカニズムが、ある程度解明されてきている（PCT公開WO 96/05309(12/22/96)，Friedman；Zhangら，Nature 372：4 25-432(1994);また、Nature 374:479（1995）の訂正も参照されたい）。OBタンパク質は、ob/ob突然変異マウス（OB遺伝子産物の産生の欠損によるマウスの肥満）および正常な野生型マウスの両方でインビボで活性である。その生物活性は、とりわけ、体重減少を示す。一般的には、Barinaga，"Obese"Protein Slims Mice，Science 269:475-476（1995）を参照されたい。OBタンパク質、その誘導および哺乳動物およびヒトを含む動物の体重および脂肪症の制御のためのモデュレーターとしてのその用途は、参照することにより本明細書に組入れるPC T公開WO 96/05309(12/22/96)および図面に、より詳しく開示されている。 OBタンパタ質の他の生物効果は、十分に特徴づけられていない。ob/ob突然変異マウスにOBタンパク質を投与すると、例えば、血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルが減少することが公知である。また、OBタンパク質を投与すると、体脂肪が減少することが公知である。これは、ob/ob突然変異マウスおよび非肥満正常マウスの両方で認められた［Pelleymounterら，Science 269：540- 543(1995);Halaasら，Science 269：543-546(1995)，また、Campfieldら，Scien ce 269:546-549（1995）(マイクログラム用量のOBタンパク質の末梢および中枢投与により、ob/obおよび食餌誘導肥満マウスでは食物摂取および体重が減少したが、db/db肥満マウスでは減少しなかった)も参照されたい］。これらの報告ではいずれも、最高用量においても毒性は認められていない。インスリン代謝の調節においては、他の物質か何らかの役割を果たしている可能性がある。チアゾリジンジオンは、依然として未知の作用メカニズムを有する抗高血糖剤のクラスである。Wilsonら，J．Med Chem．39:665-668(1996);Kallen ら，P.N.A.S.,93:5793-5796(1996)；Sohdaら，Chem.Pharm.Bull.,43:2168-2172( 1995);Swansonら，Drug Dev．Res.，35:69-82(1995);Kletzienら，Mol．Pharmac ol.，42:558-62(1992)を参照されたい。このクラスの薬物は、１）インスリン感受性を増加させることにより、または２）転写因子、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（PPAR）（ガンマ）を活性化することにより、高血糖を軽減するように作用すると考えられている。PPAR（ガンマ）は、一次線維芽細胞から脂肪細胞への変換において何らかの役割を果たしていると考えられている。Wilsonら，J ．Med Chem．39:665-668(1996);Kallenら，P.N.A.S.，93:5793-5796(1996);Swan sonら，Drug Dev．Res.，35:69-82(1995)を参照されたい。最近、チアゾリジンジオンの１つ（AD-5057）が、肥満ラットおよびマウスにおいて、体重の僅かな上昇を招くものの食物摂取には実質的に影響を及ぼすことなく、脂肪細胞レプチンmRNAおよび血清レプチンレベルを有意に減少させうることが報告された(Zhangら，J．Biol．Chem.，271:9455-9459(1996))。もう１つの報告は、別のタイプのチアゾリジンジオンであるBRL496553も、インビトロで脂肪細胞内のレプチンmRNAレベルを減少させることを示している（Kallenら，P.N. A.S.，93:5793-5796(1996)）。したがって、チアゾリジンジオンは、内因性OBタンパク質を減少させると考えられている。チアゾリジンジオンはインスリン感受性を増加させると考えられているが、現在のところ、OBタンパタ質（またはレプチン）に対する個体の感受性を増加させる公知の物質は存在しない。そのような感受性の増加は、必要用量の減少または投与頻度の減少につながるため、レプチンの使用者に好都合であろう。発明の概要本発明は、チアゾリジンジオン組成物がOBタンパク質に対する感受性を増加させるという仮定に基づく。理論に拘束されることを望むものではないが、チアゾリジンジオン組成物は、シグナル伝達に利用可能なOBタンパク質受容体を「アップレギュレート」する、すなわち、OB受容体の数を増加させるか又はOB受容体のリガンド（OBタンパク質）に対するOB受容体の親和性を増加させる可能性がある。機能的OBタンパク質受容体の利用能または親和性のこのような増加は、内因性および／または外因性OBタンパク質のシグナル伝達を増強する。驚くべきこと、かつ、重要なことに、これは、治療用および／または美容用の外因性OBタンパク質の投与量および／または投与頻度を減少させるための手段を提供する。したがって、１つの態様において、本発明は、個体における機能的OBタンパク質受容体の利用能または親和性を増加させるように作用する１以上の組成物（例えば、チアゾリジンジオン組成物）の投与による、個体における体重調節および／または脂肪沈着の方法を提供する。もう１つの態様において、本発明は、個体における機能的OBタンパク質受容体の利用能または親和性を増加させるように作用する１以上の組成物（例えば、チアゾリジンジオン組成物）の投与とOBタンパタ質の投与とを組合せることによる、個体における体重調節および脂肪沈着の方法を提供する。さらにもう１つの態様において、本発明は、個体における機能的OBタンパク質受容体の利用能を増加させるように作用する１以上の組成物（例えば、チアゾリジンジオン組成物）の投与による、外因性 OBタンパタ質の投与量および／または投与頻度を減少させる方法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、過剰な脂肪に関連した副次的罹患状態（ co-mobidities）、例えば、糖尿病、異常または高脂質血症、受精能の欠如、そしてまた潜在的に、インスリン感受性の増加、および／または脂肪除外組織量の増加の治療方法を提供する。また、関連組成物も提供する。図面の簡単な説明図１：組換えマウスmet OBの（二本鎖）DNA（配列番号１および2）およびアミノ酸配列（配列番号3）。図２：組換えヒトmet OB類似体の（二本鎖）DNA（配列番号４および5）およびアミノ酸配列（配列番号6）。詳細な説明組成物個体におけるOBタンパク質に対する感受性または機能的OBタンパク質受容体の利用能を増加させる能力を有する組成物は、種々のチアゾリジンジオン組成物、例えば、2,4-チアゾリジンジオン、所望により置換されていてもよいチアゾリジンジオン、 5-[4-[2-(5-メチル-2-フェニル-4-オキサゾリル)-2-ヒドロキシエトキシ]エンジル]-2,4-チアゾリジンジオン（AD-5070）、クロフィブラート、シグリタゾン、エングリタゾン、ピオグリタゾン、BRL 49653、トログリタゾン、M16209、オキサゾリジンジオンならびにチアゾリジンジオンまたは前記化合物の誘導体、類似体、互変異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、エピマー、塩、溶媒和物、エステル、プロドラッグおよび代謝産物から選択することができる。 OBタンパク質は、後記（図１の配列番号3）の組換えマウスタンパク質、またはZhangら（Nature，前掲；これを参照することにより本明細書に組入れることとする）に記載されている組換えヒトタンパク質または28位のグルタミニル残基を欠くものから選択することができる（Zhangら，Nature，前掲428頁を参照されたい）。また、１）35位にリシンの代わりにアルギニンを含有し、２）74位にイソロイシンの代わりにロイシンを含有する図２の配列番号６に記載の組換えヒト OBタンパク質類似体を使用することもできる（この類似体の略称は、組換えヒト R->K³⁵、L->I⁷⁴である）。組換えヒト類似体および組換えマウスタンパク質のアミノ酸配列は、−１位にメチオニル残基が存在するものとして以下に記載されているが、これらのOBタンパク質および類似体のいずれにおいても、該メチオ二ル残基は存在していなくてもよい。該マウスタンパク質は、該ヒトタンパク質と実質的に相同である（特に、成熟タンパク質として、そしてさらに特にN末端において）。該組換えヒトタンパク質の類似体は、該組換えヒト配列内の、該マウス配列と異なるアミノ酸を改変（例えば、アミノ酸残基を置換）することにより製造することができる。該組換えヒトタンパク質はマウスにおいて生物活性を有するため、そのような類似体は、おそらくヒトにおいて活性であろう。例えば、残基35にリシンを有し残基74にイソロイシンを有する（最初のアミノ酸がバリンであり146位のアミノ酸がシステインである配列番号６の番号付けによる）ヒトタンパク質を使用して、32、35、 50、64、68、71、74、77、89、97、100、105、106、107、108、111、118、136、 138、142および145位のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することがでぎる。マウスタンパク質（配列番号3）の対応位置のアミノ酸または別のアミノ酸を選択することができる。さらに、ラットOBタンパク質配列に基づき、「コンセンサス」分子を製造することができる（Murakamiら，Biochem．Biophys．Res．Comm ．209：944-952(1995)；これを参照することにより本明細書に組入れることとする）。ラットOBタンパク質は、以下の位置（配列番号６の番号付けを使用）でヒトOBタンパク質と異なる：4、32、33、35、50、68、71、74、77、78、89、97、1 00 、101、102、105、106、107、108、111、118、136、138および145。異なっているこれらの位置のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することができる。太字の位置は、マウスOBタンパク質およびラットOBタンパク質がヒトOBタンパク質と異なっている位置であり、したがって改変に特に適した位置である。対応するラットOBタンパク質からのアミノ酸または別のアミノ酸を、これらの１以上の位置において置換することができる。ラットおよびマウス双方のOBタンパク質は、成熟ヒトOBタンパク質と以下の位置で異なる：4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102 、105、106、107、108、111、118、136、138、142および145。前記アミノ酸の１以上が欠失しているか又は別のアミノ酸（例えば、対応するラットまたはマウス配列中に見出されるアミノ酸）で置換されている配列番号６（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する）のヒトOBタンパク質も有効であろう。また、成熟ヒトOBタンパク質と異なるアカゲザルOBタンパク質中に見出されるアミノ酸は、8(S)、35(R)、48(V)、53(Q)、60(I)、66(I)、67(N)、68(L)、89(L) 、100(L)、108(E)、112(D)および118(L)（アミノ酸の種類が、括弧内に１文字のアミノ酸略語で示されている）である。組換えヒトOBタンパク質はシノモルグスザルにおいて活性であるため、アカゲザルの相違アミノ酸の１以上が別のアミノ酸（例えば、括弧内のアミノ酸）で置換されている配列番号６（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する）のヒトOBタンパク質は有効であろう。アカゲザルの或る相違アミノ酸はまた、前記マウス種において見出されるアミノ酸である（35、68、89、100および112位）ことに注目すべきである。したがって、以下の位置（35位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する配列番号６の番号付けを使用）のアミノ酸の１以上が別のアミノ酸で置換されたマウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子を製造することができる：4、8、32、33、35、48、50、53 、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、1 08、111、112 、118、136、138、142および145。他の類似体は、タンパク質アミノ酸配列の一部を欠失させることにより製造することができる。例えば、該成熟タンパク質は、リーダー配列（−22〜−１）を欠く。以下のトランケート化形態のヒトOBタンパク質分子（配列番号６の番号付けを使用している）を製造することができる：（a）アミノ酸98〜146 （b）アミノ酸1〜32 （c）アミノ酸40〜116 （d）アミノ酸1〜99および（それが接続している）112〜146 （e）アミノ酸99と112との間に置かれたアミノ酸100〜111の１以上を有するアミノ酸1〜99および（それが接続している）112〜146。さらに、該トランケート化形態はまた、ヒトOBタンパク質と異なるアミノ酸（アカケザル、ラットまたはマウスヒトOBタンパク質内）の１以上が改変されていてもよい。さらに、いずれの改変も、改変アミノ酸（例えば、ペプチド模擬体またはD-アミノ酸）の形態であってもよい。誘導体本タンパク質（本発明において「タンパク質」なる語は、特に示さない限り、「ペプチド」およびOB類似体（例えば以下に挙げるもの）を包含するものとして使用する）はまた、１以上の化学的部分を該タンパク質部分に結合させることにより誘導体化することができる。その化学的に修飾された誘導体はさらに、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、経口、鼻内、肺内、局所または他の経路での投与用に製剤化することができる。生物学的に活性なタンパク質の化学修飾により、ある状況下ではさらなる利点（例えば、該治療用タンパク質の安定性および循環時間の増加ならびに免疫原性の減少）が得られることが判明している。19 79年12月18日付け発行のDavisら，米国特許第4,179,337号を参照されたい。概説としては、Abuchowskiら，Enzymes as Drugs(J.S．HolcerbergおよびJ．Roberts 編，pp．367-383(1981))を参照されたい。タンパク質の修飾および融合タンパク質を記載している総説としては、Francis，Focus on Growth Factors 3:4-10（1 992年５月号）（Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N 20，OLD，UK発行）が挙げられる。誘導体化に適した化学的部分は、種々の水溶性重合体から選択することができる。選択する重合体は、それが結合するタンパク質が水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないように水溶性であるべきである。最終生成物を治療用に使用する場合には、該重合体は、好ましくは、医薬上許容されるものである。該重合体／タンパク質結合体を治療用に使用するか否か、また、その場合の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およびその他の考慮事項に基づき、所望の重合体の選択が当業者において可能であろう。本タンパク質およびペプチドでは、誘導体化の有効性は、誘導体を所望の形態で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射または注入により、あるいは、例えば経口、肺または鼻内運搬のためにさらに製剤化することにより）投与し、生物学的効果を観察することにより（本明細書に記載のとおり）、確認することができる。該水溶性重合体は、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6- トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダムまたは非ランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリスチレンマレアートおよびポリビニルアルコールよりなる群から選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造上有利かもしれない。ポリアミノ酸をOBタンパタ質（または類似体）部分に結合させることにより、融合タンパク質を製造することができる。例えば、該ポリアミノ酸は、該タンパク質の循環半減期を増加させるように作用する担体タンパク質であり得る。本発明における治療目的または美容目的には、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原性応答や他の有害な応答を引き起こさないものであるべきである。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、抗体またはその一部（例えば、「Fc」と称されることがある抗体定常領域）または他のポリアミノ酸よりなる群から選択することができる。後記のとおり、該ポリアミノ酸の結合位置は、OBタンパク質部分のN末端、C末端または他の位置となろうし、化学的「リンカー」部分によりOBタンパク質に連結することができよう。該重合体は、いかなる分子量のものであってもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールでは、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さの点で、約2kDa〜約100kDaである（「約」なる語は、ポリエチレングリコール調製物のうち、ある分子は、示されている分子量より大きく、ある分子は小さいことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放性の持続時間、生物活性に対する存在する効果、取り扱い易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いることかできる。このように結合されるポリマー分子の数は、様々であることが可能であり、当業者であれば、機能に対するその効果を確認することができるであろう。モノ誘導体化を行なってもよいし、同じまたは異なる化学的部分（例えば、異なる重量のポリエチレングリコールなどの重合体）により、ジ−、トリ−、テトラ −誘導体化あるいは誘導体化のいくつかの組み合わせを行なってもよい。タンパク質（またはペプチド）分子に対する重合体分子の比率は、反応混合物中のそれらの濃度と同様、特に限定されるものではない。一般に、最適な比率（過剰な未反応タンパク質または重合体が存在しないという観点からの反応効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択した重合体の分子量、該重合体が分枝状か非分枝状か、反応条件などの因子により決定されることとなる。該化学的部分は、該タンパク質の機能ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮して、該タンパク質に結合させるべきである。多数の結合方法が当業者に利用可能であり、例えば、参照することにより本明細書に組入れるEP 0 401 3 84（G-CSFに対するPEGの結合）を参照されたい。また、Malikら，Exp．Hematol ．20:1028-1035(1992)（塩化トレシル(tresyl chloride)を用いるGH-CSFのポリエチレングリコール化を報告している）も参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、アミノ酸残基により反応性基（例えば、遊離アミノまたはカルボキシル基）を介して共有結合させることができる。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合しうる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リシン残基およびN末端アミノ酸残基を含めることができる。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端アミノ酸残基を含めることができる。また、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基を使用することができる。治療目的に好ましいのは、アミノ基における結合、例えば、N末端またはリシン基における結合である。受容体結合か望まれる場合には、受容体結合に重要な残基での結合は避けるべきである。 N末端で化学修飾されたタンパタ質か特に望ましい場合もある。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いると、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などにより）から、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、行なうポリエチレングリコール化反応の型、およびN末端がポリエチレングリコール化された選択したタンパク質の入手方法を選択することができる。N末端がポリエチレングリコール化された調製物の入手方法（すなわち、必要に応じて、他のモノポリエチレングリコール化部分からこの部分を分離すること）は、ポリエチレングリコール化されたタンパク質分子の集団から、N末端がポリエチレングリコール化された物質を精製することにより行なうことができる。選択的なN末端の化学修飾は、ある特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対N末端）を利用する還元的アルキル化により達成することかできる。適当な反応条件下で、カルボニル基含有重合体による、該タンパク質の実質的に選択的なN末端での誘導体化が達成される。例えば、該タンパク質のリシン残基のε-アミノ基とN末端残基のα-アミノ基との間のpKaの相違が利用可能なpHで反応を行なうことにより、該タンパク質のN末端を選択的にポリエチレングリコール化することができる。そのような選択的な誘導体化により、タンパク質に対する水溶性重合体の結合が制御される。すなわち、該重合体との結合は該タンパク質のN末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。還元的アルキル化を用いる場合は、該水溶性重合体は、前記のタイプのものであってもよく、該タンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有すべきである。単一の反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用することが可能である。治療剤の製造の容易さの点で、N末端がモノポリエチレングリコール化された誘導体が好ましい。N末端のポリエチレングリコール化の場合には、ジ−、トリ −または他の多ポリエチレングリコール化生成物に比べて生成物の特徴付けが単純化されるため、均一な生成物が保証される。N末端生成物の製造には、商業的製造の容易さのため、前記の還元的アルキル化方法を使用することが好ましい。複合体該OBタンパク質、類似体または誘導体は、結合組成物との複合体として投与することができる。そのような結合組成物は、該OBタンパク質、類似体または誘導体の循環時間を延長する効果を有する可能性がある。そのような組成物は、タンパク質（あるいは同義的にペプチド）であることが可能である。結合タンパク質の一例として、OBタンパク質受容体またはその一部（例えば、その可溶性部分）が挙げられる。血清中のOBタンパク質を調べることにより、あるいは結合の存在に関して実験的にスクリーニングすることにより、他の結合タンパク質を確認することができる。そのような結合は、典型的には、OB タンパク質または類似体または誘導体が内因性OBタンパク質受容体に結合し及び／又はシグナル伝達を引き起こす能力を損なわないであろう。医薬組成物本発明のさらに別の態様では、該タンパク質および誘導体の医薬組成物の使用方法を提供する。そのような医薬組成物は、注射投与用、または経口、肺内、鼻内、経皮または他の形態の投与用であってもよい。一般に、本発明のタンパク質または誘導体生成物の有効量と、医薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤および／または担体とを含んでなる医薬組成物が、本発明に包含される。そのような組成物は、種々の緩衝液含有物（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pHおよびイオン強度の希釈剤；洗浄剤および可溶化剤（例えば、Tw een 80、Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）、充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤；該物質が重合性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子状調製物内またはリポソーム内へ封入されたものを含む。また、ヒアルロン酸（hylauronic acid）を使用してもよく、これは、循環における持続化を促進する効果を有するかもしれない。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。例えば、参考として本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Sciences，第18版（1990，Mack Publishing o.，Easton，PA 18 042）第1435〜1712頁を参照されたい。該組成物は、液体形態または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形態）として製造することができる。移植可能な徐放製剤、および経皮製剤も意図される。参照することにより本明細書に組入れるRemington's Pharmaceutical Science s，第18版，1990(Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)第89章に一般的に記載されている経口固体投与形態の使用が、本発明で意図される。固体投与形態には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ、カシェ剤またはペレット剤が含まれる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入により、本組成物を製剤化することができる（例えば、米国特許第4,925,673号で報告されているプＬロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソーム封入を利用してもよく、また、種々の重合体で該リポソームを誘導体化してもよい（例えば、米国特許第 5,013,556号）。治療用の可能な固体投与形態の説明は、参照することにより本明細書に組入れるMarshall，K.，Modern Pharmaceutics，G.S．BankerおよびC.T ．Rhodes編，第10章，1979に記載されている。一般には、該製剤は、該タンパク質（または類似体もしくは誘導体）と、胃環境に対する保護しおよび生物学的活性物質を腸放出させる不活性成分とを含むであろう。また、前記の誘導体化されたタンパク質の経口投与形態が特に意図される。該誘導体の経口運搬が有効となるように、タンパク質を化学修飾することができる。意図される化学修飾は、一般には、（a）タンパク質分解の抑制および（b）胃または腸から血流中への取込みを可能にする少なくとも１つの部分を、タンパク質（またはペプチド）分子自体に結合させることである。また、該タンパク質の全安定度を増加させること、および体内循環時間を増加させることが望ましい。そのような部分には、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが含まれる。AbuchowskiおよびDavis，Soluble Polym er-Enzyme Adducts，"Enzymes as Drugs"，HocenbergおよびRoberts編，Wiley-I nterscience，New York，NY，(1981)，pp 367-383;Newmarkら，J．Appl．Bioche m．4:185-189(1982)を参照されたい。使用しうる他の重合体としては、ポリ-1,3 -ジオキソランおよびポリ-1,3,6-チオキソカン（tioxocane）が挙げられる。タンパク質（または誘導体）の場合、放出部位は、胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）、または大腸となろう。胃内で溶解しないが該物質を十二指腸またはその他の腸内部位で放出する製剤は、当業者において入手可能である。好ましくは、該タンパク質（または誘導体）を保護するか又は胃環境を越えた部位（例えば、腸内）で生物学的に活性な物質を放出するかのいずれかにより、その放出が胃環境の悪影響から回避される。完全な胃抵抗性を保証するためには、少なくともpH5.0まで不透過性であるコーティングが不可欠である。腸溶性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分としては、酢酸トリメリト酸セルロース（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテートフタレート(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、Eudragit L、Eudragit SおよびShellacが挙げられる。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用してもよい。コーティングまたはコーティング混合物はまた、錠剤上で使用することもでき、これらは、胃に対する保護を意図するものではない。これには、糖衣、または錠剤の飲み込みを容易にするコーティングを含めることができよう。カプセル剤は、乾燥した治療剤（すなわち粉末）を運搬するための硬い殻（例えば、ゼラチン）よりなるものであってもよく、液体形態の場合には、軟ゼラチン殻を使用してもよい。カシェ剤の殻物質は、濃厚なデンプンまたは他の可食性紙であってもよいであろう。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉末化物では、湿塊化（mo istmassing）技術を用いることができる。該治療剤は、粒径約１mmの顆粒剤またはペレット剤の形態の細かい多粒子（mu ltiparticulate）として製剤中に含まれていてもよい。また、カプセル剤で投与する場合には、粉末剤、軽く圧縮されたプラグとして又はさらには錠剤として、物質を製剤化することもできるであろう。該治療剤は、圧縮により調製することができるであろう。着色剤および香味剤がすべて含まれていてもよい。例えば、該タンパク質（または誘導体）を製剤化し（例えば、リポソームまたはミクロスフェア封入により）、ついでさらに、食用品（例えば、着色剤および香味剤を含有する冷却された飲料）中に含有させてもよい。該治療剤の容量を不活性物質で希釈または増加させてもよい。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを含めることができる。また、ある種の無機塩、例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを、充填剤として使用してもよい。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤としては、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、EmcompressおよびAvicellが挙げられる。該治療剤の固体投与形態への製剤化の場合、崩壊剤を加えてもよい。崩壊剤として使用する物質には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるExplotabなどのデンプンが含まれるが、これらに限定されるものではない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトはすべて使用可能である。崩壊剤のもう１つの形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤および結合剤として粉末ガムを使用してもよく、これらには、寒天、Karaya 、トラガカントなどの粉末ガムを含めることができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。結合剤は、治療剤を結合させて硬質の錠剤を形成させるのに使用することができ、結合剤には、アラビアゴム、トラガカント、デンプン、ゼラチンなどの天然産物由来の物質が含まれる。その他には、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）およびカルボキシメチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロリドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）は共に、該治療剤を顆粒化するためにアルコール性溶液中で使用することができるであろう。製剤化工程中の固着を防ぐために、該治療剤の製剤化において減摩剤を加えてもよい。該治療剤とダイ壁との間の層として滑沢剤を使用してもよく、これらには、ステアリン酸（そのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE ）、流動パラフィン、植物油およびワックスを含めることができるが、これらに限定されるものではない。また、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000などの可溶性滑沢剤を使用してもよい。製剤化中の薬物の流動特性を改善することが可能で圧縮中の再配列を補助する滑り剤（glidant）を加えてもよい。該滑り剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ、水化ケイ酸アルミニウム（hydrated silicoaluminate）を含めることができる。該治療剤が水性環境中に溶解するのを補助するために、湿潤剤として界面活性剤を加えてもよい。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性洗浄剤を含めることができる。陽イオン性洗浄剤を使用してもよく、これらには、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含めることができる。界面活性剤として製剤中に加えうる可能な非イオン性洗浄剤としては、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油10、 50および60、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート40、60、65および 80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に単独でまたは種々の比率の混合物として存在させることができるであろう。該タンパク質（または誘導体）の取込みを潜在的に増強する添加剤としては、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が挙げられる。徐放製剤が望ましいかもしれない。該薬物は、拡散または浸出のいずれかのメカニズムによる放出を許容する不活性マトリックス（すなわち、ガム）中に取込ませることができるであろう。また、徐々に変性するマトリックスを製剤中に取込ませてもよい。この治療剤の徐放のもう１つの形態は、浸透作用により単一の小さな開口から水が浸入し薬物を押し出させる半透膜中に該薬物を封入するOros 治療系（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。また、いくつかの胞溶性コーティングは徐放効果を有する。他のコーティングを製剤化に使用してもよい。これらには、コーティングパン内で適用しうる種々の糖が含まれる。また、該治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤として得ることもでき、この場合に用いる物質は、２つの群に分類される。１つめは、非腸溶性物質であり、これには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが含まれる。第２の群は、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質よりなる。最適なフィルムコーティングを得るために、物質の混合物を使用してもよい。フィルムコーティングは、パンコーター内または流動床内で、または圧縮コーティングにより行なってもよい。また、本タンパク質（またはその誘導体）の肺送達も本発明で意図される。該タンパク質（または誘導体）は、吸入されて哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層（lung epithelial lining）を越えて血流に入る。（これに関する他の報告には、Adjeiら，Pharmaceutical Research 7.：565-569(1990);Adjei ら，International Journal of Pharmaceutics 63:135-144（1990）(酢酸ロイプロリド);Braquetら，Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(増刊５):s． 143-146(1989)(エンドセリン−１);Hubbardら，Annals of Internal Medicine 3 :206-212（1989）(α1-抗トリプシン);Smithら，J．Clin．Invest．84:1145-114 6（1989）(α-1-プロテイナーゼ);Osweinら，"Aerosolization of Proteins",Pr oceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colora do，1990年３月(組換えヒト成長ホルモン);Debsら，The Journal of Immunology 140:3482-3488（1988）(インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子アルファ)およびPlatzら，米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)が含まれる）。該治療用生成物の肺送達用に設計された多種多様な機械装置（例えば、噴霧器、定量吸入器、粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られているものが含まれるが、これらに限定されるものではない）を本発明の実施で使用することが意図される。本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの具体例としては、 Mallinckrodt，Inc．（St．Louis，Missouri）製のUltravent噴霧器、Marquest Medical Products(Englewood，Colorado)製のA corn II噴霧器、Glaxo Inc.(Research Triangle Park，North Carolina)製のVen tolin定量吸入器およびFisons Corp．（Bedford，Massachusetts）製のSpinhale r粉末吸入器が挙げられる。このようないずれの装置においても、タンパク質（または類似体もしくは誘導体）の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置の型に特有のものであり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加えて、適当な噴射物質の使用を含むことがある。該タンパク質（または誘導体）は、遠位の肺への最も有効な送達のためには、 10mm（またはミクロン）未満、最も好ましくは0.5〜5mmの平均粒径を有する粒子形態で製造されるのが最も有利であるはずである。担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用する他の成分には、DPPC、DOPE、DSPCおよびDOPCを含めることができる。天然または合成界面活性剤を使用してもよい。ポリエチレングリコールを使用してもよい(これは、該タンパク質または類似体の誘導体化におけるその使用と独立していてもよい)。シクロデキストランなどのデキストランを使用してもよい。胆汁酸塩および他の関連した増強剤を使用してもよい。セルロースおよびセルロース誘導体を使用してもよい。アミノ酸（例えば、緩衝液の調製で使用したもの）を使用してもよい。また、リポソーム、マイクロカプセルまたはミクロスフェア、包接複合体、または他の型の担体の使用も意図される。噴霧器（ジェット式または超音波式のいずれか）と併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物学的に活性なタンパク質約0.1〜25mgの濃度で水に溶解したタンパク質（または誘導体）を含むであろう。また、該製剤は、緩衝剤および単純な糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節用のもの）を含んでいてもよい。また、エーロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制または予防するために、該噴霧製剤は界面活性剤を含有していてもよい。定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の助けをかりて噴射剤に懸濁したタンパク質（または誘導体）を含有する微細化粉末を含むであろう。該噴射剤は、この目的に用いる通常の任意の物質（クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、または炭化水素、例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、1,1,1,2-テトラフルオロエタンなど、またはそれらの組み合わせ）であってもよい。適当な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用かもしれない。粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、タンパク質（または誘導体）を含有する微細化乾燥粉末を含むであろう。また、該製剤には、その装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、該製剤の50〜90重量％）の増量剤（例えば、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトール）が含まれていてもよい。また、該タンパク質（または類似体もしくは誘導体）の鼻内送達も意図される。鼻内送達によれば、該治療用生成物を鼻へ投与した後、該生成物の肺内での沈着を要することなく、該タンパク質を直接血流へ通過させることが可能となる。鼻内送達用の製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを含有する製剤が含まれる。他の粘膜を通過する輸送を介した送達も意図される。投与当業者であれば、投与および所望の治療効果の観察により、有効な投与量を確認することができるであろう。本発明において、OB受容体に対する感受性を増加させる［例えば、OB受容体のリガンド（OBタンパク質）に対するOB受容体の親和性を増加させる、あるいはOBタンパク質受容体を「アップレギュレート」する］組成物もさらに投与すると、ある所定の効果に必要なOBタンパク質単独の投与量は減少するであろう。好ましくは、該分子の製剤化は、約0.10μｇ/kg/日〜100mg/kg/日で所望の治療効果が得られるように行なう。有効な投与量は、時間経過に対して診断手段を使用することにより決定することができる。例えば、まず、血液（または血漿または血清）中のOBタンパク質の量を測定するための診断を用いて、OBタンパク質の内因性レベルを測定してもよい。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形態であってもよい。まず、内因性OBタンパク質を定量し、基線を決定する。内因性および外因性のOBタンパク質（すなわち、自己産生されたか又は投与されたかのいずれかの、体内で見出されるタンパク質、類似体または誘導体）の定量を治療の経過中に継続しながら、治療量を決定する。したがって、該用量は、治療の経過中に変化させてもよく、最初は、治療上の利益が認められるまで比較的高い用量を用い、そして治療上の利益を維持するために、より低い投与量を用いることができる。理論的には、脂肪除外体重の減少のみを望む場合には、その用量は、体重減少を引き起こすには不十分であろう。したがって、肥満のヒトの最初の治療経過中は、体重の減少およびそれに伴う脂肪組織の減少／脂肪除外体重の増加が達成される投与用量であろう。十分な体重減少が達成されたら、体重が再び増加するのを防ぐのに十分であって、所望の脂肪除外体重の増加（または脂肋除外体重の減少（depletion）の予防）を維持するのに十分な用量を投与してもよい。OBタンパタ質の効果は可逆的であるため、これらの用量は実験的に決定することかできる（例えば、Campfieldら，Science 269：546-549(1995)p．547）。したがって、体重減少を望まない場合に、ある用量で体重減少が生じることが認められたら、所望の脂肪除外組織重量の増加を達成すると同時に所望の体重を維持するために、より低い用量を投与することとなろう。インスリンに対する個体の感受性を増加させるために、投与量に関する同様な考慮がなされよう。糖尿病の治療のために個体に投与するインスリン（または、潜在的には、アミリンまたは他の潜在的な糖尿病治療薬）の量を減少させるのに十分な、体重減少を伴わない脂肋除外体重の増加を達成することが可能である。全体的な強度を増強するために、投与量に関して同様な考慮がなされよう。全体的な強度の増強を伴う脂肋除外体重の増加は、体重減少を引き起こすには不十分な用量で達成することができよう。赤血球（血中の酸素化）の増加、骨吸収または骨粗髭症の軽減などの他の利点も、体重減少を伴うことなく達成することが可能である。組合せ本方法は、糖尿病の治療に有用な薬（例えば、インスリンおよび恐らくチアゾリジンジオン、アミリンまたはそれらのアンタゴニスト）、コレステロールおよび血圧降下薬（例えば、血中脂質レベルを減少させる薬物または他の心臓血管薬）、活動亢進薬（例えば、アンフェタミン）などの他の薬と共に用いてもよい。また、食欲抑制剤（例えば、セロトニンまたは神経ペプチドYのレベルに影響を及ぼすもの）を使用してもよい。そのような投与は、同時にまたは連続的に行なうことができる。さらに、本方法は、身体の全体的な外観を変えるよう意図された整容手術（例えば、体重を減少させるよう意図された脂肪吸引またはレーザー手術、あるいは見掛け体重を増加させるよう意図された移植手術）などの外科的方法と共に用いてもよい。動脈斑などの脂肪の沈着による血管の遮断阻害により引き起こされる有害な状態を緩和するよう意図された心臓手術（バイパス手術その他の手術）から得られる健康上の利益は、本組成物および方法の併用により増強されるかもしれない。また、超音波またはレーザー法などの胆石を除去する方法を、一連の本治療方法の前、間または後のいずれかで使用してもよい。さらに、本方法は、骨折、筋肉損傷の手術または療法、または脂肪除外組織量の増加により改善される他の療法の補助手段として用いることができる。したがって、本発明は、個体における機能的OBタンパク質受容体の利用能、親和性または感受性を増加させる組成物の有効量を投与することを含んでなる、OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体に対する感受性を該個体において増加させる方法を提供する。また、所望により、該方法は、OBタンパク質、その類似体または誘導体の同時または連続的な投与を含む。機能的OBタンパク質受容体の利用能または感受性を増加させる前記組成物は、チアゾリジンジオン組成物、2,4-チアゾリジンジオン、所望により置換されていてもよいチアゾリジンジオン、5-[4-[2-(5-メチル-2-フェニル-4-オキサゾリル) -2-ヒドロキシエトキシ]エンジル]-2,4-チアゾリジンジオン（AD-5070）、クロフィブラート、シグリタゾン、エングリタゾン、ピオグリタゾン、BRL 49653、トログリタゾン、M16209、オキサゾリジンジオンならびにチアゾリジンジオンまたは前記化合物の誘導体、類似体、互変異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、エピマー、塩、溶媒和物、エステル、プロドラッグおよび代謝産物から選択することができる。該OBタンパク質、その類似体または誘導体は、以下のものから選択することができる：（a）配列番号３（後記）または配列番号６（後記）に記載のアミノ酸配列１〜146；（b）35位にリシン残基を有し74位にイソロイシン残基を有する配列番号６（後記）に記載のアミノ酸配列１〜146；（c）4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78 、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142および145位（配列番号６の番号付けを使用しており、28位にグルタミニル残基が存在しない場合であっても同じ番号付けのままである）の１以上の位置で置換された異なるアミノ酸を有する（b）項のアミノ酸配列；（d）28位のグルタミニル残基が所望により欠けていてもよい（a）、（b）または（c）項のアミノ酸配列；（e）N末端にメチオニル残基を有する（a）、（b）、（c）または（d）項のアミノ酸配列；（f）トランケート化OBタンパク質類似体であって、以下の（i）〜（xi）（35 位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する配列番号６の番号付けを使用している）から選ばれるもの：（i）アミノ酸98〜146、（ii）アミノ酸１〜32、（iii）アミノ酸40〜116、（iv）アミノ酸１〜99および112〜146、（v）アミノ酸100〜111の１以上がアミノ酸99と112との間に順番に位置しているアミノ酸１〜99および112〜146、（vi）アミノ酸100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138 、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（i）項のトランケート化OB類似体、（vii）アミノ酸4、8および32の１以上が別のアミノ酸で置換されている（i i）項のトランケート化類似体、（viii）アミノ酸50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、 100、102、105、106、107、108、111および112の１以上が別のアミノ酸で置換されている（iii）項のトランケート化類似体、（vix）アミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71 、74、77、78、89、97、112、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（iv）項のトランケート化類似体、（x）アミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、7 4、77、78、89、97、100、102、105、106、 107、108、111、112、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（v）項のトランケート化類似体、および（xi）N末端メチオニル残基を有する（i）〜（x）項のいずれかのトランケート化類似体；（g）タンパク質部分に結合した化学的部分を含む、（a）〜（f）のいずれかのOBタンパク質または類似体誘導体；（h）該化学的部分が水溶性重合体部分である（g）項の誘導体；（i）該水溶性重合体部分がポリエチレングリコールである（h）項の誘導体；（j）該水溶性重合体部分がポリアミノ酸部分である（h）項の誘導体；（k）該水溶性重合体部分が該タンパク質部分のN末端のみに結合している（h ）項の誘導体；（l）医薬上許容される担体中の（a）〜（k）項のいずれかのOBタンパク質、類似体または誘導体。以下の実施例は、本発明をより完全に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１は、チアゾリジンジオン組成物が個体におけるOBタンパク質受容体の親和性または利用能を増加させ、それらの個体が、該OBタンパク質に対する増加した感受性を有することを示す、ヒトでの使用の予見的（prophetic）実施例である。それに続いて、「材料および方法」を記載する。実施例１体重の減少が望まれる肥満のヒト患者（BMI>27）がいる。OBタンパク質受容体の利用能を増加させるのに有効な量のチアゾリジンジオン組成物を、該患者に１週間投与する。ついで、該患者に、体重の減少を引き起こすのに十分な量のOBタンパク質またはその誘導体もしくは類似体を投与する。循環するOBタンパク質または類似体もしくは誘導体のレベルは、該OBタンパク質（または適用可能な他の抗原源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いてモニターすることができる。該患者の体重は減少し、所望の体重減少および／または脂肪量を得る。ついで、所望の体重および／または体脂肪レベルを維持するために、所望によりチアゾリジンジオン組成物と併用してOBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体を、所望の期間、慢性的に投与する。材料および方法タンパク質またはビヒクルの投与タンパク質：配列番号1、２および３は、マウス組換えOB DNAおよびタンパク質（図1）を記載しており、配列番号４、５および６は、類似体組換えヒトOB DN Aおよびタンパク質（図2）を記載している。35位にリシン残基を有し74位にイソロイシン残基を有する配列番号６の組換えヒトタンパク質を実施例１で使用した。前記のとおり、以下のマウスおよびヒト類似体組換えタンパク質は、本発明の治療方法および医薬の製造法で使用しうるOBタンパタ質の例示にすぎない。他の OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体も使用することができる。ここでは、組換えタンパタ質のアミノ酸配列の最初のアミノ酸を＋1とし、それはバリンである。−１位のアミノ酸はメチオニンである。C末端アミノ酸は146 番目（システイン）である。製造法生物学的に活性な組換えメチオニルマウスまたはヒト類似体OBタンパタ質を製造するために、以下の製造法を用いた。生物学的に活性な組換えメチオニルヒト OBタンパク質を製造するために、同様の方法を用いることができる。発現ベクターおよび宿主株使用したプラスミド発現ベクターは、pCFM1656（ATCC受託第69576号）である。前記DNAを、XbaIおよびBamHIで線状化された発現ベクターpCFM1656中に連結し、大腸菌（E．coli）宿主株FM5中に形質転換した。大腸菌（E．coli）FM5細胞は、Amgen Inc．（Thousand Oaks，CA）において、大腸菌K-12株から誘導した（Ba chmannら，Bacteriol．Rev．40:116-167(1976)）。該細胞は、組込まれたλファージリプレッサー遺伝子cI₈₅₇を含有する(Sussmanら，C.R．Acad．Sci．254:151 7-1579(1962))。ベクターの産生、細胞の形質転換およびコロニーの選択は、標準的な方法により行なった。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Labora tory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Ha rbor，NYを参照されたし。宿主細胞をLB培地中で増殖させた。発酵方法フェド・バッチ法として公知の三相発酵プロトコールを用いた。培地組成は以下に記載する。バッチ：発酵容器（Biolafitte，12リットル容量）中、窒素およびリン酸源を滅菌した（18〜20psiで35分問、122℃まで昇温することによる）。冷却すると同時に、炭素、マグネシウム、ビタミンおよび微量金属源を無菌的に加えた。前記の組換えマウスタンパタ質を産生する細菌の一晩培養物（16 時間以上、500mL）（LB培地中で増殖させたもの）を、その発酵槽へ加えた。フィードI：4.0〜6.0 OD₆₀₀に達したら、培養にフィードIを供給した。増殖速度（m）を制御するために、グルコースは、供給速度を制限して供給した。増殖速度を0.15世代／時間に制御するように自動化システム（Distributive Control Systemと称される）に指令した。フィードII：OD₆₀₀が30に達したら、培養温度をゆっくりと42℃まで増加させ、供給を以下のフィードIIに変えた。２時間毎にサンプリングしながら、該発酵を10時間続けた。10時間後、該発酵槽の内容物を20℃未満に冷却し、遠心分離により収穫した。培地組成：バッチ： 10g/L 酵母エキス 5.25g/L (NH₄)₂SO₄ 3.5g/L K₂HPO₄ 4.0g/L KH₂PO₄ 5.0g/L グルコース 1.0g/L MgSO₄・7H₂O 2.0mL/L ビタミン溶液 2.0mL/L 微量金属溶液 1.0mL/L P2000消泡剤フィードI： 50g/L バクト−トリプトン（Bacto-tryptone） 50g/L 酵母エキス 450g/L グルコース 8.75g/L MgSO₄・7H₂O 10mL/L ビタミン溶液 10mL/L 微量金属溶液フィードII： 200g/L バクト−トリプトン（Bacto-tryptone） 100g/L 酵母エキス 110g/L グルコースビタミン溶液（バッチおよびフィードI）： 0.5gのビオチン、0.4gの葉酸および4.2gのリボフラビンを、450mlのH₂Oおよび 3mlの10N NaOHに溶解し、H₂O中で500mLとした。14gのピリドキシン−HClおよび6 1gのナイアシンを150mlのH₂Oおよび50mlの10N NaOHに溶解し、H₂O中で250mLとした。54gのパントテン酸を200mLのH₂Oに溶解し、250mLとした。その３つの溶液を合わせ、10リットルの合計容量とした。微量金属溶液（バッチおよびフィードI）：塩化第二鉄（FeCl₃・6H₂O）：27g/L 塩化亜鉛（ZnCl₂・4H₂O）：2g/L 塩化コバルト（CoCl₂・6H₂O）：2g/L モリブデン酸ナトリウム（NaMoO₄・2H₂O）：2g/L 塩化カルシウム（CaCl₂・2H₂O）：1g/L 硫酸第二銅（CuSO₄・5H₂O）：1.9g/L ホウ酸（H₃BO₃）：0.5g/L 塩化マンガン（MnCl₂・4H₂O）：1.6g/L クエン酸ナトリウム二水和物：73.5g/L マウスOBタンパク質の精製方法精製は、以下の工程により行なった（特に示さない限り、以下の工程は４℃で行なった）。１．細胞ペースト大腸菌（E．coli）細胞ペーストを５倍容量の７mMのEDTA（pH7.0）に懸濁した。そのEDTA中の細胞を、ミクロフルイダイザー（microfluidizer）に２回通過させることにより、さらに破壊した。その破壊された細胞を、JS-4.2ローターの付いたBeckman J6-B遠心機中、4.2Krpmで１時間遠心分離した。２．封入体の洗浄：１回目前記からの上清を除去し、ペレットを、５倍容量の７mM EDTA（pH7.0）に再懸濁し、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。３．封入体の洗浄：２回目前記からの上清を除去し、ペレットを、10倍容量の20mMトリス（pH8.5）、10m M DTTおよび1％デオキシコラートに再懸濁し、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。４．封入体の洗浄：３回目前記からの上清を除去し、ペレットを、10倍容量の蒸留水に再懸濁し、ホモジナイズした。この混合物を、工程１と同様に遠心分離した。５．再生該ペレットを15容量の10mMヘペス（pH8.5）、１％サルコシンナトリウム（N- ラウロイルサルコシン）で室温にて再生させた。60分後、この溶液が60μＭ硫酸銅となるようにし、ついで一晩攪拌した。６．サルコシンの除去その再生混合物を５容量の10mMトリス緩衝液（pH7.5）で希釈し、工程１と同様にして遠心分離した。該上清を集め、１時 MI）（20〜50メッシュ、塩化物形態、希釈された再生混合物しい情報については、WO89/10932の第26頁を参照されたい。この混合物をカラムに注ぎ、溶出液を集めた。サルコシンの除去は、逆相HPLCで確認した。７．酸の沈殿前記工程からの溶出液を集め、pHを5.5に調整し、室温で30分間インキュベートした。この混合物を工程１と同様にして遠心分離した。８．陽イオン交換クロマトグラフィー前工程からの上清のpHを4.2に調整し、CM Sepharose Fast Flow上にローディングした（７％容量にて）。20mM NaOAc（pH4.2）、0Mから1.0MのNaClにより、2 0カラム容量の塩勾配に付した。９．疎水性相互作用クロマトグラフィー前記工程からのピーク画分（紫外線吸光度から確認）のCM Sepharoseプールを、0.2M硫酸アンモニウムとした。5mM NaOAc（pH4.2）にて0.4Mから0Mの硫酸アンモニウムにより、20カラム容量の逆塩勾配に付した。この物質を濃縮し、PBS中にダイアフィルトレーションした。組換えヒトOBタンパク質類似体の発酵：組換えヒトOBタンパク質類似体（配列番号6）を製造するための前記宿主細胞の発酵は、組換えマウス物質に関して前記したのと同じ条件および組成を用いて行なうことができる。組換えヒトOBタンパク質類似体の精製：組換えヒトタンパク質類似体は、前記の組換えマウスタンパク質の精製で用いたのと同様の方法により精製することができる。組換えヒトOBタンパタ質類似体の製造では、工程７からの上清のpHを5.0に調整し、これをCM Sepharose高速流動カラム上にローディングすることにより、工程８を行なうべきである。20カラム容量塩勾配は、20mM NaOAc（pH5.5）、0Mから0.5MのNaClで行なうべきである。工程９は、CM Sepharoseプールを水で４倍希釈し、pHを7.5に調整することにより行なうべきである。この混合物は、0.7M硫酸アンモニウムとすべきである。 20カラム容量の逆塩勾配を、5mM NaOAc（pH5.5）、0.2Mから0Mの硫酸アンモニウムで行なうべきである。それ以外は、前記の工程と同じである。リシン35およびイソロイシン74を有する配列番号６の組換えヒトOBタンパク質を、10mMヒスチジン、4.3％アルギニンを含有する緩衝液（pH6.0）中に製剤化した。本発明は好ましい実施態様に関して記載されているが、その変更および修飾が当業者において見出されると理解される。したがって、添付の請求の範囲は、特許請求されている発明の範囲内にあるそのような均等なすべての変更を包含すると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 9/10 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．個体内の機能的OBタンパク質受容体の親和性または利用能を増加させる組成物を投与することを含んでなる、OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体に対する感受性を該個体において増加させる方法であって、所望により、該OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体の投与と組合せることを特徴とする方法。２．機能的OBタンパク質受容体の親和性または利用能を増加させる前記組成物がチアゾリジンジオン組成物である、請求項１に記載の方法。３．該OBタンパク質またはその類似体もしくは誘導体が、（a）配列番号３または配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜146；（b）35位にリシン残基を有し74位にイソロイシン残基を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列１〜146；（c）4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78 、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142および145位（配列番号４の番号付けを使用している）の１以上の位置で置換された異なるアミノ酸を有する（b）項のアミノ酸配列；（d）28位のグルタミニル残基が所望により欠けでいてもよい（a）、（b）または（c）項のアミノ酸配列；（e）N末端にメチオニル残基を有する（a）、（b）、（c）または（d）項のアミノ酸配列；（f）トランケート化OBタンパク質類似体であって、以下の（i）〜（xi）（35 位にリシンを有し74位にイソロイシンを有する配列番号６の番号付けを使用している）から選ばれるもの：（i）アミノ酸98〜146、（ii）アミノ酸１〜32、（iii）アミノ酸40〜116、（iv）アミノ酸１〜99および112〜146、（v）アミノ酸100〜111の１以上がアミノ酸99と112との間に順番に位置しているアミノ酸１〜99および112〜146、（vi）アミノ酸100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138 、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（f）（i）項のトランケート化OB類似体、（vii）アミノ酸4、8および32の１以上が別のアミノ酸で置換されている（f ）（ii）項のトランケート化類似体、（viii）アミノ酸50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、 100、102、105、106、107、108、111および112の１以上が別のアミノ酸で置換されている（f）（iii）項のトランケート化類似体、（vix）アミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71 、74、77、78、89、97、112、118、136、138、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（f）（iv）項のトランケート化類似体、（x）アミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、7 4、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138 、142および145の１以上が別のアミノ酸で置換されている（f）（v）項のトランケート化類似体、および（xi）N末端メチオニル残基を有する（f）（i）〜（x）項のいずれかのトランケート化類似体；（g）タンパク質部分に結合した化学的部分を含む、（a）〜（f）のいずれかのOBタンパク質または類似体誘導体；（h）該化学的部分が水溶性重合体部分である（g）項の誘導体；（i）該水溶性重合体部分がポリエチレングリコールである（h）項の誘導体；（j）該水溶性重合体部分がポリアミノ酸部分である（h）項の誘導体；（k）該水溶性重合体部分が該タンパク質部分のN末端のみに結合している（h ）項の誘導体；（l）医薬上許容される担体中の（a）〜（k）項のいずれかのOBタンパタ質、類似体または誘導体から選ばれる、請求項１または２に記載の方法。４．該投与が、過剰体重、糖尿病、高血中脂質レベル、動脈硬化症、動脈斑、胆石形成の軽減または予防、不十分な脂肪除外組織量、インスリンに対する不十分な感受性、および卒中から選ばれる状態を治療するためのものである、請求項１、２または３に記載の方法。