PL194159B1

PL194159B1 - Proteina fuzyjna OB, kompozycja farmaceutyczna zawierająca tę proteinę i zastosowanie tej proteiny, a także kwas nukleinowy kodujący tę proteinę, wektor zawierający ten kwas nukleinowy, komórka gospodarza zawierająca ten wektor oraz sposób wytwarzania proteiny fuzyjnej OB

Info

Publication number: PL194159B1
Application number: PL334242A
Authority: PL
Inventors: Michael Banjamin Mann; Randy Ira Hecht
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2007-05-31
Also published as: NO992779L; NO992779D0; YU27999A; JP4659068B2; NO325096B1; PL334242A1; BG64288B1; AU5606098A; IL130396A; KR20000069617A; SK287578B6; RS49927B; BR9713755A; EA004791B1; ZA9711239B; IL130396A0; CN1246154A; AR009436A1; EP1835030A1; NO20071415L

Abstract

1. Proteina o wzorze wybranym z grupy obejmujacej wzory ogólne R 1-R 2 oraz R 1-L-R 2, w których R 1 oznacza prote- ine Fc lub jej analoga, R 2 oznacza proteine OB lub jej analoga, zas L oznacza lacznik i w których proteina Fc lub jej analog wybrane sa z grupy, która tworza: a) aminokwasy 1-233 sekwencji SEQ ID NO: 9 i 12 oraz aminokwasy 1-228 sekwencji SEQ ID NO: 15 i 18 b) aminokwasy 1-233 sekwencji SEQ ID NO: 9, sposród których rózne aminokwasy sa zastapione lub opuszczone w jednej lub kilku sposród nastepujacych pozycji: (i) jedna lub wiecej reszt cysteinowych jest zastapionych przez reszte alaninowa lub serynowa; (ii) jedna lub wiecej reszt tyrozynowych jest zastapionych przez reszte fenyloalaninowa; (iii) aminokwas w pozycji 5 jest zastapiony przez alanine; (iv) aminokwas w pozycji 20 jest zastapiony przez glutaminian; (v) aminokwas w pozycji 103 jest zastapiony przez alanine; (vi) aminokwas w pozycji 105 jest zastapiony przez alanine; (vii) aminokwas w pozycji 107 jest zastapiony przez alanine; (viii) aminokwasy w pozycjach 1, 2, 3, 4 i/lub 5 sa opuszczone lub podstawione; a takze (ix) jedna lub wiecej reszt jest zastapionych lub opuszczonych dla usuniecia miejsca wiazania receptora Fc; (x) jedna lub wiecej reszt jest zastapionych lub opuszczonych dla usuniecia miejsca wiazania komple- mentu (C1q); a takze (xi) kombinacja elementów z podpunktów (i) do (x). c) sekwencja aminokwasowa z podczesci (a) lub (b) majaca reszte metionylowa na N-koncu; d) proteina Fc lub jej analog z dowolnej podczesci (a) do (c) obejmujaca reszte chemiczna przylaczona do reszty proteinowej; e) pochodna z podczesci (d), w której reszta chemiczna jest ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru; f) pochodna z podczesci (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest glikol polietylenowy; g) pochodna z podczesci (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest ugrupowanie polia- minokwasowe; a takze h) pochodna z podczesci (e), w której ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest przylaczone wylacznie do N-konca reszty proteinowej. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Obecny wynalazek dotyczy proteiny fuzyjnej OB, kompozycji farmaceutycznej zawierającej tę proteinę i zastosowania tej proteiny, a także kwasu nukleinowego kodującego tę proteinę, wektora zawierającego ten kwas nukleinowy, komórki gospodarza zawierającej ten wektor oraz sposobu wytwarzania proteiny fuzyjnej OB.

Stan techniki

Jakkolwiek podstawa molekularna otyłości jest w znacznej mierze nieznana, identyfikacja „genu OB” i kodowanej nim proteiny („proteina OB” lub „leptyna”) rzuciła nieco światła na mechanizmy stosowane przez organizm w celu regulacji odkładania tłuszczu w organizmie. Porównaj: publikacja PCT WO/05309 (12/22/96), Friedman i wsp.; Zhang i wsp., Nature 372: 425-432 (1994); patrz również: the Correction at Nature 374: 479 (1995). Proteina OB jest aktywna in vivo zarówno u myszy mutantów ob/ob (myszy otyłe wskutek defektu w wytwarzaniu produktu genu OB), jak również u normalnych myszy dzikiego typu. Aktywność biologiczna przejawia się, między innymi w spadku wagi ciała. Patrz (informacje ogólne): Barrinaga, „Obese” Protein Slims Mice, Science 269: 475-456 (1995). Proteina OB, jej pochodne i zastosowanie jako modulatorów kontroli wagi i otyłości zwierząt, włączając w to ssaki i człowieka, została ujawniona bardziej szczegółowo w publikacji PCT WO 96/05309 (12/22/96), włączonej wraz z rysunkami do niniejszego tekstu jako odsyłacz.

Inne wpływy biologiczne proteiny OB nie zostały dobrze scharakteryzowane. Wiadomo na przykład, że u myszy mutantów ob/ob podawanie proteiny OB prowadzi do obniżenia poziomów insuliny w surowicy i poziomów glukozy w surowicy. Wiadomo również, że podawanie proteiny OB prowadzi do obniżenia tłuszczu w organizmie. Zaobserwowano to zarówno u myszy mutantów ob/ob, jak również u normalnych myszy nieotyłych. Pelleymounter i wsp., Science 269: 540-543 (1995); Halaas i wsp., Science 269: 543-546 (1995). Patrz również: Campfield i wsp., Science 269: 546-549 (1995) (Obwodowe i centralne podawanie mikrogramowych dawek proteiny OB zmniejszyło pobieranie pożywienia i ciężar ciała myszy otyłych ob/ob i w skutek diety, lecz nie u myszy db/db). W żadnym z tych doniesień nie zaobserwowano toksyczności, nawet przy najwyższych dawkach.

Pomimo zapowiedzi klinicznego zastosowania proteiny OB, sposób działania proteiny OB in vivo nie jest wyraźnie wyjaśniony. Informacja dotycząca receptora OB wskazuje na wiązanie z wysokim powinowactwem proteiny OB wykryte w podwzgórzu szczura, co świadczy o umiejscowieniu receptora OB. Stephens i wsp., Nature 377: 530-532. Mysz db/db przedstawia identyczny fenotyp jak mysz ob/ob, tzn. skrajną otyłość i cukrzycę typu II; uważa się, że ten fenotyp wynika z wadliwego receptora OB, zwłaszcza że myszy db/db nie reagują na podawanie proteiny OB. Patrz wyżej Stephens i wsp..

Wraz z postępami w technikach rekombinacyjnego DNA dostępność protein rekombinacyjnych dla zastosowań terapeutycznych zrodziła postęp w formulacji i chemicznym modyfikowaniu protein. Jednym z celów takiej modyfikacji jest ochrona i zmniejszenie degradacji proteiny. Proteiny fuzyjne i przyłączenia chemiczne mogą skutecznie blokować fizyczny kontakt enzymu proteolitycznego z samym szkieletem proteiny i tym samym zapobiegać degradacji. Dodatkowe korzyści obejmują - pod pewnymi warunkami - zwiększenie trwałości, czasu krążenia i aktywności biologicznej proteiny terapeutycznej. Artykuł przeglądowy, opisujący modyfikację protein i proteiny fuzyjne to: Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (maj 1992) (opublikowany przez Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, Wielka Brytania).

Jedną z takich modyfikacji jest użycie obszaru Fc immunoglobulin. Przeciwciała obejmują dwie funkcjonalnie niezależne części, zmienną domenę - zwaną „Fab”, która wiąże antygen oraz stałą domenę - znaną jako „Fc”, która zapewnia połączenie z funkcjami efektorowymi takimi, jak komórki komplementów lub fagocytarne. Część Fc immunoglobuliny ma długi okres półtrwania w osoczu, podczas gdy Fab - krótki okres półtrwania. Capon i wsp., Nature 337: 525-531 (1989).

Skonstruowano terapeutyczne produkty proteinowe stosując domenę Fc by zapewnić dłuższy okres półtrwania bądź by włączyć funkcje takie, jak wiązanie receptora Fc, wiązanie proteiny A, ustalenie komplementu i przenikanie łożyskowe, które to funkcje, wszystkie związane są z proteinach Fc immunoglobulin. Id. Przykładowo, obszar Fc przeciwciała IgG1 poddano fuzji z N-końcem CD30-L - cząsteczki, która wiąże się z receptorami CD30 podlegającymi ekspresji na nowotworowych komórkach w chorobie Hodgkina, anaplastycznych komórkach chłoniaka, komórkach białaczki komórek T i innych typach komórek złośliwych. Patrz: patent Stanów Zjednoczonych nr 5,480,981. IL-10,

PL 194 159 B1 czynnik przeciwzapalny i zapobiegający odrzutom, poddano fuzji z mysim Fcg2a aby zwiększyć krótki czas półtrwania tej cytokiny w krwioobiegu. Zheng, X. i wsp., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995). W badaniach oceniono także zastosowanie receptora czynnika martwicy nowotworu połączonego z proteiną Fc ludzkiej IgG1 w leczeniu pacjentów z szokiem septycznym. Fisher, C. I wsp., N. Engl. J. Med., 334: leczeniu pacjentów z szokiem septycznym. Fisher, C. I wsp., N. Engl. J. Med., 334: 1697-1702 (1996); Van Zee, K. i wsp., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996). Fc poddano także fuzji z receptorem CD4 by wytworzyć proteinę terapeutyczną do leczenia AIDS. Patrz: Capon i wsp., Nature, 337: 525-531 (1989). Ponadto, także N-koniec interleukiny 2 poddano fuzji z częścią Fc IgG1 lub IgG3 aby przezwyciężyć krótki czas półtrwania interleukiny 2 i jej toksyczność układową. Patrz: Harvill i wsp., Immunotechnology, 1: 95-105 (1995).

Na skutek identyfikacji proteiny OB jako obiecującej proteiny terapeutycznej powstało zapotrzebowanie na opracowanie kompozycji zawierających analog OB do stosowania klinicznego w połączeniu z proteiną OB lub zamiast tej proteiny. Takie opracowanie objęłoby kompozycje z analogiem OB, w których dzięki zastosowanym formulacjom białkowym oraz modyfikacjom chemicznym można byłoby doprowadzić do obniżenia degradacji protein, zwiększenia trwałości i czasu cyrkulacji. Obecny wynalazek dostarcza takich kompozycji.

Istota wynalazku

Wynalazek dotyczy proteiny o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc lub jej analoga, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina Fc lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

a) aminokwasy 1-233 sekwencji SEQ ID NO: 9 i 12 oraz aminokwasy 1-228 sekwencji SEQ ID NO: 15 i 18

b) aminokwasy 1-233 sekwencji SEQ ID NO:9, spośród których różne aminokwasy są zastąpione lub opuszczone w jednej lub kilku spośród następujących pozycji:

(i) jedna lub więcej reszt cysteinowych jest zastąpionych przez resztę alaninową lub serynową;

(ii) jedna lub więcej reszt tyrozynowych jest zastąpionych przez resztę fenyloalaninową;

(iii) aminokwas w pozycji 5 jest zastąpiony przez alaninę;

(iv) aminokwas w pozycji 20 jest zastąpiony przez glutaminian;

(v) aminokwas w pozycji 103 jest zastąpiony przez alaninę;

(vi) aminokwas w pozycji 105 jest zastąpiony przez alaninę;

(vii) aminokwas w pozycji 107 jest zastąpiony przez alaninę;

(viii) aminokwasy w pozycjach 1, 2, 3, 4 i/lub 5 są opuszczone lub podstawione; a także (ix) jedna lub więcej reszt jest zastąpionych lub opuszczonych dla usunięcia miejsca wiązania receptora Fc;

(x) jedna lub więcej reszt jest zastąpionych lub opuszczonych dla usunięcia miejsca wiązania komplementu (C1q); a także (xi) kombinacja elementów z podpunktów (i) do (x).

c) sekwencja aminokwasowa z podczęści (a) lub (b) mająca resztę metionylową na N-końcu;

d) proteina Fc lub jej analog z dowolnej podczęści (a) do (c) obejmująca resztę chemiczną przyłączoną do reszty proteinowej;

e) pochodna z podczęści (d), w której resztą chemiczną jest ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru;

f) pochodna z podczęści (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest glikol polietylenowy;

g) pochodna z podczęści (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest ugrupowanie poliaminokwasowe; a także

h) pochodna z podczęści (e), w której ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest przyłączone wyłącznie do N-końca reszty proteinowej.

Korzystnie w proteinie według wynalazku proteina OB lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

a) sekwencja aminokwasów 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 3, bądź sekwencji SEQ ID NO: 6;

b) sekwencja aminokwasowa 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 6, mająca resztę lizenową w pozycji oraz resztę izoleucynową w pozycji 74;

PL 194 159 B1

c) sekwencja aminokwasowa z podczęści (b), mająca różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89,97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118,

136, 138, 142 oraz 145;

d) sekwencja aminokwasowa z podczęści (a), (b) lub (c), w której ewentualnie jest brak reszty glutaminylowej w pozycji 28;

e) sekwencja aminokwasowa z podczęści (a), (b), (c) lub (d) mająca resztę metionylową na N-końcu;

f) obcięty analog proteiny OB wybrany z grupy obejmującej (numeracja według SEQ ID NO: 6 mającej resztę lizynową w pozycji 35 oraz resztę izoleucynową w pozycji 74):

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytuowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99 -112, a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

(vii) obcięty analog z podczęści (f)(ii) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8 oraz 32 podstawionych innym aminokwasem;

(viii) obcięty analog z podczęści (f)(iii) mający jeden lub więcej aminokwasów 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 oraz 112 zastąpionych innym aminokwasem;

(ix) obcięty analog z podczęści (f)(iv) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpionych innym aminokwasem;

(x) obcięty analog z podczęści (f)(v) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpionych innym aminokwasem;

(xi) obcięty analog z podczęści (f)(i) do (f)(x) mający N-końcową resztę metionylową;

(g) proteina OB lub jej analog według dowolnej podczęści (a) do (f) obejmująca resztę chemiczną przyłączoną do reszty proteinowej;

(h) pochodna z podczęści (g), w której resztą chemiczną jest ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru (i) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest glikol polietylenowy;

(j) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest ugrupowanie poliaminokwasowe; a także (k) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest przyłączone wyłącznie do N-końca reszty proteinowej.

W proteinie według wynalazku sekwencję łącznika tworzy jeden lub więcej aminokwasów wybranych z grupy, którą tworzą glicyna, aspargina, seryna, treonina i alanina.

Korzystnie, łącznik jest wybrany z grupy, którą tworzą:

a) ala-ala-ala;

b)ala-ala-ala-ala;

c) ala-ala-ala-ala-ala;

d) gly-gly;

e) gly-gly-gly;

f) gly-gly-gly-gly-gly;

g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

h) gly-pro-gly;

i)gly-gly-pro-gly-gly;

j) reszta chemiczna, a także

k) dowolna k ombinacja podczęści (a) do (j).

PL 194 159 B1

Wynalazek dotyczy także proteiny o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina OB lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

b) sekwencja aminokwasów 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 6, mająca resztę lizynową w pozycji oraz resztę izoleucynową w pozycji 74;

c) sekwencja aminokwasów z podczęści (b), mająca różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145;

d) sekwencja aminokwasów z podczęści (a), (b) lub (c), w której ewentualnie jest brak reszty glutaminylowej w pozycji 28;

e) sekwencja aminokwasów z podczęści (a), (b), (c) lub (d) mająca resztę metionylową na N-końcu;

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99-112, a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

(ix) obcięty analog z podczęści (t)(iv) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpionych innym aminokwasem;

g) proteina OB lub jej analog według dowolnej podczęści (a) do (f) obejmująca resztę chemiczną przyłączoną do reszty proteinowej;

h) pochodna z podczęści (g), w której resztą chemiczną jest ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru;

i) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest glikol polietylenowy;

j) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest ugrupowanie poliaminokwasowe; a także

k) pochodna z podczęści (h), w której ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest przyłączone wyłącznie do N-końca reszty proteinowej.

Wynalazkiem objęta jest także sekwencja kwasu nukleinowego kodującego proteinę o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc lub jej analoga, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina Fc lub jej analog są wybrane z grupy, którą tworzą:

b) aminokwasy 1-233 sekwencji SEQ ID NO: 9, spośród których różne aminokwasy są zastąpione lub opuszczone w jednej lub kilku spośród następujących pozycji:

(i) jedna lub więcej reszt cysteinowych jest zastawionych przez resztę alaninową lub serynową;

(ii) jedna lub więcej reszt tyrozynowych jest zastąpionych przez resztę fenyloalaninowa;

PL 194 159 B1 (iii) aminokwas w pozycji 5 jest zastąpiony przez alaninę;

(iv) aminokwas w pozycji 20 jest zastąpiony przez glutaminian;

(v) aminokwas w pozycji 103 jest zastąpiony przez alaninę;

(vi) aminokwas w pozycji 105 jest zastąpiony przez alaninę;

(vii) aminokwas w pozycji 107 jest zastąpiony przez alaninę;

(viii) aminokwasy w pozycjach 1, 2, 3, 4 i/lub 5 są opuszczone lub podstawione;

(ix) jedna lub więcej reszt jest zastąpionych lub opuszczonych dla usunięcia miejsca wiązania receptora Fc;

c) sekwencja aminokwasowa z podczęści (a) lub (b) mająca resztę metionylową na N-końcu.

Wynalazek obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego, kodującego proteinę, w której proteina

OB lub jej analog są, korzystnie wybrane jest z grupy, którą tworzą:

b) sekwencja aminokwasów 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 6, mająca resztę lizynową w pozycji 35 oraz resztę izoleucynową w pozycji 74;

c) sekwencja aminokwasów z podczęści (b), mająca różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89,97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145;

e) sekwencja aminokwasów z podczęści (a), (b), (c) lub (d) mająca resztę metionylową na N-końcu; a także obcięty analog proteiny OB wybrany z grupy obejmującej (numeracja według SEQ ID NO: 6 mającej resztę lizynową w pozycji 35 oraz resztę izoleucynową w pozycji 74):

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytuowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99 - 112, a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

(x) obcięty analog z podczęści (f)(v) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpionych innym aminokwasem; a także (xi) obcięty analog z podczęści (f)(i) do (f)(x) mający N-końcową resztę metionylową. Wynalazek obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującego proteinę, w której sekwencję łącznika tworzy jeden lub więcej aminokwasów wybranych z grupy obejmującej glicynę, asparginę, serynę, treoninę i alaninę.

PL 194 159 B1

Korzystnie, wynalazek obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującego proteinę, w której łącznik jest wybrany z grupy obejmującej:

a) ala-ala-ala;

b) ala-ala-ala-ala;

c) ala-ala-ala-ala-ala;

d) gly-gly;

e) gly-gly-gly;

f) gly-gly-gly-gly-gly;

g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

h) gly-pro-gly;

i) gly-gly-pro-gly-gly; a także

j) dowolne kombinacje podczęści (a) do (i).

Wynalazek obejmuje również sekwencję kwasu nukleinowego kodującego proteinę o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina OB lub jej analog są wybrane z grupy, którą tworzą:

e) sekwencja aminokwasów z podczęści (a), (b), (c) lub (d) mająca resztę metionylową na N-końcu; a także

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytuowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99-112, a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

(x) obcięty analog z podczęści (f)(v) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpionych innym aminokwasem; a także (xi) obcięty analog z podczęści (f)(i) do (f)(x) mający N-końcową resztę metionylową.

Wektor według wynalazku zawiera wyżej określoną sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku.

PL 194 159 B1

Korzystnie, wektorem tym jest pAMG21 zawierający sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku, określoną wyżej.

Wynalazek obejmuje także prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę gospodarza zawierającą wektor według wynalazku, określony wyżej.

Ponadto, wynalazek obejmuje sposób wytwarzania wyżej określonej proteiny fuzyjnej według wynalazku, obejmujący etapy prowadzenia w odpowiednich warunkach hodowli wyżej określonej komórki gospodarza według wynalazku oraz wyodrębniania wytworzonej proteiny.

Korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytworzonej proteiny.

Wynalazkiem objęta jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca skuteczną ilość proteiny według wynalazku, określonej wyżej, w farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalniku, adiuwancie lub nośniku.

Jednocześnie wynalazek odnosi się także do zastosowania proteiny według wynalazku określonej wyżej jako leku do stosowania zwłaszcza w leczeniu stanów, zaburzeń i chorób wybranych z grupy obejmującej nadwagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, stwardnienie tętnic, płytkę tętniczą, zmniejszenie lub zahamowanie tworzenia kamieni żółciowych, niedostateczną masę tkanki beztłuszczowej, niedostateczną wrażliwość na insulinę i udar, u zwierząt, w szczególności u ssaków oraz u ludzi.

Zastosowanie według wynalazku cechuje się tym, że wytwarzany środek zawiera terapeutycznie skuteczną ilość proteiny według wynalazku, określonej wyżej.

Korzystnie, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wytwarzany środek przeznaczony jest do stosowania w medycynie ludzkiej.

Obecny wynalazek dotyczy zatem kompozycji zawierających proteinę fuzyjną Fc-OB oraz sposobów wytwarzania takich kompozycji i ich zastosowań. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy genetycznej proteiny fuzyjnej obejmującej obszar Fc immunoglobuliny lub jego analog poddany fuzji z N-końcową częścią proteiny OB lub jej analoga. Proteina fuzyjną Fc-OB jest zdolna do dimeryzacji przez reszty cysteinowe obszarów Fc. Nieoczekiwanie, genetyczna modyfikacja fuzyjna przy użyciu Fc przy N-końcu proteiny OB jest korzystna pod względem trwałości, szybkości zaniku w organizmie i obniżonej degradacji, których nie obserwuje się w przypadku proteiny OB lub w przypadku fuzji Fc do C-końca proteiny OB. Zaskakująco, i co jest bardzo istotne, modyfikacja N-końca dostarcza nieoczekiwanej ochrony proteiny przed degradacją, zwiększa czas cyrkulacji i trwałość w porównaniu z proteiną OB lub modyfikacją polegającą na fuzji Fc do C-końca proteiny OB. Takie nieoczekiwane korzyści wynikające z modyfikacji proteiny OB domeną Fc są korzystne dla konsumentów proteiny OB w tym sensie, że zmiany te przyczyniają się do obniżenia wymaganych dawek lub rzadszego dawkowania. Tak więc, obecny wynalazek ma szereg aspektów -jak to bardziej szczegółowo opisano poniżej, odnoszących się do genetycznej modyfikacji protein poprzez fuzję obszaru Fc do proteiny OB (lub jej analogów), jak również specyficznych modyfikacji, preparatów i ich zastosowań.

Zgodnie z powyższym, w jednym aspekcie obecny wynalazek zapewnia proteinę fuzyjną Fc-OB, w której Fc jest genetycznie poddane fuzji do N-końca proteiny OB (lub jej analogów). Ponadto, część Fc może być także połączona z N-końcem proteiny OB (lub jej analogów) poprzez łączniki peptydowe lub chemiczne tak, jak to jest znane w stanie techniki. Jak zaznaczono powyżej i opisano bardziej szczegółowo poniżej, proteina fuzyjną Fc-OB ma nieoczekiwaną ochronę przed degradacją oraz zwiększony czas cyrkulacji oraz trwałość w porównaniu z proteiną OB lub proteinami fuzyjnymi C-końca OB-Fc. Dodatkowe aspekty obecnego wynalazku obejmują zatem nie tylko kompozycje proteiny fuzyjnej Fc-OB, lecz także sekwencje DNA kodujące takie proteiny, związane z nimi wektory i komórki gospodarza zawierające takie wektory, jedne i drugie przydatne do wytwarzania protein fuzyjnych według obecnego wynalazku.

W drugim aspekcie obecny wynalazek zapewnia wytwarzanie proteiny fuzyjnej Fc-OB. Sposoby te obejmują techniki rekombinacyjne DNA wytwarzania protein rekombinacyjnych. Ponadto, sposoby takie obejmują także sposoby fermentacji i oczyszczania.

W innym aspekcie obecny wynalazek zapewnia zastosowanie protein fuzyjnych Fc-OB według wynalazku do wytwarzania środków medycznych do leczenia nadmiernej wagi u ludzi lub zwierząt łącznie z modulowaniem i/lub odkładaniem tłuszczu. Dzięki właściwościom proteiny fuzyjnej Fc-OB wynalazek pozwala na zmniejszenie ilości i/lub częstotliwości dawkowania proteiny OB poprzez zastosowanie obniżającego wagę środka zawierającego proteinę fuzyjną Fc-OB.

PL 194 159 B1

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania protein fuzyjnych według wynalazku do wytwarzania środków medycznych do leczenia równocześnie występujących stanów chorobowych związanych z nadmiarem tłuszczu, takich jak cukrzyca, dys- lub hiperlipidemia, stwardnienie tętnic, płytka tętnicza, zmniejszenie lub przeciwdziałanie tworzeniu kamieni żółciowych, obżarstwa, a także zwiększenie wrażliwości na insulinę i/lub zwiększenie masy tkanek beztłuszczowych.

Obecny wynalazek zapewnia także związane z tym kompozycje farmaceutyczne zawierające proteiny Fc-OB, ich analogi i pochodne, przydatne terapeutycznie w leczeniu w powyższych chorób.

Krótki opis rysunków

Figura 1: DNA (dwuniciowy) rekombinacyjnego mysiego metOB (SEQ ID NO 1 i 2) oraz sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 3).

Figura 2: Analog DNA (dwuniciowego) rekombinacyjnego ludzkiego metOB (SEQ ID NO 4 i 5) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 6).

Figura 3 (A-C): DNA (dwuniciowy) rekombinacyjnego ludzkiego metFc-OB (SEQ ID NO 7 i 8) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 9).

Figura 4 (A-C): Odmiana DNA (dwuniciowego) rekombinacyjnego ludzkiego metFc-OB (SEQ ID NO 10 i 11) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 12).

Figura 5 (A-C): Odmiana DNA (dwuniciowego) rekombinacyjnego ludzkiego metFc-OB (SEQ ID NO 13 i 14) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 15).

Figura 6 (A-C): Odmiana DNA (dwuniciowego) rekombinacyjnego ludzkiego metFc-OB (SEQ ID NO 16 i 17) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 18).

Szczegółowy opis wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy kompozycji z fuzyjną proteiną Fc-OB, sposobów wytwarzania takich kompozycji i ich zastosowań. W szczególności, obecny wynalazek dotyczy genetycznej lub chemicznej fuzji obszaru Fc immunoglobulin do N-końca proteiny OB. Nieoczekiwanie, fuzja Fc przy N-końcu proteiny OB wykazuje korzyści, których brak w przypadku proteiny OB lub w przypadku fuzji Fc do C-końca proteiny OB. Zaskakująco, N-końcowo zmodyfikowana proteina Fc-OB zapewnia nieoczekiwaną ochronę proteiny przed degradacją, zwiększony czas cyrkulacji i zwiększoną trwałość. Zgodnie z powyższym, proteina fuzyjna Fc-OB i jej analogi lub pochodne, jak również związane z tym sposoby stosowania i wytwarzania opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Kompozycje

Sekwencję Fc rekombinacyjnej sekwencji ludzkiego Fc-OB podaną w SEQ ID NO 9 (patrz fig. 3) można wybrać z ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG-1; patrz Ellison, J. W. i wsp., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982) lub z jakiejkolwiek innej sekwencji Fc znanej w stanie techniki (przykładowo, z innych klas IgG włączając w to, lecz nie ograniczając się do IgG-2, IgG-3 i IgG-4 lub innych immunoglobulin). Odmianę, analogi lub pochodne części Fc można skonstruować, przykładowo, przez wykonanie różnych podstawień reszt lub sekwencji.

Reszty cysteinowe można usunąć lub zastąpić innymi aminokwasami by uniknąć tworzenia poprzecznych wiązań dwusiarczkowych pomiędzy sekwencjami Fc. W szczególności, aminokwas w pozycji 5 sekwencji SEQ ID NO 9 - to reszta cysteinowa. Rekombinacyjna sekwencja Fc-OB sekwencji SEQ ID NO 9 to proteina Fc-OB o 378 aminokwasach (nie licząc reszty metioninowej). Pierwszą sekwencję aminokwasową rekombinacyjnej proteiny Fc-OB z rysunku fig. 3 określa się jako +1 z metioniną w pozycji -1.

Można usunąć resztę cysteinową w pozycji 5 lub podstawić ją jednym lub więcej aminokwasami. Resztę alaninową można podstawić za resztę cysteinową w pozycji 6 uzyskując odmianę sekwencji aminokwasowej z rysunku fig. 4 (SEQ ID NO 12). Rekombinacyjna proteiną Fc-OB z fig. 4 jest proteina Fc-OB o 378 aminokwasach (nie licząc reszty metioninowej). Pierwszą sekwencję aminokwasową rekombinacyjnej proteiny Fc-OB z rysunku fig.4 określa się jako +1 z metioniną w pozycji -1.

Podobnie, cysteinę w pozycji 5 sekwencji SEQ ID NO 9 można podstawić seryną lub inną resztą aminokwasową lub ją usunąć. Można także wytworzyć odmianę lub analog przez usunięcie aminokwasów w pozycjach 1, 2, 3, 4 i 5, jak w przypadku odmiany w SEQ ID NO 15 (patrz fig. 5). Można również wykonać podstawienia w tych pozycjach i mieszczą się one w zakresie obecnego wynalazku. Rekombinacyjna proteiną Fc-OB z rysunku fig. 5 jest proteina Fc-OB o 373 aminokwasach (nie licząc reszty metioninowej). Pierwszą sekwencję aminokwasową rekombinacyjnej proteiny Fc-OB z rysunku fig.5 określa się jako +1 z metioniną w pozycji -1.

PL 194 159 B1

Można także wykonać modyfikacje by wprowadzić cztery podstawienia aminokwasów by usunąć miejsce wiązania receptora Fc i miejsce wiązania komplementu (C1q). Te modyfikacje odmiany SEQ ID NO 15 objęłyby leucynę w pozycji 15 podstawioną glutaminianem, glutaminian w pozycji 98 podstawiony alaniną i lizyny w pozycjach 100i 102 podstawione alaninami (patrz fig.6 i SEQ ID NO 18). Rekombinacyjną proteiną Fc-OB z rysunku fig. 6 jest proteina Fc-OB o 373 aminokwasach (nie licząc reszty metioninowej). Pierwszą sekwencję aminokwasową rekombinacyjnej proteiny Fc-OB z rysunku fig. 6 określa się jako +1 z metioniną w pozycji -1.

Podobnie, jedną lub więcej reszt tyrozynowych można także zastąpić resztami fenyloalaninowymi. W dodatku, inne wariantowe wstawienia, delecje i/lub podstawienia aminokwasów są również możliwe i mieszczą sięw zakresie obecnego wynalazku. Ponadto, zmiany mogą być w postaci zmienionych aminokwasów takich, jak poptydomimetyki lub D-aminokwasy. Proteinę Fc można również połączyć z proteinami OB w proteinie Fc-OB przez ugrupowania łącznikowe, zarówno chemiczne jak i aminokwasowe o zmiennej długości. Takie łączniki chemiczne są dobrze znane w stanie techniki. Sekwencje łączników aminokwasowych mogą obejmować, lecz nie są do nich ograniczone:

(a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala;

(c)ala-ala-ala-ala-ala;

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly;

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly-gly-pro-gly-gly; i (j) dowolne kombinacje podczęści (a) do (i).

Część OB proteiny fuzyjnej Fc-OB można wybrać spomiędzy rekombinacyjnej proteiny mysiej określonej sekwencją SEQ ID NO 3 (patrz fig.1) lub rekombinacyjnej proteiny ludzkiej wskazanej w publikacji: Zhang i wsp., Nature, jak wyżej, (tu przywołanej w charakterze odnośnika) lub proteiny pozbawionej reszty glutaminylowej w pozycji 28. (Patrz Zhang i wsp., Nature, jak wyżej, na stronie 428). Można także użyć analoga ludzkiej rekombinacyjnej proteiny OB określonej sekwencją SEQ ID NO 6 (patrz fig. b2), który zawiera: (1) argininę w miejsce lizyny w i pozycji 35 i (2) leucynę w miejsce izoleucyny w pozycji 74. (Skrótowe określenie tego analogu jest następujące: rekombinacyjna ludzka R->L³⁵, I->L⁷⁴). Sekwencje aminokwasowe rekombinacyjnych ludzkich i rekombinacyjnych mysich protein lub ich analogów z częścią Fc fuzyjnie przyłączoną do N-końca proteiny OB lub bez tej części - podano poniżej wraz z resztą metionylową w pozycji -1; jednakże tak, jak w przypadku jakiejkolwiek z obecnych protein OB i analogów, reszta metionylowa może być nieobecna.

Proteina mysia jest zasadniczo homologiczna względem proteiny ludzkiej, szczególnie jako proteina dojrzała i - ponadto -w szczególności przy N-końcu. Można wytworzyć analog rekombinacyjnej proteiny ludzkiej przez zmianę (taką, jak podstawienie reszt aminokwasowych) w rekombinacyjnej sekwencji ludzkiej tych aminokwasów, które odbiegają od sekwencji mysiej. Z uwagi na to, że rekombinacyjna proteina ludzka ma aktywność biologiczną u myszy, taki analog prawdopodobnie byłby aktywny u ludzi. Przykładowo, stosując proteinę ludzką zawierającą lizynę jako resztę 35 i izoleucynę jako resztę 74 według numeracji SEQID NO 6, w której pierwszym aminokwasem jest walina, a aminokwasem w pozycji 146 jest cysteina, można podstawić innym aminokwasem jeden lub więcej aminokwasów w pozycjach 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 i 145. Można wybrać aminokwas w odpowiedniej pozycji proteiny mysiej (SEQ ID NO 3) lub inny aminokwas.

Można ponadto wytworzyć cząsteczki „zgodne” oparte na sekwencji szczurzej proteiny OB. Publikacja Murakami i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944-952 (1995) - włączona tu jako odnośnik. Szczurza proteina OB różni się od ludzkiej proteiny OB w następujących pozycjach (przy użyciu numeracji SEQ ID NO 6): 4,32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106. 107, 108, 111, 118, 136, 138 i 145. Można podstawić innym aminokwasem jeden lub więcej aminokwasów w tych różniących się pozycjach. Pozycje zaznaczone tłustym drukiem to te, w których mysia proteina OB, jak również szczurza proteina OB,różni się od ludzkiej proteiny OB i tym samym są one szczególnie nadające się do zmiany. Wjednej lub więcej pozycjach można podstawić aminokwas z odpowiedniej szczurzej proteiny OB lub inny aminokwas.

PL 194 159 B1

Pozycje z zarówno szczurzej, jak i mysiej proteiny OB, które różnią się od dojrzałej proteiny ludzkiej OB, są następujące: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 i 145. Proteina OB według SEQ ID NO 6 o jednym lub więcej z powyższych aminokwasów zastąpionych innym aminokwasem, takim jak aminokwas występujący w odpowiedniej sekwencji szczurzej lub mysiej, może także być efektywna.

Ponadto, aminokwasy stwierdzone w proteinie OB od małpy rezusa, które różnią się od dojrzałej proteiny ludzkiej OB, są następujące (ze wskazaniem w nawiasach ich identyfikacji za pomocą jednoliterowego skrótu nazwy aminokwasu): 8(S), 35®, 48(V), 53(Q), 60(I), 66(1), 67(N), 68(L), 89(L), 100(L), 108(E), 112(D) i 118(L). Z uwagi na to, że rekombinacyjna proteina ludzka OB jest aktywna u małp gatunku cynomolgus, ludzka proteina OB według SEQ ID NO 6 (z lizyną w pozycji 35 i izoleucyną w pozycji 74) mająca jeden lub więcej aminokwasów innych niż w proteinie od małp rezusa, zastąpionych innym aminokwasem takim, jak aminokwasy w nawiasie, może być skuteczna. Należy zaznaczyć, że pewne aminokwasy różne w przypadku rezusa to takie, które także znajdują się w powyższych mysich związkach (pozycje 35, 68, 89, 100 i 112). A zatem, można wytworzyć cząsteczkę „zgodnego” mysiego/rezusowego/ludzkiego związku, mającą (stosując numerację SEQ ID NO 6 mającej lizynę w pozycji 35 i izoleucynę w pozycji 74) jeden lub więcej aminokwasów zastąpionych przez inny aminokwas w pozycjach: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112,118, 136, 138, 142 i 145.

Inne analogi można wytworzyć przez usunięcie części sekwencji aminokwasowej proteiny. Przykładowo, dojrzała proteina nie ma sekwencji lidera (-22 do -1). Można wytworzyć następujące obcięte formy cząsteczek ludzkiej proteiny OB (stosując numerację SEQ ID NO 6):

a) aminokwasy 98-146

b) aminokwasy 1-32

c) aminokwasy 40-116

d) aminokwasy 1-99 i (połączone z) 112-146

e) aminokwasy 1-99 i (połączone z) 112-146, mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 pomiędzy aminokwasami 99 i 112.

Ponadto, obcięte formy mogą także mieć zmieniony jeden lub więcej aminokwasów, które są różne (w szczurzej, mysiej lub rezusowej proteinie OB) od ludzkiej proteiny OB. Ponadto, wszelkie zmiany mogą być w postaci zmienionych aminokwasów takich, jak peptydomimetyki lub D-aminokwasy.

A zatem, obecny wynalazek obejmuje proteinę fuzyjną Fc-OB, w której proteina OB jest wybrana z grupy obejmującej:

a) sekwencję aminokwasową 1-146, jak określono w SEQ ID NO 3 lub SEQ ID NO 6;

b) sekwencję aminokwasową 1-146, jak określono w SEQ ID NO 6, mającą resztę lizynową w pozycji 35 oraz reszę izoleucynową w pozycji 74;

c) sekwencję aminokwasową z podczęści (b), mającą różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO 6, z zachowaniem tej samej numeracji nawet w przypadku nie obecności reszty glutaminylowej w pozycji 28): 4, 32,

33, 35, 48, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 oraz 145;

d) sekwencję aminokwasową z podczęści (a), (b) lub (c), w której jest ewentualnie brak reszty glutaminylowej w pozycji 28;

e) sekwencję aminokwasową z podczęści (a), (b) (c) lub (d) mającą resztę metionylową na N-końcu;

f) obcięty analog proteiny OB wybrany z grupy obejmującej (numeracja według SEQ ID NO 6):

(xii) aminokwasy 98-146 (xiii) aminokwasy 1-32 (xiv) aminokwasy 40-116 (xv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (xvi) aminokwasy 1-99 oraz 112-146, mające jeden lub kilka aminokwasów 100-111 usytuowanych pomiędzy aminokwasami 99-112; i (xvii) obcięty analog OB z podczęści (i) mający jeden lub kilka aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpiony innym aminokwasem;

(xviii) obcięty analog z podczęści (ii) mający jeden lub kilka aminokwasów 4, 8 oraz 32 zastąpiony innym aminokwasem;

PL 194 159 B1 (xix) obcięty analog z podczęści (iii) mający jeden lub kilka aminokwasów 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 oraz 112 zastąpiony innym aminokwasem;

(xx) obcięty analog z podczęści (iv) mający jeden lub kilka aminokwasów 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89,97,112,118,136, 138,142 oraz 145 zastąpiony innym aminokwasem;

(xxi) obcięty analog z podczęści (v) mający jeden lub kilka aminokwasów 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 oraz 145 zastąpiony innym aminokwasem;

(xxii) obcięty analog z dowolnej podczęści (i) do (x) mający resztę metionylową na N-końcu;

g) proteinę OB lub pochodny analog z dowolnej podczęści (a) do (f), obejmującą resztę chemiczną przy łączoną do reszty proteinowej;

h) pochodną z podczęści (g), w której resztą chemiczną jest ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru

i) pochodną z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest glikol polietylenowy;

j) pochodną z podczęści (h), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest ugrupowanie poliaminokwasowe;

k) pochodną z podczęści (h), w której ugrupowanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru jest przyłączone wyłącznie do N-końca tego ugrupowania proteinowego.

Pochodne

Obecne proteiny fuzyjne OB (w niniejszym tekście określenie „proteina” stosuje się w znaczeniu obejmującym „peptyd”, Fc, OB lub ich analogi takie, jak wymienione wyżej, o ile nie wskazano inaczej) derywatyzuje się przez dołączenie jednego lub więcej ugrupowań chemicznych do ugrupowania proteiny fuzyjnej Fc-OB Te chemicznie zmodyfikowane pochodne można dalej formułować stosownie do sposobu podawania: dotętniczego, śródotrzewnowego, domięśniowego podskórnego, dożylnego, doustnego, donosowego, dopłucnego, miejscowego zewnętrznego lub innych dróg podawania, jak omówiono poniżej.

Stwierdzono, że chemiczna modyfikacja aktywnych biologicznie protein dostarcza dodatkowych cech korzystnych w pewnych okolicznościach, takich jak zwiększenie trwałości i czasu cyrkulacji proteiny terapeutycznej i obniżenie immunogeniczności. Patrz: patent Stanów Zjednoczonych nr 4,179,337, Davis i wsp., udzielony 18 grudnia 1979 roku. Dla ogólnego przeglądu patrz Abuchowski i wsp., w: Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg i J. Roberts, eds. strony 367-383 (1981)); Francis i wsp., jak wyżej.

Ugrupowania chemiczne odpowiednie dla takiej derywatyzacji można wybrać spośród polimerów rozpuszczalnych w wodzie. Wybrany polimer powinien być rozpuszczalny w wodzie tak, by proteina, do której jest on dołączony, nie wytrącała się w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne.

Korzystnie, dla terapeutycznego stosowania preparatu zawierającego produkt końcowy, polimer będzie dopuszczalny farmaceutycznie. Biegły w sztuce będzie w stanie wybrać pożądany polimer opierając się na takich rozważaniach jak to, czy koniugat polimer/proteina będzie stosowany terapeutycznie, a jeżeli tak, to w oparciu o żądane dawkowanie, czas cyrkulacji, odporność na proteolizę i inne względy. W przypadku obecnych protein i peptydów, skuteczność derywatyzacji można określić przez podanie pochodnej w pożądanej formie (to jest za pomocą pompy osmotycznej lub - korzystniej - przez iniekcję lub infuzję lub w bardziej przetworzonej postaci, przykładowo do podawania doustnego, dopłucnego lub donosowego) i zaobserwowanie efektów biologicznych, jak to opisano w niniejszym tekście.

Rozpuszczalny w wodzie polimer może być wybrany z grupy, na którą składają się, przykładowo, glikol polietylenowy, kopolimery glikol etylenowy/glikol propylenowy, karboksymetyloceluloza, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, poly-1,3-dioksolan, poly-1,3,6-trioksan, kopolimer etylen/bezwodnik maleinowy, poliaminokwasy (homopolimery lub przypadkowe kopolimery) i dekstran lub glikol poli(n-winylopirolidono)polietylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu/tlenek etylenu, polioksyetylowane poliole i alkohol poliwinylowy. Propionaldehyd glikolu polietylenowego może być korzystny zalety przy wytwarzaniu, ze względu na jego trwałość w wodzie. Można także stosować bursztynian i styren.

PL 194 159 B1

Proteiny OB lub Fc stosowane przy formulacji proteiny fuzyjnej Fc-OB można wytworzyć przez przyłączenie poliaminokwasów lub aminokwasów z punktem rozgałęzienia do ugrupowania proteiny Fc lub OB (lub analogów). Przykładowo, poliaminokwas może być dodatkową proteiną nośnikową, która - podobnie jak reszta Fc przyłączona fuzjnie do proteiny OB lub analoga OB według obecnego wynalazku - służy także do zwiększenia cyrkulacyjnego czasu półtrwania proteiny, obok korzyści omówionych wyżej uzyskiwanych dzięki proteinie fuzyjnej Fc-OB.

Dla celów terapeutycznego lub kosmetycznego zastosowania proteiny według wynalazku takimi poliaminokwasami powinny być takie poliaminokwasy, które dają lub nie powodują neutralizującej reakcji antygenicznej lub w innych niekorzystnych reakcji. Takie poliaminokwasy mogą być wybrane z grupy obejmującej albuminę surowicy (taką, jak albuminę ludzkiej surowicy), dodatkowe przeciwciało lub jego część (przykładowo obszar Fc) lub inne poliaminokwasy, przykładowo lizyny. Jak wskazano poniżej przyłączenie poliaminokwasu może mieć miejsce przy N-końcu ugrupowania białkowego Fc-OB lub przy C-końcu, lub w innych miejscach pomiędzy nimi i może być także połączone przez ugrupowanie „łącznika” chemicznego do proteiny Fc-OB.

Polimer może mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. W przypadku glikolu polietylenowego korzystny ciężar cząsteczkowy wynosi między około 2 kDa i około 100 kDa (określenie „około” wskazuje, że w preparatach glikolu polietylenowego pewne cząsteczki będą ważyć więcej, niektóre mniej niż podany ciężar cząsteczkowy) dla łatwości przy operowaniu i wytwarzaniu. Można stosować inne wielkości zależnie od żądanego profilu terapeutycznego (przykładowo, żądanego czasu trwania przedłużonego uwalniania, wpływu - o ile taki występuje - na aktywność biologiczną, łatwości posługiwania się, stopnia lub braku antygeniczności lub innych znanych wpływów glikolu polietylenowego na terapeutyczną proteinę lub jej analog).

Liczba tak przyłączonych cząsteczek polimeru może się zmieniać, a biegły w sztuce będzie mógł ustalić ich wpływ na właściwości. Można mono-derywatyzować lub można zapewnić di-, tri-, tetra- lub inną kombinację derywatyzacji, przy użyciu tych samych lub różnych ugrupowań chemicznych (przykładowo polimerów takich, jak glikole polietylenowe o różnym ciężarze cząsteczkowym). Proporcja cząsteczek polimeru do cząsteczek proteiny (lub peptydu) będzie się zmieniać, podobnie jak ich stężenia w mieszaninie reakcyjnej.

Zasadniczo, optymalny stosunek (w kategoriach wydajności reakcji w tym sensie, że nie ma nadmiaru nieprzereagowanej proteiny lub polimeru) zostanie określony przez czynniki takie, jak żądany stopień derywatyzacji (przykładowo mono-, di-, tri-i td.), ciężar cząsteczkowy wybranego polimeru, to czy polimer jest rozgałęziony czy nierozgałęziony oraz warunki reakcji.

Ugrupowania chemiczne należy przyłączać do proteiny przy uwzględnieniu wpływu na funkcjonalne lub antygeniczne domeny proteiny. Istnieje szereg metod przyłączania dostępnych dla biegłych w sztuce, przykładowo EP O 401 384, przywołany tutaj jako odsyłacz (sprzęganie PEG z G-CSF), patrz również Malik i wsp., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (relacjonujący pegylowanie GM-CSF przy użyciu chlorku trezylu).

Przykładowo, glikol polietylenowy może być związany kowalencyjnie przez reszty aminokwasowe za pośrednictwem grupy reaktywnej takiej, jak wolna grupa aminowa lub karboksylowa. Grupami reaktywnymi są takie, do których może być przyłączona aktywowana cząsteczka glikolu polietylenowego. Reszty aminokwasowe mające wolną grupę aminową mogą obejmować reszty lizynowe i N-końcową resztę aminokwasową.

Reszty mające wolną grupę karboksylową mogą obejmować reszty kwasu asparaginowego, reszty kwasu glutaminowego i C-końcową resztę aminokwasową. Jako grupę reaktywną dla przyłączania cząsteczki(cząsteczek) glikolu polietylenowego można również stosować grupy sulfhydrylowe. Dla celów terapeutycznych korzystne jest przyłączenie przy grupie aminowej takie, jak przyłączenie przy N-końcu lub przy grupie lizynowej. Należy unikać przyłączenia przy resztach ważnych dla wiązania receptora, jeżeli jest pożądane wiązanie receptora.

W szczególności, może być pożądana proteina fuzyjna Fc-OB zmodyfikowana chemicznie przy N-końcu. Stosując glikol polietylenowy jako ilustrację obecnych kompozycji można dokonywać wyboru spośród różnorodnych cząsteczek glikolu polietylenowego (różniących się ciężarem cząsteczkowym, rozgałęzieniem itd.), spośród proporcji cząsteczek glikolu polietylenowego do cząsteczek proteiny (lub peptydu) w mieszaninie reakcyjnej, typu wykonywanej reakcji pegylowania i sposobu otrzymania wybranej proteiny pegylowanej przy N-końcu.

PL 194 159 B1

Sposób otrzymania N-końcowo pegylowanego preparatu (to znaczy oddzielenia tego ugrupowania od innych ugrupowań monopegylowanych, jeśli jest to niezbędne) może polegać na oczyszczaniu substancji pegylowanej N-końcowo z populacji wszystkich cząsteczek pegylowanych protein. Selektywną N-końcową modyfikację chemiczną można wykonać przez alkilowanie redukujące wykorzystujące różną reaktywność różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych (lizyny bądź występującej na N-końcu) dostępnych dla derywatyzacji w konkretnej proteinie. Przy odpowiednich warunkach reakcji zasadniczo osiąga się selektywną derywatyzację proteiny przy N-końcu przy użyciu polimeru zawierającego grupę karbonylową.

Przykładowo, można selektywnie N-końcowo pegylować proteinę przez prowadzenie reakcji przy wartości pH, która umożliwia wykorzystanie różnic pKa między grupą e-aminową reszt lizynowych i grupą a-aminową N-końcowej reszty proteiny. Przez taką selektywną derywatyzację kontroluje się przyłączanie polimeru rozpuszczalnego w wodzie do proteiny: skoniugowanie z polimerem zachodzi głównie przy N-końcu proteiny i brak jest znaczącej modyfikacji innych grup reaktywnych takich, jak grupy aminowe bocznego łańcucha lizyny. W przypadku stosowania alkilowania redukującego, polimer rozpuszczalny w wodzie może być typu opisanego wyżej i powinien mieć pojedyncze reaktywne ugrupowanie aldehydowe dla sprzęgania z proteiną. Można zastosować propionaldehyd glikolu polietylenowego zawierający pojedynczą reaktywną grupę aldehydową.

N-końcowo monopegylowana pochodna jest korzystna ze względu na łatwość w wytwarzaniu środka terapeutycznego. N-końcowe pegylowanie zapewnia produkt jednorodny, gdyż identyfikacja produktu jest uproszczona w porównaniu z produktami di-, tri- lub innych multi-pegylowanymi.

Korzystne jest zastosowanie powyższego procesu alkilowania redukującego przy wytwarzaniu N-końcowego produktu, ze względu na łatwość prowadzenia wytwarzania przemysłowego.

Kompleksy

Proteinę fuzyjną Fc-OB, jej analog lub pochodną, można poddawać w postaci skompleksowanej z kompozycją wiążącą. Taka kompozycja wiążąca może mieć wpływ polegający na dalszym przedłużaniu czasu cyrkulacji w stosunku do wydłużenia właściwego dla proteiny fuzyjnej Fc-OB, jej analoga lub pochodnej. Taka kompozycja może być proteiną (lub - co stanowi synonim - peptydem).

Przykładem proteiny wiążącej jest receptor proteiny OB lub jego część taka, jak jego część rozpuszczalna. Inne proteiny wiążące można ustalić przez badanie proteiny OB lub proteiny Fc-OB w surowicy lub metodą doświadczalnego skriningu na obecność wiązania. Stosowane proteiny wiążące nie będą w typowym przypadku kolidować ze zdolnością proteiny OB, protein fuzyjnych Fc-OB lub ich analogów lub pochodnych - do wiązania się z endogennym receptorem proteiny OB i/lub wpływaniem na przetwarzanie sygnału.

Kompozycje farmaceutyczne

Obecny wynalazek dotyczy również zastosowania związków według wynalazku i kompozycji farmaceutycznych zawierających proteiny fuzyjne Fc-OB i ich pochodne. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być do podawania przez iniekcję lub do podawania doustnego, dopłucnego, donosowego, transdermalnego lub mieć postać dostosowaną do innych dróg podawania.

W ogólnym przypadku należy rozumieć, że wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczne ilości proteiny lub produktów pochodnych według wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, konserwantami, solubilizatorami, emulgatorami, adiuwantami i/lub nośnikami. Takie kompozycje zawierają rozcieńczalniki o różnej zawartości buforu (przykładowo, Tris-HCl, octan, fosforan), różnym pH i sile jonowej; dodatki takie jak środki powierzchniowo czynne i środki solubilizujące (przykładowo, Tween 80, Polysorbate 80), przeciwutleniacze (przykładowo, kwas askorbinowy, metawodorosiarczyn sodu), konserwanty (przykładowo, Thimersol, alkohol benzylowy) i substancje spęczniające (przykładowo, laktoza, mannitol); włączanie substancji do preparatów ziarnistych związków polimerowych, takich jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy i tp. albo do liposomów.

Można również stosować kwas hilauronowy i to może wywołać efekt sprzyjający przedłużonemu trwaniu w cyrkulacji. Takie kompozycje mogą wpływać na stan fizyczny, trwałość, szybkość uwalniania in vivo i szybkość usuwania in vivo z organizmu obecnych protein i pochodnych.

Patrz, przykładowo publikacja: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), strony 1453-1712, którą włączono tutaj jako odnośnik. Kompozycje można wytworzyć w postaci ciekłej lub mogą być w postaci wysuszonego proszku takiej, jak w postać liofilizowana.

PL 194 159 B1

Wynalazek obejmuje również implantowalne formy o powolnym uwalnianiu, takie jak formy transdermalne.

Dla stosowania w obecnym wynalazku przydatne są doustne stałe formy dawkowania, które opisano ogólnie w: Remington's Pharmaceutical Sciencesm 18^th Ed. 1990 (MackPublishing Co. Easton PA 18042) w rozdziale 89, która to publikacja została włączona tutaj jako odnośnik. Stałe formy do podawania doustnego obejmują tabletki, kapsułki, pigułki, pastylki-kołaczyki lub pastylki do ssania, opłatki lub peletki. Przy formulacji niniejszych kompozycji można także stosować otoczkowanie liposomowe lub proteinoidowe (jak, przykładowo, mikrosfery proteinoidowe opisane w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4,925,673).

Można stosować otoczkowanie liposomowe, a liposomy mogą być derywatyzowane przy użyciu różnych polimerów (przykładowo, według patentu Stanów Zjednoczonych nr 5,013,556). Opis możliwych stałych form dawkowania dla środków leczniczych został podany w publikacji: Marshal, K. w Modern Pharmaceutics, wydany przez: G. S. Banker i C. T. Rhodes, rozdział 10, 1979, włączonej tutaj jako odnośnik. Generalnie, omawiana postać zawiera proteinę fuzyjną Fc-OB (lub analog lub pochodną) i składniki obojętne, umożliwiające ochronę przed środowiskiem żołądka i uwalnianie substancji biologicznie czynnej w jelitach.

W szczególności, wynalazek uwzględnia także doustne formy dawkowania powyższych derywatyzowanych protein. Proteina fuzyjną Fc-OB może być zmodyfikowana chemicznie tak, że doustne podawanie pochodnej jest skuteczne. Generalnie, rozpatrywaną modyfikacją chemiczną jest przyłączenie co najmniej jednego ugrupowania do samej cząsteczki proteiny (lub peptydu), przy czym wspomniane ugrupowanie umożliwia (a) inhibitowanie proteolizy i (b) wychwyt do strumienia krwi z żołądka lub jelit.

Pożądany jest również wzrost całkowitej trwałości proteiny i zwiększenie czasu cyrkulacji w organizmie. Przykłady takich ugrupowań obejmują: glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon i poliprolinę. Abuchowski i Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, w: „Enzymes as Drugs”, Hocenberg i Roberts, wy d. Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), strony 367-383; Newmark i wsp., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982).

Innymi polimerami, które można zastosować, są: poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. W zastosowaniu farmaceutycznym, jak wskazano powyżej, korzystne są ugrupowania glikolu polietylenowego.

W przypadku proteiny fuzyjnej Fc-OB, jej analoga lub pochodnej, miejscem uwolnienia może być żołądek, jelito cienkie (przykładowo, dwunastnica, jelito czcze lub jelito kręte) lub też jelito grube. Biegły w sztuce zna dostępne postaci leków, które nie rozpuszczaj ą się w żołądku, a jednak będą uwalniać substancję w dwunastnicy lub innym miejscu jelit.

Korzystnie, przy uwalnianiu należy unikać szkodliwego wpływu środowiska żołądka, bądź to przez ochronę proteiny fuzyjnej Fc-OB, jej analoga lub pochodnej lub też przez uwalnianie substancji biologicznie czynnej poza środowiskiem żołądka, przykładowo w jelitach.

Aby zapewnić pełną odporność gastryczną istotna jest powłoka nieprzepuszczalna do co najmniej pH=5,0. Przykładami składników obojętnych częściej stosowanych jako powłoki dojelitowe są: trimelitan octanu celulozy (CAT), ftalan hydroksypropylometylocelulozy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalan poliwinylooctanu (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalan octanu celulozy (CAP), Eudragit L, Eudragit S i Shellac. Powłoki te można stosować jako warstewki mieszane.

Na tabletkach można również stosować powłokę lub mieszaninę powłok, co do których nie jest zamierzona ochrona względem środowiska żołądka. Może to obejmować powłoki cukrowe lub powłoki, które ułatwiają połykanie tabletki. Kapsułki mogą się składać z twardej powłoki (takiej, jak żelatyna) dla dostarczania suchego środka leczniczego, przykładowo proszku; w przypadku form ciekłych można stosować powłokę z miękkiej żelatyny.

Materiałem powłokowym dla opłatków mogłaby być gruba warstwa skrobi lub inny jadalny opłatek. W przypadku pigułek, tabletek do ssania, tabletek stopionych lub rozcieranych tabletek, można stosować techniki dostosowane do postępowania z wilgotną masą.

Środek leczniczy może być włączony do danej postaci leku w formie drobnych wielocząstek, w formie granulek lub peletek o wielkości cząstki około 1mm. Formą substancji do podawania w postaci kapsułki mógłby być również proszek, lekko sprasowane grudki lub nawet tabletki. Środek leczniczy mógłby być wytworzony przez sprasowanie.

PL 194 159 B1

Można włączyć również barwniki i substancje smakowe. Przykładowo, proteina (lub jej pochodna) mogą być poddane formulacji (przykładowo przez otoczkowanie liposomowe przy użyciu mikrosfer), a następnie wprowadzone dalej do produktu jadalnego, takiego jak chłodzony napój zawierający barwniki i substancje smakowe.

Można rozcieńczyć lub zwiększyć objętość środka leczniczego przy użyciu materiału obojętnego. Rozcieńczalniki te mogłyby zawierać węglowodany, w szczególności mannitol, a-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę, sacharozę, zmodyfikowane dekstrany i skrobię. Pewne sole nieorganiczne można również stosować jako wypełniacze, włączając w to trójfosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Pewne dostępne handlowo rozcieńczalniki to: Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.

Przy formulacji środka leczniczego w postaci stałej formy dawkowania można włączyć substancje powodujące dezintegrację. Substancje powodujące rozkruszenie obejmują - lecz nie wyłącznie skrobię, włączając w to substancję handlową opartą na skrobi - Explotab. Można także stosować: glikolan sodowy skrobi, Amberlite, karboksymetylocelulozę sodową, ultramylopektynę, alginian sodu, żelatynę, skórkę pomarańczową, karboksymetylocelulozę kwasową, gąbkę naturalną i bentonit.

Inną formą substancji powodujących dezintegrację są nierozpuszczalne żywice kationowymienne. Sproszkowane żywice można stosować jako substancje powodujące dezintegrację oraz jako lepiszcza i mogą one obejmować sproszkowane żywice takie, jak agar, Karaya i tragakant. Kwas alginowy i jego sól sodowa są również przydatne jako środki dezintegrujące.

Lepiszcza można stosować do utrzymywania spójności środka leczniczego, by utworzył twardą tabletkę. Obejmują one substancje z produktów naturalnych takich, jak guma arabska, tragakant, skrobia i żelatyna. Inne obejmują metylocelulozę (MC), etylocelulozę (EC) i karboksymetylocelulozę (CMC). Można stosować poliwinylopirolidon (PVP) i hydroksypropylometylocelulozę (HPMC) w roztworach alkoholowych by przeprowadzić granulację środka leczniczego.

Do składu środka leczniczego można włączyć środek przeciw tarciu, by zapobiec przyleganiu podczas procesu formulacji. Można stosować środki zmniejszające tarcie jako warstwę między środkiem leczniczym i ścianką, i mogą one obejmować, lecz nie są do podanych środków ograniczone: kwas stearynowy, włączając w to jego sole magnezu i wapnia, politetrafluoroetylen (PTFE), ciekłą parafinę, oleje roślinne i woski. Można także stosować ciekłe substancje zmniejszające tarcie takie, jak siarczan laurylowo-sodowy, siarczan laurylowo-magnezowy, glikol polietylenowy o różnych ciężarach cząsteczkowych, Carbowax 4000 i 6000.

Można dodawać substancje poślizgowe, które mogą polepszyć płynność (sypkość) leku podczas formulacji i wspomóc przemieszczanie podczas sprasowywania. Substancje poślizgowe mogą obejmować skrobię, talk, krzemionkę pirogeniczną i uwodniony glinokrzemian.

Aby wspomóc rozpuszczanie środka leczniczego w środowisku wodnym można dodać substancję powierzchniowo czynną jako środek zwilżający. Substancje powierzchniowo czynne mogą obejmować detergenty anionowe takie, jak siarczan laurylowo-sodowy, sulfobursztynian dioktylowosodowy i sulfonian dioktylowo-sodowy. Można też stosować detergenty kationowe i mogłyby one obejmować chlorek benzalkoniowy lub chlorek benzetomiowy.

Lista potencjalnych detergentów niejonowych, które mogłyby być włączone przy formulacji jako środki powierzchniowo czynne jest następująca: Lauromacrogol 400, stearynian polioksylu 40, uwodorniony olej rycynowy 10, 50 i 60 z polioksyetylenem, monostearynian gliceryny, polisorbat 40, 60, 65 i 80, ester kwasu tłuszczowego i sacharozy, metyloceluloza i karboksymetyloceluloza. Te środki powierzchniowo czynne mogłyby być obecne w formulacji proteiny lub jej pochodnej same, bądź w mieszaninie o różnych stosunkach ilościowych.

Dodatkami, które potencjalnie zwiększają wychwyt proteiny (lub jej pochodnej) są, przykładowo, kwasy tłuszczowe, kwas oleinowy, kwas linoleinowy i kwas linolenowy.

Mogą być pożądane formy o kontrolowanym uwalnianiu. Lek może być włączony do obojętnej matrycy, która umożliwia uwalnianie bądź przez mechanizmy dyfuzji lub ługowania, przykładowo żywicę. Można do kompozycji włączyć również matryce ulegające powolnej degeneracji, przykładowo alginiany, polisacharydy.

Inna forma kontrolowanego uwalniania obecnego środka leczniczego polega na metodzie opartej na układzie terapeutycznym Oroś (Alza Corp.), to znaczy lek jest zawarty w półprzepuszczalnej membranie, która umożliwia wniknięcie wody i wypieranie leku przez mały, pojedynczy otwór dzięki zjawiskom osmotycznym. Niektóre powłoki dojelitowe również wykazują efekt opóźnionego uwalniania.

PL 194 159 B1

Dla celów formulacji można stosować inne powłoki. Obejmują one cały szereg cukrów, które można zastosować w powłoczce. Środek leczniczy mógłby być także podany w tabletce pokrytej powlekającą warstewką i substancje stosowane w tym przypadku dzielą się na dwie grupy.

Pierwsza grupa to substancje nie-dojelitowe i obejmuje ona: metylocelulozę, etylocelulozę, hydroksyetylocelulozę, metylohydroksyetylocelulozę, hydroksypropylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, karboksymetylocelulozę sodową, prowidon i glikole polietylenowe. Druga grupa składa się z materiałów dojelitowych, którymi są zwykle estry kwasu ftalowego.

W celu zapewnienia optymalnego pokrycia warstewką powlekającą można stosować mieszaninę substancji. Powlekanie warstewką można przeprowadzić w powlekarce talerzowej lub w złożu fluidalnym, lub poprzez powlekanie przez sprasowanie.

Wobecnym zgłoszeniu rozważane jest także podawanie dopłucne obecnej proteiny (lub jej pochodnych). Proteina (lub pochodna) jest dostarczana do płuc ssaka podczas inhalowania i przechodzi przez wyściółkę nabłonkową płuc do strumienia krwi. (Inne doniesieniana ten temat obejmują: Adjei i wsp., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei i wsp., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (octan leuprolidu); Braquet i wsp., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s.143-146 (1989) (endoteloin-1); Hubbard i wsp., Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989) (a1-antytrypsyna); Smith i wsp., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (a-1-proteinaza); Oswein i wsp., „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (recombinacyjny ludzki hormon wzrostu); Debs i wsp., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (interferon-g i czynnik martwicy guza TNF-a) oraz Platz i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5,284,656 (czynnik stymulujący kolonie granulocytów).

Dla zastosowania w praktyce obecnego wynalazku nadaje się szeroki zakres urządzeń mechanicznych, przeznaczonych do dostarczania dopłucnego produktów terapeutycznych, włączając w to lecz nie wyłącznie - nebulizatory, inhalatory z odmierzaną dawką, inhalatory proszkowe, z których wszystkie są znane biegłym w sztuce.

Pewne szczególne przypadki dostępnych handlowo urządzeń odpowiednich w praktyce obecnego wynalazku to: nebulizator Ultravent, wytwarzany przez Mallinc krodt, Inc., St. Louis, Missouri; nebulizator Acorn II, wytwarzany przez Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; inhalator z odmierzaną dawką Ventolin, wytwarzany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, Norm Carolina i inhalator proszkowy Spinhaler, wytwarzany przez Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Wszystkie takie urządzenia wymagają stosowania form odpowiednich dla dozowania proteiny (jej analoga lub pochodnej). W typowym przypadku dla każdego rodzaju zastosowanego urządzenia przewidziana jest odmienna kompozycja i jej przygotowanie może wiązać się z użyciem odpowiedniego materiału rozpylającego, obok rozcieńczalników, adiuwantów i/lub nośników przydatnych w terapii.

Proteina lub jej pochodna powinna najkorzystniej być wytwarzana w postaci cząstek o średnim wymiarze mniejszym niż 10 mm (lub mikronów), najkorzystniej 0,5 do 5 mm, dla najbardziej skutecznego dostarczania do bardziej odległych rejonów płuc.

Nośniki obejmują węglowodany takie, jak trehalozę, mannitol, ksylitol, sacharozę, laktozę i sorbitol. Inne składniki dla stosowania w tych postaciach mogą obejmować DPPC, DOPE, DSPC, DSPC i DOPC. Można stosować naturalne lub syntetyczne środki powierzchniowo czynne. Można użyć glikol polietylenowy (nawet niezależnie od jego stosowania przy derywatyzowaniu proteiny lub jej analog a). Można stosować dekstrany takie, jak cyklodekstran. Można stosować sole żółciowe lub inne pokrewne środki wspomagające. Można stosować celulozę lub pochodne celulozy. Można stosować aminokwasy takie, jak stosowane w kompozycjach buforowych.

Uwzględniane jest także stosowanie liposomów, mikrokapsułek lub mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych oraz innych typów nośników.

Kompozycje odpowiednie do stosowania w nebulizatorze wytryskowym bądź ultradźwiękowym, będą w typowym przypadku obejmować proteinę Fc-OB, jej analogi lub pochodne, rozpuszczone w wodzie w stężeniu około 0,1 do 25 mg biologicznie czynnej proteiny na ml roztworu. Formulacja może także zawierać bufor i prosty cukier (przykładowo, dla stabilizacji proteiny i regulacji ciśnienia osmotycznego) . Postać do nebulizatora może także zawierać środek powierzchniowo czynny, by zmniejszyć lub zapobiec agregacji proteiny, indukowanej powierzchniowo w wyniku rozpylenia roztworu przy tworzeniu aerozolu.

PL 194 159 B1

Postacie do stosowania w urządzeniu inhalatora o odmierzanej dawce będą w ogólnym przypadku obejmować bardzo rozdrobniony proszek zawierający pochodną w postaci zawiesiny w środku rozpylającym, przy pomocy środka powierzchniowo czynnego.

Środek rozpylający może być dowolną typową substancją stosowaną do tego celu, taką jak związek węglochlorofluorowy, węglowodorochlorofluorowy, węglowodorofluorowy lub węglowodorowy, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoro-etan lub ich kombinacje. Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują trioleinian sorbitanu i lecytynę sojową. Również kwas oleinowy może być przydatny jako środek powierzchniowo czynny.

Postacie do podawania w urządzeniu inhalatora proszkowego będą obejmować bardzo rozdrobniony suchy proszek zawierający proteinę (lub jej pochodną) i mogą także zawierać środek spęczniający taki jak laktoza, sorbitol, sacharoza, mannitol, trehaloza lub ksylitol w ilościach, które ułatwiają wydostawanie się proszku z urządzenia, przykładowo 50 do 90% wagowych w przeliczeniu na masę kompozycji.

Podawanie donosowe proteiny (jej analoga lub pochodnej) jest również możliwe. Podawanie donosowe pozwala na przejście proteiny do strumienia krwi bezpośrednio po podaniu środka leczniczego do nosa, bez konieczności odkładania produktu w płucach. Postacie do podawania donosowego obejmują kompozycje zawierające dekstran lub cyklodekstran. Uwzględnia się również podawanie poprzez transport przez inne błony śluzowe.

Dawki

Biegły w sztuce będzie w stanie określić skuteczne dawki metodą podawania i obserwowania czy żądany efekt terapeutyczny został osiągnięty. Dzięki N-końcowej modyfikacji proteiny OB obecny wynalazek dostarcza nieoczekiwanej ochrony proteiny przed degradacją i zwiększa czas cyrkulacji oraz trwałość w porównaniu z proteiną OB lub C-końcową modyfikacją proteiny OB. A zatem, biegły w sztuce będzie w stanie na podstawie tych zmian ocenić, że skuteczne dawkowanie może wymagać niższych dawek lub mniej częstego podawania.

Korzystnie, modyfikacja związku aktywnego ma być taka, żeby przy dawce pomiędzy około 0,10 mg/kg/dzień i 10 mg/kg/dzień zapewniony był żądany efekt terapeutyczny. Skuteczną dawkę można określić stosując przez pewien czas instrumenty diagnostyczne. Przykładowo, instrumentem diagnostycznym do mierzenia ilości proteiny OB lub proteiny fuzyjnej Fc-OB we krwi (w osoczu lub w surowicy) może być najpierw użyty do określenia endogennych poziomów proteiny.

Takim narzędziem diagnostycznym mogą być próby z przeciwciałem takie, jak próba sandwiczowa na przeciwciała. Ilość endogennej proteiny OB jest ilościowo oznaczana na początku i na tej podstawie jest określana linia podstawowa. Dawki terapeutyczne są określane w miarę kontynuacji terapii, na podstawie ilościowych oznaczeń endogennej i egzogennej proteiny OB lub proteiny fuzyjnej Fc-OB (to znaczy proteiny, jej analoga lub pochodnej znajdującej się w organizmie, wytworzonej samodzielnie lub podanej) jest kontynuowane w trakcie leczenia.

Dawki mogą się zatem zmieniać w trakcie leczenia od stosunkowo wysokiej dawki stosowanej początkowo do momentu stwierdzenia skutku terapeutycznego, do coraz niższych dawek stosowanych dla utrzymania korzystnych efektów terapeutycznych.

W idealnym przypadku w sytuacjach, gdzie jest pożądane wyłącznie obniżenie poziomu lipidów we krwi, gdzie jest pożądane utrzymanie obniżenia poziomów lipidów we krwi lub jest pożądany wzrost beztłuszczowej masy ciała - dawkowanie będzie niewystarczające dla spowodowania utraty wagi ciała. A zatem, w początkowym przebiegu leczenia osoby otyłej można podawać dawki, przy których osiąga się utratę wagi ciała i towarzyszące temu obniżenie poziomu lipidów we krwi lub towarzyszące temu zmniejszenie tkanki tłuszczowej lub wzrost beztłuszczowej masy ciała.

Po osiągnięciu wystarczającej utraty wagi ciała można podawać dawkę wystarczającą do zapobieżenia odzyskaniu wagi ciała, a równocześnie wystarczającą do utrzymania żądanych poziomów lipidów we krwi lub wzrostu beztłuszczowej masy ciała (lub do zapobieżenia utracie beztłuszczowej masy ciała). Dawki te można określać empirycznie ponieważ wpływ proteiny OB lub Fc-OB jest odwracalny (patrz: Campfield i wsp., Science 269: 546-549 (1995) na 547). A zatem, jeśli obserwuje się dawkę prowadzącą do utraty wagi ciała, gdy nie jest pożądana utrata wagi ciała można podawać niższą dawkę aby osiągnąć żądane poziomy lipidów we krwi lub zwiększyć beztłuszczową masę ciała, a równocześnie utrzymać żądaną wagę.

PL 194 159 B1

Dla zwiększenia wrażliwości osobnika na insulinę należy uwzględnić podobne uwarunkowania dotyczące dawki. Można osiągnąć zwiększenie beztłuszczowej wagi ciała bez utraty ciężaru ciała, wystarczające by zmniejszyć ilość insuliny (lub -potencjalnie - amyliny, tiazolidynodionów lub innych potencjalnych leków przeciw-cukrzycowych), którą należałoby podawać pacjentowi w celu leczenia cukrzycy.

Celem ogólnego wzmocnienia należy uwzględnić podobne uwarunkowania dotyczące dawki. Zwiększenie beztłuszczowej masy ciała z jednoczesnym ogólnym wzmocnieniem można osiągnąć przy dawkach niewystarczających do spowodowania utraty wagi ciała. Inne korzyści takie jak zwiększenie czerwonych ciałek krwi (i natlenienia krwi) oraz obniżenie resorpcji kości lub osteoporozy można również osiągnąć bez utraty wagi ciała.

Kombinacje

Obecne sposoby można stosować w połączeniu z innymi środkami leczniczymi, takimi, jak środki przydatne w leczeniu cukrzycy (przykładowo, insulina, ewentualnie tiazolidynodiony, amylina lub ich antagoniści), środki lecznicze obniżające poziom cholesterolu i ciśnienie krwi (takie, jak środki obniżające poziom lipidów we krwi lub inne środki naczyniowosercowe) i środki lecznicze zwiększające aktywność (przykładowo amfetaminy). Można również stosować środki powstrzymujące apetyt (takie, jak wpływające na poziom serotonoiny lub neuropeptydu Y). Takie podawanie może być równoczesne lub in seriatim.

Ponadto, niniejsze sposoby można stosować w połączeniu z zabiegami chirurgicznymi, takimi jak chirurgia kosmetyczna w celu zmiany ogólnego wyglądu ciała (przykładowo, odciąganie tłuszczu lub chirurgia laserowa w celu zmniejszenia masy ciała).

Korzyści zdrowotne wynikające z zabiegów kardiochirurgicznych takich, jak operacje by-pass lub inne operacje prowadzone w celu wywołania ulgi w stanach spowodowanych przez zablokowanie naczyń krwionośnych przez złogi tłuszczu, takie jak płytki tętnicze, można zwiększać dzięki jednoczesnemu stosowaniu obecnych kompozycji i sposobów. Można również stosować sposoby eliminacji kamieni żółciowych takie, jak kruszenie ultradźwiękami lub laserowe bądź przed, podczas lub po przeprowadzeniu omawianych metod terapeutycznych opartych na podawaniu związków aktywnych według wynalazku.

Ponadto, omawiane sposoby terapeutyczne można stosować jako dodatek do operacji chirurgicznych lub leczenia złamań kości, uszkodzonych mięśni lub innych terapii, które dawałyby lepsze wyniki przy zwiększeniu beztłuszczowej masy ciała pacjenta.

Poniższe przykłady podano w celu pełniejszego zilustrowania wynalazku, lecz nie należy ich interpretować jako ograniczenia jego zakresu.

P r z y k ł a d 1

Stosowanie mysiej proteiny Fc-OB podawanej drogą iniekcji podskórnych

Przykład ten pokazuje, że podskórna iniekcja mysiej proteiny Fc-OB prowadzi do utraty wagi u normalnych myszy. Normalnym (nie otyłym) myszom CDI podawano mysią proteinę Fc-OB przez iniekcje podskórne przez okres 22 dni. Dawka 10 mg proteiny/kg wagi ciała/dzień prowadziła do 14% (± 1,1%) utraty w porównaniu z wagą podstawową w okresie do 22 dnia iniekcji. Podawanie samego PBS doprowadziło do 3,9% (± 3,3%) utraty w porównaniu z wagą podstawową w czasie do 22 dnia iniekcji. Utrata wagi ciała przy stosowaniu proteiny Fc-OB w dawce 10 mg proteiny/kg ciała/dzień u otyłych myszy CD1 prowadziła do 10% (± 4,3%) utraty w porównaniu z wagą podstawową, a dawkowanie PBS prowadziło do 8,7% (± 1,3%) utraty w porównaniu z wagą podstawową, w obu przypadkach w okresie do 22 dnia iniekcji.

Poniżej przedstawiono różnice procentowe (%) względem wagi podstawowej u myszy CD1 (w wieku 8 tygodni):

PL 194 159 B1

T a b e l a 1

Utrata wagi ciała po iniekcji podskórnej

Czas (dni)	Zaróbka (PBS)	myszy chude / rekombinacyjna proteina fuzyjna Fc-OB	myszy otyłe / rekombinacyjna proteina fuzyjna Fc-OB
1-2	-0,44 +/-1,1	-3,6 +/- 0,41	-1,03 +/-1,36
3-4	-1,06 +/ -0,13	-6,8 +/-1,5	-2,7 +/-1,1
5-6	-0,13 +/-1,1	-9,5 +/-1,2	-4,9+/-0,95
7-8	-0,92 +/- 0,29	-12,5 +/-1,6	-7,7 +/- 29
9-10	1,6 +/- 1,3	-12,6 +/-1,9	-8,2 +/- 2,9
11-12	-1,98 +/-1	-13,6 +/-1,96	-8,6 +/- 2,9
13-14	-5,2 +/-1,3	-14,6 +/-1,7	-10,1 +/-3,6
15-16	-8,6+/-0,1	-14,5 +/-2	-9,4 +/- 2,2
17-18	-8,5+/-0,64	-16,1 +/-1,8	-9,6 +/- 2,99
19-20	-4,1+/-0,99	-16 +/- 1,5	-10,4 +/-3,3
21-22	-3,9 +/- 3,3	-14,1 +/-1,1	-10 +/-4,3

Jak widać, przy końcu 22 dnia podawania podskórnego zwierzęta otrzymujące proteinę Fc-OB utraciły ponad 14,1% ich wagi ciała w przypadku myszy chudych i 10% wagi ciała w przypadku myszy otyłych, w porównaniu do zwierząt otrzymujących jedynie zaróbkę PBS i porównując do linii podstawowej.

Nieoczekiwanie, zwierzęta otrzymujące proteinę Fc-OB do 22 dnia, nadal traciły wagę aż do 28 dnia, 4 dni po ostatniej iniekcji. W przypadku normalnych (nieotyłych) myszy CD1, którym podawano mysią proteinę Fc-OB w dawce 10 mg proteiny/kg wagi ciała/dzień, przez iniekcje podskórne, zakończone 22 dnia uzyskano 21% utraty względem wagi podstawowej w dniu 28, w porównaniu z 14% utraty w dniu. Podobnie, w przypadku myszy otyłych CD1, którym podawanie mysiej proteiny Fc-OB w dawce 10 mg proteiny/kg wagi ciała/dzień, zakończono 22 dnia, uzyskano 13% utraty względem wagi podstawowej w dniu 28, w porównaniu z 10% utraty w 22 dniu. W dniu 34 - utrata wagi została utrzymana na poziomie 10% utraty u myszy otyłych, podczas gdy w przypadku myszy chudych zachowano 5% utratę. Próby kontrolne w każdym systemie od dnia 22 do dnia 34 dały wartość średnią wzrostu wagi od 4% w przypadku myszy otyłych do 7%u myszy chudych.

P r z y k ł a d 2

Stosowanie ludzkiej proteiny Fc-OB podawanej przez iniekcję podskórną u myszy C57

Przykład ten pokazuje, że podskórna iniekcja ludzkiej proteiny Fc-OB prowadzi do utraty wagi u normalnych myszy. Normalnym (nieotyłym) myszom C57 podawano ludzką proteinę Fc-OB przez iniekcje podskórne przez okres 7 dni. Dawka 10 mg proteiny/kg wagi ciała/dzień doprowadziła do 12% (± 1,3%) utraty w porównaniu z wagą podstawową w okresie do 7 dnia iniekcji. Dawkowanie 1 mg proteiny/kg wagi ciała/dzień doprowadziło do 8,9% (± 1,5%) utraty w porównaniu z wagą podstawową w czasie do 7 dnia iniekcji. Utrata wagi ciała przy stosowaniu proteiny ludzkiej OB w dawce 10 mg proteiny/kg ciała/dzień u otyłych myszy CD57 wyniosła 1,1% (± 0,99%) utraty w porównaniu z wagą podstawową, a dawkowanie 1 mg/kg wagi ciała/dzień prowadziło do 2,5% (± 1,1%) utraty w porównaniu z wagą podstawową, w obu przypadkach w okresie do 7 dnia iniekcji.

Wyniki

Poniżej przedstawiono różnice procentowe (%) względem wagi podstawowej u myszy C57 (w wieku 8 tygodni):

PL 194 159 B1

T a b e l a 2

Utrata wagi ciała po iniekcji podskórnej

Czas (dni)	Zaróbka (PBS)	Rekombinacyjna proteina fuzyjna Fc-OB	Rekombinacyjna proteina OB
1-2	0,258 +/- 1,3	-6,4 +/-1,6	-2,1 +/-0,91
3-4	2,2 +/-1,1	-12,1 +/-1,5	-0,78 + /- 0,36
5-6	4,5 +/-2	-11,5 +/-1,5	-1,7+/-0,6
7-8	7,0 + / -2,1	-11,9 +/-1,6	0,1 +/- 1,2
9-10	9,0 +/- 1,9	-11,5 +/-1,3	7,2 +/- 2,7
11-12	10 +/-3,8	-9 +/-1,4	10,9 +/-2,9
13-14	12,5 +/-4,4	-9,5 + /- 1,6	12,3 +/-6,4
15-16	11,1 +/1,0	-3,0 + /-1,5	10,3 +/-3,3
17-18	-17,2 +/ -3,6	8,0 + /-1,3	13,3 +/-3,4

Jak widać, przy końcu 17 dnia po 7-dniowym trybie podawania podskórnego przy dawce 10 mg/kg/dzień, zwierzęta otrzymujące proteinę Fc-OB odzyskały do 8% ich ciężaru ciała. Zwierzęta otrzymujące dawki 1 mg/kg/dzień po 7 dniu trybu podawania podskórnego powróciły do 6,4% ciężaru ciała po 12 dniach.

Badania te pokazują także, że podczas okresów odzyskiwania od dnia 7 do dnia 22 po ostatniej iniekcji dnia 7, odzyskiwanie ciężaru ciała jest wolniejsze w przypadku myszy C57, którym podawano Fc-OB, niż w przypadku myszy, którym podawano OB. Sugeruje to, że proteina Fc-OB nie jest usuwana tak szybko jak proteina OB, tym samym powodując przedłużony efekt utraty wagi.

P r z y k ł a d 3

Reakcja na dawkę u myszy CF7, leczonych proteiną fuzyjną Fc-OB

Dodatkowe badanie pokazało, że występowała reakcja na dawkę przy ciągłym podawaniu proteiny Fc-OB. W tym badaniu otyłym myszom CF7, ważącym 35-40 gramów podawano rekombinacyjną ludzką proteinę Fc-OB stosują metody podobne jak w powyższym przykładzie. Wyniki zestawiono poniżej w tabeli 3 (% utraty wagi ciała w stosunku do wartości podstawowej, mierzono jak wyżej).

T a b e l a 3

Reakcja na dawkę przy ciągłym podawaniu

Dawka	Czas	% redukcji masy ciała
0,25 mg/kg/dzień	5 dni	4
0,5 mg/kg/dzień	5 dni	12
1 mg/kg/dzień	5 dni	16

Jak widać, zwiększenie dawki z 0,25 mg/kg/dzień do 1 mg/kg/dzień zwiększyło utratę wagi ciała z 4% do 16%. Warto również zaznaczyć, że 5 dnia dawka 1 mg/kg/dzień doprowadziła do 16% zmniejszenia ciężaru ciała. Badania te również wykazały powolne szybkości odzyskiwania ciężaru ciała do 0% sugerując, że proteina Fc-OB nie jest tak szybko usuwana, tym samym powodując przedłużony efekt utraty wagi ciała.

P r z y k ł a d 4

Farmakokinetyka rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB u myszy CD-1 oraz u psów

Badanie to pokazało właściwości farmakokinetyczne rekombinacyjnej ludzkiej proteiny metFc-OB u myszy CD-1 i psów. Po dożylnym lub podskórnym podawaniu przy dawce 1 mg/kg/dzień, stężenia rekombinacyjnej ludzkiej proteiny metFc-OB i ludzkiej proteiny metOB oznaczono za pomocą próby immunosorbenta związanego z enzymem (ELISA).

W przypadku obu powyższych gatunków zaobserwowano zwiększenie ekspozycji oceniane ilościowo na podstawie wyższego piku stężenia maksymalnego w surowicy i większej powierzchni pod

PL 194 159 B1 krzywą stężenia w surowicy (AUC) w porównaniu z rekombinacyjna ludzką proteiną metOB. Fc-OB wykazuje wolniejsze usuwanie układowe niż rekombinacyjną ludzka proteina metOB. Przejawia się to wolniejszym usuwaniem i dłuższym czasem półtrwania proteiny Fc-OB w porównaniu z proteiną OB. Wzrost rozmiarów powoduje nie tylko wzrost trwałości proteiny, lecz także spadek skuteczności usuwania przez nerki. W wyniku tego proteina Fc-OB jest usuwana wolniej z cyrkulacji układowej. Wzrost piku czasu, maksymalnej wartości stężeń w surowicy oraz AUC dla proteiny Fc-OB jest spójny z wolniejszym usuwaniem. Proteina Fc-OB zasadniczo da wyższą ekspozycję układową w porównaniu z proteiną OB. Wyniki podano poniżej w tabeli 4:

T a b e l a 4

Parametry farmakokinetyczne

Gatunek	Myszy CD-1	Myszy CD-1	Psy gończe
Droga podawania	Dożylnie	Podskórnie	Podskórnie
	Proteina OB	Proteina Fc-OB	Proteina OB	Proteina Fc-OB	Proteina OB	Proteina Fc-OB
Poziom dawki (mg/kg)	1	1	1	1	0,5	0,5
Pik czasu (h)			0,14	6	2,8	8
Maksymalne stężenie w surowicy			1520	7550	300	1120
AUC (ng x godz./ml)			1230	132000	2200	52500
Czas półtrwania	0,491	21,4	0,388		2,13	22,9
Usuwanie (m/godz./kg)	681	2,73

P r z y k ł a d 5

Przykład ten pokazuje, że u myszy normalnych, które nie są otyłe i nie mają podwyższonych poziomów lipidów we krwi, podawanie rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB prowadzi do obniżenia poziomów cholesterolu, glukozy i trójglicerydów. Ponadto, przykład ten pokazuje, że poziomy te pozostają niskie przez trzydniowy okres po zaprzestaniu podawania.

Normalnym myszom CD1 podano rekombinacyjną ludzką proteinę Fc-OB przez iniekcje podskórne. Próbki krwi pobrano 24 godziny po dniu 23 - ostatnim dniu iniekcji. Jak omawiano powyżej, zwierzęta utraciły ciężar ciała przy podanych dawkach. Jak widać z tabeli 5 u myszy odnotowano zasadnicze zmniejszenie cholesterolu, glukozy i trójglicerydów w surowicy, w sposób zależny od dawki, w porównaniu do prób kontrolnych.

Tabe l a 5

Dawka	Glukoza	Cholesterol	Trój glicerydy
PBS	232,6 +/- 15,1	67,8 +/- 3,6	52,6 +/-3,7
1 mg/kg/dzień	225,8 +/-29,1	54 +/- 5,6	43 +/- 8,7
10 mg/kg/dzień	193,2+/-21,1	53,4 +/-5,7	38+/-11
1 mg/kg, co 2 dni	242,0 +/-9,3	52,6 +/- 4,4	40,8 +/- 7,2
10 mg/kg, co 2 dni	197,4 +/-27,9	51,4+/-5,9	29,8 +/-6,3
1 mg/kg, co 3 dni	244,8 +/- 19,5	60,8 +/-7,3	54+/-7,1
10 mg/kg, co 3 dni	188 +/-31,2	52,2 +/-6,9	26,2+/-10,7

Dane te pokazują, że proteina Fc-OB lub jej analogi lub pochodne są skutecznymi środkami obniżającymi poziom lipidów we krwi.

PL 194 159 B1

P r z y k ł a d 6

Pacjentowi, otyłemu człowiekowi, podaje się ludzką proteinę Fc-OB, jej analog lub pochodną, w celu zmniejszenia wagi. Otyły pacjent ma również podwyższone poziomy lipidów we krwi, w tym podwyższone poziomy cholesterolu, ponad 200 mg/100 ml. Pacjent osiąga zadowalające obniżenie wagi w trakcie leczenia Fc-OB. Dawkę podtrzymującą proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej podaje się temu samemu pacjentowi już nieotyłemu by podtrzymać obniżony poziom lipidów we krwi, w tym obniżony poziom cholesterolu, poniżej 200 mg/100 ml. Podawana dawka jest niewystarczająca by spowodować dalszą utratę wagi. Podawanie ma charakter permanentny. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny taki, jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

P r z y k ł a d 7

Nieotyły pacjent, człowiek, podlega operacji chirurgicznej bypassu wieńcowego lub innemu leczeniu inwazyjnemu by złagodzić zaawansowany etap tworzenia płytek tętniczych. Po operacji pacjentowi podaje się dawkę podtrzymującą proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej aby zapobiec powtórnemu tworzeniu płytek tętniczych. Podawana dawka jest niewystarczająca by spowodować utratę wagi. Podawanie ma charakter permanentny. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny, taki jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

P r z y k ł a d 8

U nieotyłego pacjenta - człowieka - obserwuje się nadciśnienie spowodowane ograniczonym przepływem krwi wskutek zatkanych tętnic. Pacjentowi podaje się dawkę proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej wystarczającą do zmniejszenia płytek tętniczych powodujących zatykanie tętnic. Następnie, pacjent jest monitorowany na dalsze tworzenie płytek arteryjnych oraz na nadciśnienie. Jeśli stan ten ponownie pojawia się, pacjentowi ponownie podaje się skuteczną ilość proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej, wystarczającą do przywrócenia przepływu krwi, a równocześnie niewystarczającą do spowodowania utraty wagi. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB lub analoga, lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny taki, jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

P r z y k ł a d 9

Pacjent - człowiek - ma kamienie żółciowe. Kamienie żółciowe, bądź to nie są usuwane i chodzi o uniknięcie tworzenia dodatkowych kamieni żółciowych, bądź też kamienie żółciowe są usuwane, lecz pęcherzyk żółciowy pozostaje (przykładowo przy operacji wykonanej techniką laserową lub ultradźwiękową) i chodzi o uniknięcie tworzenia dodatkowych kamieni żółciowych. Pacjentowi podaje się skuteczną ilość proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej, by doprowadzić do zapobieżenia akumulacji dodatkowych kamieni żółciowych lub re-akumulacji kamieni żółciowych. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB lub analoga, lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny taki, jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

P r z y k ł a d 10

Pacjent chory na cukrzycę - człowiek - chce stosować obniżone dawki insuliny w leczeniu cukrzycy. Pacjentowi podaje się skuteczną ilość proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej, by spowodować wzrost beztłuszczowej masy ciała. Wrażliwość pacjenta na insulinę wzrasta, a dawkowanie insuliny niezbędne do obniżenia objawów cukrzycy jest obniżone, bądź w kategoriach obniżenia jednostek potrzebnej insuliny, bądź w kategoriach obniżenia liczby iniekcji insuliny wymaganych dziennie. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny taki, jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

P r z y k ł a d 11

Nieotyły pacjent - człowiek - chce zwiększyć beztłuszczową masę ciała dla celów terapeutycznych, takich jak powrót do zdrowia po chorobie, która spowodowała spadek beztłuszczowej masy ciała. Pacjentowi podaje się skuteczną ilość proteiny Fc-OB, jej analoga lub pochodnej, by spowodować wzrost beztłuszczowej masy ciała. Wzrost beztłuszczowej masy ciała jest monitorowany metodą skanowania DEXA. Poziomy cyrkulującej proteiny Fc-OB lub analoga, lub pochodnej można monitorować stosując zestaw diagnostyczny taki, jak próba przy użyciu przeciwciała przeciw proteinie OB (lub innego źródła antygenicznego, jeśli ma to zastosowanie).

PL 194 159 B1

Materiały i metody

Zwierzęta: W powyższych przykładach użyto dzikiego typu myszy CD1 i myszy (+/+) C57B16. Wiek myszy w momencie początkowym wynosił 8 tygodni i zwierzęta były stabilizowane co do wagi.

Żywienie oraz pomiar wagi: Myszom podawano rozdrobnione pożywienie dla gryzoni (PMI Feeds, Inc.) w urządzeniach do karmienia sproszkowanym pożywieniem (Allentown Caging and Equipment), co umożliwiło dokładniejszy i bardziej czuły pomiar niż przy użyciu pożywienia w postaci regularnych bloków. Wagę mierzono o tej samej porze każdego dnia (14⁰⁰) przez żądany czas. Wagę ciała w dniu przed iniekcją określono jako wagę podstawową. Użyte myszy ważyły 18-22 gramy.

Pomieszczenia: Myszy przechowywano w jedno-osobniczych pomieszczeniach i utrzymywano w humanitarnych warunkach.

Podawanie proteiny lub zarobki: Proteinę (jak opisano poniżej) lub zaróbkę (roztwór soli buforowany fosforanem, pH=7,4) podawano metodą iniekcji podskórnej lub dożylnie.

Próby kontrolne: Zwierzętami kontrolnymi były te, którym wstrzykiwano samą zaróbkę bez dodawania do zarobki proteiny fuzyjnej Fc-OB, bądź proteiny OB.

Proteina: Sekwencje o numerach 1, 2 i 3 określają mysi rekombinacyjny OB DNA i rekombinacyjną mysią proteinę OB (rysunek 1), a sekwencje o numerach 4, 5 i 6 określają analogiczny ludzki rekombinacyjny OB DNA i rekombinacyjną ludzką proteinę OB. Jak zaznaczono wyżej, rekombinacyjna ludzka proteina OB jak w SEQ ID NO 6, ma resztę lizynową w pozycji 35 i resztę izoleucynową w pozycji 74. Ponadto, rekombinacyjną ludzka proteina podana w: Zhang i wsp., Nature - patrz wyżej oraz w publikacji PCT WO 96/05309 (12/22/96) (obie pozycje wraz z rysunkami przywołano tutaj jako odnośniki) oraz analogi rekombinacyjnych protein mysich i ludzkich z rysunku fig. 1 i 2 przedstawiają proteinę OB, którą można użyć przy tworzeniu proteiny fuzyjnej Fc-OB zgodnie z obecnym wynalazkiem. Można także użyć innych protein OB lub Fc, bądź ich analogów, lub pochodnych do wytwarzania proteiny fuzyjnej Fc-OB.

W obecnym zgłoszeniu pierwszy aminokwas sekwencji aminokwasowej rekombinacyjnej proteiny OB jest oznaczony jako +1 i jest to walina, a aminokwas w pozycji -1 jest metioniną. C-końcowy aminokwas ma numer końcowy 146 (cysteina) (patrz rysunek fig. 1 i 2). Pierwsza sekwencja aminokwasowa rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB z rysunku fig. 3 jest oznaczana jako +1 i jest to glutaminian, a aminokwas w pozycji -1 jest metioniną. C-końcowy aminokwas ma numer 378 (cysteina). Pierwsza sekwencja aminokwasowa odmiany rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB z rysunku fig.4 jest oznaczona jako +1 i jest to glutaminian, a aminokwas w pozycji -1 jest metioniną. C-końcowy aminokwas ma numer 378 (cysteina). Pierwsza sekwencja aminokwasowa odmiany rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB z rysunku fig. 5 jest oznaczona jako +1 i jest to kwas asparaginowy, a aminokwas w pozycji -1 jest metioniną. C-końcowy aminokwas ma numer 373 (cysteina). Pierwsza sekwencja aminokwasowa odmiany rekombinacyjnej ludzkiej proteiny Fc-OB z rysunku fig. 6 jest oznaczona jako +1 i jest to kwas asparaginowy, a aminkowas w pozycji -1 jest metioniną. C-końcowy aminokwas ma numer 373 (cysteina).

Wektor ekspresji i szczep gospodarza

Użytym plazmidowym wektorem ekspresji jest pAMG21 (numer dostępu w kolekcji ATCC 98113), który jest pochodną pCFM1656 (numer dostępu ATCC 69576) i zawiera odpowiednie miejsca restrykcyjne dla wstawiania genów w dół od promotora lux PR (patrz patent Stanów Zjednoczonych nr 5,169,318 odnośnie opisu układu ekspresji lux). DNA Fc-OB opisany poniżej i pokazany na rysunkach fig. 3-6 utworzono i ligowano do wektora ekspresji pAMG21 zlinearyzowanego przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Ndel i BamHI i transformowano do szczepu gospodarza E. coli, FM5. Komórki FM5 E. coli wyprowadzono w Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, ze szczepu E. coli K-12 (Bachman i wsp., Bacterial. Rev. 40: 116-167 (1976)) i zawierają gen represora zintegrowanego fagu lambda, cI857 (Sussman i wsp., C. R. Acad. Sci. 254: 1517-1579 (1962)). Wytwarzanie wektora, transformacja komórki i wybór kolonii wykonano metodami stndardowymi (przykładowo: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). Komórki gospodarza wzrastały w pożywkach LB.

Konstrukcja DNA kodującego Fc-OB

Plazmid pFc-A3 (opisany poniżej) służył jako źródło sekwencji ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG-1 od aminokwasu o numerze 99 (Glu) do naturalnego końca karboksylowego. Sekwencję ludzkiego IgG-1 można otrzymać z Genebank (P01857).

Sekwencja ludzkiej proteiny OB jest ujawniona powyżej, jak również w: Zhanga i wsp., Nature patrz wyżej oraz w publikacji PCT WO 96/05309; obie pozycje wraz z rysunkami włączono tutaj jako

PL 194 159 B1 odnośniki. DNA kodujący OB ligowano do wektora ekspresji pCFM1656 zlinearyzowanego przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Xbal i BamHI, stosując standardowe procedury klonowania, przykładowo wg: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Plazmid pCFM1656 zawierający sekwencję DNA kodującą OB służył jako źródło sekwencji dla genu rekombinacyjnej ludzkiej OB

Fuzję genetyczną tych dwóch sekwencji wykonano metodą wydłużania komplementarnych końców w reakcji PCR (Ho, S. N. i wsp., Site Directed Mutagenesis By Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction, Gene 77: 51-59 (1989)). Produkt PCR rozszczepiono przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Ndel z utworzeniem lepkiego końca-5' i przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej BamHI z utworzeniem lepkiego końca -3'. Podobnie rozszczepiono wektor pAMG21. Ligację wykonano przy użyciu fragmentu fuzyjnego i zlinearyzowanego wektora. Ligowany DNA transformowano przez elektroporację do szczepu gospodarza E. coli. Klony, które przetrwały na płytkach selekcyjnych agaru z kanamycyną (50 mg/ml) sprawdzono na ekspresję proteiny o wielkości Fc-OB. Plazmid z indywidualnych klonów wyizolowano i zweryfikowano sekwencję obszaru kodującego genu.

Gdy były pożądane dodatkowe modyfikacje genu Fc-OB, użyto ponownie techniki PCR dla przeprowadzenia tych zmian. Wykonano dwa zestawy zmian przy N-końcu części Fc proteiny fuzyjnej (SEQ ID NO 9) z wytworzeniem odmian SEQ IDNO 12 i 15. Inną odmianę skonstruowano by wprowadzić cztery podstawienia aminokwasów dla usunięcia miejsca wiązania receptora-Fc (leucyna w pozycji 15 podstawiona glutaminianem) oraz miejsca wiązania komplementu (C1q) (glutaminian w pozycji 98 podstawiony alaniną, lizyna w pozycji 100 podstawiona alaniną oraz lizyna w pozycji 102 podstawiona alaniną -patrz: Xin Xiao Zheng i wsp., J. Immunol. 154: 5590-5600 (1995)). Szablonem dla tego konstruktu była sekwencja SEQ ID NO 15, a uzyskaną odmianą była sekwencja SEQ ID NO 18.

Konstrukcja wektora pFC-A3

Plazmid pFc-A3 zawierający obszar kodujący część Fc ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG-1 (patrz: Ellison, J. W. i wsp., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982)), od pierwszego aminokwasu Glu-99 domeny zawiasowej do końca karboksylowego plus miejsce fuzji 5'-NotI i miejsca 3'-Sali i XbaI, wykonano przez amplifikację biblioteki cDNA ludzkiej śledziony. Reakcje PCR wykonano w końcowej objętości 100 ml i użyto 2 jednostki polimerazy DNA Vent w 20 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % Triton X-100 z 400 mM każdego dNTP i 1 ng biblioteki cDNA poddawanej amplifikacji wraz z 1 uM każdego primera. Reakcję zainicjowano przez denaturację w 95°C przez 2 minuty, a następnie przez 30 cykli w temperaturze 95°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 73°C przez 2 minuty. Primer 5'- włączył miejsce Notl bezpośrednio 5' względem pierwszej reszty (Glu-99) domeny zawiasowej IgG-1. Primer 3'- włączył miejsca SalIi Xbal. Produkt PCR o 717 parach zasad wytrawiono przy użyciu Notl i SalI, a uzyskany fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę przy użyciu 1% agarozy i oczyszczono oraz klonowano w wektorze pbluescript II KS (Stratagene) wytrawionym Notl i SalL. Insert w uzyskanym plazmidzie pFc-A3 sekwencjonowano by potwierdzić wiarygodność reakcji PCR.

Sposoby wytwarzania

Poniższe sposoby wytwarzania stosowano celem wytwarzania aktywnej biologicznie rekombinacyjnej metionylowej proteiny OB będącej analogiem proteiny mysiej lub ludzkiej oraz protein fuzyjnych Fc-OB. Podobne sposoby można stosować do wytwarzania biologicznie aktywnej metionylowej ludzkiej proteiny OB

Proces fermentacji

Zastosowano rzutowy proces fermentacji. Składy pożywek podano poniżej.

Część pożywek składających się w pierwszym rzędzie ze źródeł azotu sterylizowano (przez podwyższenie temperatury do 120-123°C przez 25-35 minut) w naczyniu do fermentacji. Po ochłodzeniu dodano aseptycznie źródła węgla, magnezu, fosforanu i metali śladowych. Hodowlę powyższych bakterii wytwarzających rekombinacyjną proteinę mysią o objętości 500 mlwyhodowaną przez noc (namnożona w brzeczce LB) dodano do fermentatora. Gdy gęstość optyczna hodowli (zmierzona przy 600 nm jako wskaźnik gęstości komórek) osiągnęła 15-25 jednostek absorpcji, do hodowli dodano (1 ml/l) roztwór autoinduktora (0,5 mg/mllaktonu homoseryny) by indukować ekspresję genu rekombinacyjnego. Kontynuowano proces fermentacji przez dalsze 10 do 16 godzin, a następnie zebrano brzeczkę przez odwirowanie.

PL 194 159 B1

Skład pożywek:
Wsad: 34 g/l	ekstrakt drożdży
78 g/l	pepton sojowy
0,9 g/l	chlorek potasu
5,0 g/l	heksafos*
1,7 g/l	kwas cytrynowy
120 g/l	gliceryna
0,5 g/l	MgSO4 x 7H2O
0,2 ml/l	roztwór metali śladowych
0,5 ml/l	środek przeciwpieniący P2000

Ph2PCH2CH2P(Ph)CH2CH2P(Ph)CH2CH2P(Ph)CH2CH2P(Ph)CH2CH2PPh2

Roztwór metali śladowych:

Chlorek żelaza (FeCl3 x 6H2O): 27 g/l

Chlorek cynku (ZnCl2 x 4H2O): 2 g/l

Chlorek kobaltu (CoCl2 x 6H2O): 2 g/l

Molibdenian sodu (NaMoO4 x 2H2O): 2 g/l Chlorek wapnia (CaCl2 x 2H2O): 1 g/l

Siarczan miedzi (CuSO4 x 5H2O): 1,9 g/l

Kwas borowy (H3BO3): 0,5 g/l

Chlorek manganu (MnCl2 x 4H2O): 1,6 g/l

Dwuwodny cytrynian sodu: 73,5 g/l

Proces oczyszczania ludzkiej proteiny fuzyjnej Fc-OB

Oczyszczanie ludzkiej proteiny fuzyjnej Fc-OB wykonano według poniższych etapów (o ile nie zaznaczono inaczej poniższe etapy wykonywano w temperaturze 4°C). Oczyszczanie mysiej i ludzkiej proteiny OB jest ujawnione w publikacji PCT WO 96/05309 - patrz wyżej, włączonej tu jako odnośnik.

1. Pasta komórkowa.

Pastę komórkową E. coli przeprowadzono w stan zawiesiny w 5-krotnej objętości wody destylowanej. Komórki w wodzie poddano następnie dalszemu rozdrobnieniu stosując dwa przejścia przez mikrofluidyzator. Komórki po rozpadzie odwirowano przy 4200 obrotów/minutę w wirówce Beckman'a JB-6 z wirnikiem J5-4.2.

2. Przemycie ciał inkluzywnych.

Supernatant z powyższego etapu 1 usunięto i grudkę części stałych powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny przy użyciu 5 objętości wody destylowanej. Mieszaninę odwirowano jak w etapie pierwszym.

3. Solubilizacja.

Grudkę części stałych solubilizowano przy użyciu 10 objętości 50 mM tris, pH=8,5, 8 M chlorowodorku guanidyny, 10 mM ditiotreitolu i mieszano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Sporządzono z tego roztwór 40 mM dichlorowodorku cystaminy i mieszano przez godzinę.

4. Roztwór z etapu 3 dodano do 20-30 objętości poniższego, powtórnie zestawionego roztworu: 50 mM tris, pH=8,5; 0,8 M argininy; 2 M mocznika i 4 mM cysteiny. Powtórnie zestawiony roztwór mieszano przez 16 godzin w temperaturze 8°C.

5. Wymiana buforu.

Roztwór z etapu 4 zatężono i poddano diafiltracji do 10 mM tris, pH=8,5.

6. Wytrącanie kwasu.

Roztwór z etapu 5 doprowadzono do pH=4,75 przy użyciu 50% lodowatego kwasu octowego i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór przesączono.

7. Chromatografia kationowymienna.

Roztwór z etapu 6 doprowadzono do pH=7,0 i wprowadzono na kolumnę CM Sepharose Fast Flow w temperaturze 10°C. W 20 objętościach kolumny wykonano gradient przy 10 mM fosforanu, pH=7,0, od O do 0,1 M NaCl.

8. Chromatografia anionowymienna.

Wyciek z kolumny CM z etapu 7 rozcieńczono 5-ciokrotnie przy użyciu 5 mM tris, pH=7,5 i wprowadzono na kolumnę Q Sepharose Fast Flow w temperaturze 10°C. W 20 objętościach kolumny wykonano gradient przy 10 mM tris, pH=7,5, od 0 do 0,2 M NaCl.

PL 194 159 B1

9. Chromatografia na zasadzie oddziaływań hydrofobowych.

Wyciek z kolumny Q Sepharose przeprowadzono w roztwór 0,75 M względem siarczanu amonu i wprowadzono na metylową kolumnę Macroprep z oddziaływaniami hydrofobowymi, w temperaturze pokojowej. W 20 objętościach kolumny wykonano gradient przy 10 mM fosforanu, pH=7,0, od 0,75 M do 0M siarczanu amonu.

10. Wymiana buforu.

Wyciek z etapu 9 zatężono tak jak to było nie zbędne i poddano dializie wobec buforu PBS. Podczas gdy obecny wynalazek opisano w kategoriach korzystnych wykonań, należy rozumieć, że biegli w sztuce dostrzegą odmiany i modyfikacje. A zatem, należy rozumieć, że załączone zastrzeżenia obejmują wszystkie takie równoważne odmiany, które mieszczą się w zakresie zastrzeganego wynalazku.

PL 194 159 B1

WYKAZ SEKWECJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Mann, Michael B.

Hecht, Randy I.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: PROTEINA FUZYJNA OB - KOMPOZYCJE ORAZ SPOSOBY (iii) LICZBA SEKWENCJI: 18 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Amgen Inc.

(B) ULICA:STREET: 1840 DeHavilland Drive (C) MIASTO: Thousand Oaks (D) STAN: CA (E) KRAJ: USA (F) KOD: 91320-1789 (v) FORMA CZYTELNA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) DATA BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/770,973 (B> DATA ZGŁOSZENIA: 20 grudnia 1996 (C) KLASYFIKACJA:

(Viii) INFORMACJA DOTYCZĄCA PEŁNOMOCNIKA PRAWNEGO/AGENTA:

(A) NAZWISKO: Knight, Matthew W.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 36,846 (C) NUMER ODNIEŚIENIA/AKT: A-416 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 491 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTA NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA:I: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CEHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POŁOŻENIE: 41 (C) INNE INFORMACJE: /note= MET = ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATGGTACCGA TCCAGAAAGT 60

TCAGGACGAC ACCAAAACCT TAATTAAAAC GATCGTTACG CGTATCAACG ACATCAGTCA 120

CACCCAGTCG GTCTCCGCTA AACAGCGTGT TACCGGTCTG GACTTCATCC CGGGTCTGCA 180

CCCGATCCTA AGCTTGTCCA AAATGGACCA GACCCTGGCT GTATACCAGC AGGTGTTAAC 240

CTCCCTGCCG TCCCAGAACG TTCTTCAGAT CGCTAACGAC CTCGAGAACC TTCGCGACCT 300

PL 194 159 B1

GCTGCACCTG	CTGGCATTCT	CCAAATCCTG	CTCCCTGCCG	CAGACCTCAG	GTCTTCAGAA	360
ACCGGAATCC	CTGGACGGGG	TCCTGGAAGC	ATCCCTGTAC	AGCACCGAAG	TTGTTGCTCT	420
GTCCCGTCTG	CAGGGTTCCC	TTCAGGACAT	CCTTCAGCAG	CTGGACGTTT	CTCCGGAATG	430
TTAATGGATC	C					491

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 491 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (Dł TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2

AGATCTAAAC	TCAAAATTGA	AAATCTTCCT	CCTTATTGTA	TACCATGGCT	AGGTCTTTCA	60
AGTCCTGCTG	TGGTTTTGGA	ATTAATTTTG	CTAGCAATGC	GCATAGTTGC	TGTAGTCAGT	120
GTGGGTCAGC	CAGAGGCGAT	TTGTCGCACA	ATGGCCAGAC	CTGAAGTAGG	GCCCAGACGT	130
GGGCTAGGAT	TCGAACAGGT	TTTACCTGGT	CTGGGACCGA	CATATGGTCG	TCCACAATTG	240
GAGGGACGGC	AGGGTCTTGC	AAGAAGTCTA	GCGATTGCTG	GAGCTCTTGG	AAGCGCTGGA	300
CGACGTGGAC	GACCGTAAGA	GGTTTAGGAC	GAGGGACGGC	GTCTGGAGTC	CAGAAGTCTT	360
TGGCCTTAGG	GACCTGCCCC	AGGACCTTCG	TAGGGACATG	TCGTGGCTTC	AACAACGAGA	420
CAGGGCAGAC	GTCCCAAGGG	AAGTCCTGTA	GGAAGTCGTC	GACCTGCAAA	GAGGCCTTAC	480
AATTACCTAG	G					491

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 147 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ NICI: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Proteina (D) POŁOŻENIE: 1 (E) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) StartS at -1 (xi)OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:

Met 1

Val

Pro

Ile

Gin 5

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr Leu

Ile 15

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

35

40

45

Ile

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

50

55

60

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

Ile

Ala

Asn

Asp

PL 194 159 B1

70 75 BO

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

His

Leu 90

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys 95

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro 100

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu 105

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser 110

Leu

Asp

Gly

Val

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

val

val 125

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 130

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 135

Asp

Ile

Leu

Gin

Gin 140

Leu

Asp

Val

Ser

Pro Glu Cys 145 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 454 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

<ix)	CECHY:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: miscfeature
	(F)	POŁOŻENIE: 4
	(G)	INNE INFORMACJE: /note= Met = ATG

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4

CATATGGTAC	CGATCCAGAA	AGTTCAGGAC	GACACCAAAA	CCTTAATTAA	AACGATCGTT	60
ACGCGTATCA	ACGACATCAG	TCACACCCAG	TCGGTGAGCT	CTAAACAGCG	TGTTACAGGC	120
CTGGACTTCA	TCCCGGGTCT	GCACCCGATC	CTGACCTTGT	CCAAAATGGA	CCAGACCCTG	180
GCTGTATACC	AGCAGATCTT	AACCTCCATG	CCGTCCCGTA	ACGTTCTTCA	GATCTCTAAC	240
GACCTCGAGA	ACCTTCGCGA	CCTGCTGCAC	GTGCTGGCAT	TCTCCAAATC	CTGCCACCTG	300
CCATGGGCTT	CAGGTCTTGA	GACTCTGGAC	TCTCTGGGCG	GGGTCCTGGA	AGCATCCGGT	360
TACAGCACCG	AAGTTGTTGC	TCTGTCCCGT	CTGCAGGGTT	CCCTTCAGGA	CATGCTTTGG	420
CAGCTGGACC	TGTCTCCGGG	TTGTTAATGG	ATCC			454

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 5 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 454 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

GTATACCATG	GCTAGGTCTT	TCAAGTCCTG	CTGTGGTTTT	GGAATTAATT	TTGCTAGCAA	60
TGCGCATAGT	TGCTGTAGTC	AGTGTGGGTC	AGCCACTCGA	GATTTGTCGC	ACAATGTCCG	120
GACCTGAAGT	AGGGCCCAGA	CGTGGGCTAG	GACTGGAACA	GGTTTTACCT	GGTCTGGGAC	180

PL 194 159 B1

CGACATATGG	TCGTCTAGAA	TTGGAGGTAC	GGCAGGGCAT	TGCAAGAAGT	CTAGAGATTG	240
CTGGAGCTCT	TGGAAGCGCT	GGACGACGTG	CACGACCGTA	AGAGGTTTAG	GACGGTGGAC	300
GGTACCCGAA	GTCCAGAACT	CTGAGACCTG	AGAGACCCGC	CCCAGGACCT	TCGTAGGCCA	360
ATGTCGTGGC	TTCAACAACG	AGACAGGGCA	GACGTCCCAA	GGGAAGTCCT	GTACGAAACC	420
GTCGACCTGG	ACAGAGGCCC	AACAATTACC	TAGG			454

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO : 6 ·.

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) nazwa/klucz: Protein (H) POŁOŻENIE: 1 (I) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) starts at -1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6

Met 1

Val

Pro

Ile

Gin 5

Lys

Val

Gin

Asp

Asp 10

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 15

Lys

Thr

Ile

Val

Thr 20

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 25

Ser

His

Thr

Gin

Ser 30

Val

Ser

Lys

Gin 35

Arg

Val

Thr

Gly

Leu 40

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 45

Leu

His

Pro

Ile

Leu 50

Thr

Leu

Ser

Lys

Met 55

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala 60

Val

Tyr

Gin

Ile 65

Leu

Thr

Ser

Met

Pro 70

Ser

Arg

Asn

Val

Leu 75

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp 80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

His

Val 90

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys 95

Ser

Cys

His

Leu

Pro 100

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu 105

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser 110

Leu

Gly

Val

Leu 115

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

Val

val 125

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 130

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 135

Asp

Met

Leu

Trp

Gin 140

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1150 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) topologia: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

PL 194 159 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: miscfeature (J) POŁOŻENIE: 4 (K) INNE INFORMACJE: /note= Met = ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

CATATGGAAC	CCAAATCTTG	TGACAAAACT	CACACATGCC	CACCGTGCCC	AGCACCTGAA	60
CTCCTGGGGG	GACCGTCAGT	CTTCCTCTTC	CCCCCAAAAC	CCAAGGACAC	CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATGCGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCGTGGAG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGGGAG	240
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCTTGAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAGT	TGTTGCTCTG	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGTTGT	1140

TAATGGATCC 1150 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO : 8 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1150 par zasad

(B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8 :
GTATACCTTG	GGTTTAGAAC	ACTGTTTTCA GTGTGTACGG	GTGGCACGGG	TCGTGGACTT	60
GAGGACCCCC	CTGGCAGTCA	GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC CACGTATTAC	GGTTCTGTTT	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG AGGTTGTTTC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360

PL 194 159 B1

TTTTGGTAGA	GGTTTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTCTTTCAA	72 0
GTCCTGCTGT	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TGTCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840
GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAATTGG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140
ATTACCTAGG						1150
(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO : 9 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 379 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ NICI: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana

(ii) typ CZĄSTECZKI: proteina (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Protein (L) POŁOŻENIE: 1 (M) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) starts at -1 (XX) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9 :

Met 1

Gin

Pro

Lys

Ser 5

Cys

Asp

Lys

Thr

His 10

Thr

Cys

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Gin

Leu 20

Leu

Gly

Pro

Ser 25

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 30

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 35

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 40

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 45

Thr

Cys

Val

Val 50

Asp

Val

Ser

His

Glu 55

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 60

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 65

Asp

Gly

Val

Glu

Val 70

His

Asn

Ala

Lys

Thr 75

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 85

Tyr

Arg

Val

Ser 90

Val

Leu

Thr

Val

Leu 95

His

Gin

Asp

Trp

Leu 100

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 105

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 110

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 115

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 12 0

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala 125

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 130

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 135

Thr

Leu

Pro

Ser 140

Arg

Asp

Glu

Leu

PL 194 159 B1

Thr Lys Asn 145

Gin

Val

Ser 150

Leu Thr Cys

Leu

Val 155

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

ISO

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

245

250

255

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

375

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1150 par zasad <B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

<ix>	CECHY:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: miscfeature
	(N)	POŁOŻENIE: 4
	(0)	INNE INFORMACJE: /note= Met = ATG

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10

CATATGGAAC	CAAAATCTGC	TGACAAAACT	CACACATGTC	CACCTTGTCC	AGCTCCGGAA	60
CTCCTGGGGG	GTCCTTCAGT	CTTCCTCTTC	CCCCCAAAAC	CCAAGGACAC	CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATGCGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCGTGGAG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGGGAG	240

PL 194 159 B1

GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCTTGAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAGT	TGTTGCTCTG	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGTTGT	1140

TAATGGATCC 1150 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1150 par zasad

(B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11: GTATACCTTG GTTTTAGACG ACTGTTTTGA GTGTGTACAG	GTGGAACAGG	TCGAGGCCTT	60
GAGGACCCCC	CAGGAAGTCA	GAAGGAGAAG	GGGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTTT	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGTTTC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360
TTTTGGTAGA	GGTTTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTCTTTCAA	720
GTCCTGCTGT	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TGTCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840
GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAATTGG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960

PL 194 159 B1

GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140
ATTACCTAGG						1150

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 12;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 379 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ NICI: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Proteina (B) POŁOŻENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) StartS at -1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

Met 1

Glu

Pro

Lys

Ser 5

Ala

Asp

Lys

Thr

His 10

Thr

Cys

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 20

Leu

Gly

Pro

Ser 25

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 30

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 35

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 40

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 45

Thr

Cys

Val

Val 50

Asp

Val

Ser

His

Glu 55

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 60

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 65

Asp

Gly

Val

Glu

Val 70

His

Asn

Ala

Lys

Thr 75

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 85

Tyr

Arg

Val

Ser 90

Val

Leu

Thr

Val

Leu 95

His

Gin

Asp

Trp

Leu 100

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 105

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 110

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 115

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 120

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala 125

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 130

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 135

Thr

Leu

Pro

Ser 140

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr 145

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 150

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 155

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 165

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 170

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 175

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 180

Pro

Val

Leu

Asp 185

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 190

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 195

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 200

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 205

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 210

Cys

Ser

Val

Met

His 215

Glu

Ala

Leu

His

Asn 220

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 225

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser 230

Pro

Gly

Lys

Val

Pro 235

Ile

Gin

Lys

Val

Gin 240

PL 194 159 B1

Asp

Thr Lys

Thr 245

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile Val 250

Thr Arg

Ile Asn Asp 255

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

375

(2)

INFORMACJA

. DLA

. SEQ

ID

NO:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1135 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inisc_f eature (B) POŁOŻENIE: 4 (C) INNE INFORMACJE: /note= Met = ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:13:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGTCCACCT	TGTCCAGCTC	CGGAACTCCT	GGGGGGTCCT	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	300
TACAAGTGCA	AGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840

PL 194 159 B1

TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGA	1020
GGGGTCCTGG	AAGCATCCGG	TTACAGCACC	GAAGTTGTTG	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT	1080
TCCCTTCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGAC	CTGTCTCCGG	GTTGTTAATG	GATCC	1135

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1135 par zasad

	(B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:
GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACAGGTGGA	ACAGGTCGAG	GCCTTGAGGA	CCCCCCAGGA	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGGACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTCCTC	300
ATGTTCACGT	TCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCTTTTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGAATTAAT	TTTGCTAGCA	ATGCGCATAG	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	7Θ0
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTGGAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	GTCGTCTAGA	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTAGAGATT	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960
AAGAGGTTTA	GGACGGTGGA	CGGTACCCGA	AGTCCAGAAC	TCTGAGACCT	GAGAGACCCG	1020
CCCCAGGACC	TTCGTAGGCC	AATGTCGTGG	CTTCAACAAC	GAGACAGGGC	AGACGTCCCA	1080
AGGGAAGTCC	TGTACGAAAC	CGTCGACCTG	GACAGAGGCC	CAACAATTAC	CTAGG	1135

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 374 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) POSTAĆ NICI: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (ix) CECHY:

PL 194 159 B1 {A} NAZWA/KLUCZ: Protein (D) POŁOŻENIE: 1 (E) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) starts at -1

(xi)	OPIS SEKWENCJI	: SEQ ID	NO:	15:
Met Asp	Lys Thr His Thr	Cys Pro	Pro	Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1	5			10 15
Gly Gly	Pro Ser Val Phe	Leu Phe	Pro	Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
	20		25	30
Met Ile	Ser Arg Thr Pro	Glu Val	Thr	Cys Val Val Val Asp Val Ser
	35	40		45
His Glu	Asp Pro Glu Val	Lys Phe	Asn	Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50		55		60
Val His	Asn Ala Lys Thr	Lys Pro	Arg	Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
65	70			75 80
Tyr Arg	Val Val Ser Val	Leu Thr	Val	Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
	85			90 95
Gly Lys	Glu Tyr Lys Cys	Lys Val	Ser	Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
	100		105	110
Ile Glu	Lys Thr Ile Ser	Lys Ala	Lys	Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
	115	120		125
Val Tyr	Thr Leu Pro Pro	Ser Arg	Asp	Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
130		135		140
Ser Leu	Thr Cys Leu Val	Lys Gly	Phe	Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145	ISO			155 160
Glu Trp	Glu Ser Asn Gly	Gin Pro	Glu	Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
	165			170 175
Pro Val	Leu Asp Ser Asp	Gly Ser	Phe	Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
	180		185	190
Val Asp	Lys Ser Arg Trp	Gin Gin	Gly	Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
	195	200		205
Met His	Glu Ala Leu His	Asn His	Tyr	Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
210		215		220
Ser Pro	Gly Lys Val Pro	Ile Gin	Lys	Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr
225	230			235 240
Leu Ile	Lys Thr Ile Val	Thr Arg	Ile	Asn Asp Ile Ser His Thr Gin
	245			250 255
Ser Val	Ser Ser Lys Gin	Lys Val	Thr	Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly
	260		265	270
Leu His	Pro Ile Leu Thr	Leu Ser	Lys	Met Asp Gin Thr Leu Ala Val
	275	280		285
Tyr Gin	Gin Ile Leu Thr	Ser Met	Pro	Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile
290		295		300
Ser Asn	Asp Leu Glu Asn	Leu Arg	Asp	Leu Leu His Val Leu Ala Phe
305	310			315 320
Ser Lys	Ser Cys His Leu	Pro Trp	Ala	Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp
	325			330 335
Ser Leu	Gly Gly Val Leu	Glu Ala	Ser	Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val
	340		345	350

PL 194 159 B1

Ala	Leu	Ser 355	Arg	Leu	Gin	Gly Ser Leu Gin Asp Met 360	Leu Trp Gin Leu 365
Asp	Leu 370	Ser	Pro	Gly	Cys

(2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO:1S:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1135 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

(ix)	CECHY:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: miscfeature
	(F)	POŁOŻENIE: 4
	(G)	INNE INFORMACJE: /note= Met = ATG

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:16

CATATGGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCTG CGGAACTCGA AGGTGGTCCG 60

TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 120

GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC ISO

GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 240

ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAAGCT 300

TACGCATGCG CGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 360

GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 420

ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 480

GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 540

GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 600

CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 660

AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 720

ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 780

TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 840

TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 900

AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 960

TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC 1020

GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 1080

TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 1135 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 17;

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1135 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 194 159 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 17:

GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACGGGTGGC ACGGGTCGAG GCCTTGAGCT TCCACCAGGC 60

AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 120

CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 180

CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 240

TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTTCGA 300

ATGCGTACGC GCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 360

CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 420

TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 480

CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 540

CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 600

GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 660

TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 72 0

TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 780

AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 840

AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 900

TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 960

AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020

CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080

AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135 (2) INFORMACJA DLA SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: Protein (B) POŁOŻENIE: 1 (C) INNE INFORMACJE: /note= Met (ATG) starts at -1

(xi)	OPIS SEKWENCJI	: SEQ ID NO:18:
Met Asp 1	Lys Thr His Thr 5	Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu 10 15
Gly Gly	Pro Ser Val Phe 20	Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 25 30
Met Ile	Ser Arg Thr Pro 35	Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 40 45
His Glu SO	Asp Pro Glu Val	Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 55 60

PL 194 159 B1

Val 65

His

Asn Ala Lys

Thr 70

Lys

Pro

Arg Glu Glu Gin Tyr 75

Asn

Ser

Thr 80

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ala

Cys

Ala

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

145

150

155

160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

26 0

265

270

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

PL 194 159 B1

Claims

1. Proteina o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc lub jej analoga, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina Fc lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

b) aminokwasy1-233sekwencji SEQ ID NO:9, spośród których różne aminokwasy są zastąpione lub opuszczone w jednej lub kilku spośród następujących pozycji:

(i) jedna lub więcej reszt cysteinowych jest zastąpionych przez resztę alaninowąlub serynową;

(iii) aminokwas w pozycji 5 jest zastąpiony przez alaninę;

(iv) aminokwas w pozycji 20 jest zastąpiony przez glutaminian;

(v) aminokwas w pozycji 103 jest zastąpiony przez alaninę;

(vi) aminokwas w pozycji 105 jest zastąpiony przez alaninę;

(vii) aminokwas w pozycji 107 jest zastąpiony przez alaninę;

c) sekwencja aminokwasowa z podczęści (a) lub (b) mająca resztę metionylowąna N-końcu;

d) proteina Fc lub jej analog z dowolnej podczęści (a) do (c) obejmująca resztęchemiczną przyłączoną do reszty proteinowej;

f) pochodna z podczęści (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego wwodzie polimeru jest glikol polietylenowy;

g) pochodna z podczęści (e), w której ugrupowaniem rozpuszczalnego wwodzie polimeru jest ugrupowanie poliaminokwasowe; a także

2. Proteina według zastrz. 1, w której proteina OB lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

a) sekwencja aminokwasów 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 3, bądź sekwencjiSEQ ID NO: 6;

b) sekwencja aminokwasowa 1-146 sekwencji SEQ ID NO: 6, mająca resztę lizenową w pozycji 35 oraz resztę izoleucynową w pozycji 74;

c) sekwencja aminokwasowa z podczęści (b), mająca różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78,89,97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145;

f) obcięty analog proteiny OB wybrany z grupy obejmującej (numeracja według SEQ ID NO: 6 mającej resztę lizynową w pozycji 35 oraz resztę izoleucynową w pozycji74):

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytuowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99 -112 , a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

PL 194 159 B1 (vii) obcięty analog z podczęści (f)(ii) mający jeden lub więcej aminokwasów 4, 8 oraz 32 podstawionych innym aminokwasem;

3. Proteina według zastrz. 1, w której sekwencję łącznika tworzy jeden lubwięcej aminokwasów wybranych z grupy, którą tworzą glicyna, aspargina, seryna,treonina i alanina.

4. Proteina według zastrz. 1, w której łącznik jest wybrany z grupy, którątworzą:

a) ala-ala-ala;

b) ala-ala-ala-ala;

c) ala-ala-ala-ala-ala;

d) gly-gly;

e) gly-gly-gly;

f) gly-gly-gly-gly-gly;

g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

h) gly-pro-gly;

i) gly-gly-pro-gly-gly;

j) reszta chemiczna, a także

k) dowolna kombinacja podczęści (a) do (j).

5. Proteina o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc lub jej analoga, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina OBlub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

c) sekwencja aminokwasów z podczęści (b), mająca różne aminokwasy podstawione w jednej lub kilku następujących pozycjach (numeracja według SEQ ID NO: 6):4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145;

(i) aminokwasy 98-146 (ii) aminokwasy 1-32 (iii) aminokwasy 40-116 (iv) aminokwasy 1-99 oraz 112-146

PL 194 159 B1 (v) aminokwasy 1-99 oraz 112-146 mające jeden lub więcej aminokwasów 100-111 usytowanych sekwencyjnie pomiędzy aminokwasami 99-112, a także (vi) obcięty analog OB z podczęści (f)(i) mający jeden lub więcej aminokwasów 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 oraz 145 podstawionych innym aminokwasem;

6. Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego proteinę o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc lub jej analoga, R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina Fc lub jej analog wybrane są z grupy, którą tworzą:

(ii) edna lub więcej reszt tyrozynowych jest zastąpionych przez resztę fenyloalaninowa;

(iii) aminokwas w pozycji 5 jest zastąpiony przez alaninę;

(iv) aminokwas w pozycji 20 jest zastąpiony przez glutaminian;

(v) aminokwas w pozycji 103 jest zastąpiony przez alaninę;

(vi) aminokwas w pozycji 105 jest zastąpiony przez alaninę; (vii) aminokwas w pozycji 107 jest zastąpiony przez alaninę;

7. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz 6, kodującego proteinę, w której proteina OB lub jej analog są wybrane z grupy, którą tworzą:

PL 194 159 B1

8. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 6, kodującego proteinę, w której sekwencję łącznika tworzy jeden lub więcej aminokwasów wybranych z grupy obejmującej glicynę, asparaginę, serynę, treoninę i alaninę.

9 Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 6, kodującego proteinę, w której łącznik jest wybrany z grupy obejmującej:

a) ala-ala-ala;

b)ala-ala-ala-ala;

c)ala-ala-ala-ala-ala;

d) gly-gly;

e) gly-gly-gly;

f) gly-gly-gly-gly-gly;

g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

h) gly-pro-gly;

i)gly-gly-pro-gly-gly; a także

j) dowolne kombinacje podczęści (a) do (i).

10. Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego proteinę o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory ogólne R1-R2 oraz R1-L-R2, w których R1 oznacza proteinę Fc,R2 oznacza proteinę OB lub jej analoga, zaś L oznacza łącznik i w których proteina OBlub jej analog są wybrane z grupy, którą tworzą:

PL 194 159 B1

11. Wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 6 albo 10.

12. Wektor według zastrz. 11, którym jest pAMG21 zawierający sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 6 albo 10.

13. Prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca wektor określony w zastrz. 11.

14. Sposób wytwarzania proteiny określonej w zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że obejmuje etapy prowadzenia w odpowiednich warunkach hodowli komórki gospodarza określonej w zastrz. 13 oraz wyodrębniania wytworzonej proteiny.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytworzonej proteiny.

16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość proteiny określonej w zastrz. 1 albo 5, w farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalniku, adiuwancie lub nośniku.

17. Zastosowanie proteiny określonej w zastrz. 1 albo 5 do wytwarzania leku do leczenia stanów, zaburzeń i chorób wybranych z grupy obejmującej nadwagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, stwardnienie tętnic, płytkę tętniczą, zmniejszenie lub zahamowanie tworzenia kamieni żółciowych, niedostateczną masę tkanki beztłuszczowej, niedostateczną wrażliwość na insulinę i udar, u zwierząt, w szczególności u ssaków oraz u ludzi.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że wytwarzany środek zawiera terapeutycznie skuteczną ilość proteiny określonej w zastrz. 1 albo 5.

19. Zastosowanie według zastrz. 17 albo 18, znamienne tym, że wytwarzany środek przeznaczony jest do stosowania w medycynie ludzkiej.