SK287578B6

SK287578B6 - Proteín, sekvencia nukleovej kyseliny, vektor, hostiteľská bunka, spôsob produkcie proteínu a jeho použitie na výrobu liečiva, farmaceutická kompozícia

Info

Publication number: SK287578B6
Application number: SK774-99A
Authority: SK
Inventors: Michael Benjamin Mann; Randy Ira Hecht
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2011-03-04
Also published as: NO992779L; NO992779D0; YU27999A; JP4659068B2; NO325096B1; PL334242A1; BG64288B1; AU5606098A; IL130396A; KR20000069617A; PL194159B1; RS49927B; BR9713755A; EA004791B1; ZA9711239B; IL130396A0; CN1246154A; AR009436A1; EP1835030A1; NO20071415L

Abstract

Proteín všeobecného vzorca R1-R2 alebo R1-L-R2, kde R1 predstavuje Fc časť imunoglobulínu; L predstavuje linker; R2 predstavuje OB proteín. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca tento proteín. Vektor pAMG21 uložený pod číslom ATCC 98113. Hostiteľská bunka obsahujúca tento vektor. Spôsob produkcie tohto proteínu zahŕňajúci kultiváciu hostiteľskej bunky a izoláciu vyrobeného proteínu. Farmaceutická kompozícia s obsahom tohto proteínu a jeho použitie na výrobu liečiva na liečenie nadmernej telesnej hmotnosti, diabetes, vysokej hladiny lipidov v krvi, arteriosklerózy a arteriálneho plátu, na redukciu alebo prevenciu vzniku žlčových kameňov a na liečenie nedostatočnosti tkaniva tvorenej v podstate svalovinou neobsahujúcou tuk, nedostatočnej citlivosti na inzulín a mŕtvice.

Description

Vynález sa týka Fc-OB fúzneho proteínu, sekvencie nukleovej kyseliny, vektora, hostiteľskej bunky, spôsobu produkcie proteínu a jeho použitia na výrobu liečiva a farmaceutickej kompozície na báze tohto proteínu.

Doterajší stav techniky

Hoci je molekulárny základ obezity z veľkej časti neznámy, identifikácia „OB génu“ a kódovaného proteínu („OB proteínu“ čiže „leptínu“) do určitej miery osvetlila mechanizmus, ktorý organizmus používa na reguláciu ukladania telesného tuku - pozri PCT publikáciu WO 96/05309 (12/22/96), Friedman et al.; Zhang et al., Náture 372, str. 425 až 432 (1994) a tiež Correction at Náture 374, str. 479 (1995). OB proteín je aktívny in vivo tak pri mutantných myšiach ob/ob (myši, pri ktorých je príčinou obezity defekt v produkcii produktu OB génu), ako pri normálnych myšiach divokého typu. Biologická aktivita sa manifestuje okrem iných stratou hmotnosti. Všeobecne pozri Barrinaga, „Obese“ Proteín Slims Mice, Science 269, str. 475 až 456 (1995). OB proteín, jeho deriváty a ich použitie ako modulátorov kontroly hmotnosti a adipozity pri živočíchoch, ako pri cicavcoch a ľuďoch, sú veľmi podrobne opísané v PCT publikácii WO 96/05309 (12/22/96), ktorá tu je citovaná náhradou na prenesenie celého jej obsahu, vrátane obrázkov, do tohto textu.

Ostatné biologické účinky OB proteínu nie sú dobre charakterizované. Je napríklad známe, že pri ob/ob mutantných myšiach podávanie OB proteínu vedie k zvýšeniu hladiny inzulínu v sére a hladiny glukózy v sére. Je rovnako známe, že podávanie OB proteínu vedie k zníženiu hladiny sérového inzulínu a sérovej glukózy. Je tiež známe, že podávanie OB proteínu má za následok zníženie telesného tuku. To bolo zistené tak pri ob/ob mutantných myšiach, ako pri neobéznych normálnych myšiach. (Pozri Pelleymounter et al., Science 269, str. 540 až 543, 1995; Halaas et al., Science 269, str. 543 až 546, 1995 a ďalej Campfield et al., Science 269, str. 546 až 549, 1995, Peripheral and centrál administration of microgram doses of OB proteín reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice.) Podľa žiadnej z týchto správ nebola pozorovaná toxickosť, a to ani pri najvyšších dávkach.

Cez prísľub klinického využitia OB proteínu nie je mechanizmus jeho pôsobenia in vivo celkom objasnený. Informácie o OB receptore ukazujú vysokú väzbovú afinitu k OB proteínu zistenom v hypotalame potkana, čo dokazuje umiestnenie OB receptora - pozri Stephens et al., Náture 377, str. 530 až 532. Myš db/db má rovnaký fenotyp ako myš ob/ob, t. j. extrémnu obezitu a diabetes typu II. Predpokladá sa, že k tomuto fenotypu vedie defektný OB receptor, najmä preto, že myši db/db neodpovedajú na podávanie OB proteínu (pozri Stephens, uvedená citácia).

Pokrok dosiahnutý v technológiách s rekombinantnou DNA, ktorý zvýšil dostupnosť rekombinantných proteínov pre terapeutické použitia, sa odrazil v rozvoji formulácie a chemickej modifikácie proteínov. Jedným z cieľov takej modifikácie je ochrana proteínu a zníženie jeho degradácie. Fúzne proteíny a chemické pripojenia môžu účinne blokovať fyzický kontakt proteolytického enzýmu s hlavným reťazcom proteínu, a tak brániť degradácii. Ako ďalšie výhody je za určitých okolností možné uviesť zvýšenie stability, času cirkulácie a biologickej aktivity terapeutického proteínu. Prehľadný opis modifikácie proteínov a fúznych proteínov je možné nájsť v Francis, Focus on Growth Factors 3, str. 4 až 10 (máj 1992), vyd. Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lane, Londýn N20, OLD, Veľká Británia.

Jednou z takých modifikácií je použitie Fc regiónu imunoglobulínov. Protilátky obsahujú dve funkčne nezávislé časti, variabilnú doménu, známu ako „Fab“, ktorá viaže antigén, a konštantnú doménu, známu ako „Fc“, ktorá poskytuje spojenia na efektorové funkcie, ako komplementu alebo fagocytov. Fc časť imunoglobulínu má dlhý polčas v plazme, zatiaľ čo Fab časť má polčas krátky (Capon et al., Náture 337, 525 až 531, 1989).

Terapeutické proteínové produkty boli skonštruované pri použití Fc domény, aby sa dosiahol dlhší polčas alebo začlenenie funkcií, ako je väzba Fc receptora, väzba proteínu A, fixácia komplementu a priestup placentou, ktoré všetky náležia Fc proteínom imunoglobulínov. Tak napríklad bola fúzovaná Fc oblasť protilátky IgGl s N-terminálnym koncom CD30-L, molekuly, ktorá viaže receptory CD30 exprimované na nádorových bunkách Hodgkinovho nádoru, bunkách anaplastického lymfómu, leukemických T-bunkách a malígnych bunkách iných typov (pozri US patent č. 5 480 981). IL-10, protizápalové činidlo a látka znižujúca odmietavú reakciu, bol na účely zvýšenia polčasu cirkulácie cytokínu fúzovaný s myšou Fcr2a (Zheng, X. et al., The Joumal of Immunology, 154: 5590 až 5600, 1995). Boli tiež spracované štúdie hodnotiace použitie receptora faktora nekrózy nádorov viazaného s Fc proteínom ľudského IgGl pri liečení pacientov postihnutých septickým šokom (Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334, 1697 až 1702, 1996; Van Zee, K. et al., The Joumal of Immunology, 156, 2221 až 2230, 1996). Fc bol tiež fúzovaný s receptorom CD4 za vzniku terapeutického proteínu na liečenie AIDS (pozri Capon et al., Náture, 337, 525 až 531, 1989). Okrem toho bol na účely prekonania krátkeho polčasu interleukinu 2 a jeho systemickej toxicity fúzovaný N-koniec interleukinu 2 s Fc časťou IgGl alebo IgG3 (pozri Harvill et al., Immunotechnology, 1, 95 až 105, 1995).

Vzhľadom na to, že OB proteín bol identifikovaný ako sľubný terapeutický proteín, vznikla potreba vyvinúť kompozície na báze OB analógu na klinické použitie, ktoré by sa podávali spolu s OB proteínom alebo namiesto neho. Tento vývoj by mohol byť zameraný na kompozície na báze OB analógu, pri ktorom by sa formuláciami a chemickými modifikáciami proteínov dosiahlo zníženie degradácie proteínu, zvýšenie stability a času cirkulácie. Také kompozície sú predmetom tohto vynálezu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je proteín všeobecného vzorca (R_rR₂) alebo (R_rL-R₂), kde R] predstavuje Fc časť imunoglobulínu; L predstavuje linker; a R₂ predstavuje OB proteín. Proteín podľa vynálezu je podrobnejšie definovaný. Predmetom vynálezu je ďalej sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej tento proteín, vektor pAMG21 uložený pod číslom ATCC 98113 a hostiteľská bunka obsahujúca tento vektor. Predmetom vynálezu je aj spôsob produkcie tohto proteínu zahŕňajúci kultiváciu hostiteľskej bunky a izoláciu vyrobeného proteínu, farmaceutická kompozícia s obsahom tohto proteínu a použitie tohto proteínu na výrobu liečiva na liečenie ďalej špecifikovaných porúch.

Predmetom vynálezu je predovšetkým genetický fúzny proteín, ktorý obsahuje Fc časť imunoglbulínu fuzovanú s N-terminálnou oblasťou OB proteínu. Fc-OB fúzny proteín je schopný dimerizácie na cysteínových zvyškoch Fc oblasti. Neočakávane sa ukázalo, že genetická fuzna modifikácia s Fc na N-konci OB proteínu je výhodná z hľadiska stability, rýchlosti clearance a zníženia degradácie. Tieto výhody sa pri OB proteíne alebo pri fúzii Fc s C-koncom OB proteínu nedosiahnu. Prekvapivé a dôležité je zistenie, že v porovnaní s OB proteínom alebo Fc modifikáciou na C-konci OB proteínu, modifikácia na N-konci OB proteínu poskytuje neočakávanú ochranu proteínu pred degradáciou, predĺžený čas cirkulácie a zvýšenú stabilitu. Tieto neočakávané výhody vyplývajúce z Fc modifikácie OB proteínu by pre konzumentov OB proteínu boli prospešné, pretože tieto zmeny prispievajú k požadovanému zníženiu dávok alebo nižšej frekvencie podávania. Tento vynález, ako je podrobnejšie opísané, má teda rad aspektov spojených s genetickou modifikáciou proteínov prostredníctvom fúzie Fc oblasti s OB proteínom (alebo jeho analógom), ako tiež so špecifickými modifikáciami, spôsobmi výroby a použitia.

Podľa jedného aspektu je predmetom vynálezu Fc-OB fúzny proteín, v ktorom je Fc oblasť geneticky fúzovaná s N-koncom OB proteínu (alebo jeho analógu). Okrem toho, ako je známe odborníkom v tomto odbore, môže byť Fc oblasť pripojená k N-koncu OB proteínu (alebo jeho analógu) prostredníctvom peptidového alebo chemického linkera. Ako už bolo poznamenané a je podrobnejšie opísané, Fc-OB fúzny proteín má neočakávanú ochranu proti degradácii, predĺžený čas cirkulácie a zvýšenú stabilitu v porovnaní s OB proteínom alebo C-terminálnymi OB-Fc fuznymi proteínmi. Podľa ďalších aspektov sú teda predmetom vynálezu nielen kompozície na báze Fc-OB fúzneho proteínu, ale tiež DNA sekvencie kódujúce také proteíny, príslušné vektory a hostiteľské bunky obsahujúce také vektory, ktoré sú užitočné na produkciu fúznych proteínov podľa vynálezu.

Ďalším predmetom tohto vynálezu sú spôsoby prípravy Fc-OB fuzneho proteínu. Tieto postupy zahŕňajú postupy s rekombinantnou DNA na prípravu rekombinantných proteínov a ďalej spôsoby fermentácie a purifikácie.

Fc-OB fúzny proteín podľa vynálezu je možné použiť na liečenie nadváhy osôb alebo živočíchov, pri ktorom sa podávaním znižuje ukladanie tuku. Vzhľadom na vlastnosti Fc-OB fuzneho proteínu sa pri tomto spôsobe môže znížiť množstvo a/alebo frekvencia podávania OB proteínu.

Fc-OB fúzny proteín podľa vynálezu je tiež možné použiť na liečenie chorobných stavov spojených s nadbytkom tukového tkaniva, ako je diabetes, dys- alebo hyperlipidémia, arteriálna skleróza a arteriálny plát, spôsob redukcie alebo prevencie tvorby žlčových kameňov, liečenie mŕtvice a rovnako spôsob zvyšovania citlivosti na inzulín a/alebo zvyšovania hmoty tkanív tvorených prevažne svalovinou bez tuku.

Podľa ďalšieho aspektu sú predmetom vynálezu farmaceutické kompozície na báze Fc-OB proteínov a analógov a ich derivátov na použitie pri liečení uvedených stavov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1A a IB je znázornená rekombinantná myšia metOB (dvojreťazcová) DNA (SEQ ID NO: 1 a 2) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID: NO: 3), pričom obr. 1A zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240 a obr. IB zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 454.

Na obr. 2A a 2B je znázornený rekombinantný ľudský metOB analóg DNA (dvojreťazcovej) (SEQ ID NO: 4 a 5) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 6), pričom obr. 2A zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240 a obr. 2B zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 454.

Na obr. 3A-1 až 3C je znázornená rekombinantná ľudská metFc-OB (dvojreťazcová) DNA (SEQ ID NO: 7 a 8) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 9). Obr. 3A-1 pritom zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240, obr. 3A-2 zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 540, obr. 3B-1 zobrazuje nukleové kyseliny 541 až 780, obr. 3B-2 zobrazuje nukleové kyseliny 781 až 1080 a obr. 3C zobrazuje nukleové kyseliny 1081 až 1150.

Na obr. 4A-1 až 4C je znázornený rekombinantný ľudský metFc-OB variant (dvojreťazcová) DNA (SEQ ID NO: 10 a 11) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 12). Obr. 4A-1 pritom zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240, obr. 4A-2 zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 540, obr. 4B-1 zobrazuje nukleové kyseliny 541 až 780, obr. 4B-2 zobrazuje nukleové kyseliny 781 až 1080 a obr. 4C zobrazuje nukleové kyseliny 1081 až 1150.

Na obr. 5A-1 až 5C je znázornený rekombinantný ľudský metFc-OB variant (dvojreťazcová) DNA (SEQ ID NO: 13 a 14) a sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 15). Obr. 5A-1 pritom zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240, obr. 5A-2 zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 540, obr. 5B-1 zobrazuje nukleové kyseliny 541 až 780, obr. 5B-2 zobrazuje nukleové kyseliny 781 až 1080 a obr. 5C zobrazuje nukleové kyseliny 1081 až 1135.

Na obr. 6A-1 až 6C je znázornený rekombinantný ľudský metFc-OB variant (dvojreťazcová) DNA (SEQ ID NO: 16 a Uja sekvencia aminokyselín (SEQ ID NO: 18). Obr. 6A-1 pritom zobrazuje nukleové kyseliny 1 až 240, obr. 6A-2 zobrazuje nukleové kyseliny 241 až 540, obr. 6B-1 zobrazuje nukleové kyseliny 541 až 780, obr. 6B-2 zobrazuje nukleové kyseliny 781 až 1080 a obr. 6C zobrazuje nukleové kyseliny 1081 až 1135.

Nasleduje podrobnejší opis vynálezu.

Predmetom vynálezu sú kompozície na báze Fc-OB fúzneho proteínu, spôsoby prípravy takých kompozícií a ich použitie. Konkrétne sa vynález týka genetickej alebo chemickej fúzie Fc oblasti imunoglobulínu s N-terminálnou oblasťou OB proteínu. Neočakávane sa zistilo, že fúzia Fc na N-koniec OB proteínu má výhody, ktoré OB protein alebo fúzia Fc na C-koniec OB proteínu nemá. N-terminálna Fc modifikácia OB proteínu mu prekvapivo poskytuje neočakávanú ochranu pred degradáciou, predĺžený čas cirkulácie a zvýšenú stabilitu. Fc-OB fúzny protein, jeho analógy a ich deriváty, ako tiež spôsoby použitia a prípravy sú podrobnejšie opísané.

Látky

Fc sekvencia rekombinantnej humánnej Fc-OB sekvencie uvedená v SEQ ID NO: 9 (pozri obr. 3) môže byť zvolená zo súboru skladajúceho sa z ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu IgG-1 (pozri Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071 až 4079, 1982) alebo akejkoľvek inej Fc sekvencie známej v tomto odbore (napríklad IgG iných tried, ktorých neobmedzujúcimi príkladmi sú IgG-2, IgG-3 a IgG-4 alebo iné imunoglbulíny). Varianty, analógy alebo deriváty Fc časti môžu byť skonštruované napríklad rôznymi zámenami zvyškov alebo sekvencií.

Cysteínové zvyšky je možné odstrániť alebo nahradiť inými aminokyselinami, aby sa zabránilo vytvoreniu disulfidových priečnych väzieb v Fc sekvencií. Konkrétne, aminokyselinou v polohe 5 SEQ. ID. NO: 9 je cysteínový zvyšok. Rekombinantnou Fc-OB sekvenciou (SEQ. ID. NO: 9) je 378-aminokyselinový Fc-OB protein (keď sa neráta metionínový zvyšok). Prvá aminokyselina sekvencie rekombinantného Fc-OB proteínu z obr. 3 je označovaná ako +1 s metionínom v polohe -1.

Cysteín v polohe 5 je možné odstrániť alebo nahradiť jednou aminokyselinou alebo väčším počtom aminokyselín. Cysteínový zvyšok v polohe 6 je možné nahradiť alanínom, čím sa získa variantná aminokyselinová sekvencia znázornená na obr. 4 (SEQ. ID. NO. 12). Rekombinantným Fc-OB proteínom z obr. 4 je 378-aminokyselinový Fc-OB (nerátajúc metionínový zvyšok). Prvá aminokyselina sekvencie pre rekombinantný Fc-OB protein z obr. 4 je označovaná ako +1 s metionínom v polohe - L

Podobne by cysteín v polohe 5 SEQ. ID. NO: 9 mohol byť nahradený serínom alebo zvyškom inej aminokyseliny alebo vypustený. Variant alebo analóg je tiež možné pripraviť deléciou aminokyselín v polohách 1, 2, 3, 4 a 5, ako je to napríklad pri variante v SEQ. ID. NO. 15 (pozri obr. 5). Zvyšky v týchto polohách je tiež možné nahradiť, a také substitúcie patria do rozsahu tohto vynálezu. Rekombinantný Fc-OB protein z obr. 5 je Fc-OB proteínom s 373 aminokyselinami (nerátajúc metionínový zvyšok). Prvá aminokyselina sekvencie pre rekombinantný Fc-OB protein z obr. 5 je označovaná ako +1 s metionínom v polohe -1.

Modifikácie je tiež možné uskutočňovať na účely zavedenia štyroch aminokyselinových substitúcií na odstránenie väzbového miesta Fc receptora a väzbového miesta komplementu (Clq). Tieto variantné modifikácie z SEQ. ID. NO: 15 by zahŕňali nahradenie leucínu v polohe 15 kyselinou glutámovou, nahradenie kyseliny glutámovej v polohe 98 alanínom a nahradenie lyzínu v polohách 100 a 102 alanínom (pozri obr. 6 a SEQ. ID. NO: 18). Rekombinantný Fc-OB protein z obr. 6 je Fc-OB proteínom s 373 aminokyselinami (nerá tajúc metionínový zvyšok). Prvá aminokyselina sekvencie pre rekombinantný Fc-OB proteín z obr. 6 je označená ako +1 s metionínom v polohe -1.

Podobne je jeden alebo viac tyrozínových zvyškov možné nahradiť fenylalanínovými zvyškami. Okrem toho je možné uskutočniť iné variantné inzercie, delécie a/alebo substitúcie aminokyselín, ktoré rovnako patria do rozsahu tohto vynálezu. Ďalej prichádzajú do úvahy alterácie vo forme alterovaných aminokyselín, ako sú peptidomimetika alebo D-aminokyseliny. Fc proteín je tiež možné naviazať na OB proteíny Fc-OB proteínu pomocou „linkerových“ zvyškov, ktorými sú buď zvyšky chemických zlúčenín, alebo zvyšky aminokyselín s rôznou dĺžkou. Také chemické linkery sú odborníkom v tomto odbore dobre známe. Ako neobmedzujúce príklady sekvencií aminokyselinových linkerov je možné uviesť:

(a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala, ala;

(c) ala, ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly;

(f) gly, gly, gly, gly, gly;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly, gly, pro, gly, gly; a (j) ktorúkoľvek kombináciu (a) až (i).

OB časť: Fc-OB fúzneho proteínu môže byť zvolená zo súboru skladajúceho sa z rekombinantného myšieho proteínu opísaného v SEQ. ID. NO: 3 (pozri obr. 1) a rekombinantného ľudského proteínu uvedeného v Zhang et al., Náture, pozri skôr a proteínu zhodného s týmto proteínom, ktorý však v polohe 28 nemá glutaminylový zvyšok (pozri Zhang et al., Náture, pozri skôr, str. 428). Rovnako je možné použiť analóg rekombinantného ľudského OB proteínu, ktorý je uvedený v SEQ. ID. NO: 6 (pozri obr. 2), ktorý obsahuje (1) arginín namiesto lyzínu v polohe 35; a (2) leucín namiesto izoleucínu v polohe 74 (skratka tohto analógu je „rekombinantný ľudský R->L³⁵, I->L⁷⁴“). Aminokyselinová sekvencia pre rekombinantný ľudský a rekombinantný myší proteín alebo ich analógy s fúzovanou Fc časťou na N-konci OB proteínu alebo bez tejto časti sú uvedené s metionylovým zvyškom v polohe -1, hoci v ktoromkoľvek z týchto OB proteinov a analógov môže metionylový zvyšok chýbať.

Myší proteín je v podstate homológny s ľudským proteínom, najmä vo forme maturovaného proteínu, osobitne na N-konci. Analóg rekombinantného ľudského proteínu je možné pripraviť alteráciou (ako substitúciou aminokyselinových zvyškov) aminokyselín v rekombinantnej ľudskej sekvencií aminokyselinami, ktoré sa líšia od myšej sekvencie. Pretože rekombinantný ľudský proteín má biologickú aktivitu pri myšiach, bol by taký analóg pravdepodobne aktívny u ľudí. Tak je napríklad možné pri použití ľudského proteínu s lyzínom v polohe 35 a izoleucínom v polohe 74, číslované podľa SEQ. ID. NO: 6, kde prvou aminokyselinou je valín a aminokyselinou v polohe 146 je cysteín, jednu alebo viac aminokyselín v polohách 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145 nahradiť inými aminokyselinami. Aminokyselinu je možné zvoliť zo súboru skladajúceho sa z aminokyselín v zodpovedajúcich polohách myšieho proteínu (SEQ. ID. NO: 3) a iných aminokyselín.

Ďalej je možné pripravovať „konvenčné“ molekuly založené na sekvencií potkanieho OB proteínu (pozri publikáciu Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209, 944 až 952, 1995, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie jej obsahu do tohto textu). Potkaní OB proteín sa od ľudského OB proteínu líši v nasledujúcich polohách (pri použití číslovania z SEQ. ID. NO: 6): 4, 3 2, 33, 35. 50. 68, 71. 74. 77, 78, 89. 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 a 145. Inou aminokyselinou je možné nahradiť jednu alebo viac aminokyselín v týchto polohách s odlišnosťou. Podtrhnutie označuje polohy, v ktorých sa od ľudského OB proteínu odlišuje tak myší OB proteín, ako aj potkaní OB proteín, teda polohy, ktoré sú osobitne vhodné na alteráciu. Aminokyselinu zo zodpovedajúceho potkanieho OB proteínu alebo inú aminokyselinu je možné nahradzovať v jednej alebo viacerých polohách.

Polohy aminokyselín tak z potkanieho, ako z myšieho OB proteínu, ktoré sa líšia od maturovaného ľudského OB proteínu, sú: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145. OB proteín podľa SEQ. ID. NO. 6, ktorý má jednu alebo väčší počet uvedených aminokyselín nahradených inou aminokyselinou, ako aminokyselinou, ktorá sa nachádza v zodpovedajúcej potkanej alebo myšej sekvencií, môže byť tiež účinný.

Okrem toho aminokyselinami, ktoré sa nachádzajú v OB proteíne makaka rhesus a sú odlišné od maturovaného ľudského OB proteínu, sú: 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66(1), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) a 118 (L) (v zátvorkách je uvedená jednopísmenová skratka aminokyseliny). Pretože je rekombinantný ľudský OB proteín aktívny pri opiciach Cynomolgus, ľudský OB proteín podľa SEQ. ID. NO: 6 (s lyzínom v polohe 35 a izoleucínom v polohe 74), v ktorom je jedna alebo väčší počet takých „rhesus divergentných“ aminokyselín nahradený inou aminokyselinou, ako aminokyselinou uvedenou v zátvorkách, môže byť účinný. Je potrebné poznamenať, že určité „rhesus divergentné“ aminokyseliny sa tiež nachádzajú v uvedenom myšom type polohy 35, 68, 89, 100 a 112). Je teda možné pripraviť myšiu/rhesus/ľudskú konvenčnú molekulu (s lyzínom v polohe 35 a izoleucínom v polohe 74, číslované podľa SEQ. ID. NO: 6), kde je jedna alebo viac aminokyselín v polohách 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89,

97. 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112. 118, 136, 138, 142 a 145 nahradených inou aminokyselinou.

Ďalšie analógy je možné pripraviť deléciou časti aminokyselinovej sekvencie proteínu. Napríklad maturovaný proteín nemá vedúcu sekvenciu (-22 až -1). Je možné pripraviť nasledujúce skrátené formy molekúl ľudského OB proteínu (číslované podľa SEQ. ID. NO: 6):

(a) aminokyseliny 98 až 146, (b) aminokyseliny 1 až 32, (c) aminokyseliny 40 až 116, (d) aminokyseliny 1 až 99 a (súčasne) 112 až 146, (e) aminokyseliny 1 až 99 a (súčasne) 112 až 146 s jednou alebo väčším počtom aminokyselín 100 až 111 umiestnenými medzi aminokyseliny 99 a 112.

Okrem toho skrátené formy môžu tiež obsahovať alteráciu v jednej alebo väčšom počtu aminokyselín, ktoré sú v OB proteíne potkana, myši alebo rhesus odlišné (divergentné) od ľudského OB proteínu, a akákoľvek alterácia môže mať formu alterovaných aminokyselín, ako sú peptidomimetika alebo D-aminokyseliny.

Predmetom vynálezu je teda Fc-OB fúzny proteín, v ktorom je OB proteín zvolený zo súboru skladajúceho sa z (a) aminokyselinovej sekvencie 1 až 146 uvedenej v SEQ. ID. NO: 3 (ďalej) alebo SEQ. ID. NO: 6;

(b) aminokyselinovej sekvencie 1 až 146 uvedenej v SEQ. ID. NO: 6 s lyzínovým zvyškom v polohe 35 a izoleucínovým zvyškom v polohe 74;

(c) aminokyselinovej sekvencie podľa odseku (b) s rôznymi aminokyselinami substituovanými v jednej alebo väčšom počtu nasledujúcich polôh (číslované podľa SEQ. ID. NO: 6, a to aj v prípade, že glutaminylový zvyšok v polohe 28 chýba): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145;

(d) aminokyselinovej sekvencie podľa odseku (a), (b) alebo (c), v ktorej prípadne chýba glutaminylový zvyšok v polohe 28;

(e) aminokyselinovej sekvencie podľa odseku (a), (b), (c) alebo (d) s metionylovým zvyškom na N-konci;

(f) skráteného analógu OB proteínu zvoleného zo súboru skladajúceho sa z (rátane podľa SEQ. ID. NO: 6) (i) aminokyselín 98 až 146, (ii) aminokyselín 1 až 32, (iii) aminokyselín 40 až 116, (iv) aminokyselín 1 až 99 a 112 až 146, (v) aminokyselín 1 až 99 a 112 až 146 s jednou alebo väčším počtom aminokyselín 100 až 111 umiestnených medzi aminokyseliny 99 a 112; a (vi) skráteného OB analógu podľa odseku (i), v ktorom je jedna alebo väčší počet aminokyselín 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145 nahradený inou aminokyselinou;

(vii) skráteného analógu podľa odseku (ii), v ktorom je jedna alebo väčší počet z aminokyselín 4, 8 a 32 nahradený inou aminokyselinou;

(viii) skráteného analógu podľa odseku (iii), v ktorom je jedna alebo väčší počet z aminokyselín 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 a 112 nahradený inou aminokyselinou;

(ix) skráteného analógu podľa odseku (iv), v ktorom je jedna alebo väčší počet z aminokyselín 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahradený inou aminokyselinou;

(x) skráteného analógu podľa odseku (v), v ktorom je jedna alebo väčší počet z aminokyselín 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68,71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145 nahradený inou aminokyselinou;

(xi) skráteného analógu podľa ktoréhokoľvek z odseku (i) až (x) s N-terminálnym metionylovým zvyškom;

(g) derivátu OB proteínu alebo analógu podľa ktoréhokoľvek z odsekov (a) až (f), ktorý obsahuje chemický zvyšok pripojený k proteínovému zvyšku;

(h) derivátu podľa odseku (g), v ktorom je chemickým zvyškom zvyšok vodorozpustného polyméru;

(i) derivát podľa odseku (h), v ktorom je zvyškom vodorozpustného polyméru zvyšok polyetylénglykolu;

(j) derivát podľa odseku (h), v ktorom je zvyškom vodorozpustného polyméru zvyšok polyaminokyseliny;

(k) derivát podľa odseku (h) až (j), kde je uvedený zvyšok pripojený iba na N-konci proteínového zvyšku a (l) OB proteín, analóg alebo derivát podľa ktoréhokoľvek z odsekov (a) až (k) vo farmaceutický vhodnom nosiči.

Deriváty

Fc-OB fúzne proteíny (pod pojmom „proteín“ sa rozumie „peptid“, Fc, OB alebo analógy, aké sú napríklad uvedené neskôr, pokiaľ to nie je uvedené inak) sa derivatizujú tak, že sa k zvyšku Fc-OB fúzneho proteínu pripojí jeden alebo väčší počet chemických zvyškov. Tieto chemicky modifikované deriváty je ďalej možné spracovávať na formy pre intraarteriálne, intraperitoneálne, intramuskuláme, subkutánne, intravenózne, orálne, nazálne, pulmonáme, topické alebo iné podávanie, ako je opísané. Bolo zistené, že chemické modifikácie biologicky aktívnych proteínov poskytujú za určitých podmienok ďalšie výhody, ako je zvýšenie stability a predĺženie času cirkulácie terapeutického proteínu a zníženie imunogenity (pozri US patent č. 4 179 337, Davis et al., vydaný 18. decembra 1979; a prehľad Abuchowski et al., Enzymes as Drugs, J. S. Holcerberg a J. Roberts ed., str. 367 až 383, 1981; Francis et al., uvedená citácia).

Ako chemické zvyšky vhodné na takú derivatizáciu je možné voliť rôzne vodorozpustné polyméry. Zvolený polymér by mal byť vodorozpustný, aby sa proteín, ku ktorému je pripojený, nezrážal vo vodnom prostredí, ako fyziologickom prostredí. Pre terapeutické použitie konečného produktu bude polymér prednostne farmaceutický vhodný. Odborník v tomto odbore bude schopný zvoliť požadovaný polymér napríklad na základe toho, či sa konjugát polymér/proteín bude používať na liečebné účely, a pokiaľ áno, na základe požadovanej dávky, času cirkulácie, rezistencie proti proteolýze a ďalších ohľadov. V prípade proteínov a peptidov podľa vynálezu môže byť efektívnosť derivatizácie zistená tak, že sa podávajú deriváty v požadovanej forme (t. j. napríklad pomocou osmotickej pumpy, alebo, výhodnejšie, pomocou injekcií alebo infúzií, alebo ešte výhodnejšie, formuláciou na orálnu, pulmonámu alebo nazálnu dodávku) a pozorujú sa biologické účinky uvedené v tomto opise.

Vodorozpustný polymér je možné voliť zo súboru skladajúceho sa napríklad z polyetylénglykolu, kopolymérov etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulózy, dextránu, polyvinylalkoholu, polyvinylpyrolidónu, poly-l,3-dioxolánu, poly-l,3,6-trioxánu, kopolyméru etylénu a anhydridu kyseliny maleínovej, polyaminokyselín (buď homopolymérov alebo štatistických kopolymérov) a dextránom alebo poly(n-vinylpyrolidónom) modifikovaného polyetylénglykolu, homopolymérov propylénglykolu, kopolymérov polypropylénoxidu a etylénoxidu, polyoxyetylovaných polyolov a polyvinylalkoholu. Pri výrobe môže byť výhodné použitie polyetylénglykolpropiónaldehydu,vzhľadom na jeho stabilitu vo vode. Rovnako je možné použiť polymér sukcinátu a styrénu.

OB alebo Fc proteíny, ktoré sa používajú na prípravu Fc-OB fúzneho proteínu, je možné vyrábať tak, že sa k zvyšku Fc alebo OB proteínu (alebo analógu) naviaže polyaminokyselina alebo „branch point“ aminokyselina. Tak napríklad polyaminokyselina môže predstavovať prídavný nosičový proteín, ktorý podobne ako Fc fúzovaný k OB proteínu alebo OB analógu podľa vynálezu, slúži na to, že sa okrem opísaných výhod FcOB fúzneho proteínu tiež dosiahne predĺženie polčasu cirkulácie proteínu. Pri použití na terapeutické alebo kozmetické účely by sa mali voliť polyaminokyseliny, ktoré nemajú alebo nevyvolávajú neutralizačnú antigénmi odpoveď alebo iné nežiaduce odozvy. Také polyaminokyseliny je možné voliť zo súboru skladajúceho sa zo sérového albumínu (ako ľudského sérového albumínu), ďalších protilátok alebo ich častí (napríklad Fc oblasti) a iných polyaminokyselín, napríklad lyzínov. Ako je uvedené, miesto pripojenia polyaminokyseliny sa môže nachádzať na N-konci Fc-OB proteínového zvyšku, na jeho C-konci alebo na inom mieste medzi nimi. Polyaminokyselina môže byť k Fc-OB fuznemu proteínu tiež pripojená pomocou chemického linkeru.

Polymér môže mať akúkoľvek molekulovú hmotnosť a môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený. Pri polyetylénglykole sa s ohľadom na ľahkosť spracovania a výroby venuje prednosť molekulovej hmotnosti od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod pojmom „asi“ sa rozumie, že v polyetylénových produktoch budú mať niektoré molekuly hmotnosť vyššiu a niektoré hmotnosť nižšiu, ako je uvedená molekulová hmotnosť). Je možné použiť aj iné veľkosti, a to v závislosti od požadovaného terapeutického profilu, ako sú napríklad požadovaný čas trvalého uvoľňovania, účinky na biologickú aktivitu (pokiaľ k dajakým dochádza), ľahkosť spracovania, stupeň alebo absencia antigenicity a iných známych účinkov, ktoré má polyetylénglykol na terapeutický proteín alebo analóg.

Počet takto pripojených polymémych molekúl môže byť rôzny a odborník v tomto odbore bude schopný stanoviť jeho účinky na funkciu. Je možné uskutočniť monoderivatizáciu, alebo je možné uskutočniť di-, tri-, tetraderivatizáciu alebo určité kombinácie derivatizácie, pričom sa používajú rovnaké alebo rôzne chemické zvyšky (napríklad polyméry, ako polyetylénglykoly s rôznou molekulovou hmotnosťou). Pomer polymérnych molekúl k molekulám proteínu (alebo peptidu) bude kolísať s ich koncentráciou v reakčnej zmesi. Optimálny pomer (z hľadiska efektívnosti reakcie, t. j. aby nebol prítomný žiadny prebytok nezreagovaného proteínu alebo polyméru) bude daný takými faktormi, ako je požadovaný stupeň derivatizácie (napríklad mono-, di-, tri- a pod.), molekulová hmotnosť zvoleného polyméru, okolnosť, či je polymér rozvetvený, alebo nerozvetvený a reakčné podmienky).

Chemické zvyšky by k proteínu mali byť pripojené s ohľadom na účinky na funkčné a antigénne domény proteínu. Existuje rad spôsobov takých pripojení, ktoré sú dostupné odborníkom v tomto odbore (pozri napríklad EP 0 401 384, ktorý je tu citovaný náhradou za prenesenie jeho obsahu do tohto textu (kopulácia PEG k G-CSF)), a ďalej Malik et al., Exp. Hematol. 20, 1028 až 1035, 1992 (opisujúci pegyláciu GM-CSF pri pou žití trezylchloridu). Tak je napríklad polyetylénglykol možné kovalentne viazať prostredníctvom aminokyselinového zvyšku cez reaktívnu skupinu, ako je voľná aminoskupina alebo karboxyskupina. Reaktívnymi skupinami sú skupiny, ku ktorým sa môže viazať molekula aktivovaného polyetylénglykolu. Ako príklady aminokyselinových zvyškov s voľnou aminoskupinou je možné uviesť zvyšky lyzínu a N-terminálne aminokyselinové zvyšky. Ako príklady aminokyselinových zvyškov s voľnou karboxyskupinou je možné uviesť zvyšky kyseliny asparágovej, zvyšky kyseliny glutámovej a C-terminálne aminokyselinové zvyšky. Ako reaktívne skupiny pre pripojenie molekuly alebo molekúl polyetylénglykolu je rovnako možné využiť sulfhydrylové skupiny. Z hľadiska použitia na terapeutické účely sa venuje prednosť pripojeniu na aminoskupine, ako je N-terminálne pripojenie alebo na zvyšku lyzínu. Pripojeniu na zvyškoch, ktoré sú dôležité pre väzbu receptora, je potrebné sa vyhnúť, v prípade, že je väzba k receptoru žiaduca.

V určitých prípadoch môže byť potrebné Fc-OB fúzny proteín N-terminálne chemicky modifikovať. V prípade polyetylénglykolu, ktorý je tu uvedený ako ilustratívny príklad, je možné voliť z rôznych molekúl polyetylénglykolu (čo sa týka molekulovej hmotnosti, rozvetvenia a pod.), pomerov polyetylénglykolových molekúl k molekulám proteínu (alebo peptidu) v reakčnej zmesi, typov pegylačnej reakcie, ktorá sa má uskutočniť, a spôsobov prípravy zvoleného N-terminálne pegylovaného proteínu. Spôsobom prípravy N-terminálne pegylovaného prípravku (t. j. oddelenia tohto zvyšku od iných monopegylovaných zvyškov, pokiaľ je to nevyhnutné) môže byť purifikácia N-terminálne pegylovanej látky zo súboru molekúl pegylovaného proteínu. Selektívnu N-terminálnu chemickú modifikáciu je možné vykonávať reduktívnou alkyláciou, ktorá využíva rôznu reaktivitu rôznych typov primárnych aminoskupín (lyzín versus N-koniec), ktoré sú v konkrétnom proteíne dostupné pre derivatizáciu. Za vhodných reakčných podmienok sa pri použití polyméru obsahujúceho karbonylovú skupinu dosiahne v podstate selektívna derivatizácia proteínu na N-konci. Tak je napríklad možné selektívne N-terminálne pegylovať proteín tak, že sa reakcia vykonáva pri pH, ktoré umožní využiť výhody rozdielov v pK_a medzi e-aminoskupinou lyzínových zvyškov a α-aminoskupinou N-terminálneho zvyšku proteínu. Takou selektívnou derivatizáciou je riadené pripojenie vodorozpustného polyméru k proteínu: ku konjugácii s polymérom dochádza prevažne na N-konci proteínu a nedochádza k žiadnej významnej modifikácii iných reaktívnych skupín, ako je aminoskupina lyzínového postranného reťazca. Pri použití postupu reduktívnej alkylácie môže byť vodorozpustným polymérom polymér opísaného typu, ktorý by mal mať jedinú reaktívnu aldehydovú skupinu na kopuláciu s proteínom. Môže sa použiť polyetylénglykolpropiónaldehyd, ktorý obsahuje jedinú reaktívnu aldehydovú skupinu.

N-terminálne monopegylovaným derivátom sa venuje prednosť z hľadiska uľahčenia prípravy liečiv. N-terminálna pegylácia zaisťuje homogénny produkt, pretože charakterizácia produktu je vzhľadom k di-, trialebo iným multipegylovaným produktom zjednodušená. Použitie opísaného postupu reduktívnej alkylácie na prípravu N-terminálneho produktu má prednosť z hľadiska uľahčenia výroby v priemyselnom meradle.

Komplexy

Fc-OB fúzny proteín, jeho analóg alebo ich derivát je možné podávať vo forme komplexu s väzbovou látkou. Taká väzbová látka môže mať vplyv na predĺženie času cirkulácie, ktorý môže byť dokonca dlhší ako pri použití Fc-OB fúzneho proteínu, jeho analógu alebo derivátu. Takými väzbovými látkami môžu byť proteíny (čiže peptidy). Ako príklad väzbového proteínu je možné uviesť receptor OB proteínu alebo jeho časť, ako je jeho vodorozpustná časť. Iné väzbové proteíny je možné zistiť skúškou OB proteínu alebo Fc-OB proteínu v sére alebo empirickým skríningom na prítomnosť väzby. Použité väzbové proteíny zvyčajne nebudú interferovať so schopnosťou OB proteínu, Fc-OB fúznych proteínov alebo analógov, alebo ich derivátov viazať sa k endogénnemu receptoru OB proteínu a/alebo vyvolávať transdukciu signálu.

Farmaceutické kompozície

Predmetom vynálezu sú tiež spôsoby použitia farmaceutických kompozícií na báze Fc-OB fúznych proteínov a derivátov. Také farmaceutické kompozície môžu byť vo forme na injekčné, orálne, pulmonáme, nazálne, transdermálne alebo iné podávanie. Predmetom vynálezu sú farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú účinné množstvo proteínového produktu alebo derivátu podľa vynálezu spolu s farmaceutický vhodným riedidlom, konzervačným činidlom, solubilizátorom, emulgátorom, adjuvansom a/alebo nosičom. Ako príklady takých látok je možné uviesť riedidlá s obsahom rôznych tlmivých roztokov (ako je napr. Tris-HCl, acetátový tlmivý roztok a fosfátový tlmivý roztok), s rôznym pH a iónovou silou; aditíva, ako detergenty a solubilizačné činidlá (napríklad Tween 80, Polysorbate 80), antioxidačné činidlá (napríklad askorbovú kyselinu, disiričitan sodný), konzervačné činidlá (napríklad Thimersol, benzylalkohol) a látky dodávajúce objem (napríklad laktózu, manitol). Do úvahy tiež prichádza začlenenie látky do časticového prípravku na báze polymémej zlúčeniny, ako kyseliny polymliečnej, polyglykolovej a pod. alebo do lipozómov. Tiež je možné použiť kyselinu hyalurónovú, ktorá môže mať podporný účinok na predĺženie času cirkulácie. Také látky môžu ovplyvniť fyzikálny stav, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť clearance in vivo proteínov a derivátov podľa vynálezu (pozri napríklad publikáciu Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, str. 1435 až 1712, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie jej obsahu do tohto textu). Kompozície je možné pripravovať v kvapalnej forme alebo vo forme suchého prášku, ako v lyofilizovanej forme. Do úvahy rovnako prichádzajú implantovateľné prostriedky s pretrvávajúcim uvoľňovaním, a ďalej tiež transdermálne prostriedky.

Pre použitie prichádzajú do úvahy orálne pevné dávkovacie formy, ktoré sú všeobecne opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, 1990, Mack Publishing Co., Easton PA 18042 v kapitole 89, ktorá je tu uvedená náhradou za prenesenie jej obsahu do tohto textu. Ako príklady pevných dávkovacích foriem je možné uviesť tablety, tobolky, piluly, pastilky alebo zdravotné bonbóny, oblátky alebo pelety. Pri formulácii kompozícií podľa vynálezu tiež je možné využiť zapuzdrenie v lipozómoch alebo proteínoidoch (napríklad proteinoidové mikroguľôčky opísané v US patente č. 4 925 673). Je možné použiť lipozomálne zapuzdrenie a lipozómy je možné derivatizovať rôznymi polymérmi (napríklad US patent č. 5 013 556). Opis možných pevných dávkovacích foriem pre liečivé látky je uvedený v publikácii Marshall, K., Modem Pharmauceutics, Ed. G. S. Banker a C. T. Rhodes, kapitola 10, 1979, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie jej obsahu do tohto textu. Kompozícia bude zvyčajne obsahovať Fc-OB fuzny proteín (alebo analóg, alebo derivát) a inertné prísady, ktoré biologicky účinnej látke poskytnú ochranu proti prostrediu žalúdka a umožnia jej uvoľňovanie v čreve.

Osobitne pozoruhodné sú tiež orálne dávkovacie formy opísaných derivatizovaných proteínov. Fc-OB fúzny proteín je možné chemicky modifikovať tak, aby orálna dodávka tohto derivátu bola účinná. Zvyčajne je takou chemickou modifikáciou pripojenie aspoň jedného zvyšku k samotnej molekule proteínu (alebo peptidu), pokiaľ taký zvyšok umožní (a) inhibovať proteolýzu; a (b) vstrebávanie do krvného prúdu zo žalúdka alebo čreva. Žiaduce je tiež zvýšenie celkovej stability proteínu a predĺženie času cirkulácie v organizme. Ako príklady takých zvyškov je možné uviesť polyetylénglykol, kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulózu, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón a polyprolín (Abuchowski a Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, „Enzymes as Drugs“, eds. Hocenberg a Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY, 1981, str. 367 až 383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4, 185 až 189, 1982). Ako iné polyméry, ktoré by mohli byť použité, je možné uviesť poly-l,3-dioxolán a poly-l,3,6-tioxokán. Ako bolo uvedené, pri farmaceutickom použití majú prednosť zvyšky polyetylénglykolu.

Miestom uvoľňovania Fc-OB fúzneho proteínu, analógu alebo derivátu môže byť žalúdok alebo tenké črevo (napríklad duodénum, jejunum alebo ileum), alebo hrubé črevo. Pre odborníka v tomto odbore sú dostupné prostriedky, ktoré sa nebudú rozpúšťať v žalúdku, ale budú látku uvoľňovať v duodéne alebo kdekoľvek inde v čreve. Uvoľňovanie sa bude prednostne vyhýbať škodlivým účinkom prostredia žalúdka, a to buď pomocou ochrany Fc-OB fúzneho proteínu, analógu alebo derivátu, alebo prostredníctvom uvoľňovania biologicky účinnej látky mimo prostredie žalúdka, ako v čreve.

Na zaistenie plnej rezistencie proti prostrediu v žalúdku sú podstatné obaly, ktoré sú nepriepustné pri pH aspoň 5,0. Ako príklady najobvyklejších inertných prísad, ktoré sa používajú ako enterické povlaky, je možné uviesť acetát trimelitát celulózy (CAT), ftalát hydroxypropylmetylcelulózy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylacetátftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetát ftalát celulózy (CAP), Eudragit L,Eudragit S a šelak. Tieto povlaky sa môžu používať ako zmesové filmy.

Obaly alebo zmesi obalov sa tiež môžu používať na tabletách, ktoré nemajú byť chránené pred prostredím žalúdka. Ako príklady takých obalov je možné uviesť cukrové obaly alebo obaly, ktoré uľahčujú prehítanie tablety. Tobolky môžu byť tvorené tvrdými tobolkami (ako želatínovými) na dodávku suchého liečiva (t. j. prášku); pre kvapalné formy je možné použiť mäkké želatínové tobolky. Stenu oblátok môže tvoriť stužený škrob alebo iný jedlý papier. Pre piluly, pastilky, liate tablety a tabletové trituráty je možné použiť postupy kompaktovania, miesenia alebo spracovanie za vlhka.

Liečivo môže byť v prostriedku obsiahnuté ako jemné multičastice v forme granúl alebo peliet s veľkosťou častíc asi 1 mm. Látka na podávanie vo forme toboliek môže tiež mať formu prášku, ľahko zlisovaných valčekov alebo peliet, alebo dokonca formu tabliet. Liečivo je možné pripravovať lisovaním.

Je možné použiť všetky farbiace a aromatizačné činidlá. Tak je napríklad možné pripraviť formuláciu na báze proteínu alebo derivátu (ako zapuzdrením v lipozómoch alebo mikroperlách) a potom ju ďalej začleniť do jedlého produktu, ako chladených nápojov obsahujúcich farbiace a aromatizačné činidlá.

Pri použití inertnej látky je možné terapeutikum riediť alebo zvyšovať jeho objem. Ako príklady takých riedidiel je možné uviesť sacharidy, najmä manitol, α-laktózu, bezvodú laktózu, celulózu, sacharózu, modifikované dextrány a škrob. Ako plnivá je možné tiež použiť niektoré anorganické soli, ako fosforečnan vápenatý, uhličitan horečnatý a chlorid sodný. Riedidlami dostupnými na trhu sú napríklad Fast-Flo, Emdex, STARX 1500, Encompress a Avicell.

Pri formuláciách terapeutiká na pevnú dávkovaciu formuje možné začleniť rozvoľňovadlá. Ako neobmezujúce príklady látok, ktoré sú používané ako rozvoľňovadlá, je možné uviesť škroby, ako obchodne dostupné rozvoľňovädlo na báze škrobu, Explotab. Takisto je možné použiť sodnú soľ škrobového glykolátu, Amberlite, sodnú soľ karboxymetylcelulózy, ultramylopektín, alginát sodný, želatínu, pomarančovú šupku, karboxymetylcelulózu vo voľnej forme, prírodné huby a bentonit. Ďalšiu formu rozvoľňovadiel predstavujú ne rozpustné katexové živice. Ako rozvoľňovadlá a spojivá je možné použiť práškové živice, ako je agar, Karaya alebo tragant. Užitočné ako rozvoľňovadlá sú tiež kyselina algínová a jej sodná soľ.

Pri výrobe tvrdých tabliet je možné použiť spojivá, aby sa dosiahla súdržnosť terapeutického činidla. Ako príklady spojív je možné uviesť látky z prírodných produktov, ako je živica, tragant, škrob a želatína, a ďalej metylcelulózu (MC), etylcelulózu (EC) a karboxymetylcelulózu (CMC). Na granuláciu liečiva je možné použiť polyvinylpyrolidón (PVP) aj hydroxypropylmetylcelulózu (HPMC) v alkoholických roztokoch.

Aby sa znížila lepivosť zmesi počas formulačného procesu, môžu terapeutické prostriedky obsahovať príslušné činidlá znižujúce trenie. Je možné použiť lubrikanty, ktoré budú tvoriť vrstvu medzi liečivom a stenou formy. Ako neobmedzujúce príklady takých látok je možné uviesť kyselinu stearovú, vrátane jej horečnatých a vápenatých solí, polytetrafluóretylén (PTFE), kvapalný parafín, rastlinné oleje a vosky. Tiež je možné použiť rozpustné lubrikanty, ako laurylsulfát sodný, laurylsulfát horečnatý, polyetylénglykol s rôznymi molekulovými hmotnosťami, Carbowax 4000 a 6000.

Je možné pridať klzné látky, ktoré môžu zlepšovať vlastnosti tečenia liečiva počas formulácie a napomáhať preskupovaniu počas lisovania. Ako príklady klzných látok je možné uviesť škrob, mastenec, koloidný oxid kremičitý a hydratovaný hlinitokremičitan.

Na uľahčenie rozpúšťania liečiva vo vodnom prostredí je možné pridať povrchovo aktívnu látku ako namáčadlo. Ako príklady povrchovo aktívnych látok je možné uviesť aniónové detergenty, ako laurylsulfát sodný, dioktylsulfojantaran sodný a dioktylsulfonan sodný. Je možné použiť tiež katiónové detergenty, ako benzalkóniumchlorid alebo benzetomiumchlorid. Ako povrchovo aktívne látky vo formuláciách môžu byť obsiahnuté nasledujúce potenciálne neiónové detergenty: lauromakrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyetylénovaný hydrogenovaný ricínový olej 10, 50 a 60, glycerolmonostearát, polysorbate 40, 60, 65 a 80, ester mastnej kyseliny a sacharózy, metylcelulóza a karboxymetylcelulóza. Tieto povrchovo aktívne látky môžu byť v prípravku na báze proteínu alebo derivátu prítomné samotné alebo vo forme zmesí v rôznych pomeroch.

Ďalšími prídavnými látkami, ktoré môžu podporovať absorpciu proteínu (alebo derivátu), sú napríklad mastné kyseliny, ako je kyselina olejová, kyselina linolová a kyselina linolénová.

Môže byť žiaduce pripraviť formulácie s riadeným uvoľňovaním. Liečivo je možné začleniť do inertnej matrice, ktorá umožní uvoľňovanie difúziou alebo prostredníctvom mechanizmu vylúhovania (napr. živice). Do formulácie tiež môžu byť začlenené pomaly degenerujúce matrice, napríklad algináty a polysacharidy. Ďalšou formou riadeného uvoľňovania tohto liečiva je spôsob založený na terapeutickom systéme Oros (Alza Corp.), keď sa liečivo uzatvorí v semipermeabilnej membráne, ktorá vode dovoľuje vstúpiť a osmotický vytlačiť liečivo jediným malým otvorom. Účinok odloženého uvoľňovania tiež majú niektoré enterické poťahy.

Na formuláciu je možné použiť ďalšie obaly, ako sú rôzne cukry, ktoré je možné nanášať v dražovacom bubne. Terapeutické činidlo je možné tiež podávať v tabletách vybavených filmovým povlakom. Látky, ktoré sa používajú na tento účel, sa delia do dvoch skupín. Prvú skupinu predstavujú neenterické látky, ako sú metylcelulóza, etylcelulóza, hydroxyetylcelulóza, metylhydroxyetylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, sodná soľ karboxymetylcelulózy, providone a polyetylénglykoly. Druhú skupinu tvoria enterické látky, ktorými zvyčajne sú estery kyseliny fialovej.

Aby sa získal optimálny filmový povlak, je možné použiť zmes látok. Filmové povlaky je možné nanášať v zariadení s bubnom alebo fluidným lôžkom, alebo nalisovaním.

Protein podľa vynálezu (alebo jeho deriváty) je tiež možné podávať pulmonáme. Protein (alebo derivát) sa dodáva do pľúc cicavca pri inhalácii a epiteliálnou výstelkou pľúc prechádza do krvného prúdu (ďalšie správy pozri v Adjei et al., Pharmaceutical Research 7, 565 až 569, 1990; Adjei et al., International Joumal of Pharmaceutics 63, 135 až 144, 1990 (leuprolid acetát); Braquet et al., Joumal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5), 143 až 146, 1989 (endotelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicíne 3, 206 až 212, 1989 (α-1-antitrypsín); Smith et al., J. Clin. Invest. 84, 1145 až 1146, 1989 (α-1-proteáza); Oswein et al., „Aerosolization of proteins“, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marec 1990 (rekombinantný ľudský rastový hormón); Debs et al., The Joumal of Immunology 140, 3482 až 3488, 1988 (interferon-r a faktor nekrózy nádorov a) a Platz et al., US patent č. 5 284 656 (faktor stimulujúci kolónie granulocytov).

V praxi prichádza do úvahy rad mechanických zariadení skonštruovaných na pulmonárnu dodávku liečiv, ktoré sú odborníkom v tomto odbore dobre známe. Ako neobmedzujúce príklady takých zariadení je možné uviesť rozprašovače, inhalátory pre odmeranú dávku a inhalátory pre práškové liečivá.

Ako príklady konkrétnych zariadení, ktoré sú v praxi dostupné, je možné uviesť rozprašovač Ultravent, výrobok firmy Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, USA; rozprašovač Acom II, výrobok firmy Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, USA; inhalátor odmeranej dávky Ventolin, výrobok firmy Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, USA; a inhalátor pre práškové liečivá Spinhaler, výrobok firmy Fisons Corp., Bedford, Massachusetts, USA.

Všetky tieto zariadenia vyžadujú použitie formulácií vhodných na dávkovanie proteínu (alebo jeho analógu, alebo derivátu). Zvyčajne je každá formulácia špecifická vzhľadom na typ použitého zariadenia a môže okrem použitia riedidiel, adjuvansov a/alebo nosičov užitočných pri liečení zahŕňať použitie vhodnej hnacej látky.

Proteín (alebo derivát) by sa na najúčinnejšiu dodávku do distálnej časti pľúc mal najvýhodnejšie pripravovať vo forme častíc s priemernou veľkosťou menej ako 10 pm, najvýhodnejšie v rozmedzí od 0,5 do 5 pm.

Ako príklady nosičov je možné uviesť sacharidy, ako je trehalóza, manitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Vo formuláciách je možné použiť ďalšie prísady, ako DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Je možné tiež použiť prírodné alebo syntetické povrchovo aktívne látky. Môže sa použiť polyetylénglykol (aj okrem jeho použitia pri derivatizácii proteínu alebo analógu). Ďalej sú použiteľné dextrány, ako cyklodextrán; soli žlčových kyselín a ďalšie príbuzné podporné látky a tiež celulóza a deriváty celulózy. Je možné použiť aminokyseliny, ako je použitie v tlmených formuláciách.

Predpokladá sa rovnako použitie lipozómov, mikrotoboliek alebo mikroguľôčok, inkluzných komplexov a ďalších typov nosičov.

Formulácie vhodné na použitie s rozprašovačom, prúdovým alebo ultrazvukovým, budú zvyčajne obsahovať Fc-OB proteín alebo jeho analógy, alebo deriváty rozpustené vo vode v koncentrácii asi 0,1 až 25 mg biologicky aktívneho proteínu na 1 ml roztoku. Formulácie tiež môžu obsahovať tlmivý roztok a jednoduchý cukor (napríklad na stabilizáciu proteínu a reguláciu osmotického tlaku). Rozprašovacie formulácie rovnako môžu obsahovať povrchovo aktívnu látku, aby sa znížila alebo vylúčila agregácia proteínu vyvolaná rozprašovaním roztoku pri tvorbe aerosólu.

Formulácie podávané pomocou zariadenia na inhaláciu odmeranej dávky budú zvyčajne obsahovať jemne rozdelený prášok s obsahom proteínu (alebo derivátu), ktorý je pomocou povrchovo aktívnej látky suspendovaný v propelente. Propelentom môže byť akákoľvek látka, ktoré sa zvyčajne používa na tento účel, ako je napríklad plne chlórfluórovaný uhľovodík, čiastočne chlórfluórovaný uhľovodík, čiastočne fluórovaný uhľovodík alebo uhľovodík, ako trichlórfluórmetán, dichlórdifluórmetán, dichlórtetrafluóretanol a 1,1,1,2-tetrafluóretán a ich kombinácie. Vhodnými povrchovo aktívnymi látkami sú napríklad sorbitántrioleát a sójový lecitín. Ako povrchovo aktívna látka môže byť užitočná tiež kyselina olejová.

Formulácie na dodávku zo zariadení pre inhaláciu práškov budú obsahovať jemne rozdelený prášok s obsahom proteínu (alebo derivátu) a prípadne tiež činidlo zvyšujúce objem, ako laktózu, sorbitol, sacharózu, manitol, trehalózu alebo xylitol, a to v množstve, ktoré uľahčí dispergovanie prášku zo zariadení, napríklad v množstve 50 až 90 %, vztiahnuté na hmotnosť formulácie.

Proteín (alebo analóg alebo derivát) je tiež možné dodávať nazálne. Nazálna dodávka umožňuje proteínu prejsť do krvného prúdu priamo potom, ako liečivo bolo podané do nosa, bez nevyhnutného ukladania produktu v pľúcach. Ako príklady formulácií pre nazálnu dodávku je možné uviesť formulácie s dextránom alebo cyklodextránom. Do úvahy tiež prichádza dodávka cez iné sliznicové membrány.

Dávkovanie

Odborník v tomto odbore bude schopný zistiť účinné dávky z pozorovania požadovaného terapeutického účinku po podaní liečiva. N-terminálna modifikácia OB proteínu podľa vynálezu v porovnaní s OB proteínom alebo jeho C-terminálnou modifikáciou poskytuje proteínu neočakávanú ochranu pred degradáciou, predĺžený čas cirkulácie a stabilitu. Odborníkovi v tomto odbore bude na základe týchto zmien zrejmé, že účinná dávka môže byť nižšia alebo že je možné znížiť frekvenciu podávania.

V prednostnom rozpracovaní bude formulácia taká, že sa pri dennej dávke asi 0,10 pg/kg až asi 10 mg/kg dosiahne požadovaný terapeutický účinok. Účinné dávky je možné stanoviť v časovom období pri použití diagnostických nástrojov. Tak sa napríklad najskôr stanoví endogénna hladina proteínu pri použití diagnostiky na meranie množstva OB proteínu alebo Fc-OB fúzneho proteínu v krvi (alebo plazme, alebo sére). Také diagnostické nástroje môžu mať podobu stanovenia protilátky, napríklad sendvičové stanovenie protilátky. Najskôr sa kvantifikuje množstvo endogénneho OB proteínu a stanoví sa základná línia. Terapeutické dávky sa určia na základe toho, ako sa vyvíja množstvo endogénneho a exogénneho OB proteínu alebo Fc-OB fiizneho proteínu (t. j. proteínu, analógu alebo derivátu zisteného v organizme, ktorý si organizmus vyprodukoval alebo ktorý mu bol dodaný) počas liečby. Dávky sa teda počas liečby môžu meniť tak, že sa najskôr používa relatívne vysoká dávka, a to až dovtedy, keď je pozorovaný pozitívny terapeutický účinok, a na udržanie pozitívnych terapeutických účinkov sa používajú nižšie dávky.

V čisto teoretickej situácii, keď je požadované iba zníženie hladiny lipidov v krvi, keď je žiaduce udržanie zníženej hladiny lipidov v krvi alebo zvýšenie hmoty tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku, bude dávka nedostatočná na zníženie hmotnosti. Počas počiatočného obdobia liečby obéznej osoby je teda možné podávať dávky, pri ktorých sa dosiahne zníženie hmotnosti a súčasné zníženie hladiny lipidov v krvi alebo súčasné zníženie tukového tkaniva/zvýšenie hmoty tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku. Len čo sa dosiahne dostatočné zníženie hmotnosti, je možné podávať dávku, ktorá je dostatočná na zabránenie opätovnému vzrastu hmotnosti, ale postačuje na udržanie požadovanej hladiny lipidov v krvi alebo zvýšenie hmoty tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku (alebo prevenciu straty tohto tkaniva). Tieto dávky je možné stanoviť empiricky, pretože účinky OB alebo Fc-OB proteínu sú reverzibilné (napr. Cam pfíeld et al., Science 269: 546 až 549, 1995, na strane 547). Pretože je teda pozorované, že dávka vedie k zníženiu hmotnosti, ktoré nie je žiaduce, je možné podávať dávku nižšiu, pri ktorej sa dosiahne požadovaná hladina lipidov v krvi alebo zvýšenie hmoty tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku, ale požadovaná hmotnosť zostane zachovaná.

Pri zvyšovaní citlivosti jedinca na inzulín je možné brať do úvahy podobné faktory ovplyvňujúce dávkovanie. Bez úbytku hmotnosti je možné dosiahnuť také zvýšenie podielu tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku, ktoré umožní znížiť množstvo inzulínu (alebo potenciálne amylínu, tiazolidíndionov alebo iných možných liečiv pre liečbu diabetes), aké by sa jedincovi podávalo na liečbu diabetes.

Pri zvyšovaní celkovej sily je možné brať opäť do úvahy podobné faktory ovplyvňujúce dávkovanie. Zvýšenie podielu tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku spolu so súčasným zvýšením celkovej sily je možné dosiahnuť s dávkami, ktoré sú dostatočné na stratu hmotnosti. Bez straty hmotnosti je možné rovnako dosiahnuť ďalšie pozitívne výsledky, ako je zvýšenie červených krviniek (a okysličovanie krvi) a zníženie resorpcie kosti alebo osteoporózy.

Kombinácie

Uvedené postupy je možné použiť spolu s inými liečivami, ako sú liečivá užitočné na liečenie diabetes (napríklad inzulín, potenciálne tiazolidíndiony, amylín alebo ich antagonisty), lieky znižujúce cholesterol a krvný tlak (ako sú lieky znižujúce hladinu lipidov v krvi alebo iné kardiovaskulárne liečivá) a lieky zvyšujúce aktivitu (napríklad amfetamíny). Rovnako je možné používať činidlá potlačujúce chuť k jedlu (ako sú látky ovplyvňujúce hladinu serotonínu alebo neuropeptidu Y). Také podávanie môže byť simultánne alebo postupné.

Okrem toho je tieto spôsoby možné použiť spolu s chirurgickými postupmi, ako sú kozmetické chirurgické výkony vykonávané na účely zmeny celkového výzoru tela (napríklad liposukcia alebo laserová chirurgia na účely zníženia telesnej hmotnosti). Súčasným použitím kompozícií a spôsobov podľa vynálezu je možné posilniť pozitívne výsledky srdcových operácií, ako sú operácie bypass, alebo iné zákroky, ktoré majú zmierniť stavy vyvolané blokádou ciev tukovými usadeninami, ako je arteriálny plát. Pred liečením pri použití kompozícií alebo spôsobov podľa vynálezu, počas takej liečby alebo nej, je možné použiť postupy eliminujúce žlčové kamene, ako sú postupy využívajúce ultrazvuk alebo laser. Spôsoby liečby podľa vynálezu je ďalej možné použiť ako podpornú liečbu pri operáciách alebo liečení zlomených kostí, poškodených svalov alebo iných terapiách, pri ktorých by vplyvom zvýšenia hmoty tkanív tvorených v podstate svalovinou bez tuku došlo k zlepšeniu.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Aplikácia myšieho Fc-OB proteínu vo forme subkutánnych injekcií

Tento príklad demonštruje, že subkutánne injekcie myšieho Fc-OB proteínu vedú pri normálnych myšiach k zníženiu hmotnosti. Normálnym (neobéznym) myšiam CD1 sa subkutánnymi injekciami počas 22 dní podáva myší Fc-OB proteín. Pri dennej dávke proteínu 10 mg/kg telesnej hmotnosti sa 22. deň podávania injekcií dosiahol 14 % (±1,1 %) úbytok hmotnosti vzhľadom na základnú líniu. Podávanie PBS viedlo 22. deň injekčného podávania k 3,9 % (±3,3 %) úbytku hmotnosti vzhľadom na základnú líniu. Podávaním Fc-OB proteínu obéznym myšiam CD1 v dennej dávke 10 mg/kg telesnej hmotnosti sa 22. deň dosiahlo 10 % (±4,3 %) zníženie hmotnosti vzhľadom na základnú líniu a podávanie PBS viedlo 22. deň k 8,7 % (±1,3 %) zníženiu hmotnosti vzhľadom na základnú líniu.

Ďalej sú uvedené percentuálne odchýlky od základnej línie hmotnosti pri myšiach CD1 (starých 8 týždňov).

Tabuľka 1

Úbytok hmotnosti pri subkutánnom injekčnom podávaní

Čas (dni)	Vehikulum (PBS)	Normálne myši/rekombinantný Fc-OB fúzny proteín	Obézne myši rekombinantný Fc-OB fúzny proteín
1 až 2	-0,44 ±1,1	-3,6 ±0,41	-1,03 ±1,36
3 až 4	-1,07 ±0,13	-6,8 ±1,5	-2,7 ±1,1
5 až 6	-0,13 ±1,1	-9,5 ±1,2	-4,9 ±0,95
7 až 8	-0,92 ±0,29	-12,5 ±1,6	-7,7 ±2,9
9 až 10	1,6 ±1,3	-12,6 ±1,9	-8,2 ±2,9

Čas (dni)	Vehikulum (PBS)	Normálne myši/rekombinantný Fc-OB fúzny proteín	Obézne myši rekombinantný Fc-OB fúzny proteín
11 až 12	-1,98 ±1	-13,6 ±1,96	-8,6 ±2,9
13 až 14	-5,2 ±1,3	-14,6 ±1,7	-10,1 ±3,6
15 až 16	-8,6 ±0,1	-14,5 ±2	-9,4 ±2,2
17 až 18	-8,5 ±0,64	-16,1 ±1,8	-9,6 ±2,99
19 až 20	-4,1 ±0,99	-16 ±1,5	-10,4 ±3,3
21 až 22	-3,9 ±3,3	-14,1 ±1,1	-10 ±4,3

Ako je zrejmé, na konci 22-denného režimu subkutánneho podávania pri zvieratách, ktoré dostali Fc-OB proteín, sa znížila hmotnosť o 14,1 % (neobézne zvieratá) a 10 % (obézne zvieratá), na rozdiel od zvierat, ktoré dostávali iba vehikulum PBS a v porovnaní so základnou líniou.

Pri zvieratách, ktorým bol podávaný Fc-OB proteín počas celých 22 dní, sa hmotnosť prekvapivo znižovala počas až 28 dní, ešte 4 dni po poslednej injekcii. Pri normálnych (neobéznych) myšiach CDI subkutánne injekčné podávanie Fc-OB myšieho proteínu v dennej dávke 10 mg/kg telesnej hmotnosti, ktoré bolo zastavené 22. deň, viedlo k úbytku hmotnosti 21 % vzhľadom na základnú línii zistenú 28. deň, proti 14 % úbytku zistenému 22. deň. Podobne pri obéznych myšiach CDI subkutánne injekčné podávanie Fc-OB myšieho pro10 teínu v dennej dávke 10 mg/kg telesnej hmotnosti, ktoré bolo zastavené 22. deň, viedlo k úbytku hmotnosti 13 % vzhľadom na základnú líniu zistenú 28. deň, oproti 10 % úbytku zistenému 22. deň. 34. deň sa úbytok hmotnosti pri obéznych myšiach udržal na 10 %, pričom pri myšiach s nízkym podielom tukového tkaniva došlo k opätovnému nadobudnutiu hmotnosti, takže úbytok robil 5 %. Kontrola v každom systéme v období od 22. do 34. dňa v prípade obéznych myší vykázala 4 % a v prípade myší s nízkym podielom tukového tka15 niva 7 % prírastok.

Príklad 2

Aplikácia ľudského Fc-OB proteínu vo forme subkutánneho injekčného podávania myšiam C57

Tento príklad demonštruje, že subkutánne injekcie ľudského Fc-OB proteínu vedú pri normálnych my20 šiach k strate hmotnosti. Normálnym (neobéznym) myšiam C57 bol počas 7 dní subkutánnymi injekciami podávaný ľudský Fc-OB proteín. Denná dávka proteínu 10 mg/kg telesnej hmotnosti viedla 7. deň injekčného podávania k 12 % (±1,3 %) úbytku vzhľadom na základnú líniu. Denná dávka proteínu 1 mg/kg telesnej hmotnosti viedla 7. deň injekčného podávania k 8,9 % (±1,5 %) úbytku vzhľadom na základnú líniu. Pri obéznych myšiach C57 denná dávka ľudského OB proteínu 10 mg/kg telesnej hmotnosti viedla 7. deň in25 jekčného podávania k 1,1 % (±0,99 %) úbytku vzhľadom na základnú líniu a denná dávka proteínu 1 mg/kg telesnej hmotnosti viedla 7. deň injekčného podávania k 2,5 % (±1,1 %) úbytku vzhľadom na základnú líniu.

Výsledky

Ďalej uvedené hodnoty predstavujú percentuálne rozdiely od základnej hmotnosti myší C57 (staré 8 týždňov).

Tabuľka 2

Úbytok hmotnosti pri subkutánnom injekčnom podávaní

Čas (dni)	Vehikulum (PBS)	Rekombinantný Fc-OB fúzny proteín	Rekombinantný OB proteín
1 až 2	0,258 ±1,3	-6,4 ±1,6	-2,1 ±0,91
3 až 4	2,2 ±1,1	-12,1 ±1,5	-0,78 ±0,36
5 až 6	4,5 ±2	-11,5 ±1,5	-1,7 ±0,6
7 až 8	7,0 ±2,1	-11,9 ±1,6	0,1 ±1,2
9 až 10	9,0 ±1,9	-11,5 ±1,3	7,2 ±2,7
11 až 12	10 ±3,8	-9 ±1,4	10,9 ±2,9
13 až 14	12,5 ±4,4	-9,5 ±1,6	12,3 ±6,4
15 až 16	11,1 ±1,0	-3,0 ±1,5	10,3 ±3,3
17 až 18	17,2 ±3,6	8,0 ±1,3	13,3 ±3,4

Je možné si povšimnúť, že na konci 17. dňa po 7 dňoch režimu so subkutánnou dennou dávkou 10 mg/kg telesnej hmotnosti, zvieratá, ktorým bol podávaný Fc-OB proteín, opätovne získali 8 % svojej telesnej hmotnosti. Zvieratá, ktoré dostávali dennú dávku 1 mg/kg pri sedemdennom režime subkutánneho podávania, po 12 dňoch opäť získali 6,4 % telesnej hmotnosti.

Tieto skúšky tiež ukazujú, že počas obdobia regenerácie od 7. do 22. dňa po poslednej injekcii, ktorá bola 40 podaná 7. deň, je návrat telesnej hmotnosti pri myšiach C57 ošetrených Fc-OB pomalší ako pri myšiach ošet rených OB proteínom. Z toho sa dá usúdiť, že Fc-OB proteín nie je eliminovaný tak rýchlo ako OB proteín, čo predlžuje účinok spočívajúci v znižovaní hmotnosti.

Príklad 3

Závislosť odpovede od dávky pri myšiach CF7 ošetrovaných Fc-OB fúznym proteínom

Ďalšia skúška dokladá existenciu závislosti odpovede od dávky pri nepretržitom podávaní Fc-OB fúzneho proteínu. Pri tejto skúške sa obéznym myšiam CF7 s hmotnosťou 35 až 40 g podáva rekombinantný ľudský Fc-OB proteín pri použití metodológie opísanej v predchádzajúcom príklade. Výsledky skúšky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3, kde úbytok telesnej hmotnosti (%) vzhľadom na základnú líniu je stanovený opísaným postupom.

Tabuľka 3

Dávka (mg/kg/deň)	Čas	Úbytok telesnej hmotnosti (%)
0,25	deň 5	4
0,5	deň 5	12
1	deň 5	16

Je zrejmé, že zvýšenie dávky z 0,25 mg/kg/deň na 1 mg/kg/deň vedie k zvýšeniu úbytku z 4 % na 16 %. 16 % zníženie telesnej hmotnosti v deň 5 pri dávke 1 mg/kg/deň je rovnako pozoruhodné. Tieto skúšky tiež svedčia o pomalom návrate hmotnosti na 0 %, a je teda možné usúdiť, že Fc-OB proteín nie je eliminovaný rýchlo, čo je príčinou predĺženého účinku spočívajúceho v znižovaní hmotnosti.

Príklad 4

Farmakokinetické vlastnosti rekombinantného Fc-OB proteínu pri skúške na myšiach CD-1 a psoch

Táto skúška demonštruje farmakokinetické vlastnosti rekombinantného ľudského met Fc-OB proteínu pri myšiach CD-1 a psoch. Po intravenóznom alebo subkutánnom podávaní v dávke 1 mg/kg/deň sa enzýmovo spriahnutým imunochemickým stanovením na pevnom povrchu (ELISA) zistí sérové koncentrácie rekombinantného ľudského met Fc-OB proteínu a ľudského met OB proteínu.

Pri obidvoch druhoch bola pozorovaná zvýšená expozícia, kvantifikovaná vyšším píkom sérových koncentrácií a väčšou plochou pod krivkou koncentrácie v sére (AUC), oproti rekombinantnému met-ľudskému OB proteínu. Fc-OB má nižšiu systemickú clearance ako rekombinantný met-ľudský OB proteín. To je zrejmé z nižšej clearance a dlhšieho polčasu Fc-OB proteínu oproti OB proteínu. Väčšia veľkosť proteínu nevyvoláva iba zvýšenie jeho stability, ale tiež zníženie účinnosti renálnej clearance. Výsledkom je, že Fc-OB proteín je zo systemického obehu eliminovaný pomalšie. Zvýšenie časového maxima, maxima sérovej koncentrácie a AUC pre Fc-OB proteín sú v súlade s nižšou clearance, Fc-OB proteín poskytuje podstatne vyššiu systemickú expozíciu ako OB proteín. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 4.

Tabuľka 4

Farmakokinetické vlastnosti

Druh	Myši CD-1	Myši CD-1	Psi beagle
Spôsob podávania	Intravenózne	Subkutánne	Subkutánne
	OB proteín	Fc-OBín	„ . Fc-OB prote- OB proten , ^r m	OB proteín	Fc-OB proteín
Dávkovanie (mg/kg)	1	1	1 1	0,5	0,5
Časové maximum (h)			0,14 6	2,8	8
Maximum sérovej koncentrácie (ng/ml)			1520 7550	300	1120
AUC (ng.h/ml)	1470	366000	1230 132000	2200	52500
Polčas (h)	0,491	21,4	0,388	2,13	22,9
Clearance (ml/h/kg)	681	2,73

Príklad 5

Tento príklad demonštruje, že pri normálnych myšiach, ktoré sú obézne a nemajú zvýšenú hladinu lipidov v krvi, podávanie ľudského rekombinantného Fc-OB proteínu vedie k zníženiu hladiny cholesterolu, glukózy a triglyceridov. Tento príklad okrem toho demonštruje, že hladiny týchto látok zostávajú počas trojdenného regeneračného obdobia nízke.

Normálnym myšiam CDI sa subkutánnymi injekciami podáva rekombinantný ľudský Fc-OB proteín. 24 hodín po dni 23, čo je deň podania poslednej injekcie, sa odoberú krvné vzorky. Ako je diskutované, zvieratá pri podávaných dávkach stratili na hmotnosti. Z tabuľky 5 vyplýva, že pri myšiach v porovnaní s kontrolou došlo k významnému zníženiu sérového cholesterolu, glukózy a triglyceridov, ktoré je závislé od dávky.

Tabuľka 5

Dávka	Glukóza	Cholesterol	Triglyceridy
PBS	232,6 ±15,1	67,8 ±3,6	52,6 ±3,7
1 mg/kg/deň	225,8 ±29,1	54 ±5,6	43 ±8,7
10 mg/kg/deň	193,2 ±21,4	53,4 ±5,7	38 ±11
1 mg/kg/každé 2 dni	242,0 ±9,3	52,6 ±4,4	40,8 ±7,2
10 mg/kg/každé 2 dni	197,4 ±27,9	51,4 ±5,9	29,8 ±6,3
1 mg/kg/každé 3 dni	244,8 ±19,5	60,8 ±7,3	54 ±7,1
10 mg/kg/každé 3 dni	188 ±31,2	52,2 ±6,9	26,2 ±10,7

Tieto údaje dokladajú, že Fc-OB proteín alebo jeho analógy, alebo deriváty sú činidlá, ktoré účinne znižujú krvné lipidy.

Príklad 6

Obéznemu pacientovi (človeku) sa na účely zníženia hmotnosti podáva ľudský Fc-OB proteín alebo analóg, alebo derivát. Tento obézny pacient má tiež zvýšenú hladinu lipidov v krvi, ako je zvýšená hladina cholesterolu, nad 200 mg/100 ml. Pacient počas liečenia Fc-OB proteínom dosiahne uspokojivé zníženie hmot15 nosti. Tomuto neobéznemu pacientovi sa podáva udržovacia dávka Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu, aby sa udržala znížená hladina krvných lipidov, vrátane zníženej hladiny cholesterolu, pod 200 mg/100 ml. Táto podávaná dávka nie je natoľko vysoká, aby viedla k ďalšiemu znižovaniu hmotnosti. Podávanie je dlhodobé. Hladiny cirkulujúceho Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti OB proteínu (alebo inému zdroju 20 antigenickosti, keď je použiteľný).

Príklad 7

Pacientom je neobézny človek, ktorý podstúpil koronárnu operáciu bypass alebo iné invazívne ošetrenie na účely zmiernenia rozvinutej tvorby arteriálneho plátu. Po operácii sa pacientovi podáva udržovacia dávka 25 Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu, aby sa zabránilo opätovnej tvorbe arteriálneho plátu. Podávaná dávka nie je taká vysoká, aby viedla k strate hmotnosti. Podávanie je dlhodobé. Hladiny cirkulujúceho FcOB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať, pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti OB proteínu (alebo inému zdroju antigenickosti, keď je použiteľný).

Príklad 8

Pacientom je neobézny človek, ktorý trpí hypertenziou vyvolanou obmedzením krvného toku z upchatých artérií. Tomuto pacientovi sa podáva Fc-OB proteín alebo jeho analóg, alebo derivát v dávke, ktorá je dostatočná na redukciu arteriálneho plátu vedúceho k upchatiu tepien. Potom sa u pacienta monitoruje ďalšia tvorba arteriálneho plátu a hypertenzia. Pokiaľ opäť dôjde k tomuto stavu, pacientovi sa opäť podáva Fc-OB pro35 teín, analóg alebo derivát v množstve dostatočnom na obnovenie krvného toku, pričom toto množstvo nie je také vysoké, aby viedlo k zníženiu hmotnosti. Hladiny cirkulujúceho Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti Fc-OB proteínu (alebo inému zdroju antigenickosti, keď je použiteľný).

Príklad 9

Pacientom je človek so žlčovými kameňmi. Žlčové kamene buď neboli odstránené, a je snaha vyhnúť sa tvorbe ďalších kameňov, alebo odstránené boli, ale žlčník bol ponechaný (ako v prípade použitia laserovej alebo ultrazvukovej chirurgie), a je snaha vyhnúť sa tvorbe ďalších kameňov. Pacientovi sa podáva Fc-OB proteín alebo jeho analóg, alebo derivát v množstve, ktoré je účinné na zabránenie akumulácie ďalších žlčo45 vých kameňov alebo opätovnej akumulácie žlčových kameňov. Hladiny cirkulujúceho Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti Fc-OB proteínu (alebo inému zdroju antigenickosti, keď je použiteľný).

Príklad 10

Pacientom je diabetik, pri ktorom je snaha znížiť dávky inzulínu pri liečbe diabetes. Pacientovi sa podáva Fc-OB proteín alebo jeho analóg, alebo derivát v množstve, ktoré je účinné na zvýšenie hmoty tkaniva tvorenej v podstate svalovinou neobsahujúcou tuk. Citlivosť pacienta na inzulín sa zvýši a dávka inzulínu nevyhnutná na aleváciu od symptómov diabetes sa zníži. Toto zníženie sa prejaví buď ako zníženie potrebných jednotiek inzulínu, alebo vo forme zníženia potrebného počtu inzulínových injekcií za deň. Hladiny cirkulujúceho Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti OB proteínu (alebo inému zdroju antigenickosti, keď je použiteľný).

Príklad 11

Pacientom je neobézny človek, ktorý na liečebné účely potrebuje zvýšiť hmotu tkaniva tvorenú v podstate svalovinou neobsahujúcou tuk, ako je napríklad rekonvalescencia po ochorení, ktoré tieto tkanivá vyčerpáva. Pacientovi sa podáva Fc-OB proteín alebo jeho analóg, alebo derivát v množstve, ktoré je účinné pre požadované zvýšenie hmoty tkaniva tvorenej v podstate svalovinou neobsahujúcou tuk. Zvýšenie hmoty tohto tkaniva je možné monitorovať snímaním DEXA. Hladiny cirkulujúceho Fc-OB proteínu alebo analógu, alebo derivátu je možné monitorovať pri použití diagnostického kitu, ako je stanovenie protilátok proti OB proteínu (alebo inému zdroju antigenickosti, keď je použiteľný).

Materiály a metódy

Zvieratá

Pri skúškach podľa uvedených príkladov boli použité myši CD1 divokého typu a myši (+/+) C57B16. Vek myší na počiatku bol 8 týždňov a zvieratá mali stabilizovanú hmotnosť.

Kŕmenie a meranie hmotnosti

Myšiam bolo podávané mleté krmivo pre hlodavcov (PMI Feeds, Inc.) v kŕmiacom zariadení pre práškové krmivá (Allentown Caging and Equipment), ktoré umožňuje presnejšie a citlivejšie odmeriavanie, než aké je pri kusovom krmive. Hmotnosť sa meria počas požadovaného obdobia každý deň v rovnaký čas (14.00). Telesná hmotnosť deň pred injekciou bola definovaná ako základná línia hmotnosti. Myši použité pri skúške vážili 18 až 22 g.

Chov

Myši sa chovajú po jednej za humánnych podmienok.

Podávanie proteínu alebo vehikula

Proteín (opísaný neskôr) alebo vehikulum (fosfátom tlmený soľný roztok, pH 7,4) sa podávajú subkutánnymi injekciami alebo intravenózne.

Kontrola

Kontrolné zvieratá sú zvieratá, ktorým bolo injekčné podané samotné vehikulum, ku ktorému nebol pridaný ani Fc-OB fúzny proteín, ani OB proteín.

Proteín

V SEQ. ID. NO: 1, 2 a 3 je opísaná myší rekombinantné OB DNA a proteín (obr. 1) a v SEQ. ID: NO: 4, 5 a 6 je opísaný analóg rekombinantnej ľudskej OB DNA a proteín (obr. 2). Ako už bolo uvedené, rekombinantný ľudský OB proteín opísaný v SEQ. ID. NO: 6 má lyzínový zvyšok v polohe 35 a izoleucínový zvyšok v polohe 74. Ako ilustratívne príklady OB proteínu, ktorý je možné použiť pri tvorbe Fc-OB fuzneho proteínu na účely spôsobu liečenia a spôsobu výroby liečiva podľa vynálezu je ďalej možné uviesť rekombinantný ľudský proteín uvedený v Zhang et al., Náture, pozri skôr a PCT publikáciu WO 96/05309 (12/22/96) (citácie predstavujú náhradu za prenesenie celého obsahu citovaných publikácií, vrátane obrázkov, do tohto textu) a myšie a ľudské analógy rekombinantných proteínov uvedené na obr. 1 a 2. Pri tvorbe Fc-OB fuzneho proteínu je tiež možné použiť iné OB alebo Fc proteíny alebo ich analógy, alebo deriváty.

Prvou aminokyselinou sekvencie aminokyselín pre rekombinantný OB proteín, ktorá je označená ako +1, je valín, a aminokyselinou v polohe -1 je metionin. C-terminálna aminokyselina má číslo 146 (cysteín) (pozri obr. 1 a 2). Prvá aminokyselina sekvencie pre rekombinantný ľudský Fc-OB proteín uvedená na obr. 3 je označená ako +1 a ide o kyselinu glutámovú a aminokyselinou v polohe -1 je metionin. C-terminálna aminokyselina má číslo 378 (cysteín). Prvá aminokyselina sekvencie pre variant rekombinantného ľudského Fc-OB proteínu znázornená na obr. 4 je označená ako +1, a ide o kyselinu glutámovú. Aminokyselinou v polohe -1 je metionin. C-terminálna aminokyselina má číslo 378 (cysteín). Prvá aminokyselina sekvencie pre variant rekombinatného ľudského Fc-OB proteínu znázornená na obr. 5 je označená ako +1, a ide o kyselinu asparágovú. Aminokyselinou v polohe -1 je metionin a C-terminálna aminokyselina má číslo 373 (cysteín). Prvá aminokyselina sekvencie pre variant rekombinatného ľudského Fc-OB proteínu znázornená na obr. 6 je označená ako +1, a ide o kyselinu asparágovú. Aminokyselinou v polohe -1 je metionín a C-terminálna aminokyselina má číslo 373 (cystein).

Expresný vektor a hostiteľský kmeň

Použitým plazmidovým expresným vektorom je pAMG21 (prírastkové číslo ATCC 98113), ktorý je derivátom pCFM1656 (prírastkové číslo ATCC 69576) a obsahuje vhodné reštrikčné miesta pre inzerciu génov za (v smere expresie) lux PR promótor (opis systému lux expresie pozri v US patente č. 5 169 318). Vytvorí sa Fc-OB DNA opísaná neskôr a znázornená na obr. 3 až 6 a liguje sa do expresného vektora pAMG21 linearizovaného reštrikčnými endonukleázami Ndel a BamHI a transformuje do hostiteľského kmeňa E. coli FM5. Bunky E. coli FM5 boli odvodené firmou Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, USA z kmeňa E. coli K-12 (Bachmann, et al., Bacterial. Rev. 40: 116 až 167, 1976) a obsahujú integrovaný represorový gén fágu lambda, clg57 (Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254: 1517 až 1579, 1962). Produkcia vektora, bunková transformácia a selekcia kolónií sa uskutočňuje pri použití štandardnej metodológie (napr. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Hostiteľské bunky sa pestujú v LB médie.

Konštrukcia Fc-OB DNA

Ako zdroj sekvencie pre ťažký reťazec ľudského imunoglobulínu IgG-1 od aminokyseliny číslo 99 (Glu) do prirodzeného karboxylového konca slúži plazmid pFC-A3 (opísaný neskôr). Sekvenciu ľudského IgG-1 je možné získať z génovej banky Genebank (P01857).

Ľudská OB sekvencia je opísaná skôr a tiež v publikácii Zhang et al., Náture, pozri skôr a PCT WO 96/05309, ktoré sú tu citované náhradou za prenesenia celého ich obsahu, vrátane obrázkov, do tohto textu. OB DNA sa liguje do expresného vektora pCFM1656 linearizovaného reštrikčnými endonukleázami Xbal a BamHI pri použití štandardných postupov klonovania (pozri napr. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Plazmid pCFM1656, ktorý nesie OB DNA sekvenciu, slúži ako zdroj sekvencie pre rekombinantný ľudský OB gén.

Genetická fúzia týchto dvoch sekvencií sa vykonáva predĺžením prekryvu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (Ho, S. N., et al., Site Directed Mutagenesis by Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction, Gene 77: 51 až 59, 1989). Produkt PCR sa štiepi reštrikčnou endonukleázou Ndel, aby vznikol 5'-lepivý koniec a reštrikčnou endonukleázou BamHI, aby vznikol 3'-lepivý koniec. Podobne sa štiepi vektor pAMG21. Ligácia sa vykonáva pri použití fuzneho fragmentu a linearizovaného vektora. Ligovaná DNA sa elektroporuje do hostiteľského kmeňa E. coli. Klony prežívajúce na kanamycínových (50 ng/ml) selekčných agarových miskách sa preverí na expresiu proteínu s veľkosťou Fc-OB. Izolujú sa plazmidy jednotlivých klonov a overí sa sekvencia oblasti kódujúcej gén.

V prípade, že je žiaduce Fc-OB gén ďalej modifikovať, na vykonanie zmien sa použijú opäť PCR postupy. Na účely získania variantov SEQ. ID. NO: 12 a 15 boli na N-konci Fc časti fúzneho proteínu (SEQ. ID. NO: 9) uskutočnené dva súbory zmien. Ďalší variant bol skonštruovaný zavedením štyroch aminokyselinových substitúcií, aby sa odstránilo väzbové miesto Fc-receptora (leucín v polohe 15 sa nahradí kyselinou glutámovou) a väzbové miesto komplementu (Clq) (kyselina glutámová v polohe 98 sa nahradí alanínom, lyzín v polohe 100 sa nahradí alanínom a lyzín v polohe 102 sa nahradí alanínom) (pozri Xin Xiao Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590 až 5600, 1995). Templátompre tento konštrukt je SEQ. ID. NO. 15 a výsledný variant je SEQ. ID.NO: 18.

Konštrukcia pFC-A3 vektora

Plazmid pFc-A3, ktorý obsahuje oblasť kódujúcu Fc oblasť ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu IgG-1 (pozri Ellison, J. W. et al., Nucleis Acids Res. 10: 4071 až 4079, 1982) od prvej aminokyseliny Glu-99 pantovej domény do karboxylového konca plus fúzne miesto 5'-NotI a miesta 3'-SalI a Xbal, sa pripravia PCR amplifikáciou knižnice cDNA ľudskej sleziny. PCR reakcie boli vykonané v konečnom objeme 100 ml a použili sa 2 jednotky Vent DNA polymerázy v 20mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM chloride draselnom, lOmM sírane amónnom, 2mM sírane horečnatom, 0,1 % Triton X-100 a 400mM každého z dNTP a 1 ng cDNA knižnici, ktorá sa má amplifikovať, spolu s IM každého prajmeru. Reakcia sa začne denaturáciou pri 95 °C počas 2 minút, po ktorej nasleduje 30 cyklov zahrievania 30 sekúnd na 95 °C, 30 sekúnd na 55 °C a 2 minúty na 73 °C. 5'-prajmer začlení miesto NotI bezprostredne 5' k prvému zvyšku (Glu-99) pantovej domény IgG-1. 3'-prajmer zavedie miesta Sali a Xbal. 717bp PCR produkt sa štiepi NotI a Sali a výsledný DNA fragment sa izoluje elektroforézou na 1 % agarózovom géli, purifikuje a klonuje do NotI vektora pBluescript II KS štiepeného Sali (Stratagene). Inzert vo výslednom plazmide, pFC-A3, sa sekvenuje, aby sa potvrdila presnosť PCR reakcie.

Spôsoby produkcie

Ďalej opísané spôsoby produkcie sa používajú na prípravu biologicky aktívneho rekombinantného metionylovaného myšieho alebo ľudského analógu OB proteínu a Fc-OB fúznych proteínov. Podobné postupy je možné použiť na prípravu biologicky aktívneho metionylovaného ľudského OB proteínu.

Fermentácia

Použije sa postup jednorazovej fermentácie. Zloženie médií je uvedené.

Dávka média, ktoré obsahuje predovšetkým zdroje dusíka, sa sterilizuje (zvýšením teploty na 120 až 123 °C počas 25 až 35 minút) vo fermentačnej nádobe. Po ochladení sa k médiu za aseptických podmienok pridajú zdroje uhlíka, horčíka, fosfátu a stopových prvkov. Do fermentoru sa pridá nočná kultúra (500 ml) baktérií produkujúcich uvedený rekombinantný myší proteín (pestovaná v živnej pôde LB). Keď sa optická hustota kultúry (meraná pri 600 nm ako indikátor hustoty buniek) zvýši na 15 až 25 absorpčných jednotiek, pridá sa autoindukčný roztok (0,5 mg/ml homoserínlaktónu) (1 ml/1), aby sa indukovala expresia rekombinantného génu. Fermentačný proces sa nechá prebiehať počas ďalších 10 až 16 hodín a potom sa pôda zoberie centrifugáciou.

Zloženie média

Várka:	34 g/1	kvasinkový extrakt
	78 g/1	sójový peptón
	0,9 g/1	chlorid draselný
	5,0 g/1	hexaphos
	1,7 g/1	kyselina citrónová
	120 g/1	glycerol
	0,5 g/1	MgSO₄.7H₂O
	0,2 ml/1	roztok stopových prvkov
	0,5 ml/1	protipenové činidlo P2000
Roztok stopových prvkov
Chlorid železitý (FeCl₃.6H₂O):	27 g/1
Chlorid zinočnatý (ZnCl₂.4H₂O):	2 g/1
Chlorid kobaltnatý (C0Cl₂.6H₂O):	2 g/1
Molybdénan sodný (NaMoO₄.2H₂O):	2 g/1
Chlorid vápenatý (CaCl₂2H₂O):	1 g/1
Síran meďnatý (CuSO₄.5H₂O)	1,9 g/1
Kyselina boritá (H3BO3)	0,5 g/1
Chlorid mangánatý (MnCl₂.4H₂O):	1,6 g/1
Dihydrát citranu sodného:	73,5 g/1
Purifikácia ľudského Fc-OB fúzneho proteínu

Purifikácia ľudského Fc-OB fúzneho proteínu sa uskutočňuje v ďalej uvedených stupňoch (pokiaľ to nie je uvedené inak, vykonávajú sa tieto stupne pri teplote 4 °C). Purifikácia myšieho a ľudského OB proteínu je opísaná v PCT publikácii WO 96/05309, pozri skôr, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie celého jej obsahu do tohto textu.

1. Bunková pasta. Pasta z buniek E. coli sa suspenduje v päťnásobnom objeme destilovanej vody. Bunky vo vode sa ďalej rozbijú tak, že sa dvakrát nechajú prejsť mikrofluidizérom.

Rozbité bunky sa centrifugujú jednu hodinu pri 4200 min.'¹ v centrifúge Beckman JB-6 s rotorom J5-4.2.

2. Premytie inkluzného telesa. Supematant z uvedeného stupňa sa odstráni a peleta sa resuspenduje v piatich objemoch destilovanej vody. Zmes sa centrifuguje za uvedených podmienok.

3. Solubilizácia. Peleta sa solubilizuje v 10 objemoch 50mM tris, pH 8,5, 8M hydrochloridu guanidínu, 10 mM ditiotreitolu a mieša 1 hodinu pri teplote miestnosti. K roztoku sa pridá dihydrochlorid cystamínu (do 40 mM koncentrácie) a roztok sa 1 hodinu mieša.

4. Roztok zo stupňa 3 sa pridá k 20 až 30 objemom roztoku s nasledujúcim zložením: 50 mM tris, pH 8,5, 0,8 M arginín, 2M močovina a 4mM cysteín. Zmes sa mieša 16 hodín pri 8 °C.

5. Výmena tlmivého roztoku. Roztok zo stupňa 4 sa skoncentruje a diafiltruje do 10 mM tris, pH 8,5.

6. Vyzrážanie kyselinou. Hodnota pH roztoku zo stupňa 5 sa 50 % ľadovou kyselinou nastaví na 4,75. Výsledný roztok sa inkubuje 30 minút pri teplote miestnosti a potom prefiltruje.

7. Katexová chromatografia. Hodnota pH roztoku zo stupňa 6 sa nastaví na 7,0 a roztok sa pri 10 °C umiestni na stĺpec CM Sepharose Fast Flow. Stĺpcom sa nechá prejsť gradient 0 až 0,lM chlorid sodný v 10 mM fosfáte s pH 7,0 (20 objemov stĺpca).

8. Anexová chromatografia. Zhromaždené CM frakcie zo stupňa 7 sa päťnásobne zriedia 5mM tris, pH 7,5 a pri 10 °C umiestnia na stĺpec Q Sepharose Fast Flow. Gradient (20 objemov stĺpca): 10 mM tris, pH 7,5, 0 až 0,2M NaCl.

9. Hydrofóbna chromatografia. K zhromaždeným Q sepharosovým frakciám sa pridá síran amónny do koncentrácie 0,75M a roztok sa umiestni na hydrofóbny interakčný stĺpec metyl Macroprep pri teplote miestnosti. Gradient (20 objemov stĺpca): 10 mM fosfát, pH 7,0, 0,75M až 0M síran amónny.

10. Výmena tlmivého roztoku. Zhromaždené frakcie zo stupňa 9 sa skoncentrujú, tak ako je to nutné a dialyzujú proti tlmivému roztoku PBS.

Sekvenčný protokol (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ:	Mann, Michael B. Hecht, Randy I. OB fúzny proteín - kompoz a spôsoby
(ii)	NÁZOV	VYNÁLEZU:
(iii)	POČET	SEKVENCIÍ	:: 18
(iv)	ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:
	(A)	ADRESA:	Amgen Inc.
	(B)	ULICA:	1840 DeHavilland Drive
	(C)	MESTO:	Thousand Oaks
	(D)	ŠTÁT:	Kalifornia
	(E)	KRAJINA:	Spojené štáty americké
	(F)	ZIP:	91320-1789

(v) ícia

POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ FORMA: TYP MÉDIA: pružný disk POČÍTAČ: OPERAČNÝ SOFTWARE:

(A) (B) (C) (D)

IBM PC kompatibilný

SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS

Patentln Release # 1.0, verzia 1.30 (vi)

ÚDAJE (A) (B) (C)

O PRIHLÁŠKE:

PRIHLÁŠKA ČÍSLO: US 08/770,973

DÁTUM PODANIA: 20. decembra 1996 ZATRIEDENIE:

(Vii)

INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Knight, Matthew W.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 36,846 (C) ZNAČKA SPISU: A-416 (2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 1: CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 491 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (i) (ii)

DRUH MOLEKULY: cDNA (ix)

ZNAK:

(A) MENO/KÍÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 41 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 1:

TCTAGATTTG	A.GTTTTAACT	TTTAGAAGGA	GC-AATAACAT	ATC-GTACCGA	TCCAGAAAGT	60
TCAGGACGAC	ACCAAAACCT	TAATTAAAAC	GATCGTTACG	CC-TATCAACG	ACATCAGTCA	120
CACCCAGTCG	GTCTCCGCTA	AACAGCGTGT	TACCGGTCTG	GACTTCATCC	CGGGTCTGCA	180
CCCC-ATCCTA	AGCTTGTCCA	AAATGGACCÄ	C-ACCCTGGCT	G7ATACCAGC	AGGTGTTAAC	240
CTCCCTGCCG	TCCCAGAACG	TTCTTCAGAT	CGCTAACC-ÄC	CTCGAGAACC	TTCGCGACCT	300
GCTGCACCTG	CTGGCATTCT	CCAAATCCTG	CTCCCTGCCG	CAGACCTCAG	GTCTTCAGAA	360
ACCGGAATCC	CTGGACGGGG	TCCTGGAAGC	ATCCCTGTAC	AGCACCGAAG	TTGTTGCTCT	420
GTCCCGTCTC-	GAGGGTTCCC	7TCAGGACAT	CCTTCAGCAC-	CTGGACGTTT	CTCCGGAATG	480
TTAATGGATC						491

(2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 491 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojreéazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 2:

AGATCTAAAC	TCAAAATTGA	AAATCTTCCT	CCTTATTGTA	TACCATGGCT	AGGTCTTTCA	60
AGTCCTGCTG	2GGTTTTGGA	ATTAATTTTG	CTAC-CAATGC	GCATAGTTGC	TGTAGTCAGT	120
GTGGGTCAGC	CAGAGGCGAT	TTGTCGCACA	ATGGCCAGAC	CTGAAGTAGG	GCCCAGACC-T	180
GGGCTAGGAT	TCGAACAGGT	TTTACCTGGT	CTGGGACCC-A	CATATGGTCC-	TCCACAATTG	240
GAGGGACGGC	AGGGTCTTGC	AAGAÄGTCTA	GCGATTGCTG	GAC-CTCTTC-G	AAGCGCTGGA	300
CGACGTGGAC	GACCGTAAGA	GGTTTAGGAC	GAGGGACGGC	GTCTGGAGTC	CAGAAGTCTT	360
TGGCCTTAGG	GACCTGCCCC	AGGACCTTCG	TÄGGC-ACATG	TCGTGGCTTC	AACAACGAGA	420
CAGGGCAGAC	GTCCCAAGGG	AAGTCCTGTA	GGAAGTCGTC	GACCTGCAAA	GAGGCCTTAC	480
AATTACCTAG	G					91

(2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĺŽKA: 147 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: neznámy (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (ix) ZNAK:

(A) MENO/KÍÚČ: proteín (B) POZÍCIA: 1 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met (ATG) začína v polohe -1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 3:

Met 1

Val

Pro

íle

Gin 5

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 10

Lys

Thr

Leu

íle 15

Lvs

Thr

íle

Val

Thr

Arg

íle

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

C-ln

Ser

Val

Ser

20

25

30

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

His

Pro

35

40

45

íle

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Glr.

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

C-ln

50

55

60

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

T » a

Ala

Asn

Asp

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Eis

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

85

90

35

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser

Leu

Asp

100

105

11C

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Tvr

Ser

Thr

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

115

120

125

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

íle

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ser

130

135

140

Pro Glu Cys

145 (2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 454 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) MENO/KIjÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 4 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 4:

CATATGGTAC	CGATCCAGAA	AG7TCAGGAC	GACACCAAAA	CCTTAATTAA	AACGA.TCGTT	60
ACGCGTATCA	ACGACATCAG	TCACACCCAG	TCGGTGAGCT	CCAAACAGCG	TGTTACAGGC	120
CTGGACTTCA	TCCCGGGTCT	GCACCCGATC	CTGACCTTGT	CCÄAAATGGA	CCAGACCCTG	180
GCTGTATACC	AGCAGATCTT	ÄACCTCCATG	CCGTCCCGTA	ACGTTCTTCA	GATCTCTAAC	240
GACCTCGAGA	ACCTTCGCGA	CCTGCTGCAC	GTGCTGGCAT	TCTCCAAÄTC	C7GCCACCTG	300
CCATGGGCTT	CAGGTCTTGA	GACTCTGGAC	TCTCTGGGCG	GGGTCCTGGA	AGCATCCGGT	360
TACAGCACCG	ÄAGTTGTTGC	TCTGTCCCGT	CTGCAGGGTT	CCCTTCAGGA	CATGCTTTGG	420
CAGCTGGACC	TGTCTCCGGG	TTGTTÄATGG	ATCC			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 454 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojreťazcová (D) TOPOLÓGIA: 1ineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 5:

GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTTT GGAATTAA.TT TTGCTAGCAA

TGCGCATAGT TGCTGTAGTC AGTGTGGGTC AGCCACTCGA GATTTGTCGC ACAATGTCCG

120

GACCTGAAGT	AGGGCCCAC-A	CGTGGGCTAG	GÄCTGGAACA	GGTTTTACCT	GGTCTGGGAC	180
CGACATATGG	TCGTCTAGAA	TTGGAGGTAC	GGCAGGGCAT	TGCAÄGAAGT	CTAGAGATTG	240
CTGGAGCTCT	TGGAAGCGCT	GGACGÄCGTG	CACGACCGTA	AGAGGTTTÄG	GACGGTGGAC	300
GGTACCCGAA	GTCCAC-AACT	CTC-AGACCTG	AGAGACCCGC	CCCAGGACCT	TCGTAGGCCA	360
ATC-TCGTGGC	TTCAACAACG	AGACAGGGCA	GACGTCCCAA	GGGAAGTCCT	GTACGAAACC	420
GTCGACCTGG	ACAGAC-GCCC	AACAATTACC	TAGG			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÉŽKA: 147 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: neznámy (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (ix) ZNAK:

(A) MENO/KÚÚČ: proteín (B) POZÍCIA: 1 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met (ATG ) začína v polohe -1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 6:

Met

val

Pro

Zle

C-ln 5

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

I le 15

Lvs

Thr

íle

Val

Thr

Arg

Zle

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Ser

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

Leu

His

Pro

35

40

45

íle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

C-ln

Gin

50

55

60

íle

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Leu

Gin

íle

Ser

Asn

Asp

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

85

90

95

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

100

105

110

Gly

Val

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

Val val 125

Ala Leu Ser

Arg

Leu 130

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 135

Asp

Met

Leu

Trp

Glr. Leu 140

Asp Leu Ser

Pro 145

Gly

Cys

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÉŽKA: 1150 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) MENO/KÚÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 4 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 7:

CATATGGAAC	CCAAATCTTG	TGACAAAACT	CACACATGCC	CACCGTGCCC	AGCACCTGAA	60
CTCCTGGGGG	GACCGTCAGT	cttcctcttc	CCCCCAAAAC	CCAAGGACÄC	CCTCATGÄTC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCÄC	ATGCGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGÄ	CGGCGTGGAG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCC-GGAG	240
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCC7C-CA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGÄTG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720

CAGGACGACA	CCÄAÄACCTT	AATTAAÄACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CA7CAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAÄAG7T	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AA7GGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	gatcttaacc	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCC7GC	CACCTGCCAT	GGGC7TCAGG	TC77GAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGÄÄGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAGT	TGTTGCTCTG	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGT7GT	1140
TAATGGATCC						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍiŽKA: 1150 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 8:

GTATACCTTG	GGTTTAGAAC	ACTGTT7TGA	C-TGTGTACGG	GTGGCACGGG	TCGTGGACTT	60
GAGGACCCCC	CTGGCAGTCA	GAAGGAGÄÄG	GGGGGTTT7G	GGTTCCTG7G	GC-ÄG7ACTAG	120
AGGGCCTGGG	GÄCTCCAGTG	7ACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGC7TCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACC7C	CACGTATTAC	GGTTC7GT77	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GG7CCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGT7TC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360
TTTTGGTAGA	GG7TTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGÄCTGGA	CGGACCAGTT	7CCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTC7C	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGC7A	GGTC7TTCAA	720

GTCCTGCTC-T	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCÄATGCC-	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TGTCCGGACC	TGAAGTAGC-G	CCCAGACGTG	840
GGC7AGGACT	GGAACAGGTT	TTÄCCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAAT7GG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCÄ	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGC7GGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTC7GA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGC-CCAATGT	CGTGGC7TCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTC-TAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	aggcccaaca	1140
ATTACCTAGG						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 379 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: neznámy (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (ix) ZNAK:

(A) MENO/KĹÚČ: proteín (B) POZÍCIA: 1 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met (ATG) začína v polohe -1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 9:

Met 1

Glu

Pro

Lys

Ser 5

Cys

Asp

Lys

Thr

His 10

Th*·

cys

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Glu

L-eu

Leu

c-iy

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

20

25

30

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Ásp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

50

55

60

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

65

70

75

80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 85

Tyr

Arg Val

Val

Ser 90

Val

Leu

Thr

Val

Leu 95

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

cys

Lys

Val

Sex*

Asn

Lys

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tvr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

íle

Ala

Val

C-lu

Trp

G1U

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

16 5

170

175

Tyr

Lys

Thr

Pro

?ro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

Hi.s

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

íle

Glr.

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

íle

Lys

Thr

íle

Val

Thr

Arg

Íle

Asn

Asp

245

250

255

íle

S S x*

His

Ťhr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

Leu

His

Pro

íle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Me t

Asp

275

2S0

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

C-ln

íle

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

íle

Gin

íle

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Pne

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

C-ly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 375 (2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍiŽKA: 1150 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) MENO/KÉÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 4 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 10:

CATATGGAAC	CAAAATCTGC	TGACAAAACT	CACACATGTC	CACCTTGTCC	AGCTCCGGAA	60
CTCCTGGGGG	GTCCTTCAGT	CTTCCTCTTC	CCCCCAAÄAC	CCAAGGACAC	CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATGCGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCGTGGAG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGGGAG	240
GAGCAGTACA	ÄCAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCC7CCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAÄGCCAA	AC-GGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCÄA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	C-CCTGGTCAA	ÄGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAÄGÄG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGÄCGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGÄGCTCTAA	ÄCAGAÄAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAÄ	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900

TCCATGCCGT	CCCGTÄACGT	TATCCAGÄTC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCTTGAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAG7	TGTTGC7CTG	1080
TCCCGTCTGC	ÄGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGG7TGT	1140
TÄATGGATCC						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍ.ŽKA: 1150 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: CDNA (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 11:

GTATACCTTG	GTTTTAGACG	ACTGTTTTGA	GTGTGTACAG	GTGGAACAGG	TCGAGGCCTT	60
GAGGACCCCC	CAGGÄAGTCA	GAAGGAGAAG	GGGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAÄGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTTT	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAC-GAGT	GGCAGGACGT	GGTCC7GACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGTľTC	GGGAGGGTCG	GGGG7AGCTC	360
TľTTGGTAGA	ggtttcggtt	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCÄG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACC-AGGC	ACTACGTACT	CCGÄGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTCTTTCAA	720
GTCCTGCTGT	ggttttggaa	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAÄ	TGTCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840

GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAATTGG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140
ÄTTACCTAGG						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 12:

(A) MENO/KĹÚČ: proteín (B) POZÍCIA: 1 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met (ATG) začína v polohe -1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 12:

Met 1

Glu

Pro

Lys

Ser 5

Ala

Asp

Lys

Thr

His 10

Thr

Cys

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 20

Leu

Gly

Pro

Ser 25

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 30

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 35

Thr

Leu

Met

íle

Ser 40

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 45

Thr

Cys

Val

Val 50

A.sp

Val

Ser

His

Glu 55

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 60

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 65

Asp

Gly

Val

Glu

Val 70

His

Asn

Ala

Lys

Thr 75

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 85

Tyr

Arg

Val

Ser 90

Val

Leu

Thr

Val

Leu 95

His

C-ln

Asp

Trp

Leu 100

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 1 ης

Lys

Cys

Lys

Val

Ser ί i n

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 115

Ala

Pro

íle

Glu

Lys 120

Thr

íle

Ser

Lys

Ala 125

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

íle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

A.sn

Val

195

200

20S

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

A i a

Leu

His

Asr.

His

Tyr

T ŕ. r

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

val

Pro

íle

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

íle

Lys

Thr

íle

val

Thr

Arg

íle

Asn

Asp

245

250

255

íle

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

Leu

His

Pro

íle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

íle

Leu

ΤΛ2Γ

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

íle

Gin

íle

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

C-ln

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

375

(2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 1135 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) MENO/KÍÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 4 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 13:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGTCCACC7	TGTCCÄGCTC	GGGAACTCCT	GGGC-GGTCCT	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CC-TGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	300
TACAAGTGCA	AGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CÄTCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020

GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT

TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTG7CTCCGG GTTGTTAÄTG GATCC

1080

1135 (2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 1135 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 14:

GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACAGGTGGA	ACAGGTCGAG	GCCTTGAGGA	CCCCCCAGGA	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGC-ACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCC-T	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTCCTC	300
ATGTTCACGT	TCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGC-GGT	AGCTCTTTTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTC-C	AGAAGAGTAC	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGAATTAAT	TTTGCTÄGCA	ATGCGCATAG	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	780
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTGGAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	GTCGTCTAGA	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTAGAGATT	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960
AAGAGGTTTA	ggacggtgga	CGGTACCCGA	AGTCCAGAAC	TCTGAGACCT	GAGAGACCCG	1020
CCCCAGGACC	TTCGTAGGCC	AATGTCGTGG	CTTCAACAAC	GAGACAGGGC	AGACGTCCCA	1080

ÄGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCC-ACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135 (2) ÚDAJE K SEKVENCII ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 374 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH REŤAZCA: neznámy (D) TOPOLÓGIA: neznáma (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (ix) ZNAK:

(A) MENO/KĹÚČ: proteín (B) POZÍCIA: 1 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met (ATG) začína v polohe -1 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 15:

Met 1

Asp

Lys

Thr

His S

Thr

Cvs

Pro

Cys 10

Pre

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp Thr

Leu

20

25

30

Met

íle

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

V a l

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

Asn

Ala

Lys

0%. w * * « k

Lys

Pro

Arg

C-l u

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr

Árg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

145

150

155

160

Glu Trp

Glu

Ser Asn 165

Gly

Gin Pro Glu

Asn Asn 170

Tyr

Lys

Thr

Thr 175

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

A.sn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

íle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

íle

Lys

Thr

íle

Val

Thr

Arg

íle

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Lys

Glu

Lys

val

Thr

Giv

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

250

265

270

Leu

His

Pro

íle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

íle

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

íle

Gin

íle

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 (2) ÚDAJE K SEKVENCIÍ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 1135 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: dvojretazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: CDNA (ix) ZNAK:

(A) MENO/KCÚČ: osobitný znak (B) POZÍCIA: 4 (D) INÁ INFORMÁCIA: Met je ATG (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ. ID. NO: 16:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGCCCACCG	TGCCCAGCTC	CGGAACTCGA	AGGTGGTCCG	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAA-ACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAÄ	TGGCAAÄGCT	300
TACGCATGCG	CGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAÄA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCÄAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGÄG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAÄCCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	ÄACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTC-GACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGA7	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCC'ľ	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCA7	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	C-CCATGGGCT	TCAGGTCTTG	ÄGÄCTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020
GGGGTCCTGG	AAGCATCCGG	TTACAGCACC	GAAGTTGTTG	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT	1080
TCCCTTCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGÄC	CTGTCTCCGG	gttgttaätg	GATCC	1135

Pro

Val

Leu

Asp Ser Asp 180

Gly

Ser

Phe 185

Phe Leu Tyr

Ser Lys 190

Leu

Thr

val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

íle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

íle

Lys

Thr

íle

Val

Thr

Arg

íle

Asn

Asp

íle

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

íle

Pro

Gly

260

265

270

Leu

His

Pro

íle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

íle

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

íle

Gin

íle

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Proteín všeobecného vzorca (R_rR₂) alebo (R_rL-R₂), kde R) predstavuje Fc proteín; R₂ predstavuje OB proteín; a L predstavuje linker, pričom Fc proteín je zvolený zo súboru skladajúceho sa z (a) aminokyselín 1 až 233 zo SEQ, ID. NO:9 a 12 a aminokyselín 1 až 228 zo SEQ, ID. NO:15 a 18;

(b) aminokyselín 1 až 233 zo SEQ. ID. NO:9, v ktorých je nahradená inou aminokyselinou alebo vypustená aminokyselina v jednej alebo väčšom počte nasledujúcich polôh tak, že:

(i) jeden alebo väčší počet cysteínových zvyškov je nahradený zvyškom alanínu alebo serínu;

(ii) jeden alebo väčší počet tyrozínových zvyškov je nahradený zvyškom fenylalanínu;

(iii) aminokyselina v polohe 5 je nahradená alanínom;

(iv) aminokyselina v polohe 20 je nahradená glutamátom;

(v) aminokyselina v polohe 103 je nahradená alanínom;

(vi) aminokyselina v polohe 105 je nahradená alanínom;

(vii) aminokyselina v polohe 107 je nahradená alanínom;

(viii) aminokyselina v polohe 1, 2, 3, 4 a/alebo 5 je vypustená alebo substituovaná;

(ix) je uskutočnená kombinácia zmien (i) až (viii);

(c) aminokyselinovej sekvencie podľa odsekov (a) alebo (b) s metionylovým zvyškom na N-konci;

(d) Fc proteínu podľa ktoréhokoľvek z odsekov (a) až (c), ktorý obsahuje chemický zvyšok pripojený k zvyšku proteínu, kde chemickým zvyškom je polyetylénglykol;

(e) derivátu podľa odseku (d), kde polyetylénglykol je pripojený iba na N-konci zvyšku proteínu.

2. Proteín podľa nároku 1, v ktorom je sekvencia linkera tvorená jednou alebo väčším počtom aminokyselín zvolených zo súboru skladajúceho sa z glycínu, asparagínu, serínu, treonínu a alaninu.

3. Proteín podľa nároku 1, v ktorom je linker zvolený zo súboru skladajúceho sa z (a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala;

(c) ala-ala-ala-ala-ala;

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly;

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h) gly-pro-gly;

(Í) gly-gly-pro-gly-gly a

Q) akejkoľvek kombinácie (a) až (i).

4. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca proteín všeobecného vzorca (R_rR₂) alebo (R_rL-R₂), kde R] predstavuje Fc proteín; R₂ predstavuje OB proteín a L predstavuje linker, pričom Fc proteín je zvolený zo súboru skladajúceho sa z (a) aminokyselín 1 až 233 zo SEQ. ID. NO:9 a 12 a aminokyselín 1 až 228 zo SEQ. ID. NO: 15 a 18;

(i) jeden alebo väčší počet cysteínových zvyškov je nahradený zvyškom alaninu alebo serínu;

(iii) aminokyselina v polohe 5 je nahradená alanínom;

(iv) aminokyselina v polohe 20 je nahradená glutamátom;

(v) aminokyselina v polohe 103 je nahradená alanínom;

(vi) aminokyselina v polohe 105 je nahradená alanínom;

(vii) aminokyselina v polohe 107 je nahradená alanínom;

(viii) aminokyselina v polohe 1, 2, 3, 4 alebo 5 je vypustená alebo substituovaná;

(ix) je uskutočnená kombinácia zmien (i) až (viii);

(c) aminokyselinovej sekvencie podľa odsekov (a) alebo (b) s metionylovým zvyškom na N-konci.

5. Vektor obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny podľa nároku 4.

5. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 4 kódujúca proteín, v ktorom je sekvencia linkera tvorená jednou alebo väčším počtom aminokyselín zvolených zo súboru skladajúceho sa z Gly, Asn, Ser, Thr a Ala.

6. Vektor podľa nároku 7, ktorým je vektor pAMG21 (ATCC 98113) a sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 4.

6. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 4 kódujúca proteín, v ktorom je linker zvolený zo súboru skladajúceho sa z (a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala;

(c) ala-ala-ala-ala-ala;

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly;

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly-gly-pro-gly-gly a (j) akejkoľvek kombinácie (a) až (i).

7. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku 7.

8. Spôsob produkcie proteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň kultivácie hostiteľskej bunky podľa nároku 9 za vhodných podmienok a stupeň izolácie vyrobeného proteínu.

9. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa stupeň purifikácie vyrobeného proteínu.

10. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo proteínu podľa nároku 1 vo farmaceutický vhodnom riedidle, adjuvanse alebo nosiči.

11. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 12 na výrobu liečiva na liečenie poruchy zvolenej zo súboru skladajúceho sa z nadmernej telesnej hmotnosti, diabetes, vysokej hladiny lipidov v krvi, artériosklerózy a arteriálneho plátu, na redukciu alebo prevenciu vzniku žlčových kameňov a liečenie nedostatočnosti tkaniva tvoreného v podstate svalovinou neobsahujúcou tuk, nedostatočnej citlivosti k inzulínu a mŕtvice.